JPS6398388A - 除草剤耐性遺伝子の作成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 産業上の利用分野 本発明は、組換えＤＮＡ技術によって、除草剤耐性植物
を育成するために必要な除草剤耐性遺伝子を効率よく取
得するための方法に関する。

除草剤の使用は、労働力の軽減、肥料・土壌養分の有効
利用、病害虫発生の抑制等の多大な効果を作物栽培、管
理面に及ぼしている。農薬の開発からみれば、人畜に無
害で、残留性が少ない、より安全な農薬が求められるこ
とは言うまでもない。

しかし、これらの要求を満たしながら、選択性を持たな
いために作物を栽培中の農地では成育期間中に利用でき
ないものもある。したがって、非選択的除草剤に耐性を
示す作物を育成することができれば、栽培管理が容易で
、利用価値が高い。

従来の知見 除草剤の作用機能については、光合成の電子伝達系を阻
害して光合成によるエネルギー生産を阻害する例、代謝
系に関与する酵素と除草剤が結合することにより代謝系
を阻害する例、などがよく知られている。後者の具体例
としては、除草剤グリホサートの植物体への効果が挙げ
られよう。すなわち、グリホサートは、植物のシキミ酸
合成経路に関与する５−エノールビルビル−３ホスホシ
キメート（以下ＥＰＳＰという）シンセターゼと結合す
ることによって芳香族アミノ酸の合成を阻害することに
よって、除草効果を持つ（ＦＥＢＳＬＥＴＴＥＲ８、よ
ニュ、１９１−１．９６）。

注目すべきことに、細菌でも植物と同一のシキミ酸合成
系路を保有しており、細菌のＥＰＳＰシンセターゼがグ
リホサートと結合することによって、成育が阻害される
と報告されている（Ａｒｃｈ。

ＭＩｅｒｏｂｌｏｌ　、よ３７，１２１−１２３　（１
９８４）およびＥｕｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　
１４３．３５１−３５７（１９８４））。

Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、グ
リホサートにより成育阻害を受け、この場合もＥＰＳＰ
シンセターゼがグリホサートの標的酵素であって、ａｒ
。

Ａ遺伝子にコードされている。Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ
ｕｍを突然変異源で処理して得たグリホサート耐性のＳ
。

ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍからグリホサート耐性のＥＰＳ
ＰシンセターゼをコードするａｒｏＡ遺伝子を取得した
例も報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ　、　２２１．３
７０−３７１）。グリホサート感受性および耐性のＥＰ
ＳＰシンセターゼをコードするａｒｏＡ遺伝子のＤＮＡ
塩基配列を比較した結果、これらの遺伝子の産物である
ＥＰＳＰシンセターゼのアミノ酸配列のたった１か所が
変化しているにすぎなかった（Ｊ、Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈ
ｅｍ、＋　２６０．４７２４−４７２８　（１９８５）
）。このことは、除草剤と結合することによって機能阻
害を受けるタンパク質をコードする遺伝子の特定の塩基
上に突然変異を生じさせて、産物のタンパク質の機能を
残したまま除草剤と結合できなくさせることが可能であ
ることを示している。

上に述べた除草剤耐性のＥＰＳＰシンセターゼをコード
するａｒｏＡ遺伝子を取得する過程では、Ｓ、ｔｙｐｈ
ｌｍｕｒｌｕｍに２段階の突然変異処理を行っているが
、グリホサートに耐性能を持っＳ、ｔｙｐｈｉｍｕ−ｒ
ｉｕｍ突然変異株のうち１／１００〜１／１０００の株
がａｒｏＡ遺伝子座に突然変異を生じたことが明らかに
されている（前出５ｃｉｅｎｃｅ　）。

除草剤に感受性の細菌に突然変異源処理をして得られる
除草剤耐性細菌には、大別して次の二つのものがあろう
。

＝　　４　− （１）　除草剤化合物と結合することによって機能阻害
を受けるタンパク質をコードする遺伝子−Ｌに突然変異
が生じた突然変異株。

（２）　未同定の遺伝子に突然変異が生じた結果、例え
ば、細菌の細胞膜の透過能が変化して除草剤が細菌細胞
内に入れなくなった結果としての耐性変異株、あるいは
、細菌内に入った除草剤を分解または修飾などして無毒
化するような酵素が遺伝子の突然変異によって生じたこ
とによる耐性変異株。

