CN114836447B - 一种重组大肠杆菌催化合成莱鲍迪苷d的方法 - Google Patents

一种重组大肠杆菌催化合成莱鲍迪苷d的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组大肠杆菌催化合成莱鲍迪苷D的方法，本发明利用Spy/Snoop系统，实现了重组大肠杆菌的构建，既可以使糖基转移酶和蔗糖合成酶酶形成复合体，从而增加酶的局部浓度，提高催化效率；也可以利用Spy/Snoop环化使环化酶成为耐热酶。当采用全细胞催化时，能通过热处理以增加细胞的通透性，从而提高催化效率。当采用无细胞合成时，通过简单的热处理纯化酶，以增加抽提液中目标酶的浓度，提高催化效率。可用于高效催化RA转化成RD，为RD的生产提供了一条新途径；为大规模生产奠定了基础。

Description

一种重组大肠杆菌催化合成莱鲍迪苷D的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌催化合成莱鲍迪苷D的方法。
背景技术
甜菊糖(Steviol glycosides)是从甜叶菊(Stevia rehaudiana)叶片中提取分离得到的一类甜菊糖苷类化合物，具有高甜度、低热量、无毒、耐高温、耐酸碱和水溶性好的有点，是新一代的天然甜味剂，受到了学界和产业界的广泛关注。甜叶菊中含量相对丰富的甜菊苷(Stevioside)和莱鲍迪苷A(简称RA)等已广泛应用于饮料、食品、调味剂、酒类、乳制品等食品加工领域。但甜菊苷和RA具有明显的后苦味和甘草味，口感上尚不能完全替代蔗糖。而甜叶菊中含量相对少的莱鲍迪苷D(简称RD)却没有苦味、而且具有更高的甜度(RD、RA和甜菊苷的甜度分别是蔗糖的221倍、200倍和210倍)。因此，RD具有更好的口感和更高的甜度，是甜菊糖苷类甜味剂开发的新方向。
前人报道了双酶催化体系(图1)，催化RA合成RD。利用含糖基转移酶和蔗糖合酶的重组微生物进行全细胞或者细胞粗提液催化RA合成RD(ZL201710875197.7,CN201811148647.3,Food Chemistry 259(2018)286-291)。但是文献所构建的工程菌表达的外源酶在细胞质、细胞粗提液催化反应液中都是高度分散的，导致酶局部浓度很低，从而影响酶的催化效率。实际上，生物体的天然代谢过程由多种酶协同完成，胞内酶往往形成多酶复合体，催化反应高度有序，从而提高其催化效率。因此，如能形成对酶复合体，便能模仿天然代谢途径，提高整体反应效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以形成对酶复合体，便能模仿天然代谢途径的催化RA合成RD的重组菌。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种基因表达模块，所述基因表达模块包含：糖基转移酶基因和蔗糖合成酶基因；其特征在于，
(a)所述表达模块还包含Spy/Snoop；或
(b)所述糖基转移酶和蔗糖合成酶均为Spy/Snoop环化。
在本发明的一些实施方式中，所述糖基转移酶为水稻OsEUGT11(GenBank:XP_015629141.1)、番茄SIUGTL2(GenBank:XP_004250485.1)或马铃薯StUGT(GenBank:XP_006367681.1)。
在本发明的一些实施方式中，所述蔗糖合成酶为拟南芥AtSUS3(GenBank:NP_192137.1)或马铃薯StSUS1(GenBank:AAA333841.1)。
在本发明的一些实施方式中，所述Spy为SpyTag/SpyCatcher；所述Snoop为SnoopTag/SnoopCatcher；具体为将糖基转移酶和蔗糖合成酶分别与SpyTag/SpyCatcher或SnoopTag/SnoopCatcher进行融合表达。
在本发明的一些实施方式中，所述融合表达可以是在酶的N端，也可以是在酶的C端或酶的N端；优选为SpyTag或SnoopTag连接到蔗糖合酶的N端；SpyCatcher或SnoopCatcher连接到糖基转移酶的C端。
在本发明的一些实施方式中，
SpyTag：AHIVMVDAYKPTK；
SnoopTag：KLGDIEFIKVNK；
SpyCatcher：GDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNG；
SnoopCatcher：KPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQDIPATYEFTNGKHYITNEPIPPK。
本发明的第二方面，提供一种重组载体，包含本发明第一方面所述的基因表达模块。
在本发明的一些实施方式中，所述载体为pZEABP、pZEABP、pZACBP、pZSABP或任何本领域常用的大肠杆菌表达载体。
本发明的第三方面，提供一种重组菌，包含本发明第一方面所述的基因表达模块或本发明第二方面所述的重组载体。
在本发明的一些实施方式中，所述菌为大肠杆菌、酵母菌或枯草芽孢杆菌。
