WO2015021690A1 - 一种酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 - Google Patents

一种酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 Download PDF

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李国庆
梁晓亮
李⋅托马斯
叶⋅格雷戈瑞
陶⋅安德鲁
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苏州汉酶生物技术有限公司
百事可乐公司
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the invention relates to a preparation method of rebaudioside M, in particular to a biological preparation method of rebaudioside M.
  • Sweeteners are a class of food additives widely used in the production of food, beverages and confectionery. It can be added either during the production of food or as a substitute for sucrose by proper dilution during home baking.
  • Sweeteners include natural sweeteners and artificial sweeteners, such as sucrose, high fructose corn syrup, honey, and the like, such as aspartame, saccharin, and the like.
  • Stevioside is a kind of natural sweetener extracted from plant stevia and has been widely used in foods and beverages.
  • the extract of Stevia contains a variety of steviosides including rebaudioside, and the naturally-derived stevioside has a large difference in batch composition and requires subsequent purification.
  • Rebaudio A contains some other steviosides such as Rebaudioside C, D and F.
  • the stevioside prepared by the extraction method is usually mixed with some impurities, which may have a certain influence on its use.
  • Rebaudioside M has an advantage over Rebaudioside A, but its content in stevia leaves is extremely low and is only detected in the stevia Morita plant brown (20) 0, J, Appl. Glycosci., 57, 199-209). There is currently no commercial production of Rebaudio M.
  • the technical problem to be solved by the present invention is to overcome the deficiencies of the prior art and provide a method for preparing rebaudioside M by enzymatic method, which can produce high purity rebaudioside at a low cost and in a short cycle. M product.
  • the present invention adopts the following technical scheme: A method for preparing rebaudioside M by enzymatic method, which uses Rebaudioside A or Rebaudioside D as a substrate to make a substrate in glucose In the presence of a basal donor, it is catalyzed by UDP-glucanosyl alcohol and/or recombinant cells containing UDP-glucosyltransferase to produce rebaudioside M.
  • the glucose-based donor may be UDP-glycoside or a UDP-glucose regeneration system consisting of sucrose, sucrose synthase and UDP (2007, FEBS Letters' 581, 2562-2566), and preferably by sucrose, sucrose
  • the UDP-glucose regeneration system consisting of synthetase and UDP has a higher UDP glucose price, and the UDP-glycan regeneration system can greatly reduce the cost.
  • UDP-glucosyltransferase i.e., ubiquitinuclease-transferase, abbreviated as UGT
  • UGT ubiquitinuclease-transferase
  • the UDP-glucosyltransferase used in the present invention is UGTA and Z from Stevia rebaudkma or UG B from rice (Oryza sativa).
  • the amino acid sequence of UG A may be at least 60% identical to Sequence 2.
  • the amino acid sequence of UGT-A has at least 70% identity to sequence 2.
  • the amino acid sequence of UG ⁇ C-A has at least 80% identity with Sequence 2.
  • the amino acid sequence of UG A has at least 90% identity to sequence 2.
  • the amino acid sequence of UG A is identical to that of sequence 2.
  • the amino acid sequence of UGT-B can be at least 60% identical to sequence 4. More preferably, the amino acid sequence of UGT-B has at least 70% identity to sequence 4. Further preferably, the amino acid sequence of UGI-B is at least 80% identical to SEQ ID NO:4. Most preferably, the amino acid sequence of UGT-B has at least 90% of sequence 4. Consistency. According to a specific aspect, the amino acid sequence of UGX-B is identical to that of sequence 4.
  • the reaction can be carried out in an aqueous phase system having a temperature of from 4 ° C to 50 ° C and a pH of 5.0 9.0.
  • the reaction is carried out in an aqueous phase system having a temperature of 25 Torr to 35 Torr and a pH of 6.5 to 7.5.
  • reaction is allowed to proceed at a temperature of 30 TTF.
  • reaction is carried out at a pH of 7,0.
  • the reaction is carried out in a phosphate buffer of pH 7.0.
  • the reaction when catalysis is carried out using a recombinant cell containing UDP-glucosyltransferase, the reaction can be carried out in the presence of a cell penetrating agent.
  • the cell penetrating agent is toluene, and the volume ratio of the whole reaction system may be from 3% to 3%. More preferably, the volume ratio of toluene is 2%.
  • the recombinant cell may preferably be a microbial cell, wherein the microorganism may and preferably is Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris.
  • the preparation method is carried out as follows; all the raw materials used in the reaction are added to the reaction vessel, mixed uniformly, and placed at a set temperature, and the reaction is stirred. After the reaction is completed, the Rebaudio ⁇ product that meets the requirements for use can be obtained by purification treatment.