除草剤耐性植物を組換えＤＮＡ技術を用いて育成する場
合には、何らかの方法によって変異株を（１）と（２）
に分別し、（１）の変異株のＤＮＡが耐性遺伝子を取得
するために供給されるべきである。従って、突然変異に
よって（１）の性質を有する変異株のみが得られれば好
都合であるといえる。しかし、突然変異は染色体ＤＮＡ
上にランダムに生ずるために、除草剤感受性細菌に突然
変異源処理を行なって、（１）の性質を有する変異株の
みを選択することは困難である。

〔発明の概要〕

要旨 本発明は、」１記の点に解決を与えて、除草剤化合物と
結合することによって機能阻害を受ける酵素またはタン
パク質をコードする遺伝子に高度に特異的に、高頻度で
突然変異を生じさせる方法の開発に係るものである。

すなわち、本発明による除草剤耐性遺伝子の作成法は、
下記の工程からなること、を特徴とするものである。

（イ）　除草剤化合物と結合することによって機能阻害
を受ける植物酵素またはタンパク質と同一の機能を有す
る酵素またはタンパク質をコードする原核生物由来の遺
伝子（以下、除草剤感受性遺伝子という）を、原核生物
を宿主とする遺伝的相補性を利用したクローニングに付
し、得られたクロー・ンから、該除草剤感受性遺伝子を
組込んだ組換えＤＮＡ分子を得ること。

（ロ）　この除草剤感受性原核生物にこのＤＮＡ分子を
保有させ、これに突然変異源を作用させて、該除草剤感
受性原核生物を除草剤耐性原核生物に変換させること。

（ハ）　除草剤耐性原核生物を選択し、除草剤耐性原核
生物から前記（ロ）の工程で保有させたＤＮＡ分子を抽
出して、除草剤感受性から除草剤耐性に変換された遺伝
子を得ること。

効果 本発明方法は除草剤感受性遺伝子に突然変異を起こさせ
てこれを除草剤耐性にするものであるところ、この突然
変異処理を該遺伝子含有の除草剤感受性原核生物に対し
て行なうのではなくて、除草剤感受性原核生物にこの除
草剤感受性遺伝子を組込んだ組換えＤＮＡ分子を保有さ
せたものに対して行なうのであり、変異源処理生成物か
ら除草剤耐性原核生物を選択することにより得られた除
草剤耐性原核生物が保育する前述ＤＮＡ分子はほぼ１０
０％の確率で目的とする除草剤耐性遺伝子に変換されて
おり、容易かつ高率に除草剤耐性遺伝子を得ることがで
きる。

また、本発明で典型的な除草剤感受性遺伝子はａｒｏＡ
遺伝子であるが、ａｒｏＡ遺伝子以外の大腸菌遺伝子に
突然変異が起きた場合にも、大腸菌はグリホサートに耐
性になることも本発明者らは別途実験で確認している。

従って、本発明は高頻度に、しかも確実に目的遺伝子に
突然変異を引き起こすことが可能となった。

本発明によって取得される除草剤耐性遺伝子プラスミド
の具体例であるｐＫＢＧＲ１〜ｐＫＢＧＲＩＯを保有す
る大腸菌形質転換体からは、組換えＤＮＡ技術を用いて
容易に組換えプラスミド分子か抽出され、これをもとに
除草剤耐性植物の育成か可能となる。具体的には、組換
えプラスミド分子からａｒｏＡ遺伝子領域を切り出し、
制限酵素、修飾酵素あるいは化学的な方法によりａｒｏ
Ａ遺伝子の構造遺伝子領域を含む所望のフラクションの
５′末端側に植物で発現させるための所謂プロモーター
ＤＮＡフラクションを連結し、３′末側に、ａｒｏＡ遺
伝子が植物細胞中で転写されてポリ（Ａ）が付加される
ような、いわゆるポリ（Ａ）シグナルを連結したキメラ
遺伝子が作成される。この遺伝子を適当なベクターに組
込んで植物細胞に導入し、得られるキメラ遺伝子組込み
植物あるいはカルスを選択することによって、除草剤耐
性植物が作出される。なお、原核生物から除草剤耐性遺
伝子をクローン化し、この遺伝子を植物発現用プロモー
ター下流に連結し、さらにその下流にポリ（Ａ）シグナ
ルを連結してなる遺伝子を植物に導入して除草剤耐性植
物が得られたとの報告がある（Ｎａｔｕｒｅ、　３二１
７−１７１４−７４４　（１９８５））。

