JP2023520359A - 放射性核種イメージングのためのレポーター系 - Google Patents
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Abstract
本発明は、(i)細胞内でレポーター遺伝子を発現させるための遺伝子発現構築物であって、前記レポーター遺伝子が、レポータードメインにインフレームで融合された膜貫通ドメインを含む融合タンパク質をコードし、前記膜貫通ドメインが、細胞膜中への融合タンパク質の挿入が起こると、融合タンパク質を細胞膜に固定し、同時にレポータードメインを細胞表面で発現する、遺伝子発現構築物;及び(ii)放射性標識物質で標識されたレポーターペプチドを含み、前記レポータードメインが、スプリットルシフェラーゼの大型ポリペプチドサブユニットを含み、且つ前記レポーターペプチドが、前記スプリットルシフェラーゼの小型ペプチドサブユニットを含み、両方のサブユニットが補完によって会合してルシフェラーゼ複合体を形成する、レポーター系を提供する。
Description
本発明は、医学、特に、遺伝子療法治療及び細胞療法治療の分野に属する。本発明は、とりわけ、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法において、T細胞等の細胞をそれらの輸注後に追跡するための作製物及び方法を提供する。本発明は更に、全体として、腫瘍溶解性ウイルス療法及び他の遺伝子/細胞療法において使用するための作製物及び方法も提供する。
T細胞療法又は腫瘍溶解性ウイルス療法等の新規な療法の前臨床開発及び早期臨床開発は、治療目的のために対象に細胞又はウイルスを輸注した後のそれらに対する信頼性の高い追跡方法の恩恵を大きく受ける。分子療法及び細胞療法のイメージングは、治療応答の変動、新しい治療戦略の有効性を理解するため、及び患者安全性モニタリングのために不可欠である。in vivoイメージングは、いくつかの独自の特徴を有することが示されており、この特徴により、実験系においてがんに対する一次免疫応答を追跡するため、及び小動物から得られた結果を患者に置き換えるための理想的なアプローチになっている。in vivoイメージングは非侵襲性であり、全身の情報をもたらし、動的イメージングによって動態学的情報を提供し、且つ標準化を可能にする。
1つの上首尾な追跡方法は、mAbイメージングとも呼ばれる免疫陽電子放出断層撮影(PET)を含み、この撮影法では、特定の細胞表面マーカー又は受容体を標的とし放射性核種で標識されたモノクローナル抗体を用いて細胞がモニターされる。例えば、免疫PETは、患者体内のCD8陽性腫瘍浸潤リンパ球(TIL)をin vivoで可視化することを可能にするために使用できる。in vivoイメージング研究により、このようなCD8+ TILが前臨床固形腫瘍モデルにおけるT細胞治療に関する予測値を与えることが示されている。
別の追跡方法は、内因性又は異種発現されたレポーター遺伝子を利用してもよい。ヒトナトリウム・ヨウ素共輸送体(hNIS)(2.2Kb)は、CAR T細胞療法の臨床モニタリングにおいてレポーター遺伝子として使用することができ、その際、形質導入されたT細胞における共輸送体活性が、SPECTイメージングによってテクネチウム-99m過テクネチウム酸(99mTcO4-)プローブの細胞内蓄積として可視化される。PETイメージングもまた、124Iプローブを用いる場合にこのような方法において支援される。
NISレポーター遺伝子系は免疫原性が低いために有利であるが、その使用には制限がある。例えば、これは、甲状腺、胃、唾液腺、乳腺、及び時として乳房細胞において天然に発現される。更に、トレーサープローブが捕捉されずに流出する場合があり、その結果、イメージングの時間枠が短くなる。最も重要なことには、NISレポーター遺伝子は比較的長く、そのため、治療用の細胞又はウイルスへの容易なクローニングが妨げられる。
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したがって、小型でクローニングが容易であり、且つ細胞内で発現させることができる、より特異的なPET/SPECTレポーターに対する要求はまだ満たされていない。
本発明は、レポーター遺伝子発現に基づく核イメージングのための作製物及び方法であって、レポーター遺伝子が核プローブに高い親和性で特異的に結合し、有利な点として、レポーター遺伝子が短く、遺伝子療法で使用される治療用のウイルスベクター中又は細胞療法で使用される細胞中に、PET/SPECTを用いてこれらの療法をモニターする目的のために容易にクローニングできる、作製物及び方法を提供する。
本明細書において説明される作製物及び方法は、細胞プロセス及び分子プロセスが調査され、それらがレポーター遺伝子の発現に関連付けられる、間接的イメージングの系を提供する。現在利用可能なPET/SPECTレポーター遺伝子及び他の間接的な細胞標識方法と比較して、本発明は独特であり、高度に特異的である。
本発明の1つの独特な利点は、レポーター遺伝子が、PET/SPECTイメージングに加えてバイオルミネセンス(BL)イメージングも支援することである。したがって、ハイブリッドBL/PET/SPECTレポーター遺伝子は、診断/予後状況での細胞追跡方法又は治療方法において、(コンパニオン)診断物質としても、又は治療物質としても、適用されうる。
本発明は次に、第1の態様において、以下:
- 細胞内でレポーター遺伝子を発現させるための遺伝子発現構築物であって、前記レポーター遺伝子が、レポータードメインにインフレームで融合された膜貫通ドメインを含む融合タンパク質をコードし、前記膜貫通ドメインが、細胞膜中への融合タンパク質の挿入が起こると、融合タンパク質を細胞膜に固定し、同時にレポータードメインを細胞表面で発現する、遺伝子発現構築物;
- 放射性標識物質で標識されたレポーターペプチド;を含み、
前記レポータードメインは、スプリットルシフェラーゼの大型ポリペプチドサブユニットを含むか、好ましくはそれからなり、且つ前記レポーターペプチドは、前記スプリットルシフェラーゼの小型ペプチドサブユニットを含むか、好ましくはそれからなり、その際、両方のサブユニットが補完によって会合して(好ましくは発光性の)ルシフェラーゼ複合体を形成する、レポーター系を提供する。
- 細胞内でレポーター遺伝子を発現させるための遺伝子発現構築物であって、前記レポーター遺伝子が、レポータードメインにインフレームで融合された膜貫通ドメインを含む融合タンパク質をコードし、前記膜貫通ドメインが、細胞膜中への融合タンパク質の挿入が起こると、融合タンパク質を細胞膜に固定し、同時にレポータードメインを細胞表面で発現する、遺伝子発現構築物;
- 放射性標識物質で標識されたレポーターペプチド;を含み、
前記レポータードメインは、スプリットルシフェラーゼの大型ポリペプチドサブユニットを含むか、好ましくはそれからなり、且つ前記レポーターペプチドは、前記スプリットルシフェラーゼの小型ペプチドサブユニットを含むか、好ましくはそれからなり、その際、両方のサブユニットが補完によって会合して(好ましくは発光性の)ルシフェラーゼ複合体を形成する、レポーター系を提供する。
本発明の系の好ましい実施形態において、前記レポータードメインは、スプリットルシフェラーゼの大型ポリペプチドサブユニットからなり、前記レポーターペプチドは、前記スプリットルシフェラーゼの小型ペプチドサブユニットからなる。
本発明の系の別の好ましい実施形態において、小型ペプチドサブユニットは、前記スプリットルシフェラーゼの大型ポリペプチドサブユニットに対して高い親和性を有する。本明細書において使用される場合、「高い親和性」という用語は、生理的条件又はアッセイ条件下で検出可能な複合体の形成を引き起こすのに十分な強さを有する、2つの実体の間の分子間相互作用を意味する。本明細書において使用される「高い親和性」という用語は、2つのサブユニットが0.1μM未満、より好ましくは10nM未満、更により好ましくは1nM未満、更により好ましくは0.1nMから1nMの間、更により好ましくは0.5nMから1nMの間であるKdで会合したことを意味する。
本発明の系の別の好ましい実施形態において、スプリットルシフェラーゼは、ホタル(フォチナス・ピラリス(Photinus pyralis))ルシフェラーゼ(FLuc)、コメツキムシ(例えば、ピロフォラス・プラギオフタラマス(Pyrophorus plagiophthalamus))ルシフェラーゼ、ガウシア(Gaussia)(例えば、ガウシア・プリンセプス(Gaussia princeps))ルシフェラーゼ(GLuc)、ウミシイタケ(Renilla)(例えば、レニラ・レニフォルミス(Renilla reniformis))ルシフェラーゼ(RLuc)、オプロフォラス(Oplophorus)(例えば、オプロフォラス・グラシリロストリス(Oplophorus gracilirostris))ルシフェラーゼ(OLuc;NanoLuc)、及び細菌ルシフェラーゼ(Lux)から選択されうる。最も好ましくは、スプリットルシフェラーゼは好ましくはNanoLucである。
本発明の系の更に別の好ましい実施形態において、レポーターペプチドは、9～30個のアミノ酸残基の長さを有する。好ましくは、レポーターペプチドの長さは、10個から25個の間のアミノ酸である。例えば、11～22個のアミノ酸。好ましくは、レポーターペプチドは血液中で切断されない。
本発明の系の更に別の好ましい実施形態において、大型ポリペプチドサブユニットは、配列番号48のアミノ酸配列又は配列番号48に対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記配列同一性は、アミノ酸配列の全長に対して測定され、配列番号48に対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する前記アミノ酸配列は、好ましくは高い結合親和性でレポーターペプチドに結合し、その際の解離定数Kdは、0.1μM未満、より好ましくは10nM未満、更により好ましくは1nM未満、更により好ましくは0.1nMから1nMの間、更により好ましくは0.5nMから1nMの間である。
本発明の系の更に別の好ましい実施形態において、小型ペプチドサブユニットは、配列番号28～46のいずれかのアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。
本発明の系の更に別の好ましい実施形態において、レポータードメインは、そのC末端において前記膜貫通ドメインに融合されている。
本発明の系の更に別の好ましい実施形態において、膜貫通ドメインは、タンパク質PDGFR、CD8、B7タンパク質、TLR4、CD4、ニューレキシン3b、Notch受容体ポリペプチド、CD28、CD137(41BB)、CD3C、及び他の短縮されたヒトI型及びII型膜貫通型タンパク質の膜貫通ドメインから選択され、(表面発現の促進のために働きうる)前記タンパク質の細胞質内ドメインと場合によっては組み合わされ、好ましくは、前記膜貫通ドメインは、配列番号1～11からなる群から選択される配列を含む。
本発明の系の更に別の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、好ましくはN末端において、膜貫通ドメインにインフレームで融合されたリーダーペプチドを更に含む。リーダー配列は、好ましくは、(細胞膜に融合タンパク質を導くために働きうる)シグナルペプチドを含むか、又はシグナルペプチドである。レポーター遺伝子中のリーダー配列は、好ましくは、膜貫通ドメイン配列の開始コドンのすぐ上流(5')に位置しているか、又は開始コドンを含んでもよい。リーダー配列は、好ましくは、(細胞膜に融合タンパク質を導くために働きうる)シグナルペプチドをコードする。リーダー配列は、好ましくは、限定されるわけではないが、ヒト又はマウスのIgK、CD8、OSM、IgG2 H、BM40、Secrecon、IgKVIII、CD33、tPA、キモトリプシノーゲン、トリプシノーゲン-2、IL-2、アルブミン(HSA)、及びインスリンのリーダー配列からなる群から選択され、好ましくは、前記リーダー配列は、配列番号12～26からなる群から選択される配列を含む。
本発明の系の更に別の好ましい実施形態において、遺伝子発現構築物は、プロモーター又はポリA配列等の調節エレメントを更に含む。
本発明の系の更に別の好ましい実施形態において、レポーターペプチドは、好ましくはキレート剤を介してレポーターペプチドに結合されている放射性標識物質を含む。好ましくは、キレート剤は、リンカーを介してレポーターペプチドに結合されている。
本発明の系の好ましい実施形態において、放射性標識物質は、51Cr、52Fe、52mMn、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、77As、89Zr、90Y、97Ru、99Tc(例えば99mTc)、105Rh、109Pd、111In、111Ag、113mIn、121Sn、124I、127Te、142Pr、143Pr、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、161Tb、165Dy、166Ho、169Er、169Yb、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、203Pb、11C、18F、15O、及び13Nから選択される。
本発明の系の著しく好ましい実施形態において、放射性標識物質は111Inである。
本発明の系の別の著しく好ましい実施形態において、キレート剤は、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N,N",N'"-四酢酸(DOTA)である。
本発明の系の著しく好ましい実施形態において、リンカーは6-アミノヘキサン酸(6ahx)である。
本発明の系の好ましい実施形態において、リンカーは、バリン残基を介してレポーターペプチドに連結される。
本発明の系の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、細胞表面でレポータードメインを提示するように操作される。
本発明の系の好ましい実施形態において、遺伝子発現構築物はベクター中に含まれる。ベクターは、好ましくは、本明細書において説明されるレポーター遺伝子をコードする転写単位に作動可能に連結されたプロモーターを含み、好ましくは、その際、レポーター遺伝子は真核生物シグナル配列に作動可能に連結されている。
本発明の系の更に好ましい実施形態において、ベクターは、組換え細胞、好ましくはT細胞中に含まれる。
