DE10027821A1 - Der Mevalonat-unabhängige Isoprenoidbiosyntheseweg - Google Patents

Der Mevalonat-unabhängige Isoprenoidbiosyntheseweg

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Enzyme und Intermediate des Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosynthesewegs stromab von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat und stromauf von Isopentenylpyrophosphat oder Dimethylallylpyrophosphat. Diese werden benützt als Grundlage für ein Screening-Verfahren für Inhibitoren dieser Enzyme und ein Verfahren zur Identifizierung von inhibitor-resistenten Varianten davon. Weitere Offenbarungen betreffen die DNS, die für die Enzyme und für inhibitor-resistente Varianten davon codiert, Vektoren, welche die DNS enthalten, Zellen, welche die Vektoren enthalten und Pflanzensamen, die Zellen, welche die Vektoren enthalten, umfassen. Diese Erfindung ist geeignet für die Inhibitierung der Biosynthese von Isoprenoiden in Pflanzen, Bakterien und Protozoen, für die Übertragung von Herbizid-Resistenz auf Pflanzen sowie für die Wachstumskontrolle in der Landwirtschaft unter Verwendung einer Nutzpflanze, die ein herbizid-resistentes Gen und eine wirksame Menge eines geeigneten Herbizids enthält.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft den Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosyntheseweg. Insbesondere betrifft sie die Stromab-Intermediate von 2C- Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat und deren Herstellung sowie Gene und Proteine, die für ihre Biosynthese verantwortlich sind; ebenso isolierte DNA, welche für solche Proteine codiert und Expressionsvektoren, welche eine Sequenz solcher DNA enthalten, sowie rekombinante Zellen, die solche Vektoren enthalten. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Screeningmethoden für den Nachweis von Inhibitoren der enzymatischen Umsetzungen von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat und Inhibitoren, besonders Herbizide, die dadurch auffindbar sind, sowie Zubereitungen und Verfahren für die Inhibierung der Synthese von Isoprenoiden und für die Wachstumskontrolle von Organismen, besonders Pflanzen, basierend auf solchen Inhibitoren. Die Erfindung betrifft auch die Entwicklung von Inhibitor-resistenten, pflanzlichen Enzymen und Pflanzen, pflanzlichen Geweben, Pflanzensamen und Pflanzenzellen.
Durch die klassischen Untersuchungen von Bloch, Cornforth, Lynen und Mitarbeitern wur­ den Isopentenylpyrophosphat (IPP) und Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP) als Schlüs­ selintermediate der Biosynthese von Isoprenoiden über Mevalonsäure nachgewiesen. Kürzlich wurde gefunden, daß in den meisten Bakterien, in Protozoen wie Plasmodium falciparum und in den Plastiden von Pflanzen ein alternativer Mevalonat-unabhängiger Biosyntheseweg abläuft. Dieser ist bislang nur teilweise aufgeklärt worden. Er kann als aus drei Teilabschnitten bestehend dargestellt werden:
Im ersten Biosyntheseabschnitt, wie in Abb. 1 dargestellt, unterlaufen Pyruvat (I) und D- Glycerinaldehyd-3-phosphat (2) mittels 1-Deoxy-D-xylulose 5-phopshat-Synthase eine Kondensation zu 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat (DXP) (3). Anschließend wird DXP in 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat (4) in einer zweistufigen Reaktion bestehend aus einer Umlagerung und einer Reduktion durch 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat- Reduktoisomerase. Dieses bildet das fünfzählige Kohlenstoff-Isoprenoidgrundgerüst.
Im anschließenden Abschnitt des, Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg (Abb. 2 und 3), wird 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat zuerst mit CTP zu 4-Diphosphocytidyl-2C- methyl-D-erythritol (5) in Gegenwart von Magnesiumionen umgesetzt. Dieses Intermediat (5) wird anschließend mit ATP zu 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat (6) durch 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Kinase umgesetzt. Dieses Intermediat (6) wird anschließend in 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat (7) umgewandelt. Diese drei enzymatischen Schritte bilden eine biosynthetische Einheit, welche das Isoprenoid-C5-Grundgerüst für den dritten Biosyntheseabschnitt aktivieren (Rohdich et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 11758-11763 (1999); Lüttgen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1062-1067 (2000); Herz et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2486-2490 (2000)).
Der dritte Biosyntheseabschnitt ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Er betrifft die reduktive Umsetzung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat in Intermediate vom TYP IPP und DMAPP. Mit diesem Abschnitt ist der Mevalonat-unabhängige Isoprenoidbiosyntheseweg (ein Hauptbiosyntheseweg) vollständig. IPP und DMAPP unterlaufen anschließend einer Kondensation zu höheren Isoprenoiden (oder Terpenoiden).
Der Mevalonat-unabhängige Isoprenoidbiosyntheseweg ist gänzlich abwesend in Tieren. Dies macht ihn zu einem idealen Angriffspunkt für pestizidäre und medizinische Anwendungen. Die idiosynkratische Natur der Reaktionen in diesem Biosyntheseweg reduziert das Risiko der Überkreuz-Inhibition mit anderen, insbesondere Säugerenzymen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Deswegen ist es eine erste Aufgabe der Erfindung, eine chemische Verbindung bereitzustellen, die als Intermediat im Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosyntheseweg stromab von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat und stromauf von Intermediaten vom Typ IPP und DMAPP dient. Diese Aufgabe wird durch die Verbindungen der Ansprüche 1 bis 5 oder durch die Zellflüssigkeit der Ansprüche 6 oder 7 gelöst.
Eine zweite Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Umsetzung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat in ein Intermediat stromab von 2C- Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat und stromauf von Intermediaten vom TYP IPP und DMAPP. Diese Aufgabe wird mittels durch die Verfahren gemäß der Ansprüche 8 bis 10 gelöst.
Eine dritte Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Screening-Methode für Inhibitoren eines Enzyms funktionstüchtig stromab von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4- cyclopyrophosphat. Diese Aufgabe wird durch die Methoden der Ansprüche 17 bis 19 gelöst.
Eine vierte Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Enzyms in einer Form, welche wirksam in dem Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosyntheseweg stromab von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat ist. Diese Aufgabe wird durch das Enzym gemäß Anspruch 12 oder eines Proteins, welches ein solches Enzym umfasst, gelöst.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer gereinigten, isolierten Nukleinsäure, insbesondere DNA, die für ein Enzym gemäß Anspruch 12 oder einen Vektors oder eine davon abgeleitete rekombinante Zelle codiert. Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Ansprüche 13 bis 16 gelöst.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Methode zum Identifizieren von Inhibitor-resistenten Varianten von einem der oben erwähnten Enzyme, sowie von Nucleinsäuren und DNA-Vektoren, welche für solche Varianten codieren, sowie Pflanzenzellen und -samen, die eine solchen Vektor besitzen, sowie eine Methode für die Übertragung von Inhibitor-Resistenz auf Pflanzen und eine entsprechende Methode zur Saatkontrolle. Diese Aufgaben werden gemäß der Ansprüche 20 bis 28 gelöst.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Inhibitors für ein oben identifiziertes Enzym, Zubereitungen, die solche Inhibitoren enthalten, und von Methoden zur in vivo Inhibition der Isoprenoidbiosynthese. Diese Aufgaben werden gemäß der Ansprüche 29 bis 31 gelöst.
Wo immer eine phosphorylierte Verbindung oder eine Carbonsäureverbindung erwähnt wird, mag sie als freie Säure oder als Salz mit mindestens einem durch ein Ammonium- oder Metallion oder einem organischem Kation ausgetauschten Proton vorliegen. Das Metallion kann vorzugsweise ein Alkalimetallion oder Erdalkalüon sein. Das organische Kation kann von einem Amin abgeleitet sein. Es kann ein Sulfoniumion, Guanidiniumion oder Heteroaromatenion sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Abb. 1 zeigt den vorher bekannten ersten Biosyntheseabschnitt des Mevalonat- unabhängigen Biosynthesewegs.
Abb. 2 und 3 zeigen den vorher bekannten zweiten Biosyntheseabschnitt des Mevalonat- unabhängigen Biosynthesewegs.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Herstellung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat
2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat ist eine Schlüsselsubstanz für die Erfindung. Sie kann in benötigter Menge mittels enzymatischer Präparation im Großmaßstab erhalten werden. Die unmittelbaren Ausgangsmaterialien für diese Präparation sind Pyruvat und D- Glycerinaldehyd-3-phosphat. Jedoch wird vorzugsweise Dihydroxyacetonphosphat in zusammen mit Triosephosphat-lsomerase unter geeigneten Bedingungen als eine Quelle für D-Glycerinaldehyd-3-phosphat eingesetzt. Noch vorteilhafter ist der Gebrauch von Glukose und ATP zusammen mit den Glykolyseenzymen Hexokinase, Phosphoglukoisomerase, Phosphofruktokinase, Aldolase und Triosephosphatisomerase. Im dem speziellen Fall von Dihydroxyacetonphosphat kann die Herstellung von 2C- Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophospaht folgendermaßen beschrieben werden:
  • a) Umsetzen von Dihydroxyacetonphosphat und Natriumpyruvat in Gegenwart von Magnesiumsalz, Thiaminpyrophosphat, Triosephosphatisomerase und 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase zur Herstellung von 1-Deoxy-D- xylulose-5-phosphat;
  • b) Umsetzen der in Schritt (a) erhaltenen Reaktionsmischung mit Glukose und NADP+ in Gegenwart eines Mg2+- oder Mn2+- Salzes, Glukosedehydrogenase und 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat- Reduktoisomerase zur Herstellung von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat;
  • c) Umsetzen der in Schritt (b) erhaltenen Reaktionsmischung mit Cytosintriphosphat, einem unten definierten Enzym und einem divalenten Metallsalz zur Herstellung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol;
  • d) Umsetzen der 4 schrir (5) erhaltenen Reaktionsmischung mit Adenosintriphosphat, einem divalenten Metallsalzes und einem unten definierten Enzyms und einem divalenten Metallsalz zur Herstellung von 4- Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat;
  • e) Umsetzen der in Schritt (d) erhaltenen Reaktionsmischung mit einem unten definierten Enzym zur Herstellung von 2C-methyl-D-erythritol-2,4- cyclopyrophosphat;
  • f) Isolieren des Produkts aus Schritt (e).
Für Schritt (a) wird das Enzym 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase aus Bacillus subtilis (Williams et al., J. Bacteriol. 146 (3), 1162-1165 (1981) gemäßeiner früher beschriebenen Methode und wie hier exemplifiziert hergestellt.
Dihydroxyacetonphosphat wird gemäß Effenberger et al. (Tetrahedron Lett. 28, 1641-1644 (1987) hergestellt. Für Schritt (b) wir Enzym 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat- Reduktoisomerase aus E. coli gemäß einer früher beschriebenen Methode hergestellt. Für Schritt (c) wird das Enzym 4-Diphosphocytdyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase benötigt. Das Enzym wird durch Expression des Gens ygbP von E. coli wie hier beschrieben erhalten. Für Schritt (d) wird das Enzym 4-Diphosphocytdyl-2C-methyl-D-erythritol-Kinase benötigt. Das Enzym wird durch Expression des Gens ychß von E. coli wie hier beschrieben erhalten. Für Schritt (e) wird das Enzym 2C-methyl-D-erythritol-2,4- cyclopyrophosphat-Synthase benötigt. Das Enzym wird durch Expression des Gens ygbB von E. coli wie hier beschrieben erhalten.
Die Schritte (a) bis (e) können als separate Schritte, gegebenenfalls mit Isolierung der Intermediate oder als Eintopfreaktion ausgeführt werden.
Diese Herstellung kann mit jeder gewünschten Markierung ausgeführt werden, insbesondere mit Deuterium, Tritium, 13C oder 32P. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist die totale oder teilweise Markierung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4- cyclopyrophosphat mit 13-Kohlenstoff zum Zweck der analytischen Unterscheidung oder eine Markierung mit 14C oder 32P zum Zweck der Detektion bevorzugt, wobei die 13C- Markierung und die radioaktive Markierung kombiniert werden kann.
Die totale 13C-Markierung kann vorteilhaft ausgeführt werden, indem man von [U- 13C6]Glukose und [U-13C3]Natriumpyruvat oder [2,3-13C2]Pyruvat ausgeht. In Gegenwart von Thiaminpyrophosphat, ATP und MgCl2 werden die folgenden Enzyme benützt für die Herstellung von [U-13C]1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat; Triosephosphatisomerase, Hexokinase, Phosphoglukoseisomerase, Phosphofruktokinase, Aldolase, 1-Desoxy-D- xylulose-5-phosphat-Synthase. Anschließend können die Produkte umgewandelt werden zu [U-13C]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat mit 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat- Reduktoisomerase, Glukosedehydrogenase und Glukose, NADP+ und MgCl2.
Weiterhin kann [U-13C5]2C-Methyl-D-erythritol in [U-13C5]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D- erythritol, [U-13C5]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat und [U-13C5]2C- methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat unter Benützung der Enzyme YgbP, YchB und YgbB in Gegenwart von CTP, ATP, MgCl2 und MnCl2 umgesetzt werden. Für die Regeneration von ATP ist es auch möglich Pyruvatkinase in Gegenwart von Phosphoenolpyruvat zu benützen.
Stromab-Intermediate
Es wurde überraschenderweise entdeckt, daß ein Intermediat stromab von 2C-Methyl-D- erythritol-2,4-cyclopyrophosphat hergestellt werden kann, unter Verwendung letzterer Verbindung als Ausgangsmaterial und Zellen oder Zellfraktionen als Katalysator.
Die Zellen, die für die Herstellung des Katalysators benutzt werden, können Zellen eines Organismus sein, welcher mit dem Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg ausgestattet ist, insbesondere Zellen von Pflanzen, Protozoen wie Plasmodium falciparum oder Bakterien. Es ist möglich, Plastiden anstelle von Pflanzenzellen zu benützen. Eine Pflanzenzellkultur, zum Beispiel von Catharanthus roseus kann benützt werden.
In einer bevorzugten Darstellung werden Pflanzenplastiden benützt. Die Plastiden können Chromoplasten, Chloroplasten, Etioplasten oder Leukoplasten sein.
Die Plastiden können aus Pflanzenmaterial gewonnen werden durch Aufbrechen der Zellen, Filtration und Zentrifugation gemäß bekannter Methoden z. B. von Camara (Methods Enzymol. 214, 352-365 (1993)) oder Liedvogel (Cytobiology 12, 155-174 (1976)). Diese Publikationen beschreiben auch Inkubationsmedien für diese Plastiden.
Die Inkubation kann in jedem Inkubationsmedium ausgeführt werden, welches geeignet ist für die Inkubation von Plastiden oder Zellsuspensionen. Es ist lediglich erforderlich, daß die Umwandlung mindestens das Ausmaß des alternativen Biosynthesewegs erreicht.
Das Inkubationsmedium sollte die Umwandlung unterstützen. Im einfachsten und bevorzugten Fall sollte das Inkubationsmedium die involvierten Reaktionen nicht inhibieren und alle Cofaktoren würden durch die Plastiden oder Zellen zur Verfügung gestellt. Es ist ebenso möglich einen oder mehrere Cofaktoren zum Inkubationsmedium hinzuzufügen. Der pH des Inkubationsmedium sollte physiologisch geeignet sein, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 9 und speziell im Bereich von 7 bis 8 liegen.
Da die Plastiden biochemisch vollständig kompetent sind, stellen sie jede zusätzliche Komponenten für die Biosynthese bereit. Es wird bevorzugt aber nicht zwingend notwendig, ein Magnesiumsalz und/oder ein divalenten Mangansalz, um die Enzyme in optimale Aktivität zu bringen, hinzuzufügen und es ist weiterhin bevorzugt, NADPH und/oder NADP jeweils in Konzentrationen von 0,5 bis 4 mM, vorzugsweise von 1 bis 2 mM hinzuzufügen. Weiter kann FAD in Konzentration von vorzugsweise 1 bis 100 µM, besonders 5 bis 50 µM hinzugefügt werden. Die Konzentration von NaF ist vorzugsweise 1 bis 20 mM.
Die Plastiden oder Zellen, welche mittels per se bekannter Methoden isoliert wurden, können vollständig intakt oder mehr oder weniger beschädigt sein, sogar bis zum Ausmaß der vollständigen Aufbrechung. Die biochemische Kompetenz und der Erfolg der Screening-Methode ist im wesentlichen unabhängig von solchen Unterschieden und recht stabil.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß 2C-Methyl-D-erythritol-2,4- cyclopyrophosphat durch Plastiden aufgenommen wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Pflanzenzellen oder vorzugsweise Plastiden davon; oder Bakterienzellen wie E. coli, insbesondere M15(pRep4), angezogen und mittels Zentrifugation geerntet; und anschließend zum Aufbrechen resuspendiert. Jede konventionelle Aufbrechmethode kann benützt werden. Eine bevorzugte Methode macht Gebrauch von einer Inkubation mit Lysozym in einem geeigneten Medium. Das Medium kann zum Beispiel aus Tris-Hydrochlorid, pH 7,5, vorzugsweise pH 8,0 sowie MgCl2 (z. B. 5 bis 20 mM) und Dithiothreitol (z. B. 2 bis 10 mM) bestehen.
Anschließend wird die Reaktionsmischung gekühlt und beschallt. Die erhaltene Mischung wird zentrifugiert um ein Pellet von festen Bestandteilen herzustellen. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die enzymatische Aktivität für die Umwandlung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat in der festen Zellfraktion lokalisiert ist.
Deswegen wird die feste Zellfraktion in einem geeigneten Medium (vorzugsweise im gleichen wie oben) resuspendiert.
Es ist möglich, die feste Zelifraktion weiter in Subfraktionen aufzutrennen. Dies kann erreicht werden mittels konventioneller Methoden, zum Beispiel mittels differentieller Zentrifugation oder Zentrifugation mit Dichtegradienten.
Anschließend wird 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat zu dieser Suspension hinzugefügt. Zum Zweck der Detektion wird vorzugsweise radioaktiv markiertes 2C- Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat verwendet. Es kann T, 14C- oder 32P-markiert sein. Zum Beispiel kann es in Position 2 mit 14C markiert sein.