〔発明の詳細な説明〕

工程 本発明方法は、前記の三段階を必須とするものである。

（１）第一段階（除草剤感受性遺伝子のクローニング） 遺伝子 原核生物由来の除草剤感受性遺伝子、すなわち除草剤化
合物と結合することによって機能阻害を受ける植物酵素
またはタンパク質と同一の機能を有する酵素またはタン
パク質をコードする原核生物由来の遺伝子、をクローニ
ングに付すことによって、この除草剤感受性遺伝子を組
込んだ組換えＤＮＡ分子を保有する除草剤感受性形質転
換体を得る。

この場合の遺伝子供給源としての原核生物としては大腸
菌、サルモネラ菌、クレブシェラ菌等があるが、大腸菌
が最も代表的であり、また好ましいものである。

除草剤化合物と結合することによって機能阻害を受ける
植物酵素またはタンパク質およびそれをコードする遺伝
子の具体例としては、除草剤化合物グリホサートに対す
る酵素ＥＰＳＰシンセターゼおよび遺伝子ａｒｏＡ、除
草剤化合物スルホメツロンメチル（ｓｕｌｆｏｍｅｔｕ
ｒｏｎ　ｍｅｔｈｙｌ　）およびイミダゾリノンに対す
る酵素アセトラクテートシンセターゼ（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．、　ＵＳＡ　、　８３
．４４１８−４４２２　（１９８６））および遺伝子ｉ
１ｙＱＭが挙げられる。

クローニング 本発明ではこのような遺伝子を原核生物に求めてそれを
クローニングするのであるが、本発明で行なうクローニ
ングは、原核生物を宿主とする遺伝的相補性を利用した
クローニング、である。このクローニングは所謂ショッ
トガンクローニングの範躊に入るものであり、前記のよ
うな遺伝子（Ｘということにする）に対応するＤＮＡが
その構成鎖員として含まれているＤＮＡ鎖を宿主原核生
物から取出して適当な制限酵素で切断し、得られるＤＮ
ＡフラグメントとベクターＤＮＡとを試験管内で連結し
、得られたキメラプラスミドによって該遺伝子欠損宿主
原核生物（Ｘ−）を形質転換させ、形質転換体混合物か
ら当該遺伝子がコードする酵素ないしタンパク質の機能
を利用して、目的形質転換体を選択する。

クローニング用宿主原核生物の具体例は大腸菌、枯草菌
等であるが、大腸菌が代表的であり、また好ましいもの
である。

ショットガン・クローニングは周知の技術であって、そ
の詳細は、たとえば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙ
−一　　１１　− ｍｏｌｏｇｙ、旦旦、３９６−４０８　（１９７９）に
述べられている。

目的形質転換体の選択を当該遺伝子がコードする酵素な
いしタンパク質の機能を利用して行なう一つの方法は、
形質転換体の栄養要求性の差を利用することからなるも
のである。すなわち、たとえば、目的遺伝子（Ｘ）がａ
ｒｏＡであるときのＸ−宿主としてａｒｏＡ欠損株であ
るＥ、ｃｏｌｉＡ　８１３２１株を使用したときは、こ
の株はａｒｏＡによってコードされるＥＰＳＰシンセタ
ーゼを生産することができないので、シキミ酸合成経路
でのこの酵素の生成代謝産物以降の代謝産物ができず、
そのためこの株はトリプトファン、チロシンおよびフェ
ニルアラニンを含まない合成培地上では成育できないの
に対して、ａｒｏＡ遺伝子人転子入されている目的形質
転換体はこの遺伝子によって導入された形質としてＥＰ
ＳＰシンセターゼ産生能を獲得しているので、形質転換
体混合物をｌ−記三種のアミノ酸を含まない合成培地で
培養すれば、目的形質転換体のみが成育してくることに
＝　　１２　　＝ なる。

