JP7195665B2 - 診断及び治療のための、改善された薬物動態及びコレシストキニン-2受容体(cck2r)への標的化 - Google Patents
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Description
本発明は、とりわけ、特定のコレシストキニン-2受容体(CCK2R)への標的化について改善された特性を有するペプチド模倣体、並びにその診断使用及び治療使用に関する。コレシストキニン受容体は、CCK1R及びCCK2Rという、2つの受容体サブタイプに分類される。CCK2Rは、神経内分泌腫瘍、甲状腺髄様癌(MTC)、小細胞肺癌(SCLC)、平滑筋肉腫/平滑筋腫、消化管間質腫瘍、インスリノーマ、血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍、カルチノイド、星状細胞腫、間質卵巣癌、乳腺癌及び子宮内膜腺癌、並びにその他などの様々な腫瘍において同定されているが(Reubi JC et al., Cancer Res 1997, 57: 1377-1386; Reubi JC, Curr Top Med Chem 2007, 7: 1239-1242; Sanchez C et al. Mol Cell Endocrinol 2012, 349: 170-179)、CCK1Rは、限られた数のヒト腫瘍においてしか発現されていない。様々な放射性標識されたペプチドプローブが、CCK2R、コレシストキニン(CCK)、又はガストリンに対する内因性リガンドに基づいて開発されている。CCK及びガストリンという2つのペプチドは、ほぼ同じ親和性及び効力でCCK2Rに結合し、C末端における共通した生物活性領域である、Trp-Met-Asp-Pheを共有し(Dufresne M et al., Physiol Rev 2006, 86: 805-847)、これは受容体への結合にとって必須であることが証明されている(Tracy HJ et al., Nature 1964, 204: 935-938)。親ペプチドの生理学的半減期が非常に短いために、医療への適用のために鎖状アミノ酸配列を代謝的に安定化させる該ペプチドの追加の合成による修飾が一般的に必要とされる(Fani M et al., Theranostics 2012, 2: 481-501)。このような修飾は、放射性標識されたCCK及びガストリン類似体についても探究されている(Roosenburg S et al., Amino Acids 2011, 41: 1049-1058)。Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2(CCK8)及びLeu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2(ミニガストリン、MG)に基づいた放射性リガンドの他に、非ペプチド性リガンドも提案されている(Wayua C et al., J Nucl Med 2015, 56: 113-119)。CCK2R特異的な腫瘍への取り込みが、蛍光CCK2R標的化MG類似体(dQ-MG-754)を用いての光学的イメージングによって、結腸直腸腺癌細胞から得られた腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにおいても近年証明されている(Kossatz S et al., Biomaterials 2013, 34: 5172-5180)。細胞毒性薬物をCCK2R陽性腫瘍に選択的に送達するチューブリシンBにコンジュゲートさせた強力なCCK2RリガンドのZ-360を使用することによって、腫瘍の退縮を前臨床動物モデルにおいて観察することができた(Wayua C et al., Mol Pharm 2015, 12: 2477-2483)。
本発明の目的は、CCK2R標的化ペプチド模倣体の腎臓への少ない滞留を維持しつつ、血清中半減期、好ましくはまたインビボにおける安定性、細胞への取り込み、及び腫瘍標的化特性を改善させることである。この目的は、本発明に従って、本発明の以下の実施態様及び局面によって達成される。
