JPH0630589B2 - プラスミドｄｎａによる植物プロトプラストの試験管内形質転換方法 - Google Patents

プラスミドｄｎａによる植物プロトプラストの試験管内形質転換方法

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JPH0630589B2
JPH0630589B2 JP58019865A JP1986583A JPH0630589B2 JP H0630589 B2 JPH0630589 B2 JP H0630589B2 JP 58019865 A JP58019865 A JP 58019865A JP 1986583 A JP1986583 A JP 1986583A JP H0630589 B2 JPH0630589 B2 JP H0630589B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高等植物のＤＮＡ中に外来のプラスミドまたは
その一部分のＤＮＡを挿入することによつて高等植物の
遺伝学的性質を形質転換させる方法に関する。
生きている細胞の遺伝系の制御された変質はＤＮＡを宿
主細胞に導入しそして再現性のある方法で宿主細胞の染
色体にとり入れることのできる可能性を必要とする。こ
れはバクテリア細胞、イースト細胞および哺乳動物細胞
に対しては既に成功裡に適用されているが、高等植物の
細胞に対しては今だに成功裡に適用されてはいない。そ
の理由はこの場合、細胞壁があまりにも強固な障壁を形
勢しているからである。それ故、植物細胞の代りに植物
プロトプラストを、異種のＤＮＡがその染色体中に取り
入れられるような方法で処理する試みがなされた。
かくて、植物プロトプラストがエスチエリチア・コリの
バクテリアプラスミドＤＮＡで処理された(Hughes,B.
G.,White,F.G.,Smith,M.A.,FEBS Lett.1977,79,80-4；O
wens,L.D.,Plant Physiol.1979,63,683-6)。また、培養
混合物にポリエチレングリコールまたはポリ−Ｌ−オル
ニチンまたはｐＨ１０のＣａ＋＋を添加することによつ
てこの種のＤＮＡの取り込みを促進することが試みられ
た(Lurguin,P.F.Arch.,Int.Physiol.Biochim.1979,87,8
24-5)。ポリ−Ｌ−オルニチンとアクロバクテリウムチ
ユメフアシエンスからのＴｉプラスミドＤＮＡとによる
類似の実験がDaveyらによつて行なわれた(Pl.Sci.Lett.
1980,18,307-313)。リポゾーム(liposomes)中でイー・
コリからのプラスミドＤＮＡをまずカプセル化し、その
後これらを植物プロトプラストと融合させることによる
全く異なつた試みが行なわれた(Lurguin,P.F.,Nucleic
Acid Res.1979,6,3773-3784)。
Hughesらによる研究、Owensによる研究、およびLurguin
による研究において、外来のＤＡＮが適用条件下でどの
程度まで分解されるか、および植物プロトプラストによ
る取り込みがあるか否かが、生物学的方法および技術に
よつて検討された。
Lurguinはポリエチレングリコールおよびポリ−Ｌ−オ
ルニチンは、Ｃａ＋＋(pH10)やリポゾームとは異なり、
植物プロトプラストによる完全なＤＮＡの取り込みにつ
いて良好な結果を与えないと結論した。然しながら、こ
れらのすべての場合に適用した生物学的方法によつて
は、適用した植物プロトプラストの処理が多少なりとも
実際に外来ＤＮＡをプロトプラストに浸透させて究極的
に核中にその経路を見出せるか否かを示すことは不可能
である。培養後に外来ＤＮＡがプロトプラストに結合し
ていることのみが結論しうるにすぎない。このＤＮＡが
表面に存在しているか否か、またはこのＤＮＡがプロト
プラストに浸透したか否かは、依然として知られていな
い。外来ＤＮＡがＤＮＡ処理プロトプラストから分離さ
れた核中に見出される場合（Hughesの研究参照）におい
てさえ、ＤＮＡが植物プロトプラストによつて取り込ま
れてそこに到達したか否か疑問である。事実、核の分離
中にプロトプラスト表面に結合した外来ＤＮＡが放出さ
れ、次いで核に再結合したということを排除することは
