CN110891589A - 用于诊断和治疗的改善的药代动力学和胆囊收缩素-2受体(cck2r)靶向 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗和诊断目的的有价值的肽模拟物，以及基于这些肽模拟物的组合物、方法、用途和试剂盒。特别地，本发明的肽模拟物被表达CCK2R的细胞摄取，例如被癌细胞摄取。这允许例如选择性地破坏癌细胞或选择性地对表达CCK2R的癌细胞进行成像。

Description

用于诊断和治疗的改善的药代动力学和胆囊收缩素-2受体 (CCK2R)靶向
背景技术
除了其他方面，本发明涉及具有改善的特异性胆囊收缩素-2受体(CCK2R)靶向特性的肽模拟物及其诊断和治疗用途。胆囊收缩素受体分为两种受体亚型——CCK1R和CCK2R。CCK2R已在诸如神经内分泌肿瘤、甲状腺髓样癌(MTC)、小细胞肺癌(SCLC)、平滑肌肉瘤/平滑肌瘤、胃肠道间质瘤、胰岛瘤、舒血管肠肽瘤、类癌、星形细胞瘤、卵巢间质癌、乳腺癌和子宫内膜腺癌等的各种肿瘤中鉴定到(Reubi JC et al.,Cancer Res1997,57:1377-1386；Reubi JC,Curr Top Med Chem 2007,7:1239-1242；Sanchez C et al.Mol CellEndocrinol 2012,349:170-179)，而CCK1R仅在有限数量的人类肿瘤中表达。基于CCK2R、胆囊收缩素(CCK)或胃泌素的内源性配体，已经开发出了不同的放射性标记的肽探针。两种肽CCK和胃泌素以几乎相同的亲和力和效价结合CCK2R，并在C端共有一个共同的生物活性区域Trp-Met-Asp-Phe(Dufresne M et al.,Physiol Rev 2006,86:805-847)，其被证明对于受体结合是必不可少的(Tracy HJ et al.,Nature 1964,204:935-938)。由于亲本肽的生理半衰期非常短，因此通常需要对该肽进行额外的合成修饰来在代谢上稳定该线性氨基酸序列以用于医疗应用(Fani M et al.,Theranostics 2012,2:481-501)。也已为放射性标记的CCK和胃泌素类似物开发了这样的修饰(Roosenburg S et al.,Amino Acids 2011,41:1049-1058)。除了基于Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2(CCK8)和Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2(小胃泌素，MG)的放射性配体之外，还提出了非肽配体(Wayua C et al.,J Nucl Med 2015,56:113-119)。最近通过利用发荧光的靶向CCK2R的MG类似物(dQ-MG-754)的光学成像，在荷有来源于结直肠腺癌细胞的肿瘤异种移植物的裸小鼠中也可以证明CCK2R特异性肿瘤摄取(Kossatz S et al.,Biomaterials2013,34:5172-5180)。通过利用与tubulysin B缀合的强效CCK2R配体Z-360，将细胞毒性药物选择性地递送至CCK2R阳性肿瘤，可在临床前动物模型中观察到肿瘤消退(Wayua C etal.,Mol Pharm 2015,12:2477-2483)。
利用放射性标记的[二乙烯三胺五乙酸0，D-Glu1]小胃泌素(DTPA-MG0)，已获得了良好的肿瘤靶向特性，然而，在用90Y标记的DTPA-MG0治疗的患者中也观察到了非常高的肾脏摄取，引起严重的肾脏副作用(BéhéM et al.,Biopolymers 2002,66:399-418)。然而，已证明在用于患有MTC和SCLC的患者中的肿瘤检测方面，111In-DTPA-MG0优于生长抑素受体闪烁扫描术和2-脱氧-2-[18F]氟-D-葡萄糖正电子发射断层扫描术(FDG PET)，并且已表明其在具有低生长抑素受体表达的神经内分泌肿瘤中还具有额外的价值(Gotthardt M etal.,Eur J Nucl Med Mol Imaging 2006,33:1273-1279；Gotthardt M et al.,EndocrRelat Cancer 2006,13:1203-1211)。
利用截短的111In标记的肽类似物[1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸0,D-Glu1,DesGlu2-6]小胃泌素(DOTA-MG11)，在动物研究中显示出显著降低的肾脏摄取(Behe M et al.,Eur J Nucl Med Mol Imaging 2005:32,S78)，并在首次临床研究中得到了证实(Froberg AC et al.,Eur J Nucl Med Mol Imaging 2009,36:1265-1272)。然而，由于针对酶促降解的稳定性明显降低以及低于5分钟的体内低生物学半衰期(Breeman WAet al.,Nucl Med Biol 2008,35:839-849)，利用111In-DOTA-MG11仅观察到较差的诊断功效。为了在降低肾脏滞留的同时增加酶促稳定性并提高特异性受体靶向，已在肽的N端区域中尝试了对肽序列的不同修饰(Aloj L et al.,Eur J Nucl Med Mol Imaging 2011,38:1417-1425；Laverman P et al.,Eur J Nucl Med Mol Imaging 2011,38:1410-1416)。在C端区域中也尝试了仅非常少的修饰，并且限于用诸如正亮氨酸或高炔丙基甘氨酸(homopropargylglycin)的非天然氨基酸代替蛋氨酸来防止与受体亲和力丢失有关的蛋氨酸氧化(Mather SJ et al.,J Nucl Med 2007,48:615-622；Roosenburg S et al.,Bioconjug Chem2010,21:663-670)。然而，对注射了这些用177Lu标记的不同的新肽类似物的BALB/c小鼠的血液和尿液的分析表明，注射后已经10min仍检测不到完整的放射性配体(Ocak M et al.,Eur J Nucl Med Mol Imaging 2011,38:1426-1435)。而且，非经典氨基酸甲氧氨基酸(methoxinine)最近已被用来代替氧化敏感的蛋氨酸残基并化学稳定MG类似物(Grob NM et al.,J Pept Sci 2017,23:38-44)，但是没有改善生物学半衰期。上述研究清楚表明，迄今为止采用的化学修饰在改善体内生物学半衰期和靶向特性方面并不成功。
本发明人先前已生成了两种111In标记的肽类似物，其具有结构111In-DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-1Nal-NH2和111In-DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-(N-Me)Phe-NH2，分别称为MGS1和MGS4(Klingler M et al.,Eur J Nucl Med MolImaging 2017,44:S228)。与DOTA-MG11相比，这些肽类似物在血清中显示出增加的稳定性。然而，需要关于细胞摄取和特异性受体靶向的进一步改善。因此，本发明人开发了其他的肽模拟物，并研究了其酶稳定性、受体亲和力和特异性受体靶向，包括还评估了肾脏滞留的体外细胞摄取和体内肿瘤摄取。本发明人惊奇地发现，靶向CCK2R的一组新的肽模拟物具有优异的抗酶促降解稳定性，同时具有改善的体内肿瘤摄取和滞留。不受任何特定理论的束缚，目前据信改善的肿瘤摄取和滞留至少部分归因于改善的细胞摄取。
发明内容
本发明的目的是改善靶向CCK2R的肽模拟物的血清中的半衰期，优选地还有体内稳定性、细胞摄取和肿瘤靶向特性，同时保留低的肾脏滞留。根据本发明，该目的通过本发明的以下实施方式和方面来实现。
在第一种实施方式中，本发明提供了包含具有序列X1-X2-Asp-X3的氨基酸聚合物的肽模拟物，其中X1是疏水性氨基酸，诸如Phe或Trp，X2是与Met具有结构相似性的疏水性氨基酸，诸如Leu或Nle，X3是与Phe具有结构相似性的非天然疏水性氨基酸，诸如1Nal和2Nal，并且该肽模拟物具有5至50个氨基酸的长度。
在优选的实施方式中，本发明的肽模拟物包含具有序列X4-X5-X6-X7-X1-X2-Asp-X3的氨基酸聚合物，其中X4是Leu或其他疏水性氨基酸诸如Pro，或任何蛋白原带电荷的氨基酸，诸如Arg、Asp、Lys、His或Glu，优选地为D型，X5是Ala、β-Ala、Tyr或Pro，X6是Tyr、Pro、Phe、Met或与Met具有结构相似性的疏水性氨基酸，诸如Leu或Nle，并且X7是Gly、Thr、Ser、Ala、β-Ala或Pro。在其他实施方式中，与N端缀合的化学基团和X4、X4和X5、X5和X6、X6和X7、X7和X1、X1和X2、X2和Asp以及Asp和X3之间的至少一个键(-)是异肽键或假肽键，诸如-NHCO-、-CONCH3-或-CH2NH-。优选地，C端被酰胺化。优选地，肽模拟物包含8-13个氨基酸。在一些实施方式中，肽模拟物包含报告基团或细胞毒性基团。在一些实施方式中，报告基团或细胞毒性基团被肽模拟物包含的螯合剂配位。在一些实施方式中，报告基团或细胞毒性基团是肽模拟物包含的辅基的一部分。优选地，报告基团或细胞毒性基团是放射性核素。
在另一实施方式中，本发明提供了产生本发明的肽模拟物的方法，包括合成氨基酸聚合物。
此外，本发明提供了包含本发明的肽模拟物的药物或诊断组合物。
本发明还提供了本发明的肽模拟物用于向细胞递送报告基团或细胞毒性基团的用途。
在另一方面，本发明提供了靶向和成像细胞的方法，其中该方法包括以下步骤：a)使细胞与本发明的肽模拟物接触，其中该肽模拟物包含报告基团，以及b)将与细胞接触的报告基团可视化。
在优选的实施方式中，接触包括向患者给药本发明的肽模拟物，其中该肽模拟物包含报告基团，优选地，其中该患者患有癌症。
本发明还提供了本发明的肽模拟物用于治疗的用途。
本发明还提供了本发明的肽模拟物用于治疗癌症的用途，优选地，该癌症是在肿瘤细胞的表面上表达CCK2R的癌症。
本发明还提供了本发明的肽模拟物用于诊断，优选诊断癌症，更优选诊断本文中提及的癌症类型的用途。
在优选的实施方式中，本发明的肽模拟物与CCK2R特异性结合。与CCK2R的特异性结合允许靶向表达CCK2R的细胞和组织超过不表达CCK2R的细胞和组织。本发明的肽模拟物的这种特点可用于诊断和治疗目的，例如，用于诊断和治疗某些类型的癌症，特别是表达CCK2R的癌症。然而，本发明的教导不限于癌症，而是涉及与CCK2R的表达有关的任何疾病。特别地，本发明的肽模拟物可用于诊断和治疗目的，因为其显示出被表达CCK2R的细胞的高水平的细胞摄取(细胞内化)。另外，本发明的肽模拟物是有用的，因为其对于降解，特别是在血清中被蛋白酶降解，优选在体内被多种蛋白水解酶代谢降解是特别稳定的。此外，本发明的肽模拟物是有用的，因为其不会在肾脏中积累，或者其仅在肾脏中积累至较低水平而对用本发明的肽模拟物治疗的患者无害。
上述实施方式是本发明的特别优选的实施方式。要强调的是，以上实施方式或其中的各个技术特征的任何组合在本文中也被公开为本发明的一部分。技术人员理解，本发明不限于以上明确陈述的实施方式，而且还包括上文或下文未明确公开的组合。例如，这样的组合是通过将上述的本发明的方面、实施方式或特征与下面在本发明的详细描述中公开的本发明的方面、实施方式或特征进行组合而得到的。技术人员将理解，实际上，上述实施方式将与下面进一步给出的详细描述的相应部分以及本申请中阐述的实施例一起考虑。此外，说明书中给出的任何标题通常不应被解释为对标题下公开的主题的限制，即可以将一个标题下公开的主题与在不同标题下描述的主题结合起来阅读。
通过以下详细描述，本发明的其他方面、实施方式、特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解，尽管详细描述和具体实施例指示本发明的优选实施方式，但是其仅是通过说明的方式给出的，因为根据详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
在以下部分中将更详细地描述本发明，并在以下显示的附图中进行说明：