Es ist auch möglich total 13C-markiertes Ausgangsmaterial, um strukturelle Charakterisierung des Produktes zu ermöglichen. Dazu kann eine kleine Menge radioaktives (z. B. 14C-markiert) Ausgangsmaterial hinzugefügt werden.
Die Mischung wird inkubiert, vorzugsweise bei 30 bis 45°C und insbesondere bei 37°C, innerhalb einer vorher festgelegten Zeitdauer, z. B. 2 bis 20 h, insbesondere 4 bis 12 h, besonders 5 bis 8 h.
Es wird bevorzugt, ein Cobalt(II)-Salz, insbesondere CoCl2, hinzuzufügen. Die Konzentration des Cobalt(II)-salzes sollte vorzugsweise 1 bis 30 mM und am bevorzugten 2 bis 10 mM, insbesondere etwa 5 mM sein. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß das Cobalt(II)-Salz zu einer erhöhten Konzentration des gebildeten Intermediats führt. Der Mechanismus ist gegenwärtig unklar. Es kann angenommen werden, daß Cobaltionen als Antreiber für ein Enzym für die Synthese des Intermediats oder als ein Inhibitor für ein anschließendes Enzym fungiert.
Nach Inkubation wird die Mischung zentrifugiert (optional nach dem Aufbrechen der Zellen oder Plastiden) und der wässerige Überstand analysiert. Zu diesem Zweck kann er konzentriert werden z. B. mittels Lyophilisation. Aliquote des Konzentrats können analysiert werden mittels Chromatographie, besonders Hochleistungsflüssigkeits- Chromatographie (HPLC). Es wird bevorzugt, reversed-phase Ionenpaar-HPLC einzusetzen. Es ist möglich, als eine Säule eine Multospher 120 RP18 Säule (5 µm, kristallines Kieselgel, 4,6 × 250 mm, CS-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Deutschland) zu benützen. Zum Aufbauen von Ionenpaarbindungen sollte die Säule mit einer wässerigen Lösung aus Tetraalkylammonium-Salz, vorzugsweise Tetra-n- butylammoniumsalz, wobei ein.gebtäuchliches Anion, z. B. Chlorid oder Hydrogensulfat benützt werden kann. Die Säulenentwicklung kann bewirkt werden mit einer wässerigen Lösung (z. B. 5 bis 20 mM, vorzugsweise 10 mM) aus obigem Tetraalkylammonium-Salz, wobei ein (vorzugsweise linearer) Gradient eines wasserlöslichen Lösungsmittels (z. B. Methanol benützt werden kann, z. B. von 0 bis 42% von Methanol. Der Durchfluß wird überwacht mit einem geeigneten Detektor, besonders einem Radiodetektor im dem Fall von radioaktiv-markiertem Ausgangsmaterial.
Es wurde beobachtet, daß 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat unter obigen Bedingungen in ein neues Intermediat umgewandelt wird, welches verschieden vom Ausgangsmaterial ist und ebenso von IPP und DMAPP. Es besitzt ein Retentionsvolumen zwischen den Retentionsvolumina von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat und IPP. Außerdem, wenn die Reaktion über die Zeit verfolgt wird, ist die Abnahme des Peaks von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat deutlich korreliert mit der Zunahme des Produktpeaks.
Enzyme des Isoprenoidbiosynthesewegs
Wir haben früher gezeigt, daß die E. coli Enzyme YgbP, YchB und YgbB und homologe Enzyme in anderen Organismen verantwortlich sind für die Umwandlung von 2C-Methyl- D-erythritol-4-phosphat in 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat über 4- Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2- phosphat.
Wir haben nun eine bestimmte theoretische Vorgehensweise benützt, um einen Satz von Enzymen zu bestimmen, in welchem mit großer Wahrscheinlichkeit Enzyme, die stromab von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat und stromauf von IPP und/oder DMAPP fungieren, sich befinden. Diese wurde bewerkstelligt mittels Bestimmung der Gene, welche die gleiche taxonomische Verteilung wie ygbP, ychB und ygbB haben. Speziell wird eine erste Untermenge von Genen (Schnittmenge) bestimmt, welche üblich für die sequenzierten Genome von allen "positiven" Organismen sind, die bekanntermaßen mit dem Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg ausgestattet sind. YgbP, ychB und ygbB werden als Vertreter solcher ersten Untermenge gefunden. Als nächstes werden "negative" Organismen wie Saccharomyces cerevisiae ausgewählt, welche bekanntermaßen den Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg nicht besitzen. Danach wird eine zweite Untermenge von Genen bestimmt mittels Subtraktion von der ersten Untermenge solcher Gene, die ein Homolog in den negativen Organismen besitzen. Danach wird eine dritte Untermenge gebildet mittels Subtraktion von der zweiten Untermenge jeder Gene, die für Proteine codieren, die gut fundiert bekannte Funktion haben. Die verbliebene beschränkteste Untermenge besteht aus den E. coli Genen gcpE und IytB wie in dem E. coli Genom benannt. Die taxonomische Verteilung dieser zwei Gene ist in Tabellen 1 und 2 gezeigt.
Ein wenig breiterer Satz von vier Enzymen enthält zusätzlich die E. coli Gene yjeE und ybeB. Die taxonomische Verteilung dieser zwei Gene ist in Tabellen 3 und 4 gezeigt.
Tabelle 1 Vorkommen von orthologen gcpE Sequenzen in verschiedenen Organismen
Organismus
Entsprechend zu gcpEa
Akzessionsnummer, Basenpaare
Aquifex aeolicus VF5 gbb AE000745, 352-1425
Bacillus subtilis 168 embc Z99116, 193139-194272
Chlamydia pneumoniae CWL029 gb AE001621, 8026-9867
Chlamydia trachomatis D/UW-3/CX gb AE001280, 4785-6593
Deinococcus radiodurans gb AE001898, 7744-9033
Escherichia coli K-12 MG1655 gb AE000338, 372-1204
Haemophilus influenzae Rd gb U32712, 1613-2719
Helicobacter pylori strain 26695 gb AE000577, 90-1169
Helicobacter pylori strain J99 gb AE001490, 107-1186
Mycobacterium leprae gb L78824, 16209-17186
Mycobacterium tuberculosis H37Rv emb AL008883, 10845-12008
Streptomyces coelicor A3(2) emb AL049485, 15496-16650
Synechocystis sp. PCC6803 dbjd D90908, 73164-74375
Thermotoga maritima gb AE001754, 6801-8306
Treponema pallidum gb AE001221, 10202-11416
a http:/ / www.ncbi.nlm.nih.gov@ b GenBank Datenbank@ c europäische Datenbank@ d Datenbank von Japan
Tabelle 2 Vorkommen von orthologen gcpE Sequenzen in verschiedenen Organismen
Organismus
Entsprechend zu IytBa
Akzessionsnummer, Basenpaare
Arabidopsis thaliana chromosome II BAC embc AL035521, 66098-68216
Bacillus subtilis 168 dbjd D84432, 122126-123070
Burkholderia pseudomallei gb AF098521, 236-1177
Campylobacter jejuni NCTC 11168 emb X89371, 1655-2488
Chlamydia pneumoniae CWL029 gb AE001682, 5359-6291
Chlamydia trachomatis D/UW-3/CX gb AE001359, 2001-2924
Deinococcus radiodurans gb AE002049, 12853-13860
Escherichia coli K-12 MG1655 gb AE000113, 5618-6565
Haemophilus influenzae Rd gb U32781, 8285-9229
Helicobacter pylori strain J99 gb AE001527, 7015-7839
Helicobacter pylori strain 26695 gb AE000556, 91-915
Listeria monocytogenes gb U17284, 2082<<2555
Mycobacterium leprae emb AL049491, 6002-7009
Mycobacterium tuberculosis H37Rv emb AL021897, 63983-64990
Nicotiana tabacum gb AF159699, 1<<504
Pseudomonas aeruginosa gb L76605, 6331<<6729
Pseudomonas fluorescens gb M35366, 1857<2396
Synechocystis sp. PCC6803 dbj D64000, 46364-47584
Thermotoga maritima gb AE001796, 3613-4440
Treponema pallidum gb AE001230, 1785-2915
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Tabelle 3 Vorkommen von orthologen yjeE Sequenzen in verschiedenen Organismen
Organismus
Entsprechend zu yjeEa
Akzessionsnummer, Basenpaare
Anabaena species PCC7120 gbb AF046871, 990-1478
Aquifex aeolicus VF5 gb AE000710, 2932-3333
Bacillus subtilis 168 dbjd D88802, 27672-28148
Borrelia burgdorferi gb AE001129, 5010-5423
Bradyrhizobium japonicum gb AF042096, 7016-7489
Campylobacter jejuni NCTC 11168 embc AL139076, 361-768
Chlamydia pneumoniae CWL029 gb AE001648, 7612-8037
Chlamydia trachomatis D/UW-3/CX gb AE001324, 7590-8063
Deinococcus radiodurans gb AE002066, 2143-2589
Escherichia coli K-12 MG1655 gb AE000489, 3299-3760
Erysipelothrix rhusiopathiae dbj AB019247, 4372-4692
Haemophilus influenzae Rd gb U32692, 68-544
Helicobacter pylori strain J99 gb AE001497, 9098-9499
Helicobacter pylori strain 26695 gb AE000584, 8919-9320
Lactococcus lactis emb Z70730, 4572-4916
Mycobacterium leprae gb U00020, 6462-6947
Mycobacterium tuberculosis H37Rv emb Z77165, 27337-27843
Neisseria meningitidis strain Z2491 gb AF058689, 10961-11371
Neisseria meningitidis strain Z4400 gb AF194079, 1685-2095
Rickettsia prowazekii emb AJ235270, 11821-12255
Streptomyces coelicor emb AL031317, 21836-22282
Synechocystis sp. PCC6803 dbj D90914, 142000-142473
Thermotoga maritima gb AE001806, 7502-7987
Treponema pallidum gb AE001257, 7721-8128
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Tabelle 4 Vorkommen von orthologen ybeB Sequenzen in verschiedenen Organismen
Organismus
Entsprechend zu ybeBa
Akzessionsnummer, Basenpaare
Aquifex aeolicus VF5 gbb AE000732, 4157-4486
Bacillus subtilis 168 embc Z99117, 42657-43013
Borrelia burgdorferi gb AE001177, 8901-9260
Campylobacter jejuni NCTC 11168 emb AL139078, 116712-117038
Chlamydia muridarum gb AE002282, 5712-6071
Chlamydia pneumoniae CWL029 gb AE001671, 6617-6976
Chlamydia trachomatis D/UW-3/CX gb AE001349, 5715-6074
Deinococcus radiodurans gb AE002087, 4944-5294
Escherichia coli K-12 MG1655 gb AE000168, 6454-6663
Haemophilus influenzae Rd gb U32688, 11870-12178
Helicobacter pylori strain J99 gb AE001554, 2536-2877
Helicobacter pylori strain 26695 gb AE000642, 600-941
Mycobacterium tuberculosis H37Rv emb Z81368, 40124-40504
Neisseria meningitidis strain MC58 gb AE002552, 3227-3613
Neisseria meningitidis strain Z2491 emb AL162753, 46997-47383
Rickettsia prowazekii emb AJ235273, 148106-148432
Streptomyces coelicor emb AL136518, 16927-17373
Synechocystis sp. PCC6803 dbjd D90908, 56510-56974
Thermotoga maritima gb AE001700, 2645-2977
Treponema pallidum gb AE001245, 10516-10851
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Mit diesen funktionellen Zuordnungen von YgbP, YchB und YgbB und mit der Herstellung von Proteinen mit enzymatisch aktiven Faltungsstrukturen haben wir erstmals Wege eröffnet für die Herstellung der Produkte der enzymatischen Reaktion von YgbP, YchB und YgbB, nämlich 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol, 4-Diphosphocytidyl-2C- methyl-D-erythritol-2-phosphat und 2C-Methyl-D-erythritol-cyclopyrophosphat oder deren Salze. Auf der Grundlage dieser Fortschritte haben wir neue Wege eröffnet für die Hemmung des alternativen Terpenoidwegs in Pflanzen ebenso wie in Bakterien und in Protozoen, wie z. B. Plasmodium.
Die Bezeichnungen von YgbP, YgbB und YchB aus dem E. coli Genom werden hier auch für die homologen Protein aus anderen Organismen benützt.
Wir haben festgestellt, dass in Pflanzen, insbesondere Arabidopsis thaliana die zu YgbP, YchB und YgbB homologen Enzyme ein Signalpeptid besitzen, welche in bakteriellen Enzymen nicht vorkommt. Dieses Signalpeptid dient dem Transport des Enzyms in Plastiden. Diese spezifische Signalsequenz kann ersetzt werden dureh irgend eine andere Signalsequenz aus Arabidopsis thaliana oder aus einer anderen Pflanze. Alternativ kann die Signalsequenz eliminiert werden.
Die A. thaliana Sequenz von YgbP wurde durch Genomsequenzierung erhalten. Wir haben das Gen ygbP von A. thaliana sequenziert und das vollständige Gen aus RNA kloniert. Die cDNA-Sequenz des klonierten ygbP Gens von A. thaliana unterschied sich von der in der Datenbank aufgefundenen DNA-Sequenz (gb AC004136) aufgrund der Introns. Die Aminosäuresequenz, die zu dieser cDNA gehört, ist auch verschieden von der Aminosäuresequenz aus der Datenbank (gb AC004136). Dies scheint zurückführbar auf irrtümliches, rechnerisches Intronspleissen aus chromosomaler DNA. Die cDNA Leadersequenz wurde als identisch mit der Datenbankvorhersage gefunden.
Die Gene ygbP, ygbB und ychB von E. coli wurden durch PCR erhalten unter Benutzung von Primern mit spezifischen Restriktionsschnittstellen. In dieser PCR-Reaktion werden zwei Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme eingeführt am 5'-Ende und am 3'-Ende. Die bevorzugte Erkennungsstelle ist NcoI oder EcoRI am 5'-Ende und PstI am 3'-Ende. Das amplifizierte PCR-Fragment und der Expressionsvektor werden mit denselben Restriktionsenzymen verdaut und zusammen ligiert mit T4-Ligase. Dabei wird ein rekombinantes Plasmid erhalten, welches zur autonomen Replikation im Wirtsorganismus befähigt ist. Das rekombinante Plasmid wird benutzt, um den Wirtsorganismus zu transformieren. Der bevorzugte Wirtsorganismus ist E. coli. Die gleiche Methode wurde benutzt für die Gene ygbP, ygbB und ychB von Arapidopsis thaliana und für ychB von Tomate, wobei die Nukleotidsequenz für den Codongebrauch in E. coli für hoch exprimierte Gene angepasst wurde (ohne Leadersequenz).
Nukleinsäuren, Vektoren, Expressionssysteme und Polypeptide
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden zahlreiche Techniken der Mole­ kularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanter DNA und Proteinbiochemie benützt, welche z. B. ausführlich beschrieben sind in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Labora­ tory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M. L. Gait ed.); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); and Protein Purification: Principles and Practice, Se­ cond Edition (Springer-Verlag, NY.).
Die vorliegende Erfindung umfasst Nukleinsäuresequenzen, welche Pflanzenenzyme, daraus abgeleitete enzymatisch aktive Fragmente und verwandte abgeleitete Sequenzen aus anderen Pflanzenarten umfassen. Erfindungsgemäss zieht sich eine Nukleinsäure, welche "abgeleitet ist" aus einer Sequenz, auf eine Nukleinsäuresequenz entsprechend einer Region der Sequenz oder homologen Sequenzen oder komplementär zu Sequenzen oder "Sequenzkonservativen Varianten" und "Funktionskonservativen Varianten". Se­ quenzkonservative Varianten sind die, in denen die Änderung in einem oder mehreren Nukleotiden in einer gegebenen Codonposition keine Änderung in der Aminosäure­ codierung dieser Position bewirkt. Funktionskonservative sind die, in welchen ein gege­ bener Aminosäurerest geändert wurde ohne die Gesamtkonformation und Funktion des Polypeptids zu ändern unter Einschluß aber nicht unter Begrenzung auf den Ersatz von Aminosäuren durch eine solche mit ähnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften (so wie z. B. sauer, hydrophob usw.). Enzymfragmente, welche enzymatische Aktivität behal­ ten können identifiziert werden entsprechend den hier beschriebenen Methoden, z. B. Ex­ pression in E. coli mit anschließender enzymatischer Untersuchung des Zellextrakts.
Sequenzen, die sich von anderen Pflanzen als Arabidopsis thaliana ableiten, können iso­ liert werden durch Routineexperimente unter Benutzung der hier zur Verfügung gestellten Methoden und Zusammensetzungen. Z. B. kann die Identifizierung von Homologen erfol­ gen durch Hybridisierung einer Nukleinsäure, welche die Gesamtheit oder Teile einer Arabidopsis Sequenz enthält unter Bedingungen intermediärer Stringenz (so wie z. B. eine wässerige Lösung von 2X SSC bei 65°C) an cDNA oder genomische DNA, welche von anderen Pflanzenarten abgeleitet wurden. Von verschiedenen Pflanzenarten abgeleitete cDNA-Bibliotheken sind kommerziell erhältlich (Clontech, Palto Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA). Alternativ können PCR-basierte Methoden benutzt werden um verwandte Se­ quenzen zu amplifizieren aus cDNA oder genomischer DNA, welche aus anderen Pflan­ zen abgeleitet wurde. Die Expression der identifizierten Sequenz, beispielsweise in E. coli, unter Benutzung von Methoden, die hier im Detail beschrieben werden wird dann durchgeführt um die enzymatische Aktivität des von der Sequenz codierten Polypeptids zu bestätigen. Dementsprechend fallen Sequenzen, welche von dicotyledonen und monocotyledonen Pflanzen abgeleitet sind in den Bereich der Erfindung.