本明細書において引用されている、特許、特許出願、及び科学的刊行物を含むがこれらに限定されない、全ての刊行物が、まるで各々の個々の刊行物が具体的にかつ個々に参照により組み入れられると示されているかのように、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書において使用する「レポーター基」という用語は、イメージング法において直接的又は間接的にのいずれかで検出されることのできる任意の材料又は化学的部分であり得る。それ故、レポーター基を含むペプチド模倣体は、イメージング法に、例えば診断目的のために使用され得る。「レポーター基」という用語は、「レポーター剤」及び「標識」という用語と互換的に使用される。レポーター基は、検出可能な放射能を放出するか又は放出が引き起こされ得(例えば、放射性崩壊、蛍光励起、スピン共鳴励起などによって)、局所的な電磁場に影響を及ぼし(例えば、常磁性種、超常磁性種、フェリ磁性種、又は強磁性種)、放射線エネルギー(例えば発色団及びフルオロフォア)、粒子(液体含有小胞を含む)、重金属及びその化合物、並びに検出可能な物質を発生する部分、及びその他を吸収又は散乱する、材料又は化学的部分であり得る。
いくつかの実施態様では、ペプチド模倣体は細胞毒性基を含む。本明細書において使用する「細胞毒性基」という用語は、細胞毒性基を含むペプチド模倣体が結合しているか又はそれが内部移行している細胞の死滅を直接的又は間接的に引き起こす、任意の材料又は化学的部分を指す。
本発明のいくつかの実施態様では、ペプチド模倣体は光増感剤を含む。
本発明のペプチド模倣体は、本明細書において定義されているような配列を有するアミノ酸ポリマーを含む。ペプチド模倣体に含まれるアミノ酸の総数は、本明細書において定義されているように制限されている。アミノ酸ポリマーに加えて、本発明のペプチド模倣体は、レポーター基、細胞毒性基、光増感剤、キレート剤、補欠分子族、薬物動態修飾因子、リンカー、又はスペーサーなどのさらなる成分を含んでいてもよい。これらの個々の成分又は化学的部分は、共有結合、イオン結合、又は配位結合を通して、互いに又はアミノ酸ポリマーに直接接続していてもよく、例えば、レポーター基又は細胞毒性基は、配位結合を通してキレート剤と接続していてもよい。
本発明のペプチド模倣体は、1つのレポーター基若しくは細胞毒性基、又は複数のレポーター基若しくは細胞毒性基を含み得る。いくつかの実施態様では、ペプチド模倣体はまた、レポーター基と細胞毒性基を含んでいてもよい。いくつかの実施態様では、レポーター基、細胞毒性基、又はその両方は、ペプチド模倣体のアミノ酸ポリマーに、例えば共有結合を通して直接連結されていてもよい。他の実施態様では、レポーター基、細胞毒性基、又はその両方は、ペプチド模倣体のアミノ酸ポリマーに間接的に連結されていてもよい。
レポーター基又は細胞毒性基の導入のために、ペプチド模倣体は、キレート剤又は補欠分子族を含むことができる。キレート剤又は補欠分子族は、ペプチド模倣体のアミノ酸ポリマーの、N末端、C末端、又は任意のアミノ酸側鎖に、又はリンカー若しくは薬物動態修飾因子に存在する官能基にコンジュゲートさせることができる。好ましくは、キレート剤又は補欠分子族は、ペプチド模倣体のアミノ酸ポリマーのN末端にコンジュゲートしている。
本発明はまた、本明細書に記載のような本発明のペプチド模倣体の作製法に関する。本発明のペプチド模倣体の作製は、当業者には利用可能な標準的な有機化学法及び固相ペプチド合成法によって可能である。該方法は少なくとも、ペプチド模倣体のアミノ酸ポリマーを合成する工程を含む(Behrendt R et al., J Pept Sci 2016, 22: 4-27; Jones J, Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press, New York 2002; Goodman M, Toniolo C, Moroder L, Felix A, Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry, Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, workbench edition set, Thieme Medical Publishers, 2004)。
実施例1:本発明のペプチド模倣体の合成
本発明のペプチド模倣体の合成は、標準的な9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)化学を使用して実施された。