できない。植物細胞中の外来ＤＮＡがそれ自体の存在を
示し、そして（あるいは）宿主染色体中に組み入れられ
たことが実証されるまでは、外来ＤＮＡによる植物プロ
トプラストの形質転換が存在したと結論することはでき
ない。DaveyはＤＮＡ形質転換の発生を追求したにすぎ
ず、Owensもこれを検討したにすぎない。いずれの場合
にも安定かつ決定的なＤＮＡ形質転換は決して観察され
なかつた。
ポリエチレングリコールはＤＮＡによる細胞の形質転換
を意図する実験に使用されるばかりでなく、全く異なつ
た発生源のものでありうる完全な細胞を融合させるため
にも使用される。すなわち、ヤマダおよびサカグチ(Agr
ic.Biol.Chem,1981,45,2301-2309)はある種のバクテリ
アをイーストプロトプラスト（サツカロマイセス セレ
ピシアエ）によつて取り込ませた。Wullemsら(Theor.Ap
pl.Genet.,1980,56,203-208)は正常細胞およびクラウン
・ゴール細胞からの植物プロトプラストの融合により、
ポリエチレングリコールを使つて体細胞ハイブリッドを
えた。クラウン・ゴール細胞はアグロバクテリウムチユ
アフアシエンスなるバクテリアによつて生ずるタバコの
腫瘍からえられた。この腫瘍細胞は体細胞ハイブリッド
中にも保持されているバクテリアＤＮＡ片を含んでい
る。従つて、クラウン・ゴール細胞の場合、外来のバク
テリアＤＮＡは試験管内ＤＮＡ形質転換の使用なしにバ
クテリアによつて自然に組み入れられたものである。
クラウン・ゴール病を生ぜしめるＡ．チユメフアシエン
スによる高等植物の細胞中のＤＮＡの自然の形質転換
は、古くから周知であつて種々の双子葉植物中に生ず
る。然し、小麦、大麦その他の穀類を包含する端子葉植
物はこのバクテリアに感染しない。このバクテリアは、
それ自身細胞に浸透することなしに、腫瘍誘起プラスミ
ド（ＴＩプラスミド）の一部を双子葉植物のＤＮＡ中に
挿入し、これによつて腫瘍特異性酸素が形質転換された
細胞中に生成し、アミノ誘導導体オクトピンまたはノパ
リンを与える。これらの物質は感染用バクテリアの良好
な炭素源および窒素源である。このように挿入されたバ
クテリア・プラスミドからのＤＮＡはＴ−ＤＮＡと呼ば
れる。このＴ−ＤＮＡにも遺伝子が配置されていて腫瘍
細胞中にオーキシン様およびシトキニン様の活性を与
え、腫瘍細胞を無制限に腫瘍に生長させ、それらに組織
培養中の自己ホルモン生産性の生長を演じさせる。上記
ＴＩプラスミドのうちの代表的なものとしては、アグロ
バクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumef
aciensu)Ａｃｈ５株から得られることの知られた野性型
プラスミドであるｐＴｉＡｃｈ５プラスミドがあげられ
る。このｐＴｉＡｃｈ５プラスミドの特徴及びその単離
法は、Bertus P.Koekman,et al.Plasmid 2,347-357(197
9)に記載がある。
対応する高等植物（単子葉植物および双子葉植物の両
者）のＤＮＡの形質転換が、高等植物のプロトプラスト
をポリエチレングリコールおよびカルシウムイオンの存
在下に、好ましくは担体としてのＤＮＡ分子特に子牛胸
腺ＤＮＡの存在下にプラスミドＤＮＡと一緒に培養し、
次いで培養媒質中のカルシウムイオン濃度を徐々に増大
させると共に同時にポリエチレングリコール濃度を減小
させ、えられたコロニーまたは細胞アグリゲート（細胞
集塊）を相互に分離し、それらを別に増殖させ、そして
それらをその遺伝学的性質の変質に関して検査すること
によつて、感染用バクテリアの媒介なしに、行ないうる
という事実が今や発見された。
無菌培養したニコチアナタバカムＳＲ１種の葉からのプ
ロトプラストを使用して次の試験を行なつた。細胞壁を
酸素により除去した後に、これらのプロトプラストを植
物ホルモンを補充したＫ３媒質中で培養した。この媒質
は次の組成をもつものである。
