CN110100006A

CN110100006A - 重组宿主中甜菊糖苷的生产

Info

Publication number: CN110100006A
Application number: CN201780068123.0A
Authority: CN
Inventors: 约恩·希尔; 菲利普·贝尔宁格; 基姆·奥尔森; 乔·谢里丹; 劳拉·奥基平蒂; 劳拉·布伦巴蒂; 克里斯蒂安·尼芬纳格; 克里斯托夫·福利
Original assignee: Evolva AG
Current assignee: Evolva Holding SA
Priority date: 2016-11-07
Filing date: 2017-11-07
Publication date: 2019-08-06
Also published as: US20200080123A1; EP3535406A1; WO2018083338A1; US11396669B2

Abstract

本发明涉及用于生产甜菊糖苷和甜菊糖苷前体的重组微生物和方法。

Description

重组宿主中甜菊糖苷的生产

技术领域

本公开涉及甜菊糖苷、甜菊醇前体糖苷以及甜菊糖苷前体在重组宿主中的重组生产。具体来说，本公开涉及包括以下的甜菊糖苷在重组宿主中的生产：甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、莱苞迪苷A(RebA)、莱苞迪苷B(RebB)、莱苞迪苷C(RebC)、莱苞迪苷D(RebD)、莱苞迪苷E(RebE)、莱苞迪苷F(RebF)、莱苞迪苷M(RebM)、莱苞迪苷Q(RebQ)、莱苞迪苷I(RebI)、杜克苷A、单糖基化内根-贝壳杉烯酸、二糖基化内根-贝壳杉烯酸、三糖基化内根-贝壳杉烯酸、单糖基化内根-贝壳杉烯醇(例如，贝壳杉烯酯(kaurenoate)-19-O-葡糖苷或19-KMG)、二糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化甜菊糖苷、四糖基化甜菊糖苷、五糖基化甜菊糖苷、六糖基化甜菊糖苷、七糖基化甜菊糖苷或其异构体。

背景技术

已熟知甜味剂为食品、饮料或糖果工业中最常使用的成分。甜味剂可在生产期间被掺入到最终食物产品中，或者当适当稀释时作为餐桌用甜味剂或烘焙时糖的家用替代物单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(诸如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)以及人造甜味剂(诸如阿斯巴甜、糖精和三氯蔗糖)。甜叶菊提取物为可从多年生灌木甜叶菊(Stevia rebaudiana)中分离和提取的天然甜味剂。甜叶菊通常在南美和亚洲生长以用于甜叶菊提取物的商业生产。纯化至各种程度的甜叶菊提取物在商业上用作食品和共混物中的高强度甜味剂或单独用作餐桌用甜味剂。

若干种甜菊糖苷的化学结构示出在图1中，包括二萜甜菊醇和各种甜菊糖苷。甜叶菊植物的提取物通常包含带来甜味的甜菊糖苷，但是每种甜菊糖苷的量经常是不同的，特别是在不同生产批次之间。

甜菊糖苷从甜叶菊植物的回收和纯化已被证明是劳动密集型并且低效的。此外，获自植物来源甜叶菊提取物的甜菊糖苷组合物通常含有可带来异味的甜叶菊植物来源组分。因此，仍然需要一种重组生产系统，所述重组生产系统可以累积高产率的所需甜菊糖苷诸如RebD和RebM并且生产出甜菊糖苷组合物，所述甜菊糖苷组合物相对于甜叶菊植物的甜菊糖苷组合物富含一种或多种所需甜菊糖苷并且相对于获自植物来源的甜叶菊提取物的甜菊糖苷组合物具有降低水平的甜叶菊植物来源组分。还需要改进在重组宿主中甜菊糖苷的生产以用于商业用途。同样，仍然需要鉴别出对具体底物具有选择性的酶以生产一种或多种特定的甜菊糖苷。在一些方面中，仍然需要增加具有19-O糖基化活性的酶的催化能力，以生产出更高产率的甜菊糖苷。

发明内容

针对以上背景，本发明提供了相对于现有技术的某些优点和改进。

尽管如本文所公开的发明不限于特定的优点或功能(诸如像，扩大一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷的生产、纯化一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷和生产甜菊糖苷组合物的能力，其中不同不利的各种甜菊糖苷提供相对于获自植物来源的甜叶菊提取物具有降低水平的甜叶菊植物来源组分的优点)，但是本发明提供一种能够生产一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷的重组宿主细胞，其包含重组基因，所述重组基因编码能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽，所述多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ ID NO：4的残基15、16、18、20、27、28、30、31、49、51、67、68、73、75、79、81、83、84、86-88、90、91、96、99、107、110、111、113、115、119-121、123、128、129、135、136、140、141、143、146、147、156、162、166、169、173、176、179-181、183-189、191-195、200、204、209、211、212、215、221、222、224、232、237、247、252、255、257、259、263、265、266、269、274、280、284、285、287、292、295-298、300、301、303、310、311、313、315、316、320、322、325、326、328、329、332、333、335、338、341、346、347、357、364、370、371、373、375-377、380、385、387-391、396、401、407-411、415、416、419、424、426、427、434、448、449、455、456或458的一个或多个氨基酸取代。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面中，所述多肽包含SEQ ID NO：4的至少一个氨基酸取代，即L15V、I16L、F18Y、L20A、F27M、I28L、F30L、G31S、G31A、T49I、N51K、Q67E、A68T、C73F、E75D、M79A、E83D、E83K、S84A、L86I、E87D、T88R、K90W、Q91E、S96T、D99E、E107S、T110P、I111V、A113C、I115V、M119F、T120L、E121P、V123A、I128K、E129Q、G135A、S136A、Q140N、A141S、V143A、S146N、L147I、I156L、E162T、V166L、F169L、Q173E、E176D、L179S、I180F、L181V、N183D、H184P、E185G、Q186S、I187Y、Q188P、S189A、W191F、S192D、Q193M、M194V、L195V、A200S、Q204K、F209L、N211H、S212T、K215E、I221V、E222D、T224M、V232T、L237I、D247E、N252Y、N255S、Y257F、A259P、E263A、M265I、N266K、N266E、D269N、E274G、A280S、L284M、V285A、H287L、V292M、I295L、I295M、T296A、R297W、A298G、I300K、D301N、D303N、I310V、K311R、K313S、E315Q、G316A、E320K、L322F、V325E、I326T、T328S、G329E、L332I、I333V、A335S、K338P、D341E、E346P、E346K、S347A、F357W、I364L、V370M、V371I、M373V、Q375L、F376W、S377T、T380S、L385F、D387E、E388D、I389V、L390W、G391K、V396A、N401K、G407E、N408E、L409I、A410E、S411D、M415E、I416V、E419G、I424E、R426K、K427E、D434E、N448K、D449N、S455A、E456K或I458V。

在一个方面中，本文所公开的重组宿主细胞还包含：

(a)编码能够从法尼基二磷酸酯(FPP)和异戊烯基二磷酸酯(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)的多肽的基因；

(b)编码能够从GGPP合成内根-柯巴基二磷酸酯的多肽的基因；

(c)编码能够从内根-柯巴基二磷酸酯合成内根-贝壳杉烯的多肽的基因；

(d)编码能够从内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸的多肽的基因；

(e)编码能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；

(f)编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；

(g)编码能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽的基因；

(h)能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽的基因；和/或

(i)能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽的基因；

其中所述基因中的至少一种为重组基因。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面中：

(a)能够合成GGPP的所述多肽包括与SEQ ID NO：20、22、24、26、28、30、32或116中任一个所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；

(b)能够合成内根-柯巴基二磷酸酯的所述多肽包括与SEQ ID NO：34、36、38、40或42中任一个所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；

(c)能够合成内根-贝壳杉烯的所述多肽包括与SEQ ID NO：44、46、48、50或52中任一个所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；

(d)能够合成内根-贝壳杉烯酸的所述多肽包括与SEQ ID NO：60、62、66、68、70、72、74、76或117中任一个所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；

(e)能够还原细胞色素P450复合物的所述多肽包括与SEQ ID NO：78、80、82、84、86、88、90或92中任一个所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；

(f)能够合成甜菊醇的所述多肽包括与SEQ ID NO：94、97、100、101、102、103、104、106、108、110、112或114中任一个所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；

(g)能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的所述多肽包括与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；

(h)能够β1，3糖基化甜菊糖苷的所述13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的所述C3′的所述多肽包括与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；

(i)能够β1，2糖基化甜菊糖苷的所述13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的所述C2′的所述多肽包括与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽或与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面中，所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷包括贝壳杉烯酯-19-O-葡糖苷(19-KMG)、甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷(RebG)、甜茶苷、莱苞迪苷A(RebA)、莱苞迪苷B(RebB)、莱苞迪苷C(RebC)、莱苞迪苷D(RebD)、莱苞迪苷E(RebE)、莱苞迪苷F(RebF)、莱苞迪苷M(RebM)、莱苞迪苷Q(RebQ)、莱苞迪苷I(RebI)、杜克苷A、单糖基化内根-贝壳杉烯酸、二糖基化内根-贝壳杉烯酸、三糖基化内根-贝壳杉烯酸、单糖基化内根-贝壳杉烯醇、二糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化甜菊糖苷、四糖基化甜菊糖苷、五糖基化甜菊糖苷、六糖基化甜菊糖苷、七糖基化甜菊糖苷和/或其异构体。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面中，相对于表达能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷、缺乏所述一个或多个氨基酸取代的多肽的对应宿主，能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷、与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有所述一个或多个氨基酸取代的所述多肽的表达增加或降低由所述细胞产生的19-KMG、19-SMG和/或甜茶苷的量至少约5％、10％、25％、50％或100％。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面中，所述重组宿主细胞包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞、古菌细胞或细菌细胞。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面中，重组宿主细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面中，重组宿主细胞为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

本发明还提供一种在细胞培养物中生产一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷的方法，其包括在表达所述基因的条件下在所述细菌培养物中培养本文所公开的重组宿主细胞；并且其中所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷是由所述重组细胞产生的。

在本文所公开的方法的一个方面中，基因是组成性地表达的。

在本文所公开的方法的一个方面中，所述基因的所述表达被诱导。

在一个方面中，本文所公开的方法还包括从所述细胞培养物中分离出所述产生的一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷。

在本文所公开的方法的一个方面中，所述分离步骤包括将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离，以获得包含所述产生的一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷的上清液，以及：

(a)将所述上清液与一种或多种吸附树脂接触，以获得所述产生的一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷的至少一部分；或

(b)将所述上清液与一种或多种离子交换或反相色谱柱接触，以获得所述产生的一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷的至少一部分；或

(c)使所述产生的一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷结晶或萃取所述产生的一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷；

从而分离出所述产生的一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷。

在一个方面中，本文所公开的方法还包括从所述细胞培养物中回收所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷。

在本文所公开的方法的一个方面中，所述回收的一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷相对于甜叶菊植物的甜菊糖苷组合物富含所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷，并且相对于获自植物来源的甜叶菊提取物的甜菊糖苷组合物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。

本发明还提供一种用于生产一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷的方法，其包括使用以下来全细胞生物转化重组宿主细胞的细胞培养物中的植物来源或合成甜菊醇、甜菊醇前体和/或甜菊糖苷：能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽，其与SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ ID NO：4的残基15、16、18、20、27、28、30、31、49、51、67、68、73、75、79、81、83、84、86-88、90、91、96、99、107、110、111、113、115、119-121、123、128、129、135、136、140、141、143、146、147、156、162、166、169、173、176、179-181、183-189、191-195、200、204、209、211、212、215、221、222、224、232、237、247、252、255、257、259、263、265、266、269、274、280、284、285、287、292、295-298、300、301、303、310、311、313、315、316、320、322、325、326、328、329、332、333、335、338、341、346、347、357、364、370、371、373、375-377、380、385、387-391、396、401、407-411、415、416、419、424、426、427、434、448、449、455、456或458的一个或多个氨基酸取代；和任选地以下中的一种或多种：

(a)能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽，其包括与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；

(b)能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽，其包括与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；

(c)能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽，其包括与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽或与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽；

其中所述多肽中的至少一种为重组多肽；以及

从而产生所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷。

在本文所公开的方法的一个方面中，能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的所述多肽包含SEQ ID NO：4的至少一个氨基酸取代，即L15V、I16L、F18Y、L20A、F27M、I28L、F30L、G31S、G31A、T49I、N51K、Q67E、A68T、C73F、E75D、M79A、E83D、E83K、S84A、L86I、E87D、T88R、K90W、Q91E、S96T、D99E、E107S、T110P、I111V、A113C、I115V、M119F、T120L、E121P、V123A、I128K、E129Q、G135A、S136A、Q140N、A141S、V143A、S146N、L147I、I156L、E162T、V166L、F169L、Q173E、E176D、L179S、I180F、L181V、N183D、H184P、E185G、Q186S、I187Y、Q188P、S189A、W191F、S192D、Q193M、M194V、L195V、A200S、Q204K、F209L、N211H、S212T、K215E、I221V、E222D、T224M、V232T、L237I、D247E、N252Y、N255S、Y257F、A259P、E263A、M265I、N266K、N266E、D269N、E274G、A280S、L284M、V285A、H287L、V292M、I295L、I295M、T296A、R297W、A298G、I300K、D301N、D303N、I310V、K311R、K313S、E315Q、G316A、E320K、L322F、V325E、I326T、T328S、G329E、L332I、I333V、A335S、K338P、D341E、E346P、E346K、S347A、F357W、I364L、V370M、V371I、M373V、Q375L、F376W、S377T、T380S、L385F、D387E、E388D、I389V、L390W、G391K、V396A、N401K、G407E、N408E、L409I、A410E、S411D、M415E、I416V、E419G、I424E、R426K、K427E、D434E、N448K、D449N、S455A、E456K或I458V。

在本文所公开的方法的一个方面中，所述重组宿主细胞包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞、古菌细胞或细菌细胞。

在本文所公开的方法的一个方面中，重组宿主细胞为酿酒酵母细胞。

在本文所公开的方法的一个方面中，重组宿主细胞为解脂耶氏酵母细胞。

本发明还提供一种用于生产一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷的体外方法，其包括向反应混合物中添加能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽，所述多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ ID NO：4的残基15、16、18、20、27、28、30、31、49、51、67、68、73、75、79、81、83、84、86-88、90、91、96、99、107、110、111、113、115、119-121、123、128、129、135、136、140、141、143、146、147、156、162、166、169、173、176、179-181、183-189、191-195、200、204、209、211、212、215、221、222、224、232、237、247、252、255、257、259、263、265、266、269、274、280、284、285、287、292、295-298、300、301、303、310、311、313、315、316、320、322、325、326、328、329、332、333、335、338、341、346、347、357、364、370、371、373、375-377、380、385、387-391、396、401、407-411、415、416、419、424、426、427、434、448、449、455、456或458的一个或多个氨基酸取代；和任选地以下中的一种或多种：

和植物来源或合成甜菊醇、甜菊醇前体和/或甜菊糖苷；

其中所述多肽中的至少一种为重组多肽；以及

从而产生所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷。

在本文所公开的方法的一个方面中，所述反应混合物包含：

(a)一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷；

(b)UGT多肽；

(c)二磷酸尿苷(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或

(d)反应缓冲液和/或盐。

在本文所公开的方法的一个方面中，所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体藤苷包括19-KMG、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebG、甜茶苷、RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、RebF、RebM、RebQ、RebI、杜克苷A、单糖基化内根-贝壳杉烯酸、二糖基化内根-贝壳杉烯酸、三糖基化内根-贝壳杉烯酸、单糖基化内根-贝壳杉烯醇、二糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化甜菊糖苷、四糖基化甜菊糖苷、五糖基化甜菊糖苷、六糖基化甜菊糖苷、七糖基化甜菊糖苷和/或其异构体。

本发明还提供一种细胞培养物，其包含本文所公开的重组宿主细胞，所述细胞培养物还包含：

(a)由所述重组宿主细胞生产的所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷；

(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；以及

(c)补充营养素，其包含痕量金属、维生素、盐、YNB和/或氨基酸；

其中所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷在至少每升所述细胞培养物1mg的浓度下存在；

其中所述细胞培养物相对于甜叶菊植物的甜菊糖苷组合物富含所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。

本发明还提供一种在细胞培养物中生长的本文所公开的重组宿主细胞的细胞裂解液，其包含：

(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或

(c)补充营养素，其包含痕量金属、维生素、盐、酵母氮源基础、YNB和/或氨基酸；

其中由所述重组宿主细胞生产的所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷在至少每升所述细胞培养物1mg的浓度下存在。

本发明还提供由本文所公开的重组宿主细胞所生产的一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷；其中有所述重组宿主细胞生产的所述一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷以与甜叶菊植物的甜菊糖苷组合物不同的相对量存在，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有降低水平的甜叶菊植物来源组分。

本发明还提供由本文所公开的方法所生产的一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷；其中有所述重组宿主细胞生产的所述一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷以与甜叶菊植物的甜菊糖苷组合物不同的相对量存在，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有降低水平的甜叶菊植物来源组分。

本发明还提供甜味剂组合物，其包含由本文所公开的重组宿主细胞或方法所生产的一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷。

本发明还提供一种食物产品，其包含本文所公开的甜味剂组合物。

本发明还提供一种饮料或饮料浓缩物，其包含本文所公开的甜味剂组合物。

本发明还提供一种分离的核酸分子，其编码能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽或其催化活性部分，其中所述编码的多肽或所述其催化活性部分包括与SEQID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ ID NO：4的残基15、16、18、20、27、28、30、31、49、51、67、68、73、75、79、81、83、84、86-88、90、91、96、99、107、110、111、113、115、119-121、123、128、129、135、136、140、141、143、146、147、156、162、166、169、173、176、179-181、183-189、191-195、200、204、209、211、212、215、221、222、224、232、237、247、252、255、257、259、263、265、266、269、274、280、284、285、287、292、295-298、300、301、303、310、311、313、315、316、320、322、325、326、328、329、332、333、335、338、341、346、347、357、364、370、371、373、375-377、380、385、387-391、396、401、407-411、415、416、419、424、426、427、434、448、449、455、456或458的一个或多个氨基酸取代的多肽。

