CN110499301A - 一种催化效率提高的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体 - Google Patents

一种催化效率提高的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体 Download PDF

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    • C12P13/222—Phenylalanine
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Abstract

本发明公开了一种催化效率提高的内消旋‑二氨基庚二酸脱氢酶突变体，属于基因工程技术领域。本发明通过对SEQ ID NO.2的内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶进行单点/双位点突变，并在大肠杆菌中成功表达并纯化出突变体酶D94A、W123K、D94A/W123K、W148K，通过酶活测定，发现所述三种内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体具有相对于野生型较高的催化活性，如突变体酶DAPDH‑D94A、DAPDH‑W123K、DAPDH‑D94A/W123K催化苯丙酮酸的效率分别提高了3.5、1.5、1.3倍，成功提高了关键酶的酶活。

Description

一种催化效率提高的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体
技术领域
本发明涉及一种催化效率提高的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，属于基因工程技术领域。
背景技术
D-苯丙氨酸在食品、工业、农业、生物医药等方面有着很大的应用价值，如用于治疗糖尿病的雷奈酸锶干混悬剂、用于治疗糖尿病的那格列奈片等。内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(DAPDH，EC 1.4.1.16)已被广泛用于D型芳香族氨基酸如D-苯丙氨酸的制备(Akita H,et al.Highly stable meso-diaminopimelate dehydrogenase from an Ureibacillusthermosphaericusstrain A1 isolated from a Japanese compost:purification,characterization and sequencing.AMB Express,2011,1:43)。并且已有部分研究对内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶进行了定点突变改造其性质，都集中改造位于底物催化区域附近、酶表面或特定的氨基酸残基，如Parmeggiani F等选择了150位谷氨酰胺、154位天冬氨酸、169位酪氨酸、195位精氨酸及244位组氨酸进行了突变(Parmeggiani F,et al.Singlelbiocatalyst Synthesis of Enantiopure D-Arylalanines Exploiting an EngineeredD-Amino Acid Dehydrogenase.Advanced Synthesis&Catalysis,2016,358(20):3298-3306.)，成功将其由高底物特异性转变为同时也对芳香族酮酸如苯丙酮酸起作用。但是，目前没有研究报道对于内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的底物通道进行改造以提高酶活。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，所述突变体是在SEQ ID NO.2的基础上，将第94位天冬氨酸替换为丙氨酸，或/和将第123位色氨酸突变为赖氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.2的基础上，将第94位天冬氨酸替换为丙氨酸，得到突变体Asp94Ala，即D94A，含有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.2的基础上，将第123位色氨酸突变成赖氨酸，得到突变体Trp123Lys，即W123K，含有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.2的基础上，将第94位天冬氨酸替换为丙氨酸，将第123位色氨酸突变成赖氨酸，得到突变体D94A/W123K，含有SEQID NO.8所示的氨基酸序列。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体D94A由SEQ ID NO.3所示的基因编码。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体W123K由SEQ ID NO.5所示的基因编码。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体D94A/W123K由SEQ ID NO.7所示的基因编码。
本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体，包括但不限于质粒、噬菌体或病毒载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET系列载体，例如pET-28a。
本发明的第四个目的是提供一种提高内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶催化活性的方法，是在SEQ ID NO.2的基础上，将第94位天冬氨酸替换为丙氨酸，或/和将第123位色氨酸突变成赖氨酸。
本发明的第五个目的是提供一种表达所述内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体的细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞以细菌或真菌细胞为宿主，其满足重组表达载体稳定自我复制的条件，且能够使所述内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体基因有效表达。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞的宿主包括但不限于E.coli BL21、E.coliBL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)为宿主。
本发明的第六个目的是提供一种生产内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的方法，是培养上述细胞，诱导获得内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述培养是将基因工程菌在LB培养基中，35-39℃下培养至OD600达到0.6-0.9，加入终浓度为0.1-1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)溶液的诱导，于15-17℃诱导培养12-16h。
在本发明的一种实施方式中，所述LB培养基含有蛋白脉10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2。
本发明的第七个目的是提供上述内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体或上述细胞在制备D-苯丙氨酸或含D-苯丙氨酸的产品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明首次对内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的底物通道内氨基酸残基进行定点突变，改造了酶的底物通道内的结合位点，获得了对底物苯丙酮酸具备更高催化活性的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶。本发明提供的催化效率提高的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其中单点突变D94A、W123K对于苯丙酮酸的催化效率分别提高了3.5和1.5倍，复合突变体D94A/W123K提高了1.3倍，而单点突变W148K(在SEQ ID NO.2的基础上，将第148位色氨酸突变成赖氨酸，得到突变体Trp148Lys，即W148K，含有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)对于苯丙酮酸的催化效率仅为野生型的80％。
具体实施方式
酶活单位(U)的定义为：50℃下，每分钟催化1μmol NADPH氧化所需的酶量。
比酶活为每毫克蛋白所具有的酶活(U/mg)。