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfassen Purin- und Pyrimidin-enthaltende Polymere von beliebiger Menge, entweder Polyribonukleotide oder Polydesoxyribonukleo­ tide oder gemischte Polyribo-Polydesoxyribonukleotide. Diese umfassen einzel- und dop­ pelsträngige Moleküle, z. B. DNA-DNA, DNA-RNA und RNA-RNA Hybride ebenso wie Pro­ teinnukleinsäuren (PNA), welche gebildet sind durch Konjugation von Basen an ein Ami­ nosäurerückgrat. Dies schließt auch Nukleinsäuren mit modifizierten Basen ein. Die Nu­ kleinsäuren können direkt aus Zellen isoliert werden. Alternativ kann PCR benützt werden zur Herstellung der Nukleinsäuren der Erfindung unter Benutzung von chemisch synthe­ tisierten Strängen oder genomischem Material als Matrize. Für die PCR benützte Primer können synthetisiert werden unter der Benutzung der hier bereitgestellten Sequenz­ information und können weiterhin so konstruiert werden, dass nach Bedarf neue Restrik­ tionsstellen eingeführt werden um den Einbau in einen gegebenen Vektor für die rekombi­ nante Expression zu erleichtern.
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können flankiert sein durch natürliche Arabidopsis Regulationssequenzen oder können assoziiert sein mit heterologen Sequenzen, einschließlich Promotoren, Enhancern, Responselementen, Signalsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Introns, 5'- und 3'-nichtcodierende Regionen und ähnliches. Die Nukleinsäuren können auch modifiziert sein durch viele Maßnahmen entsprechend dem Stand der Forschung. Nicht-limitierende Beispiele für sol­ che Modifikationen enthalten Methylierung, "Caps", Substitution einer oder mehrerer der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, und Internukleotidmodifikationen, wie z. B. diejenigen mit ungeladenen Verknüpfungen, (z. B. Methylphosphonate, Phospho­ triester, Phosphoramidate, Caramate, etc.) und mit geladenen Verknüpfungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate, etc.). Nukleinsäuren können eine oder mehrere zusätzliche kovalent verknüpfte Einheiten enthalten wie z. B. Proteine (z. B. Nukleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin, etc.), Intercalatoren (z. B., Acridin, Psora­ len, etc.), Chelatoren (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Eisen, oxidative Metalle, etc.) und Alkylatoren. Die Nukleinsäuren können abgeleitet werden durch Bildung einer Methyl- oder Ethylphosphotriesterbindung oder einer Alkylphosphoramidatbindung. Weiterhin können die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung auch modifiziert werden mit einer Markierung, welche ein direkt oder indirekt detektierbares Signal liefert. Exem­ plarische Markierungen schließen Radioisotope, fluoreszierende Moleküle, Biotin und wei­ teres ein.
Die Erfindung stellt auch Nukleinsäurevektoren bereit, welche die offen gelegten Sequenzen oder Derivate oder Fragmente davon umfassen. Eine große Zahl von Vekto­ ren, einschließlich Plasmid und Pilzvektoren sind beschrieben worden für die Replikation und/oder Expression in einer Vielfalt von eukaryotischen und prokaryotischen Wirten. Nicht-limitierende Beispiele umfassen pKK Plasmide (Clontech), pUC Plasmide, pET Plasmide (Novagen, Inc., Madison, WI) oder pRSET oder pREP (Invitrogen, San Diego, CA) und viele geeignete Wirtszellen unter Benutzung von Methoden, die hier offengelegt oder zitiert werden oder die dem Fachmann anderweitig bekannt sind. Rekombinante Klonierungsvektoren umfassen oft ein oder mehrere Replikationssysteme für die Klonie­ rung oder Expression, einen oder mehrere Marker für die Selektion im Wirt, z. B. Anti­ biotikaresistenz und ein oder mehrere Expressionskassetten. Geeignete Wirtszellen kön­ nen transformiert/transfiziert/infiziert werden je nach Bedarf durch eine geeignete Methode unter Einschluß von Elektroporation, CaCl2-vermittelten DNA-Aufnahme, tungae Infektion, Mikroinjektion, Mikroprojektil oder andere etablierte Methoden.
Geeignete Wirte schließen Bakterien, Archaebakterien, Pilze, insbesondere Hefe, Pflan­ zen und tierische Zellen, insbesondere Säugerzellen ein. Von besonderer Bedeutung sind E. coli, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Schizo­ saccharomyces pombe, SF9 Zellen, C129 Zellen, 293 Zellen, Neurospora, und CHO Zel­ len, COS Zellen, HeLa Zellen und immortalisierte myeloide und lymphoide Säugetier­ zellen. Bevorzugte Replikationssysteme schließen M13, ColE1, SV40, Baculovirus, Lambda, Adenovirus und ähnliches ein. Eine große Anzahl von Transkriptions-, Initiations- und Terminationsregulationsregionen sind isoliert worden und ihre Wirksamkeit in der Transkription und Translation heterologer Proteine in den verschiedenen Wirten ist ge­ zeigt worden. Beispiele für diese Regionen, Methoden für die Isolierung, Art der Hand­ habung, etc. sind dem Fachmann bekannt. Unter geeigneten Expressionsbedingungen können Wirtszellen benützt werden als Quelle für rekombinant produzierte Enzymabgelei­ tete Peptide und Polypeptide.
Vorteilhafterweise können Vektoren ein Transkriptionsregulationselement (d. h. einen Promoter) einschließen, der operational verknüpft. ist mit dem Enzymanteil. Der Promoter kann nach Bedarf Operatorportionen und/oder Ribosomenbindungsstellen enthalten. Nicht-limitierende Beispiele für bakterielle Promotoren, welche mit E. coli kompatibel sind schließen ein: trc Promoter, β-Lactamase (Penicillinase)-Promoter, Lactosepromoter, Tryptophan (trp)-Promoter, Arabinose BAD Operon-Promoter, lambda-abgeleiteter P1- Promoter und N Gen Ribosomenbindungsstelle und den Hybriden Tac Promoter, der ab­ geleitet ist aus Sequenzen von trp und lac UV5 Promotoren. Nicht-limitierende Beispiele für Hefepromotoren umfassen 3-Phosphoglyceratkinasepromoter, Glyceraldehyd-3-phos­ phatdehydrogenase (GAPDH) Promoter, Galactokinase (GALI) Promoter, Galacto­ epimerase Promoter und Alkoholdehydrogenase (ADH) Promoter. Geeignete Promotoren für Säugerzellen umfassen ohne Limitierung virale Promotoren wie z. B. solche aus Simian Virus 40 (SV40), Rous sarcoma Virus (RSV), Adenovirus (ADV) und Rinderpapilloma Vi­ rus (BPV). Säugerzellen können auch Terminatorsequenzen und Poly-A Additions­ sequenzen benötigen und Enhancersequenzen, welche die Expression erhöhen können eingeschlossen werden. Sequenzen, welche die Amplifizierung von Genen verursachen können ebenfalls wünschenswert sein. Weiterhin können Sequenzen eingeschlossen werden, welche die Sekretion des rekombinanten Proteins aus der Zelle erleichtern unter Einschluß aber ohne Begrenzung auf Bakterien, Hefen und tierische Zellen, wie z. B. se­ kretorische Signalsequenzen und/oder Prohormon pro Region-Sequenzen.
Nukleinsäuren, welche Wildtyp oder Variantenenzympolypeptide codieren können in Zel­ len auch durch Rekombinationsereignisse eingeführt werden. Z. B. kann eine Sequenz in eine Zelle eingeführt werden und dadurch homologe Rekombination am Ort des endo­ genen Gens oder einer Sequenz mit substantieller Identität mit dem Gen bewirken. An­ dere rekombinationsbasierte Methoden, wie z. B. nicht-homologe Rekombination oder Deletion endogener Gene durch homologe Rekombination kann ebenfalls benützt werden.
Enzym-abgeleitete Polypeptide entsprechend der vorliegenden Erfindung unter Einschluss funktionskonservativer Enzymvarianten können aus Wildtyp oder Mutanten Arabidopsis Zellen oder aus heterologen Organismen oder Zellen (unter Einschluss aber nicht unter Beschränkung auf Bakterien-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen- und Säugetier-Zellen) isoliert werden, in welche eine Enzym-abgeleitete Protein-codierende Sequenz eingeführt und exprimiert worden ist. Weiterhin können die Polypeptide Zellen rekombinanter Fusions­ proteine sein. Alternativ können Polypeptide chemisch synthetisiert werden durch kom­ merziell verfügbare, automatisierte Prozeduren unter Einschluss aber nicht unter Be­ schränkung auf ausschließliche Festphasensynthese, partielle Festphasenmethoden, Fragmentkondensation oder klassische Lösungssynthese.
"Reinigung" eines Enzympolypeptids bezieht sich auf die Isolierung des Enzympolypeptids in einer Form, welche es erlaubt, seine enzymatische Aktivität zu messen ohne Be­ einträchtigung durch andere Komponenten der Zelle, in welcher das Polypeptid exprimiert wird. Methoden zur Polypeptidreinigung unter Einschluss aber nicht unter Beschränkung auf präparative Disc-Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, reversed-phase HPLC, Gelfiltration, Ionenaustausch- und Partitionschromatographie und Gegenstromverteilung sind dem Fachmann wohlbekannt. Für bestimmte Zwecke ist es vorzuziehen, das Polypeptid in einem rekombinanten System zu produzieren, in welchem das Protein einen zusätzlichen Sequenzabschnitt ("sequence taq"), wie z. B. aber nicht ausschließlich eine Polyhistidinsequenz, enthält, welche die Reinigung erleichtert. Das Polypeptid kann dann aus einem Rohlysat der Wirtszelle gereinigt werden durch Chromatographie an einer geeigneten Festphasenmatrix. Alternativ können gegen das Enzym oder gegen davon abgeleitete Peptide produzierte Antikörper als Reinigungsreagenz benützt werden. Andere Reinigungsmethoden sind möglich.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Derivate und Homologe der Enzympolypeptide. Für bestimmte Zwecke können Peptid-codierende Nukleotidsequenzen geändert werden durch Substitution, Addition oder Deletion, welche funktionell äquivalente Moleküle, z. B. funktionskonservative Varianten, liefern. Z. B. kann ein oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz substituiert werden durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften, wie z. B. positiv geladene Aminosäuren (Arginin, Lysin und Histidin); nega­ tiv geladene Aminosäuren (Aspartat und Glutamat); polare, neutrale Aminosäuren; und nicht-polare Aminosäuren.
Die Bezeichnungen YgbB, YgbB und YchB aus dem E. coli Genom werden hier auch für homologe Proteine aus anderen Organismen benützt.
Die isolierten Polypeptide können z. B. modifiziert werden durch Phosphorylierung, Sulfa­ tisierung, Acylierung oder andere Proteinmodifikationen. Sie können auch modifiziert wer­ den mit einer Markierung, welche ein detektierbares Signal liefern kann, und zwar ent­ weder direkt oder indirekt unter Einschluss aber nicht unter Beschränkung auf Radio­ isotope und fluoreszierende Verbindungen.
Gene, welche YgbP (oder YgbB) oder YchB aus irgendeiner Pflanze entsprechen, können isoliert werden durch gut bekannte Techniken, wie z. B. Southern-Hybridisierung oder PCR unter Benutzung entarteter Primer. Insbesondere kann eine cDNA-Bank dieser fraglichen Pflanze gescreent werden unter Benutzung des Nukleinsäure-Direktmarkierungs- und De­ tektionssystemkits, welches geliefert wird von Amersham Pharmacia Biotech (Heidelberg, Deutschland). Hybridisierungsbedingungen sind z. B. 7% Natriumdodecylsulfat (SDS). Positiv hybridisierende Plaques werden detektiert durch Lumineszenzdetektion (oder in anderen Systemen durch Autoradiographie). Nach Reinigung zu einzelnen Plaques wer­ den cDNAs isoliert und ihre Sequenz wird bestimmt durch die Kettenabbruchmethode un­ ter Benützung von Dideoxyterminatoren, welche mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Dieses experimentelle Protokoll kann vom Fachmann benützt werden um Gene mit substantieller Ähnlichkeit zum Arabidopsis Gen aus irgendeiner anderen Pflanze zu erhalten.
Screening-Verfahren zur Identifizierung von Enzyminhibitoren/Herbiziden
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können benützt wer­ den zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Funktion von Enzymen hemmen und dadurch z. B. nützlich sind als Herbizide oder als Leitverbindungen für die Entwicklung von nützlichen Herbiziden. Dies kann erreicht werden durch Bereitstellung einer Zelle, welches das Enzym exprimiert und dadurch Zellkulturen produziert, welche das Enzym exprimieren und Inkubation besagter Zelllinien in Gegenwart von Testverbindungen um Testkulturen zu bilden und in Abwesenheit von Testverbindungen um Kontrollkulturen zu bilden. Man lässt die Inkubation über eine ausreichende Zeit und unter geeigneten Bedin­ gungen erfolgen damit die Einwirkung auf die Enzymfunktion eintreten kann. Zu einer vor­ bestimmten Zeit nach dem Start der Inkubation mit einer Testverbindung wird ein Test ausgeführt um die Enzymaktivität zu bestimmen. In einer Ausführungsform wird die En­ zymaktivität in ganzen Zellen bestimmt. Alternativ kann die Enzymaktivität bestimmt wer­ den in Zellextrakten oder Medien, welche das isolierte Enzym enthalten unter Benutzung von Methoden so wie die unten Beschriebenen. Zusätzliche Kontrollen, sowohl im Hinblick auf Kulturproben und Testproben, werden ebenfalls eingeschlossen, wie z. B. eine Wirts­ zelle, welche das Enzym nicht exprimiert (z. B. Line Wirtszeile, welche transformiert ist mit einem Expressionsplasmid, welche das Enzymgen in reverser Orientierung enthält oder welche kein Insert enthält). Enzymhemmende Verbindungen werden als solche identifi­ ziert, welche die Enzymaktivität in den Testkulturen relativ zu den Kontrollkulturen verrin­ gern.
Wirtszellen, die benützt werden können um die vorliegende Erfindung auszuüben um­ fassen ohne Einschränkung Bakterien-, Pilz-, Insekten-, Säuger- und Pflanzenzellen. Vor­ zugsweise werden bakterielle Zellen benützt. Am meisten bevorzugt werden bakterielle Zellvarianten (wie z. B. die imp Mutante von E. coli), welche erhöhte Membranpermeabilität für Testverbindungen im Vergleich mit der Wildtypwirtszelle zeigen.
Vorzugsweise werden die Methoden der vorliegenden Erfindung angepasst für einen "highthroughput screen", welcher es erlaubt eine Vielfalt von Verbindungen in einem ein­ zigen Test zu prüfen. Solche hemmenden Verbindungen können z. B. gefunden werden in Bibliotheken von Naturprodukten, Fermentationsbibliotheken (welche Pflanzen und Mikro­ organismen umfassen), kombinatorischen Bibliotheken, Verbindungsdatenbanken und synthetischen Verbindungsbibliotheken. Z. B. sind synthetische Verbindungsbibliotheken kommerziell erhältlich von Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH), und Microsource (New Milford, CT). Eine seltene chemische Bibliothek ist verfügbar von Aldrich Chemical Company, Inc. (Milwaukee, Wl). Alternativ sind Bibliotheken von Naturstoffen in Form von Bakterien, Pil­ zen, Pflanzen und Tierextrakten verfügbar, z. B. von Pan Laboratories (Bothelf, WA) oder MycoSearch (NC), oder können leicht hergestellt werden. Außerdem können natürliche und synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen leicht modifiziert werden durch konventionelle chemische, physikalische und biochemische Mittel (Blondell et al., TibTech 14: 60, 1996). Hemmtests entsprechend der vorliegenden Erfindung sind vorteil­ haft insofern, als sie viele unterschiedliche Lösungsmitteltypen zulassen und dadurch die Testung von Verbindungen aus vielen Quellen erlauben.
Nachdem eine Verbindung durch die Methoden der vorliegenden Erfindung als Inhibitor identifiziert wurde, können in vivo und in vitro Tests durchgeführt werden um die Natur und den Mechanismus der Hemmwirkung weiter zu charakterisieren. Der Effekt einer identifizierten Verbindung auf eine in vitro Enzymaktivität eines gereinigten oder partiell gereinigten Enzyms kann bestimmt werden und Enzymkinetikplots können benützt werden um z. B. zwischen kompetitiven und nicht-kompetitiven Inhibitoren zu unterscheiden.
Verbindungen, welche als Inhibitoren identifiziert wurden unter Benutzung der Methoden der vorliegenden Erfindung können modifiziert werden um die Potenz, Wirksamkeit, Auf­ nahme, Stabilität und Brauchbarkeit für die Benutzung in kommerziellen Herbizid­ applikationen etc. modifiziert werden. Diese Modifikationen werden erreicht und getestet unter Benutzung von Methoden, welche dem Fachmann wohlbekannt sind.
Isolierung von Herbizid-resistenten Enzymvarianten
Die vorliegende Erfindung umfasst die Isolierung von Enzymvarianten, welche resistent sind gegen die Wirkung von Enzyminhibitoren/Herbiziden. Die Enzymvarianten können natürlich vorkommen oder können erhalten werden durch zufällige oder ortsgerichtete Mutagenese.
In einer Ausführungsform wird eine Population von Zellen oder Organismen, welche das Enzym exprimieren mutagenisiert unter Benutzung von dem Fachmann wohlbekannten Methoden, wonach die Zellen oder Organismen einem Auswahlverfahren unterworfen werden um diejenigen zu Identifizieren, welche resistent sind gegen die toxischen Effekte von Inhibitoren. Das Variantenenzym wird dann aus den resistenten Zellen oder Organis­ men isoliert, beispielsweise unter Benutzung von PCR-Techniken.
In einer anderen Ausführungsform wird ein isoliertes Enzymgen der stochastischen oder ortsspezifischen Mutagenese in vitro unterworfen, wonach mutagenisierte Versionen des Gens in eine geeignete Zelle, wie z. B. E. coli zurückübertragen wird und die Zellen werden einer Selektions- oder Auswahlprozedur unterworfen, wie oben beschrieben.