图1在将本发明的111In标记的肽模拟物在人血清中温育24h后，如通过放射性HPLC分析的，相比111In-DOTA-MG11和111In-DOTA-MGS1的针对人血清中的酶促降解的稳定性：放射性标记之后的放射化学纯度(虚线)，在人血清中温育之后的放射性HPLC(实线)。
图2在A431-CCK2R和A431-mock细胞上温育2h之后，本发明的111In标记的肽模拟物相比111In-DOTA-MG11、111In-PP-F11、111In-PP-F11N、111In-DOTA-MGS1和111In-DOTA-MGS4的细胞内化。
图3在A431-CCK2R和A431-mock细胞上温育2h之后，本发明的肽模拟物的细胞内化：A)用111In、68Ga和177Lu放射性标记的DOTA-MGS5，以及用99mTc标记的HYNIC-MGS5，和B)用177Lu放射性标记的DOTA-MGS10、PP-F11和PP-F11N，和C)用68Ga放射性标记的DOTA-MGS12。
图4在注射后(p.i.)4h时，选择的本发明的111In标记的肽模拟物相比111In-DOTA-MGS1和111In-DOTA-MGS4在荷有A431-CCK2R和A431-mock肿瘤-异种移植物的裸小鼠中的生物分布。值表示为百分比注射的活性每克(％ΙΑ/g；平均值±SD，n＝4；111In-DOTA-MGS1和111In-DOTA-MGS4，n＝3)。
图5对于注射后(p.i.)1h或4h的不同时间点，用111In、68Ga和177Lu放射性标记的肽模拟物DOTA-MGS5以及用99mTc标记的HYNIC-MGS5在荷有A431-CCK2R和A431-mock肿瘤-异种移植物的裸小鼠中的生物分布。值表示为％ΙΑ/g(平均值±SD，n＝4)。
图6在静脉注射以下之后：A)本发明的111In标记的肽模拟物(在注射后(p.i.)10min)和B)示例性的本发明的177Lu标记的肽模拟物相比177Lu-PP-F11和177Lu-PP-F11N(在注射后(p.i.)30min)，如通过采自BALB/c小鼠的血液样品的放射性HPLC分析的针对体内酶促降解的稳定性：放射性标记之后的放射化学纯度(虚线)，血液样品的放射性HPLC(实线)。
具体实施方式
本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利、专利申请和科学出版物，均通过引用并入本文用于所有目的，就好像每个单独的出版物均被明确地和单独地指出通过引用并入本文。
使用的术语“包含(comprising)”以及其他语法形式诸如“包含(comprises)”和“包含(comprised)”为非限制性的。术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”应理解为是指本发明的实施方式的开放性的描述，其可以但不必包括除明确陈述的技术特征之外的其他技术特征。在同样意义上，术语“涉及(involving)”以及其他各自的语法形式诸如“涉及(involves)”和“涉及(involved)”为非限制性的。这同样适用于术语“包括(including)”和其他的语法形式，诸如“包括(includes)”和“包括(included)”。整个说明书中的章节标题仅用于组织目的。特别地，它们不旨在限制其中描述的各种实施方式，并且应当理解，在一个小标题下描述的实施方式(及其中的特征)可以与在另一小标题下描述的实施方式(及其中的特征)自由组合。此外，术语“包含(comprising)”、“涉及(involving)”和“包括(including)”及其任何语法形式不应解释为专门指包括明确列举的那些特征之外的其他特征的实施方式。这些术语同样指仅由明确提及的那些特征组成的实施方式。
如本文所用，术语“肽模拟物”、“肽类似物”或“肽衍生物”或“肽缀合物”是指包含两个或更多个氨基酸的聚合物的化合物，其包含至少一种非天然氨基酸、假肽键或不同于氨基酸的化学部分，诸如报告基团或细胞毒性基团，还包括螯合剂、辅基、连接子或药代动力学改性剂。如本文所定义的肽模拟物通常模拟天然肽的生物活性。在本情形下，本发明的肽模拟物在具有能力的意义上模拟天然CCK2R配体(诸如胃泌素)与CCK2R结合的能力。
如本文所用，术语“氨基酸聚合物”是指两个或更多个氨基酸的聚合物。
术语“肽”是指通过酰胺键连接的L型的两个或更多个蛋白原氨基酸(蛋白氨基酸，proteinogenic amino acid)的聚合物。
如本文所用，术语“氨基酸”是指在其单体状态下含有至少胺(-NH2)和羧基(-COOH)官能团的化合物。如果通过肽键与另一氨基酸结合，则该氨基酸的胺或羧基基团将与另一氨基酸的胺或羧基基团形成酰胺基团-CONH-。如下文所述，如果氨基酸通过假肽键与另一氨基酸缀合，则根据假肽键的性质，胺或羧基基团可被其他化学部分取代。优选地，如本文所用的术语“氨基酸”是指α-氨基酸或β-氨基酸。如本文所用，术语“氨基酸”包括蛋白原氨基酸丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；蛋氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；缬氨酸(Val)和硒代半胱氨酸(Sec)。如本文所用的术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸。
在本申请的意义上，“非天然氨基酸”是天然存在的或是化学合成的非蛋白原氨基酸，例如正亮氨酸(Nle)、甲氧氨基酸、高炔丙基甘氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸类似物，诸如在Liu CC,Schultz PG,Annu Rev Biochem 2010,79:413-444和LiuDR,Schultz PG,Proc Natl Acad Sci U S A 1999,96:4780-4785中描述的那些。如本文所用的非天然氨基酸可以是例如D型的蛋白原氨基酸，例如DGlu。另外考虑的非天然氨基酸是对位、邻位或间位取代的苯丙氨酸，诸如对乙炔基苯丙氨酸、4-Cl-苯丙氨酸(Cpa)、4-氨基-苯丙氨酸和4-NO2-苯丙氨酸、高脯氨酸、高丙氨酸、β-丙氨酸、1-萘基丙氨酸(1Nal)、2-萘基丙氨酸(2Nal)、对苯甲酰基-苯丙氨酸(Bpa)、双苯丙氨酸(Bip)、高苯丙氨酸(hPhe)、高炔丙基甘氨酸(Hpg)、叠氮高丙氨酸(Aha)、环己基丙氨酸(Cha)、氨基己酸(Ahx)、2-氨基丁酸(Abu)、叠氮正亮氨酸(Anl)、叔亮氨酸(Tie)、4-氨基-氨基甲酰基-苯丙氨酸(Aph(Cbm))、4-氨基-氢化乳清酰-苯丙氨酸(Aph(Hor))、S-乙酰胺甲基-L-半胱氨酸(Cys(Acm))、3-苯噻嗯基丙氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(Sta)。这些非天然氨基酸中的一些已被开发用于生长抑素和蛙皮素类似物(Fani M et al.,J Nucl Med 2011,52:1110-1118；Glnj M etal.,Proc Natl Acad Sci U S A 2006,103:16436-16441；Glnj M et al.,Clin CancerRes 2005,11:1136-1145；Mansi R,J Med Chem 2015,58:682-691)。
如本文所用，术语“疏水性氨基酸”是指在生理pH(约pH 7.4)下具有净零电荷的氨基酸。疏水性氨基酸可以是蛋白疏水性氨基酸或非天然疏水性氨基酸。蛋白疏水性氨基酸是例如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。优选的蛋白疏水性氨基酸为脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。非天然疏水性氨基酸是例如正亮氨酸(Nle)、甲氧氨基酸、叔亮氨酸(Tle)、1-萘基丙氨酸(1Nal)、2-萘基丙氨酸(2Nal)、3-苯噻嗯基丙氨酸、对苯甲酰-苯丙氨酸(Bpa)、双苯丙氨酸(Bip)、高苯丙氨酸(hPhe)、高炔丙基甘氨酸(Hpg)、叠氮高丙氨酸(Aha)、环己基丙氨酸(Cha)、氨基己酸(Ahx)、2-氨基丁酸(Abu)、叠氮正亮氨酸(Anl)、2-氨基辛炔酸(Aoa)、正缬氨酸(Nva)、对乙炔基苯丙氨酸、4-Cl-苯丙氨酸、高脯氨酸和高丙氨酸。
如本文所用的“与Met具有结构相似性的疏水性氨基酸”是具有与Met的生物电子等排体相似的分子几何结构和/或为Met的生物电子等排体的如上文所定义的疏水性氨基酸。特别地，在本发明的上下文中，与Met具有结构相似性的非天然疏水性氨基酸可以在位置X2和/或位置X6处插入，同时维持肽模拟物的足够的细胞摄取。如果肽模拟物的细胞摄取为如实施例5中所述的测定中的总活性的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％，则维持了肽模拟物的足够的细胞摄取。如本文所用的“与Met具有结构相似性的疏水性氨基酸”可以是蛋白疏水性氨基酸或非天然疏水性氨基酸，优选Nle或Leu。
如本文所用的“与Phe具有结构相似性的非天然疏水性氨基酸”是具有与Phe的生物电子等排体相似的分子几何结构和/或为Phe的生物电子等排体的如上文所定义的非天然疏水性氨基酸。特别地，在本发明的上下文中，与Phe具有结构相似性的非天然疏水性氨基酸可以在位置X3处插入，同时维持肽模拟物的足够的细胞摄取。如果肽模拟物的细胞摄取为如实施例5中所述的测定中的总活性的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％，则维持了肽模拟物的足够的细胞摄取。优选地，如本文所用的“与Phe具有结构相似性的非天然疏水性氨基酸”是1Nal或2Nal。
在一些实施方式中，本发明的肽模拟物具有的细胞摄取(即结合至细胞膜并内化至细胞内)的程度为如实施例5中所述的测定中的总活性的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％。
在一些实施方式中，本发明的肽模拟物特异性地结合CCK2R。本发明的肽模拟物对CCK2R的结合亲和力可以为CCK8、小胃泌素或五肽胃泌素对CCK2R的结合亲和力的至少约2％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％。在本发明的一些实施方式中，肽模拟物对CCK2R的结合亲和力甚至可以高于CCK8、小胃泌素或五肽胃泌素对CCK2R的结合亲和力，例如为如实施例4中所述的测定中的CCK8、小胃泌素或五肽胃泌素对CCK2R的结合亲和力的至少约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约500％、约1000％、约1500％或约2000％。在本发明上下文中的CCK2R的特异性结合意指本发明的肽模拟物与CCK2R的结合，其可被CCK2R的同源配体(诸如胃泌素)或同源配体的放射性标记的变体(诸如[125I]Tyr12标记的胃泌素-I)取代。半最大抑制浓度(IC50)是对如上文所解释的该特异性结合的一种度量，且可以从如实施例4中所述的测定中获得。
通过测量半最大抑制浓度(IC50)来确定根据本发明的结合亲和力，其中结合亲和力和IC50值具有逆关系，意指结合亲和力随IC50值降低而增加，并且结合亲和力随IC50值增加而降低。因此，约50％的结合亲和力意指IC50值为CCK8、小胃泌素或五肽胃泌素对CCK2R的IC50值的约两倍高。
如本文所用的术语“带电荷的氨基酸”包括在约7.4的生理pH下具有非零净电荷的氨基酸，并且包括蛋白和非天然氨基酸，例如，蛋白原氨基酸Arg、Lys、His、Glu和Asp。
肽模拟物的结构以本领域技术人员已知的三字母氨基酸代码表示，其起始于左侧肽模拟物的N端(氨基末端)，并终止于右侧肽模拟物的C端。例如，由四个氨基酸X4、X5、X6和X7组成的四肽模拟物或肽“X4-X5-X6-X7”在N端具有氨基酸X4，且在C端具有氨基酸X7。连字符“-”表示两个单独的氨基酸(例如X4和X5)之间的化学键。
连接本发明的肽模拟物的两个氨基酸的化学键可以是肽键，即酰胺键(-CONH-)。可以在与一个氨基酸的α碳连接的氨基基团和与另一氨基酸的α碳连接的羧基基团之间形成如本文所用的肽键。还可以在氨基基团和羧基基团之间形成肽键，其中一个不与氨基酸的α碳连接，而是与氨基酸的侧链连接(异肽键)，例如赖氨酸的侧链中的氨基基团。化学键也可以是假肽键。在优选的实施方式中，连接肽模拟物的两个氨基酸的化学键是酰胺键。