これらの形質転換体よりプラスミドを抽出することによ
り、目的とする除草剤感受性遺伝子を組込んだ組換えＤ
ＮＡ分子を得ることができる。ショットガン・クローニ
ングの際に除草剤感受性遺伝子をたとえばｐＢＲ３２２
との組換え体として宿主細胞に導入する場合には、この
プラスミドの属性により除草剤感受性遺伝子は細胞当り
十数コピー存在するので、突然変異源処理によりこの遺
伝子に突然変異が生じる確率がさらに増大（＋数倍）す
ることになる。

（２）　第二段階（突然変異処理） 第一段階で得られた除草剤感受性遺伝子を組込んだ組換
えＤＮＡ分子を除草剤感受性原核生物に保有させたのち
に突然変異処理する。

原核生物に対する突然変異処理は周知の技術であって、
本発明でのこの工程も合目的的な任意の方法によって行
なうことができる。

突然変異源としては、たとえば、エチルメタンサルフォ
ネート（ＥＭＳ）、紫外線、電離放射線、アジ化ナトリ
ウム、ニトロソグアニジン、核酸アナログおよびアクリ
ジン色素などが挙げられる。

（３）　第三段階（突然変異体および目的遺伝子の取得
） 突然変異によって除草剤耐性となった株の選択は、除草
剤添加培地での培養によって行なえばよい。

選択された除草剤耐性株は、これを再度クローン化して
耐性株の確立、純化および増殖を行なうことがふつうで
ある。すなわち、選択された除草剤耐性株から組換えＤ
ＮＡプラスミドを抽出し、これを除草剤感受性宿主細胞
に導入して形質転換を行い、除草剤耐性遺伝子を組込ん
だ組換えプラスミドを保有する除草剤耐性形質転換株を
選択する。

このような除草剤耐性形質転換株からは、目的の除草剤
耐性遺伝子ＤＮＡを抽出するのがふつうである。菌体か
らのＤＮＡ分子の抽出および抽出されたＤＮＡ分子から
の目的除草剤遺伝子の切出しは、すべて遺伝子組換え技
術の分野において周知の手法によって行なうことができ
る。

実　　施　　例 （１）　グリホサート感受性ａｒｏＡ遺伝子のクローニ
ング 公知の方法（Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、ＢＩｏｌ、、　３．２０
８（１９６１））により大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｃ６０
０株（Ｆ−１ｔｈｊ−１、ｔｈｒ−１，１ｅｕＢ６、Ｉ
ａｃＹｌ、ｔｏｎＡ２１、」史−Ｅ４４、λ−）より染
色体ＤＮＡを抽出精製し、これをグリホサート感受性ａ
ｒｏＡ遺伝子をクローン化するための供与ＤＮＡとして
用いた。　７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７，５）　、
６０ｍＭＮａｃ　１，７ｍＭＭｇＣ１２からなる溶液１
００μｍ中に上記ＤＮＡ５μｇと旧ｎｄｎ［２０ユニツ
トを加え、混和して１６時間にわたって３７°Ｃで加温
後、フェノール抽出により酵素を除いて反応を止め、エ
タノール沈澱により、旧ｎｄＩ［分解ＤＮＡ断片を回収
した。クローニングベクターとして、次のようにして調
製したｐＢＲ３２２の旧ｎｄｍ分解物を用いた。７ｍＭ
Ｔｒｊｓ−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、６０ｍＭＮａＣ１，
７ＩＩＩＭＭｇＣ１２からなる溶液にｐＢＲ３２２２，
５ｕｇと旧ｎｄｍ　１０　：Ｌ−ット＝　　１５　− を加え、３７℃で１６時間加汎後、エタノール沈澱によ
り旧ｎｄＩＩ［分解ｐＢＲ３２２を回収した。これを１
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０）に溶解し、
バクチリアルアルカリホスファターゼ１００ユニツトを
加え、６５℃で６０分加温後、フェノール抽出により酵
素を除去して反応を止め、エタノール沈澱によりｐＢＲ
３２２の旧ｎｄＩＩＩ分解物で５′−末端のリン酸が除
去されているクローニングベクターを調製した。６６＋
ｎＭＴｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７，６）　、６．６＋ｎＭ
ＭｇＣ１２，１０ｍＭＤＴＴ。