インビトロにおいて放射性標識されたペプチド模倣体を特徴付けるために、ヒト血清中の安定性を試験した。111Inで標識されたペプチド模倣体を、新鮮なヒト血清中で500~2000pmol/mLの濃度で、37℃で最大24時間かけてインキュベートし、分解を、ラジオHPLCによって評価した。この目的のために、ヒト血清試料をACNを用いて沈降させ、2000gで2分間遠心分離にかけ、水で希釈し(1:1/v:v)、その後、フェノメネクス社のJupiter ProteoC12カラム(90Å、4μm、250×4.6mm)又はBischoff社のクロマトグラフィーヌクレオシルC18カラム(120Å、5μm、250×4.6mm)を具備した、放射線検出及びUV検出を含む、ダイオネクス社のクロマトグラフィーシステムで、様々な水/アセトニトリル/0.1%TFA勾配系を使用して、HPLC分析を行なった。図1に示されているように、ヒト血清中の放射性標識されたペプチド模倣体の安定性は、24時間インキュベートした後に、それぞれ16.1%(n=2)及び60.1%(n=1)のインタクトな放射性標識されたペプチド模倣体を示した、111Inで標識されたDOTA-MG11及び111In-DOTA-MGS1と比較するとかなり増加した。111In-DOTA-MGS5、111In-DOTA-MGS5-2、111In-DOTA-MGS8、111In-DOTA-MGS9、及び111In-DOTA-MGS10は同じ時点で、94%を超える数値を示し、それ故、酵素による分解に対してはるかにより高い安定性を示した。111In-DOTA-MGS11及び111In-DOTA-MGS12もまた、ヒト血清中において94%を超えるインタクトな放射性ペプチドを示した。この安定化は、MGのC末端受容体特異的配列内に少なくとも2つの置換を、好ましくは追加のN末端における置換と組み合わせて適用することによって達成される。本発明者らはさらに、Metを(N-Me)Nleで単一置換した111In-DOTA-MGS16を試験し、部分的な安定化が判明した(53.1%のインタクトな放射性ペプチド、n=2)。このことは、例えば(N-Me)Nle又は1Nalを用いての単一置換は、ペプチド模倣体を分解から完全に保護せず、本発明に記載のような、異なる位置における置換の組合せのみが、ペプチド模倣体の完全な安定化を可能とすることを確認する。
さらに、血清タンパク質へのタンパク質の結合を調べた。この目的のために、111Inで標識されたペプチド模倣体をデュプリケートで、新鮮なヒト血清中(500pmol/mL)で37℃でインキュベートし、セファデックスG-50サイズ排除クロマトグラフィー(GEヘルスケアIllustra、リトル・チャルフォント、英国)によって4時間後及び24時間後に分析した。カラム及び溶出液を2480ウィザード2自動γカウンター(パーキンエルマーライフサイエンスアンドアナリティカルサイエンス社、トゥルク、フィンランド)で測定することによって、タンパク質結合率を決定した。結果を表5にまとめる。
CCK2Rに対する親和性を、Luigi Aloj博士(Aloj L et al., J Nucl Med 2004, 45: 485-494)によって親切にも提供された、ヒトCCK2R(A431-CCK2R)の完全コード配列を含有しているプラスミドpCR3.1が安定にトランスフェクトされたA431ヒト類表皮癌細胞において試験した。ペンタガストリン(Boc-β-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2)、DOTA-MG11、及びPP-F11(ペンタ-Glu配列を5つのD-グルタミン酸残基で置換することによってMG0から誘導されたペプチド類似体)、並びにDOTA-MGS1及びDOTA-MGS4と比較した、[125I]Tyr12-ガストリン-Iに対する結合親和性を競合アッセイで試験した。ガストリン-Iの放射性ヨウ素化はクロラミンT法を使用して実施された。キャリアの添加されていない[125I]Tyr12-ガストリン-Iを、HPLCによる精製によって得、分注して-20℃で保存した。結合アッセイは、10mMトリス/139mM NaCl pH7.4(2×250μl)で前処理された96ウェルフィルタープレート(マルチスクリーンHTS-FB、メルクグループ、ダルムシュタット、ドイツ)中で実施された。