如本文所用的术语“假肽键”是指连接两个氨基酸的键，并且不是酰胺键(-CONH-)。酰胺化的C端中也可以包括假肽键。在本发明上下文中考虑了本领域已知的任何假肽键，例如-CH2NH-、-CONRCH2-、-CONCH3-(后者也称为N-Me)或-CONR-，其中R是烷基，优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1-甲基-2-甲基丙基、2,2-二甲基丙基或1-乙基丙基。
在本文中，两个氨基酸之间的化学键的特性可以在通过该键连接的氨基酸之间的圆括号或方括号中表明，例如X4-(N-Me)X5。在这种情况下，两个氨基酸X4和X5通过结构-CONCH3-的假肽键连接，其中酰胺氮被甲基化。以下示例性地为两个氨基酸X4和X5以及假肽键N-Me给出的拼写在本文中可互换使用，用于指示假肽键的性质：“X4-(N-Me)-X5”，“X4-(N-Me)X5”和“X4(N-Me)-X5”。烷基酯、烷基醚和脲键也被认为是假肽键。还考虑了其他伪肽键，诸如1,2,3-三唑(Mascarin A et al.,Bioconjug Chem 2015,26:2143-2152)或其他酰胺键生物电子等排体，其已被证明可以稳定肽模拟物并改善肿瘤靶向。
在一些实施方式中，假肽键的存在通过如本领域中通常使用的术语“psi”来表示。例如，X4-psi[CH2NH]-X5表示两个氨基酸X4和X5经由假肽键-CH2NH-连接。在一些实施方式中，假肽键可以是-psi[CH2-NH-CO-NH]-、-psi[CH2-NH]-、-psi[CH2-CH2]-、-psi[CS-NH]-或-psi[Tz]-。
其他优选的假肽键是：-COO-、-COS-、-COCH2-、-CSNH-、-CH2CH2-、-CHCH-、-CC-、-NHCO-、-CH2S-、-CH2-NH-CO-NH-和-CH2O-。
在本发明的上下文中，L-氨基酸和D-氨基酸同等地被考虑。除非另有说明，否则本发明的任何氨基酸都可以L或D型存在。L型通过在氨基酸名称之前直接加上“L”来表示，D型通过在氨基酸名称之前直接加上“D”来表示。例如，“DGlu”是指氨基酸谷氨酸的D型，且“LGlu”是指氨基酸谷氨酸的L型。在优选的实施方式中，肽模拟物的一个、多个或所有氨基酸的对映体形式为L型。例如，如果命名包括两种对映体形式，例如在“-Asp-”的情况下，则优选的对映体形式是L型(如为“-LAsp-”)。
还考虑了本发明的肽模拟物的环化形式，例如，可以通过将N端与C端、N端或N端氨基酸的侧链与氨基酸侧链，或者C端或C端氨基酸的侧链与氨基酸侧链，或者两个不同的氨基酸的两个侧链连接来环化肽模拟物。
在本发明的一些实施方式中，N端与连接子、间隔子、螯合剂或辅基缀合，并且C端被酰胺化。
术语“螯合剂”如本领域中所使用的，并且是指能够螯合金属离子的有机化合物。
术语“辅基”也称为双功能标记剂，如本领域中所使用，并且是指这样的小有机分子，其可以容易地例如用放射性核素进行放射性标记，并在放射性标记之前或之后与生物分子(诸如氨基酸聚合物)缀合，且不是螯合剂。通常，辅基与生物分子中存在的胺、硫醇或羧酸官能团缀合。还考虑了经由点击化学的缀合。
在本发明的优选实施方式中，对肽模拟物的C端(羧基端)进行修饰，以例如减少蛋白水解降解、延长保质期和/或改善细胞摄取。C端可以例如被-NR’R”基团酰胺化，其中R’和R”独立地是氢或如本文所定义的取代或未取代的烷基。在一些实施方式中，R’和R”独立地为乙基、丙基、丁基、戊基或己基。在一些优选的实施方式中，本发明的肽模拟物在C端被-NH2基团酰胺化。也可以用-C(O)OR”’类型的酯修饰C端，其中R”’可以是如本文所定义的取代或未取代的烷基，例如，乙基、丙基、丁基、戊基或己基。
如本文所用的术语“烷基”是指具有1至20(C1-C20)，优选1至15(C1-C15)，更优选1至10(C1-C10)，且最优选1至5(C1-C5)个碳原子的直链或支链饱和脂族烃。例如，“烷基”可以指甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1-甲基-2-甲基丙基、2,2-二甲基丙基和1-乙基丙基。
“烷基”基团可以被例如卤素(诸如氟、氯和溴)、胺(诸如伯胺(-NH2))、伯酰胺、羟基(-OH)、其他含氧、含硫或含氮官能团、杂环或芳基取代基(诸如苯基和萘基)取代。
在优选的实施方式(实施方式A)中，肽模拟物的X1-X2-Asp-X3中Asp的对映体形式是L-型(X1-X2-LAsp-X3)。
在另一优选的实施方式(实施方式B)中，X1-X2-Asp-X3的X2和Asp之间的键不是-CONCH3-(N-Me，NMe)。
在又一优选的实施方式(实施方式C)中，X1-X2-Asp-X3的X2和Asp之间的键是酰胺键。
在优选的实施方式(实施方式D)中，X1-X2-Asp-X3的X1和X2之间的键是-CONCH3-(N-Me，NMe)。
在优选的实施方式(实施方式E)中，X2是Nle。
特别优选的是实施方式(实施方式F)，其中X1-X2-Asp-X3的X1和X2之间的键是-CONCH3-(N-Me，NMe)，且X2是Nle。
在优选的实施方式(实施方式G)中，X1-X2-Asp-X3的X1和X2之间的键是-CONCH3-(N-Me，NMe)，X2是Nle，且X3是1Nal或2Nal，优选为1Nal。
在另一优选的实施方式(实施方式H)中，X4-X5-X6-X7中的一个或多个氨基酸残基是Pro。
特别优选的是实施方式G与实施方式A、B、C或H的组合。
本发明包括为实施方式A-H的组合的肽模拟物，特别地，所有实施方式A-H的组合的肽模拟物。这些实施方式可以与任何先前的或随后的实施方式组合。特别地，可以将任何公开的包括序列X1-X2-Asp-X3的肽模拟物与实施方式A-H或其任何组合进行组合。
特别优选的是这样的实施方式，其中X1-X2-Asp-X3是X1-(N-Me)Nle-(CONH)-LAsp-X3，并且其中X3是1Nal或2Nal。
在本发明的优选实施方式中，肽模拟物包含具有序列X4-X5-X6-X7-X1-X2-Asp-X3的氨基酸聚合物。优选地，肽模拟物在肽模拟物的C端包含该聚合物。更优选地，如上文所提及的，肽模拟物的C端被-NH2基团酰胺化。X4是Leu或其他疏水性氨基酸，诸如Pro，或任何蛋白原带电荷的氨基酸，诸如Arg、Asp、Lys、His和Glu。X5是Ala、β-Ala、Tyr或Pro。X6是Tyr、Pro、Phe、Met或与Met具有结构相似性的疏水性非天然氨基酸，诸如Nle。X7是Gly、Thr、Ser、Ala、β-Ala或Pro。氨基酸X1、X2和X3如本文中所定义。在本发明上下文中等同地考虑从氨基酸X4、X5、X6、X7、X1、X2和X3的上述或下述实施方式产生的任意组合。
本发明的肽模拟物包含5-50个氨基酸。如本文所用，术语“包含5至50个氨基酸”意指肽模拟物具有不超过50个氨基酸且不少于5个氨基酸。另外，包含性语言(“包含(comprising)”)意指肽模拟物可包含未明确陈述的其他组分，诸如螯合剂、辅基、连接子、间隔子、药代动力学改性剂、报告基团或细胞毒性基团。
在一些实施方式中，肽模拟物包含不超过45、40、35、30、25、20、15或13个氨基酸。特别优选的是包含5-15个氨基酸的肽模拟物。更优选的是包含8-13个氨基酸的肽模拟物。在本发明的一些实施方式中，肽模拟物包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。在本发明上下文中也考虑了从肽模拟物所包含的上述最大和最小数量的氨基酸的组合产生的任何范围，例如，在一些实施方式中，肽模拟物包含8至35、8至25或8至20个氨基酸。其中不包括范围的上下端点，包括范围的上下端点，其中包括下端点且不包括上端点，或者其中不包括下端点且包括上端点的上述范围被同等地考虑。该解释适用于本申请中叙述的所有范围。
在本发明的一些优选的实施方式中，肽模拟物包含8至13个氨基酸，X1是Trp，X2是Nle，且X3是1Nal或2Nal。在本发明的甚至更优选的实施方式中，肽模拟物包含8至13个氨基酸，X1是Trp，X2是Nle，X3是1Nal或2Nal，X1和X2之间的键是-CONCH3-，并且C端被-NH2基团酰胺化。在其他优选的实施方式中，肽模拟物包含8至13个氨基酸，X1是Trp，X2是Nle，X3是1Nal或2Nal，X1和X2之间的键是-CONCH3-，X1-X2-Asp-X3中的Asp为L型，X2和Asp之间的键是酰胺键(-CONH-)，并且C端被-NH2基团酰胺化。优选地，本文提及的这些和所有其他肽模拟物在N端被螯合剂DOTA或HYNIC修饰。
在本发明的一些实施方式中，X1是疏水性氨基酸。优选地，X1是Phe或Trp。最优选地，X1是Trp。
在本发明的一些实施方式中，X2是与Met具有结构相似性的疏水性氨基酸。优选地，X2是Leu或Nle。最优选地，X2是Nle。
在本发明的一些实施方式中，X3是与Phe具有结构相似性的非天然疏水性氨基酸。优选地，X3是1Nal或2Nal。最优选地，X3是1Nal。
在本发明的一些实施方式中，X4是Leu或其他疏水性氨基酸，诸如Pro，或蛋白原带电荷的氨基酸。优选地，X4是Leu、Arg、Asp、Asn、Lys、His或Glu。优选地，X4是D型氨基酸。最优选地，X4是DGlu或DLys，特别是DGlu。
在本发明的一些实施方式中，X5是Ala、β-Ala、Tyr或Pro。优选地，X5是Ala、Tyr或Pro。
在本发明的一些实施方式中，X6是Tyr、Pro、Phe、Met或与Met具有结构相似性的疏水性氨基酸，诸如Leu或Nle。优选地，X6是Tyr或Pro。
在本发明的一些实施方式中，X7是Gly、Thr、Ser、Ala、β-Ala或Pro。优选地，X7是Gly或Pro。
下表列出了本发明的特别优选的实施方式。特别优选的是包含或组成为具有表1所列序列的氨基酸聚合物的肽模拟物。在本发明的优选实施方式中，表1中列出的氨基酸聚合物位于肽模拟物的C端，优选地C端被酰胺化。
表1：
Figure BDA0002365281400000181
Figure BDA0002365281400000191
同等地考虑包含表1的氨基酸聚合物序列的至少4个最C端氨基酸的肽模拟物，并且其包含5-50个氨基酸，优选8-13个氨基酸。
在本发明的一些实施方式中，肽模拟物包含螯合剂。在一些实施方式中，螯合剂是DOTA或HYNIC。以下显示的表2示出了本发明的一些优选实施方式。在本发明的一些实施方式中，肽模拟物可以包含如表2所示的结构中的一种，或者可以由如表2所示的结构中的一种组成。
表2：
Figure BDA0002365281400000201
Figure BDA0002365281400000211
表1或2中所述的X3如本文中所用，优选为1Nal或2Nal，最优选为1Nal。
如表1或2中所述的X4、X5、X6和X7如本文中所用，特别地，X4是Leu或其他疏水性氨基酸，诸如Pro，或任何蛋白原带电荷的氨基酸，诸如Arg、Asp、Lys、His和Glu，X5是Ala、β-Ala、Tyr或Pro，且X6是Tyr、Pro、Phe、Met或与Met具有结构相似性的疏水性氨基酸，诸如Leu或Nle，且X7是Gly、Thr、Ser、Ala、β-Ala或Pro。
应该理解的是，表1和2中列出的肽模拟物是通过举例说明的方式给出的，并且还考虑了未明确公开的表1或2中所述的不同修饰的组合。表1和2的优选实施方式在下表3中给出。
表3：
DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
HYNIC-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-2Nal-NH<sub>2</sub>
DOTA-DGlu-Pro-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
DOTA-DLys-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
DOTA-DGlu-Tyr-Pro-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-2Nal-NH<sub>2</sub>
