CN113388559A - 一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents

一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113388559A
CN113388559A CN202010177473.4A CN202010177473A CN113388559A CN 113388559 A CN113388559 A CN 113388559A CN 202010177473 A CN202010177473 A CN 202010177473A CN 113388559 A CN113388559 A CN 113388559A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
escherichia coli
glutathione
ala
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010177473.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113388559B (zh
Inventor
李志敏
崔向伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
East China University of Science and Technology
Original Assignee
East China University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by East China University of Science and Technology filed Critical East China University of Science and Technology
Priority to CN202010177473.4A priority Critical patent/CN113388559B/zh
Publication of CN113388559A publication Critical patent/CN113388559A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113388559B publication Critical patent/CN113388559B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1229—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/04—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C12Y207/04001—Polyphosphate kinase (2.7.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02003—Glutathione synthase (6.3.2.3)

Abstract

本发明提供一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用，在双功能谷胱甘肽合成酶GshF的N端和多聚磷酸激酶PPK的C端分别连接SpyCatcher和SpyTag，将修饰过的两个基因片段同时整合到同一个质粒载体上，转化获得重组大肠杆菌。本发明对获得的重组大肠杆菌进行高密度培养和诱导表达条件优化后，获得多酶复合物的最大表达，收集大肠杆菌菌体进行全细胞或者组装多酶复合物的高效催化，反应结束后直接离心或膜分离，简单回收细胞或多酶复合物后可多次重复利用。该工艺有效地节约了谷胱甘肽生产成本，通过高效重复利用提高了催化体系的利用效率，操作简单，有很好的应用前景。

Description

一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域技术领域，尤其涉及一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用。
背景技术
谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的一种生物活性类三肽化合物。在生物体内，谷胱甘肽能参与体内氧化还原过程，结合过氧化物及自由基以对抗氧化剂对巯基的破坏，同时还可对抗自由基对重要脏器的损害。此外谷胱甘肽提高人体免疫力，抗衰老，在老人迟缓化的细胞上所发挥的功效比年轻人大，谷胱甘肽对于治疗放射线、放射性药物所引起的白细胞减少等症状也都具有非常显著的效果。
酶法生产谷胱甘肽具有催化周期短、转化效率高以及易纯化等优点，已经引起广泛的关注，酶法主要包括全细胞催化以及体外纯酶催化两种。2005年以来对GSH反馈抑制不敏感的双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)相继被发现，该酶同时具有γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GC)合成酶(γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶(GS)的活性而得名(J.Mol.Biol.(2012)416,486-494)。相对于纯酶催化来说，全细胞作为催化剂具有以下的优势：1、细胞可低成本获得，不需要进一步的处理纯化；2、细胞本身可以提供许多酶合适的反应条件和并且有利于一些辅助因子再生；3、将多种酶共固定在细胞内可以增加局部酶的浓度，减少多步反应中中间产物的传递等(Microb.Cell Fact.2017,16,106；Curr.Opin.Biotechnol.2016,42,169-177)。但是细胞的重复利用率是一个重要的限制因素。细胞的固定化可以提高细胞的利用率，并且在稀有糖以及一些重要的药物前体等方面得到了广泛的应用(Biotechnology andBioengineering.2019；116:745–756.)，但是细胞的固定化一般来说过程较复杂，对酶的催化活性或许会有一定的影响。除此之外仍然存在一些其它限制GSH合成的因素，例如ATP消耗量大，成本高不利于工业化的生产。