  • a specific purification method is post-treatment including resin separation, according to which a rebaudioside product having a purity of up to 95% can be obtained.
  • the substrate is rebaudioside A
  • the UDP-glucosyltransferase is a mixture of UGT ⁇ A from Stevia and UGB from rice, and the amino acid sequence and sequence of UGT ⁇ A from Stevia 2 has at least 80% identity
  • the amino acid sequence of UGT-B from rice has at least 80% identity to sequence 4.
  • the weight ratio of UG' A from stevia to UG' B from rice is 1: 0.8 ⁇ 1, 2, for example, the weight ratio of the two may be i:i.
  • the substrate is Rebaudioside D
  • the UDP-glucosyltransferase is UG' A from Stevia
  • the amino acid sequence of UG' A from Stevia has at least 80% consistency.
  • the present invention has the following advantages compared with the prior art:
  • the method for preparing rebaudioside M by enzymatic method provided by the invention has important application value. Since the growth rate of microorganisms is much faster than that of plants, the preparation method according to the present invention can greatly reduce the production cost, shorten the production cycle, and greatly improve the competitiveness of the product. In addition, the stevia content in plants is low, and there are many different structures of stevioside, it is difficult to extract a relatively pure product, and the enzymatic synthesis method of the present invention can provide a product with higher purity, which will be further expanded. Application Fan I. Compared with the technology that has extracted Rebaudio M from Stevia, this product has higher productivity, lower cost, and can provide higher purity products.
  • Rebaudi ⁇ A, ⁇ L ⁇ M are referred to as Reb A, Reb D il il leb M: respectively, the structural formula of the person is referred to the formula ⁇ , ⁇ and ffl.
  • the invention mainly provides four routes for synthesizing Reb M:
  • the UGT-A or UG B of ffi may be present in the form of an enzyme jelly or present in recombinant cells.
  • the method of obtaining UGT-A or ⁇ is as follows:
  • Recombinant Escherichia coli (or other microbial) expression strains of UG A or UGTH3 were obtained by molecular cloning technology and genetic engineering technology, and then recombinant E. coli was fermented to prepare recombinant cells containing UG' A or UG B, or UG was prepared. A or UGT ⁇ B lyophilized powder.
  • the recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3), and the expression of the target protein was induced by IPTG to obtain recombinant E. coli expression UG A or UGTHB.
  • sequence 1 and sequence 2 the gene was synthesized into a gene fragment, and Ndelhe il BamHl restriction sites were added to both ends, and ligated into pUC57 vector (Suzhou Jinweizhi Biotechnology Co., Ltd.).
  • the UGT gene fragment was digested with restriction endo alcohol I and fe HI, and the purified fragment was recovered.
  • T4 ligase was added to join the pET30a corresponding restriction site, which was difficult to transform into BL21 (DE3).
  • UGT strains were inoculated into 4 ml liquid LB medium at a ratio of 1%, shake culture (200 rpm) overnight at 37 °C, and the overnight culture was transferred to 50 mi liquid LB medium at a 1% inoculum, 37 ' ⁇ Shake culture (200 rpm) to an OD 6iW value of 0.6-0.8 , and incubate at a final concentration of 0.4 mM IPTG at 20 ° C overnight.
  • the cells were collected by centrifugation (8,000 rpm, 10 min), and the cells were resuspended with 5 mi of 2 mmol/L of phosphate buffer (pH 7.0 7.0) to obtain recombinant cells containing UG' A for catalysis.
  • the recombinant cells of UG'I ⁇ -A prepared in Example i were ultrasonically disrupted in an ice bath, and the disrupted solution was centrifuged (8,000 rpm, lOmin), and the supernatant was collected for 24 h to obtain UGT ⁇ A. Frozen powder.
  • the UGT ⁇ B gene fragment was synthesized, and Ndel and ⁇ HI restriction sites were added to both ends, and ligated into pUC57 vector (Suzhou Jinweizhi Biotechnology Co., Ltd.).
  • the UGT gene fragment was digested with restriction endonucleases Nde and BcrmHl, and the purified fragment was recovered.
  • the fragment was ligated into the corresponding cleavage site of P ET30a by T4 ligase, and transformed into BL21 (DE3) strain.
  • UGT 3 ⁇ 4 species were inoculated into 4 ml liquid LB medium at a ratio of 1%, 37 (shake culture (200 rpm) overnight, and the overnight culture was transferred to 50 mi liquid LB medium at 1% inoculum, 37 shaking culture ( 200 rpm) to 0D 6 ( 3 ⁇ 4 ) value reached 0.64X8, added to a final concentration of 0.4 mM IPTG and shaken overnight at 2 CTC. After centrifugation, centrifuge the cells (8,000 rpm, 10 niin), H] 5 ml 2 mmol/L phosphate buffer The cells (H value 7.0) were resuspended and recombinant cells containing UGT ⁇ B were obtained for catalysis.
  • the recombinant cells of UG ⁇ B prepared in Example 3 were ultrasonically disrupted in an ice bath, and the disrupted solution was centrifuged (8,000 rpm, lOmin), and the supernatant was collected and lyophilized for 24 hours to obtain a frozen powder of UGT B.
  • the UGT ⁇ A lyophilized powder prepared according to the method of Example 2 was used to catalyze the synthesis of Reb M.
  • 150 mL of 0.05 mol/L phosphate buffer (pH 7.0), 0.255 g UDP glucose, 0.17 g Reb D, and UG A frozen powder 1.5 g were sequentially added, and the mixture was uniformly placed in a 30 ⁇ water bath. ⁇ 60ipm stirred reaction for 2 h. After the reaction, 500 ⁇ of the reaction solution was added to an equal volume of anhydrous methanol, and the mixture was centrifuged at 8,000 rpm for 10 min.
  • the supernatant was filtered and detected by high performance liquid chromatography (chromatographic conditions; column; Agilent eclipse sb-C18 4.6X250mm ; detection wavelength: 210 nm; mobile phase: ⁇ 1 ⁇ 2 formic acid aqueous solution: methanol ::: 20%: 80%; flow rate: 1.0m: L / min; column temperature: 25 ': C).
  • the conversion rate of Reb D is 40% or more. After separation by silica gel resin, crystallization, etc. After purification by treatment, it was obtained: R_eb M: 0,054 g, purity greater than 95%.
  • the lyophilized powder prepared according to the method of Example 2 and the UG' B lyophilized powder prepared according to the method of Example 4 were used for catalytic synthesis of Reb M.
  • reaction system 150 niL 0,05 mol/L phosphate buffer (pH 7 ⁇ 0), 0,51 g UDP glucose, 0.145 g Reb A, UGT-A and UGT ⁇ B lyophilized powder were added in sequence. 5 g, mix and mix, place in a 30 C water bath, stir the reaction at 160 rpm for 2 h. After the reaction is completed, take 500 ⁇ ! The reaction solution is mixed with an equal volume of anhydrous methanol, centrifuge at 8,000 rpm for 1O min to remove the supernatant filtration membrane.
  • Example 8 Reb M is synthesized by Reb A as a substrate enzymatic method (Route 4)
  • sucrose a sucrose synthase from Arabidopsis thaliana (hereinafter referred to as AtSUS i ), and a UDP-glucose regeneration system composed of UDP were used.
  • the supernatant was filtered and analyzed by high performance liquid chromatography (chromatographic conditions: column: Agilent eclipse sb-C18 4.6 ⁇ 250 ⁇ ; detecting Jun length: 210 nm; mobile phase: 1% aqueous formic acid: methanol - 20%: 80%; flow rate: 1.0 mL / min: Column temperature: 25 V), the conversion rate 80'1 ⁇ 2 Reb a above. After purification by silica gel resin, crystallization and the like, it was purified to obtain Reb M 0.108 g, and the purity was more than 95%.
  • Example 9 Whole cell catalytic synthesis of Reb M using Reb D as substrate
  • the UGT ⁇ A-containing recombinant cells prepared according to the method of Example i are used for catalytic synthesis of Reb. M.
  • the conversion rate of Reb D is 40% or more.
  • Example 0 Whole cell catalytic synthesis of Reb A with Reb A as substrate
  • reaction system 150 ml, 0,05 moi/L phosphate buffer (pH 7,0), 0,51 g UDP glucose, 3 mL guanidine, 0.145 g Reb A, and UGH and UG' B were added in sequence.
  • the whole cells were 10 g each, mixed uniformly, placed in a 30 ⁇ water bath, and stirred at 160 rpm for 2 h.
  • 500 ⁇ l of the reaction solution was added to an equal volume of anhydrous methanol, and the mixture was centrifuged at 8,000 rpm for 10 mill.
  • the conversion rate of Reb A is 40% or more.
  • the supernatant was purified by silica gel resin separation, crystallization, etc., and then purified to obtain Reb M 0,05 g, and the purity was more than 95%.

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Abstract

提供了一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，该方法以瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D为底物，使所述底物在葡萄糖基供体存在下，在UDP-葡萄糖基转移酶和/或含有UDP-葡萄糖基转移酶的重组细胞的催化下反应生成瑞鲍迪甙M。

Description

种酶法制备瑞鲍迪甙 M的方法
技术领域
本发明涉及一种瑞鲍迪甙 M 的制备方法，特别涉及一种瑞鲍迪甙 M的生物制备方 法。
背景技术
甜味剂是一类广泛应用于食品、 饮料及糖果生产的食品添加剂。 其既可以在食品的 生产过程中添加， 也可以在家庭烘焙时经过适当稀释作为蔗糖的替代品使用。 甜味剂包 括天然甜味剂和人工甜味剂， 前者如蔗糖、高果糖玉米糖浆、蜜糖等， 后者如阿斯巴甜、 糖精等。 甜菊糖是一类 ^植物甜菊中提取出来的天然甜味剂， 目前已被广泛用在食品及 饮料中。 甜菊的提取物中含有包含瑞鲍迪甙在内的多种甜菊糖， 天然提取的甜菊糖不同 的批次成分差异较大， 需要后续的提纯。 目前商业化的产品瑞鲍迪甙 A包含一些其它的 甜菊糖如瑞鲍迪甙 C， D及 F等。 提取的方法制备的甜菊糖通常还有混有一些杂质， 有 可能对其使用范 I造成一定的影响。 瑞鲍迪甙 M相较于瑞鲍迪甙 A具有优势， 但其在 甜菊叶中的含量极少， 且只在甜菊 Morita植棕中被检测到 （20】0, J, Appl. Glycosci., 57, 199-209)。 目前尚未有瑞鲍迪甙 M的商业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种酶法制备瑞鲍迪甙 M 的方法， 该方法可以较低的成本， 较短的周期生产出高纯度的瑞鲍迪甙 M产品。
为解决以上技术问题， 本发明釆取如下技术方案： 一种酶法制备瑞鲍迪甙 M 的方 法，该方法以瑞鲍迪甙 A或瑞鲍迪甙 D为底物，使底物在葡萄糖基供体存在下，在 UDP- 蔔萄糖基转移醇和 /或含有 UDP-葡萄糖基转移酶的重组细胞的催化下反应生成瑞鲍迪甙 M。
根据本发明， 葡萄糖基供体可以为 UDP-蔔萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和 UDP组成 的 UDP-葡萄糖再生体系 (2007, FEBS Letters' 581 , 2562-2566), 且优选由蔗糖、 蔗 糖合成酶和 UDP组成的 UDP-葡萄糖再生体系， UDP葡萄糖价格较高， 采 ^由 UDP- 蔔萄糖再生体系可以大幅度降低成本。
根据本发明， UDP-蔔萄糖基转移酶 （即脈普二磷酸蔔萄糖基转移酶， 简称 UGT) 是已知的。优选地， 本发明所用的 UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊（Stevia rebaudkma) 的 UGTA和 Z或来自水稻 （Oryza sativa) 的 UG B。
UG A的氨基酸序列可以与序列 2具有至少 60%的一致性。 优选地， UGT-A的氨 基酸序列与序列 2具有至少 70%的一致性。 进一歩优选地， UG^C-A的氨基酸序列与序 列 2具有至少 80%的一致性。 最优选地， UG A的氨基酸序列与序列 2具有至少 90% 的一致性。 根据一个具体方面， UG A的氨基酸序列与序列 2完全一致。
UGT-B的氨基酸序列可以与序列 4具有至少 60%的一致性。 更优选地， UGT-B的 氨基酸序列与序列 4具有至少 70%的一致性。进一歩优选地， UGI-B的氨基酸序列与序 列 4具有至少 80%的一致性。 最优选地， UGT-B的氨基酸序列与序列 4具有至少 90% 的一致性。 根据一个具体方面， UGX-B的氨基酸序列与序列 4完全一致。
根据本发明， 可以使反应在温度 4°C〜50°C以及 pH值 5.0 9.0的水相体系中进行。 优选地， 使反应在温度 25Ό〜35'Ό以及 pH值 6.5~7.5的水相体系中进行。
更优选地， 使反应在温度 30TTF进行。
更优选地， 使反应在 pH值 7,0下进行。
根据一个具体优选方面， 使反应在 pH值 7.0的磷酸缓冲液中进行。
根据本发明， 当采用含有 UDP -葡萄糖基转移酶的重组细胞来进行催化时， 可以使 反应在细胞通透剂存在下进行。 优选的， 所述细胞通透剂为甲苯， 其在整个反应体系中 的体积比浓度可以为 %〜3%。 更优选地， 甲苯的体积比浓度为 2%。
根据本发明， 重组细胞可以 ϋ优选为微生物细胞， 其中微生物可以且优选为大肠埃 希氏杆菌、 酿酒酵母或毕赤酵母等。
根据一个具体和优选方面， 制备方法实施如下； 将反应所用的全部原料加入到反应 釜中， 混合均匀后， 置于设定温度下， 搅拌反应。 反应完毕后， 通过提纯处理即可获得 达到使用要求的瑞鲍迪甙 Μ 产品。 一个具体的提纯方方法是经包括树脂分离在内的后 处理， 按照该提纯方法， 可获得纯度高达 95%的瑞鲍迪甙 Μ产品。
根据本发明的一个具体方面； 底物为瑞鲍迪甙 A, UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜 菊的 UGT^A和来自水稻的 UG B的混合物，来自甜菊的 UGT^A的氨基酸序列与序列 2 具有至少 80%的一致性； 来自水稻的 UGT-B的氨基酸序列与序列 4具有至少 80%的一 致性。优选地，混合物中，来自甜菊的 UG' A和来自水稻的 UG' B的重量比为 1 :0.8〜1 ,2， 例如二者的重量比可以为 i:i。
根据本发明的又一具体方面： 底物为瑞鲍迪甙 D, UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜 菊的 UG' A， 该来自甜菊的 UG' A的氨基酸序列与序列 2具有至少 80%的一致性。
由于以上技术方案的实施， 本发明与已有技术相比具有如下优势：
本发明提供的酶法制备瑞鲍迪甙 M 的方法具有重要的应用价值。 由于微生物生长 速度远远快于植物， 采取根据本发明的制备方法可以较大幅度的降低生产成本， 缩短生 产周期， 极大的提高产品的竞争力。 此外， 植物中的甜菊糖含量低， 且有较多不同结构 的甜菊糖， 很难提取较纯的产品， 而采用本发明的酶法合成方法能够提供纯度更高的产 品， 将会进一步扩大其应用范 I。 与已有从甜菊 n†中提取瑞鲍迪甙 M 的技术相比， 本 ， 产能提高， 成本较低， 且可提供纯度更高的产品， 因而能
Figure imgf000004_0001
附图说明
图 1为本发明实施例 5所得产品的氢核磁谱图。
具体实施方式
以下瑞鲍迪甙 A、 瑞鲍迪甙 L 瑞鲍迪甙 M分别简称 Reb A、 Reb D禾 il〗leb M:， 者的结构式分别参见式 ί、 Π和 ffl。
Figure imgf000005_0001
本发明主要提供四条合成 Reb M的路线:
路线一：
UGT--A
Re b D + UDP~葡萄糖 Reb M + UDP 路线
UGT-A
Reb A +2 UDP-葡萄糖 ► Reb M + 2 UDP
UGT-B
路线:三: Reb I) e b M
UDP-葡萄糖
Figure imgf000006_0001
根据本发明，所 ffi的 UGT-A或 UG B可以酶冻千粉形式存在或存在于重组细胞中。 UGT-A或 υατ·Β的获得方法如下：
利用分子克隆技术、 基因工程技术获得 UG A或 UGTH3的重组大肠杆菌（或其它 微生物菌）表达菌株， 然后将重组大肠杆菌发酵， 制备得到含有 UG' A或 UG B的重 组细胞， 或者制备得到 UG A或 UGT^B的冻干粉。
上述的分子克隆技术和基因工程技术均是已知的。 分子克隆技术可参见《分子克隆 实验指南》 第-三版 CL沙姆布鲁克著，2005)。
采用基因工程技术构建本发明重组菌株的表达歩骤如下：
(1) (根据序列 i及序列 2, 或根据序列 3及序列 4) 基因合成所需的基因片段， 连入 pUC57载体， 两端分别加上 Ndel和 S Hi酶切位点：
(2) 通过双酶切、 连接， 将各基因片段插入表达载体 pET30a相应的酶切位点中， 使各基因置于 T7启动子的控制之下；
(3) 将重组质粒转化进入大肠杆菌 BL21 (DE3) 中， 利用 IPTG诱导目的蛋白表 达， 得到 UG A或 UGTHB的重组大肠杆菌表达 f棕。
利用含有 或 UG^B的重组大肠杆菌表达菌株制备含有 UG A或 UG B的 重组细胞， 或者 UG' A或 UGT^B的冻千粉的步骤如下：
以 1%比倒将含有 UGl^A或 UGT^B的重组大！/杆菌表达菌株接种到 4ml液体 LB 培养基中， 37 Ό振荡培养（200 rpm) 过夜， 取过夜培养物以 1%接种量转接于 50 mi液 体 培养基， 37 'Ό振荡培养（200 rpm)至 OD600值达到 0.6-0.8, 加入终浓度 0.4 mM IPTG于 2CTC振荡培养过夜。 诱导结束后离心收集细胞 （8,000 rpm， 10 mm), 用 5 mi 2 mniol/L磷酸缓冲液 （pH值 70) 重悬细胞， 获得重组细胞， 或进一歩于冰浴中超声波 破碎细胞， 将破碎液离心 （8，000ipm, lOmin), 收集上清液冻干 24 h, 获得冻干粉。 以下结合具体的实施例对本发明作更为详细的描述。 实施例〗： 制备含 UG A的重组大肠杆菌细胞
根据序列 1及序列 2， 基因合成 基因片段， 两端分别加上 Ndel禾 il BamHl 酶切位点， 连入 pUC57载体 （苏州金唯智生物技术有限公司）。 将 UGT基因片段用限 制性内切醇 I和 fe HI酶切， 回收纯化片段， 加入 T4连接酶将片段连入 pET30a对 应酶切位点， 转化 BL21 (DE3) 難。
以 1%比例将 UGT菌种接种到 4 ml液体 LB培养基， 37 °C振荡培养 （200 rpm) 过 夜， 取过夜培养物以 1%接种量转接于 50 mi液体 LB培养基， 37 'Ό振荡培养（200 rpm) 至 OD6iW值达到 0。6- 0.8， 加入终浓度 0.4 mM IPTG于 20°C振荡培养过夜。 诱导结束后 离心收集细胞 （8,000 rpm, lOmin), 用 5 mi 2 mmol/L磷酸缓 液 （ρΗ值 7.0) 重悬细 胞， 获得含 UG' A的重组细胞用于催化。
实施例 2: 制备 UG' A冻千粉
将实施例 i中制得的 UG'I^-A的重组细胞于冰浴中超声波破碎细胞， 将破碎液离心 (8,000 rpm, lOmin), 收集上清液冻千 24 h, 获得 UGT^A的冻千粉。
实施例 3; 制备含 UG B的重组大肠钎菌细胞
根据序列 3及序列 4, 基因合成 UGT^B基因片段， 两端分别加上 Ndel和 β HI酶 切位点， 连入 pUC57载体 （苏州金唯智生物技术有限公司）。 将 UGT基因片段用限制 性内切酶 Nde 和 BcrmHl酶切， 回收纯化片段， 加入 T4连接酶将片段连入 PET30a对应 酶切位点， 转化 BL21 (DE3) 菌株。
以 1%比例将 UGT ¾种接种到 4 ml液体 LB培养基， 37 (振荡培养 （200 rpm) 过 夜, 取过夜培养物以 1%接种量转接于 50 mi液体 LB培养基， 37 振荡培养 (200 rpm) 至 0D6(¾)值达到 0.64X8， 加入终浓度 0.4 mM IPTG于 2CTC振荡培养过夜。 诱导结束后 离心收集细胞 (8,000 rpm, 10 niin), H] 5 ml 2 mmol/L磷酸缓冲液 ( H值 7.0) 重悬细 胞， 获得含 UGT^B的重组细胞用于催化。
实施例 4: 制备 UGT^B冻干粉
将实施例 3中制得的 UG^B的重组细胞于冰浴中超声波破碎细胞， 将破碎液离心 (8,000 rpm, lOmin), 收集上清液冻干 24 h, 获得 UGT B的冻千粉。
实施例 5: 以 Reb D为底物酶法合成 Reb M (路线一）
在本实施例中， 按照实施例 2方法制备的 UGT^A冻干粉被用于催化合成 Reb M。 在反应体系中依次加入 150 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液 (pH值 7.0)， 0.255 g UDP 蔔萄糖， 0.17 g Reb D, UG A冻千粉 1.5 g, 混合均匀后置于 30 Ό水浴， 〗60ipm搅拌 反应 2 h。反应结束后，取 500 μΐ反应液加入等体积无水甲醇混匀， 8,000 rpm离心 10 min 取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测 （色谱条件； 色谱柱； Agilent eclipse sb-C18 4.6X250mm; 检测波长： 210 nm ； 流动相： Γ½甲酸水溶液： 甲醇 ::: 20%： 80%； 流速: 1.0m:L/min ； 柱温： 25 ':C)。 Reb D的转化率为 40%以上。 经硅胶树脂分离、 结晶等后 处理纯化后得到 :R_eb M: 0,054g， 纯度大于 95%。
实施飼 6； 以 Reb A为底物酶法合成 Reb M (路线二）
在本实施飼中， 按照实施例 2方法制备的 冻干粉和按照实施例 4方法制备 的 UG' B冻干粉被用于催化合成 Reb M。
在反应体系中依次加入 150 niL 0,05 mol/L磷酸缓冲液 （pH值 7„0 ) , 0,51 g UDP葡 萄糖， 0.145 g Reb A , UGT-A及 UGT~B冻干粉各 1 ,5 g,混合均勾后置于 30 C水浴， 160 rpm搅拌反应 2 h。 反应结束后， 取 500 μ!反应液加入等体积无水甲醇混匀， 8,000 rpm 离心 iO min取上清液过滤膜后 高效液相色谱检测（色谱条件： 色谱柱： Agilent eclipse sb-C18 4.6X250nini; 检测波长： 210 nm ； 流动相： 1%甲酸水溶液： 甲醇 = 20%： 80%； 流速： l .O mL/miri ； 柱温： 25 °C )。 Reb A的转化率为 40%以上。 经硅胶树脂分离、 结 晶等后处理纯化后得到 Reb M 0.05g， 纯度大于 95%。 实施^ 7: 以 Reb D为底物酶法合成 Reb M (路线三） 在本实施例中， 使用蔗糖、 来自拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 的蔗糖合成酶 （以 下简称 AtSUSl ) 以及 UDP组成的 UDP-葡糖糖再生体系作为葡糖糖基供体。
在反应体系中依次加入 150 niL 0.05 mol/L磷酸缓冲液 (pH值 7.0 ) , 0.182 g UDP, 51 ,3 g蔗糖， 0. 17 g Reb D, UGT-A冻干粉： L5 g以及 AtSUSl冻干粉 0,5 g， 混合均匀后 置于 30 Γ水浴， 160 rpm搅拌反应 2 h。 反应结束后， 取 500μ1反应液加入等体积无水 甲醇混匀， 8,000 rpm离心 10 mm取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测 （色谱条件： 色谱柱： Agilent eclipse sb-Cl 8 4,6X250mm ; 检测波长： 2】0 nm ; 流动相： 〗％甲酸水 溶液： 甲醇 = 20%： 80%； 流速： LO fflL/min ； 柱温： 25 。(: )。 Reb D的转化率为 80% 以上。 经硅胶树脂分离、 结晶等后处理纯化后得到 Reb M O. l lg, 纯度大于 95%。 实施例 8 : 以 Reb A为底物酶法合成 Reb M (路线四） 在本实施例中， 使用蔗糖、 来自拟南芥 (Arabkiopsis thaliana) 的蔗糖合成酶 （以 下简称 AtSUS i ) 以及 UDP组成的 UDP-葡糖糖再生体系作为葡糖糖基供体。
在反应体系中依次加入 150 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH7,0 ) , 0,364 g UDP, 51.3 g蔗糖， 0J45 g Reb A, UGT-A.和 UGTHB各】, 5 g以及 AtSUS i冻干粉 0.5 g, 混合均匀 后置于 30 'Ό水浴， 160 rpm搅拌反应 2 h。 反应结束后， 取 500 μΐ反应液加入等体积无 水甲醇混匀， 8,000 rpm离心 10 mm取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测（色谱条件： 色谱柱： Agilent eclipse sb-C18 4.6Χ250ηιηι; 检测浚长： 210 nm ； 流动相： 1%甲酸水 溶液： 甲醇 - 20%： 80%； 流速： 1.0 mL/min ： 柱温： 25 V ) , Reb A的转化率为 80'½ 以上。 经硅胶树脂分离、 结晶等后处理纯化后得到 Reb M 0.108g, 纯度大于 95%。
实施例 9: 以 Reb D为底物全细胞催化合成 Reb M
在本实施例中， 按照实施例 i方法制备的含 UGT^A的重组细胞用于催化合成 Reb M。
在反应体系中依次加入 150 mL 0.05 moi/L磷酸缓冲液 (pH值 7.0)， 0.255 g UDP 葡萄糖， 3 mL甲苯， 0,17 g Reb D，含有 UG' A的重组细胞 10 g，混合均匀后置于 30 U 水浴， 160 rpm搅拌反应 2 h。 反应结束后， 取 500 μΐ反应液加入等体积无水甲醇混匀， 8,000 rpm离心 10 mm取上清液过滤膜后用高效液相色谱检则（色谱条件：色谱柱: Agite eclipse sb-C 18 4.6X250nim; 检测波长： 210 nm ； 流动相： 1%甲酸水溶液： 甲醇 ：:= 20% ： 80%； 流速: l.O mL/min ； 柱温: 25 。C )。 Reb D的转化率为 40%以上。 经离心, ..!:: 清过硅胶树脂分离、 结晶等后处理纯化后得到 Reb M 0.052 g， 纯度大于 95%。
实施例 0: 以 Reb A为底物全细胞催化合成 Reb M
在反应体系中依次加入 150 ml, 0,05 moi/L磷酸缓冲液 （pH值 7,0), 0,51 g UDP葡 萄糖， 3 mL曱苯， 0.145 g Reb A, 同时含有 UGH和 UG' B的全细胞各 10 g, 混合均 匀后置于 30 Ό水浴， 160 rpm搅拌反应 2 h。 反应结束后， 取 500 μ 反应液加入等体积 无水甲醇混匀， 8,000 rpm离心 10 mill取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测 （色谱条 件: 色谱柱: Agilent eclipse sb-C 18 4.6X250mm; 检测波长: 210 nm ； 流动相： 1%甲 酸水溶液： 甲醇 = 20% : 80%; 流速： 1.0 mL/min ； 柱温： 25 ':C )。 Reb A的转化率为 40%以上。 经离心， 上清过硅胶树脂分离、 结晶等后处理纯化后得到 Reb M 0,05 g， 纯 度大于 95%。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士 能够了解本发明的内容并据以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围。 凡根据本发明 精神实质所作的等效变化或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范 ί簡之内。

Claims

权利要求-
L 一种酶法制备瑞鲍迪甙 M的方法， 其特征在于： 该方法以瑞鲍迪甙 A或瑞鲍迪甙 D 为底物， 使所述底物在葡萄糖基供体存在下， 在 UDP-葡萄糖基转移酶和 /或含有 UDP- 蔔萄糖基转移酶的重组细胞的催化下反应生成瑞鲍迪甙 M。
2. 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于： 葡萄糖基供体为 UDP葡萄糖或由蔗糖、 蔗糖合成酶和 UDP组成的 UDP-蔔萄糖再生体系。
3. 根据权利要求〗所述的方法,其特征在于: UDP -葡萄糖基转移酶为来自甜菊的 UGTA 和 /或来自水稻的 UGT4B。
4. 根据权利要求 3所述的方法， 其特征在于： UGT-A的氨基酸序列与序列 2具有至少 80%的一致性。
5. 根据权利要求 4所述的方法， 其特征在于： UGT^A的氨基酸序列与序列 2具有至少 90%的一致性。
6. 根据权利要求 3所述的方法， 其特征在于： UGTH3的氨基酸序列与序列 4具有至少 80%的一致性。
7. 根据权利要求 6所述的方法， 其特征在于： UG B的氨基酸序列与序列 4具有至少 90%的一致性。
8. 根据权利要求 1所述的方法，其特征在于：使反应在温度 25X：〜 35 以及 pH值 6.5〜7.5 的水相体系中进行。
9. 根据权利要求 8所述的方法，其特征在于： 使反应在 pH值 7,0的磷酸缓冲液中进行。
10. 根据权利要求 8所述的方法， 其特征在于： 采用含有 UDP-葡萄糖基转移酶的重组 细胞来进行催化， 反应的体系中还含有体积比浓度为 1%〜3%的甲苯。
11. 根据权利要求 8所述的方法， 其特征在于该方法实施如下： 将反应所用的全部原料 加入到反应釜中， 混合均匀后， 置于设定温度下， 搅拌反应。
12. 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在干： 重组细胞为微生物细胞。
13. 根据权利要求 i2所述的方法， 其特征在于： 微生物为大肠埃希氏杆菌、 酿酒酵母或 毕赤酵母。
14. 根据权利要求 ί至 13中任一项权利要求所述的方法，其特征在于： 底物为瑞鲍迪甙 A, UDP-蔔萄糖基转移酶为来自甜菊的 UG A和来自水稻的 UGTH3的混合物， 所述来 自甜菊的 UGT^A的氨基酸序列与序列 2具有至少 80%的一致性；所述来自水稻的 UG B 的氨基酸序列与序列 4具有至少 80%的一致性。
15. 根据权利要求 14所述的方法， 其特征在于： 混合物中， 来自甜菊的 UGT^A和来自 水稻的 UGT-B的重量比为 1 :0.8-1 ,2ο
16. 根据权利要求 i至 13中任一项权利要求所述的方法，其特征在于：底物为瑞鲍迪甙 D， UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊的 UGT^A, 所述来自甜菊的 UG A的氨基酸序列 与序列 2具有至少 80%的一致性。
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