DGlu-Pro-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
DLys-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
DGlu-Tyr-Pro-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-(N-Me)1Nal-NH<sub>2</sub>
HYNIC-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-(N-Me)1Nal-NH<sub>2</sub>
DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Pro-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-(N-Me)1Nal-NH<sub>2</sub>
DGlu-Ala-Tyr-Pro-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
在表1-3中，除非另有指示，否则单个氨基酸均通过酰胺键连接。优选地，表1-3中显示的任何氨基酸均为L型，例如，表1-3中的Asp优选为LAsp。
在本发明的一些实施方式中，肽模拟物包含如表2或3中所示的结构中的一种，其中螯合剂DOTA或HYNIC配位放射性核素，例如金属放射性核素，诸如225Ac、212Bi、213Bi、62Cu、64Cu、67Cu、69Cu、66Ga、67Ga、68Ga、111In、113mln、177Lu、186Re、188Re、43Sc、44Sc、47Sc、155Tb、161Tb、99mTc、86Y、90Y、169Yb、175Yb。
在本发明的特别优选的实施方式中，肽模拟物由如表2或3中所示的结构组成，其中除了表2或3中提供的信息外，DOTA螯合剂配位放射性核素90Y、111In、68Ga或177Lu，并且HYNIC螯合剂配位放射性核素99mTc。
本发明的肽模拟物可以包含报告基团、细胞毒性基团、光敏剂、连接子和/或药代动力学改性剂。优选地，肽模拟物包含报告基团或细胞毒性基团。
报告基团
如本文所用的术语“报告基团”可以是能够在成像方法中被直接或间接检测到的任何材料或化学部分。因此，包含报告基团的肽模拟物可用于成像方法，例如，用于诊断目的。术语“报告基团”可与术语“报告剂”和“标签”互换使用。报告基团可以是这样的材料或化学部分，其会发射或可能导致发射可检测的辐射(例如，通过放射性衰变、荧光激发、自旋共振激发等)、影响局部电磁场(例如，顺磁性、超顺磁性、亚铁磁性或铁磁性物类)、吸收或散射辐射能(例如，生色团和荧光团)、颗粒(包括含囊泡的液体)、重元素及其化合物，以及产生可检测物质的部分等。
通过成像方法，例如成像诊断方法，诸如计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、闪烁扫描术、SPECT、PET或其他类似技术可检测的多种材料和化学部分是本领域已知的，并且将根据要使用的成像方法来选择报告基团。因此，例如对于超声成像，通常选择回声材料或能够产生回声材料的材料。
报告基团可以是荧光团。如本文所定义的荧光团在本领域中是已知的，并且是技术人员可获得的，并且包括且不限于alexa家族的所有不同成员、bimane、bodipy、硝基苯并噁二唑、丹磺酰基、acrylodan、荧光素、若丹明、镧系元素和Cye3/Cye5系列的成员(Filizola M,G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery,Humana Press,Springer Science+Business Media New York 2015)。优选的荧光团是例如近红外染料，诸如吲哚菁绿、IRDye 800CW、IRDye 650、LS-288或Alexa Fluor染料(例如AF647、AF680和AF488)、荧光素、花菁和半花菁染料，诸如Dy488、Dy676和Dy754。这些荧光团可以例如在荧光显微镜或荧光引导的内窥镜或手术和光学成像的背景下用于成像方法中。报告基团也可以是化学发光染料。
报告基团也可以是稳定同位素或包含稳定同位素的化学部分。
报告基团还可以是或包含重原子(例如原子量为38或更高)，特别是用于通过X-射线成像检测。报告基团也可以是非零核自旋同位素(诸如19F)，或具有不成对电子自旋并因此具有顺磁性、超顺磁性、亚铁磁性或铁磁性性质的材料，其对于磁共振成像很有用。报告基团可以是光散射体(例如，有色或无色颗粒)、光吸收剂或光发射体，它们对光成像很有用。对于磁力成像，报告基团将具有可检测的磁性；对于电阻抗成像，报告基团将影响电阻抗。报告基团可以是放射性核素或包含放射性核素的化学部分，其可用于闪烁扫描术、SPECT、PET或其他类似的技术。
可在本发明的背景下使用的合适的报告基团的实例从诊断成像文献中已广为人知，例如，磁性氧化铁颗粒、含囊泡的X-射线造影剂、螯合的顺磁性金属(诸如Gd、Dy、Mn、Fe等)。参见例如美国专利No.4,647,447、PCT/GB97/00067、美国专利No.4,863,715、美国专利No.4,770,183、WO96/09840、WO85/02772、WO92/17212、PCT/GB97/00459、EP-A-554213、美国专利No.5,228,446、WO91/15243、WO93/05818、WO96/23524、WO96/17628、美国专利No.5,387,080、WO95/26205和GB9624918.0。还参见WO 98/47541(第63-66和70-86页)。
特别优选作为报告基团的是螯合的顺磁性金属离子，诸如Gd、Dy、Fe和Mn，尤其是当被大环螯合剂螯合时。
报告基团可以是：(1)含可螯合金属或多原子金属的离子(即TcO等)，其中金属是高原子序数金属(例如原子序数大于37)、顺磁性物类(例如过渡金属或镧系元素)或放射性同位素，(2)共价结合的非金属物类，其是不成对的电子位点(例如，持久性自由基中的氧或碳)、高原子序数非金属或放射性同位素；(3)含有高原子序数原子的多原子团簇或晶体，其表现出协同的磁性行为(例如，超顺磁性、亚铁磁性或铁磁性)或含有放射性核素，或(4)发色团(通过该术语包括了发荧光或发磷光的物类)，例如无机或有机结构，特别是具有广泛离域电子系统的配合金属离子或有机基团。
特别优选的报告基团的实例在下文中有更详细的描述。
优选的报告基团为例如放射性核素，诸如金属放射性核素、顺磁性金属离子、荧光金属离子、重金属离子和团簇离子。
本发明的放射性核素可以例如选自：C、N、O、F、Na、P、Sc、Ti、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Br、Rb、Sr、Y、Zr、Mo、Tc、Ru、Rh、Pd、Ag、In、Sn、Sb、Te、I、La、Ce、Pr、Pm、Sm、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、TI、Pb、Bi、Po、At、Ra、Ac、Th和Fm的放射性同位素。
优选的放射性核素包括但不限于金属的放射性核素，诸如但不限于：225Ac、198Au、199Au、212Bi、213Bi、51Cr、62Cu、64Cu、67Cu、69Cu、159Dy、166Dy、66Ga、67Ga、68Ga、159Gd、166Ho、111In、113mln、196Ir、177Lu、189mOs、203Pb、109Pd、149Pm、151Pm、142Pr、143Pr、186Re、188Re、97Ru、43Sc、44Sc、47Sc、153Sm、117mSn、121Sn、155Tb、161Tb、99mTc、127Te、167Tm、86Y、90Y、169Yb、175Yb和89Zr。优选的报告基团是卤素的放射性核素，诸如但不限于：18F、131I、123I、124I和125I。
用于诊断应用的γ和正电子发射体包括但不限于：11C、51Cr、62Cu、64Cu、52Fe、66Ga、67Ga、68Ga、123I、124I、125I、111In、113mIn、177Lu、24Na、203Pb、97Ru、43Sc、44Sc、152Tb、155Tb、94mTc、99mTc、167Tm、86Y和89Zr。
用于治疗应用的具有α和β发射以及俄歇电子和内部转换电子发射的放射性核素包括且不限于：225Ac、111Ag、77As、211At、198Au、199Au、212Bi、213Bi、77Br、58Co、51Cr、67Cu、152Dy、159Dy、165Dy、169Er、255Fm、67Ga、159Gd、195Hg、161Ho、166Ho、123I、125I、131I、111In、192Ir、194Ir、196Ir、177Lu、189mOs、32P、212Pb、109Pb、149Pm、142Pr、143Pr、223Ra、186Re、188Re、105Rh、119Sb、47Sc、153Sm、117mSn、121Sn、89Sr、149Tb、161Tb、99mTc、127Te、227Th、201Tl和90Y。优选的顺磁性金属离子包括但不限于过度金属和镧系金属的离子(例如，具有6-9、21-29、42、43、44或57-71的原子序数的金属)，特别是Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的离子，尤其是Mn、Cr、Fe、Gd和Dy的离子，更尤其是Gd的离子。
在本发明的一些实施方式中，报告基团没有治疗作用，诸如细胞毒性作用，特别是当被肽模拟物包含时。在一些实施方式中，报告基团至少没有与治疗相关的程度的细胞毒性作用。技术人员能够确定报告基团的给药剂量/放射性剂量，其足以例如在成像方法中被检测到，但是足够低而不具有治疗作用。因此，在本发明的一些实施方式中，例如，成像方法和任何诊断用途或方法，使用了足够检测但没有治疗作用的一定剂量的报告基团，特别是放射性核素。如本文所用，没有治疗作用的报告基团被称为“非治疗性报告基团”。因此，本发明还涉及上述报告基团的非治疗性实施方式。例如，本发明包括非治疗性荧光团、稳定同位素或包含稳定同位素的化学部分、重原子、放射性核素(诸如金属放射性核素)、顺磁性金属离子、荧光金属离子、重金属离子和团簇离子。
作为可用于成像的放射性核素的优选非治疗性报告基团是：64Cu、67Ga、68Ga、123I、124I、125I、131I、111In、177Lu、203Pb、97Ru、44Sc、152Tb、155Tb、99mTc、167Tm、86Y和89Zr。
细胞毒性基团
在一些实施方式中，肽模拟物包含细胞毒性基团。如本文所用，术语“细胞毒性基团”是指直接或间接引起结合或内化了包含细胞毒性基团的肽模拟物的细胞死亡的任何材料或化学部分。
细胞毒性基团可以是例如化疗剂或放射性核素。如果肽模拟物所包含的化疗剂或放射性核素被表达CCK2R的细胞内化，则表达CCK2R的细胞将被化疗剂或放射性核素杀死。在一些实施方式中，结合肽模拟物的细胞也可以在不内化包含细胞毒性基团的肽模拟物的情况下被杀死。
化疗剂可以选自由以下组成的组：长春碱单酰肼、微管溶素B酰肼(tubulysin Bhydrazide)、放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、博来霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、卡铂(carboplatin)、卡培他滨(capecitabine)、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、道诺霉素(daunorubicin)、多西他赛(docetaxel)、去氧氟尿苷、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、埃博霉素(epothilone)、依托泊苷(etoposide)、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、伊达比星(idarubicin)、伊马替尼(imatinib)、伊立替康(irinotecan)、氮芥、巯基嘌呤、甲氨蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、替尼泊苷(teniposide)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、拓扑替康(topotecan)、indotecan、indimitecan、美登素(mertansine)、美坦新(emtansine)、戊柔比星(valrubicin)、维莫非尼(vemurafenib)、长春碱、长春新碱、长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)。