本发明还提供一种分离的核酸分子，其编码能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽或其催化活性部分，其中所述编码的多肽或所述其催化活性部分包括与SEQID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ ID NO：4的至少一个氨基酸取代即L15V、I16L、F18Y、L20A、F27M、I28L、F30L、G31S、G31A、T49I、N51K、Q67E、A68T、C73F、E75D、M79A、E83D、E83K、S84A、L86I、E87D、T88R、K90W、Q91E、S96T、D99E、E107S、T110P、I111V、A113C、I115V、M119F、T120L、E121P、V123A、I128K、E129Q、G135A、S136A、Q140N、A141S、V143A、S146N、L147I、I156L、E162T、V166L、F169L、Q173E、E176D、L179S、I180F、L181V、N183D、H184P、E185G、Q186S、I187Y、Q188P、S189A、W191F、S192D、Q193M、M194V、L195V、A200S、Q204K、F209L、N211H、S212T、K215E、I221V、E222D、T224M、V232T、L237I、D247E、N252Y、N255S、Y257F、A259P、E263A、M265I、N266K、N266E、D269N、E274G、A280S、L284M、V285A、H287L、V292M、I295L、I295M、T296A、R297W、A298G、I300K、D301N、D303N、I310V、K311R、K313S、E315Q、G316A、E320K、L322F、V325E、I326T、T328S、G329E、L332I、I333V、A335S、K338P、D341E、E346P、E346K、S347A、F357W、I364L、V370M、V371I、M373V、Q375L、F376W、S377T、T380S、L385F、D387E、E388D、I389V、L390W、G391K、V396A、N401K、G407E、N408E、L409I、A410E、S411D、M415E、I416V、E419G、I424E、R426K、K427E、D434E、N448K、D449N、S455A、E456K或I458V的多肽。

在本文所公开的核酸的一个方面中，所述核酸为cDNA。

本发明还提供一种能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽或其催化活性部分，其中所述编码的多肽或所述其催化活性部分包括与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ ID NO：4的残基15、16、18、20、27、28、30、31、49、51、67、68、73、75、79、81、83、84、8688、90、91、96、99、107、110、111、113、115、119-121、123、128、129、135、136、140、141、143、146、147、156、162、166、169、173、176、179-181、183-189、191-195、200、204、209、211、212、215、221、222、224、232、237、247、252、255、257、259、263、265、266、269、274、280、284、285、287、292、295-298、300、301、303、310、311、313、315、316、320、322、325、326、328、329、332、333、335、338、341、346、347、357、364、370、371、373、375-377、380、385、387-391、396、401、407-411、415、416、419、424、426、427、434、448、449、455、456或458的一个或多个氨基酸取代的多肽。

本发明还提供一种能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽或其催化活性部分，其中所述编码的多肽或所述其催化活性部分包括与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ ID NO：4的至少一个氨基酸取代即L15V、I16L、F18Y、L20A、F27M、I28L、F30L、G31S、G31A、T49I、N51K、Q67E、A68T、C73F、E75D、M79A、E83D、E83K、S84A、L86I、E87D、T88R、K90W、Q91E、S96T、D99E、E107S、T110P、I111V、A113C、I115V、M119F、T120L、E121P、V123A、I128K、E129Q、G135A、S136A、Q140N、A141S、V143A、S146N、L147I、I156L、E162T、V166L、F169L、Q173E、E176D、L179S、I180F、L181V、N183D、H184P、E185G、Q186S、I187Y、Q188P、S189A、W191F、S192D、Q193M、M194V、L195V、A200S、Q204K、F209L、N211H、S212T、K215E、I221V、E222D、T224M、V232T、L237I、D247E、N252Y、N255S、Y257F、A259P、E263A、M265I、N266K、N266E、D269N、E274G、A280S、L284M、V285A、H287L、V292M、I295L、I295M、T296A、R297W、A298G、I300K、D301N、D303N、I310V、K311R、K313S、E315Q、G316A、E320K、L322F、V325E、I326T、T328S、G329E、L332I、I333V、A335S、K338P、D341E、E346P、E346K、S347A、F357W、I364L、V370M、V371I、M373V、Q375L、F376W、S377T、T380S、L385F、D387E、E388D、I389V、L390W、G391K、V396A、N401K、G407E、N408E、L409I、A410E、S411D、M415E、I416V、E419G、I424E、R426K、K427E、D434E、N448K、D449N、S455A、E456K或I458V的多肽。

在所述多肽或其催化活性部分的一个方面中，其中所述多肽或所述其催化活性部分为纯化的多肽或其催化活性部分。

本发明的这些和其他特征和优点将通过以下详细描述结合所附权利要求书而得到更充分地理解。应注意，权利要求书的范围由其中的表述限定，而非由本描述中列出的特性和优点的特定讨论限定。

附图说明

当结合以下附图阅读时，可以最好地理解本发明的实施方案的以下详细描述，其中类似结构用类似参考数字指示，并且其中：

图1示出通过合适的UGT酶催化的代表性主要甜菊糖苷糖基化反应和若干甜菊糖苷化合物的化学结构。

图2示出从异戊烯基磷酸酯生产甜菊醇、糖基化内根-贝壳杉烯酸和糖基化内根-贝壳杉烯醇的生物化学途径。

技术人员将了解，附图中的元件出于简洁和清楚目的而示出，并且不一定要按比例绘制。例如，附图中一些元件的尺寸可相对于其他元件被扩大，以有助于提高对本发明的一个或多个实施方案的理解。

具体实施方式

本文引用的所有公布、专利和专利申请均出于所有目的以引用的方式明确并入本文。

在详细描述本发明之前，将定义许多术语。除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指代物。例如，提及一个“核酸”意指一个或多个核酸。

应注意，术语如“优选地”、“通常地”和“一般地”在本文中不用于限制要求保护的发明的范围或暗示某些特性对于要求保护的发明的结构或功能是关键的、必要的或甚至重要的。相反，这些术语仅仅旨在突出可以或不可以用于本发明的具体实施方案中的替代的或另外的特征。

出于描述和限定本发明的目的，应注意，术语“基本上”在本文中用于表示可归因于任何定量比较、值、测量或其他表示的固有不确定程度。术语“基本上”在本文中还用于表示定量表示可以与规定的参考不同的程度，而不导致讨论中的主题的基本功能发生变化。

可使用本领域的技术人员熟知的方法来构建根据本发明的遗传表达构建体和重组细胞。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、体内重组技术和聚合酶链反应(PCR)技术。参见，例如，如Green和Sambrook，2012，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第四版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Ausubel等，1989，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NewYork；以及PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis等，1990，Academic Press，San Diego，CA)所述的技术。

根据如技术人员所理解的上下文在单链或双链实施方案中，如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可以互换地用于指代包括DNA、RNA、其衍生物或其组合的核酸。

如本文所用，术语“微生物”、“微生物宿主”、“微生物宿主细胞”、“重组宿主”和“重组宿主细胞”可以互换使用。如本文所用，术语“重组宿主”旨在指代其基因组已被至少一个DNA序列扩充的宿主。此类DNA序列包括但不限于非天然存在的基因、未正常转录成RNA或翻译成蛋白质(“被表达”)的DNA序列和希望引入到宿主中的其他基因或DNA序列。应了解，通常本文所述的重组宿主的基因组通过稳定引入一种或多种重组基因来扩充。通常，引入的DNA最初并未驻留在作为DNA受体的宿主中，但在本公开的范围内从给定宿主中分离DNA区段并且随后将该DNA的一个或多个另外的拷贝引入相同宿主中，例如以增强基因产物的产生或者改变基因的表达模式。在一些情况下，引入的DNA将通过例如同源重组或定点诱变来修饰或甚至替代内源基因或DNA序列。合适的重组宿主包括微生物。

如本文所用，术语“细胞培养物”是指包含一种或多种重组宿主的培养基。细胞培养物可包含单一重组宿主菌株，或者可包含两种或更多种不同的宿主菌株。培养基可以为任何培养基，其可包含重组宿主，例如液体培养基(即，培养发酵液)或半固体培养基，且可包含额外组分，例如，UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖、N-乙酰基-葡糖胺、葡萄糖、果糖、蔗糖、痕量金属、维生素、盐、酵母氮源基础(YNB)等。

如本文所用，术语“重组基因”是指引入到受体宿主中的基因或DNA序列，无论此一宿主中是否已经存在相同或类似的基因或DNA序列。在此上下文中“引入”或“扩充”在本领域中已知意指通过人工手动引入或扩充。因此，重组基因可以是来自另一物种的DNA序列或者可以是来源于或存在于相同物种但已通过重组方法并入宿主中以形成重组宿主的DNA序列。应了解，引入到宿主中的重组基因可以是与通常存在于正在转化的宿主中的DNA序列相同的并且被引入以提供DNA的一个或多个另外的拷贝，从而允许那个DNA的基因产物过度表达或修饰的表达。在一些方面中，所述重组基因由eDNA编码。在其他实施方案中，重组基因为合成的和/或被密码子优化以在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达。

如本文所用，术语“工程化生物合成途径”是指重组宿主中发生的生物合成途径，如本文所述。在一些方面中，生物合成途径的一个或多个步骤并不天然存在于未修饰的宿主中。在一些实施方案中，将异源版本的基因引入到包含内源版本的基因的宿主中。

如本文所用，术语“内源”基因是指来源于具体生物体、组织或细胞或者在具体生物体、组织或细胞内产生或合成的基因。在一些实施方案中，内源基因为酵母基因。在一些实施方案中，基因为酿酒酵母内源的，包括但不限于酿酒酵母菌株S288C。在一些实施方案中，内源酵母基因是过度表达的。如本文所用，术语“过度表达”用于指代生物体中的基因表达水平高于野生型生物体中的基因表达水平。参见例如Prelich，2012，Genetics 190：841-54。在一些实施方案中，内源酵母基因是缺失的。参见例如Giaever和Nislow，2014，Genetics 197(2)：451-65。如本文所用，术语“缺失”、“缺失的”、“敲除”和“敲除的”可以互换地用于指代已被操纵以不再在生物体中表达的内源基因，所述生物体包括但不限于酿酒酵母。

如本文所用，术语“异源序列”和“异源编码序列”用于描述来源于除重组宿主之外的物种的序列。在一些实施方案中，重组宿主为酿酒酵母细胞，并且异源序列来源于除酿酒酵母之外的生物体。异源编码序列例如可以来自原核微生物、真核微生物、植物、动物、昆虫或不同于表达异源序列的重组宿主的真菌。在一些实施方案中，编码序列为宿主原生序列。

如本文所用，术语“组成性(constitutive)”、“组成性表达(constitutiveexpression)”或“组成性表达(constitutively expressed)”是指基因的连续转录，其导致蛋白质的连续表达。

如本文所用，术语“诱导性(inducible)”、“诱导性表达(inducible expression)”或“诱导性表达(inducibly expressed)”是指回应于刺激的基因表达。刺激包括但不限于化学品、应力或生物刺激。

“可选择标记”可以是补充宿主细胞营养缺陷、提供抗生素抗性或引起颜色变化的任何数目的基因之一。然后使用本领域熟知的方法将基因替代载体的线性化DNA片段引入到细胞中(参见下文)。线性片段向基因组中的整合和基因的破坏可以基于选择标记来确定并且可以通过例如PCR或DNA印迹分析来验证。在选择中使用之后，可选择标记可以通过例如Cre-LoxP系统从宿主细胞基因组中去除(参见，例如Gossen等，2002，Ann.Rev.Genetics36：153-173和U.S.2006/0014264)。可替代地，基因替代载体可以一种方式构建以便包含待破坏的基因的一部分，其中所述部分没有任何内源基因启动子序列并且没有编码基因编码序列或编码所述序列的无活性片段。

如本文所用，术语“变体”和“突变体”用于描述与具体蛋白质的野生型序列相比已在一个或多个氨基酸处修饰的蛋白质序列。

如本文所用，术语“非活性片段”为编码具有例如由基因全长编码序列产生的蛋白质的活性的小于约10％(例如，小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％或0％)的蛋白质的基因片段。基因的此部分以一种方式插入在载体中，使得没有已知的启动子序列可操作地连接至基因序列，但是终止密码子和转录终止序列可操作地连接至基因序列的所述部分。此载体可以随后在基因序列的部分中被线性化并转化到细胞中。通过单一同源重组，此线性化载体然后在其灭活的情况下被整合在基因的内源对应物中。

如本文所用，术语“甜菊糖苷”是指莱苞迪苷A(RebA)(目录号58543-16-1)、莱苞迪苷B(RebB)(目录号58543-17-2)、莱苞迪苷C(RebC)(目录号63550-99-2)、莱苞迪苷D(RebD)(目录号63279-13-0)、莱苞迪苷E(RebE)(目录号63279-14-1)、莱苞迪苷F(RebF)(目录号438045-89-7)、莱苞迪苷M(RebM)(目录号1220616-44-3)、甜茶苷(目录号63849-39-4)、杜克苷A(目录号64432-06-0)、莱苞迪苷I(RebI)(MassBank记录：FU000332)、莱苞迪苷Q(RebQ)、1，2-甜菊苷(目录号57817-89-7)、1，3-甜菊苷(RebG)、甜菊醇-1，2-二糖苷(MassBank记录：FU000299)、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、三糖基化甜菊糖苷、四糖基化甜菊糖苷、五糖基化甜菊糖苷、六糖基化甜菊糖苷、七糖基化甜菊糖苷和其异构体。参见图1；还参见Steviol GlycosidesChemical and Technical Assessment 69th JECFA，2007，由Harriet Wallin制定，FoodAgric.Org。

如本文所用，术语“甜菊糖苷前体”和“甜菊糖苷前体化合物”用于指代甜菊糖苷生物合成途径中的中间体化合物。甜菊糖苷前体包括但不限于香叶基香叶基二磷酸酯(GGPP)、内根-柯巴基-二磷酸酯、内根-贝壳杉烯、内根-贝壳杉烯醇、内根-贝壳杉烯醛、内根-贝壳杉烯酸和甜菊醇。参见图2。另外如本文所用，术语“甜菊醇前体”和“甜菊醇前体化合物”用于指代甜菊醇生物合成途径中的中间体化合物。甜菊醇前体还可为甜菊糖苷前体，并且包括但不限于香叶基香叶基二磷酸酯(GGPP)、内根-柯巴基-二磷酸酯、内根-贝壳杉烯、内根-贝壳杉烯醇、内根-贝壳杉烯醛和内根-贝壳杉烯酸。另外如本文所用，术语“甜菊醇前体”和“甜菊醇前体化合物”用于指代甜菊醇生物合成途径中的中间体化合物。

另外如本文所用，术语“甜菊醇前体糖苷”用于指代可被糖基化的甜菊醇前体，例如，三糖基化内根-贝壳杉烯酸(内根-贝壳杉烯酸+3Glc)、二糖基化内根-贝壳杉烯酸、单糖基化内根-贝壳杉烯酸、三糖基化内根-贝壳杉烯醇、二糖基化内根-贝壳杉烯醇(内根-贝壳杉烯醇+2Glc)或单糖基化内根-贝壳杉烯醇(内根-贝壳杉烯醇+1Glc；例如，贝壳杉烯酯-19-O-葡糖苷或19-KMG)。在一些实施方案中，甜菊糖苷前体本身为甜菊糖苷化合物。例如，19-SMG、甜茶苷、甜菊苷和RebE为RebM的甜菊糖苷前体。参见图1。

如本文所用，术语“接触”用于指代两个对象之间的任何物理相互作用。例如，术语“接触”可以指代酶与底物之间的相互作用。在另一实施例中，术语“接触”可以指代液体(例如，上清液)与吸附树脂之间的相互作用。

甜菊醇前体还可为甜菊糖苷前体，并且包括但不限于香叶基香叶基二磷酸酯(GGPP)、内根-柯巴基-二磷酸酯、内根-贝壳杉烯、内根-贝壳杉烯醇、内根-贝壳杉烯醛和内根-贝壳杉烯酸。甜菊糖苷和/或甜菊糖苷前体或者甜菊醇前体糖苷可在体内(即，在重组宿主中)、在体外(即，以酶促方式)或通过全细胞生物转化来产生。

如本文所用，术语“产生”和“累积”可以互换地用于描述在体内、在体外或通过全细胞生物转化进行的甜菊糖苷和甜菊糖苷前体的合成。

如本文所用，术语“培养发酵液”、“培养基”和“生长培养基”可互换地用于指代支持细胞生长的液体或固体。培养发酵液可包含葡萄糖、果糖、蔗糖、痕量金属、维生素、盐、酵母氮源基础(YNB)和/或氨基酸。痕量金属可以是二价阳离子，包括但不限于Mn²⁺和/或Mg²⁺。在一些实施方案中，Mn²⁺可以是以MnCl₂二水合物的形式并且范围为约0.01g/L至100g/L。在一些实施方案中，Mg²⁺可以是以MgSO₄七水合物的形式并且范围为约0.01g/L至100g/L。例如，培养发酵液可包含i)约0.02-0.03g/L MnCl₂二水合物和约0.5-3.8g/L MgSO₄七水合物，ii)约0.03-0.06g/L MnCl₂二水合物和约0.5-3.8g/L MgSO₄七水合物，和/或iii)约0.03-0.17g/L MnCl₂二水合物和约0.5-7.3g/L MgSO₄七水合物。另外，培养发酵液可包含一种或多种由重组宿主产生的甜菊糖苷，如本文所述。

重组产甜菊糖苷酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S.cerevisiae)菌株描述于WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328中，所述专利各自以全文引用的方式并入。通过全细胞生物转化在重组宿主中以及在体外产生甜菊糖苷的方法还描述于WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328中。