１、、ＯｍＭＡＴＰを含む溶液１００μｍ中に、上記Ｅ
、ｃｏｌｌ　　Ｃ６００株染色体ＤＮＡのＨ１ｎｄｌＩ
Ｉ分解物２μｇとｐ　Ｂ　Ｒ３２２Ｈｉｎｄｍ分解物１
μｇを溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．１ユニツトを加
え、１２．５℃で１６時間保温して、供与ＤＮＡ断片と
クローニングベクターとの連結を行なった。

グリホサートによって機能阻害を受けるＥＰＳＰシンセ
ターゼは、大腸菌のａｒｏＡ遺伝子にコードされており
、大腸菌染色体ＤＮＡＪ−の２０分の位置に存在してい
る（　Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　　ＬＥＴＴＥＲ８。

１６５０，１２１−１２７（１９８４）およびＭｉｃｒ
ｏｂｌｏｌ、Ｒｅｖ、、４７、　１．８Ｏ−２３０（１
９８３））。そこでａｒｏＡ欠損株の大腸菌ＡＢＩ−ド
大学医学部大腸菌株保存センター、コード番号ＣＧＳＣ
＃ｓ］、３２１）を宿主として、遺伝的相補性を利用し
てａｒｏＡ遺伝子をクローン化した。公知の方法（Ｐｒ
ｏｃ、　　Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、、ＩＪＳＡ１
６９．２１１０−２１１４　（１９７２）　）により、
−１−記の方法によって調製されたライゲーション溶液
を用いて、ＡＢ１３２１株を形質転換させた。グリホサ
ートの標的酵素であるＥＰＳＰシンセターゼをコードす
るａｒｏＡ遺伝子がクローン化されている組換えプラス
ミドを保有する大腸菌形質転換体は、Ｍ９合成培地（Ｔ
、Ｍａｎｌａｔｉｓら、１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　
１リットル当りプロリン１００■、ヒスチジン１００ｍ
ｇ、チアミン２０ｍｇおよび５０ｍｇのアンピシリンを
含む固体培地−にでコロニーを形成した。しかし、Ａ３
１３２１株は同−培地上で成育はできなかった。

得られたＡＢ１３２１株形質転換体のうち１０クローン
を１．５ｍｌのＬ−Ｂｒｏｔｈ培地で１晩培養後、公知
の方法（Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、７．
１５１３−１５２３　（１９７９））により抽出した組
換えＤＮＡ分子はすべて、ｐＢＲ３２２に旧ｎｄｎＩで
切断される１０．６ＫｂｐのＤＮＡ断片が挿入されてい
た。この１０．６Ｋｂｐの旧ｎｄＩＩＩ断片を組込んだ
ｐＢＲ３２２をｐＫＢＧｓｌと名付けた。

１０．６Ｋｂｐの旧ｎｄＩｎ断片のＢａｍ　ＨＩおよび
Ｂｇｌ■による制限酵素地図を図面に示した。この１０
．６ＫｂｐのＤＮＡ断片には、目的とするａｒｏＡ遺伝
子以外の遺伝子がコードされている可能性がある。そこ
で、組換えＤＮＡ技術の常法によってｐＫＢＧＳｌから
旧ｎｄＩＩＩ分解により取り出された１、０．６Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片をＢｇｌ　Ｉ［とＢａＩＩＩＨＩで分解し
、３．　５Ｋｂｐと１．０Ｋｂｐの断片は１１１ｎｄｌ
ｌｌとＢｇｌ　ＩＩで分解したプラスミドｐＫＣ７と連
結し、また１、　　６Ｋｂｐ　、　２．　０Ｋｂｐおよ
び２、　５Ｋｂｐの断片はＢｇｌ　ｎで分解したプラス
ミドｐＫＣ７と結合した後、Ｃ６００株の形質転換を行
なった。ａｒｏＡ断片を組込んだ組換えプラスミドを保
有するＣ６００株形質転換体は、Ｍ９合成培地１リット
ル当りロイシン１００ｍｇ、スレオニン］、００ｍｇ、
チアミン２０ｐｐｍ、アンピシリン５０ａ＋ｇおよびグ
リホサート２００　ｐｐｍを含む固体培地上でコロニー
を形成することから選択された。