Die Variantenenzymgene werden in geeigneten Wirtszellen exprimiert und die enzymatischen Eigenschaften von Variantenenzympolypeptiden werden mit dem Wildtypenzym verglichen. Vorzugsweise führt eine gegebene Mutation zu einem Enzymvariantenpolypeptid, welches in vitro Aktivität behält, während es katalytische Aktivität zeigt, die relativ resistenter ist gegen das (die) ausgewählte(n) Herbizid(e) als das Wildtypenzym. Vorzugsweise hat das Variantenenzym ausreichende katalytische Aktivität um die Lebensfähigkeit der Zelle, in der es exprimiert wird zu unterhalten, wenn es in einer Zelle exprimiert wird, welche Enzymaktivität zur Überlebensfähigkeit benötigt; oder katalytische Aktivität in Kombination mit anderen Herbizid-resistenten Enzymvariantenproteinen, die ebenfalls in der Zelle exprimiert werden, welche die selbe oder verschieden vom ersten Enzymprotein sein können, die ausreichend sind, um die Lebensfähigkeit der Zelle zu erhalten in der es exprimiert wird; und (ii) katalytische Aktivität, die resistenter ist gegen das Herbizid als das Wildtypenzym.
Es ist deshalb nicht unbedingt erforderlich, dass ein bestimmtes Enzymvariantenprotein die gesamte katalytische Aktivität hat, die notwendig ist um die Lebensfähigkeit der Zelle aufrecht zu erhalten, sondern es muss eine gewisse katalytische Aktivität in einem Aus­ maß haben, allein oder in Kombination mit der katalytischen Aktivität zusätzlicher Kopien der gleichen Enzymvariante und/oder der katalytischen Aktivität anderer Enzymvarianten­ proteine, die ausreichend ist um die Lebensfähigkeit der Zelle zu erhalten, die Enzym­ aktivität zum Überleben benötigt. Z. B. kann die katalytische Aktivität erhöht werden bis zu minimal akzeptablen Niveaus durch Einführen multipler Kopien eines Varianten-codieren­ den Gens in die Zelle oder durch Einführen des Gens, welches weiterhin einen relativ starken Promoter einschließt um die Produktion der Variante zu erhöhen.
Resistenter bedeutet, dass die katalytische Aktivität der Variante durch das Herbizid wenn überhaupt, zu einem geringeren Grad als die katalytische Aktivität des Wildtyps durch das Herbizid (die Herbizide) verringert wird. Eine bevorzugte resistentere Enzymvariante hält ausreichend katalytische Aktivität um die Lebensfähigkeit einer Zelle oder einer Pflanze oder eines Organismus, in dem bei der gleichen Konzentration des gleichen Herbizids (der gleichen Herbizide) das Wildtypenzym keine ausreichende katalytische Aktivität be­ halten würde um die Lebensfähigkeit der Zelle der Pflanze oder des Organismus zu erhal­ ten.
Vorzugsweise beträgt die katalytische Aktivität in Abwesenheit des Herbizids mindestens 5% und vorzugsweise mehr als 20% der katalytischen Aktivität des Wildtypenzyms in Abwesenheit des Herbizids (der Herbizide).
Herbizid-resistente Enzymvarianten können als genetische Marker in jeglicher Zelle be­ nützt werden, welche unter normalen Umständen empfindlich bezüglich inhibitorischer Effekte, welche von Herbiziden ausgebildet werden, sind. In dieser Darstellung wird DNA, welche für eine herbizid-resistente Enzymvariante codiert, in ein Plasmid unter der Kon­ trolle eines geeigneten Promoters inkorporiert. Jegliche, benötigte DNA kann dann in ein Plasmid inkorporiert werden, und das letztlich rekombinante Plasmid kann in eine herbi­ zid-empfindliche Zelle eingeführt werden. Zellen, welche mit dem Plasmid transformiert wurden, werden dann selektiert oder gescreent durch Bebrüten in Gegenwart einer aus­ reichenden Konzentration an Herbizid, um das Wachstum und/oder die Pigmentbildung zu inhibieren.
Chemisch-resistente Pflanzen und Pflanzen, die Gene von Enzymvarianten enthalten
Die gegenwärtige Erfindung schließt transgene Zellen, eingeschlossen, aber nicht be­ grenzt auf Samen, Organismen und Pflanzen, in welche Gene, welche für herbizid­ resistente Enzymvarianten codieren, eingeführt wurden, ein. Nicht-limitierende Beispiele für geeignete Empfängerpflanzen sind in Tabelle 5 unten aufgeführt:
TABELLE 5
EMPFÄNGERPFLANZEN
Expression von den Polypeptidvarianten in transgenen Pflanzen überträgt ein hohes Maß von Resistenz gegen Herbizide, was den Gebrauch dieser Herbizide während der Kultivie­ rung der transgenen Pflanzen erlaubt.
Methoden für die Einführung von Fremdgenen in Pflanzen sind allgemein bekannt. Nicht­ limitierende Beispiele dieser Methoden schließen die Agrobakterium-Infektion, Partikel­ bombardierung, Polyethylenglykol-(PEG) Behandlung von Protoplasten, Elektroporation von Protoplasten, Mikroinjektion, Makroinjektion, Ähreninjektion, Pollenschlauch-Bio­ synthese, Trockensameneinsaugung, Laserperforation und Elektrophorese. Diese Metho­ den sind z. B. in B. Jenes et al., und S. W. Ritchie et al. In Transgenic Plants, Vol. 1, En­ gineering and Utilization, Ed. S.-D. Kung, R. WU, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich 1993; und L. Mannonen et al., Critical Reviews in Biotechnology, 14, 287-310, 1994 beschrieben.
In einer bevorzugten Darstellung wird die DNA, die für eine Enzymvariante codiert in einen DNA-Vektor kloniert, welcher ein Antibiotika-Resistenz-Markergen enthält, und das DNA für das rekombinante Enzym enthaltende Plasmid wird in Agrobakterium fumefaciens, welches ein Ti-Plasmid enthält, eingeführt. Dieses "binäre Vektor-System" wird z. B. in U.S. Patent Nr. 4,490,838, und in An et al., Plant Mol. Biol. Manual A3; 1-19 (1988) be­ schrieben. Das transformierte Agrobakterium wird dann ko-kultiviert mit Blattscheiben der Empfängerpflanze, um eine Infektion und Transformation der Pflanzenzellen zu erlauben. Transformierte Pflanzenzellen werden dann in Regenerationsmedium kultiviert, welches die Bildung von Schößlingen fördert, zuerst in Gegenwart eines geeigneten Antibiotikum für das Selektionieren von transformierten Zellen, dann in Gegenwart von Herbiziden. In Pflanzenzellen, welche erfolgreich mit für herbizid-resistenten Enzymen codierender DNA transformiert wurden, findet Schößlingbildung sogar in Gegenwart von Herbizidmengen statt, welche die Schößlingbildung aus nicht transformierten Zellen inhibierten. Nach Be­ stätigung des Vorhandenseins von DNA für die Enzymvariante, unter Benützung, zum Beispiel, der Polymerase-Kettenreaktions-(PCR) Analyse, werden die transformierten Pflanzen auf ihre Fähigkeit, der Herbizidspritzung zu widerstehen, und auf ihr Vermögen zur Samenkeimung und Wurzelbildung und Gedeihen in Gegenwart von Herbiziden ge­ testet.
Die Methoden und Zubereitungen der vorliegenden Erfindung können für die Herstellung von herbizid-resistenten Enzymvarianten benützt werden, welche in Pflanzen eingeführt werden können, um selektive Herbizid-Resistenz auf Pflanzen zu übertragen. Intermediä­ re Enzymvarianten (zum Beispiel Varianten, die nicht ganz optimale spezifische Aktivität, aber hohe Herbizid-Resistenz zeigen, oder das Gegenteil) sind nützlich als Muster für den Entwurf von Enzymvarianten der zweiten Generation, welche adäquate spezifische Aktivi­ tät und hohe Resistenz behalten.
Gene für Herbizid-Resistenz-Enzyme können in einer oder mehreren Kopien in Spezies von Feldfrüchten transformiert werden, um die Herbizid-Resistenz zu übertragen. Die all­ gemeine großtechnische Produktion von Nutzpflanzenspezies mit einer reduzierten Emp­ findlichkeit gegen Herbizide kann:
  • A) Das Spektrum und die Flexibilität der Verabreichung von spezifisch wirksamen und umweltfreundlichen Herbiziden erhöhen;
  • B) Den kommerziellen Wert dieser Herbizide verstärken;
  • C) Den Unkrautanteil in Nutzpflanzenfeldern durch die effektive Nutzung von Herbiziden bei herbizid-resistenten Nutzpflanzenspezies zu reduzieren und den entsprechenden Ernteertrag erhöhen;
  • D) Den Verkauf von Samen für herbizid-resistente Pflanzen erhöhen;
  • E) Die Resistenz gegenüber der Nutzpflanzenvernichtung wegen des Übertrags von Herbiziden, welche in früherer Pflanzung verabreicht wurden, erhöhen;
  • F) Die Anfälligkeit gegenüber Veränderungen der Herbizideigenschaften, resultierend aus ungünstigen klimatischen Bedingungen verringern und
  • G) Die Toleranz gegenüber ungleichmäßig falsch angewendeten Herbiziden erhöhen.
Zum Beispiel können Pflanzen, die transgenes Protein der Enzymvariante enthalten, kultiviert werden. Die Nutzpflanze kann mit für Unkraut wachstumkontrollierend ausreichender Menge an Herbiziden behandelt werden, gegen welches die transgene Pflanze mit der Enzymvariante resistent ist, resultierend in der Wachstumskontrolle für Unkraut im Nutzpflanzenfeld ohne die kultivierte Nutzpflanze dramatisch zu beeinflussen.
Die Verbindungen, welche durch die oben genannten Screeningmethoden als Inhibitoren entdeckt wurden können eingesetzt werden als Reinsubstanzen oder als Mischung ge­ meinsam mit geeigneten Additiven zur Hemmung der Enzyme in Pflanzen, Bakterien oder in Protozoen. Gebräuchliche Additive im Bereich der Herbizide, antibakteriellen Agentien oder Antiprotozoenwirkstoffe können benutzt werden.
Die Erfindung wird nun beschrieben im Hinblick auf spezielle Beispiele.
Referenzbeispiel 1 Konstruktion des Expressionsvektors pNCO113
2,0 µg des Vektors pQE30 (Qiagen. Hilden, Deutschland) wird mit 30 E NcoI (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland (NEB)) in einem Gesamtvolumen von 60 µl, das 6 µl NEB4 Puffer enthält, verdaut. Die Reaktionsmischung wird für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 33 µM jedes dNTP's (NEB) und 5 E Klenow- Fragment der Polymerase I aus E. coli (NEB) wird die Reaktionsmischung für weitere 30 min. bei 25°C inkubiert. Die Vektor DNA wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt. 500 µl des Puffers PB (Qiagen) werden zu 98 µl der PCR- Reaktions-Mischung gegeben und auf eine Qiaquick-Säule aufgetragen und 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen. 0,75 ml des Puffers PE (Qiagen) werden auf die Säule gegeben und wie oben zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen und die Säule wir ein weiteres Mal für 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Die Säule wird in ein sauberes Eppendorf-Gefäß gesteckt. 50 µl H2O (bidestilliert, steril) werden auf die Säule gegeben und sie wird 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf enthielt 1,5 µg gereinigte Vektor DNA.
20 ng Vektor-DNA werden religiert mit 1 E T4-Ligase von Gibco BRL (Eggenstein, Deutschland), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pQE_noNco. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert, mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert (Bullock, W. O., Fernandez, J. M., and Short, J. M. (1987). XL1-Blue: a high efficieny plasmid transforming recA Escherichia coli with β-galactosidase selection. BioTechniques 5, 376-379).
Herstellung elektrokompetenter Zellen: 1 Liter LB-Medium wird im Verhältnis 1 : 100 beimpft mit einer frischen Übernacht-Kultur. Die Zellen werden bei 37°C unter Schütteln bei 220 UpM inkubiert bis eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm erreicht ist. Die Zellen werden 20 min. auf Eis gekühlt und 15 min. bei 4000 UpM und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Pellet wird resuspendiert in 1 l eiskaltem, sterilem 10% (v/v) Glycerol. Die Zellen werden ein weiteres mal wie vorher beschrieben zentrifugiert und in 0,5 l bzw. 20 ml 10% eiskaltem, sterilem Glycerol resuspendiert. Die Zellen werden erneut zentrifugiert und das Pellet wird resuspendiert in 2 ml eiskaltem 10% (v/v) Glycerol. Diese Suspension wird in Aliquots von 80 µl eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert.
Elektrotransformation mit dem Gene Pulser Apparat von BioRad (München, Deutschland): Die elektrokompetenten Zellen werden auf Eis aufgetaut. 40 µl der Zellsuspension werden mit 2 µl der Ligationsmixtur gemischt und in eine vorgekühlte, sterile 0,2 cm Küvette (BioRad) eingefüllt. Die Suspension wird durch Schütteln auf den Küvettenboden gebracht und die Küvette wird in den vorgekühlten Schlitten eingesetzt. Der Schlitten wird in die Kammer geschoben und die Zellen werden bei 2,50 kV, 25 µF und Pulse Controller Stellung 200 Ω gepulst. Die Küvette wird aus dem Schlitten entfernt und die Zellen werden suspendiert in 1 ml SOC-Medium (2% (w/v) Casein Hydrolysat, 0,5% (w/v), Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 und 20 mM Glukose). Die Suspension wird 1 Stunde bei 37°C geschüttelt. 100 µl der Suspension werden auf LB-Platten mit einem Gehalt von 150 mg Ampicillin/Liter plattiert zwecks Erhaltung des Plasmids pQE_noNco. Das Plasmid pQE noNco wird wie vorher beschrieben isoliert. 9 µg Plasmid-DNA werden erhalten.
Escherichia coli XL1-Blue Zellen welche den Expressionsvektor pQE_noNco enthalten, werden über Nacht in Luria Bertani (LB) Medium kultiviert. Das Medium enthält 180 mg/Liter Ampicillin um den Verlust des Plasmids aus den Wirtszellen zu verhindern. 7 ml Kultur werden 20 min. bei 5000 UpM zentrifugiert. Das Zellpellet wird zur Isolierung des Plasmids pQE_noNco mit dem Miniplasmidisolation-Kit von Qiagen (Hilden, Deutschland) benutzt. Das Zellpellet wird resuspendiert in 0,3 ml 10 mM EDTA in 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0. 30 µg RNase A werden zugefügt. 0,3 ml einer 1% SDS-Lösung (w/v) in 200 mM Natriumhydroxid werden zugegeben und die Mischung wird 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert. 0,3 ml einer gekühlten 3,0 M Natriumacetat-Lösung, pH 5,5 werden zugefügt und die Mischung wird 10 min. auf Eis inkubiert. Die Mischung wird 15 min. bei 14000 UpM in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird auf ein Qiagensäulchen gegeben, das vorher äquilibriert wurde mit einer Lösung von 750 mM NaCl, 15% (v/v) Ethanol und 0,15% (v/v) Triton X-100 in 50 mM MOPS, pH 7,0. Das Qiagensäulchen wird vier mal gewaschen mit 1 ml einer Lösung von 1000 mM NaCl und 15% (v/v) Ethanol in 50 mM MOPS, pH 7,0. Die DNA wird mit 0,8 ml einer Lösung von 1250 mM NaCl und 15% (v/v) Ethanol in 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,5 eluiert. Die DNA wird mit 0,56 ml Isopropanol gefällt, 30 min. bei 14000 UpM zentrifugiert und mit 1 ml eiskaltem 70% (v/v) Ethanol gewaschen. Nach 5-minütiger Trocknung in einer Vakuumzentrifuge wird die DNA in 50 µl bidestilliertem Wasser gelöst. Die Lösung enthielt 8,3 µg Vektor-DNA pQE_noNco.
Die DNA-Sequenz des Plasmids pQE_noNco wird nach der automatischen Dideoxynukleotid-Methode (Sanger, F., S. Nicklen, und A. R. Coulson. (1977). DNA sequence analysis with chain terminating inhibitors. Proc. Acad. Natl. Sci. USA 74, 5463-5468) unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Eimer (Norwalk, USA) mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions (Foster City, USA) sequenziert. Die DNA-Sequenz stimmt mit der erwarteten überein.
2,0 µg des Vektors pQE noNco werden mit 30 E EcoRI und 30 E SalI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 60 µl, das 6 µl EcoRI-Puffer enthält, verdaut. Die Reaktionsmischung wird für 3 Std. bei 37°C inkubiert. Die Vektor-DNA wird unter Benützung des PCR-Reinigungskit gereinigt. 25 pMol der Oligonukleotide 5'- CACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATGGGAGGATCCGTCGACCTG CAGCC-3' und 5'- GGCTGCAGGTCGACGGATCCTCCCATGGTTAATTTCTCCTCTTTAATGAATTCT GTGTG-3' werden in 6 µl EcoRl-Puffer (NEB) und 54 µl H2O gelöst. Die Lösung wird 2 min. bei 96°C erhitzt und innerhalb 12 Std. auf 10°C abgekühlt, um den DNA- Linker zu hybridisieren. Die Reaktionsmischung wird mit 30 E EcoRI und 30 E SalI (NEB) versetzt und 3 Std. bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wird 30 min. bei 65°C erhitzt, um die Enzyme zu inaktivieren, und innerhalb 12 Std. auf 10°C zur Hybridisierung abgekühlt. Die Reaktionsmischung enthält ungefähr 730 ng des DNA- Linkers.
20 ng der verdauten pQE noNco Vektor-DNA (siehe oben) und 300 pg des DNA- Linkers werden ligiert mit 1 E T4-Ligase von Gibco BRL (Eggenstein, Deutschland), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pNCO113. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert, mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert.
5 µg DNA des Plasmids pNCO113 werden isoliert und die DNA-Sequenz des Vektors pNCO113 wird sequenziert wir oben beschrieben. Die DNA-Sequenz ist in Anhang F gezeigt. Die Kultur wurde als Patenthinterlegung bei ATCC unter dem Titel "Escherichle ccli strain XL1-Blue harbouring plasmid pNCO113 hinterlegt, zugewiesen PTA-852, Datum der Hinterlegung 14. Oktober 1999.