可用作细胞毒性基团的优选的放射性核素包括金属和卤素放射性核素。本发明的放射性核素可以例如选自以下的放射性同位素：P、Sc、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Ga、As、Br、Sr、Y、Tc、Ru、Rh、Pd、Ag、In、Sn、Sb、Te、I、Pr、Pm、Sm、Gd、Tb、Y、Ho、Er、Lu、Ta、W、Re、Os、Ir、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Ra、Ac、Th和Fm。优选的放射性核素包括但不限于：225Ac、111Ag、77As、211At、198Au、199Au、212Bi、213Bi、77Br、58Co、51Cr、67Cu、152Dy、159Dy、165Dy、169Er、255Fm、67Ga、159Gd、195Hg、161Ho、166Ho、123I、125I、131I、111In、192Ir、194Ir、196Ir、177Lu、189mOs、32P、212Pb、109Pd、149Pm、142Pr、143Pr、223Ra、186Re、188Re、105Rh、119Sb、47Sc、153Sm、117mSn、121Sn、89Sr、149Tb、161Tb、99mTc、127Te、227Th、201Tl和90Y。
光敏剂
在本发明的一些实施方式中，肽模拟物包含光敏剂。
如本文所用的术语“光敏剂”是指这样的材料或化学部分，其在暴露于光时会变得有毒或释放有毒物质，诸如单线态氧或对细胞材料或生物分子(包括细胞膜和细胞结构)有害的其他氧化基团，并且这样的细胞或膜损伤最终可杀死细胞。如本文所定义的光敏剂是本领域已知的，并且是技术人员可获得的。光敏剂的细胞毒性作用可用于治疗各种异常或病症，包括肿瘤疾病。这样的治疗被称为光动力治疗(PDT)，并且涉及向身体的受影响区域给药光敏剂，然后暴露于激活光下以激活光敏剂，并将它们转化为细胞毒性形式，从而杀死受影响的细胞或减弱其增殖潜力。
光敏剂通过多种机制直接或间接地发挥其作用。因此，例如，某些光敏剂在被光激活时直接变成有毒的，而其他光敏剂作用产生有毒物类，例如氧化剂，诸如单线态氧或氧衍生的自由基，其对细胞材料和生物分子(诸如脂质、蛋白质和核酸)具有破坏性，并最终杀死细胞。
在一些实施方式中，光敏剂包括例如补骨脂素、卟啉、二氢卟酚和酞菁。卟啉光敏剂通过产生有毒的氧物类而间接起作用，且是特别优选的。卟啉是天然存在的血红素合成中的前体。特别地，在通过酶亚铁螯合酶的作用将铁(Fe2+)掺入原卟啉IX(PplX)中时产生血红素。PplX是一种高效的光敏剂。可以在本发明的背景下使用的其他光敏剂是氨基乙酰丙酸(ALA)、硅酞菁Pc 4、间四羟基苯基二氢卟酚(mTHPC)和单-L-天冬氨酰二氢卟酚e6(NPe6)、卟吩姆钠(porfimer sodium)、维替泊芬(verteporfin)、替莫泊芬(temoporfin)、氨基酮戊酸甲酯、氨基酮戊酸己酯、laserphyrin-PDT、BF-200ALA、amphinex和氮杂二吡咯亚甲基(azadipyrromethenes)。
连接子
本发明的肽模拟物包含具有如本文中定义的序列的氨基酸聚合物。如本文所定义的，肽模拟物所包含的氨基酸的总数是有限的。除氨基酸聚合物外，本发明的肽模拟物还可包含其他组分，诸如报告基团、细胞毒性基团、光敏剂、螯合剂、辅基、药代动力学改性剂、连接子或间隔子。这些单个组分或化学部分可以通过共价键、离子键或配位键直接彼此连接或与氨基酸聚合物连接，例如，报告基团或细胞毒性基团可以通过配位键与螯合剂连接。
替代地，上述组分可以通过连接子间接地彼此连接或与氨基酸聚合物连接。如本文所用，术语“连接子”是指连接两个单独的化学部分的化学部分。术语“连接子”或“间隔子”在文献中和本文中可互换使用，以描述这样的化学部分。连接子可以与肽模拟物的氨基酸聚合物的N端结合，整合在肽模拟物的氨基酸聚合物的氨基酸序列内，或者与肽模拟物的氨基酸聚合物的氨基酸的侧链或其他官能团缀合，并且通常用作肽模拟物的氨基酸聚合物与报告剂或细胞毒性剂之间的分隔物，或用作影响例如肽模拟物的亲水性和药代动力学的药代动力学改性剂。例如，本发明的报告基团、细胞毒性基团、光敏剂、螯合剂、辅基或药代动力学改性剂可以通过连接子与氨基酸聚合物(例如X4-X5-X6-X7-X1-X2-Asp-X3)连接。连接子可以将任何上述组分与肽模拟物的氨基酸聚合物的N端、C端或任何侧链连接。在一些实施方式中，连接子也可以将上述组分相互连接，例如，连接子可以将药代动力学改性剂与报告基团连接。
连接子可以是全部为L或D型的氨基酸，诸如Gly、Ala、Gln、Glu、His，或者是由这些氨基酸中的一种或多种组成的氨基酸聚合物，或者是任何其他化学部分，诸如聚乙二醇或碳水化合物，以及氨基己酰或氨基苯甲酰或哌啶部分。在一些实施方式中，连接子可以是6-氨基己酸、4-氨基丁酸、4-氨基-1-羧甲基哌啶或脲，或允许在肽模拟物中引入官能团的其他化学部分。在一些实施方式中，连接子是上述连接子的组合。
连接子可以用作肽模拟物的单个组分的分隔物。连接子也可以用于形成多种肽模拟物的多聚体缀合物，或与靶向例如替代的受体的其他配体结合使用。连接子还可以用于将多个报告基团或报告基团和细胞毒性基团的组合与肽结合起来。这样的实例由以下给出：二价胃泌素肽模拟物DOTA-Gly-Ser-Cys(琥珀酰亚胺基丙酰基-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2)-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2(DOTA-MGD5)(Sosabowski JKet al.,J Nucl Med 2009,50:2082-2089)，或靶向胃泌素释放肽受体拮抗剂的双模态荧光和放射性标记的配体DOTA-Lys(IRDye-650)-PEG4-[D-Phe6,Sta13]-蛙皮素(6-14)NH2(HZ220)(Zhang H et al.,J Nucl Med 2017,58:29-35)。DOTA-MGD5是基于马来酰亚胺-连接子的二价MG类似物，在临床前研究中已证明其具有高肿瘤摄取和低肾脏滞留。靶向胃泌素释放肽(GRP)受体的胃泌素释放肽受体拮抗剂HZ220基于蛙皮素类似物，其中赖氨酸的两个胺用于缀合螯合剂DOTA和近红外荧光(NIRF)染料IRDye 650。对于68Ga标记的HZ220，PET和光学成像均可实现高的肿瘤-背景对比度。连接子也可用于将可切割基团引入肽序列，从而释放一部分的肽缀合物，诸如肽片段、细胞毒性或报告基团。这样的实例通过组织蛋白酶B切割位点给出(Naqvi SA et al.,Cancer Biother Radiopharm 2010,25:89-95；Albericio F and Kruger HG,Future Med Chem 2012,4:1527-1231)。也可以使用连接子的组合，诸如蛙皮素衍生物177Lu-DOTA-Lys(葡萄糖)-4氨基苯甲酸-BBS7-14中的葡萄糖和4-氨基苯甲酸的组合(Lim JC et al,Nucl Med Biol 2015,42:234-241。
如本文所用，“药代动力学改性剂”是指影响肽模拟物的药代动力学，诸如亲水性、生物降解和清除的化学部分。例如，药代动力学改性剂可以延长肽模拟物在血流中的半衰期。
放射性标记的MG类似物DOTA-His-His-Glu-Aly-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2(Mather SJ et al.,J Nucl Med 2007,48:615-622)来源于MG11，并且在肽的N端部分中包括两个His残基。放射性标记的MG类似物DOTA-DGln-DGln-DGln-DGln-DGln-DGln-Aly-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2、DOTA-DGln-DGln-DGln-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2、DOTA-DGln-DGlu-DGln-DGlu-DGln-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2和DOTA-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2来源于MG0，并且在肽的N端部分中包括不同数量的DGln和DGlu残基(Laverman P et al.,Eur J Nucl MedMol Imaging2011,38:1410-1416)。这些新的肽衍生物的设计基于以下认识：MG0的高肾脏摄取是由结构中的阴离子五谷氨酸序列引起的。通过引入带正电荷的残基和D-氨基酸残基，可以降低肾脏摄取，同时改善肿瘤/肾脏比。为了在成像中获得高的肿瘤-背景对比度，需要从循环中快速清除放射性配体。另外，还研究了具有不同极性的其他间隔子，包括PEG或D-氨基酸，诸如D-Ser和D-Gln，作为MG类似物的药代动力学改性剂，以尝试提高放射性配体的稳定性和肿瘤/肾脏比(Kolenc-Peitl P et al.,J Med Chem 2011,54:2602-2609)。通过引入不同长度的亲水性且不带电荷的间隔子，可以观察到对血清稳定性、肾脏摄取和肿瘤/肾脏比的有利影响。
报告基团和细胞毒性基团的连接
本发明的肽模拟物可以包含报告基团或细胞毒性基团或者多个报告基团或细胞毒性基团。在一些实施方式中，肽模拟物还可以包含报告基团以及细胞毒性基团。在一些实施方式中，报告基团、细胞毒性基团或二者可以例如通过共价键与肽模拟物的氨基酸聚合物直接连接。在其他实施方式中，报告基团、细胞毒性基团或二者可以与肽模拟物的氨基酸聚合物间接连接。
如果报告基团或细胞毒性基团或二者与肽模拟物的氨基酸聚合物间接连接，则它们通过如上文定义的连接子或药代动力学改性剂，或通过螯合剂或辅基与氨基酸聚合物连接。例如，为荧光团的报告基团优选地直接或通过连接子或间隔子(诸如聚乙二醇)与肽模拟物的氨基酸聚合物共价连接。另一方面，放射性核素(诸如金属放射性核素)和金属离子优选地经由螯合剂与肽模拟物连接。卤素的放射性核素优选地经由辅基或经由氨基酸的侧链的官能团与肽模拟物连接。
报告基团或细胞毒性基团可以经由N端、C端或经由氨基酸侧链，例如赖氨酸或半胱氨酸，或经由连接子或药代动力学改性剂的官能团与肽模拟物的氨基酸聚合物直接或间接连接。优选地，报告基团或细胞毒性基团经由N端与肽模拟物的氨基酸聚合物连接。在本发明的优选实施方式中，报告基团或细胞毒性基团通过螯合剂或辅基与肽的N端连接。特别地，在一些实施方式中，放射性核素经由肽的N端与肽模拟物的氨基酸聚合物连接。连接子另外可用于将螯合剂或辅基与肽序列中的氨基酸的N端或侧链连接。报告基团，例如放射性核素可以通过螯合剂来配位，或在与肽缀合物缀合之前或之后被引入辅基内。
螯合剂和辅基
为了引入报告基团或细胞毒性基团，肽模拟物可以包含螯合剂或辅基。可以在N端、C端或在任何氨基酸侧链或存在于连接子或药代动力学改性剂中的功能团处将螯合剂或辅基与肽模拟物的氨基酸聚合物缀合。优选地，螯合剂或辅基在N端与肽模拟物的氨基酸聚合物缀合。
可以在螯合剂或辅基与肽模拟物的氨基酸聚合物缀合之前或之后，将报告基团或细胞毒性基团引入螯合剂或辅基。
在一些实施方式中，螯合剂配位金属(例如如本文中提及的金属放射性核素)作为报告基团或细胞毒性基团，或者辅基包含卤素(例如如本文中提及的卤素放射性核素)作为报告基团或细胞毒性基团。
螯合剂可包含用于金属配合的不同的供体基团，诸如氧、氮、硫、(羧基、膦酸基、异羟肟酸基、胺、硫醇、硫代羧酸盐或其衍生物)，并且包含无环和大环螯合剂，诸如多氨基多羧酸配体。