本発明の系の代替の好ましい実施形態において、ベクターはウイルスゲノム中に含まれ、ウイルスゲノムとしては、アデノウイルス(adenovirus)、レオウイルス(reovirus)、麻疹ウイルス(measles virus)、単純ヘルペスウイルス(herpes simplex virus)、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス(vaccinia virus)、セネカウイルス(senecavirus)、エンテロウイルス(enterovirus)RIGVIR、セムリキ森林ウイルス(semliki forest virus)、水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)、及びポリオウイルス(poliovirus)等の腫瘍溶解性ウイルスのゲノム、又はレトロウイルス(retrovirus)若しくはレンチウイルス(lentivirus)等の細胞形質転換のためのウイルスのゲノムが挙げられる。
別の態様において、本発明は、スプリットルシフェラーゼの小型ペプチドサブユニットを含むレポーターペプチドであって、小型ペプチドサブユニットは前記スプリットルシフェラーゼの大型ポリペプチドサブユニットと補完によって会合してルシフェラーゼ複合体を形成し、小型ペプチドサブユニットは大型ポリペプチドサブユニットに対して高い親和性を有し、レポーターペプチドは、9～30個のアミノ酸残基の長さを有し、且つ前記レポーターペプチドは、PET又はSPECTで使用するのに適していることが好ましい放射性核種で標識されており、前記放射性核種はキレート剤及びリンカーを介して前記レポーターペプチドに結合されていることが好ましい、レポーターペプチドを提供する。
スプリットルシフェラーゼは、好ましくは、ホタル(フォチナス・ピラリス)ルシフェラーゼ(FLuc)、コメツキムシ(例えば、ピロフォラス・プラギオフタラマス)ルシフェラーゼ、ガウシア(例えば、ガウシア・プリンセプス)ルシフェラーゼ(GLuc)、ウミシイタケ(例えば、レニラ・レニフォルミス)ルシフェラーゼ(RLuc)、オプロフォラス(例えば、オプロフォラス・グラシリロストリス)ルシフェラーゼ(OLuc;NanoLuc)、及び細菌ルシフェラーゼ(Lux)から選択され、好ましくは、スプリットルシフェラーゼはNanoLucである。
本発明のレポーターペプチドの好ましい実施形態において、レポーターペプチドの長さは、10個から25個の間のアミノ酸である。例えば、11～22個のアミノ酸。好ましくは、レポーターペプチドは血液中で切断されない。
本発明のレポーターペプチドの好ましい実施形態において、放射性標識物質は、51Cr、52Fe、52mMn、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、77As、89Zr、90Y、97Ru、99Tc(例えば99mTc)、105Rh、109Pd、111In、111Ag、113mIn、121Sn、124I、127Te、142Pr、143Pr、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、161Tb、165Dy、166Ho、169Er、169Yb、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、203Pb、11C、18F、15O、及び13Nから選択される。好ましくは、放射性標識物質は111Inである。
本発明のレポーターペプチドの好ましい実施形態において、キレート剤は、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N,N",N'"-四酢酸(DOTA)である。
本発明のレポーターペプチドの好ましい実施形態において、リンカーは、6-アミノヘキサン酸(6ahx)である。
本発明のレポーターペプチドの好ましい実施形態において、レポーターペプチドは、配列番号28～46のいずれか1つの配列を含み、好ましくはそれからなる。
別の態様において、本発明は、本発明のレポーターペプチドを含む、対象の体内に輸注するための薬学的組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明のレポーター系の遺伝子発現構築物を含むベクター又は組換え細胞を含む、対象の体内に輸注するための薬学的組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、以下:
- 本発明のレポーター系の遺伝子発現構築物を含むベクター又は組換え細胞を含む、対象の体内に輸注するための薬学的組成物、及び
- 本発明のレポーターペプチドを含む薬学的組成物
を含む、対象の体内に同時に、別々に、又は逐次的に輸注するための薬学的組合せを提供する。
- 本発明のレポーター系の遺伝子発現構築物を含むベクター又は組換え細胞を含む、対象の体内に輸注するための薬学的組成物、及び
- 本発明のレポーターペプチドを含む薬学的組成物
を含む、対象の体内に同時に、別々に、又は逐次的に輸注するための薬学的組合せを提供する。
別の態様において、本発明は提供する。
本明細書において上記に示された本発明の態様における「薬学的組成物」という用語は、「診断用組成物」という形をとってもよく、このことから、この組成物の目的が治療的というよりはむしろ診断的であることが示唆される。
本発明はまた、それを必要とする対象に、治療的又は診断的に有効な量の本発明によるレポーター系又は本発明の薬学的組合せを投与する工程を含む、疾患を治療するため又は疾患治療をモニターするための方法も提供する。
本発明のレポーター系を用いて治療又はモニターされる疾患候補としては、腫瘍溶解性ウイルス又は(CAR)T細胞を用いるがん療法を挙げることができる。
別の態様において、本発明は、本発明によるレポーター系の遺伝子発現構築物によって形質導入された細胞、好ましくはヒト細胞又は動物細胞、より好ましくは非ヒト哺乳動物細胞を提供する。
「レポーター遺伝子」という用語は、本明細書において使用される場合、「プローブ」を用いて容易にその発現が定量可能又は観察可能であるレポータータンパク質をコードする遺伝子を意味する。遺伝子調節は転写段階で起こることが通常であるため、転写調節及びプロモーター活性は、遺伝子産物の定量に基づいて評価されることが多い。本発明の態様において、レポーター遺伝子は、とりわけ、外部から供給されるプローブによって認識される、細胞表面に提示されるタンパク質ドメイン(レポータードメイン)をコードし、外部から供給されるプローブは、高親和性のタンパク質断片補完によってレポータータンパク質のレポータードメインと結合する標識されたペプチド(レポーターペプチド)で構成されている。
NanoLucルシフェラーゼ補完アッセイ等のタンパク質-断片補完アッセイが、LgBiTポリペプチド断片とSmBiTペプチド断片との弱い会合に基づくタンパク質-タンパク質相互作用を推測するために一般に使用されている。このアッセイの基本原理は、生物発光酵素が2つの別個の構成要素に分割され、それらが再会合し、機能的な生物発光複合体を形成する、スプリット補完アッセイに見出される。これらのアッセイの強みは、生物発光タンパク質がその天然且つ活性な構造物を形成する傾向が驚くほど強いことだけでなく、イメージング及びin vivo研究にアッセイを適用可能であることにも見出される。
本発明の態様において、レポーター遺伝子はレポータータンパク質をコードし、レポータータンパク質は、発現され、レポータータンパク質に融合された膜貫通ドメインを介して細胞の膜に固定される、スプリット生物発光タンパク質の大型断片(例えば、NanoLucの大型断片であるLgBiT)に相当する。レポータータンパク質の検出のために使用されるプローブは、スプリット生物発光タンパク質の小型補完断片に相当する小型ペプチド(例えば、NanoBiTのHiBiTペプチド)によって形成されており、スプリット生物発光タンパク質の(主にN末端の)大型断片に対して高い特異的親和性を有しており、このことは、これら2種の断片が互いに対してナノモル濃度の親和性を有することを意味する。レポーター遺伝子は、細胞において(例えば、in vitroの形質導入されたT細胞において)発現され、したがって、これらの細胞は、対象の血液循環にプローブを添加した後に、PET/SPECTイメージングによって対象においてin vivoで追跡することができる。
実験的実証として、本発明者らは、レポーター遺伝子TMLgBiT(TMは膜貫通型を表す)を発現するin vitroでトランスフェクトされたHEK-293細胞は、マウスに皮下注射された場合、111In-DOTA-6ax-HiBiTペプチドを注射することにより、1時間後にPET/SPECTイメージングによってin vivoで検出できたことを示す。
この新しいレポーター系によって、細胞療法(特にT細胞療法)を対象とする診断的イメージング及び予後イメージングが可能になる。
Hallら(ACS Chem. Biol. 2012年7月、1848～1857頁)によって発見され更に発展させられた発光タンパク質NanoLuc(登録商標)(Nluc)は、深海エビ(オプロフォラス・グラシリロストリス)ルシフェラーゼから指向性進化法によって人工的に作られた。酵素のルミネセンスは、セレンテラジン類似体の合成及びスクリーニングによって得られる新規の基質の同定を用いて最適化した。Nlucタンパク質は、19.1kDaの、単量体であり溶解性が高く安定なATP非依存性酵素である。最適な基質であるフリマジンは、ホタルルシフェラーゼ(Fluc)又はウミシイタケルシフェラーゼ(Rluc)の比活性よりも高い比活性でグロータイプのルミネセンス(半減期>2h)を生成する。Fluc(61kDa)又はRluc(36kDa)と比べてNlucのルミネセンス強度が高いこと、その溶解度が高いこと、及びそのサイズが小さいことから、Nlucはin vitroのタンパク質-タンパク質相互作用アッセイのための有力な手段であるとみなされている。
バイオルミネセンスを用いて生細胞内のタンパク質-タンパク質相互作用(PPI)を検出するための従来のルシフェラーゼ補完アッセイ(LCA)では、ルシフェラーゼの相補的DNA(cDNA)が最初にN末端断片及びC末端断片に分割され、次いで、関心対象のタンパク質ペアのcDNAに融合される。得られた組換えcDNAで関心対象の細胞を形質転換又はトランスフェクトし、組換えタンパク質のペアが細胞内で発現されるようにする。組換えタンパク質が互いに相互作用すると、スプリットルシフェラーゼの酵素活性が復元される。生細胞におけるタンパク質-タンパク質相互作用を検出する他のアッセイと比べて、これらのアッセイは、試料中のバックグラウンドシグナルが極めて少ないことから、相互作用シグナルについてのダイナミックレンジが広い。
Nlucを用いる1つのこのようなルシフェラーゼ補完アッセイが、Dixonら(ACS Chem. Biol. 2016年 11巻:400～408頁)によって説明された。NanoLuc(登録商標)バイナリーテクノロジー(NanoBiT)と呼ばれるこの系は、NanoLuc(登録商標)ルシフェラーゼを用いる2サブユニット系であり、PPIの細胞内検出に適用することができる。大型BiT(LgBiT;18kDa、配列番号47及び48)サブユニット及び小型BiT(SmBiT;11アミノ酸のペプチド)サブユニットは、関心対象のタンパク質への融合物として発現され、その際、PPIによってサブユニットの補完が促進されて明るい発光酵素が生じる。酵素又はタンパク質が単に分割される関連アプローチとは異なり、LgBiTを構造的安定性のために単独で最適化し、SmBiTは、特にPPI用途のためのペプチドライブラリーから選択した。結果として、弱い力で会合する(Kd=190μM)が、飽和時の完全長NanoLucの活性の30%を依然として維持しているサブユニットペアが生じる。多くのスプリット系とは対照的に、LgBiT:SmBiT相互作用は可逆的であることから、急速に解離するタンパク質の検出が可能である。NanoBiTレポーターアッセイが、Bottaら(J Biol Chem. 2019年 294巻(45):16587～16603頁)によって、最近、開発された。この技術は、膜タンパク質複合体におけるPPIを研究するために本質的に使用されている。
「スプリットルシフェラーゼ」という用語は、どちらも、単独で利用される場合にはルミネセンスを放出しないという点で非機能性であるが、これら2つの非機能性の半部分が十分に近接するように近づけられた場合には、ドメインの補完又は再構成によってルシフェラーゼ活性が復元される、N末端ドメイン及びC末端ドメインに分割されるルシフェラーゼタンパク質と呼ぶ当技術分野において認識されている様式で本明細書において使用される。機能性酵素は、フリマジン等の適切な基質を添加すると、光の放出を示す。スプリットルシフェラーゼは、タンパク質断片補完アッセイ(PCA)技術、特に、タンパク質-タンパク質相互作用(PPI)の確認及び定量のための二分子蛍光補完アッセイ、例えばスプリットルシフェラーゼ補完アッセイ(SLCA)との関連で、周知の用語である(Paulmuruganら、Proc Natl Acad Sci USA. 2002年;99:15608～15613頁;Dengら、J Virol Methods. 2011年9月;176(1～2):108～111頁)。
このスプリットルシフェラーゼ補完アッセイの(SmBiT小型ペプチドがLgBiTに対して有する(Kd>100μM))低い親和性はPPI試験には有益でありうるが、本発明は、スプリットルシフェラーゼの大型ポリペプチド断片に対して高い親和性を有する小型ペプチドの使用に基づいている。この高親和性ペプチドは本明細書においてレポーターペプチドと呼ばれ、別の場面では補完レポーターと呼ばれうる。HiBiTペプチド(VSGWRLFKKIS[w/o Met]又はMVSGWRLFKKIS[w/Met];Dixonら、ACS Chem. Biol. 2016年11月、400～408頁;WO2016/040835)(1.3kDa)の場合、LgBiTへの結合に関するそのKdは0.7nMである。
NLucに対して高い親和性を有することが示されている他のペプチドとしては、NVSGWRLFKKISN(NLpep78;Kd=3.4nM、Dixonら、2016年)、NVTGYRLFKKISN(NLpep79;Kd=8.5nM、Dixonら、2016年)、VSGWRLFKKISN(NLpep80、Dixonら、2016年)、並びにWO2014151736A1(下記)及びWO2016040835A1に示されているもの、例えばNLpep83(w/Met)MNVSGWRLFKKISが挙げられる。結合親和性は、とりわけ、WO2014151736A1(例えば実施例26)に開示されているように測定することができる。この場合、親和性を測定しようとする結合ペア(非発光ポリペプチド及び非発光ペプチド)に、NanoGloルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega社)又はPBS+0.1%Prionex(登録商標)タンパク質安定化剤及びフリマジンを添加し、室温で10分間振盪し、その後、GloMaxを用いて0.5秒の積分時間でルミネセンスを検出し、Graphpad Prism、1部位特異的結合を用いてKd値を求めた。解離定数は様々な緩衝液条件(例えば、補完のためにPBS、次いで検出のためにNanoGlo緩衝液;補完及び検出のためにPBS;又は補完及び検出のためにNanoGlo緩衝液)のもとで、好ましくはPBS中で測定することができる。