Referenzbeispiel 2 Herstellung eines Expressionsklons und Konstruktion eines Expressionsvektors für 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase aus Bacillus subtilis
Der Expressionsvektor pNCO113 wird wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben isoliert. Chromosomale DNA aus dem Bacillus subtilis Stamm BR151 (Williams, D. M., Duvall, E. J., und Lovett, P. S. (1981) Cloning restriction fragments that promote expression of a gene in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 146 (3), 1162-1165) wird isoliert entsprechend der in Referenzbeispiel 1 beschriebenen Methode.
Der mutmaßliche ORF yqiE codierend für 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase von Bacillus subtilis (Accession Nr. dbj D84432) wird von bp Position 193991 bis 195892 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler Bacillus subtilis DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers TGATCCGCCATGGATCTTTTATCAATACAGG, 25 pMol des Primers TTGAATAGAGGATCCCCGCC, 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamt­ volumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris- Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 60 sek., bei 94°C, 60 sek. bei 50°C und 120 sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 20 min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt. 500 µl Puffer PB (Qiagen) werden zu 98 µl der PCR-Reaktionsmischung hinzugefügt, auf eine Quiaquick-Säule aufgetragen und 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen. 0,75 ml Puffer PE (Qiagen) wird auf die Säule geladen und wie vorher zentrifugiert.
Der Durchfluss wird verworfen. Die Säule wird erneut 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Die Säule wird anschließend in ein sauberes 1,5 ml Eppendorf- Röhrchen gestellt. 50 µl bidestilliertes, steriles Wasser wird auf die Säule aufge­ tragen, die anschließend 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert wird. Der Durchfluss enthielt 1,8 µg gereinigtes PCR-Produkt.
2,0 µg des Vektors pNCO113 und 1,8 µg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 7 µl NEB4-Puffer von New England Biolabs (NEB), 7 µg BSA (NEB), 40 E NcoI (NEB), 30 E BamHI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70 µl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 34 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4- Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei wird das Plasmid pNCODXSBACSU gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert. Mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert wie unter Referenzbeispiel 1 beschrieben. 6 µg Plasmid-DNA werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pNCODXSBACSU wird sequenziert wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben. Die Sequenz ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. dbj D84432).
Referenzbeispiel 3 Herstellung und Reinigung von rekombinanter für 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat- Synthase aus Bacillus subtilis
Zellen von E. coli Stamm XL1-Blue mit dem Plasmid pNCODXSBACSU werden kultiviert, induziert und geerntet wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben.
2 g Zellen werden in 10 ml 25 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, die 1 mM Dithioerythritol, 10 mM EDTA und 6 mM Phenylmethylsulfonylchlorid enthalten, in Gegenwart von 1 mg Lysozym suspendiert. Die Mischung wird bei 37°C 0.5 Std. inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA) ultraschallbehandelt, Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird zentrifugiert bei 15000 UpM für 30 min. Der Überstand wird auf eine Sepharose QFF Säule (26 cm3, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) aufgebracht, welche zuvor mit 200 ml Tris-HCl, pH 8,0, die 0,5 mM MgCl2 und 0,03% Natriumazid (Puffer A) enthalten, äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 60 ml Puffer A gewaschen, während die Extinktion bei 280 nm detektiert wird. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase wird mit einem Gra­ dienten von 0-1 M Natriumchlorid in 300 ml Puffer A eluiert. Das Enzym wird durch SDS-PAGE, welche eine Bande bei 67 kDa zeigt, identifiziert. Fraktionen, die diese Proteinbande zeigen, werden gesammelt und über Nacht gegen Puffer A dialysiert.
Das Enzym wird weiter auf einer Hydroxylapatitsäule (Macro pep 40 µm, 2,5 × 6 cm, Biorad, München, Deutschland), welche mit Puffer A äquilibiert wurde, gereinigt. Das Enzym wird durch einen Gradienten von 0-1 M Kaliumphosphat, pH 6,5 eluiert. Die Homogenität der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase wird mittels SDS-PAGE überprüft. Eine kräftige Bande bei 67 kDa ist erkennbar, was in Übereinstimmung mit der berechneten Molekularen Masse ist. Die Ausbeute von reiner 1-Deoxy-D- xylulose-5-phosphat-Synthase ist 44 mg.
Referenzbeispiel 4 Bestimmung der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase Aktivität 1. Mittels Kernmagnetischer Resonanz (NMR)
Die Reaktionsmischung enthält 400 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 25 mM [2- 13C]Natriumpyruvat, 50 mM D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat, 10 mM MgCl2, 2 mM Thiaminpyrophosphat, 1 mM Dithiothreitol, 0,5 mM EDTA, 10% D2O und 0,8 mg Enzymprobe in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml. Die Mischung wird 3 Std. bei 37°C inkubiert. Protein wird durch Zugabe von 0,1 ml 50% Trichloressigsäure (TCA) ausgefällt. Nach Zentrifugation wird ein 13C NMR-Spektrum (62,9 MHz, Bruker, Karlsruhe, Deutschland) aufgenommen. Die Umsetzung wird durch Integration der 2C-Signale von Pyruvat und 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat bestimmt. Pyruvat zeigt ein 2C-Signal bei 196,5 ppm und ein Signal bei 92,7 ppm, welches dem korrespondierendem Hydrat zugeordnet wird. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat zeigt ein Signal bei 212,5 ppm.
2. Mittels photometrischer Detektion (Variante A)
Die Reaktionsmischung enthält 200 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 25 mM Natriumpyruvat, 50 mM D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat (zuvor mit NaOH neutralisiert), 10 mM MgCl2, 4 mM Thiaminpyrophosphat, 8 mM Dithiothreitol, und 0,02 mg Enzymprobe in einem Gesamtvolumen von 25 µl. Die Mischung wird 20 min. bei 37°C inkubiert. 25 µl 30% TCA werden hinzugefügt und der Niederschlag abzentrifugiert. Der Überstand wird zu einem Puffer, der 200 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 1 mM MnSO4, 0,5 mM NADPH in einem Gesamtvolumen von 0,95 ml enthielt, hinzugefügt. Die Extinktion bei 340 nm wird gemessen. Ein Lösung (50 µl, 0,1 E) von 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase wird hinzugefügt und die Mischung wird 30 min. bei 37°C inkubiert. Die Extinktion bei 340 nm wird wiederum bestimmt. Die Extinktionsdifferenz ist äquivalent zum verbrauchten NADPH (ε340 = 6300 M-1cm-1), die wiederum äquivalent zur Menge an gebildetem 1- Deoxy-D-xylulose-5-phosphat.
3. Mittels photometrischer Detektion (Variante B)
Die Reaktionsmischung enthält 200 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 5 mM Natriumpyruvat, 10 mM D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat, 1 mM MnSO4, 1 mM Thiaminpyrophosphat, 1 mM Dithiothreitol, 0,05 mM NADPH und 1 E 1-Deoxy-D­ xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase in einem Gesamtvolumen von 1 ml. Die Mischung wird in einer thermostatierbaren Küvette bei 37°C inkubiert und die Extinktion bei 340 nm wird bestimmt. Der Test wird durch Zugabe von 5 µl Enzymprobe gestartet. Die negative Steigung der Extinktion ist äquivalent zur Umsatzrate der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase Reaktion.
Referenzbeispiel 5 Herstellung eines Expressionskfons und Konstruktion eines Expressionsvektors für 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase von E. coli
Der E. coli ORF yaeM (Accessions Nr. gb AE000126) wird von bp Position 9887 bis 11083 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Chromosomale DNA aus dem E. coli Stamm XL1-Blue wird isoliert entsprechend der in Referenzbeispiel 8 beschriebenen Methode.
Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers GGAGGATCCATGAAGCAACTCACC, 25 pMol des Primers GCGCGACTCTCTGCAGCCGG, 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamt­ volumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris- Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 45 sek. bei 94°C, 45 sek. bei 50°C und 75 sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 20 min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben.
2,5 µg des Vektors pQE30 (Qiagen), isoliert wir in Referenzbeispiel 1 beschrieben, und 2,0 µg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 7 µl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 50 E BamHI, 40 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70 µl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR- Reinigungskit von Qiagen wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben.
20 ng Vektor-DNA und 22 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4- Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei wird das Plasmid pQEyaeM gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert. Mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue und M15[pREP4] (Zamenhofet al., 1972) Zellen transformiert wie unter Referenzbeispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden hergestellt wie unter Referenzbeispiel 1 beschrieben. Das Plasmid pQEyaeM wird wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben isoliert. 12 µg Plasmid-DNA pQEyaeM werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pQEyaeM wird sequenziert wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben. Die Sequenz ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. gb AE000126).
Referenzbeispiel 6 Herstellung und Reinigung von rekombinanter für 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat- Reduktoisomerase von E. coli
Rekombinante E. coli M15[pREP4] Zellen, welche überexprimierte 1-Deoxy-D- xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase von E. coli enthalten, werden identisch zur Herstellung in Referenzbeispiel 9 hergestellt. Die Zellen werden aufgetaut in 20 ml 20 mM Imidazol in 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 und 0,5 M Natriumchlorid (Standardpuffer) in Gegenwart von 1 mg/ml Lysozym und 100 µg/ml DNase I. Die Mischung wird bei 37°C 0.5 Std. inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONlC Power Company, Danbury, USA) ultraschallbehandelt, der auf 70% Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird zentrifugiert bei 15000 UpM für 30 min. Der zellfreie Extrakt der rekombinanten 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Redukto­ isomerase von E. coli wird aufgetragen auf eine Säule aus Ni2+-chelatierender Sepharose FF (Säulenvolumen 25 ml, Amersham Pharmacia Biotech), welche zuvor mit 20 mM Imidazol in Standardpuffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 100 ml Standardpuffer gewaschen. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase wird mit einem linearen Gradienten von 20-500 mM Imidazol in Standardpuffer eluiert. 1- Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase enthaltende Fraktionen werden entsprechend SDS-PAGE vereinigt und gegen 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 über Nacht dialysiert. Die dialysierte 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat- Reduktoisomerase wird mittels Ultrafiltration (MWCO 10 kDa, Amicon, USA) konzentriert und auf eine Superdex 75 HR 26/60 Säule (Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen. Die Homogenität der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat- Reduktoisomerase wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft. Eine Bande bei 43 kDa ist sichtbar, was in Ubereinstimmung mit der berechneten Molekularen Masse ist. Die Ausbeute reiner 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat- Reduktoisomerase ist 60 mg.
Referenzbeispiel 7 Bestimmung der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase Aktivität
Die Reaktionsmischung enthält 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 1 mM MnSO4, 0,05 mM NADPH und 5 µg Enzymprobe in einem Gesamtvolumen von 1 ml. Die Mischung wird in einer thermostatierbaren Küvette bei 37°C inkubiert und die Reaktion wird spektrophotometrisch bei 340 nm verfolgt. Der Test wird gestartet durch Zugabe von 10 µl 50 mM 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat. Die negative Steigung der Extinktion ist äquivalent zur Umsatzrate der 1-Deoxy-D-xylulose-5- phosphat-Reduktoisomerase Reaktion.
Referenzbeispiel 8 Herstellung eines Expressionsklons und Konstruktion eines Expressionsvektor für ygbP von E. coli
Escherichia coli XL1-Blue Zellen, welche den Expressionsvektor pNCO113 enthalten, werden über Nacht in Luria Bertani (LB) Medium kultiviert. Das Medium enthält 180 mg/Liter Ampicillin um den Verlust des Plasmids aus den Wirtszellen zu verhindern. 7 ml Kultur werden 20 min. bei 5000 UpM zentrifugiert. Das Zellpellet wird zur Isolierung des Plasmids pNCO113 mit dem Miniplasmidisolation-Kit von Qiagen (Hilden, Deutschland) benutzt. Das Zellpellet wird resuspendiert in 0,3 ml 10 mM EDTA in 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0. 30 µg RNase werden zugefügt. 0,3 ml einer 1% SDS-Lösung (w/v) in 200 mM Natriumhydroxid werden zugegeben und die Mischung wird 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert. 0,3 ml einer gekühlten 3,0 M Natriumacetat-Lösung, pH 5,5 werden zugefügt und die Mischung wird 10 min. auf Eis inkubiert. Die Mischung wird 15 min. bei 14000 UpM in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird auf ein Qiagensäulchen gegeben, das vorher äquilibriert wurde mit 1 ml einer Lösung von 750 mM NaCl, 15% (v/v) Ethanol und 0,15% (v/v) Triton X-100 in 50 mM MOPS, pH 7,0. Das Qiagensäulchen wird vier mal gewaschen mit 1 ml einer Lösung von 1000 mM NaCl und 15% (v/v) Ethanol in 50 mM MOPS, pH 7,0. Die DNA wird mit 0,8 ml einer Lösung von 1250 mM NaCl und 15% (v/v) Ethanol in 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,5 eluiert. Die DNA wird mit 0,56 ml Isopropanol gefällt, 30 min. bei 14000 UpM zentrifugiert und mit 1 ml eiskaltem 70% (v/v) Ethanol gewaschen. Nach 5-minütiger Trocknung in einer Vakuumzentrifuge wird die DNA in 50 µl bidestilliertem Wasser gelöst. Die Lösung enthielt 8,3 µg DNA.
Chromosomale DNA aus Escherichia coli Stamm XL1-Blue wird nach einer von Meade et al., (Meade, H. M., Long, S. R., Ruvkun, C. B., Brown, S. E., und Auswald, F. M. (1982). Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenis. J. Bacteriol. 149, 114-122) beschriebenen Methode isoliert. Der E. coli ORF ygbR (Accession Nr. gb AE000358) von Basenpaar (bp) Position 6754 bis 7464 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers AAATTAACCATGGCAACCACTCATTTGG, 25 pMol des Primers TTGGGCCTGCAGCGCCAAAGG, 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einer Lösung von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 100 µl.
Die Mischung wird 3 min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 25 PCR-Zyklen für jeweils 30 sek. bei 94°C, 30 sek. bei 50°C und 45 sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 7 min. bei 72°C wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt. 500 µl Puffer PB (Qiagen) werden zu 98 µl der PCR-Reaktionsmischung hinzugefügt, auf eine Quiaquick-Säule aufgetragen und 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen. 0,75 ml Puffer PE (Qiagen) wird auf die Säule geladen und wie vorher zentrifugiert. Der Durchfluss wird verworfen. Die Säule wird erneut 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Die Säule wird anschließend in ein sauberes 1,5 ml Eppendorf- Röhrchen gestellt. 50 µl bidestilliertes, steriles Wasser wird auf die Säule aufge­ tragen, die anschließend 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert wird. Der Durchfluss enthielt 1,5 µg gereinigtes PCR-Produkt.
2,0 µg des Vektors pNCO113 und 1,5 µg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Produkte mit überlappenden Enden herzustellen. Jede Restriktionsmixtur enthielt 7 µl NEB3 Puffer (NEB), 7 µg BSA, 40 E NcoI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70 µl. Die Mischung wird 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA und PCR-Produkte werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 16 ng PCR-Produkt werden zusammen ligiert mit 1 E T4- Ligase von Gibco BRL (Eggenstein, Deutschland), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pNCOygbP. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert, mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pNCOygbP wird wie in Referenzbeispiel 1 beschri 53810 00070 552 001000280000000200012000285915369900040 0002010027821 00004 53691eben isoliert.
Das DNA-Insert des Plasmids pNCOygbP wird wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben, sequenziert.
Referenzbeispiel 9 Herstellung und Reinigung von rekombinanter YgbP-Protein aus E. coli
0,5 Liter Luria Bertani (LB) Medium mit einem Gehalt von 90 mg Ampicillin werden beimpft mit 10 ml einer Übernachtkultur von E. coli Stamm XL1-Blue, welcher das Plasmid pNCOygbP enthält. Die Kultur wird in Schüttelkolben bei 37°C bebrütet. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 0,7 wird die Kultur induziert mit 2 mM IPTG. Die Kultur wird für weitere 5 Stunden inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation (20 min., 5000 UpM, 4°C) geerntet. Die Zellen werden mit 50 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,0 gewaschen, zentrifugiert wie oben beschrieben und bei -20°C zur Lagerung eingefroren.
Die Zellen werden aufgetaut in 10 ml 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 mit einem Gehalt von 1 mM Dithioerythritol und 0,02% Natriumazid (Puffer A) in Anwesenheit von 4 mg Lysozym pro ml und 10 µg DNaseI pro ml. Die Mischung wird bei 37°C 1 Stunde inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 sek. ultraschallbehandelt mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA), der auf 70% Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird bei 15000 UpM und 4°C 30 min. zentrifugiert. Der Überstand wird auf eine Säule aus Sepharose QFF (4,6 × 24 cm, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) aufgetragen, die vorher mit 200 ml Puffer A äquilibriert wurde. Die Säule wird gewaschen mit Puffer A. Das Eluat wird bei 280 nm photometriert. 4- Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase wird von der Säule mit einem Gradienten von 0-0,5 M Natriumchlorid in 300 ml Puffer A eluiert. Das Enzym wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese identifiziert als Bande bei 26 kDa. Frak­ tionen mit diese Proteinbande werden gesammelt und gegen Puffer A über Nacht dialysiert. Das Enzym wird weiter gereinigt auf einer Säule aus Red Sepharose CL- 6B (2,6 × 10 cm, Amersham Pharmacia Biotech), die mit Puffer A äquilibriert wurde. Nach Durchgang durch die Säule wird das Enzym auf eine Source 15Q-Säule (Volumen, 20 ml; Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen. Das Enzym wird eluiert mit einem Gradienten aus 0-0,5 M Natriumchlorid in 250 ml Puffer A. Die Homogenität von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft.
Referenzbeispiel 10 Enzymatische Herstellung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol
Eine Lösung mit einem Gehalt von 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 10 mM CTP, 0,12 µCl [2-14C]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, 46 mM 2C-Methyl- D-erythritoi-4-phosphat und 225 µg YgbP Protein aus rekombinanten E. ccli Zellen wird 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Der Reaktionsverlauf wird durch 31P NMR- Messung verfolgt. Das Produkt, welches zwei 31P NMR Dubletts bei -7,2 ppm und -7,8 ppm zeigt wird durch HPLC an einer Anionenaustauschsäule Nukleosil 10SB (4,6 × 250 mm) mit einem Eluenten aus 0,1 m Ammoniumformiat in 40% (v/v) Methanol bei einer Flussrate von 1 ml/min getrennt. Das Eluat wird mit einem UV- Diodenarray Detektor (J & M TIDAS) und einem Radiometer von Berthold analysiert.