酶法合成谷胱甘肽需要ATP作为能量供体，ATP的直接添加会极大的提高生产上的成本，因此对于酶法催化来说ATP的再生就显得极为重要。专利CN201310538982在大肠杆菌中过表达双功能谷胱甘肽合成酶(STH)以及乙酸激酶(ack)，虽然该法可以实现ATP再生的目的，但是乙酰磷酸的价格相对较高。张星等(J.Biotechnol.2017；(241)：163-169)通过将重组GshF与多聚磷酸激酶相结合，体外组成一种ATP再生系统来生产GSH的方式在45℃条件下反应5h时GSH的积累量达到了28.5mM，基于半胱氨酸的得率达到了81.4％，虽然基于添加半胱氨酸的得率较高，但是谷胱甘肽的产量相对较低。
多肽段SpyTag和SpyCatcher可通过自发反应形成共价键，从而提供了一种基因编码的方式来提供肽相互作用，该共价键可以抵抗较恶劣条件并且产生稳定的分子自组装体，在本发明中希望通过SpyTag和SpyCatcher的修饰使得GshF和PPK能够融合表达形成多酶复合物从而实现重复利用。
发明内容
本发明的第一个目的在于，提供将双功能谷胱甘肽合成酶以及多聚磷酸激酶在大肠杆菌中同时表达的重组大肠杆菌。
本发明第二个目的在于，提供所述重组大肠杆菌在合成谷胱甘肽中的应用。
本发明第三个目的在于，提供一种利用重组大肠杆菌合成谷胱甘肽的方法。
为了实现上述第一个目的，本发明提供了一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌，在双功能谷胱甘肽合成酶GshF的N端和多聚磷酸激酶PPK的C端分别连接SpyCatcher和SpyTag，将修饰过的两个基因片段同时整合到同一个质粒载体上，转化获得重组大肠杆菌。
作为一个优选方案，所述SpyCatcher通过柔性linker连在GshF的N端，所述SpyTag通过柔性linker连在PPK的C端，所述柔性linker序列如SEQ ID NO.17所示。
为了实现上述第二个目的，本发明提供了所述用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌在合成谷胱甘肽中的应用。
为了实现上述第三个目的，本发明提供了一种利用重组大肠杆菌合成谷胱甘肽的方法，利用上述重组大肠杆菌在温度为30-45℃，pH为6.5-8.0的条件下催化合成谷胱甘肽。
作为一个优选方案，催化反应的底物为L-谷氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、甘氨酸、六偏磷酸钠、ADP和镁离子盐。
作为一个优选方案，催化反应的底物浓度为L-谷氨酸20-120mM、L-半胱氨酸盐酸盐20-120mM、甘氨酸20-120mM、六偏磷酸钠20-100mM、ADP 1-3mM、镁离子盐20-100mM。
镁离子盐可以为MgCl2、MgSO4等催化反应常用镁离子盐。
作为一个优选方案，利用重组大肠杆菌的全细胞或者粗酶液进行催化反应，反应结束后通过离心或膜过滤的方式回收细胞或多酶复合物重复利用。
本发明的一种实施方式中，将SpyCatcher/SpyTag分别连接在GshF的N端和来源于Jhaorihella thermophile的PPK(PPKJT)的C端得到SpyCatcherGshF(CM3)和PPKJTSpyTag(JTT)，通过同源重组的方法连接到pET28a质粒中同时过表达这两个基因，CM3以及JTT可以实现胞内自组装形成多酶复合物(MECs)。在不添加ATP的情况下，通过添加PolyP以及ADP可以有效的解决GSH合成过程中的ATP问题。
通过插入不同的CM3基因拷贝数以及不同的调控方式来优化MECs的蛋白表达量。本发明的一种实施方式中，在同一个质粒中插入不同拷贝数的CM3基因以及通过RBS或者是启动子调控可以有效的改变MECs的表达量，提高了全细胞的催化效率；最终在pH6.5-8.0的PB缓冲液中对过表达组装体蛋白的细胞进行重复利用，使用5次以后仍然能够保持接近100％的催化效率。
本发明的一种实施方式中，对全细胞进行超声或高压匀浆破碎，利用破碎后的粗酶液进行催化反应，反应结束后利用超滤膜截留蛋白，可反复用于GSH的催化合成。
本发明的一种实施方式中，在PB缓冲液中全细胞催化反应结束后可通过离心的方式，10000rpm离心10min收集沉淀，回收细胞可反复用于GSH的催化合成。
本发明的一种实施方式中，重组菌以pET-28a(+)为表达载体。
本发明的一种实施方式中，重组菌以BL21(DE3)为宿主菌。
本发明的优点在于，本发明在大肠杆菌中通过一个质粒同时过表达GshF和PPK从而构建一种应用于GSH生产的ATP再生循环系统，实现了在低成本的聚磷酸存在下可催化ATP的循环产生，为谷胱甘肽的合成反应供能；同时通过SpyCatcher/SpyTag也使得GshF与PPK实现蛋白自组装。本发明对获得的重组大肠杆菌进行高密度培养和诱导表达条件优化后，获得多酶复合物的最大表达，收集大肠杆菌菌体进行全细胞或者组装多酶复合物的高效催化，反应结束后直接离心或膜分离，简单回收细胞或多酶复合物后可多次重复利用。该工艺有效地节约了生产GSH的成本，通过高效重复利用提高了催化体系的利用效率，操作简单，有很好的应用前景。
附图说明
图1为GshF与PPK胞内自组装以及全细胞催化的验证。A不带有SpyCatcher/SpyTag的GshF与PPK的胞内共表达；B带有SpyCatcher/SpyTag的GshF与PPK的胞内共表达；C带有SpyCatcher/SpyTag的GshF与PPK的胞内共表达体的全细胞催化验证。
图2为CM3与PPKJT的基因表达优化以及不同重组菌的全细胞催化。A不同重组菌的构建的示意图；B不同重组菌的蛋白表达；C不同重组菌的全细胞催化。
图3为M3-JT与CRT全细胞催化重复利用的验证。A M3-JT的重复利用；B CRT的重复利用。
图4为CRT全细胞催化生产谷胱甘肽以及细胞的多次利用。
具体实施方式