采用(a)构建的重组大肠杆菌，通过Spy或Snoop系统，使2个酶形成复合体，从而增加酶的局部浓度，提高催化效率。
利用(b)构建的重组大肠杆菌进行全细胞催化时，使环化酶成为耐热酶。当采用全细胞催化时，能通过热处理以增加细胞的通透性，从而提高催化效率。当采用无细胞合成时，通过简单的热处理纯化酶，以增加抽提液中目标酶的浓度，提高催化效率。
本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述的基因表达模块或本发明第二方面所述的重组载体或本发明第三方面所述的重组菌在制备莱鲍迪苷D中的应用。
本发明的第五方面，提供一种制备莱鲍迪苷D的方法，以莱鲍迪苷A为底物，以本发明第三方面的重组菌催化制备莱鲍迪苷D。
在本发明的一些实施方式中，所述催化体系为全细胞催化体系或无细胞催化体系。
在本发明的一些实施方式中，所述全细胞催化体系为：50～70mmol/L柠檬酸三钠、0.05～0.2mmol/L ZnCl2、0.5～2％二甲苯、30～50g/L蔗糖、0.5～3g/L RA，菌体浓度OD600为80～120；pH为7.5～8.5。
在本发明的一些实施方式中，所述反应条件为35～45℃、150～250rpm下反应20～28h。
在本发明的一些实施方式中，所述无细胞催化体系为：0.05～0.2mmol/L ZnCl2、80～120g/L蔗糖、0.5～3g/L RA、5～15mg/mL重组菌蛋白抽提液。
在本发明的一些实施方式中，所述反应条件为：35～45℃、20～28h。
在本发明的一些实施方式中，在催化之前先对重组菌进行热处理有利于RD的合成；热处理条件为：38～45℃热处理30～40min。然后冷冻离心收集菌体进行催化处理。
本发明的有益效果是：
本发明利用Spy/Snoopy系统，实现了重组大肠杆菌的构建，既可以使糖基转移酶和蔗糖合成酶酶形成复合体，从而增加酶的局部浓度，提高催化效率；也可以利用Spy/Snoopy环化使环化酶成为耐热酶。当采用全细胞催化时，能通过热处理以增加细胞的通透性，从而提高催化效率。当采用无细胞合成时，通过简单的热处理纯化酶，以增加抽提液中目标酶的浓度，提高催化效率。可用于高效催化RA转化成RD，为RD的生产提供了一条新途径；为大规模生产奠定了基础。
附图说明
图1为催化莱鲍迪苷A合成莱鲍迪苷D反应。
图2为Spy/Snoop系统形成多酶复合体：SpyTag:SpyT；SpyCatcher:SpyC；SnoopTag:SnoopT；SnoopCatcher:SnoopC。
图3为Spy/Snoop环化。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
SpyTag(或SnoopTag)/SpyCatcher(或SnoopCatcher)系统中Tag的Asp与Catchers的Lys能自发形成的异肽共价键，从而将双酶组装在一起形成多酶复合体(图2)或环化(图3)，以提高催化效率。
SpyTag：AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO.1)；
SnoopTag：KLGDIEFIKVNK(SEQ ID NO.2)；
SpyCatcher：GDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNG(SEQ ID NO.3)；
SnoopCatcher：KPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQDIPATYEFTNGKHYITNEPIPPK(SEQ ID NO.4)。
实施例1含Spy多酶复合体的重组大肠杆菌的构建及其全细胞催化合成RD
Spy融合的水稻糖基转移酶OsEUGT11(GenBank:XP_015629141.1)、拟南芥蔗糖合酶AtSUS3(GenBank:NP_192137.1)基因委托商业公司进行全基因合成AtSUS-SpyTag、SpyTag-AtSUS、AtSUS、SpyCatcher-Oseugt和Oseugt片段，NheI/KpnI酶切连接到实验室之前构建的表达载体pZEABP(Journal of Industrial Microbiology Biotechnology 42(2015)627–636)，分别得到pZEA-AtSUS-SpyTag、pZEA-SpyTag-AtSUS、pZEA-AtSUS、pZAC-SpyCatcher-Oseugt、pZAC-Oseugt。将pZEA-AtSUS-SpyTag/pZAC-SpyCatcher-Oseugt、pZEA-SpyTag-AtSUS/pZAC-SpyCatcher-Oseugt和没有Spy系统的pZEA-AtSUS/pZAC-Oseugt，共转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到含N端Spy、C端Spy和不含Spy的重组大肠杆菌。