本発明の実施形態において好ましいレポーターペプチドは、配列VSGWRLFKKIS(配列番号25)を有する11アミノ酸のHiBiTペプチドである。HiBiT及びLgBiTは、in vivoイメージングによって放射性核種を検出するための活性な結合ペアの役割を果たす安定な複合体を、効率的に形成する。
本発明の態様の著しく好ましい実施形態において、NanoBiTレポーターアッセイの有益な態様が使用される。いくつかの実施形態において、本発明は、HiBiTサブユニットに放射性標識を連結する場合があり、それによって、免疫細胞追跡のための方法を提供する。この方法は、in vivoでは容易に測定できないルシフェラーゼ活性の追跡よりも優れている。したがって、本発明者らは、本発明のいくつかの実施形態において、放射能標識されたHiBiTペプチドの使用を提案する。その理由は、LgBiTとHiBiTの間のタンパク質親和性が本質的に維持されるので、HiBiT及びLgBiTを本明細書において提案されるレポーター遺伝子系において使用できることを、本発明者らが驚くべきことに発見したことにある。利点は、LgBiTサブユニットが小型(わずか0.8kb)でクローニングが容易であり、放射能標識されたHiBiTサブユニットと組み合わさって、マルチモーダル且つ高度に特異的なイメージングを可能にすることである。現在では、膜貫通LgBiTを発現するT細胞を作製でき、放射性標識されたSmBitを単に添加するだけでT細胞をin vivoで追跡できることが示されている。
したがって、本発明は、例えばT細胞療法においてT細胞を追跡する際に有用である診断的イメージング及び予後イメージングのための方法を提供する。輸注後の細胞又は腫瘍溶解性ウイルスの追跡はまた、前臨床研究で使用されるような動物試験にも応用される。
本発明の方法は、非侵襲性のin vivoイメージングを可能にし、全身情報を与える。PETイメージングは、例えば、124Iトレーサーを用いて実施してもよく、一方、単光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)は、例えば99mTcO4を用いて実施してもよい。融合タンパク質のレポータードメインと共に再構成されたペプチドレポーターの生物発光態様を、同時に使用してもよい。
本発明によって提案されるBL/PET/SPECTレポーター遺伝子は、小さいことが有益であり、クローニングが容易であり、マルチモーダル且つ高度に特異的なイメージングを可能にする。SPECT法は、細胞療法、特に、T細胞療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、及び一般的な遺伝子療法(ナノ粒子等)の診断的/予後イメージングのために使用することができる。本発明者らは、(場合によってはキレート剤に連結されている)高親和性レポーターペプチドが放射性標識トレーサーとして使用される場合に、新しいレポーター遺伝子が、SPECT/PETイメージングのための特異的レポーター遺伝子の役割を果たしうることを発見した。本明細書の1つの実施形態において説明されるように、例示的なTMLgBiT及びDOTA-リンカー-HiBiTペプチドは、in vivoでのSPECT/PETイメージングのための新しい系の1つの実施形態に相当し、且つ本発明の態様において好ましい実施形態に相当する。
本発明者らによって構想されるように、本発明の代案の実施形態は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために一般に使用される様々なタイプのルシフェラーゼに基づいてもよく、例として、FLucとして公知であるホタル(フォチナス・ピラリス)ルシフェラーゼ、RLucとして公知であるウミシイタケ(レニラ・レニフォルミス)ルシフェラーゼ、GLucとして公知であるカイアシ(ガウシア・プリンセプス)ルシフェラーゼ、それぞれCBR及びELucとして公知であるコメツキムシ(P.プラギオフタラマス及びクラトモルファス・ディスティンクタス(Cratomorphus distinctus)ルシフェラーゼ、又はNanoLuc若しくはNLucとして公知である深海エビ(オプロフォラス・グラシリロストリス)ルシフェラーゼが挙げられる。本発明は、ルシフェラーゼの酵素的特徴に基づいていない。正しくは、本発明の本質的要素は、NanoLucの場合について本明細書において例示されるように、ルシフェラーゼのメインサブユニットを補完するルシフェラーゼの小型ペプチドサブユニットの存在に関する。例えば、細胞において発現され、好ましくは膜貫通型として発現される大型ペプチドを含み、且つ放射性標識することができる小型サブユニットペプチドを含む、他のルシフェラーゼに由来するルシフェラーゼ補完サブユニットを使用してもよい。小型サブユニットペプチドは、20アミノ酸より長い、例えば22～25アミノ酸であってもよい。本明細書において説明されるLgBiT及びHiBiTの代替物であるこのような組合せは、本発明の実施形態として構想され、その際、好ましくは、放射性標識されたレポーターペプチドは、約30アミノ酸以下であり、好ましくは血液中で切断されない。
本発明のレポーターは、膜貫通型融合タンパク質として発現され、その際、レポータードメインが細胞外部分であり、任意の膜貫通ドメインが、細胞の外側にレポータードメインを提示するために使用される。融合タンパク質の膜貫通ドメインが、細胞表面にレポータードメインを保持することを可能にする。「膜貫通ドメイン」という用語は、本明細書において使用される場合、自己安定化し、且つ残りの部分から独立して折り畳まれる、タンパク質のポリペプチド鎖の一領域としての任意の膜貫通タンパク質ドメインを意味する。「膜貫通ドメイン」は、この用語が本明細書において使用される場合、細胞膜貫通タンパク質の任意の部分を含む。タンパク質の膜貫通ドメインは、共通の構造的特徴、例えば、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン等の疎水性アミノ酸21～26個からなるαヘリックスストレッチを共有しうる。「膜貫通の」という用語は、本明細書において使用される場合、細胞の形質膜と結合し、細胞内ドメイン又は細胞質内ドメインから細胞外ドメイン又は細胞外部のドメインまで延びる、タンパク質(本明細書においてポリペプチドとも呼ばれる)を意味する。したがって、レポータードメインは、好ましくは、そのC末端において膜貫通ドメインに融合されている。
膜貫通ドメインは、天然供給源又は合成供給源のいずれかに由来しうる。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合型又は膜貫通型のタンパク質に由来しうる。本明細書における目的のために特に有用な膜貫通領域は、以下の群から選択されるメンバーに由来しうる(すなわち、これらの少なくとも膜貫通領域を含む):T細胞受容体のα鎖、β鎖、又はζ鎖;CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、及びCD154。別法として、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、膜貫通ドメインは、ロイシン及びバリン等の疎水性残基を主に含むと考えられる。別の実施形態において、膜貫通ドメインは、合成の膜貫通ドメインの各端部に、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンの三つ組を含む。
本発明の好ましい実施形態において、融合タンパク質の膜貫通部分は、例えば、PDGFR膜貫通ドメインを含んでもよい。本発明の代替の好ましい実施形態において、レポータードメインは、本発明の融合タンパク質の膜貫通ドメインとしての、例えばCD8のAA183～203に対応する、CD8の膜貫通ドメインに、又はCD4、ニューレキシン3b、Notch受容体ポリペプチド、CD28、CD137(41BB)、CD8α、又はCD3Cの膜貫通ドメインに、融合されてもよい。レポータードメインが細胞外部の放射性標識されたレポーターペプチドと細胞外部で相互作用することが可能である限り、他の様々な膜貫通型のキャリアペプチド又はキャリアタンパク質が、レポータードメインを細胞外に発現させるための融合タンパク質の膜貫通ドメインとして使用されてもよい。
好ましい実施形態において、融合タンパク質は、好ましくは融合タンパク質中の膜貫通ドメインのN末端において融合された、リーダー配列を更に含む。このようなリーダー配列は、融合産物の膜指向性発現を引き起こす任意の適切なリーダー配列から選択されうる。適切なリーダー配列としては、例えば、LgBiTペプチドサブユニットのN末端に融合されたマウスIgK鎖リーダー配列を挙げることができる。或いは、ヒトCD8リーダー配列が使用されてもよく、これも好ましくは同様に、LgBiTペプチドサブユニットのN末端に融合されている。LgBiTペプチドサブユニットのN末端に位置する別の代替リーダー配列は、限定されるわけではないが、ヒトOSM、マウスIgΚ、ヒトIgG2 H、BM40、Secrecon、ヒトIgKVIII、CD33、tPA、ヒトキモトリプシノーゲン、ヒトトリプシノーゲン-2、ヒトIL-2、アルブミン(HSA)、及びヒトインスリンのリーダー配列からなる群から選択されてもよい。
本発明の態様におけるレポーターペプチドは、好ましくは、細胞において発現されない。本発明の態様におけるレポーターペプチドは、好ましくは、本明細書において説明される融合タンパク質を発現する組換え細胞を与えられる対象にin vivoで投与される。
本発明の態様におけるレポーターペプチドは、好ましくは、放射性標識される。「放射性標識物質」という用語は、本明細書において使用される場合、放射性核種への言及を含む。特定の態様において、標識は、「放射線不透過性」標識、例えば、X線を用いて容易に可視化できる標識であってもよい。放射線不透過性物質は、当業者には周知である。最も一般的な放射線不透過性物質としては、ヨウ化物塩、臭化物塩、又はバリウム塩が挙げられる。他の放射線不透過性物質もまた公知であり、限定されるわけではないが、有機ビスマス誘導体、放射線不透過性ポリウレタン、有機ビスマス複合物、放射線不透過性バリウムポリマー複合体等が挙げられる。好ましい放射性標識物質としては、例えば、放射性標識及び/又はMRI、NMR、PET等によって検出される標識が挙げられる。著しく好ましい放射性標識物質としては、限定されるわけではないが、51Cr、52Fe、52mMn、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、77As、89Zr、90Y、97Ru、99Tc、105Rh、109Pd、111In、111Ag、113mIn、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、161Tb、165Dy、166Ho、169Er、169Yb、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、及び203Pbが挙げられる。特定の有用なPET標識としては、限定されるわけではないが、11C、18F、15O、13N等が挙げられる。MRIで使用される一般的な標識としては、限定されるわけではないが、ガドリニウムキレート、及び様々な表面修飾を施した酸化鉄のナノ粒子又は微小粒子が挙げられる。ガドペンテト酸ジメグルミン等のガドリニウムキレートが、最も広く使用されている常磁性の造影剤である。酸化鉄粒子は、超常磁性MRIコントラスト剤のクラスの一部である。これらの化合物は、典型的には磁鉄鉱(酸化鉄)コアからなり、デキストラン若しくはシロキサンで被覆されるか、ポリマーによって封入されるか、又は更に修飾される。
放射性標識物質は、好ましくは、キレート剤を用いてレポーターペプチドに結合される。これを目的として、本発明の態様におけるレポーターペプチドは、好ましくは、レポーターペプチドへの放射性標識物質の結合を可能にするためにキレート剤に(配位結合の形成を介して)結合される。キレート基は、当業者に周知である。特定の態様において、キレート基は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、シクロヘキシル1,2-ジアミン四酢酸(CDTA)、エチレングリコール-O,O'-ビス(2-アミノエチル)-N,N,N',N'-四酢酸(EGTA)、N,N-ビス(ヒドロキシベンジル)-エチレンジアミン-N,N'-二酢酸(HBED)、トリエチレンテトラミン六酢酸(TTHA)、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N",N"'-四酢酸(DOTA)、ヒドロキシエチルジアミン三酢酸(HEDTA)、1,4,8,11-テトラ-アザシクロテトラデカン-N,N',N",N"'-四酢酸(TETA)、置換されたDTPA、置換されたEDTA等に由来する。いくつかの好ましいキレート剤の例としては、置換されていないか、又は置換されている、2-イミノチオラン及び2-イミノチアシクロヘキサン、特に、2-イミノ-4-メルカプトメチルチランが挙げられる。1つのキレート剤、すなわち1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N,N",N'"-四酢酸(DOTA)は、いくつかの診断的及び治療的に重要な金属、例えば放射性核種及び放射性標識物質をキレート化する能力があるため、特に好ましい。著しく好ましいキレート剤としては、DOTA及びその誘導体、cb-do2a、tcmc、TETA、CB-TE2A、CB-TE1A1P、DIAMSAR、NOTA及びその誘導体、NETA、NETA-モノアミド、TACN_TM、DOTAGA、NODAGA、DTPA、CHX-A-DTPA、TRAP、AAZTA、H2dedpa、h4octapa、h2decapa、H2azapa、HBED、SHBED、BPCA、CP256、DFO、PCTA、p-SCN-Bn-DFO296、p-SCN-Bn-H6phospa、HEHA、及びPEPAが挙げられる。
キレート剤は、次に、レポーターペプチドに直接的に結合されてもよいが、好ましくは、リンカーを用いてレポーターペプチドに結合される。「リンカー」又は「連結剤」とは、本明細書において使用される場合、2つ以上の分子を連結するために使用される分子であり、スペーサーと呼ばれる場合もある。特定の態様において、リンカーは、典型的には、両方の分子に対して共有結合を形成する能力を有する。連結剤は、当業者に周知である。本発明の好ましい態様において、リンカーとしては、限定されるわけではないが、6-アミノヘキサン酸(6ahx)、4-アミノ酪酸(GABA)、(2-アミノエトキシ)酢酸(AEA)、PEG2スペーサー(8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸)、PEG3スペーサー(12-アミノ-4,7,10-トリオキサドデカン酸)、PEG4スペーサー(15-アミノ-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸)、5-アミノ吉草酸(Ava)、β-アラニン、及びTtds(トリオキサトリデカン-スクシンアミド酸)が挙げることができる。直接的に結合した場合又はリンカーとして6ahxを用いた場合、これらによって(融合)ペプチド間の親和性が増大したことから、非常に良好な結果が得られている。リンカーは、レポーターペプチドのバリン残基に結合されることが好ましく、これは、この結合が、レポーターペプチドと融合タンパク質のレポータードメインとの相互作用(再構成)に与える影響が最も小さいからである。