在一些实施方案中，包含以下的重组宿主可在体内生产甜菊醇：编码能够从法尼基二磷酸酯(FPP)和异戊烯基二磷酸酯(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)的多肽(例如，香叶基香叶基二磷酸酯合酶(GGPPS)多肽)的基因；编码能够从GGPP合成内根-柯巴基二磷酸酯的多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸酯合酶(CDPS)多肽)的基因；编码能够从内根-柯巴基二磷酸酯合成内根-贝壳杉烯的多肽(例如，贝壳杉烯合酶(KS)多肽)的基因；编码能够从内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽(例如，贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽)的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，细胞色素P450还原酶(CPR)多肽或P450氧化还原酶(POR)多肽；例如但不限于能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，在NADPH向NADP⁺的转化期间从NADPH向细胞色素P450复合物的电子转移)，其用作萜类化合物生物合成的辅因子)的基因；编码能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，甜菊醇合酶(KAH)多肽)的基因；和/或编码能够从GGPP合成内根-柯巴基二磷酸酯并且从内根-柯巴基二磷酸酯合成根-贝壳杉烯的双功能多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸酯合酶(CDPS)-内根-贝壳杉烯合酶(KS)多肽)的基因。参见例如图1。技术人员将了解，这些基因中的一种或多种可以是宿主内源的，前提是这些基因中的至少一种(并且在一些实施方案中为所有)为引入到重组宿主中的重组基因。

在一些实施方案中，包含以下的重组宿主可体内生产甜菊糖苷：编码能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽(例如，UGT85C2多肽)的基因；编码能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽(例如，UGT76G1多肽)的基因；编码能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽(例如，UGT74G1多肽)的基因；和/或编码能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽(例如，UGT91D2或EUGT11多肽)的基因。技术人员将了解，这些基因中的一种或多种可以是宿主内源的，前提是这些基因中的至少一种(并且在一些实施方案中为所有)为引入到重组宿主中的重组基因。

在一些实施方案中，甜菊糖苷和/或甜菊糖苷前体在重组宿主体内通过表达参与甜菊糖苷生物合成途径的一种或多种酶来产生。例如，包含以下的重组宿主可在体内生产甜菊糖苷和/或甜菊糖苷前体：编码能够从FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够从GGPP合成内根-柯巴基二磷酸酯的多肽的基因；编码能够从内根-柯巴基二磷酸酯合成内根-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够从内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够从GGPP合成内根-柯巴基二磷酸酯并且从内根-柯巴基二磷酸酯合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因；能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽的基因；编码能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽的基因；编码能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽的基因；和/或编码能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽的基因。参见例如图1和图2。技术人员将了解，这些基因中的一种或多种可以是宿主内源的，前提是这些基因中的至少一种(并且在一些实施方案中为所有)为引入到重组宿主中的重组基因。

在一些实施方案中，产甜菊醇重组微生物包含编码以下的异源核酸：能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽；能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽；能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽；和能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽。

在一些实施方案中，产甜菊醇重组微生物包含编码以下的异源核酸：能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽；能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽；和能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽。

在一些方面中，以下多肽将葡萄糖分子从二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-葡萄糖)转移到甜菊醇和/或甜菊糖苷：能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽；能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽；能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽；和/或能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽。

在一些方面中，能够从法尼基二磷酸酯(FPP)和异戊烯基二磷酸酯(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)的包括具有SEQ ID NO：20(其可由SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：22(由SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：24(由SEQID NO：23所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：26(由SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：28(由SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：30(由SEQ IDNO：29所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：32(由SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：116(其可由SEQ ID NO：115所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。

在一些方面中，能够从GGPP合成内根-柯巴基二磷酸酯的多肽包含具有SEQ IDNO：34(其可由SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：36(由SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：38(由SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：40(由SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：42(由SEQ ID NO：41所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，能够从GGPP合成内根-柯巴基二磷酸酯的多肽缺乏叶绿体转运肽。例如，能够从GGPP合成内根-柯巴基二磷酸酯、缺乏叶绿体转运肽的多肽可以包括具有SEQ D NO：120(由SEQ ID NO：119所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。

在一些方面中，能够从内根-柯巴基焦磷酸酯合成内根-贝壳杉烯的多肽包含具有SEQ ID NO：44(其可由SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：46(由SEQ IDNO：45所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：48(由SEQ ID NO：47所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：50(由SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：52(由SEQ ID NO：51所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。

在一些方面中，能够从内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸的多肽包括具有SEQID NO：60(其可由SEQ ID NO：59所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：62(由SEQ ID NO：61所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：117(由SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：66(由SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：68(由SEQID NO：67所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：70(由SEQ ID NO：69所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：72(由SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：74(由SEQ IDNO：73所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：76(由SEQ ID NO：75所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。

在一些方面中，能够还原细胞色素P450复合物的多肽包括具有SEQ ID NO：78(其可由SEQ ID NO：77所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：80(由SEQ ID NO：79所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：82(由SEQ ID NO：81所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：84(由SEQID NO：83所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：86(由SEQ ID NO：85所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：88(由SEQ ID NO：87所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：90(由SEQ IDNO：89所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：92(由SEQ ID NO：91所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。

在一些方面中，能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽包括具有SEQ ID NO：94(其可由SEQ ID NO：93所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：97(由SEQ ID NO：95或SEQID NO：96所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：100(由SEQ ID NO：98或SEQ ID NO：99所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQID NO：106(由SEQ ID NO：105所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：108(由SEQ ID NO：107所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：110(由SEQ ID NO：109所示的核苷酸序列编码)、SEQID NO：112(由SEQ ID NO：111所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：114(由SEQ ID NO：113所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。

在一些实施方案中，重组宿主包含：编码能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽的核酸(SEQ ID NO：7)；编码能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽的核酸(SEQ ID NO：9)；编码能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽的核酸(SEQ ID NO：4)；能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽的核酸(SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13)。在一些方面中，能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列编码，能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列编码，能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽由SEQ ID NO：118或SEQ ID NO：3所示的核苷酸编码，能够β1，2糖基化甜菊糖苷13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽由SEQ ID NO：10、12、14或15中任一个所示的核苷酸序列编码。

在某些实施方案中，所生产的甜菊糖苷为RebA、RebB、RebD和/或RebM。RebA可以在表达以下的产甜菊醇重组微生物中合成：能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽；能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽；能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽；和能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽。RebB可以在表达以下的产甜菊醇重组微生物中合成：能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽；能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽；和能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽。RebD可以在表达以下的产甜菊醇重组微生物中合成：能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽；能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽；能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽；和能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽。RebM可以在表达以下的产甜菊醇重组微生物中合成：能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽；能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽；能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽；和能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽(参见图2)。

在一些实施方案中，一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷是通过全细胞生物转化来产生。对于发生的全细胞生物转化而言，表达参与甜菊糖苷途径的一种或多种酶的宿主细胞消耗并修饰细胞内的甜菊糖苷；在体内修饰之后，甜菊糖苷保留在细胞内和/或分泌到培养基中。例如，表达以下的宿主细胞可以将甜菊醇和糖基化甜菊醇吸收在细胞中：编码能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽的基因；编码能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽的基因；编码能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽的基因；和/或编码能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽的基因；在体内糖基化之后，甜菊糖苷可被分泌到培养基中。

在一些实施方案中，本文所公开的生产一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷的方法包括使用能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽在重组宿主细胞的细胞培养基中全细胞生物转化植物来源或合成甜菊醇和/或甜菊糖苷，所述多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ ID NO：4的残基15、16、18、20、27、28、30、31、49、51、67、68、73、75、79、81、83、84、86-88、90、91、96、99、107、110、111、113、115、119-121、123、128、129、135、136、140、141、143、146、147、156、162、166、169、173、176、179-181、183-189、191-195、200、204、209、211、212、215、221、222、224、232、237、247、252、255、257、259、263、265、266、269、274、280、284、285、287、292、295-298、300、301、303、310、311、313、315、316、320、322、325、326、328、329、332、333、335、338、341、346、347、357、364、370、371、373、375-377、380、385、387-391、396、401、407-411、415、416、419、424、426、427、434、448、449、455、456或458的一个或多个氨基酸取代；其中所述多肽为重组多肽；并且从而合成所述一种或多种甜菊糖苷或甜菊糖苷组合物。

在一些实施方案中，本文所公开的生产一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷的方法包括在本文所公开的重组宿主细胞的细胞培养基中全细胞生物转化植物来源或合成甜菊醇和/或甜菊糖苷，能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽包含SEQ IDNO：4的至少一个氨基酸取代，即L15V、I16L、F18Y、L20A、F27M、I28L、F30L、G31S、G31A、T49I、N51K、Q67E、A68T、C73F、E75D、M79A、E83D、E83K、S84A、L86I、E87D、T88R、K90W、Q91E、S96T、D99E、E107S、T110P、I111V、A113C、I115V、M119F、T120L、E121P、V123A、I128K、E129Q、G135A、S136A、Q140N、A141S、V143A、S146N、L147I、I156L、E162T、V166L、F169L、Q173E、E176D、L179S、I180F、L181V、N183D、H184P、E185G、Q186S、I187Y、Q188P、S189A、W191F、S192D、Q193M、M194V、L195V、A200S、Q204K、F209L、N211H、S212T、K215E、I221V、E222D、T224M、V232T、L237I、D247E、N252Y、N255S、Y257F、A259P、E263A、M265I、N266K、N266E、D269N、E274G、A280S、L284M、V285A、H287L、V292M、I295L、I295M、T296A、R297W、A298G、I300K、D301N、D303N、I310V、K311R、K313S、E315Q、G316A、E320K、L322F、V325E、I326T、T328S、G329E、L332I、I333V、A335S、K338P、D341E、E346P、E346K、S347A、F357W、I364L、V370M、V371I、M373V、Q375L、F376W、S377T、T380S、L385F、D387E、E388D、I389V、L390W、G391K、V396A、N401K、G407E、N408E、L409I、A410E、S411D、M415E、I416V、E419G、I424E、R426K、K427E、D434E、N448K、D449N、S455A、E456K或I458V。

在一些实施方案中，细胞被透化以吸收待修饰的底物或者分泌修饰的产物。在一些实施方案中，可以添加透化剂来帮助原料进入宿主并帮助产物排出。在一些实施方案中，细胞用溶剂(诸如甲苯)或用洗涤剂(诸如Triton-X或Tween)进行透化。在一些实施方案中，细胞用表面活性剂透化，例如阳离子表面活性剂，诸如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。在一些实施方案中，细胞通过周期性机械休克(诸如电穿孔或轻微渗透休克)进行透化。例如，可以将培养的微生物的粗裂解液离心，以获得上清液。然后可将所得上清液应用于色谱柱，例如C18柱，并且用水洗涤以去除亲水性化合物，接着用溶剂诸如甲醇洗脱感兴趣的一种或多种化合物。然后可通过制备型HPLC进一步纯化所述一种或多种化合物。还参见WO 2009/140394。

在一些实施方案中，通过共培养两种或更多种宿主来生产甜菊醇、一种或多种甜菊糖苷前体和/或一种或多种甜菊糖苷。在一些实施方案中，一种或多种宿主生产出甜菊醇、一种或多种甜菊糖苷前体和/或一种或多种甜菊糖苷，所述宿主各自表达参与甜菊糖苷途径的一种或多种酶。例如，表达编码能够从FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够从GGPP合成内根-柯巴基二磷酸酯的多肽的基因；编码能够从内根-柯巴基二磷酸酯合成内根-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够从内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；和/或编码能够从GGPP合成内根-柯巴基二磷酸酯并且从内根-柯巴基二磷酸酯合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因的宿主以及编码能够在C-13羟基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽的基因；编码能够β1，3糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′的多肽的基因；编码能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽的基因；和/或编码能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽的基因的宿主生产出一种或多种甜菊糖苷。

在一些实施方案中，甜菊糖苷包括但不限于例如甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、莱苞迪苷A(RebA)、莱苞迪苷B(RebB)、莱苞迪苷C(RebC)、莱苞迪苷D(RebD)、莱苞迪苷E(RebE)、莱苞迪苷F(RebF)、莱苞迪苷M(RebM)、莱苞迪苷Q(RebQ)、莱苞迪苷I(RebI)、杜克苷A、单糖基化内根-贝壳杉烯酸、二糖基化内根-贝壳杉烯酸、三糖基化内根-贝壳杉烯酸、单糖基化内根-贝壳杉烯醇(例如，贝壳杉烯酯-19-O-葡糖苷或19-KMG)、二糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化甜菊糖苷、四糖基化甜菊糖苷、五糖基化甜菊糖苷、六糖基化甜菊糖苷、七糖基化甜菊糖苷或其异构体。

在一些实施方案中，适用于体内在重组宿主中或通过全细胞生物转化来生产甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷(诸如贝壳杉烯酯-19-O-葡糖苷(19-KMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)和甜茶苷)的多肽包括能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽，诸如UGT74G1(SEQ ID NO：4)的功能性同源物。如下文“功能性同源物”节中所述，本文所公开的功能性同源物可包括但不限于例如保守氨基酸取代，诸如像，用一个疏水性残基取代另一个疏水性残基或用一个极性残基取代另一个极性残基。

在一些实施方案中，可用的UGT74G1同源物可在残基15、16、18、20、27、28、30、31、49、51、67、68、73、75、79、81、83、84、86-88、90、91、96、99、107、110、111、113、115、119-121、123、128、129、135、136、140、141、143、146、147、156、162、166、169、173、176、179-181、183-189、191-195、200、204、209、211、212、215、221、222、224、232、237、247、252、255、257、259、263、265、266、269、274、280、284、285、287、292、295-298、300、301、303、310、311、313、315、316、320、322、325、326、328、329、332、333、335、338、341、346、347、357、364、370、371、373、375-377、380、385、387-391、396、401、407-411、415、416、419、424、426、427、434、448、449、455、456或458处具有一个或多个氨基酸取代。参见表1。

可用的UGT74G1同源物的非限制性实例包括在以下残基处具有取代(相对于SEQID NO：4)的取代的多肽：15(例如，在残基15处的缬氨酸)；16(例如，在残基16处的亮氨酸)；18(例如，在残基18处的酪氨酸)；20(例如，在残基20处的丙氨酸)；27(例如，在残基27处的甲硫氨酸)；28(例如，在残基28处的亮氨酸)；30(例如，在残基30处的亮氨酸)；31(例如，在残基31处的丝氨酸或丙氨酸)；49(例如，在残基49处的异亮氨酸)；51(例如，在残基51处的赖氨酸)；67(例如，在残基67处的谷氨酸)；68(例如，在残基68处的苏氨酸)；73(例如，在残基73处的苯基丙氨酸)；75(例如，在残基75处的天冬氨酸)；79(例如，在残基79处的丙氨酸)；81(例如，在残基81处的色氨酸)；83(例如，在残基83处的天冬氨酸或赖氨酸)；84(例如，在残基84处的丙氨酸)；86(例如，在残基86处的异亮氨酸)；87(例如，在残基87处的天冬氨酸)；88(例如，在残基88处的精氨酸)；90(例如，在残基90处的色氨酸)；91(例如，在残基91处的谷氨酸)；96(例如，在残基96处的苏氨酸)；99(例如，在残基99处的谷氨酸)；107(例如，在残基107处的丝氨酸)；110(例如，在残基110处的脯氨酸)；111(例如，在残基111处的缬氨酸)；113(例如，在残基113处的半胱氨酸)；115(例如，在残基115处的缬氨酸)；119(例如，在残基119处的苯基丙氨酸)；120(例如，在残基120处的亮氨酸)；121(例如，在残基121处的脯氨酸)；123(例如，在残基123处的丙氨酸)；128(例如，在残基128处的赖氨酸)；129(例如，在残基129处的谷氨酰胺)；135(例如，在残基135处的丙氨酸)；136(例如，在残基136处的丙氨酸)；140(例如，在残基140处的天门冬酰胺)；141(例如，在残基141处的丝氨酸)；143(例如，在残基143处的丙氨酸)；146(例如，在残基146处的天门冬酰胺)；147(例如，在残基147处的异亮氨酸)；156(例如，在残基156处的亮氨酸)；162(例如，在残基162处的苏氨酸)；166(例如，在残基166处的亮氨酸)；169(例如，在残基169处的亮氨酸)；173(例如，在残基173处的谷氨酸)；176(例如，在残基176处的天冬氨酸)；179(例如，在残基179处的丝氨酸)；180(例如，在残基180处的苯基丙氨酸)；181(例如，在残基181处的缬氨酸)；183(例如，在残基183处的天冬氨酸)；184(例如，在残基184处的脯氨酸)；185(例如，在残基185处的甘氨酸)；186(例如，在残基186处的丝氨酸)；187(例如，在残基187处的酪氨酸)；188(例如，在残基188处的脯氨酸)；189(例如，在残基189处的丙氨酸)；191(例如，在残基191处的苯基丙氨酸)；192(例如，在残基192处的天冬氨酸)；193(例如，在残基193处的甲硫氨酸)；194(例如，在残基194处的缬氨酸)；195(例如，在残基195处的缬氨酸)；200(例如，在残基200处的丝氨酸)；204(例如，在残基204处的赖氨酸)；209(例如，在残基209处的亮氨酸)；211(例如，在残基211处的组氨酸)；212(例如，在残基212处的苏氨酸)；215(例如，在残基215处的谷氨酸)；221(例如，在残基221处的缬氨酸)；222(例如，在残基222处的天冬氨酸)；224(例如，在残基224处的甲硫氨酸)；232(例如，在残基232处的苏氨酸)；237(例如，在残基237处的异亮氨酸)；247(例如，在残基247处的谷氨酸)；252(例如，在残基252处的酪氨酸)；255(例如，在残基255处的丝氨酸)；257(例如，在残基257处的苯基丙氨酸)；259(例如，在残基259处的脯氨酸)；263(例如，在残基263处的丙氨酸)；265(例如，在残基265处的异亮氨酸)；266(例如，在残基266处的赖氨酸或谷氨酸)；269(例如，在残基269处的天门冬酰胺)；274(例如，在残基274处的甘氨酸)；280(例如，在残基280处的丝氨酸)；284(例如，在残基284处的甲硫氨酸)；285(例如，在残基285处的丙氨酸；287(例如，在残基287处的亮氨酸)；292(例如，在残基292处的甲硫氨酸)；295(例如，在残基295处的亮氨酸或甲硫氨酸)；296(例如，在残基296处的丙氨酸)；297(例如，在残基297处的色氨酸)；298(例如，在残基298处的甘氨酸)；300(例如，在残基300处的赖氨酸)；301(例如，在残基301处的天门冬酰胺)；303(例如，在残基303处的天门冬酰胺)；310(例如，在残基310处的缬氨酸)；311(例如，在残基311处的精氨酸)；313(例如，在残基313处的丝氨酸)；315(例如，在残基315处的谷氨酰胺)；316(例如，在残基316处的丙氨酸)；320(例如，在残基320处的赖氨酸)；322(例如，在残基322处的苯基丙氨酸)；325(例如，在残基325处的谷氨酸)；326(例如，在残基326处的苏氨酸)；328(例如，在残基328处的丝氨酸)；329(例如，在残基329处的谷氨酸)；332(例如，在残基332处的异亮氨酸)；333(例如，在残基333处的缬氨酸)；335(例如，在残基335处的丝氨酸)；338(例如，在残基338处的脯氨酸)；341(例如，在残基341处的谷氨酸)；346(例如，在残基346处的赖氨酸或脯氨酸)；347(例如，在残基347处的丙氨酸)；357(例如，在残基357处的色氨酸)；364(例如，在残基364处的亮氨酸)；370(例如，在残基370处的甲硫氨酸)；371(例如，在残基371处的异亮氨酸)；373(例如，在残基373处的缬氨酸)；375(例如，在残基375处的亮氨酸)；376(例如，在残基376处的色氨酸)；377(例如，在残基377处的苏氨酸)；380(例如，在残基380处的丝氨酸)；385(例如，在残基385处的苯基丙氨酸)；387(例如，在残基387处的谷氨酸)；388(例如，在残基388处的天冬氨酸)；389(例如，在残基389处的缬氨酸)；390(例如，在残基390处的色氨酸)；391(例如，在残基391处的赖氨酸)；396(例如，在残基396处的丙氨酸)；401(例如，在残基401处的赖氨酸)；407(例如，在残基407处的谷氨酸)；408(例如，在残基408处的谷氨酸)；409(例如，在残基409处的异亮氨酸)；410(例如，在残基410处的谷氨酸)；411(例如，在残基411处的天冬氨酸)；415(例如，在残基415处的谷氨酸)；416(例如，在残基416处的缬氨酸)；419(例如，在残基419处的甘氨酸)；424(例如，在残基424处的谷氨酸)；426(例如，在残基426处的赖氨酸)；427(例如，在残基427处的谷氨酸)；434(例如，在残基434处的谷氨酸)；448(例如，在残基448处的赖氨酸)；449(例如，在残基449处的天门冬酰胺)；455(例如，在残基455处的丙氨酸)；456(例如，在残基456处的赖氨酸)；或458(例如，在残基458处的缬氨酸)。

在一些实施方案中，具有例如以下的一个取代(相对于SEQ ID NO：4)的UGT74G1变体累积甜茶苷、19-SMG和/或19-KMG：L15V、F18Y、M79A、E87D、G31S、E83D、N51K、E75D、T49I、D99E、S96T、C73F、S84A、A68T、Q67E、I16L、I28L、G31A、S377T、M119F、E456K、L181V、L385F、N183D、E176D、F209L、N211H、V143A、R297W、A410E、L390W、N252Y、S212T、V232T、I115V、G329E、T224M、I295L、T328S、L409I、D387E、D449N、V123A、M373V、V285A、Q204K、S189A、D247E、G135A、I111V、T120L、G316A、Q173E、V166L、I221V、L147I、F376W、L284M、E162T、Q375L、S136A、E315Q、I333V、M265I、A141S、E107S、E185G、V396A、L237I、Q186S、E320K、A200S、L195V、Q188P、Y257F、D269N、D341E、D434E、K313S、L179S、S455A、E263A、K311R、A259P、T110P、V292M、I326T、T296A、E222D、G391K、K215E、I310V、I156L、D303N、E121P、V370M、K427E、I180F、E274G、I458V、A335S、S411D或F169L。

在一些实施方案中，具有例如以下的两个取代(相对于SEQ ID NO：4)的UGT74G1变体累积甜茶苷、19-SMG和/或19-KMG：E176D和F357W。在一些实施方案中，具有例如以下的三个取代(相对于SEQ ID NO：4)的UGT74G1变体累积甜茶苷、19-SMG和/或19-KMG：F18Y、I416V和F27M；E87D、Q91E和I300K；E274G、L86I和F30L；E83D、R426K和Q91E；S96T、V325E和T88R；D99E、L322F和S192D；C73F、S146N和T380S；A259P、V371I和K90W；T49I、A280S和A113C；V123A、M194V和T88R；L181V、A280S和L86I；N252Y、E129Q和F30L；A68T、L322F和A113C；S212T、F357W和F30L；E75D、I300K和F357W；A335S、G407E和Q91E；I16L、A113C和M415E；G31S、N255S和I295M；S377T、E388D和L86I；I180F、H184P和E83K；Q188P、N408E和E83K；K311R、W191F和F27M；L195V、L20A和E346P；M79A、V325E和M415E；Q67E、N401K和D301N；S84A、S347A和I295M；A141S、F27M和V371I；L179S、N266K和E83K；Q186S、W191F和T88R；A410E、A298G和L20A；K311R、W191F和F27M；V285A、E388D和L20A；E176D、L322F和K90W；F169L、K90W和N266E；E456K、N255S和N401K；V370M、N448K和M194V；A200S、E129Q和Q140N；L390W、N266K和S192D；E320K、N266K和M194V；M265I、I364L和I187Y；E315Q、E129Q和S192D；E222D、N408E和Q140N；M119F、N255S和A298G；D269N、R426K和S146N；E185G、A298G和Q193M；V232T、E388D和Q140N；G316A、V325E和I187Y；L409I、D301N和H184P；S189A、S146N和I389V；V143A、I416V和H184P；S455A、Q193M和E346K；R297W、S347A和E346K；D341E、Q193M和L332I；D434E、T380S和I389V；T328S、A280S和L332I；Q375L、E419G和R426K；I221V、K338P和I295M；T296A、I128K和L332I；D449N、G407E和H287L；T110P、K338P和E346P；E121P、I416V和H287L；L284M、I424E和E346K；K427E、K338P和I424E；D303N、N408E和I300K；D247E、D301N和E346P；F376W、N448K和I128K；K313S、I187Y、I128K；G329E、G407E和N266E；I111V、M415E和H287L；G391K、T380S和I389V；V396A、N448K和S347A；I310V、V371I和N266E；Y257F、N401K和W191F；S136A、I364L和I424E；或V292M、E419G和I364L。参见表2和表3。

在一些实施方案中，在产甜菊糖苷酿酒酵母菌株中如本文另外所述的UGT74G1变体的表达(参见WO 2014/122227，其以特此以全文引用的方式并入本文)相对于表达例如具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列UGT74G1多肽的产甜菊糖苷酿酒酵母菌株增加甜茶苷、19-SMG和/或19-KMG的累积。在一些实施方案中，在还包含内根-贝壳杉烯酸、甜菊醇和/或13-SMG的体外反应混合物中如本文另外所述的UGT74G1变体的包含相对于包含例如SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列的UGT74G1多肽的反应混合物增加甜茶苷、19-SMG和/或19-KMG的累积。在一些实施方案中，增加甜茶苷的累积的UGT74G1变体的表达还导致19-SMG和19-KMG的累积增加。在一些实施方案中，增加甜茶苷的累积的UGT74G1变体的表达还导致19-SMG的累积增加，但导致19-KMG的累积减少。在一些实施方案中，增加甜茶苷的累积的UGT74G1变体的表达还导致19-KMG的累积增加，但导致19-SMG的累积减少。在一些实施方案中，增加甜茶苷的累积的UGT74G1变体的表达还导致19-SMG和19-KMG的累积减少。

在一些实施方案中，增加19-SMG的累积的UGT74G1变体的表达还导致甜茶苷和19-KMG的累积增加。在一些实施方案中，增加19-SMG的累积的UGT74G1变体的表达还导致甜茶苷的累积增加，但导致19-KMG的累积减少。在一些实施方案中，增加19-SMG的累积的UGT74G1变体的表达还导致19-KMG的累积增加，但导致甜茶苷的累积减少。在一些实施方案中，增加19-SMG的累积的UGT74G1变体的表达还导致甜茶苷和19-KMG的累积减少。

在一些实施方案中，增加19-KMG的累积的UGT74G1变体的表达还导致甜茶苷和19-SMG的累积增加。在一些实施方案中，增加19-KMG的累积的UGT74G1变体的表达还导致甜茶苷的累积增加，但导致19-SMG的累积减少。在一些实施方案中，增加19-KMG的累积的UGT74G1变体的表达还导致19-SMG的累积增加，但导致甜茶苷的累积减少。在一些实施方案中，增加19-KMG的累积的UGT74G1变体的表达还导致甜茶苷和19-SMG的累积减少。

在一些实施方案中，具有例如以下的一个取代(相对于SEQ ID NO：4)的UGT74G1变体的表达导致增加的甜茶苷：N183D、D387E、L409I、G316A、T224M、V143A、A410E、L390W、S212T、Q204K、T120L、M79A、L237I、I295L、S136A、V285A、N211H、V232T或L181V。在一些实施方案中，具有例如以下的多于一个取代(相对于SEQ ID NO：4)的UGT74G1变体的表达导致增加的甜茶苷：A335S、G407E和Q91E；D99E、L322F和S192D；C73F、S146N和T380S；E83D、R426K和Q91E；D434E、T380S和I389V；或G361A、V325E和I187Y。

在一些实施方案中，具有例如以下的一个取代(相对于SEQ ID NO：4)的UGT74G1变体的表达导致增加的19-KMG：F169L、E176D、E456K、M119F、S377T、L15V、L385F、F18Y、L181V、N183D、F209L、V166L、R297W、C73F、D449N、E107S、N252Y、G135A、S189A、G31A、T49I、I180F、Q375L、Q186S、F376W、S411D、V370M、I111V、I221V、I458V、E87D、G31S、V123A、K427E、L179S、I28L、I156L、S84A、I16L、D303N、E274G、Q188P、L284M、Q173E、I115V、V143A、I310V、N211H、E222D、E83D、A335S、V292M、D99E、T296A、E162T、E263A、A68T、S96T、A259P、A141S、V285A、G329E、G391K、K311R、M79A、L195V、E320K、T110P、K215E或I333V。在一些实施方案中，具有例如以下的多于一个取代(相对于SEQ ID NO：4)的UGT74G1变体的表达导致增加的19-KMG：V232T、E388D和Q140N；E222D、N408E和Q140N；S189A、S146N和I389V；M119F、N255S和A298G；A200S、E129Q和Q140N；L181V、A280S和L86I；S377T、E388D和L86I；E456K、N255S和N401K；V123A、M194V和T88R；C73F、S146N和T380S；V370M、N448K和M194V；D99E、L322F和S192D；A259P、V371I和K90W；E315Q、E129Q和S192D；M265I、I364L和I187Y；T49I、A280S和A113C；E320K、N266K和M194V；L390W、N266K和S192D；D269N、R426K和S146N；E185G、A298G和Q193M；S212T、F357W和F30L；N252Y、E129Q和F30L；V143A、I416V和H184P；L409I、D301N和H184P；R297W、S347A和E346K；I16L、A113C和M415E；A68T、L322F和A113C；Q188P、N408E和E83K；G31S、N255S和I295M；E75D、I300K和F357W；G316A、V325E和I187Y；S455A、Q193M和E346K；E274G、L86I和F30L；D341E、Q193M和L332I；E176D和F357W；I180F、H184P和E83K；T328S、A280S和L332I；D449N、G407E和H287L；K313S、I187Y和I128K；S96T、V325E和T88R；V396A、N448K和S347A；F18Y、I416V和F27M；I221V、K338P和I295M；K427E、K338P和I424E；V292M、E419G和I364L；G391K、T380S和I389V；G329E、G407E和N266E；I310V、V371I和N266E；M79A、V325E和M415E；Q67E、N401K和D301N；S84A、S347A和I295M；L179S、N266K和E83K；I111V、M415E和H287L；Q186S、W191F和T88R；V285A、E388D和L20A；F376W、N448K和I128K；Y257F、N401K和W191F；D247E、D301N和E346P；D303N、N408E和I300K；A141S、F27M和V371I；S136A、I364L和I424E；K311R、W191F和F27M；Q375L、E419G和R426K；L195V、L20A和E346P；A410E、A298G和L20A；T110P、K338P和E346P；E121P、I416V和H287L；K311R、W191F和F27M；E87D、Q91E和I300K；或L284M、I424E和E346K。

在一些实施方案中，具有例如以下的多于一个取代(相对于SEQ ID NO：4)的UGT74G1变体的表达导致增加的19-SMG：G316A、Q204K、S212T、A410E、I295L、T328S、T224M、L409I、D387E、T120L、S136A、A200S、M373V、E315Q、V143A、L390W或M79A。在一些实施方案中，具有例如以下的多于一个取代(相对于SEQ ID NO：4)的UGT74G1变体的表达导致增加的19-SMG：A335S、G407E和Q91E；T296A、I128K和l332I；D434E、T380S和I389V；或E87D、Q91E和I300K。

在一些实施方案中，在体内、在体外或通过全细胞生物转化产生的一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷不包含或包含与来自特别是甜叶菊植物的甜叶菊提取物相比减少量或减少水平的植物来源的组分。植物来源的组分可带来异味并且包括颜料、脂质、蛋白质、酚类、糖类、斯巴醇和其他倍半萜烯、半日花烷型二萜类、单萜类、癸酸、8，11，14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八醇、豆甾醇、β-谷甾醇、α-香树脂醇和β-香树脂醇、羽扇豆醇、β-香树脂醇乙酸酯、五环三萜类、矢车菊黄素(centauredin)、槲皮苷、表-α-杜松醇、石竹烯(carophyllene)和衍生物、β-蒎烯、β-谷甾醇以及赤霉素。在一些实施方案中，在本文中提及的植物来源的组分为非糖苷化合物。

如本文所用，术语“可检测量”、“可检测浓度”、“可测量量”和“可测量浓度”是指以AUC、μM/OD₆₀₀、mg/L、μM或mM为单位测量的甜菊糖苷的水平。通过本领域技术人员通常可用的技术可以检测和/或分析甜菊糖苷产生(即，总体、上清液和/或细胞内甜菊糖苷水平)，所述技术例如但不限于液相色谱-质谱法(LC-MS)、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、紫外可见光光谱法/分光光度法(UV-Vis)、质谱法(MS)和核磁共振光谱法(NMR)。

如本文所用，术语“不可检测浓度”是指太低以致于不能通过诸如TLC、HPLC、UV-Vis、MS或NMR的技术进行测量和/或分析的化合物水平。在一些实施方案中，“不可检测浓度”的化合物不存在于一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷中。

在重组微生物已在培养物中生长一段时间之后，其中温度和时间段有利于甜菊糖苷的产生，然后可使用本领域中已知的各种技术从培养物中回收甜菊醇和/或一种或多种甜菊糖苷。可以使用本文所述的方法分离甜菊糖苷。例如，在发酵之后，可以在4℃下将培养发酵液以7000rpm离心30min以除去细胞，或者可以通过过滤来除去细胞。可以例如通过机械破坏或酶破坏宿主细胞并且另外进行离心以除去细胞碎片来获得无细胞裂解液。还可以诸如通过超声处理来对干燥的发酵液物质进行机械破坏。在诸如通过制备型色谱法进一步纯化之前，可以使用微米或亚微米过滤溶解或悬浮的发酵液物质。可以任选地处理发酵培养基或无细胞裂解液以除去低分子量化合物，诸如盐；并且可以任选地在纯化之前将其干燥并重新溶解在水和溶剂的混合物中。

上清液或无细胞裂解液可以如下进行纯化：可以用例如HP20 Diaion树脂(芳香型合成吸附剂；Supelco)或其他合适的非极性吸附剂或反相色谱树脂填充柱，并且可以将等分试样的上清液或无细胞裂解液加载到柱上并用水洗涤柱以除去亲水性组分。甜菊糖苷产物可以通过逐步增加水中的溶剂浓度或例如0％→100％甲醇的梯度来洗脱。然后可以通过LC-MS分析甜菊糖苷、糖基化内根-贝壳杉烯醇和/或糖基化内根-贝壳杉烯酸在每个级分(包括流通式)中的水平。然后可以将级分合并并且使用真空蒸发器减小体积。如果需要，可以利用另外的纯化步骤，诸如另外的色谱法步骤和结晶。例如，甜菊糖苷可以通过不限于离子交换色谱法、反相色谱法(即，使用C18柱)、萃取、结晶和碳柱和/或脱色步骤的方法进行分离。

如本文所用，术语“或”和“和/或”用于描述组合的或彼此排他的多种组分。例如，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。在一些实施方案中，“和/或”用于指重组细胞所包含的外源核酸，其中重组细胞包含选自一个组的一种或多种外源核酸。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊糖苷和/或甜菊醇糖苷前体的产生。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊糖苷的产生，其中产生了一种或多种甜菊糖苷。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊糖苷的产生，其中通过以下步骤产生了一种或多种甜菊糖苷：培养重组微生物、在重组微生物中合成一种或多种甜菊糖苷和/或分离一种或多种甜菊糖苷。

功能性同源物

以上所述的多肽的功能性同源物也适用于在重组宿主中产生甜菊糖苷。功能性同源物为与参考序列具有序列相似性并且执行参考多肽的一种或多种生物化学或生理学功能的多肽。功能性同源物和参考多肽可以是天然存在的多肽，并且序列相似性可以是由于会聚型或分叉型进化事件。因此，功能性同源物有时在文献中被指示为同源物、或直向同源物、或旁系同源物。天然存在的功能性同源物的变体(诸如由野生型编码序列的突变体编码的多肽)本身可以是功能性同源物。功能性同源物也可以通过定点诱变多肽的编码序列或者通过将来自不同天然存在的多肽的编码序列的结构域组合(“结构域交换”)来形成。用于修饰编码本文所述的功能性多肽的基因的技术为已知的并且特别是包括定向进化技术、定点诱变技术和随机诱变技术，并且可以适用于增加多肽的比活性、改变底物特异性、改变表达水平、改变亚细胞位置或者以所需方式修改多肽-多肽相互作用。此类修饰的多肽被认为是功能性同源物。术语“功能性同源物”有时适用于编码功能同源性多肽的核酸。

功能性同源物可以通过分析核苷酸和多肽序列比对来鉴别。例如，对核苷酸或多肽序列的数据库进行查询可以鉴别出甜菊糖苷生物合成多肽的同源物。序列分析可以涉及使用UGT氨基酸序列作为参考序列对非冗余数据库进行的BLAST、交互BLAST或PSI-BLAST分析。在一些情况下，氨基酸序列从核苷酸序列推导得到。数据库中具有大于40％序列同一性的那些多肽为进一步评价作为甜菊糖苷生物合成多肽的适合性的候选物。氨基酸序列相似性允许进行保守氨基酸取代，诸如用一个疏水性残基取代另一个疏水性残基或者用一个极性残基取代另一个极性残基。如果需要，可以进行此类候选物的手动检查，以便缩减待进行进一步评价的候选物数目。可以通过选择似乎具有甜菊糖苷生物合成多肽中所存在的结构域(例如，保守功能结构域)的那些候选物来进行手动检查。在一些实施方案中，核酸和多肽是基于表达水平而不是通过使用BLAST分析来从转录组数据中鉴别。

保守区域可以通过在甜菊糖苷生物合成多肽的主要氨基酸序列内定位一个区域来鉴别，所述区域为重复序列，形成某一二级结构(例如，螺旋和β折叠)，建立带正电或带负电的结构域，或者表示蛋白质基序或结构域。参见，例如，在万维网上网址为sanger.ac.uk/Software/Pfam/和pfam.janelia.org/的描述多种蛋白质基序和结构域的共有序列的Pfam网站。Pfam数据库处包含的信息描述于Sonnhammer等，Nucl.Acids Res.，26：320-322(1998)；Sonnhammer等，Proteins，28：405-420(1997)；和Bateman等，Nucl.Acids Res.，27：260-262(1999)。保守区域还可以通过比对来自紧密相关物种的相同或相关多肽的序列来确定。紧密相关物种优选地来自相同科。在一些实施方案中，来自两种不同物种的序列的比对足以鉴别此类同源物。

通常，表现出至少约40％氨基酸序列同一性的多肽适用于鉴别保守区域。相关多肽的保守区域表现出至少45％氨基酸序列同一性(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％氨基酸序列同一性)。在一些实施方案中，保守区域表现出至少92％、94％、96％、98％或99％氨基酸序列同一性。

例如，适用于在重组宿主中产生甜菊醇的多肽包括UGT的功能性同源物。

修饰例如UGT的底物特异性的方法为本领域的技术人员已知的，并且包括但不限于定点/合理诱变方法、随机定向进化方法以及在酶的活性位点附近进行随机诱变/饱和技术的组合。例如参见Osmani等，2009，Phytochemistry 70：325-347。

候选序列的长度通常为参考序列的长度的80％至250％，例如参考序列长度的82％、85％、87％、89％、90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、110％、115％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％或250％。功能性同源物多肽的长度通常为参考序列的长度的95％至105％，例如参考序列的长度的90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、110％、115％或120％或其间的任何范围。任何候选核酸或多肽相对于参考核酸或多肽的序列同一性％可如下确定。使用计算机程序Clustal Omega(版本1.2.1，默认参数)将参考序列(例如，本文所述的核酸或氨基酸序列)与一个或多个候选序列进行比对，所述计算机程序使核酸或多肽序列的比对在其整个长度上进行(全局比对)。Chenna等，2003，Nucleic Acids Res.31(13)：3497-500。

ClustalW计算参考序列与一个或多个候选序列之间的最佳匹配，并且将它们进行比对，以使得可确定同一性、相似性和差异。可以将一个或多个残基的空位插入到参考序列、候选序列或两者中，以使序列比对最大化。对于核酸序列的快速逐对比对，使用以下默认参数：字长：2；窗口大小：4；评分方法：年龄％；顶部对角线数目：4；以及空位罚分：5。对于核酸序列的多重比对，使用以下参数：空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：5.0；以及权重转变：是。对于蛋白质序列的快速逐对比对，使用以下参数：字长：1；窗口大小：5；评分方法：年龄％；顶部对角线数目：5；空位罚分：3。对于蛋白质序列的多重比对，使用以下参数：权重矩阵：blosum；空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水性空位：开启；亲水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys；残基特异性空位罚分：开启。ClustalW输出为反映序列之间的关系的序列比对。ClustalW可以例如在万维网上的贝勒医学院搜索发射台(Baylor College of Medicine Search Launcher)网站(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)和在万维网上的欧洲生物信息学研究所网站(ebi.ac.uk/clustalw)上运行。

为了确定候选核酸或氨基酸序列与参考序列的序列同一性％，使用ClustalOmega比对所述序列，将比对中的相同匹配的数目除以参考序列的长度，并且将结果乘以100。应注意，将序列同一性％值四舍五入成最接近的十分位。例如，将78.11、78.12、78.13和78.14向下舍入成78.1，而将78.15、78.16、78.17、78.18和78.19向上舍入成78.2。

应了解，功能性UGT蛋白质可以包含不参与由所述酶进行的酶促活性的另外的氨基酸。在一些实施方案中，UGT蛋白质为融合蛋白。术语“嵌合体”、“融合多肽”、“融合蛋白”、“融合酶”、“融合构建体”、“嵌合蛋白”、“嵌合多肽”、“嵌合构建体”和“嵌合酶”可在本文中互换用于指代通过将编码不同蛋白质的两个或更多个基因连接在一起进行工程化的蛋白质。

在一些实施方案中，通过将第一多肽蛋白A的C末端通过接头“b”连接至第二多肽蛋白B的N末端(即“蛋白A-b-蛋白B”)来构建嵌合酶。在一些方面中，嵌合酶的接头可以是氨基酸序列“KLVK”。在一些方面中，嵌合酶的接头可以是氨基酸序列“RASSTKLVK”。在一些方面中，嵌合酶的接头可以是氨基酸序列“GGGGS”。在一些方面中，嵌合酶的接头可以是氨基酸序列“GGGGS”的两次重复(即，“GGGGSGGGGS”)。在一些方面中，嵌合酶的接头可以是氨基酸序列“GGGGS”的三次重复。在一些方面中，嵌合酶的接头是第一多肽的C末端与第二多肽的N末端之间的直接键。在一些实施方案中，通过将第一多肽蛋白A的C末端通过接头“b”连接至第二多肽蛋白B的N末端(即“蛋白A-b-蛋白B”)并且将第二多肽蛋白B的C末端通过第二接头“d”连接至第三多肽蛋白C的N末端(即“蛋白A-b-蛋白B-d-蛋白C”)来构建嵌合酶。

在一些实施方案中，编码UGT多肽(例如，能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽)的核酸序列可以包含编码被设计来有利于对编码的多肽进行后续操纵(例如，有利于纯化或检测)、分泌或定位的“标签”的标签序列。标签序列可以插入在编码多肽的核酸序列中，以使得所编码的标签定位在多肽的羧基末端或氨基末端。所编码的标签的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(GFP)、人类流感病毒血凝素(HA)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、聚组氨酸-标签(HIS标签)和Flag^TM标签(Kodak，New Haven，CT)。标签的其他实例包括叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或分泌标签。

在一些实施方案中，融合蛋白为通过结构域交换改变的蛋白质。如本文所用，术语“结构域交换”用于描述用第二蛋白质的结构域替代第一蛋白质的结构域的过程。在一些实施方案中，第一蛋白质的结构域和第二蛋白质的结构域为功能上相同的或功能上类似的。在一些实施方案中，第二蛋白质的结构域的结构和/或序列不同于第一蛋白质的结构域的结构和/或序列。在一些实施方案中，通过结构域交换改变UGT多肽(例如，能够在C-19羧基上糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽)。

在一些实施方案中，融合蛋白为通过循环排列改变的蛋白质，循环排列存在于蛋白质末端的共价连接，所述蛋白质末端之后将在别处被开放。因此，在不引起蛋白质的氨基酸变化的情况下改变序列的顺序。在一些实施方案中，可以产生靶向循环排列，例如但不限于通过设计连接原始蛋白质末端的间隔区(spacer)。一旦定义了间隔区，通过公认的分子生物学技术有若干产生排列的可能性，例如但不限于通过使用PCR产生多联体并随后扩增多联体内的特定排列或者通过扩增待交换的蛋白质的离散片段以将它们以不同顺序连接。产生排列的步骤之后可以通过结合片段末端并随机截短来产生环状基因，因此由独特的构建体形成排列的集合。

甜菊醇和甜菊糖苷生物合成核酸

编码本文所述的多肽的重组基因包含那个多肽的编码序列，所述编码序列在有义方向上可操作地连接至适用于表达所述多肽的一个或多个调控区。因为许多微生物能够从多顺反子mRNA表达多种基因产物，所以在需要时可以在那些微生物的单一调控区的控制下表达多种多肽。当调控区和编码序列被定位成使得调控区有效调控序列的转录或翻译时，编码序列和调控区被认为是可操作地连接的。通常，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点被定位在单顺反子基因的调控区下游的一个与约五十个核苷酸之间。

在许多情况下，在除重组宿主之外的物种中鉴别本文所述的多肽的编码序列，即异源核酸。因此，如果重组宿主为微生物，那么编码序列可以来自其他原核或真核微生物、来自植物或来自动物。然而，在一些情况下，编码序列为宿主原生序列并且被再次引入到那个生物体中。原生序列可通过重组核酸构建体中连接至外源核酸的非天然序列(例如，侧接原生序列的非原生调控序列)的存在来与天然存在的序列区分。另外，稳定转化的外源核酸通常整合在除存在原生序列的位置之外的位置处。“调控区”是指具有影响转录或翻译起始和速率以及转录或翻译产物的稳定性和/或迁移率的核苷酸序列的核酸。调控区包括但不限于启动子序列、增强子序列、反应元件、蛋白质识别位点、诱导性元件、蛋白质结合序列、5′和3′非反应区(UTR)、转录起始位点、末端序列、聚腺苷酸化序列、内含子以及其组合。调控区通常包含至少一个核心(基础)启动子。调控区还可以包括至少一种控制元件，诸如增强子序列、上游元件或上游激活区域(UAR)。通过定位调控区和编码序列以使得调控区有效调控序列的转录或翻译来将调控区可操作地连接至编码序列。例如，为了可操作地连接编码序列和启动子序列，通常将编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点定位在启动子下游的一个与约五十个核苷酸之间。然而，调控区可定位在翻译起始位点上游的多达约5,000个核苷酸或转录起始位点上游的约2,000个核苷酸。

待包含的调控区的选择取决于若干因素，包括但不限于在某些培养阶段期间的效率、可选择性、可诱导性、所需表达水平和优选表达。通过适当选择调控区并且相对于编码序列定位调控区来调节编码序列的表达对于本领域的技术人员来说是常规事情。应理解，可以存在多于一个调控区，例如，内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和诱导性元件。

可以在重组核酸构建体的适用于甜菊醇和/或甜菊糖苷生产的离散方面的“模块”中组合一种或多种基因。在模块(尤其是多顺反子模块)中组合多个基因有利于模块在多个物种中的使用。例如，可以在多顺反子模块中组合甜菊醇生物合成基因簇或UGT基因簇，以使得在插入合适的调控区之后，可以将所述模块引入到各种各样的物种中。作为另一个实例，可以组合UGT基因簇，以使得每个UGT编码序列可操作地连接至单独的调控区，以形成UGT模块。此模块可用于需要或希望单顺反子表达的那些物种中。除适用于甜菊醇或甜菊糖苷生产的基因之外，重组构建体通常还含有复制起点和用于维持适当物种中的构建体的一个或多个可选择标记。

应了解，由于遗传密码子的简并性，许多核酸可以编码具体多肽；即对于许多氨基酸来说，存在用作氨基酸密码子的多于一个核苷酸三联体。因此，给定多肽的编码序列中的密码子可以被修饰成使得使用具体宿主中的适当密码子偏好性表获得那个宿主(例如，微生物)中的最佳表达。作为分离的核酸，这些修饰的序列可以作为纯化的分子存在并且可以并入载体或病毒中以用于构建用于重组核酸构建体的模块。

在一些情况下，希望抑制内源性多肽的一种或多种功能，以便使代谢中间体转向甜菊醇或甜菊糖苷生物合成。例如，可能希望下调酵母菌株中的甜菊醇合成，以便例如通过下调角鲨烯环氧酶来进一步增加甜菊醇或甜菊糖苷产量。作为另一个实例，可能希望抑制某些内源性基因产物的降解功能，例如从二级代谢物除去葡萄糖部分的糖水解酶或如本文所讨论的磷酸酶。在此类情况下，过度表达多肽或基因产物的核酸可包含在转化到菌株中的重组构建体中。可替代地，可以使用诱变来生成希望增加或增强功能的基因突变体。

宿主微生物

重组宿主可用于表达用于生产甜菊糖苷的多肽，包括但不限于植物细胞(包括在植物中生长的植物细胞)、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞、古菌细胞或细菌细胞。

许多原核生物和真核生物也适用于构建本文所述的重组微生物，例如格兰阴性细菌、酵母和真菌。首先分析选择用作甜菊糖苷生产菌株的种类和菌株，以确定哪些生产基因为菌株内源的并且哪些基因是不存在的。菌株中不存在内源性对应物的基因有利地组装在一个或多个重组构建体中，所述重组构建体然后被转化到菌株中，以便供应一种或多种丢失的功能。

通常，使重组微生物在一个或多个温度下在发酵器中生长一段时间，其中所述温度和时间段有利于甜菊糖苷的生产。本发明所提供的经过构建和遗传工程化的微生物可以使用常规发酵方法来培养，所述发酵方法特别包括恒化培养、分批培养、分批补料发酵、半连续发酵(诸如抽取和装满)、连续灌注发酵以及连续灌注细胞培养。根据所述方法中所用的具体微生物，还可以存在并且表达其他重组基因诸如异戊烯基生物合成基因和萜烯合酶与环化酶基因。底物和中间体(例如，异戊烯基二磷酸酯、二甲基烯丙基二磷酸二磷酸酯、GGPP、内根-贝壳杉烯、内根-贝壳杉烯酸)的水平可通过从培养基中提取样品以用于根据公布的方法进行分析来测定。

在一些方面中，重组微生物生长在深孔板中。应理解，虽然在一些方面中，在深孔培养物中生长的重组微生物生产甜菊糖苷的数据可能比在发酵培养物中更容易收集，但是深孔的小培养体积(例如，1ml或0.5ml)可以影响微生物的环境差异，并且因此影响其生产甜菊糖苷的效率和效果。例如，发酵与深孔培养物之间的营养素可用性、细胞废产物积聚、pH、温度、搅动和通气可显著不同。因此，营养素或其他酶底物的摄取可以有所变化，其影响细胞代谢(例如，改变重组微生物所积累的产物的量和/或特征)。参见例如，Duetz，TrendsMicrobiol 15(10)：469-75(2007)。

在本发明方法中使用的碳源包括可由重组宿主细胞代谢以有利于生长和/或甜菊糖苷的生产的任何分子。合适的碳源的实例包括但不限于蔗糖(例如，如糖蜜中存在的)、果糖、木糖、乙醇、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其他含葡萄糖聚合物。例如，在采用酵母作为宿主的实施方案中，诸如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油和葡萄糖的碳源为合适的。可以在整个培养期间向宿主生物体提供碳源，或者可替代地，可以在另一种能量源例如蛋白质存在下使生物体生长一段时间，然后仅在分批补料阶段期间提供碳源。

应了解，本文所讨论的各种基因和模块可以存在于除两种或更多种重组宿主中，而不是存在于单一宿主中。当使用多种重组宿主时，可以使它们在混合培养物中生长以积累甜菊醇和/或甜菊糖苷。

可替代地，两种或更多种宿主可以各自生长在单独的培养基中并且可以将第一培养基的产物(例如，甜菊醇)引入到第二培养基中，以转化成后续中间体，或者转化成最终产物例如像RebA。然后回收由第二宿主或最终宿主生产的产物。还应了解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养素源并利用除发酵器之外的系统来使重组宿主生长。

以下更详细地描述示例性原核和真核物种。然而，应理解，其他物种可以是合适的。然而，应理解，其他物种可以合适于表达产甜菊糖苷的多肽。

例如，合适的物种可以属于诸如以下的属：蘑菇属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假丝酵母属(Candida)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假囊酵母属(Eremothecium)、埃希氏菌属(Escherichia)、镰刀菌属(Fusarium)/赤霉属(Gibberella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、硫磺菌属(Laetiporus)、香菇属(Lentinus)、法夫酵母属(Phaffia)、原毛平革菌属(Phanerochaete)、毕赤酵母属(Pichia)(以前称为汉逊氏酵母属(Hansuela))、毕赤酵母属(Scheffersomyces)、小立碗藓属(Physcomitrella)、红酵母属(Rhodoturula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、痂圆孢属(Sphaceloma)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)、腐质霉属(Humicola)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、酒香酵母属(Brettanomyces)、粉状毕赤酵母属(Yamadazyma)、Lachancea属、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、Komagataella属、哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)、法夫酵母属、地霉属(Geotrichum)、布拉霉属(Blakeslea)、杜氏藻属(Dunaliella)、红球藻属(Haematococcus)、小球藻属(Chlorella)、裙带菜属(Undaria)、马尾藻属(Sargassum)、海带属(Laminaria)、栅藻属(Scenedesmus)、管囊酵母属(Pachysolen)、毛孢子菌属(Trichosporon)、枝顶孢属(Acremonium)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、棒囊壳属(Corynascus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰刀菌属、巨座壳属(Magnaporthe)、红曲霉属(Monascus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、被孢霉属(Mortierella)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、管囊酵母属、原毛平革菌属、足孢虫属(Podospora)、密孔菌属(Pycnoporus)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、粪壳菌属(Sordaria)、蓝状菌属(Talaromyces)、Rasmsonia属、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、克勒克酵母属(Kloeckera)、管囊酵母属、许旺酵母属(Schwanniomyces)、栓菌属(Trametes)、木霉属(Trichoderma)、不动杆菌属(Acinetobacter)、诺卡氏菌属(Nocardia)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、绿弯菌属(Choroflexus)、绿线菌属(Chloronema)、绿菌属(Chlorobium)、暗网菌属(Pelodictyon)、着色菌属(Chromatium)、红螺菌属(Rhode-spirillum)、红细菌属(Rhodobacter)、红微菌属(Rhodomicrobium)或耶氏酵母属(Yarrowia)。

此类属的示例性种包括：虎皮香菇(Lentinus tigrinus)、朱红硫磺菌(Laetiporus sulphureus)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、黏红酵母(Rhodoturulaglutinis)、海洋红酵母(Rhodoturula mucilaginosa)、红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)、红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)、酿酒酵母、贝酵母(Saecharomyces bayanus)、巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、多形汉逊酵母(Hansuelapolymorpha)、异酒香酵母(Brettanomyces anomalus)、嗜土粉状毕赤酵母(Yamadazymaphilogaea)、藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)/藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、克鲁斯念珠菌(Candidakrusei)、拉可夫氏假丝酵母(Candida revkaufi)、铁红假丝酵母(Candida pulcherrima)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、桔青霉(Penicillium citrihum)、顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、埃默森篮状菌(Rasamsonia emersonii)(以前称为Talaromycesemersonii)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliophtora thermophyla)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillius licheniformis)、潘蒂芽孢杆菌(Bacillus puntis)、巨大芽胞杆菌(Bacillius megaterium)、嗜碱芽孢杆菌(Bacilliushalofurans)、短小芽孢杆菌(Baciilius punilus)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcessans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、三孢布拉霉(Blakeslea trispora)、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、小球藻(Chlorella sp.)、裙带菜(Undariapinnatifida)、马尾藻、海带(Laminaria japonica)、栅藻(Scenedesmus almeriensis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、橙黄绿弯菌(Choroflexus aurantiacus)、巨大绿线菌(Chloronema gigateum)、泥生绿菌(Chlorobium limicola)、微黄暗网菌(Pelodictyonluteolum)、奥氏着色菌(Chromatium okenii)、深红红螺菌(Rhode-spirillum rubrum)、类球红细菌(Rhodobacter spaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、万尼氏红微菌(Rhodomicrobium vanellii)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、白吉利毛孢子菌(Trichosporon beigelii)和解脂耶氏酵母。

在一些实施方案中，微生物可为原核生物，诸如埃希氏菌属细菌细胞，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)细胞；乳酸杆菌属细菌细胞；乳球菌属细菌细胞；棒状杆菌属细菌细胞；醋杆菌属细菌细胞；不动杆菌属细菌细胞；或假单胞菌属细菌细胞。

在一些实施方案中，微生物可为藻类细胞，诸如三孢布拉霉、盐生杜氏藻、雨生红球藻、小球藻、裙带菜、马尾藻、海带、栅藻种。

在一些实施方案中，微生物可为包括但不限于以下属的真菌：枝顶孢属、Arxula属、蘑菇属、曲霉属、蘑菇属、短梗霉属、酒香酵母属、假丝酵母属、隐球菌属、棒囊壳属、金孢子菌属、德巴利酵母属(Debaromyces)、线黑粉酵母属、镰刀菌属、赤霉属、腐质霉属、巨座壳属、红曲霉属、毛霉属、毁丝霉属、被孢霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、梨囊鞭菌属、原毛平革菌属足孢虫属、密孔菌属、根霉属、裂褶菌属、裂殖酵母属、粪壳菌属、毕赤酵母属、蓝状菌属、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、篮状菌属(Rasmsonia)、接合酵母属、热子囊菌属、梭孢壳属、毛孢子菌属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属。真菌物种包括但不限于黑曲霉、米曲霉、烟曲霉、产黄青霉、桔青霉、顶头孢霉、里氏木霉、埃默森篮状菌(以前称为Talaromyces emersonii)、酱油曲霉、拉克淖金孢子菌、嗜热毁丝霉。

在一些实施方案中，微生物可为子囊菌(Ascomycete)，诸如藤仓赤霉、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、地霉、黑曲霉、解脂耶氏酵母、棉安舒囊霉(Ashbya gossypii)、嗜土粉状毕赤酵母、克鲁维出芽酵母(Lachancea kluyveri)、海洋酵母(Kodamaea ohmeri)或酿酒酵母。

蘑菇属、赤霉属和原毛平革菌属物种

蘑菇属、赤霉属和原毛平革菌属物种也可以是有用的，因为已知它们在培养物中产生大量的类异戊二烯。因此，用于产生大量甜菊糖苷的萜烯前体已经由内源性基因产生。因此，包含甜菊糖苷生物合成多肽的重组基因的模块可以引入到来自此类属的物种中，而不需要引入甲羟戊酸或MEP途径基因。

解腺嘌呤阿氏酵母(食腺嘌呤节孢酵母(Blastobotrys adeninivorans))

解腺嘌呤阿氏酵母为具有独特生物化学特征的二态酵母(其作为出芽酵母如面包酵母中高达42℃的温度下生长，其在超过此阈值时以丝状形式生长)。它可在广泛范围的底物上生长并且可以吸收硝酸盐。它已成功应用于生成可产生天然塑料的菌株或开发用于环境样品中的雌激素的生物传感器。

红酵母属物种

红酵母属为单细胞的有色酵母。含油红色酵母胶粘红酵母已显示由粗制甘油产生脂质和类胡萝卜素(Saenge等，2011，Process Biochemistry 46(1)：210-8)。红冬孢红酵母菌株已显示为用于改进的生物质和脂质生产量的有效分批补料发酵系统(Li等，2007，Enzyme and Microbial Technology 41：312-7)。

裂殖酵母属物种

裂殖酵母属为分裂酵母的一种属。与酿酒酵母相似，裂殖酵母属为真核细胞生物学研究中的模式生物。它提供了与酿酒酵母的进化远距离比较。物种包括但不限于嗜冷裂殖酵母(S.cryophilius)和粟酒裂殖酵母(S.pombe)。(参见Hoffman等，2015，Genetics.201(2)：403-23)。

腐质霉属物种

腐质霉属为丝状真菌的一种属。物种包括但不限于H.alopallonella和暹罗腐质霉(H.siamensis)。

酒香酵母属物种

酒香酵母属为一种非孢子形成酵母属。其来自酵母(Saccharomycetaceae)科并且通常用于酿酒和制酒工业。酒香酵母属生产若干感官性化合物，其引起酒的复杂性，具体来说引起红酒的复杂性。酒香酵母属物种包括但不限于布鲁塞尔酒香酵母(B.bruxellensis)和克劳森酒香酵母(B.claussenii)。参见例如Fugelsang等，1997，Wine Microbiology。

毛孢子菌属物种

毛孢子菌属为真菌科的一种属。毛孢子菌属物种为通常从土壤中分离出来的酵母，但也可以存在于人和动物的皮肤微生物群中。物种包括但不限于例如水生毛孢子菌(T.aquatile)、白吉利毛孢子菌(T.beigelii)和真皮毛孢子菌(T.dermatis)。

德巴利酵母属物种

德巴利酵母属为子囊菌酵母科的一种属，在所述属中物种的特征为耐盐海生物种。物种包括但不限于汉逊德巴利酵母(D.hansenii)和D.hansenius。

小立碗藓属物种

小立碗藓(Physcomitrella moss)当在悬浮培养物中生长时具有类似于酵母或其他真菌培养物的特征。这种属可用于生产植物次要代谢物，所述代谢物可能难以在其他类型的细胞中生产。

酵母属物种

酵母属为合成生物学中广泛使用的基础生物体，并且可用作重组微生物平台。例如，存在对于酿酒酵母可用的突变体文库、质粒、详细计算机代谢模型和其他信息，从而允许合理设计各种模块以增强产物产量。已知用于制备重组微生物的方法。酵母属物种的实例包括卡氏德巴利酵母(S.castellii)，也称为闹莫氏卡氏德巴利酵母(Naumovozymacastelli)。

接合酵母属物种

接合酵母属为酵母的一种属。其最初被分类为酵母属，此后被重新分类。它在食品工业中广为人知，因为若干物种对商业上使用的食品防腐技术具有极强的抗性。物种包括但不限于二孢接合酵母(Z.bisporus)和苹果酒接合酵母(Z.cidri)。(参见Barnett等，Yeasts：Charactertistics and Identification，1983)。

地霉属物种

地霉属为通常存在于全世界的土壤、水和无水中的真菌。它通常在植物、谷物和乳制品中被鉴别出来。物种包括但不限于例如白地霉(G.candidum)和克氏地霉(G.klebahnii)(参见Carmichael等，Mycologica，1957，49(6)：820-830)。

哈萨克斯坦酵母属物种

哈萨克斯坦酵母属为糖酵母科中的一种酵母属。

有孢圆酵母属物种

有孢圆酵母属为酵母的一种属，并且物种包括但不限于T.franciscae和球形有孢圆酵母(T.globosa)。

曲霉属物种

曲霉属物种诸如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)和酱油曲霉(A.sojae)为食品生产中广泛使用的微生物并且也可以用作重组微生物平台。核苷酸序列可用于构巢曲霉(A.nidulans)、烟曲霉(A.fumigatus)、米曲霉、棒曲霉(A.clavatus)、黄曲霉(A.flavus)、黑曲霉(A.niger)和土曲霉(A.terreus)的基因组中，从而允许对内源性途径进行合理设计和修饰，以增强通量并增加产物产量。已开发用于曲霉属的代谢模型以及转录组学研究和蛋白质组学研究。培养黑曲霉以用于工业生产许多食品成分诸如柠檬酸和葡糖酸，并且因此诸如黑曲霉的种类通常适用于生产甜菊糖苷。

解脂耶氏酵母

解脂耶氏酵母为二态酵母(参见解腺嘌呤阿氏酵母(Arxula adeninivorans))并且属于半子囊菌科。解脂耶氏酵母的整个基因组为已知的。耶氏酵母属物种为有氧的并且被认为是非病原性的。耶氏酵母属有效于使用疏水性底物(例如，烷烃、脂肪酸和油)并且可以在糖上生长。它具有用于工业应用的高可能性并且为含油微生物。解脂耶氏酵母可以累积脂质含量至其干燥细胞重量的大约40％并且为用于脂质累积和再活化的模型生物体。参见例如Nicaud，2012，Yeast 29(10)：409-18；Beopoulos等，2009，Biochimie 91(6)：692-6；Bankar等，2009，Appl Microbiol Biotechnol.84(5)：847-65。

圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

圆红冬孢酵母为含油酵母并且适用于将脂质产生途径工程化(参见例如Zhu等，2013，Nature Commun.3：1112；Ageitos等，2011，Applied Microbiology andBiotechnology 90(4)：1219-27)。

博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)

博伊丁假丝酵母为甲基营养性酵母(其可在甲醇上生长)。像其他甲基营养性物种诸如多形汉逊酵母和巴斯德毕赤酵母一样，其提供用于生产异源性蛋白的优异平台。已报道多克范围的分泌的外来蛋白质的产量。计算方法IPRO最新预测了以下突变：在实验上将博伊丁假丝酵母木糖还原酶的辅因子特异性从NADPH转换成NADH。参见例如Mattanovich等，2012，Methods Mol Biol.824：329-58；Khoury等，2009，Protein Sci.18(10)：2125-38。

多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))

多形汉逊酵母为甲基营养性酵母(参见博伊丁假丝酵母)。它可另外在广泛范围的其他底物上生长，它是耐热的并且可以吸收硝酸盐(还参见乳酸克鲁维酵母)。它已应用于产生乙型肝炎疫苗、胰岛素和干扰素α-2a以用于治疗丙型肝炎，另外产生一系列技术性酶。参见例如Xu等，2014，Virol Sin.29(6)：403-9。

克鲁斯念珠菌(东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis))

克鲁斯念珠菌(学名为东方伊萨酵母)广泛用于巧克力生产中。使用克鲁斯念珠菌除去可可豆的苦味并且使可可豆破裂。除这种物种参与巧克力生产之外，克鲁斯念珠菌通常作为真菌医院病原体存在于免疫失能的人群中(参见Mastromarino等，NewMicrobiolgica，36：229-238；2013)

乳酸克鲁维酵母

乳酸克鲁维酵母为经常应用于生产克非尔(kefir)的酵母。它可在若干种糖上，最重要地是在乳和乳清中存在的乳糖上生长。除其他之外，它已成功应用于生产凝乳酶(通常存在于牛胃部的酶)，以用于生产奶酪。在40,000L规模的发酵罐中进行生产。参见例如vanOoyen等，2006，FEMS Yeast Res.6(3)：381-92。

巴斯德毕赤酵母

巴斯德毕赤酵母为甲基营养性酵母(参见博伊丁假丝酵母和多形汉逊酵母)。它还通常被称为Komagataella pastoris。它提供了用于生产外来蛋白质的有效平台。平台元件可用作试剂盒并且它在学术界广泛用于生产蛋白质。已工程化可产生复杂人类N-聚糖(酵母聚糖类似于人类中可见的那些聚糖但并不相同)的菌株。参见例如Piirainen等，2014，NBiotechnol.31(6)：532-7。

树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)

树干毕赤酵母还被称为Pichia stipitis，为以单倍体形式存在的同源酵母。通常由于其由替代的呼吸系统引起的增强的呼吸能力而代替酿酒酵母使用。(参见Papini等，Microbial Cell Factories，11：136(2012))。

在一些实施方案中，微生物可为昆虫细胞，诸如果蝇属，具体来说，黑腹果蝇(Drosophilia melanogaster)。

在一些实施方案中，微生物可为藻类细胞，诸如像但不限于三孢布拉霉、盐生杜氏藻、雨生红球藻、小球藻。

在一些实施方案中，微生物可为蓝细菌细胞，诸如像但不限于三孢布拉霉、盐生杜氏藻、雨生红球藻、小球藻、裙带菜、马尾藻属、海带和栅藻。

在一些实施方案中，微生物可为细菌细胞。细菌的实例包括但不限于芽孢杆菌属(例如，纳豆芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、潘蒂芽孢杆菌(B.puntis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus))、不动杆菌属、诺卡氏菌属、黄色杆菌属、埃希氏菌属(例如大肠杆菌(E.coli))、链霉菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属(例如，粘质沙雷氏菌(S.marcessans))、假单胞菌属(例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、沙门氏菌属(例如，鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌)。细菌细胞还可以包括但不限于光合细菌(例如，绿色非硫细菌(例如，绿弯菌属细菌(例如，橙色绿弯菌(C.aurantiacus))、绿线菌属(例如，巨大绿线菌(C.gigateum))、绿色硫细菌(例如，绿菌属细菌(例如，泥生绿菌(C.limicola))、暗网菌属(例如，微黄暗网菌(P.luteolum))、紫色硫细菌(例如，着色菌属(例如，奥氏着色菌))和紫色非硫细菌(例如，红螺菌属(例如，深红红螺菌(R.rubrum))、红细菌属(例如，球形红细菌(R.sphaeroides)、荚膜红细菌(R.capsulatus))和红微菌属细菌(例如，万尼氏红微菌(R.vanellii)))。

大肠杆菌

大肠杆菌为合成生物学中广泛使用的平台生物体，并且也可用作重组微生物平台。与酵母属类似，存在对于大肠杆菌可用的突变体文库、质粒、详细计算机代谢模型和其他信息，从而允许合理设计各种模块以增强产物产量。可以使用与上文对于酵母属所述的那些方法类似的方法来制备重组大肠杆菌微生物。

可以理解，本文所公开的重组宿主细胞可以包括植物细胞(包括生长于植物中的植物细胞)、哺乳动物细胞、昆虫细胞、来自曲霉属的真菌细胞；来自以下的酵母细胞：酵母属(例如，酿酒酵母、贝酵母(S.bayanus)、巴斯德酵母(S.pastorianus)和卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis))、裂殖酵母属(例如，粟酒裂殖酵母(S.pombe))、耶氏酵母属(例如，解脂耶氏酵母(Y.lipolytica))、假丝酵母属(例如，光滑假丝酵母(C.glabrata)、白色念珠菌(C.albicans)、克鲁斯念珠菌(C.krusei)、拉可夫氏假丝酵母(C.revkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母、产朊假丝酵母(C.utilis)和博伊丁假丝酵母(C.boidinii))、棉安舒囊霉属(Ashbya)(例如，棉安舒囊霉(A.gossypii))、Cyberlindnera属(例如，C.jadinii)、毕赤酵母属(例如，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)和库德毕赤酵母(P.kudriavzevii))、克鲁维酵母属(例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis))、汉逊酵母属(例如，多形汉逊酵母(H.polymorpha))、阿氏酵母属(例如，解腺嘌呤阿氏酵母(A.adeninivorans))、法夫酵母属(例如，红法夫酵母(X.dendrorhous))、伊萨酵母属(例如，东方伊萨酵母(I.orientali))、有孢圆酵母属(例如，T.franciscae和球形有孢圆酵母(T.globosa))、地霉属(例如，白地霉和克氏地霉)、接合酵母属(例如，二孢接合酵母和苹果酒接合酵母)、粉状毕赤酵母属(例如，嗜土粉状毕赤酵母(Y.philogaea))、Lanchancea属(例如，L.kluyveri)、柯达酵母属(Kodamaea)(例如，奥莫柯达酵母(K.ohmeri))、酒香酵母属(例如，异酒香酵母(B.anomalus))、毛孢子菌属(例如，水生毛孢子菌、白吉利毛孢子菌和真皮毛孢子菌)、德巴利酵母属(例如，D.hansenuis和汉逊德巴利酵母)、毕赤酵母属(例如，S.stipis)、红冬孢酵母属(例如，圆红冬孢酵母(R.toruloides))、管囊酵母属(例如，嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus))和小立碗藓属、红酵母属、哈萨克斯坦酵母属、赤霉属、蘑菇属和原毛平革菌属；包括但不限于黑腹果蝇的昆虫细胞；藻类细胞，包括但不限于三孢布拉霉、盐生杜氏藻、雨生红球藻、小球藻、裙带菜、马尾藻、海带和栅藻；或来自以下的细菌细胞：芽孢杆菌属(例如，纳豆芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、潘蒂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)、不动杆菌属、诺卡氏菌属、黄色杆菌属、埃希氏菌属(例如，大肠杆菌)、链霉菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属(例如，粘质沙雷氏菌)、假单胞菌属(例如，铜绿假单胞菌)、沙门氏菌属(例如，鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌)，并且还包括绿弯菌属细菌(例如，橙色绿弯菌)、绿线菌属(例如，巨大绿线菌)、绿色硫细菌(例如，绿菌属细菌(例如，泥生绿菌)、暗网菌属(例如，微黄暗网菌))、紫色硫细菌(例如，着色菌属(例如，奥氏着色菌))和紫色非硫细菌(例如，红螺菌属(例如，深红红螺菌)、红细菌属(例如，球形红细菌和荚膜红细菌)和红微菌属细菌(例如，万尼氏红微菌)。

甜菊糖苷组合物

甜菊糖苷在不同食物系统中不一定具有等效性能。因此希望具有引导所选甜菊醇糖苷组合物合成的能力。本文所述的重组宿主可产生选择性富含特定甜菊糖苷(例如，RebD或RebM)并具有一致性味道特性的组合物。如本文所用，术语“富含”用于描述与甜叶菊植物的甜菊糖苷组合物(提取物)相比具体甜菊糖苷的比例增加的甜菊糖苷组合物。因此，本文所述的重组宿主可有利于产生定制来满足给定食物产品所需甜味特性并具有一定比例的批次与批次之间一致的每种甜菊糖苷的组合物。在一些实施方案中，本文所述的宿主不生产或生产减少量的存在于甜叶菊提取物中的不希望的植物副产物。因此，由本文所述的重组宿主生产的甜菊糖苷组合物可与来源于甜菊醇植物的组合物区分。

所累积的个别甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的量可以是约1至约7,000mg/L，例如，约1至约10mg/L、约3至约10mg/L、约5至约20mg/L、约10至约50mg/L、约10至约100mg/L、约25至约500mg/L、约100至约1,500mg/L或约200至约1,000mg/L，至少约1,000mg/L、至少约1,200mg/L、至少约至少1,400mg/L、至少约1,600mg/L、至少约1,800mg/L、至少约2,800mg/L或至少约7,000mg/L。在一些方面中，个别甜菊糖苷的量可以超过7,000mg/L。所累积甜菊糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的组合的量可以是约1mg/L至约7,000mg/L，例如约200至约1,500、至少约2,000mg/L、至少约3,000mg/L、至少约4,000mg/L、至少约5,000mg/L、至少约6,000mg/L或至少约7,000mg/L。在一些方面中，甜菊糖苷的组合的量可以超过7,000mg/L。通常，较长培养时间将产生较大量的产物。因此，重组微生物可以培养1天至7天、1天至5天、3天至5天、约3天、约4天或约5天。

应了解，本文所讨论的各种基因和模块可以存在于除两种或更多种重组微生物中，而不是存在于单一微生物中。当使用多种重组微生物时，可以使它们在混合培养物中生长以生产甜菊醇和/或甜菊糖苷。例如，第一微生物可包含一种或多种生物合成基因以用于产生甜菊糖苷前体，而第二种微生物包含甜菊糖苷生物合成基因。然后回收由第二微生物或最终微生物生产的产物。还应了解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养素源并利用除发酵器之外的系统来使重组微生物生长。

可替代地，两种或更多种微生物可以各自生长在单独的培养基中并且可以将第一培养基的产物(例如，甜菊醇)引入到第二培养基中，以转化成后续中间体，或者转化成最终产物诸如RebA。然后回收由第二微生物或最终微生物生产的产物。还应了解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养素源并利用除发酵器之外的系统来使重组微生物生长。

通过本文所公开的方法获得的甜菊糖苷和组合物可以用于制作食物产品、膳食补充剂和甜味剂组合物。参见例如WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO2014/122328。

例如，在食物产品诸如冰淇淋、碳酸饮料、果汁、乳酸、烘焙食品、口香糖、硬糖果和软糖果以及调味汁中可以包含基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷诸如RebM或RebD。在非食物产品诸如药物产品、医用产品、膳食补充剂和营养补充剂中也可以包含基本上纯的甜菊醇或甜菊糖苷。在用于农业工业和伴侣动物工业的动物饲料产品中也可以包含基本上纯的甜菊醇或甜菊糖苷。可替代地，甜菊醇和/或甜菊糖苷的混合物可以通过单独培养重组微生物(每种微生物产生特定甜菊醇或甜菊糖苷)、从每种微生物回收基本上纯的形式的甜菊醇或甜菊醇糖苷并且然后将所述化合物合并以获得包含所需比例的每种化合物的混合物来制备。本文所述的重组微生物允许获得与当前甜叶菊产物相比更精确且一致的混合。

在另一个替代方案中，基本上纯的甜菊醇或甜菊糖苷可以连同其他甜味剂(例如，糖精、右旋糖、蔗糖、果糖、赤藓醇、天冬甜素、三氯蔗糖、莫那甜或丁磺氨钾)一起并入食物产品中。甜菊醇或甜菊醇糖苷相对于其他甜味剂的重量比可以根据需要来改变，以实现最终食物产品中令人满意的味道。参见例如U.S.2007/0128311。在一些实施方案中，甜菊醇或甜菊糖苷可以作为风味调节剂提供风味(例如，柑橘类)。

由本文所述的重组微生物产生的组合物可以并入食物产品中。例如，由重组微生物产生的甜菊糖苷组合物可以一定量并入食物产品，所述量的范围根据甜菊糖苷和食物产品的类型为基于干重约20mg甜菊醇糖苷/kg食物产品至约1800mg甜菊醇糖苷/kg食物产品。例如，由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可以并入甜品、冷甜食(例如，冰淇淋)、乳制品(例如，酸乳)或饮料(例如，碳酸饮料)中，以使得食物产品具有基于干重500mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物产生的甜菊糖苷组合物可以并入烘焙食品(例如，饼干)中，以使得食物产品具有基于干重300mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物产生的甜菊糖苷组合物可以并入调味汁(例如，巧克力酱)或蔬菜产品(例如，咸菜)中，以使得食物产品具有基于干重1000mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物产生的甜菊糖苷组合物可以并入面包中，以使得食物产品具有基于干重160mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷组合物可以并入硬糖果或软糖果中，以使得食物产品具有基于干重1600mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊糖苷组合物可以并入加工的水果产品(例如，果汁、水果馅、果酱和果胶)中，以使得食物产品具有基于干重1000mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。在一些实施方案中，本文所生产的甜菊糖苷组合物为药物组合物的组分。参见例如Steviol GlycosidesChemical and Technical Assessment 69th JECFA，2007，由Harriet Wallin制定，FoodAgric.Org.；EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sources added to Food(ANS)，“Scientific Opinion on the safety of steviol glycosides for theproposed uses as a food additive，”2010，EFSA Journal 8(4)：1537；美国食品药品监督管理局GRAS公告323；美国食品药品监督管理局GRAS公告329；WO 2011/037959；WO 2010/146463；WO 2011/046423；和WO 2011/056834。

例如，此甜菊糖苷组合物具有90-99重量％RebA和不可检测量的甜叶菊植物来源的污染物，并且以基于干重25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg并入食物产品中。

此甜菊糖苷组合物可以是具有大于3重量％RebB的富含RebB的组合物并且并入食物产品中，以使得产品中的RebB的量为基于干重25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebB的组合物具有不可检测量的甜叶菊植物来源的污染物。

此甜菊醇糖苷组合物可以是具有大于3重量％RebD的富含RebD的组合物并且并入食物产品中，以使得产品中的RebD的量为基于干重25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebD的组合物具有不可检测量的甜叶菊植物来源的污染物。

此甜菊醇糖苷组合物可以是具有大于3重量％RebE的富含RebE的组合物并且并入食物产品中，以使得产品中的RebE的量为基于干重25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebE的组合物具有不可检测量的甜叶菊植物来源的污染物。

此甜菊醇糖苷组合物可以是具有大于3重量％RebM的富含RebM的组合物并且并入食物产品中，以使得产品中的RebM的量为基于干重25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebM的组合物具有不可检测量的甜叶菊植物来源的污染物。

在一些实施方案中，基本上纯的甜菊醇或甜菊糖苷并入餐桌用甜味剂或“杯内(cup-for-cup)”产品中。此类产品通常使用本领域技术人员已知的一种或多种增量剂(例如，麦芽糖糊精)稀释至适当的甜味水平。富含RebA、RebB、RebD、RebE或RebM的甜菊糖苷组合物可以基于干重10,000至30,000mg甜菊糖苷/kg产品包装在小囊中。在一些实施方案中，甜菊糖苷是在体内、在体外或通过全细胞转化来生产

本发明将在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求书中所述的本发明范围。

实施例

以下实施例说明了本发明的特定实施方案以及其各种用途。它们仅出于解释性目的列出并且不应理解为限制本发明。

实施例1.UGT74G1变体表达

通过如上文在“功能性同源物”中所述进行建模来鉴别在SEQ ID NO：4的UGT74G1多肽的149个位置处的一组154个可能的突变(参见表1)。制备了179个UGT74G1变体(即，功能性同源物)的文库，其包含一个或多个鉴别的突变(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)。参见表2。

表1.UGT74G1突变组

表2.UGT74G1变体文库

用表达表2的UGT74G1变体的载体转化感受态大肠杆菌细胞。在转化之后，将80μL每种培养物转移到含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL氯霉素的800μL标准溶菌肉汤(LB)培养基中并且在37℃下、在300rpm下振荡的情况下孵育18小时。制备转化的细胞的甘油储备液(25％甘油)并且在-80℃下储存。

将含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL氯霉素的1mL自诱导预培养基接种10μL如前一段所述制备的甘油储备液，并且在25℃下、在300rpm下振荡的情况下在96孔板中孵育20小时。然后将含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL氯霉素的1mL自诱导预培养基接种足以提供0.2的初始OD的量的预培养样品(约20-25μL预培养物)，并且在25℃下、在300rpm下振荡的情况下孵育18小时。然后在4℃下通过在3500rpm下离心15分钟来使细胞沉淀。通过将板倒置并且将倒置的板在薄页纸上轻敲来舍弃上清液。然后在-80℃下将沉淀物冷冻至少15分钟。

在室温下将细胞沉淀物在水浴中解冻之后，将具有蛋白酶抑制剂的结合和溶菌酶缓冲液(Tris-HCl 20mM pH 8、NaCl 0.5M、咪唑20mM、溶菌酶0.2mg/ml、DNA酶I 20μg/ml、MgCl₂ 1mM、蛋白酶抑制剂完全小规格片1x)以每100mg细胞1mL(约250μL)的量添加至各孔中。在20℃下将细胞重新悬浮于在300rpm下的轨道式震荡器上持续15分钟，然后在4℃下孵育2小时。孵育之后，将细胞通过一个或多个冻-融循环来溶解，然后通过在4℃下以3000g离心15分钟来澄清。将上清液转移至干净的96孔板并且用甘油(40％甘油)稀释。将样品在-20℃下储存。

实施例2.UGT74G1变体活性测定

将根据表3制备的在96孔板中的60μL反应混合物在30℃下、在75-100rpm下振荡的情况下孵育2h。然后通过在纯甲醇中1∶5稀释混合物来使反应淬灭，并且在3500rpm下离心15分钟。将上清液分离并且在-80℃下储存，直到进行LC-MS分析。

表3.活性测定反应混合物

将淬灭的反应混合物的5μL样品注射到Water Acquity UPLC系统(Milford，USA)中，所述系统联接到Bruker mictoTOF-Q II质量检测器(Bremen，Germany)。使用以下两种移动相的梯度，在保持55℃的Waters AcquityBEH C18柱(1.7μm，2.1mm x 50mm)上实现化合物的分离：A(具有5mM甲酸铵的水，pH 9.0)和B(乙腈)，流速为0.6mL/min。梯度曲线图由以下组成：25％B，持续0.3分钟；25％B至85％B的线性梯度，历经2分钟；100％B洗液，持续1分钟；以及最终35％B，持续0.6分钟。质量分析仪配备有电喷雾离子化(ESI)源并且以负模式操作。毛细管电压为3.5kV，源极保持在180℃，并且去溶剂化气体流速和喷雾器压力分别为8L/min和1.6巴。

以MS全扫描模式(120-800m/z范围)追踪感兴趣的化合物，并且在采集后通过从总离子色谱图提取出离子来进行定量。使用以10μM可信标准品的单点标定，使用BrukerQuantAnalysis软件，提取离子色谱图(EIC)提供甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)(525.3m/z[M+Fa-H]^-)、异贝壳杉烯酸(KA)(301.2m/z[M-H]^-)、甜茶苷(rubu)(687.3m/z[M+Fa-H]^-)和甜菊醇(317.2m/z[M-H]^-)的半定量。使用校正的响应因子，将甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)(525.3[M+Fa-H]^-)和贝壳杉烯酯-19-O-葡糖苷(19-KMG)(509.3m/z[M+Fa-H]^-)浓度估计为13-SMG当量。结果在表4中示出。

表4.UGT74G1变体活性

*估计为13-SMG当量。

表4中提供的结果显示，UGT74G1变体以与野生型UGT74G1多肽的相对量不同的相对量生产出一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷。例如，表4的若干变体以与野生型UGT74G1多肽的相对量(参见例如WO 2011/153378的实施例21)不同的相对量生产出甜茶苷和19-SMG。

已详细描述本发明并且已参考本发明的特定实施方案，显然在不脱离所附权利要求书所界定的本发明的范围的情况下，修改和变化都是可能的。更具体来说，虽然本发明的一些方面在本文中被鉴定为特别有利的，但是预期本发明并不必限于本发明的这些特定方面。

表5.本文所公开的序列.

SEQ ID NO：3

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：4

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：5

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：6

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：7

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：8

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：9

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：10

SEQ ID NO：11

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：12

SEQ ID NO：13

SEQ ID NO：14

水稻

SEQ ID NO：15

水稻

SEQ ID NO：16

水稻

SEQ ID NO：17

SEQ ID NO：18

SEQ ID NO：19

聚球藻

SEQ ID NO：20

聚球藻

SEQ ID NO：21

SEQ ID NO：22

藤仓赤霉

SEQ ID NO：23

SEQ ID NO：24

小家鼠

SEQ ID NO：25

SEQ ID NO：26

假微型海链藻

SEQ ID NO：27

SEQ ID NO：28

棒状链霉菌

SEQ ID NO：29

SEQ ID NO：30

嗜酸嗜热硫化叶菌

SEQ ID NO：31

SEQ ID NO：32

聚球藻

SEQ ID NO：33

SEQ ID NO：34

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：35

SEQ ID NO：36

棒状链霉菌

SEQ ID NO：37

SEQ ID NO：38

慢生大豆根瘤菌

SEQ ID NO：39

玉米

SEQ ID NO：40

玉米

SEQ ID NO：41

SEQ ID NO：42

拟南芥

SEQ ID NO：43

SEQ ID NO：44

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：45

SEQ ID NO：46

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：47

SEQ ID NO：48

玉米

SEQ ID NO：49

SEQ ID NO：50

毛果杨

SEQ ID NO：51

拟南芥

SEQ ID NO：52

拟南芥

SEQ ID NO：53

SEQ ID NO：54

桃拟茎点霉

SEQ ID NO：55

SEQ ID NO：56

小立碗藓

SEQ ID NO：57

SEQ ID NO：58

藤仓赤霉

SEQ ID NO：59

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：60

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：61

SEQ ID NO：62

莴苣

SEQ ID NO：63

甜叶悬钩子

SEQ ID NO：64

甜叶悬钩子

SEQ ID NO：65

SEQ ID NO：66

板栗

SEQ ID NO：67

SEQ ID NO：68

盐芥

SEQ ID NO：69

SEQ ID NO：70

葡萄

SEQ ID NO：71

SEQ ID NO：72

藤仓赤霉

SEQ ID NO：73

SEQ ID NO：74

云芝

SEQ ID NO：75

SEQ ID NO：76

拟南芥

SEQ ID NO：77

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：78

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：79

SEQ ID NO：80

罗汉果

SEQ ID NO：81

SEQ ID NO：82

藤仓赤霉

SEQ ID NO：83

SEQ ID NO：84

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：85

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：86

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：87

SEQ ID NO：88

甜叶悬钩子

SEQ ID NO：89

SEQ ID NO：90

拟南芥

SEQ ID NO：91

拟南芥

SEQ ID NO：92

拟南芥

SEQ ID NO：93

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：94

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：95

SEQ ID NO：96

甜叶悬钩子

SEQ ID NO：97

甜叶悬钩子

SEQ ID NO：98

SEQ ID NO：99

SEQ ID NO：100

欧洲甜樱桃

SEQ ID NO：101

梅

SEQ ID NO：102

梅

SEQ ID NO：103

梅

SEQ ID NO：104

桃

SEQ ID NO：105

SEQ ID NO：106

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：107

SEQ ID NO：108

灌木甜叶菊

SEQ ID NO：109

SEQ ID NO：110

拟南芥

SEQ ID NO：111

SEQ ID NO：112

葡萄

SEQ ID NO：113

SEQ ID NO：114

蒺藜苜蓿

SEQ ID NO：115

SEQ ID NO：116

拟南芥

SEQ ID NO：117

甜叶悬钩子

SEQ ID NO：118

SEQ ID NO：119

SEQ ID NO：120

玉米

Claims

1.一种能够生产一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含重组基因，所述重组基因编码能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽，所述多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ IDNO：4的残基15、16、18、20、27、28、30、31、49、51、67、68、73、75、79、81、83、84、86-88、90、91、96、99、107、110、111、113、115、119-121、123、128、129、135、136、140、141、143、146、147、156、162、166、169、173、176、179-181、183-189、191-195、200、204、209、211、212、215、221、222、224、232、237、247、252、255、257、259、263、265、266、269、274、280、284、285、287、292、295-298、300、301、303、310、311、313、315、316、320、322、325、326、328、329、332、333、335、338、341、346、347、357、364、370、371、373、375-377、380、385、387-391、396、401、407-411、415、416、419、424、426、427、434、448、449、455、456或458的一个或多个氨基酸取代。

2.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述多肽包含SEQ ID NO：4的至少一个氨基酸取代，即L15V、I16L、F18Y、L20A、F27M、I28L、F30L、G31S、G31A、T49I、N51K、Q67E、A68T、C73F、E75D、M79A、E83D、E83K、S84A、L86I、E87D、T88R、K90W、Q91E、S96T、D99E、E107S、T110P、I111V、A113C、I115V、M119F、T120L、E121P、V123A、I128K、E129Q、G135A、S136A、Q140N、A141S、V143A、S146N、L147I、I156L、E162T、V166L、F169L、Q173E、E176D、L179S、I180F、L181V、N183D、H184P、E185G、Q186S、I187Y、Q188P、S189A、W191F、S192D、Q193M、M194V、L195V、A200S、Q204K、F209L、N211H、S212T、K215E、I221V、E222D、T224M、V232T、L237I、D247E、N252Y、N255S、Y257F、A259P、E263A、M265I、N266K、N266E、D269N、E274G、A280S、L284M、V285A、H287L、V292M、I295L、I295M、T296A、R297W、A298G、I300K、D301N、D303N、I310V、K311R、K313S、E315Q、G316A、E320K、L322F、V325E、I326T、T328S、G329E、L332I、I333V、A335S、K338P、D341E、E346P、E346K、S347A、F357W、I364L、V370M、V371I、M373V、Q375L、F376W、S377T、T380S、L385F、D387E、E388D、I389V、L390W、G391K、V396A、N401K、G40/E、N408E、L409I、A410E、S411D、M415E、I416V、E419G、I424E、R426K、K427E、D434E、N448K、D449N、S455A、E456K或I458V。

3.如权利要求1或2所述的重组宿主细胞，其还包含：

(b)编码能够从GGPP合成内根-柯巴基二磷酸酯的多肽的基因；

(e)编码能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；

(f)编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；

其中所述基因中的至少一种为重组基因。

4.如权利要求3所述的重组宿主细胞，其中：

5.如权利要求1-4中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷包括贝壳杉烯酯-19-O-葡糖苷(19-KMG)、甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷(RebG)、甜茶苷、莱苞迪苷A(RebA)、莱苞迪苷B(RebB)、莱苞迪苷C(RebC)、莱苞迪苷D(RebD)、莱苞迪苷E(RebE)、莱苞迪苷F(RebF)、莱苞迪苷M(RebM)、莱苞迪苷Q(RebQ)、莱苞迪苷I(RebI)、杜克苷A、单糖基化内根-贝壳杉烯酸、二糖基化内根-贝壳杉烯酸、三糖基化内根-贝壳杉烯酸、单糖基化内根-贝壳杉烯醇、二糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化甜菊糖苷、四糖基化甜菊糖苷、五糖基化甜菊糖苷、六糖基化甜菊糖苷、七糖基化甜菊糖苷和/或其异构体。

6.如权利要求1-5中任一项所述的重组宿主细胞，其中相对于表达能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷、缺乏所述一个或多个氨基酸取代的多肽的对应宿主，能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷、与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有所述一个或多个氨基酸取代的所述多肽的表达增加或降低由所述细胞产生的19-KMG、19-SMG和/或甜茶苷的量至少约5％、10％、25％、50％或100％。

7.如权利要求1-6中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞、古菌细胞或细菌细胞。

8.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞为酿酒酵母细胞。

9.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞为解脂耶氏酵母细胞。

10.一种在细胞培养物中生产一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷的方法，其包括在表达所述基因的条件下在所述细菌培养物中培养如权利要求1-9中任一项所述的重组宿主细胞；并且其中所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷是由所述重组细胞产生的。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述基因是组成性地表达的。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述基因的所述表达被诱导。

13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其还包括从所述细胞培养物中分离出所述产生的一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷。

14.如权利要求13所述的方法，其中在所述分离步骤中包括将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离，以获得包含所述产生的一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷的上清液，以及：

15.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其还包括从所述细胞培养物中回收所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述回收的一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷相对于甜叶菊植物的甜菊糖苷组合物富含所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷，并且相对于获自植物来源的甜叶菊提取物的甜菊糖苷组合物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。

17.一种用于生产一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷的方法，其包括使用以下来全细胞生物转化重组宿主细胞的细胞培养物中的植物来源或合成甜菊醇、甜菊醇前体和/或甜菊糖苷：能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽，其与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ ID NO：4的残基15、16、18、20、27、28、30、31、49、51、67、68、73、75、79、81、83、84、86-88、90、91、96、99、107、110、111、113、115、119-121、123、128、129、135、136、140、141、143、146、147、156、162、166、169、173、176、179-181、183-189、191-195、200、204、209、211、212、215、221、222、224、232、237、247、252、255、257、259、263、265、266、269、274、280、284、285、287、292、295-298、300、301、303、310、311、313、315、316、320、322、325、326、328、329、332、333、335、338、341、346、347、357、364、370、371、373、375-377、380、385、387-391、396、401、407-411、415、416、419、424、426、427、434、448、449、455、456或458的一个或多个氨基酸取代；

和任选地以下中的一种或多种：

(c)能够β1，2糖基化甜菊糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′的多肽，其包括与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽或与SEQ IDNO：16所示的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽；

其中所述多肽中的至少一种为重组多肽；以及

从而产生所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷。

18.如权利要求17所述的方法，其中能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的所述多肽包含SEQ ID NO：4的至少一个氨基酸取代，即L15V、I16L、F18Y、L20A、F27M、I28L、F30L、G31S、G31A、T49I、N51K、Q67E、A68T、C73F、E75D、M79A、E83D、E83K、S84A、L86I、E87D、T88R、K90W、Q91E、S96T、D99E、E107S、T110P、I111V、A113C、I115V、M119F、T120L、E121P、V123A、I128K、E129Q、G135A、S136A、Q140N、A141S、V143A、S146N、L147I、I156L、E162T、V166L、F169L、Q173E、E176D、L179S、I180F、L181V、N183D、H184P、E185G、Q186S、I187Y、Q188P、S189A、W191F、S192D、Q193M、M194V、L195V、A200S、Q204K、F209L、N211H、S212T、K215E、I221V、E222D、T224M、V232T、L237I、D247E、N252Y、N255S、Y257F、A259P、E263A、M265I、N266K、N266E、D269N、E274G、A280S、L284M、V285A、H287L、V292M、I295L、I295M、T296A、R297W、A298G、I300K、D301N、D303N、I310V、K311R、K313S、E315Q、G316A、E320K、L322F、V325E、I326T、T328S、G329E、L332I、I333V、A335S、K338P、D341E、E346P、E346K、S347A、F357W、I364L、V370M、V371I、M373V、Q375L、F376W、S377T、T380S、L385F、D387E、E388D、I389V、L390W、G391K、V396A、N401K、G407E、N408E、L409I、A410E、S411D、M415E、I416V、E419G、I424E、R426K、K427E、D434E、N448K、D449N、S455A、E456K或I458V。

19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述重组宿主细胞包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞、古菌细胞或细菌细胞。

20.如权利要求17或18所述的方法，其中所述重组宿主细胞为酿酒酵母细胞。

21.如权利要求17或18所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞为解脂耶氏酵母细胞。

22.一种用于生产一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷的体外方法，其包括向反应混合物中添加能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽，所述多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ ID NO：4的残基15、16、18、20、27、28、30、31、49、51、67、68、73、75、79、81、83、84、86-88、90、91、96、99、107、110、111、113、115、119-121、123、128、129、135、136、140、141、143、146、147、156、162、166、169、173、176、179-181、183-189、191-195、200、204、209、211、212、215、221、222、224、232、237、247、252、255、257、259、263、265、266、269、274、280、284、285、287、292、295-298、300、301、303、310、311、313、315、316、320、322、325、326、328、329、332、333、335、338、341、346、347、357、364、370、371、373、375-377、380、385、387-391、396、401、407-411、415、416、419、424、426、427、434、448、449、455、456或458的一个或多个氨基酸取代；

和任选地以下中的一种或多种：

和植物来源或合成甜菊醇、甜菊醇前体和/或甜菊糖苷；

其中所述多肽中的至少一种为重组多肽；以及

从而产生所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷。

23.如权利要求22所述的方法，其中能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的所述多肽包含SEQ ID NO：4的至少一个氨基酸取代，即L15V、I16L、F18Y、L20A、F27M、I28L、F30L、G31S、G31A、T49I、N51K、Q67E、A68T、C73F、E75D、M79A、E83D、E83K、S84A、L86I、E87D、T88R、K90W、Q91E、S96T、D99E、E107S、T110P、I111V、A113C、I115V、M119F、T120L、E121P、V123A、I128K、E129Q、G135A、S136A、Q140N、A141S、V143A、S146N、L147I、I156L、E162T、V166L、F169L、Q173E、E176D、L179S、I180F、L181V、N183D、H184P、E185G、Q186S、I187Y、Q188P、S189A、W191F、S192D、Q193M、M194V、L195V、A200S、Q204K、F209L、N211H、S212T、K215E、I221V、E222D、T224M、V232T、L237I、D247E、N252Y、N255S、Y257F、A259P、E263A、M265I、N266K、N266E、D269N、E274G、A280S、L284M、V285A、H287L、V292M、I295L、I295M、T296A、R297W、A298G、I300K、D301N、D303N、I310V、K311R、K313S、E315Q、G316A、E320K、L322F、V325E、I326T、T328S、G329E、L332I、I333V、A335S、K338P、D341E、E346P、E346K、S347A、F357W、I364L、V370M、V371I、M373V、Q375L、F376W、S377T、T380S、L385F、D387E、E388D、I389V、L390W、G391K、V396A、N401K、G407E、N408E、L409I、A410E、S411D、M415E、I416V、E419G、I424E、R426K、K427E、D434E、N448K、D449N、S455A、E456K或I458V。

24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述反应混合物包含：

(a)一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体糖苷；

(b)UGT多肽；

(d)反应缓冲液和/或盐。

25.如权利要求10-24中任一项所述的方法，其中所述一种或多种甜菊糖苷或所述甜菊醇前体藤苷包括19-KMG、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebG、甜茶苷、RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、RebF、RebM、RebQ、RebI、杜克苷A、单糖基化内根-贝壳杉烯酸、二糖基化内根-贝壳杉烯酸、三糖基化内根-贝壳杉烯酸、单糖基化内根-贝壳杉烯醇、二糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化甜菊糖苷、四糖基化甜菊糖苷、五糖基化甜菊糖苷、六糖基化甜菊糖苷、七糖基化甜菊糖苷和/或其异构体。

26.一种包含如权利要求1-9中任一项所述的重组宿主细胞的细胞培养物，所述细胞培养物还包含：

27.一种生长在细胞培养物中的如权利要求1-9中任一项所述的重组宿主细胞的细胞裂解液，其包含：

28.由如权利要求1-9中任一项所述的重组宿主细胞生产的一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷；

其中有所述重组宿主细胞生产的所述一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷以与甜叶菊植物的甜菊糖苷组合物不同的相对量存在，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有降低水平的甜叶菊植物来源组分。

29.由如权利要求10-25中任一项所述的方法生产的一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷；

30.一种甜味剂组合物，其包含如权利要求28或29所述的一种或多种甜菊糖苷或甜菊醇前体糖苷。

31.一种食物产品，其包含如权利要求30所述的甜味剂组合物。

32.一种饮料或饮料浓缩物，其包含如权利要求30所述的甜味剂组合物。

33.一种分离的核酸分子，其编码能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽或其催化活性部分，其中所述编码的多肽或所述其催化活性部分包括与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ ID NO：4的残基15、16、18、20、27、28、30、31、49、51、67、68、73、75、79、81、83、84、86-88、90、91、96、99、107、110、111、113、115、119-121、123、128、129、135、136、140、141、143、146、147、156、162、166、169、173、176、179-181、183-189、191-195、200、204、209、211、212、215、221、222、224、232、237、247、252、255、257、259、263、265、266、269、274、280、284、285、287、292、295-298、300、301、303、310、311、313、315、316、320、322、325、326、328、329、332、333、335、338、341、346、347、357、364、370、371、373、375-377、380、385、387-391、396、401、407-411、415、416、419、424、426、427、434、448、449、455、456或458的一个或多个氨基酸取代的多肽。

34.一种分离的核酸分子，其编码能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽或其催化活性部分，其中所述编码的多肽或所述其催化活性部分包括与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ ID NO：4的至少一个氨基酸取代即L15V、I16L、F18Y、L20A、F27M、I28L、F30L、G31S、G31A、T49I、N51K、Q67E、A68T、C73F、E75D、M79A、E83D、E83K、S84A、L86I、E87D、T88R、K90W、Q91E、S96T、D99E、E107S、T110P、I111V、A113C、I115V、M119F、T120L、E121P、V123A、I128K、E129Q、G135A、S136A、Q140N、A141S、V143A、S146N、L147I、I156L、E162T、V166L、F169L、Q173E、E176D、L179S、I180F、L181V、N183D、H184P、E185G、Q186S、I187Y、Q188P、S189A、W191F、S192D、Q193M、M194V、L195V、A200S、Q204K、F209L、N211H、S212T、K215E、I221V、E222D、T224M、V232T、L237I、D247E、N252Y、N255S、Y257F、A259P、E263A、M265I、N266K、N266E、D269N、E274G、A280S、L284M、V285A、H287L、V292M、I295L、I295M、T296A、R297W、A298G、I300K、D301N、D303N、I310V、K311R、K313S、E315Q、G316A、E320K、L322F、V325E、I326T、T328S、G329E、L332I、I333V、A335S、K338P、D341E、E346P、E346K、S347A、F357W、I364L、V370M、V371I、M373V、Q375L、F376W、S377T、T380S、L385F、D387E、E388D、I389V、L390W、G391K、V396A、N401K、G407E、N408E、L409I、A410E、S411D、M415E、I416V、E419G、I424E、R426K、K427E、D434E、N448K、D449N、S455A、E456K或I458V的多肽。

35.如权利要求33或34所述的核酸，其中所述核酸为cDNA。

36.一种能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽或其催化活性部分，其中所述编码的多肽或所述其催化活性部分包括与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ ID NO：4的残基15、16、18、20、27、28、30、31、49、51、67、68、73、75、79、81、83、84、8688、90、91、96、99、107、110、111、113、115、119-121、123、128、129、135、136、140、141、143、146、147、156、162、166、169、173、176、179-181、183-189、191-195、200、204、209、211、212、215、221、222、224、232、237、247、252、255、257、259、263、265、266、269、274、280、284、285、287、292、295-298、300、301、303、310、311、313、315、316、320、322、325、326、328、329、332、333、335、338、341、346、347、357、364、370、371、373、375-377、380、385、387-391、396、401、407-411、415、416、419、424、426、427、434、448、449、455、456或458的一个或多个氨基酸取代的多肽。

37.一种能够在C-19羧基处糖基化甜菊醇或甜菊糖苷的多肽或其催化活性部分，其中所述编码的多肽或所述其催化活性部分包括与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有SEQ ID NO：4的至少一个氨基酸取代即L15V、I16L、F18Y、L20A、F27M、I28L、F30L、G31S、G31A、T49I、N51K、Q67E、A68T、C73F、E75D、M79A、E83D、E83K、S84A、L86I、E87D、T88R、K90W、Q91E、S96T、D99E、E107S、T110P、I111V、A113C、I115V、M119F、T120L、E121P、V123A、I128K、E129Q、G135A、S136A、Q140N、A141S、V143A、S146N、L147I、I156L、E162T、V166L、F169L、Q173E、E176D、L179S、I180F、L181V、N183D、H184P、E185G、Q186S、I187Y、Q188P、S189A、W191F、S192D、Q193M、M194V、L195V、A200S、Q204K、F209L、N211H、S212T、K215E、I221V、E222D、T224M、V232T、L237I、D247E、N252Y、N255S、Y257F、A259P、E263A、M265I、N266K、N266E、D269N、E274G、A280S、L284M、V285A、H287L、V292M、I295L、I295M、T296A、R297W、A298G、I300K、D301N、D303N、I310V、K311R、K313S、E315Q、G316A、E320K、L322F、V325E、I326T、T328S、G329E、L332I、I333V、A335S、K338P、D341E、E346P、E346K、S347A、F357W、I364L、V370M、V371I、M373V、Q375L、F376W、S377T、T380S、L385F、D387E、E388D、I389V、L390W、G391K、V396A、N401K、G407E、N408E、L409I、A410E、S411D、M415E、I416V、E419G、I424E、R426K、K427E、D434E、N448K、D449N、S455A、E456K或I458V的多肽。

38.如权利要求36或37所述的多肽或其催化活性部分，其中所述多肽或所述其催化活性部分为纯化的多肽或其催化活性部分。