その結果、当初の１．０．６ＫｂｐのＤＮＡ断片からＢ
ｇｌ　ｎとＢａｍ　ＨＩによって切り出される３、５Ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片をｐＫＣ７に連結したフラクションを
使った時にのみ２００　ｐｐｍのグリホサートを含むＭ
９合成培地上でコロニーを形成するＣ６００株組換え体
が得られた。一方、０６００株は４０ｐｐｍ以上のグリ
ホサートを含む上記培地ではコロニーを形成しなかった
。このことから３、　５ＫｂｐのＤＮＡ断片上にａｒｏ
Ａ遺伝子がコードされていることが明らかとなった。こ
のフラクションを含む組換えプラスミドをｐＫＢＧｓｌ
５と名付けた（図面参照）。ｐＫＢＧｓｌ５がＡ８１３
２１株のａｒｏＡ−を相補したということは言うまでも
ない。

なお、図面では、１０．６Ｋｂｐの断片をｐＢＲ３２２
の旧ｎｄＩ１１部位に組込んだ組換えプラスミドをｐＫ
ＢＧＳｌと、１０．６Ｋｂｐの断片をＢａｎＨＩおよび
Ｂｇｌ　ＩＩで分解して得られる断片のうち１．０Ｋｂ
ｐと３．　５ＫｂｐのものをｐＫＣ７の旧ｎｄ■および
Ｂｇｌ　ｍ部位に組込んだプラスミドをそれぞれｐＫＢ
ＧＳｌ　１およびｐＫＢＧＳｌ５と、２、　５Ｋｂｐ　
、　２．　０ＫＩ）ｐおよび１．６Ｋｂｐの断片をｐＫ
Ｃ７のＢｇｌ　１１部位に組込んだプラスミドをそれぞ
れｐＫＢＧｓｌ２、ｐ　Ｋ　Ｂ　Ｇ　Ｓ　１．３および
ｐ　Ｋ　Ｂ　Ｇ　Ｓ　１４としている。

表１は、大腸菌Ｃ６００株およびＣ６００株形質転換体
のグリホサート含有培地上での成育状況を示すものであ
る。表１に示したように、Ｃ６００株は４０ｐｐｍ以上
のグリホサートを含むＭ９合成固体培地（ロイシン、ス
レオニン、チアミン、アンピシリンを含む）上でコロニ
ー形成が−２０＝ 阻害された。一方、ｐＫＢＧｓｌあるいはｐＫＢＧＳｌ
５を保有する０６００株形質転換体は、２００　ｐｐｍ
のグリホサートを含むＭ９合成培地上でもコロニーを形
成した。グリホサート感受性ａｒｏＡ遺伝子を含む１０
．６ＫｂｐのＤＮＡ断片をｐＢＲ３２２に組込んだｐＫ
ＢＧＳｌ、３．５ＫｂｐのＤＮＡ断片をｐＫＣ７に組込
んだｐＫＢＧＳｌ５はＣ６００株形質転換体当り１５コ
ピ一程度存在する。従って、表１に示した０６００株と
ｐＫＢＧＳｌおよびｐＫＢＧＳｌ５を保有する０６００
株形質転換体とのグリホサート耐性能の差は、分子生物
学でいう所謂ジーン・ドーセッジ効果（ｇｏｎｅ　ｄｏ
ｓａｇｅ　ｅｆｆｅｃｔ）で説明される。

（２）　突然変異源処理 大腸菌Ｃ６００株とｐＫＢＧＳｌ５を保有する０６００
株形質転換体とを、それぞれ１．　５ｍｌのＬ　−Ｂ　
ｒｏｔｈ培地、７５μｇのアンピシリンを含む１、、　
５ｍｌのＬ　−Ｂ　ｒｏｔｈ培地を含む試験管中で、３
７℃で１晩振とう培養した。その１００μｍを５ｍｌの
Ｌ　−Ｂ　ｒｏｔｈ培地に移してさらに３７℃にて３時
間振とう培養し、突然変異源であるエチルメタンサルフ
ォネー）　（ＥＭＳ）を３％の濃度になるよう加え、３
０分間にわたって３７℃にておだやかに振とうした。こ
の培養液を５０１遠心チユーブに移し、３０００回転で
６分間遠心後、培養液を捨てて集菌した。この菌を３０
ｍ１のＬ−Ｂ　ｒｏｔｈ培地に懸濁後、再度同一条件で
遠心し、培地を捨てた。この工程を、もう一度くり返す
ことによって、ＥＭＳを除去した。なお、ＥＭＳ処理に
よる生存率を試べるために、８ＭＳ処理工程を行なわな
い対象区も設けた。それぞれ、（イ）Ｌ−Ｂ　ｒｏｔｈ
固体培地、（ロ）Ｍ９合成培地１リットル当りロイシン
１００■、スレオニン１００ｎ＋ｇ。