下面结合具体的相关实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。但是所描述的实施例仅为本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在未做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例都属于本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径得到。
实施例1.将SpyCatcher/SpyTag分别连接在GshF的N端和PPKJT的C端构建不同的重组表达质粒以及工程菌
选取实验室筛选到的PPKJT(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)和定向进化的GshF(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，在GshF的N端和PPKJT的C端分别通过柔性linker(GGGGS)2(核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示:ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg)连接SpyCatcher(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)和SpyTag(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)(SpyCatcher和SpyTag以及柔性linker由上海生物工程有限公司合成)，将CM3通过同源重组的方式连接到pET28a载体上，PPKJT由上海生物工程有限公司合成，每个基因都有单独的启动子或者RBS调控，将质粒分别转入BL21(DE3)。具体的引物序列见表1，序列送上海生物工程有限公司合成。
Figure BDA0002411299180000051
线性化载体的准备：以pET28a为模板，分别以pET28a-F和pET28a-R为上下游引物，进行PCR扩增。反应体系为：模板2μl；PrimerSTAR Max 25μl；正反向引物各20mM；加无菌水至总体积为50μl。反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s；60℃退火30s；72℃延伸4min，共30个循环；结束后，72℃终延伸10min。扩增得到的产物经核酸电泳跑胶验证后通过PCR Purification Kit试剂盒纯化，随后通过DpnI消化模板质粒。
DNA重组片段的准备：分别以实验室已有的质粒pET28a-gshFm3、pET28a-ppkjt为模板，以Table1中所对应的上下游引物进行扩增。反应体系同上，反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s；60℃退火30s；72℃延伸5min，共30个循环；结束后，72℃终延伸10min。以上述相同方法对产物进行回收。
将线性化载体与目的片段按浓度比1:3混合，加水补齐至10μl，在向其中加入10μl的HB-infusion，于50℃连接30-40min，随后转化至BL21(DE3)感受态细胞，涂布与LB平板上(含50μg/ml的Kanamycin)，筛选出阳性转化子，并分别提取出重组质粒，送上海杰李生物技术有限公司测序验证。
实施例2.组装体蛋白表达量优化的重组表达质粒以及工程菌的构建
在同一个质粒中插入不同的基因拷贝数以及通过启动子或者RBS调控组装体蛋白的表达量，通过同源重组的方式构建五种不同的质粒，将质粒分别转入BL21(DE3)。具体的引物序列见表1，序列送上海生物工程有限公司合成。
线性化载体的准备：以pET28a为模板，分别以pET28a-F和pET28a-R为上下游引物，进行PCR扩增。反应体系为：模板2μl；PrimerSTAR Max 25μl；正反向引物各20mM；加无菌水至总体积为50μl。反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s；60℃退火30s；72℃延伸4min，共30个循环；结束后，72℃终延伸10min。扩增得到的产物经核酸电泳跑胶验证后通过PCR Purification Kit试剂盒纯化，随后通过DpnI消化模板质粒。
DNA重组片段的准备：分别以已经构建的质粒pET28a-spycgshFm3、pET28a-ppkjtspyt为模板，以Table2中所对应的上下游引物进行扩增。反应体系同上，反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s；60℃退火30s；72℃延伸5min，共30个循环；结束后，72℃终延伸10min。以上述相同方法对产物进行回收。
将线性化载体与目的片段按浓度比1:3混合，加水补齐至10μl，在向其中加入10μl的HB-infusion，于50℃连接30-40min，随后转化至BL21(DE3)感受态细胞，涂布与LB平板上(含50μg/ml的Kanamycin)，筛选出阳性转化子，并分别提取出重组质粒，送上海杰李生物技术有限公司测序验证。
实施例3.CM3与JTT胞内自组装以及ATP再生的验证
ATP是GSH生产过程中必不可少的辅因子，因此ATP的再生是降低GSH生产成本的一个重要因素。多聚磷酸激酶PPK可利用多聚磷酸(PolyP)与ADP为底物实现ATP的高效再生。相比于单酶催化，在生物体内通过将参与代谢途径的几个酶聚合在一起形成多酶复合物能够提高中间物传递和辅因子再生等效率，同时还能够降低产物的反馈抑制等因此将GshF与PPK胞内偶联从而解决全细胞催化合成GSH过程中ATP再生的问题。在本研究中希望通过SpyCatcher和SpyTag能够实现双酶胞内自组装并用于ATP的再生。结果如图1A、B所示，在重组大肠杆菌中通过一个质粒同时过表达CM3与JTT会出现一条大分子量的条带，蛋白大小与CM3和JTT的总的分子量相符合，只是过表达M3与JT时没有大分子量的蛋白出现，证明通过对SpyCatcher/SpyTag能够实现GshF与PPK的胞内自组装。并且在全细胞催化过程中不添加ATP，添加1mM的ADP用于ATP的再生。由图1C所示，在添加20mM氨基酸的条件下1h可以生产13.7mM的GSH，证明GshF与PPK胞内自组装以后可以有效的用于GSH的合成。