4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol wird bei 30 ml eluiert. Die Fraktion, welche 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol enthält wird gesammelt und lyophilisiert. Der Rückstand wird in 0,5 ml deuteriertem Wasser aufgenommen und der NMR- Analyse unterworfen.
Referenzbeispiel 11 Herstellung eines Expressionsklons und Konstruktion eines Expressionsvektors für ychB aus E. coli
Chromosomale DNA aus Escherichia coli Stamm XL1-Blue wird wie beschrieben in Referenzbeispiel 8 isoliert.
Der offene Leserahmen ychB aus E. coli (Accession Nr. gb AE000219) wird von bp Position 5720 bis 6571 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'- GAGGAGAAATTAACCATGCGGACACAGTGGCC-3', 25 pMol des Primers 5'- GTCACCGAACTGCAGCTTGCCCG-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamt­ volumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris- Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 min. bei 95°C denaturiert. Dann werden 25 PCR Zyklen durchgeführt mit 30 sek. bei 94°C, 30 sek. bei 50°C und 45 sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 7 min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt. Es werden 1,5 µg des gereinigten PCR-Produkts erhalten.
Das PCR Amplifikat wird benützt als Matrize für eine zweite PCR-Reaktion. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'- ACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATG-3', 25 pMol des Primers 5'- GTCACCGAACTGCAGCTTGCCCG-3', 2 µl der ersten PCR-Reaktion, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Ge­ samtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischungen werden 3 min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen mit 45 sek. bei 94°C, 45 sek. bei 50°C und 60 sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 20 min. bei 72°C wird die Mixtur auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Die PCR-Amplifikate werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter Referenzbeispiel 1 beschrieben.
2,0 µg des Vektors pNCO113 und 1,5 µg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 6 µl NEB3 Puffer, 6 µg BSA, 30 E EcoRI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 60 µl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 18 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4- Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei wird das Plasmid pNCOychB gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert. Mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert und 100 µi der Zell/DNA-Suspension wird auf LB- Platten, die 150 mg/l Ampicillin zur Erhaltung des Plasmids pNCOychB enthalten, ausplattiert. Das Plasmid pNCOychB wird wie vorher beschrieben isoliert. 9 µg Plasmid-DNA werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pNCOychB wird sequenziert wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben und ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. gb AE000219).
Referenzbeispiel 12 Herstellung und Reinigung von rekombinantem YchB-Protein aus E. coli
0,5 Liter Luria Bertani (LB) Medium mit einem Gehalt von 90 mg Ampicillin werden beimpft mit 10 ml einer Übernachtkultur von E. coli Stamm XL1-Blue, welcher das Plasmid pNCOychB enthält. Die Kultur wird in Schüttelkolben bei 37°C bebrütet. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 0,7 wird die Kultur induziert mit 2 mM IPTG. Die Kultur wird für weitere 5 Stunden inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation (20 min., 5000 UpM, 4°C) geerntet. Die Zellen werden mit 50 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,0 gewaschen, zentrifugiert wie oben beschrieben und bei -20°C zur Lagerung eingefroren.
Die Zellen werden aufgetaut in 10 ml 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 mit einem Gehalt von 1 mM Dithioerythritol und 0,02% Natriumazid (Puffer A) in Anwesenheit von 4 mg Lysozym pro ml und 10 µg DNasel pro ml. Die Mischung wird bei 37°C 1 Stunde inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 sek. ultraschallbehandelt mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA), der auf 70% Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird bei 15000 UpM und 4°C 30 min. zentrifugiert. Der Überstand wird auf eine Säule aus Sepharose QFF (Säulenvolumen 30 ml, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) aufgetragen, die vorher mit 150 ml Puffer A äquilibriert wurde. Die Säule wird gewaschen mit Puffer A. Das Eluat wird bei 280 nm pho­ tometriert. YchB-Protein wird von der Säule mit einem Gradienten von 0-0,5 M Natriumchlorid in 150 ml Puffer A eluiert. Das Enzym wird durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese identifiziert als Bande bei 30 kDa. Fraktionen mit diese Proteinbande werden gesammelt und es wird Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugegeben. Das Enzym wird weiter gereinigt auf einer Säule aus Phenyl-Sepharose 6FF (Säulenvolumen 16 ml, Amersham Pharmacia Biotech), die mit Puffer A, der 0,5 M Ammoniumsulfat enthält, äquilibriert wurde. Dann wird das YchB-Protein mit einem linearen Gradienten von 0-0,5 M Ammoniumsulfat in 100 ml Puffer A eluiert. Fraktionen, die das Protein enthalten werden vereinigt und auf 3 ml aufkonzentriert. Dann wird das Enzym weiter gereinigt auf einer Superdex 75 HR 26/60, die mit Puffer A und 100 mM Natriumchlorid äquilibriert wurde. Das YchB-Protein eluiert bei 165 ml. Die Homogenität von YchB- Protein wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft.
Referenzbeispiel 13 Enzymatische Herstellung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat
Eine Lösung mit einem Gehalt von 5 mM (2-14C)4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D- erythritol, 5 mM ATP, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 100 µg gereinigtes YchB-Protein und 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 in einem Gesamtvolumen von 4 ml wird 2 Stunde bei 37°C inkubiert. Der Reaktionsverlauf wird durch 31P NMR-Messung verfolgt. Dann wird die Probe durch eine Nanosep 10K Membran (PALL Gelmann, Roßdorf, Deutschland) zentrifugiert. Das Produkt zeigt 31P NMR Signale bei 0,49, -7,28 und -8,0 ppm (bezogen auf externe 85% Phosphorsäure) und wird durch HPLC an einer Anionenaustauschsäule Nukleosil 10SB (4,6 × 250 mm, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) äquilibriert mit 0,1 M Ammoniumformiat in 40% (v/v) Methanol bei einer Flussrate von 1 ml/min; gereinigt. Das HPLC-System ist mit einer Wellchrom HPLC Pumpe K1001, einem Wellchrom Spectro-Photometer K-2600 (Knauer, Berlin, Deutschland) und einem Radiomonitor (Berthold, Wildbad, Deutschland) ausgestattet. Nach Injektion der Probe wird die Säule mit 30 ml 0,1 M Ammoniumformiat in 40% Methanol gewaschen. 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D- erythritol-2-phosphat wird durch einen linearen Gradienten von 0,1 M Ammoniumformiat in 40% (v/v) Methanol auf 1 M Ammoniumformiat in 0% (v/v) Methanol eluiert. Fraktionen, welche 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2- phosphat enthalten werden gesammelt und lyophilisiert. Der Rückstand wird in 0,5 ml deuteriertem Wasser aufgenommen und der NMR-Analyse unterworfen. Die Konzentration an 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat ist 21 mM.
Referenzbeispiel 14 Herstellung eines Expressionsklons für ygbB aus E. coli
Der offene Leserahmen ygbB von E. coli (Accession Nr. gb AE000358) wird von bp Position 6231 bis 6754 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Chromosomale DNA aus dem Escherichia coli Stamm XL1- Blue wird isoliert wie beschrieben in Referenzbeispiel 8.
Die Reaktionsmischung enthielt 10 pMol des Primers GAGGAGAAATTAACCATGCGAATTGGACACGGTTTTG, 10 pMol des Primers TATTATCTGCAGCCTTGCGGTTTACCGTGGAGG, 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 5 min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 30 sek. bei 94°C, 45 sek. bei 50°C und 45 sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 7 min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR Amplifikat wird benützt als Matrize für eine zweite PCR-Reaktion. Die Reaktionsmischung enthielt 50 pMol des Primers ACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATG, 50 pMol des Primers TATTATCTGCAGCCTTGCGGTTTACCGTGGAGG, 2,5 µl der ersten PCR-Reaktion, 10 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 100 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 500 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100. Die Mischung wird in 5 PCR-Röhrchen portioniert.
Die Mischungen werden 5 min. bei 94°C denaturiert. Es folgen 25 PCR-Zyklen mit 30 sek. bei 94°C, 45 sek. bei 50°C und 45 sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 7 min. bei 72°C wird die Mixtur auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Die PCR-Amplifikate werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter Referenzbeispiel 1 beschrieben.
4,5 µg des Vektors pNCO113 (isoliert wie unter Referenzbeispiel 1 beschrieben) und 3,4 µg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 20 µl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 100 E EcoRI (NEB), 100 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 200 µl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR- Reinigungskit von Qiagen wie unter Referenzbeispiel 1 beschrieben.
100 ng Vektor-DNA und 35 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei wird das Plasmid pNCOygbB gebildet. Die Ligationsmischung wird 2 Stunden bei 25°C inkubiert. 1 µl der Ligationsmischung wird in elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert wie unter Referenzbeispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden hergestellt wie unter Referenzbeispiel 1 beschrieben.
Referenzbeispiel 15 Herstellung und Reinigung von rekombinantem YgbB-Protein von E. coli
Der zellfreie Extrakt von YgbB Protein aus E. coli wird in der gleichen Weise hergestellt wie unter Referenzbeispiel 9 beschrieben. Der Überstand wird aufgebracht auf eine Säule aus Sepharose Q FF (Säulenvolumen, 30 ml; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland), welche vorher mit 120 ml Puffer A äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 90 ml Puffer A gewaschen. Das YgbB-Protein eluiert mit einem linearen Gradient von 0-0,5 M NaCl in 150 ml Puffer A. Die Homogenität von YgbB-Protein wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft.
Referenzbeispiel 16 Herstellung eines Expressionsklons und Konstruktion eines Expressionsvektors für ein 6xHis-YgbB-Fusionsprotein aus E. coli
Der offene Leserahmen ygbB von E. coli (Accession Nr. gb AE000358) wird von bp Position 6231 bis 6754 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Chromosomale DNA aus dem Escher/chia coll Stamm XL1- Blue wird isoliert entsprechend Referenzbeispiel 8.
Die Reaktionsmischung enthielt 10 pMol des Primers GAGAAGGATCCATGCGAATTGGACACGGTTTTGGACG, 10 pMol des Primers TATTATCTGCAGCCTTGCGGTTTACCGTGGAGG, 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 5 min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 30 sek. bei 94°C, 45 sek. bei 50°C und 45 sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 7 min, wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Das PCR Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wir in Referenzbeispiel 1 beschrieben gereinigt.
1,0 µg des Vektors pQE30, isoliert wie unter Referenzbeispiel 1 beschrieben und 0,5 µg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 10 µl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 100 E BamHI (NEB), 100 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 100 µl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR- Reinigungskit von Qiagen wie unter Referenzbeispiel 1 beschrieben.
5 fMol Vektor-DNA und 14 fMol des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei wird das Plasmid pQEygbB gebildet. Die Ligationsmischung wird 2 Stunden bei 25°C inkubiert. 1 µl der Ligationsmischung wird in elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert wie unter Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden hergestellt wie unter Referenzbeispiel 1 beschrieben. Das Plasmid pQEygbB wird wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben isoliert. 12 µg Plasmid-DNA werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pQEygbB wird sequenziert wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben und ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. gb AE000358). Das 5'-Ende des DNA-Inserts trägt die codierende Region für 6 Histidinreste.
Referenzbeispiel 17 Herstellung und Reinigung von rekombinantem 6xHis-YgbB-Fusionsprotein von E. coli
Rekombinante E. coli XL1-Blue Zellen, die überexprimiertes YgbB von E. coli (N- terminal His-beladen) enthalten, werden hergestellt, wie in Referenzbeispiel 9 beschrieben. Die Zellen werden in 20 ml 20 mM Imidazol in 100 mM Tris- Hydrochlorid, pH 8,0 und 0,5 M Natriumchlorid (Standardpuffer) in Gegenwart von 1 mg/ml Lysozym und 100 µg/ml DNasel aufgetaut. Die Mischung wird 30 min. bei 37°C inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA) ultraschallbehandelt, der auf 70% Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird 30 min. bei 4°C und 15000 UpM zentrifugiert. Der zelifreie Extrakt des rekombinanten YgbB-Proteins von E. coli wird aufgetragen auf eine Säule aus Ni2+- chelatierender Sepharose FF (Säulenvolumen 25 ml, Amersham Pharmacia Biotech), welche zuvor mit 20 mM Imidazol in Standardpuffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 100 ml Standardpuffer gewaschen. YgbB-Protein wird mit einem linearen Gradienten von 20-500 mM Imidazol in Standardpuffer eluiert. YgbB-Protein enthaltende Fraktionen werden entsprechend SDS-PAGE vereinigt und gegen 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 über Nacht dialysiert. Das dialysierte YgbB-Protein wird mittels Ultrafiltration (MWCO 10 kDa, Amicon, USA) konzentriert und auf eine Superdex 75 HR 26/60 Säule (Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen. Die Homogenität des YgbB-Proteins wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft. Eine Bande bei 17 kDa ist sichtbar, was in Übereinstimmung mit der berechneten Molekularen Masse ist. 27 mg reines Enzym werden erhalten.
Referenzbeispiel 18 Enzymatische Herstellung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat
Eine Lösung mit einem Gehalt von 5 mM [2-14C]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D- erythritol (0,02 µCi/mMol), 5 mM ATP, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 100 µg gereinigtes YchB Protein, 200 µg gereinigtes YgbB Protein und 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 in einem Gesamtvolumen von 4 ml wird 2 Stunde bei 37°C inkubiert. Der Reaktionsverlauf wird durch 13C- und 31P-NMR-Messung verfolgt. Dann wird die Probe durch eine Nanosep 10K Membran (PALL Gelmann, Roßdorf, Deutschland) zentrifugiert. Das Produkt zeigt zwei 31P NMR Signale bei -7,65 und -11,66 ppm (Dubletts, 31P-31P-kopplungskonstante 23,6 Hz) und zwei intensive 13C-NMR-Signale bei 83,87 ppm und wird durch HPLC an einer Anionenaustauschsäule Nukleosil 10SB (4,6 × 250 mm, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) mit 0,1 M Ammoniumformiat in 40% (v/v) Methanol als Eluent bei einer Flussrate von 1 ml/min. gereinigt. 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat eluiert bei 34 ml. Fraktionen, welche 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat enthalten werden gesammelt und lyophilisiert. Der Rückstand wird in 0,5 ml deuteriertem Wasser aufgenommen und der NMR-Analyse unterworfen. Die Konzentration 2C-Methyl-D- erythritol-2,4-cyclopyrophosphat ist 18 mM.
Referenzbeispiel 19 Identifizierung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat
Die Strukturaufklärung wurde mit [2,2-Me-13C2]2C-Methyl-D-erythritol-2,4- cyclopyrophosphat (Tabelle 6) durchgeführt.
1H NMR- und 1H entkoppelte 13C NMR-Spektren werden mit einem ADVANCE DRX 500 Spektrometer von Bruker, Karlsruhe, Deutschland aufgenommen. Die Transmitterfrequenzen sind 500,1 MHz für 1H und entsprechend 125,6 MHz für 13C. Die chemischen Verschiebungen werden referenziert auf externes Trimethylsilylpropansulfonat. 31P NMR-Spektren werden aufgenommen mit einem AC 250 Spektrometer von Bruker bei einer Transmitterfrequenz von 101,3 MHz. Die chemischen Verschiebungen werden referenziert auf externe 85% H3PO4.
Die Struktur des Produkts wird ausgewertet durch multinukleare, multidimensionale NMR-Spektroskopie (Tabelle 6). Im Einzelnen wird die Verbindung charakterisiert durch ein zwei 1H-entkoppelte 31P-NMR-Signale bei -7,65 ppm (Dublett mit 31p-31P- Kopplungskonstante von 23,6 Hz) und -11,66 ppm (Doppel-Dublett mit 31P-31P- Kopplungskonstante von 23,6 Hz und 31P-13C-Kopplungskonstante von 8,5 Hz). Das 31P-NMR-Signal bei -7,65 ppm ist ohne 1H-Entkopplung verbreitert. Der ermittelte 31P NMR chemische Verschiebungsbereich und die 31P 31P-Kopplung implizieren, dass die unbekannte Verbindung ein Pyrophosphat ist. Zusätzlich zeigt die gemessene 31P-13C-Kopplung des Signals bei -11,66 ppm in Verbindung mit der fehlenden 31P- 1H-Kopplung an, dass ein Phosphatrest mit C-2 des 2C-Methyl-D-erythritols verknüpft ist. In Übereinstimmung mit diesem Schluß werden 13C-31P-Kopplungen für die 13C-Signale von C-2 und C-2-Methyl beobachtet.
In Verbindung mit den beobachteten 13C-13C-Kopplungen (Tabelle 6), sind diese Daten die Basis für die 1H und 13C-NMR-Signal-Zuordnung. Das 13C-Signal bei 65,72 ppm (entspricht C-4) zeigte 13C 31P-Kopplung, was darauf hinwies, daß das Pyrophosphat auch mit C-4 verbunden ist. Die 13C-NMR-Zuordnung wird weiter durch zweidimensionale INADEQUATE Experimente überprüft, die dle 13C-13C- Verknüpfungen zeigen.
Zusammenfassend zeigten die 1H-, 13C- und 31P-NMR-Daten klar, daß es sich bei dem Produkt um 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat handelt. Die NMR- Daten stimmten gut mit den beschriebenen Daten dieser Verbindung überein (Ostrovsky, D., Kharatian, E., Dubrovsky, T., Ogrel, O., Shipanova, I. und Sibeldina, L. (1992). The abüity of bacteria to synthesize a new cyclopyrophosphate correlates with their tolerance to redox-cycling drugs: on a crossroad of chemotherapy, enviromental toxicology and immunobiochemical problems. Biofactors 4 (1), 63-68; 1992; Turner, D. L., Santos, H., Fareleira, P., Pacheco, I., LeGall, J., und Xavier, A. V. (1992). Structure determination of a novel cyclic phosphocompound isolated from Desu/fovibrio desulfuricans. Biochem. J. 285, 381-390.)