挑取LB(1％胰蛋白胨、0.5％酵母抽提物、1％NaCl)平板上的单克隆于5mL LB液体培养基中，于37℃、200rpm培养过夜制备种子液；按2％接种量转接至50mL新鲜LB培养基中，于37℃、200rpm培养至OD600约0.8左右，转移至于30℃、200rpm培养继续培养至18h；于4℃、2800g离心15min收集菌体、并用预冷生理盐水或磷酸钠盐缓冲液洗涤；将菌体重悬至含60mmol/L柠檬酸三钠、0.1mmol/L ZnCl2、1％二甲苯、40g/L蔗糖、1g/L RA的0.1M pH 8.0磷酸钠盐缓冲液，使其菌体浓度OD600为100，于40℃、200rpm下反应24h。
反应液离心去除沉淀，上清液经0.22mm膜过滤后，进行HPLC(LC-20A，岛津)分析RD的量。色谱条件：色谱柱Inertsil ODS-SP柱(5m,4.6×150mm,GL Sciences Inc.)；梯度洗脱：0-10min、25％乙氰，10-15min、75％乙氰，15-20Min、26％乙氰；流速1mL/min；柱温40℃；检测波长205nm。
结果显示含SpyTag融合在蔗糖合酶C端的多酶复合体大肠杆菌BL21(DE3)(pZEA-AtSUS-SpyTag,pZAC-SpyCatcher-Oseugt)产0.53±0.01g/L RD，含SpyTag融合在蔗糖合酶N端的多酶复合体大肠杆菌BL21(DE3)(pZEA-SpyTag-AtSUS/pZAC-SpyCatcher-Oseugt)的RD产量进一步提高至0.62±0.03g/L RD；两者RD产量明显高于没有Spy系统的对照菌(0.43±0.02g/L RD)。由此可见，Spy形成的多酶复合体有利于RD的合成，尤其SpyTag融合在蔗糖合酶的N端效果更佳。
实施例2含Spy环化酶的重组大肠杆菌的构建及其全细胞催化合成RD
Spy环化的糖基转移酶OsEUGT11与蔗糖合酶AtSUS3融合体委托商业公司进行全基因合成SpyTag-OsEUGT11-AtSUS3-SpyCatcher片段，用BamHI/EcoRI酶切连接到pET32a表达载体上，化转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到含Spy环化酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET32a-SpyTag-OsEUGT11-AtSUS3-SpyCatcher)。
挑取LB平板上的单克隆，按实施例1的方法培养菌体、重悬至含2g/L RA催化液中，进行全细胞催化和HPLC分析测定RD产量，可产0.95±0.03g/L RD。
按实施例1的方法制备OD600为100的菌悬液，于40℃热处理35min，然后冷冻离心收集菌体；重悬至含2g/L RA催化液中，进行全细胞催化和HPLC分析测定RD产量可产1.83g/L RD。由此可见，热处理有利于RD的合成。
实施例3含Spy多酶复合体的重组大肠杆菌的无细胞合成RD
实施例1培养的细胞，于4℃、2800g离心15min收集菌体，超声波破碎(超声3s、暂停3s、总时长20min；全程冰浴)，再次冷冻离心去除细胞碎片。上清液为细胞抽提液、用Bradford法测定蛋白浓度。将细胞粗提液加入到用0.1M pH 8.0磷酸缓冲液配制的催化反应体系，使反应体系中蛋白浓度为15mg/mL。反应体系含0.1mmol/L ZnCl2、100g/L蔗糖、2g/L RA。在40℃、200rpm下反应下进行无细胞催化24h，按实施例1方法HPLC分析测定RD产量。同样证明，Spy形成的多酶复合体有利于无细胞合成RD，其RD产量由没有多酶复合体无细胞系统的0.97g/L提高到1.21-1.40g/L。
实施例4含Spy环化酶的重组大肠杆菌的无细胞合成RD
实施例2培养的细胞，冷冻离心收集菌体，超声波破碎(超声3s、暂停3s、总时长20min；全程冰浴)，再次冷冻离心去除细胞碎片。细胞粗抽提液经50℃热处理5min、离心去除沉淀；将未经热处理和热处理纯化的粗抽提液加入用0.1M pH 8.0磷酸缓冲液配制的催化反应体系，反应体系含0.1mmol/L ZnCl2、100g/L蔗糖、1g/L RA、10mg蛋白/mL抽提液。进行无细胞催化24h，按实施例1的方法HPLC分析测定RD产量。热处理纯化RD产量(0.78±0.25g/L)明显高于未热处理纯化的(0.70±0.26g/L)。
除了本实施例提及的方式外，相应酶还可以用其它表达载体进行表达，也可以整合到大肠杆菌染色体上进行表达。而且Spy可以替换为Spooy，仍可以达到同样的效果。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种重组大肠杆菌催化合成莱鲍迪苷D的方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> SpyTag
<400> 1
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> SnoopTag
<400> 2
Lys Leu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 84