在一些实施方式中，螯合剂选自由以下组成的组：二亚乙基三氨基五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三[亚甲基(2-羧乙基)]次磷酸(TRAP)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸(NODA)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)以及其衍生物，诸如用戊二酸臂功能化的DOTA或NOTA(DOTAGA，NOTAGA)。还考虑了其他螯合剂，特别是用于螯合放射性金属的螯合剂。
考虑的例如用于螯合99mTc的其他螯合剂包括但不限于：二酰胺二硫醇(N2S2)、三酰胺硫醇(N3S)、四胺(N4)和肼基烟酸(HYNIC)。HYNIC通常与共配体结合使用以完成金属的配位层，共配体包括但不限于乙二胺-N,N’-二乙酸(EDDA)和N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)。在一些实施方式中，利用有机金属水合离子99mTc(CO)3(H2O)3，可以通过与单齿、二齿和三齿螯合剂交换水分子以形成稳定的配合物(还包括点击螯合(click-to-chelate)方法)来产生三羰基配合物。
例如可用于用68Ga标记肽模拟物的其他螯合剂包括但不限于：N,N’-双[2-羟基-5-(羧乙基)苄基]乙二胺-N,N’-二乙酸(HBED-CC)、基于铁载体的配体(诸如去铁胺)、羟基吡啶酮配体(诸如去铁酮)和三(羟基吡啶酮)(THP)，及其衍生物。
本发明优选的辅基用卤素(诸如碘或氟)的放射性核素标记，例如本文中提到的那些。在一些实施方式中，辅基将选自由以下组成的组：Bolton-Hunter试剂、N-琥珀酰亚胺基-5-(三烷基甲锡烷基)-3-吡啶羧酸酯或N-琥珀酰亚胺基-4-[131I]碘苯甲酸酯([131I]SIB)用于放射性碘化。在一些实施方式中，辅基将选自包括但不限于以下的组：4-[18F]氟苯甲酰甲基溴、N-琥珀酰亚胺基-4-[18F]氟苯甲酸酯([18F]SFB)、N-琥珀酰亚胺基-4-([18F]氟甲基)苯甲酸酯、4-[18F]氟苯甲醛、6-[18F]氟烟酸四氟苯基酯([18F]F-Py-TFP)、含硅的构建模块诸如N-琥珀酰亚胺基3-(二叔丁基[18F]氟甲硅烷基)苯甲酸酯([18F]SiFB)、基于碳水化合物的辅基(诸如[18F]氟-脱氧葡萄糖，优选2-[18F]氟-2-脱氧葡萄糖([18F]FDG)，和[18F]氟-脱氧甘露糖，优选[18F]2-氟-2-脱氧甘露糖或其衍生物)、基于马来酰亚胺和基于杂环甲基砜的18F合成子、允许经由点击化学进行标记的18F标记的辅基(诸如18F-叠氮化物或18F-炔烃)、18F标记的有机三氟硼酸酯和[18F]氟吡啶。在一些实施方式中，利用氟化铝(Al18F)的基于螯合剂的标记方法被用于放射性氟化。
本发明的其他方面和实施方式
本发明还涉及产生如本文所述的本肽模拟物的方法。通过本领域技术人员可获取的标准有机化学方法和固相肽合成方法产生本肽模拟物是可能的。该方法至少包括合成肽模拟物的氨基酸聚合物(Behrendt R et al.,J Pept Sci 2016,22:4-27；Jones J,AmonoAcid and Peptide Synthesis,Oxford University Press,New York2002；GoodmanM,Toniolo C,Moroder L,Felix A,Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry,Synthesis of Peptides and Peptidomimetics,workbench edition set,ThiemeMedical Publishers,2004)。
本发明还涉及包含本文所述的肽模拟物的药物和诊断组合物。根据本发明的药物组合物可用于治疗CCK2R相关的疾病，诸如特征为CCK2R表达或过表达的疾病。在一些实施方式中，本发明的药物组合物可用于治疗癌症，特别是特征为表达CCK2R的这样的癌症。在本发明的一些实施方式中，本发明的药物组合物可用于向表达CCK2R的肿瘤细胞递送细胞毒性基团，诸如化疗剂或放射性核素。因此，本发明的药物组合物可用于靶向癌症治疗。
本发明还涉及包含本发明的一种或多种组分的试剂盒，例如包含根据本发明的药物或诊断组合物或者根据本发明的肽模拟物的试剂盒。试剂盒还可以包含信息手册，其提供了如何制备或使用本发明的肽模拟物、药物组合物或诊断组合物的说明。在一种实施方式中，试剂盒包含备用的本发明的药物或诊断组合物。在其他实施方式中，试剂盒包含备用的足以制备药物或诊断组合物的两种或更多种组合物。例如，在一种实施方式中，试剂盒可以包含第一组合物，其包含含有螯合剂的肽模拟物，以及第二组合物，其包含报告基团或细胞毒性基团。为了制备最终的诊断或治疗组合物，技术人员将遵循试剂盒中提供的信息手册，并将第一和第二组合物合并以产生备用的诊断或治疗组合物。
本发明的诊断组合物可用于诊断目的。可以向患者给药本发明的诊断组合物作为诊断过程的一部分，例如以允许对表达CCK2R的细胞或组织(例如表达CCK2R的肿瘤细胞)进行成像。本发明的诊断组合物可用于成像方法，诸如根据本发明的成像方法，例如对肿瘤细胞进行成像的方法。
本发明还涉及本文所述的本发明的肽模拟物用于向细胞递送如本文所述的报告基团或细胞毒性基团的用途。优选地，报告基团或细胞毒性基团被递送至表达CCK2R的细胞，例如表达CCK2R的癌细胞。本肽模拟物的用途可以为体内的或体外的。例如，本发明的肽模拟物可用于向人类或动物(例如哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、仓鼠或其他哺乳动物)递送报告基团或细胞毒性基团。在本发明的一些实施方式中，肽模拟物可用于向离体细胞(例如，在细胞培养物中培养的永生化或原代细胞系)递送报告基团或细胞毒性基团。
本发明还涉及如本文所述的细胞成像方法。本文所述的细胞成像方法利用了本文所述的肽模拟物。在本发明的一些实施方式中，细胞成像方法利用了如本文所述的非治疗性肽模拟物。本细胞成像方法可以涉及或可以基于已建立的成像方法，诸如计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、闪烁扫描术、SPECT、PET或其他类似技术。基于所使用的各个成像方法，技术人员将选择适当的报告基团。本细胞成像方法可以在体内或体外进行。在本发明的一些实施方式中，使细胞与本发明的肽模拟物接触涉及向患者(例如患有癌症的患者，例如患有涉及CCK2R表达的癌症的患者)给药本文所述的肽模拟物。在一些优选的实施方式中，细胞是肿瘤细胞。因此，在一些优选的实施方式中，肿瘤细胞与肽模拟物接触。在一些优选的实施方式中，肿瘤细胞表达CCK2R。
在一些实施方式中，本发明还涉及治疗患有涉及CCK2R表达的疾病(例如特征在于肿瘤细胞中CCK2R的表达的癌症)的患者的方法。这样的治疗患者的方法涉及向患者给药本发明的肽模拟物。
在一些实施方式中，本发明涉及本文所述的肽模拟物用于治疗的用途。在本发明的优选实施方式中，肽模拟物用于治疗癌症。优选地，癌症为在肿瘤细胞的表面上表达CCK2R的癌症。
本发明的肽模拟物可用于诊断检查和治疗各种类型的癌症，例如：甲状腺癌(诸如甲状腺髓样癌(MTC))、肺癌(诸如小细胞肺癌(SCLC))、胃肠道间质瘤、神经系统肿瘤(诸如星形细胞瘤和脑膜瘤)、卵巢间质癌、胃肠癌、神经内分泌肿瘤、胃肠胰腺肿瘤、神经母细胞瘤、生殖系统肿瘤(诸如乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌和前列腺癌)、胰岛瘤、舒血管肠肽瘤、支气管和回肠类癌、平滑肌肉瘤、平滑肌瘤和颗粒细胞肿瘤。在一些优选的实施方式中，上述类型的癌症表达CCK2R。
实施例
实施例1：本发明的肽模拟物的合成
使用标准的9-芴甲氧羰基(Fmoc)化学进行本发明的肽模拟物的合成。
在碱性介质中，使用过量的Fmoc保护的氨基酸、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)和(2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，在于N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中的Rink Amide MBHA树脂(Novabiochem,Hohenbrunn,德国)上组装肽模拟物。利用适当的保护基团掩蔽氨基酸的反应性侧链。在组装所需的氨基酸序列之后，进行Boc保护的DOTA或HYNIC的偶联，然后从树脂上切割肽模拟物，并同时除去酸不稳定的保护基团。经HPLC纯化和冻干后，如通过RP-HPLC和MALDI-TOF MS所证实的，得到的肽模拟物的收率>20％，化学纯度≥95％。使用标准的放射性标记方案，通过将肽溶解在水溶液(诸如25-50％的乙醇)中，并将该溶液与酸性溶液(诸如含有放射性金属的盐酸)以及诸如乙酸钠溶液或抗坏血酸溶液的溶液混合用于调节pH，并在高温(90-95℃)下温育混合物约30min，来利用不同的放射性金属对本发明的肽模拟物进行放射性标记。利用不同放射性金属进行放射性标记得到高的标记产率和放射化学纯度。在以下设置上进行肽模拟物和放射性标记的衍生物的HPLC分析：在由Dionex UltiMate 3000泵(Dionex，Gemering，Deutschland)、280nm处的UV检测(UltiMate 3000可变UV检测器)和radiodetection(Gabi Star，Raytest，Straubenhardt，德国)组成的Dionex色谱系统上，并利用Phenomenex Jupiter 4μ Proteo90A 250x4.6(C12)柱和1mL/min的流速，连同含有0.1％TFA的水(溶剂A)和含有0.1％TFA的乙腈(溶剂B)的梯度系统：0-3min 10％B，3-18min10-55％B，18-20min 80％B，20-21min10％B，21-25min 10％。
根据上述方法合成了以下肽模拟物(表4)：
表4：
名称 结构
DOTA-MGS5 DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
HYNIC-MGS5 HYNIC-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
DOTA-MGS5-2 DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-2Nal-NH<sub>2</sub>
DOTA-MGS8 DOTA-DGlu-Pro-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
DOTA-MGS9 DOTA-DLys-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
DOTA-MGS10 DOTA-DGlu-Tyr-Pro-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
DOTA-MGS11 DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-(N-Me)1Nal-NH<sub>2</sub>
HYNIC-MGS11 HYNIC-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-(N-Me)1Nal-NH<sub>2</sub>
DOTA-MGS12 DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Pro-Trp-(N-Me)Nle-Asp-1Nal-NH<sub>2</sub>
DOTA-MGS16 DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-Phe-NH<sub>2</sub>
实施例2：本发明的肽模拟物在体外人血清中具有增加的稳定性