酶活测定反应体系为(100μL):0.2mM NADPH，2mM苯丙酮酸，200mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0)，200mM氯化铵缓冲液(pH 9.0)和适量的纯酶。
实施例1：内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体的构建
以含有来源于嗜热球型芽孢杆菌(Ureibacillus thermosphaericus)的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶基因(如SEQ ID NO.1所示)的pET-28a重组质粒(采用酶切连接的方法构建得到)作为模板。
以含有突变点的寡核苷酸片段为同源臂设计上下游引物，具体引物如下(加粗及下划线为突变位点)：
采用全质粒反向PCR方法构建突变体质粒。
PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各0.5μL，2×Phanta Max Master Mix聚合酶10μL，灭菌ddH2O 8μL，总反应体系20μL。PCR反应条件：95℃预变性，5min；95℃变性，30s，58℃退火，30s，72℃延伸，2min，30个循环；72℃充分延伸，10min。
PCR产物经过凝胶电泳检验，然后在15μL的PCR产物中加入1μL的Dpn I限制性内切酶对模板质粒进行消化，于25℃放置过夜或者37℃下温育3-4h。
将上述经过消化处理的PCR产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的平板上，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明含有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体基因的重组表达载体成功转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中。经测序验证，在突变成功的菌液种加入甘油并于-40℃冰箱保藏。最终获得内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体D94A、W123K、D94A/W123K、W148K核苷酸序列测序结果分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9所示，相应编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10所示。
实施例2：内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体的诱导表达
将实施例1构建的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min培养过夜后转接于50mL的LB培养基中。接种量1％，培养温度37℃，转速180r/min。培养至OD600达到0.6-0.9后加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，诱导温度降低为16℃，诱导14h后，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，于-70℃冰箱贮存备用。
实施例3：内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体的分离纯化
取实施例2收集的湿菌体细胞，用10mL的pH 7.5的50mM PBS缓冲液洗涤二次，重悬于10mL的pH 7.5的50mM PBS缓冲液中，振荡摇匀后置超声波下破碎，破1s，停3s，总时长15min。细胞破碎液于12000rpm离心20min去除细胞碎片，收集上清液即粗酶液并利用0.22μm滤膜过滤后用于酶的后续分离纯化。
纯化柱为Ni-NTA柱，装柱体积为5mL，先用上样平衡缓冲液M0(20mM Tris，500mMNaCl，pH 7.4)平衡Ni-NTA柱，以0.5mL/min的速率上样粗酶液，用上样平衡缓冲液M0洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液M700(20mM Tris，500mM NaCl和700mM咪唑，pH 7.4)洗脱收集目标蛋白，所得纯化后的酶液于-40℃贮存备用。
实施例4：内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶野生酶及其突变体的比酶活
将实施例3得到的纯化后的酶液进行以苯丙酮酸为底物的比酶活的测定，通过酶标仪在340nm处检测NADPH吸光值变化以计算内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的还原胺化活力。结果表明，以苯丙酮酸为底物，内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶野生型(WT)的比酶活是0.67U/mg，突变体D94A、W123K及、D94A/W123K、W148K的比酶活分别是2.38U/mg、0.99U/mg、0.92U/mg、0.57U/mg。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种催化效率提高的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> Ureibacillus thermosphaericus
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aaccgtgttc gttctggtga aaacccggaa ctgtctaccc gtgaaaaaca cgctatggaa 600
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<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
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1 5 10 15
Gly Val Glu Ala Ala Ile Gln Gln Asn Pro Asp Met Glu Leu Val Ala
20 25 30
Val Phe Thr Arg Arg Asp Pro Lys Thr Val Ala Val Lys Ser Asn Val
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<212> DNA
<213> 人工序列
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45

Claims (10)

1.一种内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体为(a)或(b)或(c)：
(a)含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
或，(b)含有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
或，(c)含有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为pET系列载体。
5.一种提高内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶催化活性的方法，其特征在于，是在SEQ IDNO.2的基础上，将第94位天冬氨酸替换为丙氨酸，或/和将第123位色氨酸突变成赖氨酸。
6.表达权利要求1所述内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体的细胞。
7.如权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述细胞以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)为宿主。
8.一种生产内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的方法，其特征在于，培养权利要求6或7所述细胞，诱导获得内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养是将细胞置于LB培养基中，35-39℃下培养至OD600达到0.6-0.9，加入终浓度为0.1-1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷溶液，于15-17℃诱导培养12-16h。
10.权利要求1所述内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体或权利要求6或7所述细胞在制备D-苯丙氨酸或含D-苯丙氨酸的产品中的应用。
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