或いは、又は更に、キレート剤とレポーターペプチドの間のリンカーは、非共有結合性のアルブミン結合リガンドを含んでもよく、又はそれからなってもよい。このようなリンカーは、放射性標識されたレポーターペプチドの循環血中半減期を延長しうる。このようなリガンドの非限定的な例は、とりわけ、Zorziら 2019年(Med. Chem. Commun. 10、1068頁)において提供されており、具体的には、表1～3のアルブミン結合分子、並びに文献中の図2～図4のアルブミン結合低分子有機化合物、アルブミン結合ペプチドリガンド、及びアルブミン結合タンパク質リガンドであり、これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれている。
次いで、好ましくはキレート化され放射性標識されたレポーターペプチドを、生きている対象にトレーサーとして好ましくは注射し、本明細書において説明される融合タンパク質を発現する細胞と相互作用させる。
本発明の態様における放射性標識されたレポーターペプチドの著しく好ましい実施形態は、[111In]-DOTA-6ahx-HiBiTである。
融合タンパク質のレポータードメインとレポーターペプチドとの適切な再構成は、ルシフェリンを主成分とする適切な発光性基質、すなわちd-ルシフェリン(FLuc、CBR、及びELuc)、セレンテラジン又はその誘導体若しくは類似体、例えば、フリマジン(RLuc、GLuc、及びNanoLuc)を用いてルミネセンス生成をin vitroで検査することにより、確認することができる。
本発明は、とりわけ、細胞療法(例えばCAR T細胞又はTCR T細胞)に応用される。キメラ抗原受容体(CAR)T細胞は、免疫療法において使用するための人工的T細胞受容体を産生するように遺伝子操作されたT細胞である。CARは、特定のタンパク質を標的とする新しい能力をT細胞に与えるように操作された受容体タンパク質である。この受容体は、抗原結合機能とT細胞活性化機能の両方を単一の受容体にまとめているという点で、キメラ的である。CAR-T 免疫療法の前提は、より効果的にがん細胞を標的とし破壊するために、がん細胞を認識するようにT細胞を改変することである。
CAR T細胞療法では、T細胞を患者から採取し、特殊なCARを発現するように形質転換し、このCARは、形質転換されたT細胞が腫瘍表面に存在する抗原を標的とするようにプログラムする。CAR-T細胞は、患者自身の血液中のT細胞に由来してもよく(自己由来)、又は別の健常なドナーのT細胞に由来してもよい(同種異系)。続いて、形質転換されたT細胞を患者に輸注して、患者の腫瘍を攻撃させる。CAR-T細胞を患者に輸注した後、CAR-T細胞は、がん細胞に対抗する「生きた薬物」として作用する。CAR-T細胞は、細胞上の標的抗原と接触すると、それに結合し、活性化され、次いで、増殖し始めて細胞障害性になる。CAR-T細胞は、いくつかの機序を介して細胞を破壊し、これらの機序には、刺激された細胞の大規模な増殖、他の生細胞に対するCAR-T細胞の毒性度(細胞障害性)を高めること、並びにサイトカイン、インターロイキン、及び増殖因子等の、他の細胞に影響を及ぼすことができる因子の分泌増大を引き起こすことが含まれる。
本発明者らは、以下に、これらのCAR T細胞中に、又は他の治療的細胞療法の細胞内に、治療的細胞のin vivoでの放射性核種イメージングを可能にする本発明のレポーター遺伝子を含めることを提案する。「放射性核種イメージング」という用語は、本明細書において使用される場合、対象の体内に導入されたトレーサーの減衰が原因で放出される光子を、研究中の対象の体外に配置された(ガンマ)放射線検出器を用いて検出することによって、対象の体内(組織内)の放射性トレーサーの分布を推測する非侵襲性技術を意味する。
本発明者らが予見する放射性核種イメージングのための1つの様式は、陽電子放出断層撮影法を含む。「陽電子放出断層撮影法」又は「PET」という用語は、本明細書において使用される場合、現在広く使用されている2つの主要な核イメージング技術のうちの1つを意味し、陽電子放射体で標識されたトレーサーの三次元分布が測定される。捕捉は、対象を囲んで並べられた検出器のセットを用いて実施される。陽電子放射体は、放射性同位体(例えば11C、13N、15O、18F)である。
本発明者らが予見する放射性核種イメージングのための別の様式は、単光子放射型コンピュータ断層撮影法を含む。「単光子放射型コンピュータ断層撮影法」又は「SPECT」という用語は、本明細書において使用される場合、現在広く使用されている2つの主要な核イメージング技術のうちの1つを意味し、イメージングは、ガンマ線を用いて複数の角度から映像を取得することによって実施される。心臓を目的とする場合、180度の円弧が好ましい。ガンマカメラの視野(FOV)によってカバーされるすべての軸方向の場所に対して横断面画像を作成し、結果として、3Dのデータセットを形成する2D画像の積み重ねを得る。この技術は、例えば、血流への注射によって、ガンマ線を放出するラジオアイソトープ(放射性核種)を患者体内に送達することを必要とする。本発明の態様において、ラジオアイソトープは、トレーサー分子を提供するために小型ペプチドに結合される。SPECTにおいて使用するための放射性核種としては、例えば99Y又は111Inが挙げられる。他の例は、本明細書において以下に提供される。「放射性核種イメージング」という用語は、本明細書において使用される場合、ハイブリッドイメージングシステム(例えばPET/CT、SPECT/CT、及びPET/MR)への言及も含む。
本発明の他の詳細は、その主題を作り使用するための具体的な方法及び技術を含み、以下に説明される。
発現構築物及び形質転換
「ベクター」という用語は、担体核酸分子を意味するために使用され、この担体核酸分子中に、核酸配列を複製できる場となる細胞中に導入するために該核酸配列を挿入することができる。核酸配列は「外因性」であってもよく、「外因性」は、ベクターが導入される細胞にとって該配列が外来であること、又は該配列が、細胞中のある配列と相同であるものの通常は該配列が存在しない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス)、並びに人工染色体(例えばYAC)が挙げられる。当業者には、標準的な組換え技術(例えば、Maniatisら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor、1990年)及びAusubelら、1994年、Current Protocols In Molecular Biology (John Wiley & Sons、1996年)を参照されたい。どちらも参照により本明細書に組み込まれている)を用いてベクターを構築する能力が充分に備わっているであろう。
「ベクター」という用語は、担体核酸分子を意味するために使用され、この担体核酸分子中に、核酸配列を複製できる場となる細胞中に導入するために該核酸配列を挿入することができる。核酸配列は「外因性」であってもよく、「外因性」は、ベクターが導入される細胞にとって該配列が外来であること、又は該配列が、細胞中のある配列と相同であるものの通常は該配列が存在しない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス)、並びに人工染色体(例えばYAC)が挙げられる。当業者には、標準的な組換え技術(例えば、Maniatisら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor、1990年)及びAusubelら、1994年、Current Protocols In Molecular Biology (John Wiley & Sons、1996年)を参照されたい。どちらも参照により本明細書に組み込まれている)を用いてベクターを構築する能力が充分に備わっているであろう。
「発現ベクター」という用語は、RNAをコードする転写可能な核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物を意味する。いくつかの場合において、RNA分子は、次に、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。他の場合において、例えばアンチセンス分子又はリボザイムを生じる際には、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、様々な「制御配列」を含むことができ、「制御配列」は、作動可能に連結されたコード配列を特定の宿主細胞において転写し、場合によっては翻訳するのに必要な核酸配列を意味する。転写及び翻訳を管理する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、他の機能を果たすヌクレオチド配列もまた含んでもよい。
特定の実施形態において、プラスミドベクターが、クローニング及び遺伝子導入において使用するために企図される。一般に、宿主細胞と適合性のある種に由来するレプリコン及び制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主と一緒に使用される。通常、ベクターは、複製部位、並びに形質転換細胞において表現型選択を実現することができるマーキング配列を有する。非限定的な例において、大腸菌(E. coli)は、大腸菌の種に由来するプラスミドであるpBR322の派生物を用いてしばしば形質転換される。pBR322は、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、したがって、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。pBRプラスミド、又は他の微生物プラスミド若しくはファージはまた、例えば、微生物がそれ自身のタンパク質を発現するために使用できるプロモーターを含まなくてはならないか、又は含むように改変されなければならない。
更に、宿主微生物と適合性のあるレプリコン及び制御配列を含むファージベクターが、これらの宿主と一緒に形質転換ベクターとして使用されうる。例えば、ファージラムダGEM(商標)-1を、組換えファージベクターを作製する際に使用してもよく、この組換えファージベクターは、例えば大腸菌LE392等の宿主細胞を形質転換するために使用することができる。
発現ベクターを含む細菌宿主細胞、例えば大腸菌は、いくつかの適切な培地のいずれか、例えばLB中で育てられる。ある種のベクターにおける組換えタンパク質の発現は、当業者には理解されるであろうように、宿主細胞を特定のプロモーターに特異的な作用物質と接触させることによって、例えば、IPTGを培地に添加することにより、又はインキュベーションをより高い温度に切り換えることによって、誘導することができる。通常は2時間から24時間の間のさらなる期間、細菌を培養した後、遠心分離によって細胞を回収し、洗浄して残存培地を除去する。
多くの原核ベクターもまた、真核宿主細胞を形質転換するために使用することができる。しかし、真核宿主細胞においてタンパク質を発現させるという特定の目的のために改変されたベクターを選択することが望ましい場合がある。発現系は、このような細胞における調節された、且つ/又は高レベルの発現のために設計された。例えば、昆虫細胞/バキュロウイルス系は、どちらも参照により本明細書に組み込まれている米国特許第5,871,986号及び米国特許第4,879,236号で説明されているように、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現をもたらすことができ、例えば、INVITROGEN(登録商標)からMAXBAC(登録商標)2.0という名称で、またCLONTECH(登録商標)からBACPACK(商標)バキュロウイルス発現系という名称で、購入することができる。
発現系の他の例としては、合成エクジソン誘導性受容体を使用するSTRATAGENE(登録商標)のCOMPLETE CONTROL(商標)誘導性哺乳動物発現系、又は大腸菌発現系である、そのpET発現系が挙げられる。誘導性発現系の別の例が、INVITROGEN(登録商標)から入手可能であり、これは、T-REX(商標)(テトラサイクリンによって調節された発現)系、すなわち完全長CMVプロモーターを用いる誘導性哺乳動物発現系を有する。INVITROGEN(登録商標)はまた、メチロトローフ酵母ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)における組換えタンパク質の高レベル産生を目的として設計された、ピキア・メタノリカ発現系と呼ばれる酵母発現系も提供している。当業者であれば、核酸配列又はその同族のポリペプチド、タンパク質、若しくはペプチドを産生することを目的としてベクター、例えば発現構築物を発現させる方法を承知しているであろう。
調節シグナル
構築物は、プロモーター、ポリA配列等の付加的な5'及び/又は3'のエレメントを含んでもよい。これらのエレメントは宿主細胞に由来、すなわち宿主と同種であってもよく、又はそれらは別の供給源に由来、すなわち異種であってもよい。
構築物は、プロモーター、ポリA配列等の付加的な5'及び/又は3'のエレメントを含んでもよい。これらのエレメントは宿主細胞に由来、すなわち宿主と同種であってもよく、又はそれらは別の供給源に由来、すなわち異種であってもよい。
「プロモーター」とは、核酸配列の一領域である制御配列であり、この位置で転写の開始及び速度が制御される。プロモーターは、RNAポリメラーゼ及び他の転写因子等の調節タンパク質及び調節分子が結合して核酸配列の特異的転写を開始しうる、遺伝子エレメントを含んでもよい。「作動的に位置づけられている」、「作動的に連結されている」、「制御下にある」、及び「転写制御下にある」という表現は、プロモーターが、ある核酸配列の転写開始及び/又は発現を制御するために、その配列に対して正しい機能的位置及び/又は向きに存在していることを意味する。