为了在体外表征放射性标记的肽模拟物，研究了人血清中的稳定性。于37℃下，将用111In标记的肽模拟物在新鲜的人血清中以500-2000pmol/mL的浓度温育长达24h，并通过放射性HPLC评估降解情况。为此目的，将人血清样品用ACN沉淀，以2000g离心2min，并用水(1:1/v:v)稀释，然后在配备有Phenomenex Jupiter Proteo C12 column(
Figure BDA0002365281400000401
4μm,250x4.6mm)柱或Bischoff Chromatography Nucleosil C18柱(
Figure BDA0002365281400000402
5μm,250x 4.6mm)的包括radiodetection和UV检测的Dionex色谱系统上，使用不同的水/乙腈/0.1％TFA梯度系统进行HPLC分析。如图1中所示，当相比111In标记的DOTA-MG11和111In-DOTA-MGS1(它们在24h温育后分别显示16.1％(n＝2)和60.1％(n＝1)完整的放射性标记的肽模拟物)时，人血清中的放射性标记的肽模拟物的稳定性大大增加。对于相同的时间点，111In-DOTA-MGS5、111In-DOTA-MGS5-2、111In-DOTA-MGS8、111In-DOTA-MGS9和111In-DOTA-MGS10显示>94％的值，并因此表现出高得多的针对酶促降解的稳定性。111In-DOTA-MGS11和111In-DOTA-MGS12在人血清中也显示>94％完整的放射性肽。该稳定性是通过在MG的C端受体特异性序列中应用至少两个取代，优选地与另外的N端取代相结合来实现的。我们另外研究了具有用(N-Me)Nle取代Met的单取代的111In-DOTA-MGS16，发现了部分的稳定性(53.1％完整的放射性肽，n＝2)。这证实了例如用(N-Me)Nle或1Nal的单取代不能完全保护肽模拟物免于降解，如根据本发明，只有在不同位置的取代的组合才可以完全稳定肽模拟物。
实施例3：本发明的肽模拟物与血清蛋白结合
另外，研究了蛋白与血清蛋白的结合。为此目的，将111In标记的肽模拟物于37℃下在新鲜人血清中(500pmol/mL)以一式两份温育，并在4和24h后通过Sephadex G-50尺寸排阻色谱法(GE Healthcare lllustra,Little Chalfont,UK)进行分析。通过在2480Wizard2自动γ-计数器(Perkin Elmer Life Sciences and Analytical Sciences,Turku,F)中测量柱和洗脱物来确定蛋白结合的百分比。结果概括在表5中。
表5：在人血清中温育4和24h之后确定的111In标记的肽模拟物相比111In-DOTA-MG11、111In-DOTA-MGS1和111In-DOTA-MGS4的蛋白结合(表示为与血清蛋白结合的放射性配体的百分比)
Figure BDA0002365281400000411
当相比在温育24h之后显示<10％的蛋白结合的111In-DOTA-MG11时，111In-DOTA-MGS4显示相似的蛋白结合(～12％)。本发明的放射性标记的肽模拟物显示更高的蛋白结合，如表5中所示。111In-DOTA-MGS5-2、111In-DOTA-MGS9和111In-DOTA-MGS11显示～30％的中等蛋白结合。温育24h之后，对四种肽模拟物观察到高蛋白结合，其中111In-DOTA-MGS5和111In-DOTA-MGS12的值为>40％，以及111In-DOTA-MGS8和111In-DOTA-MGS10的值为>50％。
实施例4：本发明的肽模拟物对CCK2R具有高亲和力
在由Luigi Aloj博士(Aloj L et al.,J Nucl Med 2004,45:485-494)友好提供的用含有人CCK2R的完整编码序列的质粒pCR3.1(A431-CCK2R)稳定转染的A431人表皮样癌细胞中，研究了CCK2R的亲和力。在针对[125I]Tyr12-胃泌素-I的竞争性测定中，相比五肽胃泌素(Boc-β-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2)、DOTA-MG11和PP-F11(一种通过用五个D-谷氨酸残基取代五-Glu序列的来源于MG0的肽类似物)以及DOTA-MGS1和DOTA-MGS4，测试了结合亲和力。使用氯胺-T方法对胃泌素-I进行放射性碘化。通过HPLC纯化获得未添加载体的[125I-Tyr12]胃泌素-I，并于-20℃下以等分试样储存。在用10mM TRIS/139mM NaCI pH 7.4(2x250μl)预处理的96孔过滤板(MultiScreenHTS-FB,Merck Group,Darmstadt,德国)中进行结合测定。对于测定，在含有10mM MgCl2、14μΜ杆菌肽和0.5％BSA(破坏细胞膜的完整性的低渗溶液)的35mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中制备每孔200,000-400,000个数量的A431-CCK2R细胞。利用递增浓度的肽模拟物(0.0003至10,000nM，例如0.001至1000nM)和[125I-Tyr12]胃泌素-I(20,000-60,000cpm)，以一式三份将细胞在RT下温育1h。通过过滤培养基和用冰冷的10mM TRIS/139mM NaCl pH 7.4(2x 200μl)快速冲洗来中断温育，并在γ计数器中对过滤器计数。在利用Origin软件(Microcal Origin 6.1,Northampton,MA)进行非线性回归后，计算半最大抑制浓度(IC50)值，并选择代表性测定进行比较。如表6中所示，可以确认所有测试的肽模拟物均对CCK2R具有高结合亲和力，其IC50值在低纳摩尔范围内。
表6：如通过用[125I]Tyr12-胃泌素-I取代分析的本发明的靶向CCK2R的肽模拟物相比五肽胃泌素、DOTA-MG11、DOTA-MGS1和DOTA-MGS4在A431-CCK2R细胞上的受体结合
测试的CCK2R配体 IC50[nM]
五肽胃泌素 0.9±0.3
DOTA-MG11 0.9±0.5
PP-F11 0.4±0.1
DOTA-MGS1 1.9±0.2
DOTA-MGS4 1.2±0.2
DOTA-MGS5 0.4±0.2
HYNIC-MGS5 6.0±1.5
DOTA-MGS5-2 1.6±0.4
DOTA-MGS8 1.6±0.2
DOTA-MGS9 1.8±0.4
DOTA-MGS10 0.9±0.2
实施例5：本发明的肽模拟物显示改善的细胞内化
这些研究是根据先前公开的方案(von Guggenberg E et al.，Bioconjug Chem2004，15：864-871)进行的，使用100万个A431-CCK2R细胞以及仅用空载体转染的相同细胞系(A431-mock)作为对照。补充有1％(v/v)胎牛血清的DMEM被用作内化培养基，并在A431-mock细胞中研究非特异性细胞摄取，而不是进行阻断研究。将细胞一式三份与10,000-500,000cpm，例如10,000-30,000cpm的放射性标记的肽模拟物(对应于测定中0.4nM和～600fmol最终浓度的总肽模拟物)一起温育，并于37℃下温育2h。A431-CCK2R和A431-mock细胞中的内化分数是相对于所添加的总活性(％总数)来表示的。对于每种放射性标记的肽模拟物，均示出了以一式三份进行的一个代表性测定的平均值。对于111In-DOTA-MGS1和111In-DOTA-MGS4，考虑了从两个独立测定获得的细胞摄取的平均值。
将本发明的不同放射性标记的肽模拟物的细胞内化与PP-F11和PP-F11N进行比较。这两种肽衍生物是通过用五个D-谷氨酸残基取代五-Glu序列以及在PP-F11N中另外用Nle取代Met而从MG0衍生而来的。相比用111In和177Lu标记的PP-F11和PP-F11N，本发明的所有放射性标记的肽模拟物均显示细胞内化作用增强。如图2中针对111In标记的肽模拟物所示的，温育2h后得到111In-DOTA-MGS5、111In-DOTA-MGS8、111In-DOTA-MGS10和111In-DOTA-MGS12的内化的放射性配体分数最高，其值为47-68％。这些肽模拟物也显示出最高水平的蛋白结合。具有中等蛋白结合的肽模拟物显示出稍低的细胞摄取，其中111In-DOTA-MGS9的值为37％，且111In-DOTA-MG5-2的值为45％。与显示低于24％的细胞内化的参照化合物111In-PP-F11和111In-PP-F11N，对照肽111In-DOTA-MG11(29％)，以及先前已研究过的两种肽衍生物111In-DOTA-MGS1和111In-DOTA-MGS4(21-25％)(Klingler M et al.,Eur J NuclMed Mol Imaging 2017,44:S228)相比，所有放射性标记的肽模拟物的细胞摄取均明显更高。无CCK2R表达(<1％)的A431-mock细胞中的摄取可忽略不计，这证实了受体特异性的细胞摄取。
用本发明的不同DOTA和HYNIC缀合的肽模拟物进行其他细胞摄取研究，以确认对于利用其他放射性金属的放射性标记也具有令人惊讶的高细胞摄取。如图3中所示，对于用111In、177Lu、68Ga或99mTc放射性标记的肽模拟物，也观察到非常高的细胞摄取。测量的111In-DOTA-MGS5的值为68％，68Ga-DOTA-MGS5的值为54％，且99mTc-HYNIC-MGS5和177Lu-DOTA-MGS5的值为63％(图3A)。177Lu-DOTA-MGS10也显示出>50％的细胞内化，但发现177Lu-PP-F11和177Lu-PP-F11N的摄取要低得多(<30％)(图3B)。68Ga-DOTA-MGS12显示～40％的细胞内化(图3C)。A431-mock细胞中的细胞摄取低于1.5％。
实施例6：本发明的肽模拟物显示改善的体内生物分布
在7周龄雌性无胸腺BALB/c裸小鼠(Charles River,Sulzfeld,德国)中进行评估放射性标记的本发明的靶向CCK2R的肽类似物的肿瘤摄取的生物分布研究。所有动物实验的进行均遵守奥地利动物保护法并获得奥地利科学部的批准。为了诱导肿瘤异种移植物，分别在左右两侧皮下注射A431-CCK2R和A431-mock细胞(于200μl中的200万个细胞)。当肿瘤尺寸达到约0.2ml时，进行生物分布研究。经侧尾静脉向4只小鼠的组静脉注射用111In(约0.2MBq和0.02nmol肽模拟物)、68Ga(约0.8MBq和0.02-0.03nmol肽模拟物)、177Lu(约0.5MBq和0.02nmol肽模拟物)或99mTc(约0.3MBq和0.02nmol肽模拟物)标记的本发明的肽模拟物。注射后(p.i.)1或4h的时间后，通过颈脱位处死动物，去除肿瘤和其他组织(血液、肺、心脏、肌肉、骨、脾、肠、肝、肾、胃、胰)，称重，并在γ计数器中测量其放射性。结果表示为每克组织的注射活性百分比(％IA/g)，并从在解剖的组织中测得的活性计算肿瘤与器官的活性比。在图4中，概括了本发明的111In标记的肽模拟物相比111In-DOTA-MGS1和111In-DOTA-MGS4(Klingler M et al.,Eur J Nucl Med Mol Imaging 2017,44:S228)的注射后4h时生物分布研究的结果。在图5中，示出了注射后1或4h的不同时间点的用不同放射性金属进行放射性标记的本发明的模型肽模拟物DOTA-MGS5和HYNIC-MGS5的结果。对于所有放射性配体，均观察到具有快速血液清除、占优的肾脏排泄和在大多数组织中的低非特异性摄取以及低肾脏滞留的整体高度改善的生物分布特性。不同的111In标记的肽模拟物在表达CCK2R的组织——胃(～8％IA/g)和胰(～2％IA/g)中显示更高的摄取。111In-DOTA-MGS9在肠和肝(～2％IA/g)且特别是肾(～20％IA/g)中显示稍微更高的摄取。考虑到C端Trp-Met-Asp-Phe-NH2四肽作为主要的药效团对于CCK2R介导的作用的至关重要性(Stone SR et al.,Peptides 2007,28:2211-2222)，在该特定氨基酸序列中具有两个取代的本发明的肽模拟物在A431-CCK2R肿瘤异种移植物中显示高度特异性的体内肿瘤靶向是非常令人惊讶的。