チアミン２０１１ｇを含む固体培地、（ハ）Ｍ９合成培
地１リットル当りロイシン１００ｍｇ、スレオニン１０
０ｍｇ、チアミン２０＋ｎｇ、グリホサート２０００ｍ
ｇを含む固体培地上に、スプレッダ−によりブレーティ
ングした。Ｌ−Ｂ　ｒｏｔｈ培地上にブレーティングし
たシャーレは、３７℃で１晩培養後、形成されたコロニ
ー数を計数した。一方、合成培地にブレーティングした
シャーレは、３７℃で３日間培養後、コロニー数を計数
した。結果は、突然変異源処理による生存率、生菌数に
対すグリホサート耐性菌出現頻度として表２に示した。

表２から明らかなように、本発明による方法を用いると
、グリホサート感受性Ｃ６００株と比較して、ｐＫＢＧ
ｓｌ、５を保有するＣ６００株形質転換体では生存率お
よび突然変異率は同レベルであるが、グリホサート耐性
菌の出現頻度は１０倍以上であった。

大腸菌染色体ＤＮＡは４５００　Ｋｂｐ程度の巨大環状
分子であって、すでに１０００個以上の遺伝子が染色体
上にマツピングされているのであるが（Ｍｌｃｒｏｂｌ
ｏｌ、　Ｒｅｖ、前出）、その大きさから３０００〜５
０００個の遺伝子がコードされる容量があるといえるけ
れども、その機能については不明のものか多い。ｐＫＢ
ＧＳｌ５を保有する０６００株形質転換体にＥＭＳを処
理して得られたグリホサート耐性株の耐性機構として大
別して三つの可能性がある。

（ａ）ｐＫＢＧｓｌ　５に組込まれているａｒ。

Ａ遺伝子に突然変異が生じたことにより、その産物であ
るＥＰＳＰシンセターゼの構造が変化してグリホサ−１
・と結合できなくなった結果として、耐性能が賦与され
た。

（ｂ）Ｃ６００株染色体ＤＮＡ上のａｒｏＡ遺伝子に突
然変異が生じ、（ａ）の機構と同様に耐性能が賦与され
た。

（ｃ）Ｃ６００株染色体ＤＮＡ上のａｒｏＡ以外の遺伝
子に突然変異が生じたことにより、未知の機構により耐
性能が賦与された。（Ｃ）の可能性は、より具体的には
、大腸菌の細胞膜の変化によりグリホサートを取り込め
なくなったことによる耐性、あるいはグリホサートを代
謝的に無毒化することによる耐性などが考えられる。し
かし、次の工程により（ａ）に由来する所望の耐性株は
（ｂ）および（Ｃ）に由来する耐性株と容易に区別する
ことができる。

（３）　　プラスミドレスキュー ＥＭＳ処理によって得られて２０００　ｐｐｍのグリホ
サートを含むＭ９培地上でコロニーを形成したｐＫＢＧ
Ｓｌ、５を保有するＣ６００株組換え体１０コロニーを
、７５μｇのアンピシリンを含む１．５１のＬ　−Ｂ　
ｒｏｔｈ培地で３７°Ｃにて１晩培養した。この０１５
ｎ＋１から公知の方法（Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、前出）によりプラスミドを抽出し
、公知の方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　ｓ前出）により０６００株に導入
して形質転換を行ない、Ｍ９合成培地１リットル当りロ
イシン１００ｍｇ。