<212> PRT
<213> SpyCatcher
<400> 3
Gly Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly
1 5 10 15
Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys
20 25 30
Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu
35 40 45
Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr
50 55 60
Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val
65 70 75 80
Thr Val Asn Gly
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> SnoopCatcher
<400> 4
Lys Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp
1 5 10 15
Tyr Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asn
20 25 30
Val Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Lys Asn Leu Ser Asp
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Ser Glu Pro Ala Gly Tyr Lys Pro
50 55 60
Val Gln Asn Lys Pro Ile Val Ala Phe Gln Ile Val Asn Gly Glu Val
65 70 75 80
Arg Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln Asp Ile Pro Ala Thr Tyr Glu
85 90 95
Phe Thr Asn Gly Lys His Tyr Ile Thr Asn Glu Pro Ile Pro Pro Lys
100 105 110

Claims (10)

1.一种基因表达模块，所述基因表达模块包含：糖基转移酶基因和蔗糖合成酶基因；所述糖基转移酶为水稻OsEUGT11，所述蔗糖合成酶为拟南芥AtSUS3；其特征在于，
（a）所述基因表达模块还包含Spy，所述基因表达模块分别由AtSUS3-SpyTag和SpyCatcher-OsEUGT11组成；或，分别由SpyTag-AtSUS3和SpyCatcher-OsEUGT11组成；或
（b）所述糖基转移酶基因和蔗糖合成酶基因均为Spy环化，所述基因表达模块的序列由SpyTag-OsEUGT11-AtSUS3-SpyCatcher依次组成；
所述SpyTag的序列如SEQ ID NO.1所示，所述SpyCatcher的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种重组载体，包含权利要求1所述的基因表达模块。
3.一种重组菌，包含权利要求1所述的基因表达模块或权利要求2所述的重组载体。
4.权利要求3所述的重组菌在制备莱鲍迪苷D中的应用。
5.一种催化剂，包含权利要求3所述的重组菌。
6.一种制备莱鲍迪苷D的方法，其特征在于，以莱鲍迪苷A为底物，通过权利要3所述的重组菌催化制备莱鲍迪苷D，所述催化为全细胞催化或无细胞催化。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化体系为：50～70mmol/L柠檬酸三钠、0.05～0.2 mmol/L ZnCl2、0.5～2%二甲苯、30～50g/L蔗糖、0.5～3 g/L RA的0.1M pH 8.0磷酸钠盐缓冲液，菌体浓度OD600为80～120或0.1～0.3g/ml菌体；pH为7.5~8.5。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化体系的反应条件为35～45℃、150～250 rpm下反应20～28 h。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述无细胞催化体系为：0.05～0.2 mmol/L ZnCl2、80～120 g/L蔗糖、0.5～3 g/L RA、5～20 mg/mL重组菌蛋白抽提液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述无细胞催化体系的反应条件为35～45℃下反应20～28 h。
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Citations (7)

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