实施例4.组装体表达的优化
为了提高全细胞催化的效率，对MECs的表达量进行了优化(图2A)。不同的组合以及不同的调控方式对多酶复合物的表达量有着较大的影响，由SDS-PAGE(图2B)可知，在相同条件下CRT的多酶复合物的表达量最高，而CT和CRCRT的JTT以及CM3表达量较高，通过全细胞催化的方式进一步比较不同重组菌的催化生产GSH的效率，实验结果如图2C所示，在相同的OD条件下CRT的全细胞催化效率最高，在30min时GSH的产量达到了15mM。虽然在相同的时间内CRCRT与CRT全细胞催化的效率没有太大差异，但是CRCRT的CM3表达量较高，组装体蛋白的表达量较低，因此选取CRT进行全细胞催化的重复利用验证。
实施例5.全细胞催化重复利用的验证
全细胞催化具有很多的优势，但是细胞的重复利用是限制细胞利用效率的一个重要因素，我们希望CM3与JTT在胞内自组装形成大分子蛋白以后可以随着细胞一同被离心回收从而能够增加细胞的使用次数提高细胞的利用效率。以共表达M3与JT但是没有组装的M3-JT为对照，全细胞催化生产GSH并且直接离心回收细胞再次利用，氨基酸底物的添加量为20mM。实验结果如图3所示，对照组在使用三次以后GSH和GSSG的总得率只有第一次总产量的36％，而CRT使用8次以后GSH和GSSG的总得率仍然有初始的76.6％，验证了细胞重复利用的可行性。
实施例6.全细胞催化生产GSH以及细胞的重复利用
由实施案例5可知构建的CRT可以有效的实现细胞的重复利用，因此将L-半胱氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸的浓度提高到120mM，实验结果如图4所示。将底物浓度增加到120mM时，在2h时GSH的最高产量能够达到102.6mM(31.5g/L)，同时产生6.7mM的氧化型谷胱甘肽，总得率96.7％，使用八次以后2h谷胱甘肽的产量仍然有73.5mM，氧化型谷胱甘肽8.4mM，总得率75.2％。实验结果证明双功能谷胱甘肽合成酶与多聚磷酸激酶实现胞内自组装后可以有效的实现GSH的高效生产，并且组装后可以有效的提高细胞使用次数。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用
<130> /
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> artificial synthesis
<400> 1
Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser
1 5 10 15
Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser
20 25 30
Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu
35 40 45
Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln
50 55 60
Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr
65 70 75 80
Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val
85 90 95
Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp
100 105 110
Ala His Ile Asp
115
<210> 2
<211> 751
<212> PRT
<213> artificial synthesis
<400> 2
Met Met Thr Ile Asn Gln Leu Leu Gln Lys Leu Asp Thr Ala Ser Pro
1 5 10 15
Ile Leu Gln Ala Thr Phe Gly Leu Glu Arg Glu Asn Leu Arg Val Thr
20 25 30
Thr Asp Gly His Leu Ala Gln Thr Ala His Pro Ser Gln Leu Gly Ser
35 40 45
Arg Asn Phe His Pro Tyr Ile Gln Thr Asp Phe Ser Glu Gln Gln Leu
50 55 60
Glu Leu Ile Thr Pro Ile Ala His Ser Thr Lys Glu Ala Arg Arg Leu
65 70 75 80
Leu Gly Ala Ile Ser Asp Val Ala Gly Arg Ser Ile Pro Gln Asn Glu
85 90 95
Arg Leu Trp Pro Met Ser Met Pro Pro Gln Leu Thr Glu Glu Glu Ile
100 105 110
Ala Ile Ala His Leu Glu Asn Asp Tyr Glu Arg His Tyr Arg Glu Gly
115 120 125
Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Lys Lys Lys Gln Ala Ile Ser Gly Ile His
130 135 140
Tyr Asn Met Glu Leu Gly Lys Asp Leu Val Thr Ser Leu Phe Gln Val
145 150 155 160
Ser Ser Tyr His Ser Leu Lys Asp Phe Lys Asn Asp Leu Tyr Leu Lys
165 170 175
Leu Ala Arg Asn Phe Leu Arg Phe Arg Trp Ile Leu Thr Tyr Leu Tyr
180 185 190