スレオニン］、００ｍｇ、チアミン２０ｍｇ、およびグ
リホサート２０００ｍｇを含む固体培地上にブレーティ
ング後、３７°Ｃで３日間培養した。その結果、１０ク
ローンから得たプラスミドはすべてＣ６００株にグリホ
サート耐性能を賦与した。この結果から、ＥＭＳ処理で
得られたｐＫＢＧＳｌ５を保有するグリホサート耐性０
６００株組換え体のうち、調べた１０クローンではすべ
てｐＫＢＧＳｌ５に組込まれているａｒｏＡ遺伝子上に
突然変異が生じたことか判明した。このプラスミドを、
それぞれ、ｐＫＢＧＲｌ、ｐＫＢＧＲ２、ｐＫＢＧＲ３
、ｐＫＢＧＲ４、ｐＫＢＧＲ５、ｐＫＢＧＲ６、ｐＫＢ
ＧＲ７、ｐＫＢＧＲ８、ｐＫＢＧＲ９、およびｐＫＢＧ
Ｒｌｏと名付けた。　ｐＫＢＧＲＩ〜ｐＫＢＧＲ１０を
保有する　Ｃ６００株形質転換体のグリホサート耐性能
を比較した結果は、表１に示した通りである。耐性能に
は差がみられ、４０００　ｐｐｍのグリホサートを含む
培地上でも旺盛な生長がみられた形質転換体もあった。

１）ＫＢＧＲＩ〜ｐＫＢＧＲ１０を形質転換によりａｒ
ｏＡ−のＡ３１３２１株に導入した結果、組換えプラス
ミド分子を保有するＡ　Ｂ　ｉ　３２１株形質転換株は
すべて、Ｍ９合成培地１リットル当りプロリン１００ｍ
ｇ、ヒスジン１００＋ｎｇ、チアミン２０ｍｇを含む固
体培地上にコロニーを形成した。

このことは、ｐＫＢＧＲ１〜ｐＫＢＧＲ１０に組込まれ
ているａｒｏＡ遺伝子産物は、除草剤化合物との結合に
よる機能阻害を受けなくなったにもかかわらず、ＥＰＳ
Ｐシンセターゼ活性（機能）は無傷のまま残されていた
ということを示してい関連微生物の寄託 ｐＫＢＧＲｌを含むＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００株は、昭へ 和６１年９月５日に工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されて微工研菌寄第８９６０号の受託番号を得てい
る。

なお、この株の菌学的性質は、導入されているプラスミ
ドｐＫＢＧＲ１に由来するものを除けば、Ｅ、ｃｏｌｉ
　Ｃ６００株のそれと同じである。

【図面の簡単な説明】

図面は、ａｒｏＡ遺伝子を含む１０．６ＫｂｐのＤＮＡ
断片の制限酵素地図である。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 口　　　　　　　　　　ρＫＢＧＳＩ＋［＝＝＝コ　　
　　　　　　　　　　　　　ｐＫＢＧｓ１２０＝＝コ　
　　　　　　　　　　ｐＫＢＧｓ１３０二コ　　　　　
　　　ρＫＢＧＳＩ４０＝＝＝＝］　　　ρＫＢＧＳＩ
５ ＩＫｂρ トーＨ 第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程からなることを特徴とする、除草剤耐性
   遺伝子の作成法。 （イ）除草剤化合物と結合することによって機能阻害を
   受ける植物酵素またはタンパク質と同一の機能を有する
   酵素またはタンパク質をコードする原核生物由来の遺伝
   子（以下、除草剤感受性遺伝子という）を、原核生物を
   宿主とする遺伝的相補性を利用したクローニングに付し
   、得られたクローンから、該除草剤感受性遺伝子を組込
   んだ組換えＤＮＡ分子を得ること。 （ロ）この除草剤感受性原核生物にこのＤＮＡ分子を保
   有させ、これに突然変異源を作用させて、該除草剤感受
   性原核生物を除草剤耐性原核生物に変換させること。 （ハ）除草剤耐性原核生物を選択し、除草剤耐性原核生
   物から前記（ロ）の工程で保有させたＤＮＡ分子を抽出
   して、除草剤感受性から除草剤耐性に変換された遺伝子
   を得ること。 ２、除草剤感受性がグリホサート感受性である、特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３、除草剤感受性遺伝子がａｒｏＡである、特許請求の
   範囲第１〜２項のいずれかに記載の方法。 ４、遺伝子供給源の原核生物およびクローニング用宿主
   の原核生物がいずれも大腸菌である、特許請求の範囲第
   １〜３項のいずれか１項記載の方法。