通常、プロモーターは、RNA合成の開始部位を位置づける機能を果たす配列を含む。このことについて最も良く知られた例は、TATAボックスであるが、TATAボックスを欠いているいくつかのプロモーター、例えば、哺乳動物ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター及びSV40後期遺伝子のプロモーターでは、開始部位それ自体に重なる別個のエレメントが、開始場所を定めるのに役立つ。付加的なプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の上流30～110bpの領域に位置しているが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも同様に機能的エレメントを含むことが示されている。コード配列をプロモーター「の制御下に」置くためには、選択されたプロモーターの「下流」(すなわち3')に、転写リーディングフレームの転写開始部位の5'末端を位置づける。「上流の」プロモーターがDNAの転写を促し、コードされたRNAの発現を促進する。
プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟であり、したがって、プロモーター機能は、エレメントの位置が逆にされた場合又は互いに対して動かされた場合にも、維持される。tkプロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は50bp離れた距離まで増やすことができ、それ以降は、活性が低下し始める。プロモーターによって、個々のエレメントが協同的又は別々に機能して転写を活性化できるようである。プロモーターは、「エンハンサー」と一緒に使用しても使用しなくてもよく、「エンハンサー」とは、核酸配列の転写活性化に関与しているシス作用性調節配列を意味する。
プロモーターは、核酸分子に天然に関連しているものであってもよく、コード性セグメント及び/又はエキソンの上流に配置されている5'非コード配列を単離することによって得ることができる。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーも、核酸分子に天然に関連しているものであってもよく、その配列の下流又は上流に配置されている。別法として、コード性核酸セグメントを、その天然環境において普通は核酸分子に関連していないプロモーターを意味する組換えプロモーター又は異種プロモーターの制御下に位置づけることによって、いくつかの利点が得られると考えられる。組換えエンハンサー又は異種エンハンサーとは、その天然環境において普通は核酸分子に関連していないエンハンサーを意味する。このようなプロモーター又はエンハンサーとしては、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、及び他の任意のウイルス又は原核細胞若しくは真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、並びに「天然に存在する」ものではない、すなわち、様々な転写調節領域の様々なエレメント及び/又は発現を変更する変異を含む、プロモーター又はエンハンサーを挙げることができる。例えば、組換えDNA構築において最も一般的に使用されるプロモーターとしては、β-ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)、ラクトース、及びトリプトファン(trp)のプロモーター系が挙げられる。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成によって生成することに加えて、配列は、本明細書において開示される組成物とともに、組換えクローニング及び/又はPCR(商標)を含む核酸増幅技術を用いて作製してもよい(それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第4,683,202号及び米国特許第5,928,906号を参照されたい)。更に、ミトコンドリア、葉緑体等の核を持たない細胞小器官内で配列の転写及び/又は発現を指示する制御配列も同様に使用できることも、企図される。
当然、発現のために選択された細胞小器官、細胞型、組織、器官、又は生物においてDNAセグメントの発現を効果的に指示するプロモーター及び/又はエンハンサーを使用することが重要であると考えられる。分子生物学の当業者は、通常、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組合せの使用を知っている(例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Sambrookら、1989年を参照されたい)。使用されるプロモーターは、構成的、組織特異的、誘導性、且つ/又は組換えタンパク質及び/又は組換えペプチドの大規模生産の際に有利である等、導入されたDNAセグメントの高レベルな発現を導く適切な条件下で有用であってもよい。プロモーターは、異種でも内因性でもよい。
更に、(例えば、真核生物プロモーターデータベースEPDBによる)任意のプロモーター/エンハンサー組合せもまた、発現を推進するために使用されうる。T3、T7、又はSP6細胞質発現系の使用は、別の実現可能な実施形態である。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが送達複合体の一部として又は付加的な遺伝子発現構築物として提供される場合には、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を後押しすることができる。
コード配列の効率的な翻訳のために、特定の開始シグナルも必要とされる場合がある。これらのシグナルとしては、ATG開始コドン又は隣接配列が挙げられる。ATG開始コドンを含めて、外因性翻訳制御シグナルが提供される必要がある場合がある。当業者は、これを決定し、必要なシグナルを提供することが容易にできるであろう。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなければならないことは周知である。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然でも合成でもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって向上させることができる。
本発明の特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位(IRES)エレメントの使用は、多重遺伝子又は多シストロン性のメッセージを作り出すために使用される。IRESエレメントは、5'メチル化キャップ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部部位で翻訳を開始することができる(Pelletier及びSonenberg、Nature、334:320～325頁(1988))。ピコルナウイルス科の2種のメンバー(ポリオ及び脳心筋炎)に由来するIRESエレメント(Pelletier及びSonenberg、前記)並びに哺乳動物メッセージに由来するIRES(Macejak及びSarnow、Nature、353:90～94頁(1991))が説明されている。すべてが、本発明の態様において有用である。IRESエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。それぞれがIRESによって隔てられている複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写して、多シストロン性メッセージを作り出すことができる。IRESエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近することができる。単一のメッセージを転写するように単一のプロモーター/エンハンサーを用いて、複数の遺伝子を効率的に発現させることができる(それぞれ参照により本明細書に組み込まれている米国特許第5,925,565号及び米国特許第5,935,819号を参照されたい)。複数の因子又は複合タンパク質の複数のユニット又は単一のベクター(すなわち多シストロン性ベクター)にクローニングされた複数の遺伝子の同時発現についての化学量論は、2A「自己切断」ペプチドの使用によって良くすることができ、この2A「自己切断」ペプチドは、真核細胞での翻訳中にポリペプチドの「切断」をもたらす18～22アミノ酸長のウイルスオリゴペプチドである。本発明の態様において使用するために適した例としては、例えば、口蹄疫ウイルス(foot-and-mouth disease virus)(F2A)、ウマ鼻炎Aウイルス(equine rhinitis A virus)(E2A)、ブタテッショウウイルス(porcine teschovirus)-1(P2A)、又はゾーシー・アシグナウイルス(Thosea asigna virus)(T2A)に由来する、場合によってはN末端にGSGリンカーを有する、2A配列/ペプチドが挙げられ、これに対応するコード配列が、2つのコードDNA配列の間にインフレームに挿入されてもよい。
本発明の態様において使用するために適したプロモーターとしては、限定されるわけではないが、CMVプロモーター、EF1-α、PGK1、SV40、CAGGS、UBC、ヒトB-アクチン構成的プロモーター、組織特異的プロモーター(例えば、CD2、CD8、CD3、TCF-1プロモーター)並びに誘導性プロモーター(例えば、NFAT、NFkb、TOX、TOX2、BATF3)及び化学的誘導性プロモーター(例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリンに制御される転写活性化[Tet-On/Tet-Off]系)が挙げられる。
他のベクター配列エレメント
ベクターは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であるマルチクローニング部位(MCS)を含んでもよく、これらの制限酵素部位のいずれかを標準的な組換え技術と共に使用してベクターを消化することができる(例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Carbonelliら、FEMS Microbiol. Lett.、172(1):75～82頁(1999)、Levensonら、Hum. Gene Ther. 9(8):1233～1236頁(1998)、及びCocea、Biotechniques、23(5):814～816頁(1997)を参照されたい)。「制限酵素消化」とは、核酸分子内の特定の場所でのみ機能する酵素による、核酸分子の触媒的切断を意味する。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。しばしば、ベクターは、外因性配列がベクターに連結できるようにするために、MCS内で切断する制限酵素を用いて直線化又は断片化される。「連結」とは、2つの核酸断片間でホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味し、これら2つの核酸断片は互いに隣接していてもよく、隣接していなくてもよい。制限酵素及び連結反応を使用する技法は、組換え技術の当業者に周知である。
ベクターは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であるマルチクローニング部位(MCS)を含んでもよく、これらの制限酵素部位のいずれかを標準的な組換え技術と共に使用してベクターを消化することができる(例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Carbonelliら、FEMS Microbiol. Lett.、172(1):75～82頁(1999)、Levensonら、Hum. Gene Ther. 9(8):1233～1236頁(1998)、及びCocea、Biotechniques、23(5):814～816頁(1997)を参照されたい)。「制限酵素消化」とは、核酸分子内の特定の場所でのみ機能する酵素による、核酸分子の触媒的切断を意味する。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。しばしば、ベクターは、外因性配列がベクターに連結できるようにするために、MCS内で切断する制限酵素を用いて直線化又は断片化される。「連結」とは、2つの核酸断片間でホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味し、これら2つの核酸断片は互いに隣接していてもよく、隣接していなくてもよい。制限酵素及び連結反応を使用する技法は、組換え技術の当業者に周知である。
転写された真核生物RNA分子のほとんどは、一次転写物からイントロンを除去するRNAスプライシングを受ける。真核生物ゲノム配列を含むベクターは、タンパク質発現のために転写物を適切にプロセシングすることを確実にするためにドナースプライシング部位及び/又はアクセプタースプライシング部位を必要とする場合がある(例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Chandlerら、1997年を参照されたい)。
通常、本発明のベクター又は構築物は、少なくとも1つの終止シグナルを含む。「終止シグナル」又は「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写物の特異的終止に関与しているDNA配列を含む。したがって、特定の実施形態において、RNA転写物の産生を終わらせる終止シグナルが企図される。ターミネーターは、望ましいメッセージレベルを実現するためにin vivoで必要である場合がある。
真核生物の系において、ターミネーター領域はまた、ポリアデニル化部位を露出させるために新しい転写物の部位特異的切断を可能にする特異的DNA配列を含んでもよい。これは、転写物の3'末端に約200個のアデノシン残基からなるストレッチ(ポリA)を付加する特殊な内因性ポリメラーゼにシグナルを伝達する。このポリA尾部で修飾されたRNA分子は、安定性が高いと思われ、より効率的に翻訳される。したがって、真核生物を使用する他の実施形態において、ターミネーターがRNA切断のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターシグナルがメッセージのポリアデニル化を促進することが、より好ましい。ターミネーターエレメント及び/又はポリアデニル化部位エレメントは、メッセージレベルを高め、且つカセットから他の配列へのリードスルーを最小限に抑える働きをすることができる。
本発明においての使用が企図されるターミネーターとしては、限定されるわけではないが、例えば、ウシ成長ホルモンターミネーター、SV40ターミネーター等のウイルス終止配列等の、遺伝子の終結配列を含めて、本明細書において説明されるか又は当業者に公知である任意の公知の転写ターミネーターが挙げられる。特定の実施形態において、終止シグナルは、配列切断に起因する翻訳不可能/転写不可能な配列のように、転写可能又は翻訳可能な配列の欠如であってもよい。