Gly Ala Ala Pro Trp Ala Glu Ala Gly Phe Tyr Ser Gln Glu Ile Ser
195 200 205
Gln Pro Ile Arg Ser Phe Arg Asn Ser Asp Tyr Gly Tyr Val Asn Asp
210 215 220
Glu Asn Ile Gln Val Ser Tyr Ala Ser Leu Glu Gln Tyr Ile Thr Asp
225 230 235 240
Ile Glu Asn Tyr Val Gln Ser Gly Glu Leu Ser Ala Glu Lys Glu Phe
245 250 255
Tyr Ser Ala Val Arg Phe Arg Gly Gln Lys His Asn His Ala Tyr Leu
260 265 270
Glu Gln Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Phe Arg Cys Phe Asp Leu Asn Pro
275 280 285
Phe Asp His Leu Gly Ile Ser Gln Glu Thr Leu Asp Thr Val His Leu
290 295 300
Phe Leu Leu Ser Leu Leu Trp Leu Asp Asp Val Glu Asn Val Asp Thr
305 310 315 320
Ala Leu Lys Ala Ala His Asp Leu Asn Gln Lys Ile Ala Cys Ser His
325 330 335
Pro Leu Thr Ala Leu Pro Asp Glu Ala Asp Ser Ser Ala Leu Leu Gln
340 345 350
Ala Met Glu Glu Leu Ile Gln His Phe Glu Leu Pro Thr Tyr Tyr Gln
355 360 365
Thr Leu Leu Gln Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asn Pro Gln Leu Thr
370 375 380
Leu Ser Gly Gln Leu Leu Pro His Ile Gln Gln Asp Ser Leu Met Ala
385 390 395 400
Phe Gly Leu Glu Lys Ala Glu Glu Tyr His Arg Tyr Ala Trp Thr Ala
405 410 415
Pro Tyr Ala Leu Lys Gly Tyr Glu Asn Met Glu Leu Ser Thr Gln Met
420 425 430
Leu Leu Phe Asp Ala Ile Gln Lys Gly Ile His Phe Glu Ile Leu Asp
435 440 445
Glu Gln Asp Gln Phe Leu Lys Leu Trp His Gln Asp His Val Glu Tyr
450 455 460
Val Lys Asn Gly Asn Met Thr Ser Lys Asp Asn Tyr Val Val Pro Leu
465 470 475 480
Ala Met Ala Asn Lys Thr Val Thr Lys Lys Ile Leu Ala Asp Ala Gly
485 490 495
Phe Pro Val Pro Ser Gly Asp Glu Phe Thr Ser Leu Glu Glu Gly Leu
500 505 510
Ala Tyr Tyr Pro Leu Ile Lys Asp Lys Gln Ile Val Val Lys Pro Lys
515 520 525
Ser Thr Asn Phe Gly Leu Gly Ile Ser Ile Phe Gln Glu Pro Ala Ser
530 535 540
Leu Glu Ser Tyr Arg Lys Ala Leu Glu Ile Ala Phe Ser Glu Asp Ala
545 550 555 560
Ala Val Leu Val Glu Glu Phe Ile Ala Gly Thr Glu Tyr Arg Phe Phe
565 570 575
Val Leu Asp Gly Gln Cys Glu Ala Val Leu Leu Arg Val Ala Ala Asn
580 585 590
Val Val Gly Asp Gly Gln His Thr Val Arg Glu Leu Val Ala Ile Lys
595 600 605
Asn Asp Asn Pro Leu Arg Gly Arg Asp His Arg Ser Pro Leu Glu Ile
610 615 620
Ile Glu Leu Gly Asp Ile Glu Leu Leu Met Leu Asp Gln Gln Gly Tyr
625 630 635 640
Gly Pro Asp Asp Ile Leu Pro Asp Gly Val Lys Val Asp Leu Arg Arg
645 650 655
Asn Ser Asn Ile Ser Thr Gly Gly Asp Ser Ile Asp Val Thr Asp Ser
660 665 670
Met His Pro Ser Tyr Lys Glu Leu Ala Ala Asp Met Ala Lys Ala Met
675 680 685
Gly Ala Trp Ala Cys Gly Val Asp Leu Ile Ile Pro Asp Ser Ser Ala
690 695 700
Ile Ser Thr Lys Glu Asn Pro Asn Cys Thr Cys Ile Glu Leu Asn Phe
705 710 715 720
Asn Pro Ser Met Tyr Met His Thr Tyr Cys Ala Glu Gly Pro Gly Gln
725 730 735