本发明的所有肽模拟物均显示相比于111In-DOTA-MGS1(1.3±0.1％ΙΑ/g)和111In-DOTA-MGS4(10.2±2.0％IA/g)(Klingler M et al.,Eur J Nucl Med Mol Imaging 2017,44:S228)2-40倍高，例如2.3-35.6倍高的肿瘤摄取。在注射后4h时分别具有42.8±2.3％IA/g和46.3±8.2％ΙΑ/g的值的111In-DOTA-MGS8和111In-DOTA-MGS10显示出最高的肿瘤摄取。利用111In-DOTA-MGS9，也观察到了高肿瘤摄取(33.9±9.5％ΙΑ/g)，但其伴随有较高的肾脏摄取(20.7±4.4％IA/g)。111In-DOTA-MGS5和111In-DOTA-MGS5-2分别显示23.5±1.3％ΙΑ/g和25.5±4.5％ΙΑ/g的肿瘤摄取。A431-mock肿瘤异种移植物中的摄取非常低，其值<1％ΙΑ/g，这证实了高受体特异性肿瘤摄取。不受理论的束缚，据信更高的稳定性、更高的蛋白结合和改善的细胞内化也导致更高的体内肿瘤摄取。因此，体内高稳定性与增加的蛋白结合的组合似乎导致在血液中对放射性配体的最佳保护以免于酶促降解，从而实现了极高的肿瘤摄取。对于利用DOTA-MGS5和HYNIC-MGS5作为模型肽模拟物的用不同放射性同位素进行的放射性标记，也可以证实这种惊人的高肿瘤摄取。177Lu-DOTA-MGS5(24.5±3.1％ΙΑ/g)、68Ga-DOTA-MGS5(23.3±4.7％A/g)和99mTc-HYNIC-MGS5(24.8±4.4％IA/g)显示与111In-DOTA-MGS5(23.5±1.3％IA/g)相当的肿瘤摄取。68Ga-DOTA-MGS5在血液、肺和心脏中显示稍微更高的非特异性组织摄取(1-2％IA/g)，而用Lu-177、Ga-68和In-111标记的DOTA-MGS5的肾脏摄取(4-6％IA/g)与在表达CCK2R的器官——胃(5-8％IA/g)和胰(2-3％IA/g)中的摄取是相当的。99mTc-HYNIC-MGS5显示出所有放射性同位素中的最高的肾脏摄取(8％IA/g)，并且在胃(13％IA/g)和胰(7％ΙΑ/g)中具有趋向于更高摄取的趋势。在A431-mock肿瘤异种移植物中，对于所有放射性配体均观察到<1％ID/g的非常低的摄取，这证实了A431-CCK2R肿瘤异种移植物中的受体特异性摄取。
血液和正常组织中的低摄取结合随时间非常高的肿瘤摄取和肿瘤滞留的特殊组合，产生了非常有利的肿瘤/器官活性比，特别是对于肽模拟物DOTA-MGS5、DOTA-MGS5-2、DOTA-MGS8和DOTA-MGS10。观察到了顺序为111In-DOTA-MGS8(11.6±3.0)>111In-DOTA-MGS10(9.3±2.0)>111In-DOTA-MGS5(6.4±0.6)>111In-DOTA-MGS5-2(6.0±0.9)的高肿瘤/肾脏比。
当比较用不同放射性同位素进行放射性标记的模型肽模拟物MGS5的肿瘤/肾脏比时，达到了顺序为177Lu-DOTA-MGS5(6.5±1.6)>111In-DOTA-MGS5(6.4±0.6)>68Ga-DOTA-MGS5(4.1±0.3)>99mTc-HYNIC-MGS5(3.3±1.1)的肿瘤/肾脏比。这些令人印象深刻的生物分布特性在文献中仍然是无与伦比的。到目前为止，只有通过共给药酶抑制剂才能实现靶向CCK2R的肽的靶向特性的类似改善(Kaloudi A et al.,Q J Nucl Med MolImaging2015,59:287-302；Nock BA et al.,J Nucl Med 2014,55:121-127)。没有关于通过仅单次注射放射性标记的靶向CCK2R的肽类似物来实现相当的肿瘤靶向改善的类似报道。因此，本发明的肽模拟物显示出出色的特性。当在相同肿瘤模型中比较不同的111In标记的肽类似物时，111In-DOTA-MG0显示9.9±2.0％ID/g的肿瘤摄取，且111In-DOTA-MG11显示3.04±1.30％ID/g的肿瘤摄取(Laverman P et al.,Eur J Nucl Med Mol Imaging 2011,38:1410-1416)。
在研究的一系列放射性配体中，具有六个D-Glu残基的MG类似物111In-PP-F11显示出最有利的肿瘤滞留(在注射后4h时为6.30±2.75％ID/g)，并具有1.2±0.5的肿瘤/肾脏比。还报道了177Lu-PP-F11(6.70±0.60％IA/g)和177Lu-PP-F11N(6.90±0.80％ΙΑ/g)的类似的肿瘤摄取(Sauter AW et al.,Eur J Nucl Med Mol Imaging 2016,43:S238-S239)。
相比之下，本发明的肽模拟物显示出了高度改善的肿瘤摄取和肿瘤/肾脏比，结合MG0(高肿瘤摄取)和MG11(低肾脏滞留)的积极特征，并显示出非常有利的肿瘤/肾脏比。
实施例7：本发明的肽模拟物具有增加的体内稳定性
为了进一步表征放射性标记的肽模拟物在体内的稳定性，在静脉注射了111In和177Lu标记的肽模拟物的5-6周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River,Sulzfeld,Germany)中进行代谢研究。所有动物实验的进行均遵守奥地利动物保护法，并获得奥地利科学部的批准。为了允许通过放射性HPLC监测代谢产物，通过侧尾静脉向小鼠注射较高量的放射性(5-15MBq 111In和20-40MBq177Lu，对应于1-2nmol总肽)，并在注射后(p.i.)10或30min通过颈脱位将其安乐死。采集血液样品，并通过放射性HPLC评估降解。为此目的，用ACN沉淀血液样品，以2000g离心2min，并用水(1:1/v:v)稀释，然后利用配备有Phenomenex JupiterProteo C12 column(
Figure BDA0002365281400000491
4μm,250x 4.6mm)柱或Bischoff Chromatography NucleosilC18柱(
Figure BDA0002365281400000492
5μm,250x 4.6mm)的包括radiodetection和UV检测的Dionex色谱系统，使用不同的水/乙腈/0.1％TFA梯度系统进行HPLC分析。
如图6中所示，本发明的放射性标记的肽模拟物显示非常高的针对体内酶促降解的稳定性。对于所有111In标记的肽模拟物，在注射后10min时血液中存在的完整放射性配体的百分比为≥80％(n＝2；111In-DOTA-MGS5：82.7±3.3％，111In-DOTA-MGS5-2：88.4±0.4％，111In-DOTA-MGS8：80.0±5.2％，111In-DOTA-MGS9：93.9±1.2％，111In-DOTA-MGS10：82.3±1.8％，111In-DOTA-MGS11：98.4±0.1％)。当相比在注射后5min仅显示5％完整放射性肽的111In-DOTA-MG11时，体内稳定性显著提高，而只有通过共注射酶抑制剂膦酰二肽才可以实现体内稳定性的类似改善(Nock BA et al.,J Nucl Med 2014,55:121-127)。还用选择的177Lu标记的肽模拟物(n＝1)进行了其他研究，发现了类似的结果。对于177Lu-DOTA-MGS5，血液中存在的完整放射性配体在注射后10min时总计为85.9％，且在注射后30min时为77.0，177Lu-DOTA-MGS8的值在注射后10和30min时结果分别为80.5和56.8％。
为了比较，还对用Lu-177标记的PP-F11和PP-F11N(n＝1)进行了体内代谢研究。
PP-F11:DOTA-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2
PP-F11N:DOTA-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2
PP-F11和PP-F11N中的所有键(“-”)均为酰胺键，且未明确指出对映体形式的所有氨基酸均为L型。
这两种肽衍生物均是通过用五个D-谷氨酸残基取代五-Glu序列以及在PP-F11N中另外用Nle取代Met而从MG0衍生而来的。这两种肽缀合物的开发旨在改善代谢稳定性和药代动力学，并首次描述于2012年(Kroselj M et al.,Eur J Nucl Med Mol Imaging2012,39:S533-S534和WO 2015/067473A1)。对于在注射后10min的相同时间点，确认了177Lu-PP-F11N的低酶促稳定性，其中血液中存在22.3％的完整放射性配体。在注射后30min时，177Lu-PP-F11和177Lu-PP-F11N分别显示5.5和12.7％的值，且结果为几乎完全降解。
因此，与例如现有技术的PP-F11和PP-F11N相比，本发明的肽模拟物显示出高得多的针对酶促降解的稳定性。令人惊讶的是，如根据本发明的，在不同位置的取代的组合允许完全稳定肽模拟物。
不受任何特定理论的束缚，目前据信除了改善的细胞摄取之外，体内稳定性也可能有助于改善的肿瘤摄取和滞留。极高的肿瘤摄取和肿瘤滞留以及非常有利的肿瘤/背景活性比(包括肾脏)，使得本肽模拟物对于CCK2R相关疾病(诸如癌症)中的诊断和治疗用途是特别有用的。

Claims (15)

1.一种肽模拟物，包含具有以下序列的氨基酸聚合物：
X1-X2-Asp-X3，
其中，
X1是疏水性氨基酸，诸如Phe或Trp，X2是与Met具有结构相似性的疏水性氨基酸，诸如Leu或Nle，X3是与Phe具有结构相似性的非天然疏水性氨基酸，诸如1Nal和2Nal，
并且其中所述肽模拟物包含5至50个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的肽模拟物，其中，所述肽模拟物包含具有以下序列的氨基酸聚合物：
X4-X5-X6-X7-X1-X2-Asp-X3，
并且其中，
X4是Leu、其他疏水性氨基酸，诸如Pro，或蛋白原带电荷的氨基酸，
X5是Ala、β-Ala、Tyr或Pro，
X6是Tyr、Pro、Phe、Met或与Met具有结构相似性的疏水性氨基酸，诸如Nle，并且
X7是Gly、Thr、Ser、Ala、β-Ala或Pro。
3.根据权利要求1或2所述的肽模拟物，其中，X4和X5、X5和X6、X6和X7、X7和X1、X1和X2、X2和Asp以及Asp和X3之间的至少一个键(-)是异肽键或假肽键，诸如-CONCH3-、-NHCO-或-CH2NH-。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽模拟物，其中，所述肽模拟物包含8至13个氨基酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽模拟物，其中，所述肽模拟物包含报告基团或细胞毒性基团。
6.根据权利要求5所述的肽模拟物，其中，所述报告基团或细胞毒性基团被所述肽模拟物包含的螯合剂配位，或者
其中，所述报告基团或细胞毒性基团是所述肽模拟物包含的辅基的一部分。
7.根据权利要求5或6所述的肽模拟物，其中，所述报告基团和细胞毒性基团是放射性核素。
8.一种产生权利要求1至7中任一项所述的肽模拟物的方法。
9.一种包含权利要求1至7中任一项所述的肽模拟物的药物或诊断组合物。
10.权利要求1至7中任一项所述的肽模拟物用于向细胞递送报告基团或细胞毒性基团的用途。
11.一种对细胞进行成像的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)使细胞与权利要求1至7中任一项所述的肽模拟物接触，其中所述肽模拟物包含报告基团，并且
b)将与细胞接触的所述报告基团可视化。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，接触包括向患者给药权利要求1至7中任一项所述的肽模拟物，其中所述肽模拟物包含报告基团，优选地，其中所述患者患有癌症。
13.权利要求1至7中任一项所述的肽模拟物用于治疗的用途。
14.权利要求1至7中任一项所述的肽模拟物用于治疗癌症的用途，优选地，所述癌症是在肿瘤细胞的表面上表达CCK2R的癌症。
15.权利要求1至7中任一项所述的肽模拟物用于诊断的用途。
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