アッセイのために1ウェルあたり200,000~400,000個の数のA431-CCK2R細胞を、10mM MgCl2、14μMのバシトラシン、及び0.5%BSAを含有している35mM HEPES緩衝液(pH7.4)(細胞膜の完全性をかく乱する低張溶液)中で調製した。細胞をトリプリケートで、漸増濃度のペプチド模倣体(0.0003~10,000nM、例えば0.001~1000nM)及び[125I]-Tyr12-ガストリン-I(20,000~60,000cpm)と共に室温で1時間インキュベートした。インキュベーションを、培地のろ過及び氷冷10mMのトリス/139mM NaCl(pH7.4)(2×200μl)を用いた迅速な濯ぎによって中断し、フィルターをγカウンターで計数した。半最大阻害濃度(IC50)値を、オリジンソフトウェア(Microcal社のオリジン6.1、ノーサンプトン、マサチューセッツ州)を用いて非線形回帰に従って計算し、比較のために代表的なアッセイを選択した。表6に示されているように、低いナノモル範囲のIC50値を伴うCCK2Rに対する高い親和性を、試験された全てのペプチド模倣体について確認することができた。
これらの試験は、以前に公表されたプロトコール(von Guggenberg E et al., Bioconjug Chem 2004, 15: 864-871)に従って、100万個のA431-CCK2R細胞、並びに、対照としての空ベクターのみがトランスフェクトされた同細胞株(A431モック)を使用して実施された。1%(v/v)のウシ血清アルブミンの補充されたDMEMを内部移行用培地として使用し、遮断試験を実施する代わりに、非特異的な細胞への取り込みを、A431モック細胞において試験した。細胞をトリプリケートで、10,000~500,000cpm、例えば10,000~30,000cpmの放射性標識されたペプチド模倣体(アッセイにおいて0.4nM及び約600fmolの最終濃度の全ペプチド模倣体に相当する)と共にインキュベートし、37℃で2時間インキュベートした。A431-CCK2R細胞及びA431モック細胞において内部移行した画分を、添加された全放射活性に対して表現した(全体に対する%)。各々の放射性標識されたペプチド模倣体について、トリプリケートで実施された1つの代表的なアッセイの平均値が示されている。111In-DOTA-MGS1及び111In-DOTA-MGS4については、2つの独立したアッセイから得られた細胞への取り込みの平均値が考慮された。
放射性標識された本発明のCCK2R標的化ペプチド類似体の腫瘍への取り込みを評価する生体内分布試験を、7週令の雌無胸腺BALB/cヌードマウス(チャールズリバー、スルツフェルト、ドイツ)において実施した。全ての動物実験は、オーストリア動物保護法を順守し、オーストリア科学技術省の承認を得て実施された。腫瘍異種移植片の導入のために、A431-CCK2R細胞及びA431モック細胞を、それぞれ右側腹部及び左側腹部の皮下に注射した(200μl中に200万個の細胞)。腫瘍が約0.2mlのサイズに到達したら、生体内分布試験を実施した。4匹のマウスのグループに、外側尾静脈を介して、111In(約0.2MBq及び0.02nmolのペプチド模倣体)、68Ga(約0.8MBq及び0.02~0.03nmolのペプチド模倣体)、177Lu(約0.5MBq及び0.02nmolのペプチド模倣体)、又は99mTc(約0.3MBq及び0.02nmolのペプチド模倣体)で標識された本発明のペプチド模倣体を静注した。注射から1時間又は4時間の期間の後(p.i.)、動物を頸椎脱臼によって屠殺し、腫瘍及び他の組織(血液、肺、心臓、筋肉、骨、脾臓、腸、肝臓、腎臓、胃、膵臓)を取り出し、秤量し、それらの放射活性をγカウンターで測定した。結果は、組織1gあたりに注射された活性の比率(%IA/g)として表現され、臓器に対する腫瘍の活性の比を、解体した組織において測定された活性から計算した。図4では、本発明の111In標識ペプチド模倣体についての、注射から4時間後における生体内分布試験の結果を、111In-DOTA-MGS1及び111In-DOTA-MGS4と比較してまとめる(Klingler M et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging 2017, 44: S228)。図5では、異なる放射性金属で放射性標識された、DOTA-MGS5及びHYNIC-MGS5という本発明のペプチド模倣体モデルについての結果が、注射から1時間後又は4時間後という異なる時点において示されている。迅速な血液からのクリアランス、主に腎からの排泄、及び大半の組織における低く非特異的な取り込み、及び腎臓における少ない滞留と共に全体的に非常に改善された生体内分布プロファイルが、全ての放射性リガンドについて観察された。111Inで標識された様々なペプチド模倣体は、CCK2R発現組織である胃(約8%IA/g)及び膵臓(約2%IA/g)においてより高い取り込みを示した。111In-DOTA-MGS9は、腸及び肝臓(約2%IA/g)、特に腎臓(約20%IA/g)において幾分より高い取り込みを示した。CCK2Rにより媒介される作用についての、主要なファルマコフォアとしてのC末端Trp-Met-Asp-Phe-NH2テトラペプチドの決定的な重要性から(Stone SR et al., Peptides 2007, 28: 2211-2222)、この特定のアミノ酸配列内に2つの置換を有する本発明のペプチド模倣体が、インビボでA431-CCK2R腫瘍異種移植片において非常に特異的な腫瘍標的化を示したことは非常に驚くべきことであった。本発明の全てのペプチド模倣体は、111In-DOTA-MGS1(1.3±0.1%IA/g)及び111In-DOTA-MGS4(10.2±2.0%IA/g)と比較して、2~40倍、例えば2.3~35.6倍高い腫瘍への取り込みを示した(Klingler M et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging 2017, 44: S228)。注射から4時間後にそれぞれ42.8±2.3%IA/g及び46.3±8.2%IA/gの数値を示す、111In-DOTA-MGS8及び111In-DOTA-MGS10は、腫瘍への最も高い取り込みを示した。また、111In-DOTA-MGS9を用いても、腫瘍への高い取り込みが観察され(33.9±9.5%IA/g)、これはしかしながら腎臓へのより高い取り込み(20.7±4.4%IA/g)も伴った。111In-DOTA-MGS5及び111In-DOTA-MGS5-2は、それぞれ、23.5±1.3%IA/g及び25.5±4.5%IA/gという腫瘍への取り込みを示した。1%未満のIA/gの数値を示す、A431モックの腫瘍異種移植片への取り込みは非常に少なく、これにより、受容体特異的な腫瘍への高い取り込みが確認された。理論により束縛されるものではないが、より高い安定性、より高いタンパク質結合、及び改善された細胞内への内部移行によってまた、インビボにおける腫瘍へのより高い取り込みがもたらされたと考えられる。それ故、高い安定性とインビボにおける増加したタンパク質結合との組合せにより、血中の酵素的分解から放射性リガンドが最適に保護されることになると考えられ、これにより、腫瘍への極めて高い取り込みに到達することが可能となる。この印象的な腫瘍への高い取り込みはまた、ペプチド模倣体モデルとしてDOTA-MGS5及びHYNIC-MGS5を使用し、様々な放射性同位体を用いた放射性標識においても確認することができた。177Lu-DOTA-MGS5(24.5±3.1%IA/g)、68Ga-DOTA-MGS5(23.3±4.7%IA/g)、及び99mTc-HYNIC-MGS5(24.8±4.4%IA/g)は、111In-DOTA-MGS5(23.5±1.3%IA/g)と同等な腫瘍への取り込みを示した。68Ga-DOTA-MGS5は、血液、肺、及び心臓において、組織への幾分より高く非特異的な取り込み(1~2%IA/g)を示したが、一方、Lu-177、Ga-68、及びIn-111で標識されたDOTA-MGS5の腎臓への取り込み(4~6%IA/g)並びにCCK2R発現臓器である胃(5~8%IA/g)及び膵臓(2~3%IA/g)への取り込みは同等であった。99mTc-HYNIC-MGS5は、全ての放射性同位体の中で最も高い腎臓への取り込み(8%IA/g)、並びに胃(13%IA/g)及び膵臓(7%IA/g)におけるより高い取り込み傾向を示した。A431モックの腫瘍異種移植片では、1%未満のID/gという非常に低い取り込みが、全ての放射性リガンドについて観察され、このことから、A431-CCK2R腫瘍異種移植片への受容体特異的取り込みが確認された。
インビボにおける放射性標識されたペプチド模倣体の安定性をさらに特徴付けるために、111Inで標識されたペプチド模倣体及び177Luで標識されたペプチド模倣体が静注された5~6週令の雌BALB/cマウス(チャールズリバー、スルツフェルト、ドイツ)において代謝試験を実施した。全ての動物実験は、オーストリア動物保護法を順守し、オーストリア科学技術省の承認を得て実施された。ラジオHPLCによる代謝のモニタリングを可能とするために、マウスに、外側尾静脈を通してより高い量の放射能(1~2nmolの全ペプチドに相当する、5~15MBqの111In及び20~40MBqの177Lu)を注射し、頸椎脱臼によって注射から10分後又は30分後(p.i.)に安楽死させた。血液試料を収集し、分解をラジオHPLCによって評価した。この目的のために血液試料をACNを用いて沈降させ、2000gで2分間遠心分離にかけ、水(1:1/v:v)で希釈し、その後、フェノメネクス社のJupiter ProteoC12カラム(90Å、4μm、250×4.6mm)又はBischoff社のクロマトグラフィーヌクレオシルC18カラム(120Å、5μm、250×4.6mm)を具備した、放射線検出及びUV検出を含む、ダイオネクス社のクロマトグラフィーシステムを使用して、様々な水/アセトニトリル/0.1%TFA勾配系を使用して、HPLC分析を行なった。
PP-F11N:DOTA-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2
Claims (20)
- 以下の構造を有するペプチド模倣体:
68 Ga-DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH 2
(式中、特記されない限り、アミノ酸はアミド結合を通して連結されている)。 - 請求項1に記載のペプチド模倣体を製造する方法であって、前記ペプチド模倣体を合成する工程を含む、方法。
- 請求項1に記載のペプチド模倣体を含む、診断用組成物。
- 請求項1に記載のペプチド模倣体を含む、診断における使用のための診断用組成物。
- 請求項1に記載のペプチド模倣体を含む、がんの診断における使用のための診断用組成物。
- 前記がんが、がん細胞の表面にコレシストキニン-2受容体(CCK2R)を発現している、請求項5に記載の診断用組成物。
- 細胞をイメージングする方法のための診断用組成物であって、前記診断用組成物が請求項1に記載のペプチド模倣体を含み、前記方法が、
a)前記細胞を請求項1に記載のペプチド模倣体に接触させる工程、及び
b)細胞と接触している 68 Gaを可視化する工程
を含む、診断用組成物。 - 前記工程a)が、患者に前記ペプチド模倣体を投与する工程を含む、請求項7に記載の診断用組成物。
- 前記細胞ががん細胞である、請求項8に記載の診断用組成物。
- 前記がん細胞がその表面にCCK2Rを発現している、請求項9に記載の診断用組成物。
- がん診断用の医薬の製造における、請求項1に記載のペプチド模倣体の使用。
- 前記がんが、がん細胞の表面にCCK2Rを発現している、請求項11に記載の使用。
- 以下の構造を有するペプチド模倣体:
177 Lu-DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH 2
(式中、特記されない限り、アミノ酸はアミド結合を通して連結されている)。 - 請求項13に記載のペプチド模倣体を製造する方法であって、前記ペプチド模倣体を合成する工程を含む、方法。
- 請求項13に記載のペプチド模倣体を含む、医薬組成物。
- 請求項13に記載のペプチド模倣体を含む、治療における使用のための医薬組成物。
- 請求項13に記載のペプチド模倣体を含む、がんの処置における使用のための医薬組成物。
- 前記がんが、がん細胞の表面にコレシストキニン-2受容体(CCK2R)を発現している、請求項17に記載の医薬組成物。
- がん処置用の医薬の製造における、請求項13に記載のペプチド模倣体の使用。
- 前記がんが、がん細胞の表面にCCK2Rを発現している、請求項19に記載の使用。
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