蒸留水に下記の物質を下記の割合で溶解させた ｐＨ＝５．６の液： ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ １．１ミリモル／ ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．４ミリモル／ Ｃａｃｌ２・２Ｈ２Ｏ ６．０ミリモル／ ＫＮＯ３ ２５ミリモル／ ＮＨ４ＮＯ３ ３．０ミリモル／ （ＮＨ４）２ＳＯ４ １．０ミリモル／ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．０ミリモル／ ＫＩ ４．５μモル／ Ｈ３ＢＯ３ ５０μモル／ ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ６０μモル／ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ７．０μモル／ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ １．０μモル／ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１μモル／ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．１μモル／ Ｎａ２・ＥＤＴＡ １００μモル／ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １００μモル／ イノシトール １００mg／ ニコチン酸 １．０mg／ ピリドキシン・ＨＣｌ １．０mg／ チアミン・ＨＣｌ １０．０mg／ サクロース ０．４モル／ 形質転換されたプロトプラストの発生は植物ホルモンを
含まない媒質中での生育から認められ、リソピン−デヒ
ドロゲナーゼ(LpDH)および植物中のＴ−ＤＮＡの存在も
認められた。この目的に使用した形質転換用プラスミド
はＡ．チユーメフアシエンスのＴｉプラスミドＤＮＤで
あつた。このＴｉプラスミドＤＮＡを滅菌水に適当な濃
度で溶解し、クロロホルムを加えて感染を防ぎ、使用の
ため４℃で貯蔵した。
標準試験において、プロトプラストおよびＴｉプラスミ
ドＤＮＡを担体としての子牛胸腺ＤＮＡの存在下でポリ
エチレングリコール含有溶液中で一緒に培養し、次いで
カルシウムイオンの存在下で培養を行なつた。Ｎ．タバ
カムＤＮＡ中の最高の形質転換は、初期培養中７〜２０
％（mg／cm2）の特に１２〜１５％のポリエチレングリ
コール濃度および約４０ミリモル／のカルシウムイオ
ン濃度、後期培養中の１００〜１２５ミリモル／への
カルシウムイオン濃度の漸増および同時に約１〜３％特
に約1.6〜２％のポリエチレングリコール濃度への減小
の際にえられることが見出された。培養中のＴ−ＤＮＡ
と子牛胸腺ＤＮＡとの重量比が１：５であり且つ後期培
養混合物を漸増的に加えるときに特に良好な結果がえら
れることが見出された。
この方法を上述のように行なうとき、ＴｉプラスミドＤ
ＮＡの異なった断片のＮ−タバカムＤＮＡへの挿入にも
とづく明瞭に変質された性質をもつ種々の組織セルライ
ンが作られた。
植物ホルモンの添加なしに生育するがLpDH活性は示さな
い組織セルラインがこのようにして見出された。これら
の組織セルラインから植物の再生（発芽形成）がＤＮＡ
形質転換の初期段階にえられる。他のセルラインも植物
ホルモンの添加なしに生育したがLpDH活性は示さなかつ
た。別のセルラインがLpDH活性を示したが植物ホルモン
の添加ないには成育しなかつた。
初期段階において発芽(shoots)を得ることは植物繁殖に
おいて非常に重要である。それは、長期の組織培養期間
後までに再生が起らないと染色体の組成に望ましくない
変化が起るということが知られているからである。その
上、再生能力は長時間培養中に保持された植物組織につ
いて失われることが多い。
ＴｉプラスミドＤＮＡが、変質された性質をもつ組織セ
ルラインのＮ．タバカムＤＮＡ中に挿入されたことを示
す更なる証拠は、生成した変質組織セルラインのＤＮＡ
を分離してこれを制限酵素エンドヌクレアーゼSmaIを用
いて開裂し、このようにして生成した断片をアガロース
ゲル上で電気泳動的に分けることによつてえられた。こ
の方法は、植物ホルモンの添加なしにはＬｐＤＨ活性と
生育とを共に示す２つのセルラインを、使用したＴｉプ
ラスミドを特徴付けるＴ−ＤＮＡ由来制限酵素断片１
７、１６ａおよび１０ｃを有するものとして示した。再
生を示している多数の組織セルラインもＴ−ＤＮＡを含
むことが見出された。然しこのＴ−ＤＮＡは上記の完全
な制限酵素による断片から成るものではなかつた。
本発明による方法は従つて、遺伝学的に改良されたまま
は変質された性質をもつ高等植物の突然変異体の製造の
可能性を与えるものである。これは上述の如く植物繁殖
産業にとつて非常に重要であり、更に重要なことは本発
明による方法を使用して得た組織セルラインはＤＮＡ形
質転換後の初期段階において再生物を得ることを可能に
する。
更にまた、本発明による方法を使用して得た自己独立生
育性細胞、たとえばクラウン・ゴール細胞は、醗酵器中
で適切な生育をさせるためには、非常に単純な媒質を必
要とするにすぎず、この媒質にはたとえば植物ホルモン
を添加することを必要としない。このようにして外来Ｄ
ＮＡを導入して生成された細胞はこの外来ＤＮＡによつ
てコード化されている物質たとえばアルカロイド、アミ
ノ酸、炭化水素、蛋白質、酵素、ステロイドなどの製造
のために大規模に培養することができる。
（Impact of Applied Genetics,Micro Organisms,Plant
and Animals,OTA Report,Congress of the United Sta
tes Office of Techno logy Assessment,Washington,19
81参照）。
次の実施例により本発明を更に具体的に説明する。
実施例 ニコチアナタバカムＳＲ１のプロトプラストを滅菌発芽
の葉から分離して、前述のＫ３媒質中で、ただし0.1mg
／のナフタレン酢酸および0.2mg／のカイネチンを
補充して、5.105プロトプラスト／cm3の濃度で懸濁させ
た（L.MartonらのNature 277,129-131(1979)参照）。
この懸濁液から１cm3の部分をとり、これに0.5cm3の融
合媒質を加えた(Theor.Appl.Genet.56,203(1980)参
照）。
この媒質には平衡分子量6000のポリエチレングリコール
が４０％(mg/ml)が溶かしてあり、且つ140ミリモル／
のＮａｃｌ、５ミリモル／のＫＣｌ、０，７５ミリモ
ル／のＮａ２ＨＰＯ４、５ミリモル／のグルコース
および１２５ミリモル／のＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが含
まれていて、そのｐＨは７．０であつた。次いで10μｇ
のpTi Ach5 DNA（０．４mg／cm3を含む溶液から）およ
び50μｇの子牛胸腺ＤＮＡ（１mg／cm3を含む溶液か
ら）を加えた。これによりプロトプラストが集合してア
グリゲート（塊状物）を形成した。これらのプロトプラ
ストを、時々しんとうしながら、26℃で３０分間培養し
た。その後、上記の融合媒質（ただしポリエチレングリ
コールは加えていない）の１０cm3を２cm3づつ５分間隔
で加えた。この後期培養中、アグリゲート（塊状物）を
再び破壊し、液を除きながら遠心分離によつて集めた。
このプロトプラストを上記濃度のサクロースおよびホル
モンを含むＫ３媒質１０cm3中に再び懸濁させ、２５０
μｇ／cm3のカルベニシリンの添加後、１０cmのベトリ
皿中に接種(plate)した。
暗室に２４時間保ち、次いで2000ルツクスの光に１日当
り１２時間さらした後に、細胞の５０％以上がこの処理
よりを生き抜いたことがわかつた。２週間後、前記濃度
のサクロースおよびホルモンを含むＫ３媒質５cm3を加
えた。コロニーが十分に大きくなつたとき、これらを固
体カンテン／Ｋ３媒質（ただし0.3モル／のサクロー
スを含み、更に植物ホルモンで補強したもの）中におい
た。この媒質上で約１ケ月培養した後、生成した小さい
カリー(calli)をホルモンを含まないＫ３媒質（ただし
０．２モル／のサクロースおよび0.5％のカンテンを
含む）上に接種した。１回または２回の通過後にこの媒
質中で生育しつづけたカリーをホルモンを含まないＬＳ
媒質(Nature 277,129-131(1979)参照）中に接種した。
このＬＳ媒質は蒸留水中に下記の物質を下記の割合でと
かした組成をもつ、ｐＨ＝5.6の液である。
ＫＮＯ３…１８．８ミリモル／；ＮＨ４ＮＯ３…２
０．６ミリモル／；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ…３．０ミ
リモル／；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ…１．５ミリモル／
；ＫＨ２ＰＯ４…１．２５ミリモル／； ＫＩ…５
μモル／；Ｈ３ＢＯ３…１００μモル／；ＭｎＳＯ
４・４Ｈ２Ｏ…１００μモル／；ＺｎＳＯ４・４Ｈ２
Ｏ…３０μモル／；Ｎａ２Ｍ０Ｏ４・２Ｈ２Ｏ…１μ
モル／；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ…０．１μモル／；
Ｃ０Ｃｌ２・６Ｈ２Ｏ…０．１μモル／；Ｎａ２ＥＤ
ＴＡ…１００μモル／；ＦｅＳｏ４・７Ｈ２Ｏ…１０
０μモル／；サクロース…８７．６ミリモル／（３
０ｇ／）；イノシトール…１００mg／；およびチア
ミン…０．４mg／。
この上に形質転換されたセルラインが認められ、次いで
LpDH活性について試験した。１２本のカルスセルライン
形質転換後に植物ホルモンを含まない媒質上で更に生育
するのが見出された。使用したプロトプラストに対する
分離した形質転換体の割合は１０-3〜１０-4であつた。
これらのセルラインのうちの６本は明瞭なLpDH活性を示
した。両方の形質転換による性質はＴｉプラスミドの挿
入片からのみ誘導しうるものであつた。その上、このい
わゆるＴ−ＤＮＡはすべての組織について実証された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジヨ−ジ・ヨゼフ・ウオルムズ オランダ国2361エツクスア−ル・ワ−モン ド・クロスタ−ウエイ302

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】外来のＤＮＡを、高等植物のＤＮＡに挿入
    する方法において、先ず最初に高等植物のプロトプラス
    トとプラスミドＤＮＡをポリエチレングリコール、カル
    シウムイオンの存在下に一緒に培養し、次に該培養後徐
    々に培養培地中のカルシウムイオン濃度を高め、且つポ
    リエチレングリコール濃度を低くせしめ、そして該カル
    シウムイオン濃度は、１００−１２５ｍmole／に高め
    るものであり、該ポリエチレングリコール濃度は１−３
    ％（ｗ／ｖ）に下げるものであり、そして得られたアグ
    リゲートを分離することからなることを特徴とする方
    法。
  2. 【請求項２】該最初の培養において、該ポリエチレング
    リコール濃度が１２−１５％（ｗ／ｖ）であり、該カル
    シウムイオン濃度が、約４０ｍmole／ｍである特許請
    求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】該最初の培養後、該カルシウムイオン濃度
    を１２５ｍmole／までの値に高め、同時に該ポリエチ
    レングリコール濃度を１．８％（ｗ／ｖ）までの値に下
    げるものである特許請求の範囲第１項また同第２項に記
    載の方法。
  4. 【請求項４】該培養が、担体としてのＤＮＡ分子の存在
    下に行われるものである特許請求の範囲第１項から同第
    ３項までのいずれか一つに記載の方法。
  5. 【請求項５】該培養が、担体として子牛胸腺ＤＮＡの存
    在下に行われるものである特許請求の範囲第１項から同
    第４項までのいずれか一つに記載の方法。
  6. 【請求項６】該培養が、該外来のＤＮＡ対該子牛胸腺Ｄ
    ＮＡの比が、１：５である特許請求の範囲第１項から同
    第５項までのいずれか一つに記載の方法。
  7. 【請求項７】該最初の培養後、該カルシウムイオン濃度
    を１００−１２５ｍmole／に高め、同時に該ポリエチ
    レングリコール濃度を１．６−２％（ｗ／ｖ）に下げる
    ものである特許請求の範囲第１項に記載の方法。
JP58019865A 1982-02-11 1983-02-10 プラスミドｄｎａによる植物プロトプラストの試験管内形質転換方法 Expired - Lifetime JPH0630589B2 (ja)

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