Referenzbeispiel 20 Umfassende Enzymatische Synthese von [2,2'-13C2]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl- D-erythritol Stufe a) Enzymatische Synthese von [1,2 13C2]1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat
Rohes Dihydroxyacetonphosphat wird hergestellt wie von Effenberger, F., und Straub, A. (1987) A novel convinient preparation of dihydroxyaceton phosphate and its use in enzymatic aldol reactions, Tetrahedron Lett. 28, 1641-1644 beschrieben. 1 g von Dihydroxyacetonphosphat wird in 70 ml einer Lösung von 57 mM [2,3- 13C2]Natriumpyruvat, 10 mM MgSO4 und 2,5 mM Thiaminpyrophosphat in 150 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 gelöst. 17000 E von Triosephosphatisomerase (Kaninchenmuskel) werden hinzugefügt und die Lösung wird 105 min. bei 37°C inkubiert. 0,774 ml (7,4 E) rekombinanter 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase aus B. subtilis werden hinzugefügt. Die Reaktion wird wie in Beispiel 17 beschrieben verfolgt. Nach 8 Std. wird die Reaktion durch Einstellen des pH auf einen Wert von 3 durch die Zugabe von 1 M HCl (11,2 ml) gestoppt. Die Reaktionsmischung wird bei -20°C gelagert.
Stufe b) Enzymatische Synthese von [2,2'-13C2]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat
Zur in Stufe a erhaltenen Reaktionsmischung, die [1,2 13C2]1-Deoxy-D-xylulose-5- phosphat enthält, werden 19 ml 1 M Tris-Puffer, pH 8,0, 1,1 ml 1 M MgCl2, 3 g Glukose (72 mMol) und 6 ml einer Lösung von 0,1 M MnCl2 hinzugefügt und der pH mit 7 ml 1 M NaOH auf 8,0 eingestellt. Präzipat wird durch Zentrifugation entfernt. Zu einem Endvolumen von 200 ml werden Wasser, 250 E Glukosedehydrogenase aus B. megaterium und 56,6 mg NADP+ (80 µMol) hinzugefügt. Nach 5 min. Präinkubation bei 37°C werden 2 ml (11,2 E) rekombinanter 1-Deoxy-D-xylulose-5- phosphat-Reduktoisomerase aus E. coli hinzugefügt. Nach ca. 30 Std. wird die Reaktion durch Zugabe von 8 ml 2 N HCl gestoppt. Die Reaktionsmischung wird bei -20°C gelagert.
Stufe c) Enzymatische Synthese von [2,2'-13C2]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D- erythritol
Der pH der [2,2'-13C2]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat enthaltenden Reaktionsmischung, die in Stufe b erhalten wurde, wird durch Zugabe von 4 ml 2 M NaOH auf 7,0 eingestellt. 1,4 g CTP (2,5 mMol) werden hinzugefügt und der pH wird mit 6 ml 2 N NaOH auf 8,0 eingestellt. Nach 5 min. Präinkubation bei 37°C, werden 1,5 ml (51,8 E) YgbP-Protein aus E. coli hinzugefügt. Die Reaktion wird wie in Beispiel 7 beschrieben verfolgt. Nach ca. 5 Std. wird die Reaktionsmischung wie in Beispiel 8 beschrieben gereinigt und lyophilisiert. 550 mg reines 4-Diphosphocytidyl- [2,2'-13C2]2C-methyl-D-erythritol werden erhalten.
Referenzbeispiel 21 Enzymatische Synthese von [2,2'-13C2]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol in einer Eintopfreaktion
Eine Reaktionsmischung, die 3 g Glukose, 1 g Dihydroxyacetonphosphat (5,7 mMol), 1,4 g CTP (2,5 mMol), 0,45 g 2,3-13C2-Natriumpyruvat (4 mMol), 56,6 mg NADP+ (80 µMol), in 150 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 enthalten, wird hergestellt. 17000 E Triosephosphatisomerase, 250 E Glukosedehydrogenase, 7 E 1-Deoxy-D-xylulose- 5-phosphat-Synthase, 13 E 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase und 55 E YgbP-Protein werden hinzugefügt. Zu einem Endvolumen von 200 ml werden 10 mm MgCl2, 10 mM MnSO4, 2,5 mM Thiaminpyrophosphat in 150 mM Tris- Hydrochlorid, pH 8,0 hinzugefügt. Der pH wird mit 5 ml NaOH auf 8,0 eingestellt. Die Reaktionsmischung wird bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird wie in Beispiel 7 beschrieben verfolgt. Nach 30 Std. wird die Reaktionsmischung wie in Beispiel 8 beschrieben gereinigt und lyophilisiert. 490 mg [2,2'-13C2]4-Diphosphocytidyl-2C- methyl-D-erythritol werden erhalten.
Referenzbeispiel 22 Präparative Herstellung von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat (Großmasstab)
Diese Herstellung kann mit jeder 13C-markierten Probe von Glukose oder Pyruvat als Startmaterial durchgeführt werden. In diesem Beispiel ist sie für [U-13C6]Glukose und [2,3-13C2]Pyruvat.
Schritt A) Präparative Herstellung von [U-13C5]1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat
Eine Reaktionsmischung mit 166 mg [U-13C6]Glukose (0,89 mMol), 44 mg Thiaminpyrophosphat, 1,02 g ATP (1,79 mMol), 200 mg [2,3-13C2]Pyruvat (1,79 mMol), 6 mM MgCl2 in 150 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,0 wird hergestellt. 410 E Triosephosphatisomerase (aus Kaninchenmuskel, Typ III-S, E.C. 5.3.1.1., Sigma), 360 E Hexokinase (aus Bäckerhefe, Typ VI, E.C. 2.7.1.1., Sigma), 50 E Phosphoglukoseisomerase (aus Bäckerhefe, Typ III, E.C. 5.3.1.9., Sigma), 20 E Phosphofruktokinase (aus Bach/us stearothermophilus, Typ VII, E.C. 2.7.1.11, Sigma), 35 E Aldolase (aus Kaninchenmuskel, E.C. 4.1.2.13, Sigma) und 2 E rekombinante DXP-Synthase aus B. subtilis werden auf ein Endvolumen von 58 ml aufgefüllt. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei 37°C inkubiert. Während der Reaktion wird der pH durch Zugabe von 1 M NaOH (2 ml) konstant bei 8,0 gehalten. Die Reaktion wird durch Zugabe von 3 ml 2 N Salzsäure gestoppt. 13C-NMR- Spektren werden aufgenommen um die Umsetzung zu verfolgen. (Tabelle 7).
Tabelle 7
NMR-Daten von [U-13C5]1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat
Schritt B) Präparative Herstellung von [U-13C5]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat
Zu der Lösung aus Schritt A wird 10 E DXP-Reduktoisomerase, 120 E Glukosedehydrogenase (aus Bacillus megaterlum, E.C. 1.1.1.47, Sigma), 0,97 g Glukose, 200 mM MgCl2 und 0,3 mM NADP+ gegeben. Der pH wird mit 1,5 ml 4 N Natronlauge auf 8,0 eingestellt. Nach Zentrifugation beträgt das Volumen 72 ml. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Umsetzung wird durch 13C-NMR-Spektroskopie des ansammelnden Produkts überwacht. (Tabelle 8). Das Reaktionsprodukt wird durch HPLC auf einer Anionenaustauschersäule Nukleosil 10SB (16 × 250 cm) mit 0,5 M Ameisensäure als Eluenten und einer Flußrate von 13 ml/min gereinigt. Der Eluent wird mit einem Refraktometer (GAT-LCD210 von Gamma Analyse Technik, Bremerhafen, Deutschland) überwacht. Das Produkt wird bei 14,5 ml eluiert. Die Fraktionen, die [U-13C5]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat enthalten, werden gesammelt und lyophilisiert. Die Menge beträgt 86 mg.
Tabelle 8
NMR-Daten von [U-13C5]2C-Methyl-D-erythritol
Referenzbeispiel 23 Enzymatische Herstellung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat
Diese Herstellung kann mit jeder 13C-markierten Probe von 2C-Methyl-D-erythritol-4- phosphat als Startmaterial durchgeführt werden. In diesem Beispiel wird es für [1,3,4-13C]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat beschrieben.
Zu einer Reaktionsmischung, enthaltend 15 mg gereinigtes [1,3,4-13C]2C-Methyl-D- erythritol-4-phosphat (69 µMol), 34 mg CTP (69 µMol), 16 mg Natriumphosphoenolpyruvat (69 µMol), 1,9 mg ATP (3,5 µMol), 10 mg MgCl2, 5 mM DTT, 10 mM KCl und 150 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,0, 60 µl YgbP-Protein (2,1 mg/ml), 200 µl YchB Protein (0,3 mg/ml) und 100 E Pyruvatkinase (aus Kaninchen Muskel, Typ VII, E.C. 2.7.1.40, Sigma) werden zugegeben. Das Endvolumen beträgt 5 ml. Die Reaktionsmischung wird für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird wie in Referenzbeispiel 13 beschrieben verfolgt.
4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat wird durch HPLC auf einer Anionenaustauschersäule Nukleosil 5 SB (7,5 × 150 mm) mit einem Gradient an 1 M Ammoniumformiat (B) und 100 mM Ammoniumformiat als Eluent bei einer Flußrate von 3,1 ml/min gereinigt.
Der Eluent wird mittels eines UV-Detektor (Knauer) bei 275 nm überwacht. 4- Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat eluiert bei 26 bis 27 min.
Beispiel 1 Konstruktion eines Expressionsvektors und Herstellung eines Expressionsklons für das gcpE Gen aus Escherichia coli
Escherichia coli XL1-Blue Zellen (Bullock et al., BioTechniques 5, 376-379 (1987)); kommerzielle Quelle: Stratagene, LaJolla, CA, USA) welche den Expressionsvektor pNCO113 (deutsche Patentabwendung 1 99 48 887.8) enthalten, werden über Nacht in Luria Bertani (LB) Medium kultiviert. Das Medium enthält 180 mg/Liter Ampicillin um den Verlust des Plasmids aus den Wirtszellen zu verhindern. 7 ml Kultur werden 20 min. bei 5000 UpM zentrifugiert. Das Zellpellet wird zur Isolierung des Plasmids pNCO113 mit dem Miniplasmidisolation-Kit von Qiagen (Hilden, Deutschland) benutzt. Das Zellpellet wird resuspendiert in 0,3 ml 10 mM EDTA in 50 mM Tris- Hydrochlorid, pH 8,0. 30 µg RNase A werden zugefügt. 0,3 ml einer 1% SDS- Lösung (w/v) in 200 mM Natriumhydroxid werden zugegeben und die Mischung wird 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert. 0,3 ml einer gekühlten 3,0 M Natriumacetat- Lösung, pH 5,5 werden zugefügt und die Mischung wird 10 min. auf Eis inkubiert. Die Mischung wird 15 min. bei 14000 UpM in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird auf ein Qiagensäulchen gegeben, das vorher äquilibriert wurde mit einer Lösung von 750 mM NaCl, 15% (v/v) Ethanol und 0,15% (v/v) Triton X-100 in 50 mM MOPS, pH 7,0. Das Qiagensäulchen wird vier mal gewaschen mit 1 ml einer Lösung von 1000 mM NaCl und 15% (v/v) Ethanol in 50 mM MOPS, pH 7,0. Die DNA wird mit 0,8 ml einer Lösung von 1.250 mM NaCl und 15% (v/v) Ethanol in 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,5 eluiert. Die DNA wird mit 0,56 ml Isopropanol gefällt, 30 min. bei 14000 UpM zentrifugiert und mit 1 ml eiskaltem 70% (v/v) Ethanol gewaschen. Nach 5-minütiger Trocknung in einer Vakuumzentrifuge wird die DNA in 50 µl bidestilliertem Wasser gelöst. Die Lösung enthielt 7 µg Vektor-DNA pNCO113.
Der offene Leserahmen gcpE aus E. coli (Accession Nr. gb AE000338) wird von bp Position 372 bis 1204 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'- GAGGAGAAATTAACCATGCATAACCAGGCTCC-3', 25 pMol des Primers 5'- CGAGGCGGATCCCATCACG-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamt­ volumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris- Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 min. bei 95°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 45 sek. bei 94°C, 45 sek. bei 50°C und 60 sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 7 min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Das PCR-Amplifikat wird dem PCR-Reinigungskit von Qiagen (Hilden, Deutschland) gereinigt. Zu 100 µl der PCR-Reaktionsmischung werden zu 300 µl QX1-Puffer zugegeben und die Mischung auf eine Qiaquick-Säule aufgetragen und 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen. 0,75 ml des Puffers PE (Qiagen) werden auf die Säule gegeben und wie oben zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen und die Säule wir ein weiteres Mal für 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Die Säule wird in ein sauberes Eppendorf-Gefäß gesteckt. 50 µl H2O (bidestilliert, steril) werden auf die Säule gegeben und sie wird 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Der Durchfluß enthält 1,2 µg des gereinigten PCR-Produkts. Das PCR Amplifikat wird benützt als Matrize für eine zweite PCR-Reaktion. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'- ACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATG-3', 25 pMol des Primers 5'- CGAGGCGGATCCCATCACG-3', 2 µl der ersten PCR-Reaktion, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Ge­ samtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 30 PCR-Zyklen mit 45 sek. bei 94°C, 45 sek. bei 50°C und 60 sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 7 min. bei 72°C wird die Mixtur auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Das PCR-Amplifikat wird gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie oben beschrieben. 1,1 µg des gereinigten PCR-Produktes werden erhalten. 2,0 µg des Vektors pNCO113 und 1,1 µg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 5 µl NEB3 Puffer, 20 E EcoRI (NEB), 20 E BamHI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 50 µl. Die Mischung wird 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR- Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 8 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4- Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei wird das Plasmid pNCOgcpE gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert.
Mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert.
Elektrotransformation wird wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Mit dem Plasmid pNCOgcpE werden elektrokompetente E. coli M15(pREP4) Zellen (Zamenhofet al., J. Bacteriol. 110, 171-178 (1972)) wie oben beschrieben transformiert. Dabei wird der rekombinante Stamm M15-pNCOgcpE erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pNCOgcpE wird sequenziert wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben und ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. gb AE000338).
Beispiel 2 Konstruktion eines Expressionsvektors und Herstellung eines Expressionsklons für das lytB Gen aus Escherichia coli
Der Expressionsvektor pQE30 (Qiagen) wird wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben isoliert. Der offene Leserahmen IytB aus E. coli (Accession Nr. gb AE000113) wird von bp Position 5618 bis 6565 durch PCR ampüfiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-TGGAGGGGATCCATGCAGATCCTGTTGGCC-3', 25 pMol des Primers 5'-GCATTTCTGCAGAACTTAGGC-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamt­ volumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris- Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 min. bei 95°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 60 sek. bei 94°C, 60 sek. bei 50°C und 60 sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 7 min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Referenzbeispiel 2 beschrieben gereinigt. 1,9 µg des gereinigten PCR-Produktes werden erhalten.
2,0 µg des Vektors pQE30 und 1,5 µg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 5 µl NEB3 Puffer, 20 E BamHI (NEB), 20 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 50 µl. Die Mischung wird 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR- Reinigungskit von Qiagen.
18 ng Vektor-DNA und 10 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4- Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei wird das Plasmid pQElytB gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert. Mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1- Blue Zellen transformiert wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben hergestellt.
Transformation von M15(pREP4) Zellen mit dem Plasmid pQElytB führt zur Bildung des rekombinanten Stammes M15-pQElytB.
Das DNA-Insert des Plasmides pQElytB wird sequenziert wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben und ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. gb AE000113).
Beispiel 3 Herstellung und Reinigung von rekombinantem 6xHis-LytB-Fusionsprotein aus E. coli
0,5 Liter von Luria-Bertani (LB)-Medium mit 90 mg Ampicillin und 25 mg Kanamycin werden angeimpft mit 10 ml einer Übernachtkultur vom E. coli Stamm M15(pREP4), welcher das Plasmid pQElytB enthält. Die Kultur wächst in einer Schüttelkultur bei 37°C. Bei einer optischen Dicht (600 nm) von 0,7 wird die Kultur mit 2 mM IPTG induziert. Die Kultur wächst für weitere 5 h. Die Zellen werden mittels Zentrifugation bei 5000 UpM und 4°C für 20 min. geerntet. Die Zellen werden gewaschen mit 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, zentrifugiert wie oben und zur Lagerung bei -20°C eingefroren.
Die Zellen werden in 20 ml 20 mM Imidazol in 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 und 0,5 M Natriumchlorid (Standardpuffer) in Gegenwart von 1 mg/ml Lysozym und 100 µg/ml DNasel aufgetaut. Die Mischung wird 30 min. bei 37°C inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA) ultraschallbehandelt, der auf 70% Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird 30 min. bei 4°C und 15000 UpM zentrifugiert. Der zelifreie Extrakt des rekombinanten LytB-Proteins wird aufgetragen auf eine Säule aus Ni2+-chelatierender Sepharose FF (Säulenvolumen 2,6 × 6 cm, Amersham Pharmacia Biotech), welche zuvor mit 20 mM Imidazol in Standardpuffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 100 ml Standardpuffer gewaschen. LytB-Protein wird mit einem linearen Gradienten von 20-500 mM Imidazol in Standardpuffer eluiert. LytB-Protein enthaltende Fraktionen werden entsprechend SDS-PAGE vereinigt und gegen 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 über Nacht dialysiert. Die Homogenität des LytB-Proteins wird durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft. Eine Bande bei 34 kDa ist sichtbar, was in Übereinstimmung mit der berechneten Molekularen Masse ist. 3 mg reines Enzym werden erhalten.
Beispiel 4 Konstruktion eines Expressionsvektors und Herstellung eines Expressionsklons für das yjeE Gen aus Escherichia coli
Der Expressionsvektor pNCO113 wir wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben isoliert.