Ser Ile Thr Pro Lys Ile Leu Ala Lys Leu Phe Pro Glu Met Asp
740 745 750
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> artificial synthesis
<400> 3
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 341
<212> PRT
<213> Jhaorihella thermophile
<400> 4
Met Ala Gly Pro Ser Ala Glu Thr Val Lys Pro Glu Asp Asp Lys Ile
1 5 10 15
Val Pro Val Thr Pro Thr Glu Val Asn Gly Ser Lys Pro Lys Gly Glu
20 25 30
Ser Ala Asn Lys Thr Ala Ala Ala Lys Ala Arg Thr Ala Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Lys Lys Ser Asp Glu Glu Pro Lys Pro Ser Lys Glu Phe Val Arg
50 55 60
Glu Ala Phe Glu Asn Gly Val Tyr Pro Tyr Lys Lys Lys Met Gly Arg
65 70 75 80
Arg Glu Tyr Glu Ala Glu Lys Ala Lys Leu Gln Ala Glu Leu Leu Lys
85 90 95
Val Gln Leu Trp Ala Gln Glu Thr Gly Gln Lys Phe Val Leu Leu Phe
100 105 110
Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Met
115 120 125
Glu His Leu Asn Pro Arg Thr Ala Arg Val Val Ala Leu Asn Lys Pro
130 135 140
Thr Asp Glu Glu Arg Gly Gln Trp Phe Phe Gln Arg Tyr Ile Thr His
145 150 155 160
Leu Pro Thr Ser Gly Glu Met Val Phe Tyr Asp Arg Ser Trp Tyr Asn
165 170 175
Arg Ala Gly Val Glu Arg Val Met Gly Phe Cys Lys Pro Thr Glu Tyr
180 185 190
Leu Glu Phe Met Arg Glu Thr Pro Glu Leu Glu Arg Met Leu Val Arg
195 200 205
Ser Gly Ile Arg Leu Tyr Lys Tyr Trp Phe Ser Val Thr Arg Asp Glu
210 215 220
Gln Leu Arg Arg Phe Lys Ser Arg Glu Thr Asp Pro Leu Lys Gln Trp
225 230 235 240
Lys Leu Ser Pro Ile Asp Lys Ala Ser Leu Asp Lys Trp Asp Asp Tyr
245 250 255
Thr Glu Ala Lys Glu Ala Met Phe Phe Tyr Thr Asp Thr Ala Asp Ala
260 265 270
Pro Trp Thr Ile Ile Lys Ser Asn Asp Lys Lys Arg Ala Arg Ile Asn
275 280 285
Cys Met Lys His Phe Leu Ala Ser Leu Asp Tyr Pro Asp Lys Asp Glu
290 295 300
Glu Val Val Gly Gln Pro Asp Pro Leu Ile Val Gly Gln Ala His His
305 310 315 320
Val Ile His Arg Ala Asp His Ile Leu Gly Ala Ala Leu His Pro Asp
325 330 335
Gln Arg Leu Asn Arg
340
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cctggtgccg cgcggcagcc atatggctat ggttgacact ttaag 45
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggtgctcgag tgcggccgca agcttcgagc caccgccacc cgagc 45
<210> 7
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccact gagatccggc tgcta 55
<210> 8
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
catatggctg ccgcgcggca ccaggccgct gctgtgatga tgatgatgat ggctg 55
<210> 9
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gtttccggaa atggactaaa agctttttgt ttaactttaa gaaggagata t 51
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ggtggtggtg ctcgagtgcg gccgcttact tcgtcggctt gtaggcgtcc a 51
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cactgagatc cggctgcta 49
<210> 12
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