発現、特に真核生物発現においては、転写物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含めることが典型的である。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実践が成功するために極めて重要であるとは考えられておらず、任意のそのような配列が使用されてもよい。好ましい実施形態は、SV40ポリアデニル化シグナル又はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含み、これらはどちらも、簡便であり、容易に入手可能であり、様々な標的細胞中で良好に機能することが知られている。ポリアデニル化は、転写物の安定性を高めうるか、又は細胞質輸送を促進しうる。
宿主細胞においてベクターを増殖させるために、ベクターは、その位置で複製が開始される特定のヌクレオチド配列である、1つ又は複数の複製起点部位を含んでもよい。或いは、宿主細胞が酵母である場合には、自己複製配列(ARS)を使用することもできる。
形質転換の方法
本発明と共に使用するための、核酸送達に適した方法としては、本明細書において説明されるように、又は当業者には公知であると思われるように、それによって細胞中に核酸分子(例えば、DNA)を導入できる実質的に任意の方法が挙げられると考えられる。このような方法としては、限定されるわけではないが、以下のものが挙げられる:DNAの直接送達、例えば、ex vivoトランスフェクションによる方法(Wilsonら、Science、244:1344～1346頁(1989)、Nabelら、Science、244:1342～1344頁(1989))、注射による方法(それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第5,994,624号、第5,981,274号、第5,945,100号、第5,780,448号、第5,736,524号、第5,702,932号、第5,656,610号、第5,589,466号、及び第5,580,859号)であって、マイクロインジェクション(参照により本明細書に組み込まれている、Harlan及びWeintraub、J. Cell Biol.、101(3):1094～1099頁(1985);米国特許第5,789,215号)を含む方法;エレクトロポレーションによる方法(参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第5,384,253号、Tur-Kaspaら、Mol. Cell Biol.、6:716～718頁(1986);Potterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:7161～7165頁(1984));リン酸カルシウム沈殿法による方法(Graham及びVan Der Eb、Virology、52:456～467頁(1973);Chen及びOkayama、Mol. Cell Biol.、7(8):2745～2752頁(1987);Rippeら、Mol. Cell Biol.、10:689～695頁(1990));DEAE-デキストラン、続いてポリエチレングリコールを用いる方法(Gopal、Mol. Cell Biol.、5:1188～190頁(1985));直接的な音波負荷による方法(Fechheimerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89(17):8463～8467頁(1987));リポソームを介したトランスフェクション(Nicolau及びSene、Biochem. & Biophys. Acta.、721:185～190頁(1982);Fraleyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、76:3348～3352頁(1979);Nicolauら、Meth. Enzym.、149:157～176頁(1987);Wongら、Gene、10:879～894頁(1980);Kanedaら、Science、243:375～378頁(1989);Katoら、J. Biol. Chem.、266:3361～3364頁(1991))及び受容体を介したトランスフェクション(Wu及びWu、J. Biol. Chem.、262:4429～4432頁(1987);Wu及びWu、1988年)による方法;PEGを介したプロトプラスト形質転換による方法(それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、Omirullehら、Plant Mol. Biol.、21(3):415～428頁(1987);米国特許第4,684,611号及び第4,952,500号);乾燥/阻害を介したDNA取込み(Potrykusら、Mol. Gen. Genet.、199(2):169～177頁(1985))、並びにこのような方法の任意の組合せ。
本発明と共に使用するための、核酸送達に適した方法としては、本明細書において説明されるように、又は当業者には公知であると思われるように、それによって細胞中に核酸分子(例えば、DNA)を導入できる実質的に任意の方法が挙げられると考えられる。このような方法としては、限定されるわけではないが、以下のものが挙げられる:DNAの直接送達、例えば、ex vivoトランスフェクションによる方法(Wilsonら、Science、244:1344～1346頁(1989)、Nabelら、Science、244:1342～1344頁(1989))、注射による方法(それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第5,994,624号、第5,981,274号、第5,945,100号、第5,780,448号、第5,736,524号、第5,702,932号、第5,656,610号、第5,589,466号、及び第5,580,859号)であって、マイクロインジェクション(参照により本明細書に組み込まれている、Harlan及びWeintraub、J. Cell Biol.、101(3):1094～1099頁(1985);米国特許第5,789,215号)を含む方法;エレクトロポレーションによる方法(参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第5,384,253号、Tur-Kaspaら、Mol. Cell Biol.、6:716～718頁(1986);Potterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:7161～7165頁(1984));リン酸カルシウム沈殿法による方法(Graham及びVan Der Eb、Virology、52:456～467頁(1973);Chen及びOkayama、Mol. Cell Biol.、7(8):2745～2752頁(1987);Rippeら、Mol. Cell Biol.、10:689～695頁(1990));DEAE-デキストラン、続いてポリエチレングリコールを用いる方法(Gopal、Mol. Cell Biol.、5:1188～190頁(1985));直接的な音波負荷による方法(Fechheimerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89(17):8463～8467頁(1987));リポソームを介したトランスフェクション(Nicolau及びSene、Biochem. & Biophys. Acta.、721:185～190頁(1982);Fraleyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、76:3348～3352頁(1979);Nicolauら、Meth. Enzym.、149:157～176頁(1987);Wongら、Gene、10:879～894頁(1980);Kanedaら、Science、243:375～378頁(1989);Katoら、J. Biol. Chem.、266:3361～3364頁(1991))及び受容体を介したトランスフェクション(Wu及びWu、J. Biol. Chem.、262:4429～4432頁(1987);Wu及びWu、1988年)による方法;PEGを介したプロトプラスト形質転換による方法(それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、Omirullehら、Plant Mol. Biol.、21(3):415～428頁(1987);米国特許第4,684,611号及び第4,952,500号);乾燥/阻害を介したDNA取込み(Potrykusら、Mol. Gen. Genet.、199(2):169～177頁(1985))、並びにこのような方法の任意の組合せ。
T細胞に対する形質導入は、例えば、ウイルスを用いる又はウイルスを用いない遺伝子導入方法を用いて行われうる。ウイルスを用いる方式としては、例えば、レンチウイルス遺伝子導入法又はレトロウイルス遺伝子導入法が挙げられる。レポーター遺伝子を細胞内で発現させるための遺伝子発現構築物は、T細胞又はナチュラルキラー(NK)細胞等の細胞内で発現されうる。レポーター遺伝子を細胞内で発現させるための遺伝子発現構築物は、組込み核酸(例えば、トランスポザーゼ/トランスポゾンを用いて宿主ゲノム中に組み込まれるDNA)として、又は非組込み核酸(例えば、レンチウイルス若しくはレトロウイルス等のウイルスベクターによって送達されるmRNA)として、発現されうる。その後、レポーター遺伝子を細胞内で発現させるための遺伝子発現構築物を発現しているT細胞又はNK細胞を、薬学的な調製物又は賦形剤に加えて、ヒト患者等の対象に投与して、疾患(例えば、がん、真菌感染症、細菌感染症、又はウイルス感染症)を治療又は予防することができる。いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子を細胞内で発現させるための遺伝子発現構築物をコードする裸DNA又は適切なベクターを、対象のT細胞(例えば、がん又は他の疾患に罹患しているヒト患者から得られたT細胞)中に導入してもよい。裸DNAを用いてエレクトロポレーションによってT細胞を安定にトランスフェクトする方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第6,410,319号を参照されたい。通常、裸DNAとは、本発明のレポーター遺伝子を細胞内で発現させるための遺伝子発現構築物をコードするDNAであって、発現のために適切な向きでプラスミド発現ベクター中に含まれている、DNAを意味する。いくつかの実施形態において、裸DNAを使用することによって、本発明の方法を用いて作製した、レポーター遺伝子を細胞内で発現させるための遺伝子発現構築物を発現するT細胞を作製するために要する時間を短縮することができる。或いは、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又はレンチウイルスベクター)を用いて、遺伝子発現構築物をT細胞中に導入することもできる。通常、対象に由来するT細胞をトランスフェクトするために使用される遺伝子発現構築物をコードするベ
クターは、対象のT細胞中で複製しないことが望ましい。細胞中で維持されるウイルスのコピー数が細胞の生存能力を維持するのに十分な少なさである、ウイルスをベースとする多数のベクターが公知である。例示的なベクターとしては、pFB-ネオベクター(STRATAGENE(登録商標))、及びHIV、SV40、EBV、HSV、又はBPVをベースとするベクターが挙げられる。別法として、Sleeping Beauty又はPiggyBac等のトランスポゾン系は、遺伝子導入のための非ウイルス方法に相当し、臨床応用を目的とした医薬品の製造及び品質管理に関する基準(GMP)に準拠したウイルスの高コストな生産に代わるコスト効率の高い代替手段を与える。当業者であれば、現在では治療目的のヒト細胞遺伝子操作に頻繁に使用される、トランスポザーゼ及びトランスポゾンであるSleeping Beauty又はPiggyBacから構成されているトランスポゾン系を含めて、DNAプラスミド系を応用する仕方が容易に分かるであろう。
クターは、対象のT細胞中で複製しないことが望ましい。細胞中で維持されるウイルスのコピー数が細胞の生存能力を維持するのに十分な少なさである、ウイルスをベースとする多数のベクターが公知である。例示的なベクターとしては、pFB-ネオベクター(STRATAGENE(登録商標))、及びHIV、SV40、EBV、HSV、又はBPVをベースとするベクターが挙げられる。別法として、Sleeping Beauty又はPiggyBac等のトランスポゾン系は、遺伝子導入のための非ウイルス方法に相当し、臨床応用を目的とした医薬品の製造及び品質管理に関する基準(GMP)に準拠したウイルスの高コストな生産に代わるコスト効率の高い代替手段を与える。当業者であれば、現在では治療目的のヒト細胞遺伝子操作に頻繁に使用される、トランスポザーゼ及びトランスポゾンであるSleeping Beauty又はPiggyBacから構成されているトランスポゾン系を含めて、DNAプラスミド系を応用する仕方が容易に分かるであろう。
トランスフェクト又は形質導入されたT細胞が、所望の調節を行い、且つ所望のレベルで、表面膜タンパク質として遺伝子発現構築物を発現できることがひとたび確かめられたら、レポーターが宿主細胞中で機能して、放射性核種で標識された補完的なHiBiTペプチドへの所望の結合を与えるかどうかを判定することができる。続いて、形質導入されたT細胞を対象に再導入するか又は投与して、対象において抗腫瘍反応を活性化してもよい。投与を容易にするために、形質導入されたT細胞を、好ましくは薬学的に許容される適切な担体又は希釈剤を用いて、薬学的組成物に加工してもよく、又はin vivo投与に適した埋込み剤に加工してもよい。このような組成物又は埋込み剤を作る手段は、当技術分野において説明されている(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Mack編(1980)を参照されたい)。必要に応じて、レポーター遺伝子を発現する形質導入されたT細胞を製剤化して、それらの各投与経路向けの通常の方法で、半固体形態又は液状形態の製剤、例えば、カプセル剤、液剤、注射剤、吸入剤、又はエアロゾルにすることもできる。当技術分野において公知の手段を用いて、組成物が標的組織又は標的器官に到達するまで、その組成物の放出及び吸収を防止若しくは最小化すること、又はその組成物の徐放を確実にすることができる。通常、レポーター遺伝子を発現する細胞を無効にしない薬学的に許容される形態が、好ましくは使用される。したがって、望ましくは、形質導入されたT細胞は、ハンクス平衡塩類溶液等の平衡塩類溶液又は生理食塩水を含む薬学的組成物に加工することができる。
(実施例1)
キメラ膜貫通型LgBiT
制限酵素BglII及びSalIを用いてpBiT1.1-C[TK/LgBiT](図5を参照されたい;Promega社、Madison、WI、USA)から切断したLgBiT配列を、細胞表面タンパク質提示のための哺乳動物発現ベクターであるpDisplay(商標)ベクター(Thermos Fisher Scientific社、Waltham、Ma、USA)のクローニング部位に挿入することによって、膜貫通型LgBiT配列を作出した。組換えタンパク質は、そのN末端において、分泌経路プロセシングのためのマウスIg κ鎖リーダー配列に融合されており、且つ組換えタンパク質は、そのC末端において、タンパク質を形質膜に固定し細胞外提示を可能にするための血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)膜貫通ドメインに融合されている。このようにして、キメラタンパク質又は融合タンパク質のコード配列を含む構築物であって、(核酸の5'から3'に向かって、また発現される融合タンパク質のN末端からC末端に向かって)IgGκ鎖リーダー配列-LgBiT配列-PDGFR膜貫通ドメイン配列を含む構築物を、作出する。次いで、BamHI及びNotIを用いて、キメラタンパク質のための完全配列をpDisplay(商標)ベクターから切り出し、pCDH-EF1-MCSレンチウイルスベクター(System Biosciences社、Palo Alto、CA、USA)のマルチクローニング部位に挿入して、プラスミドpCDH-EF1-LgBiTを作出した。その際、キメラタンパク質は、EF1-αプロモーターの制御下にある。パッケージングプラスミド及びプラスミドpCDH-EF1-LgBiTを用いてのHEK293細胞のトランスフェクションにより、レンチウイルス粒子を生成した。HIV p24レベルを測定する抗原捕捉ELISA(ZeptoMetrix社、NY、USA)によってウイルスを定量した。形質導入のために、PC3細胞(ヒト前立腺がん細胞株)を培地に再懸濁した。キメラ膜貫通型LgBiT構築物を含む偽型ウイルス粒子を細胞に添加した(1×105個の細胞当たりウイルス40ngを使用)。形質導入されたPC3細胞を、段階希釈法によって選択した。
キメラ膜貫通型LgBiT
制限酵素BglII及びSalIを用いてpBiT1.1-C[TK/LgBiT](図5を参照されたい;Promega社、Madison、WI、USA)から切断したLgBiT配列を、細胞表面タンパク質提示のための哺乳動物発現ベクターであるpDisplay(商標)ベクター(Thermos Fisher Scientific社、Waltham、Ma、USA)のクローニング部位に挿入することによって、膜貫通型LgBiT配列を作出した。組換えタンパク質は、そのN末端において、分泌経路プロセシングのためのマウスIg κ鎖リーダー配列に融合されており、且つ組換えタンパク質は、そのC末端において、タンパク質を形質膜に固定し細胞外提示を可能にするための血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)膜貫通ドメインに融合されている。このようにして、キメラタンパク質又は融合タンパク質のコード配列を含む構築物であって、(核酸の5'から3'に向かって、また発現される融合タンパク質のN末端からC末端に向かって)IgGκ鎖リーダー配列-LgBiT配列-PDGFR膜貫通ドメイン配列を含む構築物を、作出する。次いで、BamHI及びNotIを用いて、キメラタンパク質のための完全配列をpDisplay(商標)ベクターから切り出し、pCDH-EF1-MCSレンチウイルスベクター(System Biosciences社、Palo Alto、CA、USA)のマルチクローニング部位に挿入して、プラスミドpCDH-EF1-LgBiTを作出した。その際、キメラタンパク質は、EF1-αプロモーターの制御下にある。パッケージングプラスミド及びプラスミドpCDH-EF1-LgBiTを用いてのHEK293細胞のトランスフェクションにより、レンチウイルス粒子を生成した。HIV p24レベルを測定する抗原捕捉ELISA(ZeptoMetrix社、NY、USA)によってウイルスを定量した。形質導入のために、PC3細胞(ヒト前立腺がん細胞株)を培地に再懸濁した。キメラ膜貫通型LgBiT構築物を含む偽型ウイルス粒子を細胞に添加した(1×105個の細胞当たりウイルス40ngを使用)。形質導入されたPC3細胞を、段階希釈法によって選択した。
HiBiTの合成
Nα-Fmoc固相ペプチド合成戦略を用いて、HiBiTペプチドVSGWRLFKKISを合成した。Fmocで保護された配列(Val-Ser(tBu)-Gly-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Ser(tBu))の2-クロロトリチルクロリド樹脂への結合を、ヘキサフルオロホスファートアザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム(HATU)(3.8当量)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(7.8当量)を45分間使用して、ジメチルホルムアミド(DMF)中で実施した。DMFに溶かしたピペリジンの20%溶液で樹脂を処理することにより、Fmoc脱保護を遂行した。アミド形成及びFmoc脱保護をカイザー試験によってモニターした。反応が完了していない場合、ダブルカップリング又はFmoc脱保護を実施した。ペプチド合成は、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH(1.6mmol、4当量)を固体支持体(0.25g、積載能力:1.6mmol/g)に載せることによって開始した。この樹脂を室温で90分間、振盪した。ジクロロメタン/メタノール/N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DCM/MeOH/DIPEA)(10mL、80:15:5、v/v/v)を室温で15分間用いて、樹脂をキャッピングした。その後のFmoc脱保護並びにFmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、及びFmoc-L-Val-OHとのカップリングは、前述のプロトコルに従って、4当量の個々の保護アミノ酸を用いて実行した。
Nα-Fmoc固相ペプチド合成戦略を用いて、HiBiTペプチドVSGWRLFKKISを合成した。Fmocで保護された配列(Val-Ser(tBu)-Gly-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Ser(tBu))の2-クロロトリチルクロリド樹脂への結合を、ヘキサフルオロホスファートアザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム(HATU)(3.8当量)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(7.8当量)を45分間使用して、ジメチルホルムアミド(DMF)中で実施した。DMFに溶かしたピペリジンの20%溶液で樹脂を処理することにより、Fmoc脱保護を遂行した。アミド形成及びFmoc脱保護をカイザー試験によってモニターした。反応が完了していない場合、ダブルカップリング又はFmoc脱保護を実施した。ペプチド合成は、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH(1.6mmol、4当量)を固体支持体(0.25g、積載能力:1.6mmol/g)に載せることによって開始した。この樹脂を室温で90分間、振盪した。ジクロロメタン/メタノール/N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DCM/MeOH/DIPEA)(10mL、80:15:5、v/v/v)を室温で15分間用いて、樹脂をキャッピングした。その後のFmoc脱保護並びにFmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、及びFmoc-L-Val-OHとのカップリングは、前述のプロトコルに従って、4当量の個々の保護アミノ酸を用いて実行した。
DOTA-6ahx-HiBiTの合成
N末端バリン残基へのリンカーの結合を、DMFに溶かしたFmoc-6ahx-OH(2当量)、HATU(3.8当量)、及びDIPEA(7.8当量)を用いて遂行した。樹脂を室温で2時間撹拌した。次いで、樹脂をDMFで2回洗浄し、DMFに溶かしたピペリジンの20%溶液で樹脂を処理することにより、Fmoc保護基を除去した。ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyBoP)(3当量)、DIPEA(6当量)、及びDMFの存在下で、DOTA-トリス(tBu)エステル(3当量)をペプチドに結合させた。反応は室温で一晩実施した。固体支持体からのペプチドの切断及びそれと同時の全体的脱保護を、室温で6時間、トリフルオロ酢酸/水/トリイソプロピルシラン(TFA/H2O/TIPS)(95:2.5:2.5、v/v/v)の溶液で樹脂を処理することにより実施した。濾過し、濾液を採取し、減圧下で溶媒を蒸発させた。残渣を冷ジエチルエーテルでトリチュレーションすることにより、最終的な粗生成物を得、これをHPLCによって精製して、純粋なDOTA-6ahx-HiBiTを白色固体(12mg、16.8%)として得た。ESI-MS:m/z 910.80[M+2H]2+、922.21[M+Na+H]2+、及び930.19[M+2Na]2+。
N末端バリン残基へのリンカーの結合を、DMFに溶かしたFmoc-6ahx-OH(2当量)、HATU(3.8当量)、及びDIPEA(7.8当量)を用いて遂行した。樹脂を室温で2時間撹拌した。次いで、樹脂をDMFで2回洗浄し、DMFに溶かしたピペリジンの20%溶液で樹脂を処理することにより、Fmoc保護基を除去した。ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyBoP)(3当量)、DIPEA(6当量)、及びDMFの存在下で、DOTA-トリス(tBu)エステル(3当量)をペプチドに結合させた。反応は室温で一晩実施した。固体支持体からのペプチドの切断及びそれと同時の全体的脱保護を、室温で6時間、トリフルオロ酢酸/水/トリイソプロピルシラン(TFA/H2O/TIPS)(95:2.5:2.5、v/v/v)の溶液で樹脂を処理することにより実施した。濾過し、濾液を採取し、減圧下で溶媒を蒸発させた。残渣を冷ジエチルエーテルでトリチュレーションすることにより、最終的な粗生成物を得、これをHPLCによって精製して、純粋なDOTA-6ahx-HiBiTを白色固体(12mg、16.8%)として得た。ESI-MS:m/z 910.80[M+2H]2+、922.21[M+Na+H]2+、及び930.19[M+2Na]2+。
DOTA-6ahx-HiBiTの放射性標識
DOTA-6ahx-HiBiT(1nmol)、アスコルビン酸/ゲンチジン酸(10μL、50mM)、酢酸ナトリウム(1μL、2.5M)、及びH2O(29.7μL)の混合物に111InCl3(93.3μL、150MBq)を添加した。この混合物を90℃で20分間インキュベートした。シリカゲルを含浸させたガラス繊維シートを用いるインスタント薄層クロマトグラフィー(iTLC)により、クエン酸ナトリウム溶液(0.1M、pH5.0)で溶出して、反応をモニターした。反応混合物を5分間冷却し、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)(5μL)を添加して、残存している遊離インジウム-111を錯化した。[111In]-DOTA-6ahx-HiBiTの放射化学的収率及びモル活性は、それぞれ93%及び150MBq/nmolと測定された。
DOTA-6ahx-HiBiT(1nmol)、アスコルビン酸/ゲンチジン酸(10μL、50mM)、酢酸ナトリウム(1μL、2.5M)、及びH2O(29.7μL)の混合物に111InCl3(93.3μL、150MBq)を添加した。この混合物を90℃で20分間インキュベートした。シリカゲルを含浸させたガラス繊維シートを用いるインスタント薄層クロマトグラフィー(iTLC)により、クエン酸ナトリウム溶液(0.1M、pH5.0)で溶出して、反応をモニターした。反応混合物を5分間冷却し、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)(5μL)を添加して、残存している遊離インジウム-111を錯化した。[111In]-DOTA-6ahx-HiBiTの放射化学的収率及びモル活性は、それぞれ93%及び150MBq/nmolと測定された。
結果
前述の実施例において、本発明によるPET/SPECTイメージングのための新しいレポーター遺伝子についての実施形態が提供される。
前述の実施例において、本発明によるPET/SPECTイメージングのための新しいレポーター遺伝子についての実施形態が提供される。
本実施例で作製されるレポーター遺伝子は、NanoLucのLgBiT部分をベースとする膜発現タンパク質を含み、トレーサーは、キレート剤及びリンカーの添加によって化学的に修飾されたHiBiTペプチドである。
最初に、本発明者らは、新規の膜発現LgBiT部分の機能性を評価した。膜貫通型LgBiT(TMLgBiT)を発現する細胞を播種し、生物発光基質であるフリマジンと共にHiBiTペプチドを添加した。TMLgBiTペプチドとHiBiTペプチドの間で補完が起こる場合には、基質の添加後に光が生じる。図1は、様々な濃度のHiBiTペプチドとHEK-293細胞の膜において発現されるTMLgBiTとの反応後に集められた光シグナルを示す。
次いで、様々なタイプのリンカーを用いて、HiBiTペプチドをDOTAキレート剤に連結し、新たに生じたDOTA-HiBiTペプチドのLgBiTタンパク質に対する親和性をin vitroで評価した。
平衡解離定数(Kd)を、以下のように計算した。10%ウシ胎児血清(FBS)を含むOpti-MEM溶液(Thermo Fisher Scientific社)を調製し、10%FBSを加えたOpti-MEM中で、200nMを開始濃度として最終濃度2nMまで(各500μL)、LgBiTタンパク質を希釈した。合成したペプチド(DOTA-6ahx-HiBiT、DOTA-HiBiT)及び天然HiBiTの3倍希釈系列を調製し、次のように希釈した:150μLのペプチド溶液に、10%FBSを加えたOpti-MEMを350μL加える。上記の調製溶液90μLをトリプリケートで白いアッセイプレート(Costar 3600)に添加し、10μLの2nM LgBiT溶液(0.2nM最終濃度)を、ペプチド溶液を入れたウェルに添加し、オービタルシェーカーを用いて600RPMで30分間、インキュベートした。10%FBSを加えたOpti-MEMに溶かした、フリマジン(Promega社)及び1mM DTT(Thermo Fisher Scientific社)の溶液を調製し、10μLを各ウェルに添加した。溶液を添加した後、600RPMで5分間、オービタルシェーカー上でプレートをインキュベートした。ウェル当たり0.5秒の積分時間を用いて、GloMax Multi照度計(Promega社)でルミネセンスを測定した。GraphPad Prism、1部位特異的結合を用いてKd値を算出した。
これらの結果は、LgBiTに対するHiBiTペプチドの親和性が向上し、Kdが約10分の1に低下したことを示し、このことから、in vivoの反応がまったく損なわれていないことが示唆された。安定性が高いことを理由として、HiBiT-6ahx-DOTAペプチド(HiBiT-リンカー-DOTA)を以降の試験のために選択した。図2では、LgBiTタンパク質とHiBiTペプチドの反応についてのKdの計算結果が、1部位特異的結合関数を用いて与えられている。計算されたKdは、HiBiTの場合は6.8nM、HiBiT DOTAの場合は1.3nM、及びHiBiT-6ahx-DOTAの場合は0.7であった。
続いて、HiBiT-6ahx-DOTAがSPECTイメージングのために111In(インジウム)(150mBq/nanomol)で放射性標識されている場合の、生細胞における補完反応を評価した。
[111In]-DOTA-6ahx-HiBiTペプチド(1nM)を、レポーター遺伝子TMLgBiTを発現している細胞に添加し、TMLgBiTを発現していない細胞を陰性対照として使用した(20,000細胞/ウェル)。細胞を3回洗浄し、ガンマ線計数器を用いて放射能を測定した。TMLgBiT発現細胞とレポーター遺伝子を発現しない細胞との間で、放射性シグナルの明らかな差異(2000倍)が結果として生じた。図3では、1nmolの放射性[111In]-DOTA-6ahx-HiBiTペプチドの添加後のTMLgBiT発現細胞及び対照細胞についての放射線(単位CPM、ガンマ線計数器を用いて測定)が提供される。
最後に、in vivo実験により、新規なレポーター遺伝子TMLgBiTを発現する細胞を、20mBqの線量の[111In]-DOTA-6ahx-HiBiTペプチドを用いて特異的に検出できることが示される。図4では、[111In]-DOTA-6ahx-HiBiTペプチドの注射から1時間後に、皮下注射されたTMLgBiT発現細胞から生じたシグナルを示す。シグナルは膀胱からも生じていることから、腎臓及び尿を通ってペプチドが迅速に排泄されることが示唆される。注射後1時間目の体内分布データを記録し、様々な組織における放射能濃度を、組織1グラム当たりの注射線量に対する比率(%)として表した。図6に示すように、[111In]-DOTA-6ahx-HiBiTは(すべてのペプチドとして)腎臓によって広範囲で速やかに排除され、他の組織における有意な非特異的蓄積はない。
要約すれば、このデータから、TMLgBiTタンパク質に基づく新しいレポーター遺伝子系は、HiBiTペプチドがキレート剤に連結され放射性標識されている場合に、SPECT/PETイメージングのための特異的レポーター遺伝子として作用することが示される。膜貫通型(TM)LgBiTとDOTA-リンカー-HiBiTペプチドの組合せは、in vivoのSPECT/PETイメージングのための新しい系になる。図4では、TMLgBiTを発現する細胞(右側腹部)及びレポーターを発現しない細胞(左側腹部)を注射した生きたマウスを対象とするSPECT画像が提供される。高度な固有のシグナルが検出されている。
更に実験を行った。それらの結果を図7及び図8に示している。これらの実験では、8週齢の雄のBALB/CヌードマウスBALB/C(n=12)に、5×106個のPC-3-TM-LgBiT発現細胞を注射した(n=8)。注射用の細胞は、PBS(Sigma-Aldrich社)及びマトリゲル(Corning社)の50:50の比の溶液中で調製し、最終注射体積は50μLであった。腫瘍細胞移植後、約3～4週間、腫瘍を成長させた。イメージング系の機能性を明らかにするために、動的全身SPECT/CTスキャン(VECT/CT Milabs)を実施した。1～2%イソフルラン/O2を用いてマウスに麻酔をかけ、イメージングの期間中(1時間)、暖められたベッドアパーチャを用いることにより、体温を37℃に維持した。PC-3腫瘍モデルの場合、[111In]-DOTA-6ahx-HiBiTの尾静脈注射後すぐに、1時間の動的SPECT/CTスキャンを実施した(200μL PBS中0.13nmolに20MBqで標識)。PC-3腫瘍取込みに対する阻害効果を測定するために、13nmolのDOTA-6ahx-HiBiT(約100倍過剰)を[111In]-DOTA-6ahx-HiBiTと共に同時注射した(n=4)。[111In]-DOTA-6ahx-HiBiTの注射後すぐに、30の時間フレームを用い、合計1時間にわたって動的スキャンを取得した。取得した画像を、0.80×0.80mmのアイソトロピックボクセルを有する36×36×35mmマトリックスに対して、近似回数9回及びサブセット128個でSR-OSEMを用いて、再構成した。画像を図7に示している。
エクスビボ解析によって体内分布を評価した。この場合、マウスを安楽殺し、約20MBqの[111In]-DOTA-6ahx-HiBiTペプチドの尾静脈注射後1時間目に解剖した(処置群/対照当たりn=4)。器官(血液、心臓、皮膚、肺、肝臓、脾臓、胃、小腸、結腸、尾、筋肉、脳、腫瘍、腎臓、及び骨)を計量し、腫瘍及び他の器官における放射能取込みを測定し、組織1g当たりの注射線量比率(%ID/g)として表した。腫瘍及び器官をγ線計数器(PerkinElmer社)において計数した。計数時間は、アイソトープに固有のエネルギーウィンドウ及び5%を超えない計数誤差を用いて、試料当たり60秒とした。計数後、更に解析するために、腫瘍を液体窒素中で凍結した。
Claims (15)
- (i)細胞内でレポーター遺伝子を発現させるための遺伝子発現構築物であって、前記レポーター遺伝子が、レポータードメインにインフレームで融合された膜貫通ドメインを含む融合タンパク質をコードし、前記膜貫通ドメインが、細胞膜中への融合タンパク質の挿入が起こると、融合タンパク質を細胞膜に固定し、同時にレポータードメインを細胞表面で発現する、遺伝子発現構築物;及び
(ii)放射性標識物質で標識されたレポーターペプチド;を含み、
前記レポータードメインは、スプリットルシフェラーゼの大型ポリペプチドサブユニットを含み、且つ前記レポーターペプチドは、前記スプリットルシフェラーゼの小型ペプチドサブユニットを含み、両方のサブユニットが補完によって会合してルシフェラーゼ複合体を形成する、レポーター系。 - 前記レポータードメインが、スプリットルシフェラーゼの大型ポリペプチドサブユニットからなり、且つ前記レポーターペプチドが、前記スプリットルシフェラーゼの小型ペプチドサブユニットからなり、好ましくは、スプリットルシフェラーゼが、ホタル(フォチナス・ピラリス)ルシフェラーゼ(FLuc)、コメツキムシ(例えば、ピロフォラス・プラギオフタラマス)ルシフェラーゼ、ガウシア(例えば、ガウシア・プリンセプス)ルシフェラーゼ(GLuc)、ウミシイタケ(例えば、レニラ・レニフォルミス)ルシフェラーゼ(RLuc)、オプロフォラス(例えば、オプロフォラス・グラシリロストリス)ルシフェラーゼ(OLuc;NanoLuc)、及び細菌ルシフェラーゼ(Lux)から選択され、より好ましくはNanoLucである、請求項1に記載のレポーター系。
- 小型ペプチドサブユニットが、前記スプリットルシフェラーゼの大型ポリペプチドサブユニットに対して高い親和性を有し、好ましくは、2つのサブユニットが、0.1μM未満、より好ましくは10nM未満、更により好ましくは1nM未満、更により好ましくは0.5nMから1nMの間であるKdで会合した、請求項1又は2に記載のレポーター系。
- レポーターペプチドが、9～30個のアミノ酸残基、好ましくは10～25個のアミノ酸残基、より好ましくは11～22個のアミノ酸残基の長さを有する、請求項1から3のいずれか一項に記載のレポーター系。
- 大型ポリペプチドサブユニットが、配列番号48のアミノ酸配列又は配列番号48に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列、且つ0.1μM未満、より好ましくは10nM未満、更により好ましくは1nM未満、更により好ましくは0.5nMから1nMの間であるKdで小型ペプチドサブユニットに結合する配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のレポーター系。
- 小型ペプチドサブユニットが、配列番号28～46のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載のレポーター系。
- 膜貫通ドメインが、タンパク質PDGFR、CD8、B7タンパク質、TLR4、CD4、ニューレキシン3b、Notch受容体ポリペプチド、CD28、CD137(41BB)、CD3C、及び他の短縮されたヒトI型及びII型膜貫通型タンパク質の膜貫通ドメインから選択され、前記タンパク質の細胞質内ドメインと場合によっては組み合わされ、好ましくは、前記膜貫通ドメインが、配列番号1～11からなる群から選択される配列を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のレポーター系。
- 融合タンパク質が、好ましくはN末端において、膜貫通ドメインにインフレームで融合されたリーダーペプチドの配列を更に含み、好ましくは、リーダー配列が、ヒト又はマウスのIgK、CD8、OSM、IgG2 H、BM40、Secrecon、IgKVIII、CD33、tPA、キモトリプシノーゲン、トリプシノーゲン-2、IL-2、アルブミン(HSA)、及びインスリンのリーダー配列からなる群から選択され、好ましくは、前記リーダー配列が、配列番号12～26からなる群から選択される配列を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のレポーター系。
- レポーターペプチドが、好ましくはキレート剤を介してレポーターペプチドに結合されている放射性標識物質を含み、好ましくは、キレート剤が、リンカーを介してレポーターペプチドに結合されており、好ましくは、放射性標識物質が、51Cr、52Fe、52mMn、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、77As、89Zr、90Y、97Ru、99Tc、99mTc、105Rh、109Pd、111In、111Ag、113mIn、121Sn、124I、127Te、142Pr、143Pr、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、161Tb、165Dy、166Ho、169Er、169Yb、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、203Pb、11C、18F、15O、及び13Nから選択され、より好ましくは111Inである、請求項1から8のいずれか一項に記載のレポーター系。
- 遺伝子発現構築物がベクター中に含まれ、好ましくは、ベクターが組換え細胞、好ましくはT細胞中に含まれるか;或いはベクターがウイルスゲノム中に含まれ、ウイルスゲノムとしては、アデノウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、セネカウイルス、エンテロウイルスRIGVIR、セムリキ森林ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、及びポリオウイルスを含む腫瘍溶解性ウイルスのゲノム、又はレトロウイルス若しくはレンチウイルスを含む細胞形質転換のためのウイルスのゲノムが挙げられる、請求項1から9のいずれか一項に記載のレポーター系。
- スプリットルシフェラーゼの小型ペプチドサブユニットを含むレポーターペプチドであって、小型ペプチドサブユニットが前記スプリットルシフェラーゼの大型ポリペプチドサブユニットと補完によって会合してルシフェラーゼ複合体を形成し、小型ペプチドサブユニットが大型ポリペプチドサブユニットに対して高い親和性を有し、レポーターペプチドが、9～30個のアミノ酸残基の長さを有し、且つ前記レポーターペプチドが、PET又はSPECTで使用するのに適していることが好ましい放射性核種で標識されており、前記放射性核種がキレート剤及びリンカーを介して前記レポーターペプチドに結合されていることが好ましい、レポーターペプチド。
- スプリットルシフェラーゼが、ホタル(フォチナス・ピラリス)ルシフェラーゼ(FLuc)、コメツキムシ(例えば、ピロフォラス・プラギオフタラマス)ルシフェラーゼ、ガウシア(例えば、ガウシア・プリンセプス)ルシフェラーゼ(GLuc)、ウミシイタケ(例えば、レニラ・レニフォルミス)ルシフェラーゼ(RLuc)、オプロフォラス(例えば、オプロフォラス・グラシリロストリス)ルシフェラーゼ(OLuc;NanoLuc)、及び細菌ルシフェラーゼ(Lux)から選択され、好ましくは、スプリットルシフェラーゼがNanoLucである、請求項11に記載のレポーターペプチド。
- レポーターペプチドが、9～30個のアミノ酸残基、好ましくは10～25個のアミノ酸残基、より好ましくは11～22個のアミノ酸残基の長さを有し、好ましくは、レポーターペプチドが、配列番号28～46のいずれか1つの配列を含むか、又はそれからなり、且つ好ましくは、放射性標識物質が、51Cr、52Fe、52mMn、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、77As、89Zr、90Y、97Ru、99Tc、105Rh、109Pd、111In、111Ag、113mIn、121Sn、124I、127Te、142Pr、143Pr、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、161Tb、165Dy、166Ho、169Er、169Yb、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、203Pb、11C、18F、15O、及び13Nから選択され、好ましくは111Inである、請求項11又は12に記載のレポーターペプチド。
- a)請求項1から10のいずれか一項に記載のレポーター系の遺伝子発現構築物を含むベクター又は組換え細胞を含む、対象の体内に輸注するための薬学的組成物、及び
b)請求項11から13のいずれか一項に記載のレポーターペプチドを含む、薬学的組成物
を含む、対象の体内に同時に、別々に、又は逐次的に輸注するための薬学的組合せ。 - 疾患を治療するため又は疾患治療をモニターするための方法であって、それを必要とする対象に、治療的又は診断的に有効な量の、請求項1から10のいずれか一項に記載のレポーター系又は請求項14に記載の薬学的組合せを投与する工程を含み、好ましくは、疾患ががんであるか、又は疾患治療が腫瘍溶解性ウイルス若しくは(CAR)T細胞を用いるがん療法である、方法。
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