Der offene Leserahmen yjeE aus E. ccli (Accession Nr. gb AE000489) wird von bp Position 3299 bis 3760 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. ccli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'- GAGGAGAAATTAACCATGATGAATCGAGTAATTCC-3', 25 pMol des Primers 5'- GCGATACTGCAGCCCGCC-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamt­ volumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris- Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 min. bei 95°C denaturiert. Dann werden 30 PCR-Zyklen durchgeführt mit 30 sek. bei 94°C, 30 sek. bei 50°C und 45 sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 7 min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Das PCR-Amplifikat wird dem PCR-Reinigungskit von Qiagen (Hilden, Deutschland) gereinigt wie in Referenzbeispiel 2 beschrieben. Der Durchfluß enthält 1,1 µg des gereinigten PCR-Produkts.
Das PCR Amplifikat wird benützt als Matrize für eine zweite PCR-Reaktion. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'- ACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATG-3', 25 pMol des Primers 5'- GCGATACTGCAGCCCGCC-3', 2 µl der ersten PCR-Reaktion, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Ge­ samtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 30 PCR-Zyklen mit 30 sek. bei 94°C, 30 sek. bei 50°C und 45 sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 7 min. bei 72°C wird die Mixtur auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Das PCR-Amplifikat wird gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie oben beschrieben. 1,1 µg des gereinigten PCR-Produktes werden erhalten. 2,0 µg des Vektors pNCO113 und 1,1 µg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 5 µl NEB3 Puffer, 20 E EcoRI (NEB), 20 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 50 µl. Die Mischung wird 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR- Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 8 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4- Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei wird das Plasmid pNCOyjeE gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert.
Mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coIi XL1-Blue Zellen transformiert. Wie beschrieben in Referenzbeispiel 1. Dabei entsteht der rekombinante Stamm XL1-pNCOyjeE.
Das DNA-Insert des Plasmides pNCOyjeE wird sequenziert wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben und ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. gb AE000489).
Beispiel 5 Konstruktion eines Expressionsvektors und Herstellung eines Expressionsklons für das ybeB Gen aus Escherichia coli
Der Expressionsvektor pQE30 (Qiagen) wird wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben isoliert.
Der offene Leserahmen ybeB aus E. coli (Accession Nr. gb AE000168) wird von bp Position 6454 bis 6663 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'- CCAGGGGGGATCCATGCAGGGTAAAGC-3', 25 pMol des Primers 5'- GTTGCAGCTGCAGGCATTAACTCC-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamt­ volumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris- Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 min. bei 95°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 30 sek. bei 94°C, 30 sek. bei 50°C und 45 sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 7 min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Das PCR-Amplifikat wird dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Referenzbeispiel 2 beschrieben gereinigt. 1,5 µg des gereinigten PCR-Produktes werden erhalten. 2,0 µg des Vektors pQE30 und 1,0 µg des gereinigten PCR- Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 5 µl NEB3 Puffer, 20 E BamHI (NEB) und 20 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 50 µl. Die Mischung wird 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PGR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 6 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4- Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei wird das Plasmid pQEybeß gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert.
Mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben. Dabei entsteht der rekombinante Stamm XL1-pQEybeß.
Das DNA-Insert des Plasmides pQEybeB wird sequenziert wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben und ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. gb AE000168).
Beispiel 6 Verbrauchsassay von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat unter Benützung von Proteinfraktionen aus E. coli
Assay-Mischungen für die direkte Detektion von enzymatischen Produkten, gebildet aus 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat, über reversed-phase Ionenpaar- HPLC, enthalten 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 25 µM [2-14C]2C- Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat (15,8 µCi/pMol) und Protein in einem Gesamtvolumen von 200 µl. Sie werden für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen werden abgestoppt mittels Einfrieren in flüssigem Stickstoff und die Reaktionsmischungen werden zentrifugiert. Aliquote (50 µl) vom Überstand werden auf eine Multospher 120 RP-18-Säule appliziert (5 µm, kristallines Kieselgel, 4,6 × 250 mm, CS-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Deutschland), welche equilibriert wurde mit 10 mM Tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat, pH 6,0 bei einer Flußrate von 0,75 ml/min. Die Säule wird entwickelt mit 15 ml 10 mM Tetra-n- butylammoniumhydrogensulfat, pH 6,0 und weiter mit einem linearen Gradienten von 0 bis 42% Methanol in 45 ml von 10 mM Tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat, pH 6,0. Der Durchfluß wird unter Benützung eines Radiodetektors (Beta-RAM, Biostep GmbH, Jahnsdorf, Deutschland) überwacht. Die Retentionsvolumina von 2C-Methyl- D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat, einem neuen Produkt und Isopentenylpyrophosphat sind entsprechend 31,5, 40 und 59 ml. Dieser Assay kann in Gegenwart oder Abwesendheit eines prospektiven Inhibitors durch Ermittlung der verbliebenen Menge an Ausgangsmaterial oder Menge an Produkt und Vergleich der Ergebnisse ausgeführt werden.
Beispiel 7 Assay mit Chromoplasten aus Narcissus pseudonarcissus
Chromoplasten werden gemäß einer Methode beschrieben von Kleinig und Beyer hergestellt (in: Methods in Enzymology (Law, J. H. and Rilling, H. C., eds.) 110, 267-273 (1985), Academic Press, London).
Assay-Mischungen enthalten 100 mM Hepes, pH 7,6, 2 mM MnCl2, 10 mM MgCl2, 2 mM NADP+, 20 µM FAD, 5 mM NaF, 6 mM ATP, 1 mM NADPH, 64 µM [2-14C]2C- Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat (15,8 µCi/µMol) und 1 mg Chromoplasten in einem Gesamtvolumen von 500 µl. Die Mischung wird inkubiert bei 30°C für 240 min. und mittels HPLC auf das Auftreten von neuen Metaboliten wie in Beispiel 6 beschrieben untersucht. Peaks von neuen Metaboliten mit Retentionsvolumina von 40, 47 und 59 ml werden erhalten.
Beispiel 8 Enzymatische Herstellung eines neuen Metaboliten im Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg
25 g von M15(pREP4) Zelle, über Nacht in M9-Minimalmedium (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Press) gewachsen, werden mittels Zentrifugation geerntet und resuspendiert in 150 ml einer Lösung aus 10 mM MgC2, 5 mM Dithiothreitol und 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0. 100 mg Lysozym werden zugegeben und die Reaktionsmischung bei 37°C für 30 min. inkubiert. Die Mischung wird auf Eis gekühlt und 6 × 10 sek. Mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA) ultraschallbehandelt, der auf 70% Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird 60 min. bei 4°C und 10000 UpM zentrifugiert. Das Pellet wird in 200 ml 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 5 mM MgCl2, 5 mM Dithiothreitol und 27,3 µM [U-13C, 2- 14C]2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat (0.72 µCi/µMol) werden zugegeben und die Mischung wird bei 37°C 8 h inkubiert. Die Mischung wird bei 10000 UpM für 60 min. zentrifugiert und der Überstand lyophilisiert. Die trockene Substanz wird in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Ein Aliquot von 100 µl wird mittels HPLC auf das Auftreten eines neuen Produktpeaks bei 40 min. wie in Beispiel 6 beschrieben untersucht. 150 ml Ethanol werden hinzugefügt und die Suspension über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Die Mischung wird zentrifugiert bei 4800 UpM für 30 min. das Pellet wird resuspendiert in 5 ml destilliertem Wasser und Kügelchen eines Kationenaustauschers (AG-50W-x8, Natriumform, Biorad, München) werden zugegeben bis eine klare Lösung erhalten wird. Die Lösung wird durch einen Filter aus Whatman Papier passiert und das Filtrat wird lyophilisiert. Die trockene Substanz wird in 0,5 ml D2O gelöst.

Claims (31)

1. Intermediat, gegebenenfalls isotopen-markiert, des Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosyntheseweg, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) es herstellbar ist durch die Reaktion von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4- cyclopyrophosphat mit einer wässerigen Suspension von intakten oder lysierten Plastiden oder Bakterienzellen;
  • b) es abtrennbar ist von dem wässerigen Überstand der Reaktionsmischung, erhältlich gemäß Punkt (a) mittels Umkehrphasen, Ionenpaar- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer 4, 6 × 250 mm C18 Umkehrphasen-Säule (kristallines Kieselgel, Partikelgröße 5 µm, durchschnittlicher Porendurchmesser 12 nm), equilibriert mit wässeriger 10 mM Tetra-n-Butylammoniumhydrogensulfat, pH 6.0 und entwickelt mit 10 mM Tetra-n-Butylammoniumhydrogensulfat, pH 6.0 und einem linearen Gradienten von 0 bis 42% (v/v) Methanol in 10 mM Tetra- n-Butylammoniumhydrogensulfat, pH 6.0 und Umgebungstemperatur;
  • c) es unter den Bedingungen unter Punkt (b) ein Retentionsvolumen stromab vom Retentionsvolumen von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4- cyclopyrophosphat und stromauf vom Retentionsvolumen von Isopentenylpyrophosphat besitzt; und
  • d) seine Zunahme in der Reaktionsmischung unter Punkt (a) korreliert ist mit der Abnahme von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat wie messbar in der Detektionsmethode unter Punkt (c).
2. Das Intermediat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es herstellbar ist in teilweise radioaktiv-markierter Form ausgehend von teilweise 14C-markiertem 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat.
3. Das Intermediat gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es herstellbar ist als eine [U-13C5]Verbindung ausgehend von [U-13C5]2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat.
4. Das Intermediat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch ein Retentionsvolumen von
1,27 ± 0,15 mal von dem von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat und
0,68 ± 0,06 mal von dem von Isopentenylpyrophosphat oder von
1,50 ± 0,16 mal von dem von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat
0,80 ± 0,06 mal von dem von Isopentenylpyrophosphat
unter den Bedingungen beschrieben in Anspruch 1 Punkt (b).
5. Das Intermediat gemäß Anspruch 1 gekennzeichnet durch ein Retentionsvolumen von
1,27 mal von dem von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4- cyclopyrophosphat und 0,68 mal von dem von Isopentenylpyrophosphat oder von
1,50 mal von dem von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat und
0,80 mal von dem von Isopentenylpyrophosphat
unter den Bedingungen beschrieben in Anspruch 1 Punkt (b).
6. Wässerige Zellflüssigkeit von einem Organismus, umfassend
  • a) 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat; und
  • b) die Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Konzentration von mindestens einem von (a) und (b) höher ist als in der wässerigen Zellflüssigkeit abtrennbar von normalen Zellen des Organismus.
7. Die Zellflüssigkeit gemäß Anspruch 6, wobei die Verbindungen (a) und (b) isotopen-markiert sind.
8. Verfahren zur Herstellung eines Intermediats in dem Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosynthesewegs durch
  • a) Hinzufügen von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat zu einer wässerigen Suspension von intakten oder lysierten Plastiden oder Bakterienzellen oder einer Proteinfraktion davon;
  • b) Inkubieren der erhaltenen Mischung für eine vorher festgelegte Zeitdauer bei einer vorher festgelegten Temperatur;
  • c) gegebenenfalls Aufbrechen der Plastiden oder Zellen;
  • d) Abtrennen der unlöslichen Komponenten und polymeren Komponenten von der Mischung;
  • e) Unterwerfen der erhaltenen wässerigen Lösung, gegebenenfalls nach Konzentrierung, einer Umkehrphasen Ionenpaar- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie;
  • f) Abtrennen einer Fraktion, die einen Metaboliten mit einem Retentionsvolumen stromab von dem Retentionsvolumen von 2C-Methyl- D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat und stromauf von dem Retentionsvolumen von lsopentenylpyrophosphat enthält; und
  • g) Isolieren des Intermediats von der Fraktion.
9. Das Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei radioaktiv markiertes Ausgangsmaterial verwendet wird und die Detektion in Schritt (f) mit einem Radiodetektor ausgeführt wird.
10. Das Verfahren gemäß Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, daß ein Cobalt(II)- Salz in Schritt (a) hinzugefügt wird.
11. Verwendung des Intermediats gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 für das Screenen nach Enzymen des Mevalonat-unabhängigen Biosynthesewegs
  • a) entweder zwischen 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat und dem Intermediat; oder
  • b) zwischen dem Intermediat und Isopentenylpyrophosphat oder Dimethylallylpyrophosphat.
12. Enzym in einer Form, die wirksam ist in der biosynthetischen Umwandlung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat in das Intermediat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 innerhalb des Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosynthesewegs ausgewählt aus der Gruppe von Enzymen kodiert von
  • a) gcpE von E. coli oder von Genen ortholog dazu;
  • b) IytB von E. coli oder von Genen ortholog dazu;
  • c) yjeE von E. coli oder von Genen ortholog dazu;
  • d) ybeB von E. coli oder von Genen ortholog dazu.
13. Isolierte, gereinigte Nukleinsäure kodierend für ein Enzym gemäß Anspruch 12.
14. DNA-Vektor, der eine Sequenz der Nukleinsäure gemäß Anspruch 13 enthält.
15. Rekombinante Zelle, die den Vektor gemäß Anspruch 14 enthält, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterien-, Protozoen-, Pilz-, Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen.
16. Samen umfassend eine Pflanzenzelle, wie sie in Anspruch 15 definiert ist.
17. Verfahren zum Screenen von chemischen Bibliotheken auf das Auftreten oder Fehlen von Inhibition der Biosynthese von Isoprenoiden bezogen auf die Blockierung der Umwandlung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat gemäß folgenden Schritten:
  • a) Herstellen einer wässerigen Mischung, umfassend intakte oder lysierte Plastiden oder bakterielle Zellen, 2C-Methyl-D-erythritol-2,4- cyclopyrophosphat und ein divalentes Metallsalz;
  • b) Umsetzten der Mischung über eine vorher bestimmte Zeitdauer bei einer vorher bestimmten Temperatur;
  • c) Bestimmen des Umsatzes von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4- cyclopyrophosphat;
  • d) Wiederholen der Schritte (a) bis (c) in Gegenwart einer Testprobe einer chemischen Bibliothek;
  • e) Bestimmen des Auftretens oder Fehlen der Inhibition in Schritt (d) durch Ermittlung ob der bestimmte Umsatz in Gegenwart der Testprobe niedriger ist oder nicht.
18. Das Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei Schritt (c) ausgeführt wird durch Messen des Verbrauchs an 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat oder der Bildung des Intermediats gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5.
19. Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 17 oder 18, wobei das divalente Metallsalz mindestens eines ist ausgewählt aus der Gruppe von Cobaltsalzen, Magnesiumsalzen und Mangansalzen.
20. Verfahren zum Auffinden von Inhibitor-resistenten Varianten der Enzyme des Anspruchs 12, insbesondere Pflanzenenzymen, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
  • a) Bereitstellung einer Zellpopulation, die eines der Pflanzenproteine exprimiert;
  • b) Mutagenisierung der Zellpopulation;
  • c) Behandlung solcher mutagenisierter Zellpopulationen mit einem Herbizid, unter Bedingungen, welche inhibierend sind für die funktionelle Effektivität eines der Proteine von nicht-mutagenisierten Zellen;
  • d) Wiederauffindung von Zellen, welche resistent gegen die inhibitorischen Effekte solcher Herbizide sind und
  • e) Isolierung und gegebenenfalls Sequenzierung der Nukleinsäure, welche für herbizid-resistente Proteine aus den wiederaufgefundenen Zellen codiert, um herbizid-resistente Proteinvarianten bereitzustellen und zu identifizieren.
21. Variante eines Enzyms aus Anspruch 12, wobei eine solche Variante herbizid­ resistent ist.
22. Die Enzymvariante, wie sie in Anspruch 21 definiert ist, wobei die Enzymvariante, wenn sie in einer Zelle exprimiert wird, welche die funktionelle Aktivität eines solchen Enzyms zur Lebensfähigkeit benötigt, folgendes zeigt:
  • a) eine katalytische Aktivität, die alleine ausreicht, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in welcher sie exprimiert wird, aufrechtzuhalten; oder eine katalytische Aktivität, die in Kombination mit irgend einer herbizid­ resistenten Enzymvariante ausreicht, die auch in der Zelle exprimiert wird, welche dieselbe Enzymvariante oder von der ersten verschieden sein kann, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in welcher sie exprimiert wird, aufrechtzuhalten; und
  • b) eine katalytische Aktivität, die stärker gegen das Herbizid resistent ist als das Wildtyp-Enzym.
23. Nukleinsäure, welche für eine Enzymvariante, wie sie in Anspruch 21 definiert ist, codiert.
24. DNA-Vektor, der eine, wie in Anspruch 23 definierte, Nukleinsäure umfasst.
25. Zelle, umfassend einen DNA-Vektor, wie er in Anspruch 24 definiert ist, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Bakterien-, Pilz-, Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen.
26. Samen, umfassend eine Pflanzenzelle, wie sie in Anspruch 25 definiert ist.
27. Verfahren zur Übertragung von Herbizid-Resistenz auf eine Pflanze, wobei das Verfahren die Einführung einer Nukleinsäure, welche für eine herbizid-resisten­ te Enzymvariante, wie sie in Anspruch 21 definiert ist, codiert, unter Bedingungen, bei welchen die Nukleinsäure in der Pflanze exprimiert wird, umfasst.
28. Verfahren zur Wachstumskontrolle von Unkraut, umfassend das Kultivieren einer Nutzpflanze, die ein herbizid-resistentes Gen enthält, das eine Nuklein­ säure, wie sie in Anspruch 23 definiert ist, aufweist, in Gegenwart einer für die Wachstumskontrolle wirksamen Menge des Herbizids.
29. Inhibitor für die Biosynthese von Isoprenoiden ausgewählt aus der Gruppe chemischer Verbindungen, die eine Enzymhemmung gemäß dem Screening- Verfahren gemäß Anspruch 17 zeigen.
30. Zubereitung für die Inhibierung der Biosynthese von lsoprenoiden in Pflanzen, Bakterien oder Protozoen, die eine chemische Verbindung umfasst, die eine Enzymhemmung gemäß dem Screening-Verfahren gemäß Anspruch 17 zeigt, in einer Menge die zur Hemmung geeignet ist.
31. Verfahren zur Hemmung der Biosynthese von lsoprenoiden in Pflanzen, Bakterien oder Protozoen durch Behandlung mit einem Inhibitor gemäß Anspruch 29 oder mit einer Zubereitung gemäß Anspruch 30 in einer zur Hemmung geeigneten Menge.
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