aagcttttag tccatttccg gaaacagctt tgccagaatt ttaggggta 49
<210> 13
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
aagctgtttc cggaaatgga ctaaaagctt taatacgact cactataggg ga 52
<210> 14
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
attgcttctt aaagttaaac aaaaagcttt tagtccattt ccggaaacag ctttg 55
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
gtttccggaa atggactaaa agctttaata cgactcacta taggggaatt g 51
<210> 16
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
cctatagtga gtcgtattaa agcttttagt ccatttccgg aaacagcttt g 51
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg 30

Claims (7)

1.一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌，其特征在于，在双功能谷胱甘肽合成酶GshF的N端和多聚磷酸激酶PPK的C端分别连接SpyCatcher和SpyTag，将修饰过的两个基因片段同时整合到同一个质粒载体上，转化获得重组大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌，其特征在于，所述SpyCatcher通过柔性linker连在GshF的N端，所述SpyTag通过柔性linker连在PPK的C端，所述柔性linker序列如SEQ ID NO.17所示。
3.权利要求1—2任一所述用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌在合成谷胱甘肽中的应用。
4.一种利用重组大肠杆菌合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，利用权利要求1—2任一所述重组大肠杆菌，在温度为30-45℃，pH为6.5-8.0的条件下催化合成谷胱甘肽。
5.根据权利要求4所述的一种利用重组大肠杆菌合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，催化反应的底物为L-谷氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、甘氨酸、六偏磷酸钠、ADP和镁离子盐。
6.根据权利要求5所述的一种利用重组大肠杆菌合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，催化反应的底物浓度为L-谷氨酸20-120mM、L-半胱氨酸盐酸盐20-120mM、甘氨酸20-120mM、六偏磷酸钠20-100mM、ADP 1-3mM、镁离子盐20-100mM。
7.根据权利要求4所述的一种利用重组大肠杆菌合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，利用重组大肠杆菌的全细胞或者粗酶液进行催化反应，反应结束后通过离心或膜过滤的方式回收细胞或多酶复合物重复利用。
CN202010177473.4A 2020-03-13 2020-03-13 一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用 Active CN113388559B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010177473.4A CN113388559B (zh) 2020-03-13 2020-03-13 一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010177473.4A CN113388559B (zh) 2020-03-13 2020-03-13 一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113388559A true CN113388559A (zh) 2021-09-14
CN113388559B CN113388559B (zh) 2022-11-15

Family

ID=77616236

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010177473.4A Active CN113388559B (zh) 2020-03-13 2020-03-13 一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113388559B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114774450A (zh) * 2022-04-29 2022-07-22 中山大学 高效合成酪醇的重组大肠杆菌
CN114836447A (zh) * 2022-04-29 2022-08-02 中山大学 一种重组大肠杆菌催化合成莱鲍迪苷d的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105838704A (zh) * 2016-05-16 2016-08-10 南京工业大学 一种纳米纤维生物膜固定化双酶系统及其催化合成海藻糖的方法
WO2018228247A1 (zh) * 2017-06-15 2018-12-20 安徽古特生物科技有限公司 一种利用腺苷代替atp进行酶促反应的生产方法
CN110387379A (zh) * 2019-07-16 2019-10-29 大连医诺生物股份有限公司 一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105838704A (zh) * 2016-05-16 2016-08-10 南京工业大学 一种纳米纤维生物膜固定化双酶系统及其催化合成海藻糖的方法
WO2018228247A1 (zh) * 2017-06-15 2018-12-20 安徽古特生物科技有限公司 一种利用腺苷代替atp进行酶促反应的生产方法
CN110387379A (zh) * 2019-07-16 2019-10-29 大连医诺生物股份有限公司 一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIANG YIN等: ""Self-Assembled Multimeric-Enzyme Nanoreactor for Robust and Efficient Biocatalysis"", 《ACS BIOMATER SCI ENG》 *
XIANGWEI CUI等: ""Programming Integrative Multienzyme Systems and Ionic Strength For Recyclable Synthesis of Glutathione"", 《J. AGRIC. FOOD CHEM.》 *
ZHANG XING等: ""Engineering of supramolecular nanoreactors for ATP regeneration and recycling in glutathione biosynthesis"", 《第十二届中国酶工程学术研讨会》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114774450A (zh) * 2022-04-29 2022-07-22 中山大学 高效合成酪醇的重组大肠杆菌
CN114836447A (zh) * 2022-04-29 2022-08-02 中山大学 一种重组大肠杆菌催化合成莱鲍迪苷d的方法
CN114774450B (zh) * 2022-04-29 2024-04-16 中山大学 高效合成酪醇的重组大肠杆菌
CN114836447B (zh) * 2022-04-29 2024-05-07 中山大学 一种重组大肠杆菌催化合成莱鲍迪苷d的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113388559B (zh) 2022-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111254129B (zh) 一种多聚磷酸激酶突变体及其应用
CN110791493B (zh) 一种天冬氨酸氨裂合酶突变体及其应用
CN112795606B (zh) 一种β-烟酰胺单核苷酸的酶催化合成方法
CN112280755B (zh) 一种突变酶及其应用和酶催化法制备三胜肽的工艺
CN113388559B (zh) 一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用
JP2020504615A (ja) 新規無機リン酸ベースエネルギー再生機能を備えた無細胞発現系
CN113186142A (zh) 一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
WO2018090288A1 (zh) 一种高效合成α-氨基丁酸的单细胞工厂及其构建与应用
KR20080039879A (ko) Pdi를 융합파트너로 이용한 수용성 및 활성형 재조합단백질의 제조방법
CN112980906B (zh) 一种用于制备β-烟酰胺单核苷酸的酶组合物及其应用
CN110499301A (zh) 一种催化效率提高的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体
CN107881159B (zh) 一种提高d-氨基酸氧化酶可溶性异源表达的方法
CN113462678A (zh) 一种谷氨酸脱羧酶突变体
CN105349557B (zh) 一种苹果酸酶基因rkme2及其重组表达载体
CN108977455B (zh) 用于生产草酸脱羧酶的重组质粒、大肠杆菌表达系统及方法和应用
MX2013014939A (es) Metodos para producir carbamoil fosfato y urea.
CN115896081A (zh) 天冬氨酸酶突变体及其应用
JP2010512741A (ja) 新規ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及びｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法
CN106459940B (zh) 新型过氧化氢酶信号序列及利用其的过氧化氢酶表达方法
CN115704045A (zh) 一种生产单细胞蛋白的方法及碳固定系统
CA3136639A1 (en) Systems, methods and compositions for recombinant in vitro transcription and translation utilizing thermophilic proteins
CN114934037B (zh) 用于生产3-氨基丙腈的天冬氨酸酶突变体
EP1231266B1 (en) Arabidopsis-origin gdp-4-keto-6-deoxy-d-mannose-3,5-epimerase-4-reductase gene
CN115786296B (zh) 一种内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体及生产方法
CN113764040B (zh) 包含重组氢氧化细菌的碳固定系统及合成目标产物的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant