CN116568131A - 单性生殖基因的修饰的启动子 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种产生突变基因的方法，其中所述基因包含修饰的启动子并且其中所述基因能够诱导植物的单性生殖表型。本发明还提供了所述突变基因、分离的核酸分子、包含其的构建体或载体。此外，本发明提供了生产包含突变基因的单性生殖植物的方法，以及由此获得的单性生殖植物。突变基因基于具有SEQ ID NO：5及其直系同源物的蒲公英的PAR基因。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及包括植物育种在内的植物生物技术。本发明特别涉及与例如无配子生殖(apomixis)和单倍体诱导相关并在无配子生殖和单倍体诱导中有用的基因的鉴定和用途。本发明特别涉及与单性生殖相关的基因的突变启动子。本发明还涉及在植物和作物中诱导单性生殖的方法，涉及该基因和/或启动子用于无配子生殖中的用途，特别是与无配子生殖基因组合中的用途，或在用于生产单倍体植物中的用途，其中染色体可以加倍以产生双单倍体。
背景技术
无配子生殖(也称为不完全无配生殖)是通过种子进行的无性植物繁殖。在约400种开花植物中报道了无配子生殖(Bicknell and Koltunow,2004)。开花植物的无配子生殖有两种形式：
(1)配子体无配子生殖，其中胚胎通过单性生殖从未减数的、未受精的卵细胞产生；
(2)孢子体无配子生殖，其中胚胎从孢子体细胞体细胞产生。
配子体无配子生殖体的实例是蒲公英(蒲公英属物种(Taraxacum sp.))、山柳兰(山柳菊属(Hieracium sp.))、肯塔基蓝草(草地早熟禾(Poa pratensis))和东部加马草(eastern gamagrass)(摩擦禾(Tripsacum dactyloides))。孢子体无配子生殖的实例是柑橘(柑橘属(Citrus sp.))和山竹果(山竹(Garcinia mangostana))。配子体无配子生殖包括两个发育过程：
(1)避免减数分裂重组和减数(不完全减数分裂)；和
(2)卵细胞发育成胚胎，而不受精(单性生殖)。
无配子生殖产生的种子在遗传上与亲本植物相同。很久以前就已经认识到无配子生殖在植物育种中非常有用(Asker,1979；Hermsen,1980；Asker and Jerling,1990；Vielle-Calzada et al.,1995)。将无配子生殖引入作物最明显的优势是真正培育出杂种优势F1杂交种。在大多数作物中，F1杂交种是表现最好的品种。然而，在有性作物中，F1杂交种必须通过近交纯合亲本的杂交每一代再次产生，因为F1杂交种的自花受精通过F2后代植物基因组中的重组导致杂种优势的损失。产生有性F1种子是一个重复的、复杂的和昂贵的过程。相反，无配子生殖的F1杂交种将永远繁殖。换句话说，F1杂交种的遗传固定和通过种子产生均一后代植物成为可能。
无配子生殖的F1固定是无配子生殖一般特性的一个特例，即任何基因型，无论其遗传复杂程度如何，都可以在一步繁殖。这意味着无配子生殖可以用于多基因数量性状的即时固定。应该注意的是，大多数产量性状是多基因的。无配子生殖可用于多种性状(例如各种抗性、若干转基因或多数量性状基因座)的叠加(或聚合)。没有无配子生殖，为了固定这样一组性状，每个性状基因座必须单独纯合制备，然后组合。随着性状中涉及的基因座数量增加，通过杂交使这些性状基因座纯合变得耗时、逻辑上具有挑战性，从而成本高昂。此外，等位基因之间的特异性上位相互作用因纯合性而丧失。通过无配子生殖，有可能修复这种非叠加遗传变异。因此，无配子生殖，即通过种子的克隆繁殖，有可能导致植物育种、商业种子生产和农业的范式转变(van Dijk et al.2016)。
除了即时固定任何基因型，无论其复杂程度如何，无配子生殖还有重要的其他农业用途。有性种间杂交种和同源多倍体经常由于减数分裂问题而遭受不育。由于无配子生殖跳过减数分裂，无配子生殖可以解决种间杂交种和同源多倍体的这些问题。由于无配子生殖阻止雌性杂交，无配子生殖结合雄性不育被提出来用于遏制转基因，防止转基因作物的野生亲缘关系中的转基因渗入(Daniell,2002)。在昆虫授粉的作物(如芸苔属)中，无配子生殖的结实率不会受到授粉媒介服务不足的限制。鉴于授粉蜜蜂种群的健康问题日益严重(瓦螨(Varroa mite)感染、非洲杀人蜂等)，这一点变得越来越重要。在块茎繁殖作物(如马铃薯)中，无配子生殖将无性地保持优越的基因型，但降低甚至消除当前病毒传播的风险以及清洁生产、遏制和认证的相关成本。此外，无配子生殖种子的储存成本远低于块茎或其他无性繁殖的植物部分的。在观赏植物中，无配子生殖可以取代劳动密集型和昂贵的组织培养繁殖。据认为，一般来说，无配子生殖大大降低了品种开发和植物繁殖的成本。
不幸的是，无配子生殖不发生在任何主要作物中。已经有许多尝试在有性作物中引入无配子生殖。例如，无配子生殖基因的渗入、有性模式物种的突变、通过杂交重新产生无配子生殖以及候选基因的克隆。到目前为止，通过广泛杂交将野生无配子生殖体的无配子生殖基因渗入作物物种还没有成功(例如，从摩擦禾到玉米的无配子生殖-Savidan,Y.,2001；Morgan et al.,1998；WO97/10704)。关于突变有性模式物种，WO2007/066214描述了在拟南芥中使用称为Dyad的无配子生殖突变体。然而，Dyad是一种外显率非常低的隐性突变。在作物物种中，这种突变的用途有限。通过两种有性生态型之间的杂交重新产生无配子生殖并没有产生农学上感兴趣的无配子生殖体(US2004/0168216A1和US2005/0155111A1)。在US2004/0148667中已经描述了通过转座子标记在玉米中克隆候选无配子生殖基因。已经要求保护了elongate基因的直系同源物，其被认为诱导无配子生殖。然而，根据Barrell和Grossniklaus(2005)，elongate基因跳过减数分裂II，因此不保持母本基因型，这使得它的用处小得多。
在US2006/0179498中已经描述了所谓的反向育种将是无配子生殖的一种替代方法。然而，这是一个技术上复杂的体外实验室方法，而无配子生殖是由植物本身进行的体内方法。此外，在反向育种中，一旦亲本系被重建(双配子纯合子)，仍然需要进行杂交。
自然无配子生殖体中的无配子生殖通常具有遗传基础(Ozias-Akins and VanDijk,2007的综述)。因此，另一种方法可能是从天然无配子生殖物种中分离无配子生殖基因。然而，这并不是一件容易的事情，因为天然无配子生殖体通常具有多倍体基因组，多倍体中的定位克隆非常困难。其他复杂因素是无配子生殖特异性染色体区域的重组抑制、重复序列和杂交中的分离畸变。
如本文所述，需要在作物中诱导无配子生殖的方法，该方法没有现有技术的至少一些限制。特别地，需要产生无配子生殖植物和无配子生殖种子的方法。还需要提供涉及无配子生殖，特别是单性生殖发育过程的基因和蛋白质，这些基因和蛋白质适用于在作物中引入无配子生殖或(双)单倍体并且可以基本上模拟无配子生殖途径。
发明内容
本发明人已经鉴定和分离了单性生殖基因座和基因、与单性生殖表型相关的等位基因(本文表示为单性生殖等位基因或Par等位基因)和非单性生殖表型(本文表示为单性生殖基因的有性等位基因或par等位基因)、它们的遗传序列即启动子序列、5’UTR、编码序列、3’UTR序列和编码的蛋白质序列。
本发明提供了一种通过改变所述par等位基因的启动子序列将par等位基因修饰或改变为Par等位基因的方法。本发明特别适用于将内源性par等位基因修饰成Par等位基因，优选通过随机或靶向诱变，任选地通过转化。所得到的突变等位基因能够将植物和/或其后代转化为具有或具有增强的不经受精将卵细胞发育成胚胎的能力的植物。
定义
如本文所用，术语“基因座”(复数：loci)是指染色体上的一个(或多个)特定位置或位点，其中例如发现了基因或遗传标记。例如，“单性生殖基因座”是指单性生殖基因在基因组中的位置。已经鉴定了单性生殖基因的两种功能变体，即有助于单性生殖表型的等位基因，本文表示为单性生殖基因的单性生殖等位基因或Par等位基因，和/或其有性对应物，本文表示为单性生殖基因的有性等位基因或par等位基因。
“在单性生殖中是功能性的”基因、等位基因、蛋白质或核酸在本文中应理解为有助于单性生殖表型和/或增加或转化植物或植物细胞将卵细胞发育成胚胎的能力。
“单性生殖基因”是与单性生殖相关的基因，其中“相关”在本文中应理解为指示单性生殖或非单性生殖(有性)表型。赋予单性生殖的(显性)等位基因(Par等位基因)及其两个有性对应物(par等位基因或单性生殖基因的有性等位基因)的遗传序列已在三倍体无融合生殖体药蒲公英(Taraxacum officinale)分离株A68中首次鉴定，如PCT/EP2020/064991所述，其通过引用并入本文。优选地，Par等位基因启动单性生殖。赋予单性生殖的(显性)等位基因具有SEQ ID NO：5的遗传序列并包含具有SEQ ID NO：2序列的启动子、具有SEQ IDNO：3序列的编码序列和具有SEQ ID NO：4序列的3’UTR。其中一个有性等位基因具有SEQ IDNO：10的遗传序列并包含具有SEQ ID NO：7序列的启动子、具有SEQ ID NO：8序列的编码序列和具有SEQ ID NO：9序列的3’UTR。另一有性等位基因具有SEQ ID NO：15的遗传序列并包含具有SEQ ID NO：12序列的启动子、具有SEQ ID NO：13序列的编码序列和具有SEQ ID NO：14序列的3’UTR。基于这些单性生殖基因编码的蛋白质(表示为PAR蛋白)的特征，已经在其他物种中鉴定了直系同源基因。卵细胞中PAR蛋白的存在可能导致胚胎发生抑制剂的抑制，在没有受精的情况下触发细胞分裂。这些PAR蛋白的特征在于它们包含锌指C2H2-型结构域(IPR13087)，优选具有共有序列C.{2}C.{7}[K/R]A.{2}GH.[R/N].H的锌指K2-2-样结构域，其也可注释为：CXXCXXXXXXX[K/R]AXXGHX[R/N]XH(SEQ ID NO：37)，其中X可以是任何天然存在的氨基酸，其中[K/R]表示所述氨基酸是赖氨酸或精氨酸，并且其中[R/N]表示所述氨基酸是精氨酸或天冬酰胺(参见Englbrecht et al.,2004)。除了本文定义的锌指C2H2-型结构域，优选锌指K2-2-样结构域之外，所述蛋白质还包括具有共有氨基酸序列DLNXXP(SEQID NO：58)或DLNXP(SEQ ID NO：59)的EAR基序(两亲性抑制相关的乙烯响应元件结合因子)，其中X可以是任何天然存在的氨基酸(参见Kagale et al.,2010；和Yang et al.,2018)。优选所述EAR基序位于C-末端。优选锌指C2H2-型结构域位于所述EAR基序的N-末端。优选地，PAR蛋白具有至多400个氨基酸的长度，其中所述蛋白包含一个或两个如本文所示的EAR基序和如本文所定义的锌指K2-2-样结构域。优选地，该蛋白质具有至多400个氨基酸的长度，其中所述蛋白质仅包含一个或两个如本文所示的EAR基序和仅一个如本文所定义的锌指K2-2-样结构域，即没有其他如本文所定义的EAR基序，也没有其他如本文所定义的锌指K2-2-样结构域。除了400个氨基酸的最大大小、仅一个或两个本文所示的EAR基序和定义的单个锌指K2-2样结构域的特征之外，PAR蛋白可以包含仅一个具有C.{2}C.{12}H.{3}H的锌指共有序列的另外锌指结构域，其也可以注释为：CXXCXXXXXXXXXXXXHXXXH(SEQ IDNO：38)，但是更优选地不包含具有C.{2}C.{12}H.{3}H(SEQ ID NO：38)的锌指共有序列的另外锌指结构域。优选地，PAR蛋白具有至多500个氨基酸的长度。PAR蛋白可以是约50-500、100-300或约150-200个氨基酸。PAR蛋白可以具有大约170个氨基酸的长度。直系同源单性生殖基因可以是但不限于编码选自以下组的任何一种PAR蛋白的基因：来自菠萝(Ananascomosus)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A199URK4)、来自深圳拟兰(Apostasiashenzhenica)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A2I0AZW3)、来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的PAR蛋白(例如UniProtKB：Q8GXP9、A0A178V2S4、O81793、A0A178V1Q3、A0MFC1、O81801)、来自狭叶拟南芥亚种狭叶拟南芥(Arabidopsis lyrata subsp.Lyrata)的PAR蛋白(例如UniProtKB：D7MC52或D7MCE8)、来自花生(Arachis ipaensis)的PAR蛋白(例如SEQID NO：45或SEQ ID NO：49)、来自二穗短柄草(Brachypodium distachyon)的PAR蛋白(例如UniProtKB：I1J0D9)、来自甘蓝(Brassica oleracea)变种Oleracea的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A0D3A1Q6或A0A0D3A1Q3)、来自油菜(Brassica campestris)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A398AHT1)、来自芜菁(Brassica rapa)的PAR蛋白(例如SEQ ID NO：47)、来自芜菁亚种Pekinensis的PAR蛋白(例如UniProtKB：M4D574或M4D571)、来自甘蓝的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A3P6ESB1或A0A3P6F726)、来自油菜的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A3P5ZMM3或A0A3P5Z1M1)、来自木豆(Cajanus cajan)的PAR蛋白(例如SEQ ID NO：46)、来自Capsella rubella的PAR蛋白(例如UniProtKB：R0H2J1或R0H0C2)、来自土瓶草(Cephalotus follicularis)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A1Q3CSK1)、来自鹰嘴豆(Cicerarietinum)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A3Q7YBZ1、A0A1S2YZL9、A0A3Q7Y0Z6或A0A1S2YZM6；或SEQ ID NO：55、56或57)、菊苣(Cichorium endivia)的PAR蛋白(例如SEQ IDNO：39)、来自黄瓜(Cucumis sativus)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A0A0KGW4或A0A0A0L0X7)、来自甜瓜(Cucumis melo)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A1S3BLF2或A0A1S3B298)、来自黄瓜的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A0A0KAW8)、来自南瓜(Cucurbitamoschata)的PAR蛋白(例如SEQ ID NO：43)、来自原野菟丝子(Cuscuta campestris)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A484MGR1)、来自铁皮石斛(Dendrobium catenatum)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A2I0V7N9、A0A2I0X2T2或A0A2I0W0Q8)、来自旋蒴苣苔(Dorcocerashygrometricum)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A2Z7D3Y1)、来自盐芥(Eutremasalsugineum)的PAR蛋白(例如UniProtKB：V4LSH0；或SEQ ID NO：44)、来自欧洲山毛榉(Fagus sylvatica)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A2N9E5Y5、A0A2N9HAB9或A0A2N9H993)，来自Genlisea aurea的PAR蛋白(例如UniProtKB：S8E1M6)、来自大豆(Glycine max)的PAR蛋白(例如SEQ ID NO：51、52、53或54)、来自陆地棉(Gossypium hirsutum)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A1U8LDU9)、来自向日葵(Helianthus annuus)的PAR蛋白(例如SEQ ID NO：21)、来自巴西三叶胶(Hevea brasiliensis)的PAR蛋白(例如SEQ ID NO：42)、来自橙黄山柳菊(Hieracium aurantiacum)的PAR蛋白(例如SEQ ID NO：40)、来自核桃(Juglansregia)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A2I4E6B1)、来自莴苣(Lactuca sativa)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A2J6KZF7；或SEQ ID NO：22)、来自葫芦(Lagenaria siceraria)的PAR蛋白(例如SEQ ID NO：48)、来自蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)的PAR蛋白(例如UniProtKB：G7K024)、来自川桑(Morus notabilis)的PAR蛋白(例如UniProtKB：W9SMY3或W9SMQ7)、来自刺痛油麻藤(Mucuna pruriens)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A371ELJ8)、来自渐狭叶野生烟草(Nicotiana attenuata)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A1J6IQI6)、来自林烟草(Nicotiana sylvestris)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A1U7VXJ0)、来自烟草(Nicotiana tabacum)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A1S4A651或A0A1S3YHQ2)、来自水稻(Oryza sativa)亚种Japonica的PAR蛋白(例如UniProtKB：B9FGH8)、来自巴蒂稻(Oryzabarthii)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A0D3FWX3)、来自稷(Panicum miliaceum)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A3L6Q010或A0A3L6T1D6)、来自Parasponia andersonii的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A2P5BMI5)、来自银白杨(Populus alba)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A4U5PSY9)、来自毛果杨(Populus trichocarpa)的PAR蛋白(例如UniProtKB：B9H661)、来自石榴(Punica granatum)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A2I0IBB9、A0A218XB85或A0A218W102)、来自Senecio cambrensis的PAR蛋白(例如SEQIDNO：41)、来自桃(Prunuspersica)的PAR蛋白(例如SEQ ID NO：50)、来自异色山黄麻(Trema orientale)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A2P5EB04)、来自红三叶草(Trifolium pratense)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A2K3N851)、来自地三叶草(Trifolium subterraneum)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A2Z6MYD3或A0A2Z6MDR7)、来自红三叶草的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A2K3PR44)、来自葡萄(Vitis vinifera)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A438C778、A0A438ESC4或A0A438DBR4)和来自玉米(Zea mays)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A1D6HF46、B6UAC5、A0A3L6F4S1、A0A3L6EMC6、A0A3L6EMC6、K7UHQ6或A0A1D6KHZ4)。这种基因也可以编码选自如下的PAR蛋白：来自中华猕猴桃(Actinidia chinensis)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A2R6S2S9)、来自甜菜(Beta vulgaris)的PAR蛋白(例如UniProtKB：XP_010690656.1)、来自马铃薯(Solanum tuberosum)的PAR蛋白(例如UniProtKB：XP_015159151.1)、来自番茄(Solanum lycopersicum)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A3Q7GXB3、Solyc05g055500或Solyc06g060480)、来自辣椒(Capsicum baccatum)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A2G2WJR7)、来自茄(Solanum melongena)的PAR蛋白(例如UniProtKB：AVC18974.1)、来自大豆(Glycine soja)的PAR蛋白(例如GeneBank登录号：XP_028201014.1、XP_006596577.1或UniprotKB：A0A445M3M6)、来自落花生(Arachishypogaea)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A444WUX5)、来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的PAR蛋白(例如UniProtKB：V7CIF6)、来自胡萝卜(Daucus carota)的PAR蛋白(例如GeneBank登录号：XP_017245413.1)、来自小麦(Triticum aestivum)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A3B6RP64)、来自水稻亚种indica的PAR蛋白(例如，UniProtKB：A2YH63)、来自水稻亚种japonica的PAR蛋白(例如，UniProtKB：Q5Z7P5)和来自可可(Theobroma cacao)的PAR蛋白(例如UniProtKB：A0A061DL63)。任选地，直系同源基因是编码PAR蛋白的基因，所述PAR蛋白包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成，优选当使用例如Needleman和Wunsch算法(全局序列比对)与默认参数成对比对时并在它们的整个长度上进行比较时，所述氨基酸序列分别与SEQ ID NO：1、6和11中的任一具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更多的相同性和/或上文提供的任何一种直系同源物。
如本文所用，术语“等位基因”是指特定基因座上基因的一种或多种替代形式中的任一种。在生物体的二倍体和/或多倍体细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或基因座，其中一个等位基因存在于该组同源染色体的每条染色体上。二倍体和/或多倍体生物体或植物物种可以在特定基因座包含大量不同的等位基因。
本文中使用的术语“显性等位基因”是指一个基因的等位基因之间的关系，其中一个等位基因(即显性等位基因)的作用掩盖了同一基因座上第二个等位基因(即隐有性等位基因)的作用。对于常染色体(除性染色体以外的任何染色体)上的基因，等位基因及其相关性状是常染色体显性或常染色体隐性的。显性是孟德尔遗传和经典遗传学中的关键概念。任选地，显性等位基因编码功能蛋白，而隐有性等位基因不编码。任选地，显性等位基因和隐有性等位基因可以编码相同或基本相同的功能蛋白，而与隐有性等位基因不同，只有显性等位基因能够在特定环境下和/或在特定组织中表达一定量的所述功能蛋白，从而转化特定表型，如单性生殖。
本文中使用的术语“雌性子房”是指孢子在其中形成的外壳。它可以由单细胞组成，也可以是多细胞的。所有的植物、真菌和许多其他谱系都在它们生命周期的某个时刻形成子房。子房可以通过有丝分裂或减数分裂产生孢子。通常，在每个子房内，大孢子母细胞的减数分裂产生四个单倍体大孢子。在裸子植物和被子植物中，这四个大孢子中只有一个在成熟时有功能，其他三个退化。存在的大孢子有丝分裂并发育成雌性配子体(大配子体)，最终产生一个卵细胞。
本文中使用的术语“雌性配子”是指在有性繁殖的生物体中，在受精(受孕)期间，在正常(有性)环境下与另一个(“雄性”)细胞融合的细胞。在产生两种形态上不同类型配子并且其中每个个体只产生一种类型的物种中，雌性是指产生较大类型配子(称为胚珠(卵子)或卵细胞)的任何个体。在植物中，雌胚珠是由花的子房产生的。成熟时，单倍体胚珠产生雌配子，然后准备受精。雄性细胞是花粉(大部分是单倍体)，其由花药产生。
术语“遗传标记”或“多态性标记”是指基因组DNA上可用于“标记”染色体上特定位置的区域。如果遗传标记与基因紧密连锁或“在”基因上，它“标记”在其上发现该基因的DNA，因此可以用于(分子)标记分析以选择是否存在该基因，例如在标记辅助育种/选择(MAS)方法中。遗传标记的实例是AFLP(扩增片段长度多态性，EP534858)、微卫星、RFLP(限制性片段长度多态性)、STS(序列标记位点)、SNP(单核苷酸多态性)、SFP(单特征多态性；参见Borevitz et al.,2003)、SCAR(序列特征性扩增区)、CAPS标记(切割的扩增多态性序列)等。标记离基因越远，标记和基因之间发生重组(杂交)的可能性就越大，从而失去连锁(以及标记和基因的共分离)。遗传基因座之间的距离是根据重组频率来测量的并以cM(厘摩；1cM是两个标记之间的减数分裂重组频率为1％)表示。由于物种之间的基因组大小差异很大，用1cM(即两个标记之间的千碱基，kb)表示的实际物理距离在物种之间也有很大差异。
应当理解，当本文提及“连锁”标记时，这也包括“在”基因本身上的标记。
“MAS”指“标记辅助选择”，由此筛选植物存在和/或不存在一个或多个遗传和/或表型标记，以加速包含所述标记的DNA区域(和任选缺乏侧翼区域)转移到(优良)育种系中。
“分子标记分析”(或测试)是指(基于DNA的)分析，其指示(直接或间接)等位基因例如植物或植物部分中的Par或par等位基因的存在或不存在。优选地，它允许人们确定在任何单个植物的单性生殖基因座上特定等位基因是纯合的或杂合的。例如，在一个实施方案中，使用PCR引物扩增与单性生殖基因座连锁的核酸，酶促消化扩增产物，并且基于扩增产物的电泳解析模式，可以确定哪个(一个或多个)等位基因存在于任何单个植物中以及单性生殖基因座上等位基因的接合性(即每个基因座上的基因型)。实例是SCAR标记(序列特征性扩增区)、CAPS标记(切割的扩增多态性序列)和类似的标记分析。
如本文所用，术语“杂合”是指当两个不同的等位基因位于特定基因座、但分别位于细胞中相应的同源染色体组上时存在的遗传状况。相反，如本文所用，术语“纯合”是指当两个(或在多倍体的情况下更多)相同等位基因位于特定基因座、但分别位于细胞中相应的同源染色体组上时存在的遗传状况。
本文中使用的“变种”符合UPOV惯例，是指已知最低等级的单个植物学分类单元中的植物类群，该类群可以通过特征的表达来定义并且可以通过所述特征中的至少一个的表达来区别于任何其他植物类群并且被认为是关于其不变(稳定)繁殖的适宜性的单位。
术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用，是指由氨基酸链组成的分子，不涉及特定的作用模式、大小、三维结构或来源。因此，蛋白质的“片段”或“部分”仍可称为“蛋白质”。
术语“基因”是指包含区域(转录区域)的DNA序列，该区域在细胞中被转录成RNA分子(例如加工成mRNA的pre-mRNA)，其可操作地连接到合适的调节区域(例如启动子)。因此，基因可以包含几个可操作地连接的序列，例如启动子、包含例如涉及翻译起始序列的5’前导序列、(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA)和包含例如转录终止位点的3’非翻译序列。
“嵌合基因”(或重组基因)是指自然界中通常在物种中不存在的任何基因，特别是其中存在一个或多个核苷酸序列部分且在自然界中彼此不相关的基因。例如，启动子在自然界中不与部分或全部转录区域或另一调控区域相关联。
“天然基因”是指包含启动子序列、编码序列和任选包含3’-序列的任何基因，这些序列也可以在天然存在的基因中发现。任选地，天然基因的核苷酸序列与自然界中发现的序列相同。本文中应理解的是，天然基因可以是转基因，在该实施方案中，天然基因存在于植物物种中，其中植物物种不天然包含所述天然基因。
本文将“内源基因”理解为其自然环境中的天然基因，即存在于天然包含该基因的植物物种中。
“3’UTR”或“3’非翻译序列”(也经常称为3’非翻译区，或3’末端)是指在基因编码序列下游发现的核苷酸序列，其包含例如转录终止位点和(在大多数但不是所有真核mRNA中)聚腺苷酸化信号(例如AAUAAA或其变体)。转录终止后，mRNA转录物可以在聚腺苷酸化信号的下游被切割并且可以添加poly(A)尾，其参与mRNA到细胞质(发生翻译的地方)的转运。
“5’UTR”或“前导序列”或“5’非翻译区”是mRNA转录物和相应DNA的区域，位于mRNA转录开始的+1位置和编码区的翻译起始密码子之间(通常是mRNA上的AUG或DNA上的ATG)。5’UTR通常包含对翻译、mRNA稳定性和/或周转以及其他调节元件重要的位点。
“基因的表达”是指将可操作地连接到适当调控区域、特别是启动子的DNA区域转录成RNA的过程，该RNA具有生物活性，即能够翻译成生物活性蛋白质或肽(或活性肽片段)或其自身具有活性(例如在转录后基因沉默或RNAi中)。活性蛋白质可以是指能够实现其功能的蛋白质，其功能可以是例如通过结合所述基因的5’UTR的调节元件来抑制所述基因的表达。在某些实施方案中，活性蛋白质是指组成型活性的蛋白质。编码序列优选为有义方向并编码所需的生物活性蛋白质或肽或活性肽片段。在基因沉默方法中，DNA序列优选以反义DNA或反向重复DNA的形式存在，包括反义或有义和反义方向的靶基因的短序列。
“转录调节序列”本文定义为能够调节与转录调节序列可操作地连接的(编码)序列的转录速率的核苷酸序列。因此，本文定义的转录调节序列将包含启动转录(启动子元件)、维持和调节转录所需的所有序列元件，包括例如衰减子或增强子。尽管主要指的是编码序列的上游(5’)转录调节序列，但发现的编码序列下游(3’)的调节序列也包括在该定义中。
如本文所用，术语“启动子”是指功能是控制一个或多个DNA区域转录的核酸片段，该区域位于转录起始位点转录方向的上游，并且通过存在DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列包括但不限于转录因子结合位点、阻遏物和激活物蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的直接或间接调节来自启动子的转录量的任何其他核苷酸序列而在结构上鉴定。任选地，术语“启动子”本文还包括5’UTR区(例如，启动子本文可以包括基因的翻译起始密码子上游(5’)的一个或多个部分，因为该区域可能在调节转录和/或翻译中具有作用。
“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在生理上(如通过外用某些化合物)或发育上调节的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中有活性。“在植物或植物细胞中有活性的启动子”是指启动子驱动植物或植物细胞内转录的一般能力。它对启动子的时空活性没有任何影响。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指多核苷酸元件在功能关系中的连接。当一个核酸与另一个核苷酸序列处于功能关系时，它是“可操作地连接”。例如，启动子，或者说转录调节序列，如果影响编码序列的转录，则可操作地连接编码序列。可操作地连接意味着被连接的DNA序列通常是连续的，并且在必要时将启动子序列连接到蛋白质编码序列或蛋白质编码序列连接到3’UTR。“核酸构建体”或“载体”本文被理解为指由使用重组DNA技术产生的人造核酸分子，其用于将外源DNA递送到宿主细胞中。载体骨架可以例如是二元或双元(superbinary)载体(参见例如US 5591616、US 2002138879和WO95/06722)、共整合载体或T-DNA载体，如本领域已知的和本文其他地方所述，其中整合了基因或嵌合基因，或者，如果已经存在合适的转录调节序列，则仅在转录调节序列的下游整合所需的核苷酸序列(例如编码序列、反义或反向重复序列)。载体通常包含进一步的遗传元件，以促进它们在分子克隆中的应用，例如选择标记、多克隆位点等。
“重组宿主细胞”或“转化的细胞”或“转基因细胞”是指由于至少一种核酸分子而产生的新的单个细胞(或生物体)，特别是包含已被引入所述细胞的编码所需蛋白质转基因和/或嵌合基因或在表达时产生特异性蛋白质如本文定义的PAR蛋白的核苷酸序列。“分离的核酸”用于指不再处于其天然环境中的核酸，例如体外或重组细菌或植物宿主细胞中的核酸。
“宿主细胞”是用转基因转化为重组宿主细胞的原始细胞。宿主细胞优选为植物细胞或细菌细胞。重组宿主细胞可以包含作为染色体外(游离)复制分子的核酸构建体，或者更优选地，包含整合在宿主细胞的核或质体基因组中的基因或嵌合基因。
“重组植物”或“重组植物部分”或“转基因植物”是包含重组基因或嵌合基因或转基因的植物或植物部分(例如种子或果实或叶)，即使该基因可能不在所有细胞中表达或不在所有细胞中表达。
“优良事件(elite event)”是已被选择在基因组中的位置包含重组基因或转基因导致植物良好表型和/或农艺性状的重组植物。可以对整合位点的侧翼DNA进行测序以表征整合位点并将该事件与在基因组的其他位置包含相同重组基因的其他转基因植物区分开来。
术语“选择标记”是本领域普通技术人员熟悉的术语，本文用于描述任何遗传实体，当表达时，可用于选择含有选择标记的一个或多个细胞。选择标记基因产物赋予例如抗生素抗性，或更优选地赋予除草剂抗性或另一可选择性状，例如表型性状(例如色素沉着的变化)或营养需求。术语“报道子”主要用于指可见标记，如绿色荧光蛋白(GFP)、eGFP、荧光素酶、GUS等。
基因或蛋白质的术语“直系同源物”本文指在另一物种中发现的同源基因或蛋白质，其具有与该基因或蛋白质相同的功能，但(通常)从携带该基因的物种分化的时间点开始在序列上分化(即基因通过物种形成从共同祖先进化而来)。因此，基于序列比较(例如，基于整个序列或特定结构域上的序列相同性百分比)和功能分析，可以在其他植物物种中鉴定Taxaracum单性生殖基因的直系同源物。
术语“同源的”和“异源的”是指核酸或氨基酸序列与其宿主细胞或生物体之间的关系，尤其是在转基因生物体的上下文中。因此，同源序列在宿主物种中天然发现(例如，用莴苣基因转化的莴苣植物)，而异源序列不在宿主细胞中天然发现(例如，用来自马铃薯植物的序列转化的莴苣植物)。根据上下文，术语“同源物”或“同源的”可以替代地指是共同祖先序列后代的序列(例如，它们可以是直系同源物)。
“严格杂交条件”可用于鉴定与给定核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。严格条件依赖于序列，在不同的情况下会有所不同。通常，在规定的离子强度和pH，严格条件被选择为比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH)。通常将选择严格条件，其中盐浓度在pH 7为约0.02摩尔，温度至少为60℃。降低盐浓度和/或提高温度会增加严格性。RNA-DNA杂交的严格条件(使用例如100nt探针的Northern印迹)例如包括在63℃在0.2×SSC中至少洗涤20分钟的条件，或等效条件。DNA-DNA杂交的严格条件(使用例如100nt探针的Southern印迹)例如包括在至少50℃、通常约55℃的温度在0.2X SSC中至少一次洗涤(通常为2次)20分钟或等效条件。另参见Sambrook et al.(1989)和Sambrook and Russell(2001)。
例如，可以通过在65℃的水溶液中杂交来提供“高严格性”条件，该水溶液含有6xSSC(20x SSC含有3.0M NaCl、0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)、5x Denhardt's(100X Denhardt's含有2％Ficoll、2％聚乙烯吡咯烷酮、2％牛血清白蛋白)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)和20μg/ml变性载体DNA(单链鱼精子DNA，平均长度为120-3000个核苷酸)作为非特异性竞争物。杂交后，高严格性洗涤可分几步进行，最后一次洗涤(约30分钟)在杂交温度在0.2-0.1×SSC、0.1％SDS中进行。
“中等严格性”是指与上述溶液中的杂交相当的条件，但在大约60-62℃。在这种情况下，最终洗涤在杂交温度在1x SSC、0.1％SDS中进行。
“低严格性”是指相当于在上述溶液中约50-52℃杂交的条件。在这种情况下，最终洗涤在杂交温度在2x SSC、0.1％SDS中进行。另参见Sambrook et al.(1989)和Sambrookand Russell(2001)。
“序列相同性”和“序列相似性”可以通过使用全局或局部(取决于两个序列的长度)比对算法对两个肽或两个核苷酸序列进行比对来确定。长度相似的序列优选使用全局比对算法(例如Needleman Wunsch)进行比对，该算法在整个长度上最佳地比对序列，而长度基本不同的序列优选使用局部比对算法(例如Smith Waterman)进行比对。然后，当序列(当通过例如使用默认参数的程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时)共有至少某个最小百分比的序列相同性(如本文所定义的)时，序列可以被称为“基本上相同”或“基本上相似”。序列相同性的百分比优选使用Sequence Analysis Software PackageTM(版本10；GeneticsComputer Group,Inc.,Madison,Wis.)的“BESTFIT”或“GAP”程序来确定。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法(Needleman and Wunsch,Journal of MolecularBiology 48:443-453,1970)在两个序列的整个长度(全长)上比对两个序列，使匹配的数量最大化并使缺口的数量最小化。当两个序列具有相似的长度时，适合使用全局比对确定序列相同性。通常，使用GAP默认参数，缺口产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)并且缺口延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,915-919)。序列比对和百分比序列相同性的分数可以使用计算机程序来确定，例如GCG Wisconsin软件包，版本10.3，可从Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,CA92121-3752USA获得，或者使用开源软件，例如EmbossWIN版本2.10.0中的程序“needle”(使用全局Needleman Wunsch算法)或“water”(使用局部Smith Waterman算法)，使用与上述GAP相同的参数，或者使用默认设置(对于“needle”和“water”以及对于蛋白质和DNA比对，默认的GAP开放罚分是10.0，默认的缺口延伸罚分是0.5；对于蛋白质，默认的评分矩阵是Blossum62，对于DNA，默认的评分矩阵是DNAFull)。“BESTFIT”使用Smith和Waterman的局部同源性算法执行两个序列之间的相似性的最佳片段的最佳比对，并插入缺口以最大化匹配的数量(Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics,2:482-489,1981,Smith et al.,Nucleic AcidsResearch 11:2205-2220,1983)。当序列具有实质上不同的总长度时，优选局部比对，例如使用Smith Waterman算法的比对。
如本文所用，“序列相同性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在整个组分如核苷酸或氨基酸的比对窗口中不变的程度。测试序列和参考序列的比对片段的“相同性分数”是两个比对序列共有的相同组分的数量除以参考序列片段(即整个参考序列或参考序列的较小定义部分)中组分的总数。“相同性百分比”是相同性分数乘以100。
用于确定序列相同性的有用方法也公开于Guide to Huge Computers,MartinJ.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994和Carillo,H.,and Lipton,D.,AppliedMath(1988)48:1073。更具体地，用于确定序列相同性的优选计算机程序包括基本局部比对搜索工具(BLAST)程序，其可从Bethesda,Md.20894的国家卫生研究所国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得；参见BLAST手册，Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；BLAST程序的2.0或更高版本允许在比对中引入缺口(缺失和插入)；对于肽序列，BLASTX可用于确定序列相同性；并且，对于多核苷酸序列，BLASTN可用于确定序列相同性。
可选地，可以通过使用诸如FASTA、BLAST等算法对公共数据库进行搜索来确定百分比相似性或相同性。因此，本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来对公共数据库进行搜索，以例如识别其他家族成员或相关序列。这种搜索可以使用Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403—10的BLASTn和BLASTx程序(版本2.0)来执行。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的氧化还原酶核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTx程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以使用如Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中描述的Gapped BLAST(Gapped BLAST)。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如BLASTx和BLASTn)的默认参数。参见国家生物技术信息中心的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
本文中使用的术语“有性植物繁殖”是指一种发育途径，其中称为“大孢子母细胞”的(例如二倍体)体细胞经历减数分裂以产生四个减数的大孢子。这些大孢子中的一个有丝分裂形成大配子体(也称为胚囊)，它包含一个减数的卵细胞(即与母本相比染色体数量减数的细胞)和两个减数的极核。花粉粒的一个精子细胞使卵细胞受精产生(例如二倍体)胚胎，而第二个精子细胞使两个极核受精产生(例如三倍体)胚乳(过程称为双受精)。
本文中使用的术语“大孢子母细胞”或“大孢子细胞”是指通过减数(通常是减数分裂)产生大孢子的细胞，以产生四个将发育成雌性配子体的单倍体大孢子。在被子植物(也称为开花植物)中，大孢子母细胞产生大孢子，大孢子通过两个不同的过程发育成大配子体，包括大孢子发生(在珠心中形成大孢子或大孢子囊)和大配子体发生(大孢子发育成大配子体)。
本文所用的术语“无性植物繁殖”是在没有受精和配子融合的情况下实现植物繁殖的过程。无性繁殖产生新的个体，除了发生突变或体细胞重组之外，这些个体在遗传上与亲本植物相同，并且彼此相同。植物有两种主要类型的无性繁殖，包括营养繁殖(即原始植物营养部分的出芽、分蘖等)和无配子生殖。
本文中使用的术语“无配子生殖”是指通过无性过程形成种子。无配子生殖的一种形式的特征是：1)不完全减数分裂，指在子房中形成未减数的胚囊，和2)单性生殖，指未减数的卵发育成胚胎。数百种野生植物以无配子生殖繁殖和无性繁殖为特征。不完全减数分裂是一种产生未减数卵细胞的过程，其染色体数目与亲本植物体细胞组织相同，基因型相同或高度相似。未减数的卵细胞可来源于未减数的大孢子(倍数孢子形成)或体细胞初始细胞(无孢子形成)。在倍数孢子形成的情况下，大孢子发生被有丝分裂或修饰的减数分裂所取代。修饰的减数分裂优选是第一次分裂恢复型，没有重组。可选地，修饰的减数分裂可以是第二次分裂恢复型。在一个优选的实施方案中，不完全减数分裂是影响第一次减数分裂的双孢子型不完全减数分裂。已知无配子生殖以不同的形式发生，包括至少两种形式，称为配子体无配子生殖和孢子体无配子生殖(也称为不定胚)。发生配子体无配子生殖的植物的实例包括蒲公英(蒲公英属)、山柳兰(山柳菊属)、肯塔基蓝草(草地早熟禾)、东部加马草(摩擦禾)等。发生孢子体无配子生殖的植物的实例包括柑橘(柑橘属)、山竹果(山竹)等。
本文中使用的术语“倍数孢子形成”是指未减数的胚囊直接通过有丝分裂或终止的减数分裂事件从大孢子母细胞衍生的情况。已经报道了三种主要类型的倍数孢子形成，以它们发生的植物命名，它们是蒲公英、苦荬菜(Ixeris)和蝶须属(Antennaria)类型。在蒲公英类型中，减数分裂前期开始，但随后该过程中止，导致两个未减数的二分体，其中一个通过有丝分裂产生胚囊。在苦荬菜类型中，在减数分裂前期的等分分裂之后，细胞核的两次进一步有丝分裂产生八核胚囊。蒲公英和苦荬菜类型被称为减数分裂倍数孢子形成，因为它们涉及减数分裂的修饰。相反，在蝶须属类型中，称为有丝分裂倍数孢子形成，大孢子母细胞不启动减数分裂，直接分裂三次产生未减数的胚囊。在通过倍数孢子形成的配子体无配子生殖中，未减数的配子体由未减数的大孢子产生。这种未减数的大孢子来自有丝分裂样分裂(有丝分裂)或修饰的减数分裂(减数分裂双孢子形成)。在通过无孢子形成的配子体无配子生殖和通过倍数孢子形成的配子体无配子生殖中，未减数的卵细胞单性生殖发育成胚胎。蒲公英中的无配子生殖是双孢子型的，这意味着跳过第一次雌性减数分裂(减数分裂I)，产生两个与母株基因型相同的未减数大孢子。这些大孢子中的一个退化，另一个存活的未减数的大孢子产生未减数的大配子体(或胚囊)，其包含未减数的卵细胞。这种未减数的卵细胞在没有受精的情况下发育成与母株基因型相同的胚胎。由配子体无配子生殖过程产生的种子被称为无配子生殖种子。
术语“倍数孢子形成功能”是指在植物中，优选在雌性子房中，优选在大孢子母细胞和/或雌性配子中诱导倍数孢子形成的能力。因此，引入倍数孢子形成功能的植物能够进行倍数孢子形成过程，即通过减数分裂I恢复产生未减数的配子。
本文中使用的术语“无配子生殖种子”是指从无配子生殖植物物种或通过诱导经历无配子生殖特别是通过倍数孢子形成的配子体无配子生殖的植物或作物获得的种子。无配子生殖种子的特征在于它们是克隆并且在遗传上与亲本植物相同并且萌发能够真实繁殖的植物。在本发明中，“无配子生殖种子”也指“克隆无配子生殖种子”。
本文中使用的术语“无配子生殖植物”是指不受精而无性繁殖自身的植物。无配子生殖植物可以是已经被修饰成无配子生殖的有性植物，例如已经例如用本文教导的一种或多种单性生殖基因进行遗传修饰以获得无配子生殖植物的有性植物，或者是无配子生殖植物的后代的植物。在这种情况下，无配子生殖产生的后代在遗传上与亲本植物相同。
细胞、植物、植物部分或种子的“克隆”的特征在于，它们在遗传上与其同胞以及它们所来自的亲本植物相同。单个克隆的基因组DNA序列几乎相同，然而，突变可能会导致微小差异。
本文中使用的术语“真实繁殖”或“真实繁殖生物体”(也称为纯种生物体)是指总是将某种表型特征不变或几乎不变地传递给其后代的生物体。生物体被称为对其适用的每种性状的真实繁殖，并且术语“真实繁殖”也用于描述个体遗传性状。
本文中使用的术语“F1杂交种”(或子代1杂交种)是指具有明显不同亲本类型的后代的第一子代。亲本类型可能是也可能不是近交系。F1杂交种用于遗传学和选择性育种，在选择性育种中，它可能以F1杂交种出现。明显不同亲本类型的后代产生具有结合了父母亲代特征组合的新的、统一的表型。F1杂交种具有明显的优势，如杂种优势，因此在农业实践中非常受欢迎。在本发明的一个实施方案中，本文所教导的方法、基因、蛋白质、变体或其片段可用于固定F1杂交种的基因型，而不管其遗传复杂性如何，并允许在一个步骤中产生能够繁殖的生物体。
本文中使用的术语“授粉”或“对...授粉”是指花粉从植物的花药(雄性部分)转移到柱头(雌性部分)从而使能够受精和繁殖的过程。它是开花植物被子植物所独有的。每个花粉粒都是雄性单倍体配子体，其适于被运输到雌性配子体，在那里它可以在双受精过程中通过产生雄性配子(或多个配子)来实现受精。成功的含有雄配子的被子植物花粉粒(配子体)被运送到柱头，在那里它萌发并且它的花粉管沿着花柱生长到子房。它的两个配子沿着管行进到包含雌性配子的配子体被保存在心皮内的地方。一个细胞核与极体融合产生胚乳组织，另一个细胞核与胚珠融合产生胚胎。
本文所用术语“单性生殖”是指胚胎的生长和发育不经过受精而发生的无性繁殖形式。本发明的基因和蛋白质可以，优选与双孢子因子，例如基因或化学因子结合，产生无配子生殖后代。
本文中使用的术语“单性生殖表型”是指植物和/或其后代在不受精的情况下从卵细胞生长和发育胚胎的能力。
本文中使用的术语“聚合(pyramiding)或叠加(stacking)基因”是指将来自不同亲本系的相关或不相关基因组合成一株植物的过程，这些基因是所需或有利性状(如抗病性状、颜色、抗旱性、抗虫害性等)的基础。可以使用传统育种方法来进行基因的聚合或叠加，或者可以通过使用分子标记来识别和保留包含所需等位基因组合的植物并丢弃那些不具有所需等位基因组合的植物来加速。在本发明的一个实施方案中，本文教导的单性生殖基因可以有利地用于基因聚合或叠加程序以产生无配子生殖植物或在有性作物中引入无配子生殖。
在本文献及其权利要求书中，动词“包含”及其变化以其非限制性意义使用，表示包括该词之后的条目，但不排除未具体提及的条目。此外，用不定冠词“a”或“an”提及元素并不排除该元素存在一个以上的可能性，除非上下文明确要求存在一个且只有一个元素。因此，不定冠词“a”或“an”通常表示“至少一个”。还应理解，当本文提及“序列”时，通常指的是具有特定亚单位序列(例如氨基酸)的实际物理分子。
如本文所用，术语“植物”包括植物细胞、植物组织或器官、植物原生质体、可从中再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物细胞团和在植物或植物部分如胚胎、花粉、胚珠、果实、花、叶(例如收获的莴苣作物)、种子、根、根尖等中完整的植物细胞。
具体实施方式
本发明提供了一种产生突变基因的方法，其中所述突变基因在单性生殖中是功能性的。优选地，该方法包括突变本文中表示为par等位基因的单性生殖基因的有性变体的启动子序列以增加编码的PAR蛋白的表达的步骤。由此产生的突变基因可以被认为是Par等位基因，因为它能够诱导植物的单性生殖表型。在par等位基因是缺乏显性Par等位基因的植物或植物细胞的内源等位基因的情况下，本发明的方法通过修饰所述par等位基因的启动子，产生未显示单性生殖的植物或植物细胞转化为显示单性生殖的植物或植物细胞。本发明提供了一种通过修饰par等位基因的启动子序列将有性par等位基因转化为单性生殖Par等位基因的方法。本发明提供了一种产生在单性生殖中有功能的突变基因的方法，包括以下步骤：
(a)提供包含与启动子可操作地连接的编码PAR蛋白的序列的基因；和
(b)通过修饰编码PAR蛋白的序列上游的序列来修饰启动子，以增加编码的PAR蛋白的表达，优选在成熟雌配子体中。
更具体地，本发明提供了一种产生在单性生殖中有功能的突变基因的方法，包括以下步骤：
(a)提供包含可操作地连接到包含一个或多个转录因子MYB结合位点的启动子的编码PAR蛋白的序列的基因；和
(b)通过修饰一个或多个转录因子MYB结合位点上游的序列来修饰启动子，以增加编码的PAR蛋白的表达，优选在成熟雌配子体中。
编码PAR蛋白的序列上游的序列，优选一个或多个转录因子MYB结合位点上游的序列，可以通过引入增强PAR蛋白表达的增强子序列和/或通过去除抑制PAR蛋白表达的阻遏子序列来修饰。优选地，插入增强子序列，优选雌配子体特异性增强子序列。所述插入物可以是本文定义的MITE序列。替代地或另外，编码PAR蛋白的序列上游的启动子序列，优选一个或多个MYB结合位点上游的启动子序列，通过导致一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失的(随机)诱变而改变，以引入一个或多个增强子序列和/或增加编码的PAR蛋白的表达。
另外或替代地，本发明提供了一种产生在单性生殖中有功能的突变基因的方法，包括以下步骤：
(a)提供包含可操作地连接到包含一个或多个转录因子MYB结合位点的启动子的编码PAR蛋白的序列的基因；和
(b)通过修饰所述一个或多个转录因子MYB结合位点中的至少一个来修饰所述启动子，以增加所述编码的PAR蛋白的表达。
优选地，当存在于植物中时，与未修饰的对应物即如本文所定义的从其获得本发明启动子的(内源或天然)启动子相比，本发明突变基因的经修饰的启动子导致由可操作地连接到所述启动子的编码序列编码的PAR蛋白的表达增加。优选地，所述增加的表达至少在包含本发明的修饰的启动子和/或突变基因的植物的卵细胞中。优选地，与原始非突变基因(即本发明方法的步骤(a)的基因)相比，表达的增加是增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在一个实施方案中，编码步骤a)中PAR蛋白的基因不是来源于拟南芥的基因。在一个实施方案中，本发明的突变基因不包含来源于在一个或多个MYB结合位点中具有突变的拟南芥DAZ3的突变启动子。
步骤(a)中提供的基因是单性生殖基因，优选该基因的有性变体，即par等位基因。由于所得到的突变基因在单性生殖中有功能，本发明的方法也可以被认为是将单性生殖基因的有性等位基因(par等位基因)转化为在单性生殖中有功能的等位基因(Par等位基因)的方法。
转录因子MYB结合位点(在本文中也表示为“MYB结合位点”)是由转录因子MYB识别和结合的启动子内的序列。MYB蛋白是DNA结合蛋白家族，包含不同数量的MYB结构域重复，赋予它们在MYB结合位点结合DNA的能力，从而调节转录。
发明人在par等位基因起始密码子上游约50-150bp的区域中鉴定了一个或多个MYB结合位点。MYB结合位点本文定义为优选7个核苷酸的序列，其优选具有NACCNNN、优选AACCNNN、更优选AACCGNN、甚至更优选AACCG[C/T]N、甚至更优选AACCG[C/T]C的核苷酸序列，并且可以是AACCGCC、AACCGTC或[T/A]AACCGCC(Borg et al.,2011)。优选一个或多个MYB结合位点位于编码PAR蛋白的序列的起始密码子上游约60-140bp、70-130bp、80-120bp或90-110bp之间，优选在起始密码子上游至多约200、190、180、170、160或150、140、130、120或110个核苷酸，甚至更优选一个或多个、优选两个MYB结合位点的3’末端位于编码PAR蛋白的序列的起始密码子上游85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110个核苷酸。在一些情况下，两个MYB结合位点位于所述区域。例如，在莴苣(Lactuca sativa)中，第一个MYB结合位点位于ATG起始密码子上游117-110个核苷酸的位置以及第二个MYB结合位点位于ATG起始密码子上游104-98个核苷酸的位置。
MYB结合位点优选作为转录因子MYB的结合位点，其中MYB转录因子是R2R3转录因子或R2R3-MYB转录因子，其中所述转录因子MYB可以是DUO1(UniProtKB登录号A0A178VEK7)，或是DUO1的变体、同源物或直系同源物。所述转录因子优选与SEQ ID NO：62具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相同性。
另外或可替代地，本发明也可以被认为是产生能够诱导植物单性生殖表型的突变基因的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码PAR蛋白的序列的基因，其中所述序列可操作地连接到启动子，其中所述启动子任选地包含一个或多个转录因子MYB结合位点；和
(b)修饰所述启动子以增加编码的PAR蛋白的表达，优选通过以下至少一种：
i)在编码如本文所定义的PAR蛋白的序列的起始密码子的上游，甚至更优选在如本文所定义的一个或多个MYB结合位点的上游或直接上游的启动子序列中引入插入物，以优选通过引入增强子序列或去除阻遏子序列来增加编码的PAR蛋白的表达；
ii)在编码如本文所定义的PAR蛋白的序列的起始密码子上游的启动子序列中引入取代和/或缺失，甚至更优选在如本文所定义的一个或多个MYB结合位点的上游或直接上游，其中所述取代和/或缺失优选通过引入增强子序列或去除阻遏子序列来增加所编码的PAR蛋白的表达；和
(iii)(i)和(ii)的组合。
在本发明的方法中修饰启动子可以使用本领域已知的任何常规方法进行，例如但不限于，优选通过随机或靶向诱变，任选地通过同源重组，在本文定义的一个或多个MYB结合位点的直接上游的启动子中引入插入或缺失。
任选地，启动子中的插入、取代或缺失可以修饰或去除本文定义的一个或多个MYB结合位点。
因此，本发明也可以被认为是产生能够诱导植物单性生殖表型的突变基因的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码PAR蛋白的序列的基因，其中所述序列可操作地连接到包含一个或多个转录因子MYB结合位点的启动子；和
(b)通过修饰所述一个或多个转录因子MYB结合位点上游的序列来修饰所述启动子，以如本文所定义通过在所述启动子的所述一个或多个MYB结合位点的直接上游在所述启动子中引入插入或缺失来增加所编码的PAR蛋白的表达。
另外，或替代地，本发明的方法可以包括通过诱导、修饰或去除本文定义的一个或多个MYB结合位点来修饰所述启动子。
在启动子包含一个或多个、优选两个如本文所定义的MYB结合位点的情况下，任选地修饰或去除这些一个或多个、优选两个MYB结合位点以减少转录因子MYB的结合和/或在这些一个或多个MYB结合位点的上游引入插入或缺失。本发明方法中MYB结合位点的修饰可以是1、2、3、4、5、6或7个核苷酸的修饰，优选1、2或3个核苷酸、甚至更优选1个核苷酸的修饰，使得该序列不再是MYB结合位点。优选地，所述修饰是位于如上所述的7个核苷酸长的MYB结合基序的第一、第二、第三、第四或第五位置的至少一个突变(核苷酸交换、插入或缺失)，即基序AACCGNN的A、A、C、C和G中的至少一个的修饰。优选地，所述修饰是如上所述位于7个核苷酸长的MYB结合基序的第一、第二、第三或第四位置的至少一个突变(核苷酸交换、插入或缺失)，即基序AACCGNN的A、A、C和C中的至少一个的修饰，任选地，这些位置上的两个、三个或全部四个核苷酸的修饰。
优选地，所述修饰导致转录因子MYB与MYB结合位点的结合减少或消除。优选地，当在合适的实验条件下测试时，例如如上文Kelemen等人所述，结合亲和力降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。任选地，MYB结合位点的修饰可以是所述MYB结合位点的缺失。所述修饰可以通过随机诱变(例如通过化学或辐射诱变)或靶向诱变(例如CRISPR-核酸内切酶介导的诱变)来进行。任选地，基因中存在的多个(两个、三个或更多)MYB结合位点如本发明方法中定义的被修饰。任选地，所述突变基因包含莴苣的修饰的启动子，其中所述启动子包含SEQ ID NO：17的序列或由SEQ ID NO：17的序列组成。任选地，所述突变基因包含可操作地连接到编码莴苣PAR蛋白的序列的所述启动子，优选地，所述编码序列包含SEQ ID NO：33的序列或由SEQ ID NO：33的序列组成。任选地，所述突变基因包含SEQ ID NO：35的序列或由SEQ ID NO：35的序列组成。本发明还包括包含所述突变基因和/或构建体的植物或植物细胞，优选莴苣植物或植物细胞。
在一个实施方案中，有性基因、优选par基因的启动子可以通过在一个或多个MYB结合位点的上游引入插入物来修饰。插入物可以在一个或多个MYB结合位点附近或直接邻近处引入。插入物和MYB结合位点(或者在多个MYB结合位点的情况下，位于编码序列最上游的MYB结合位点)之间的距离优选为最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个核苷酸。优选地，插入物直接引入一个或多个MYB结合位点的上游。在本发明的方法中，可以引入基因启动子中的插入物优选包括核酸插入物，优选双链DNA插入物，其中所述插入物的长度为50至2000bp、100至1900bp、200至1800bp、300至1700bp、400至1600bp、500至1500bp、600至1400bp、1000至1400bp、1200至1400bp或1300至1400bp。甚至更优选地，所述插入物具有大约1300bp的长度。替代地或另外地，插入物在约1-50bp之间、约5-30bp之间或约10-20bp之间。优选地，将所述插入物引入本文定义的MYB结合位点上游(5’)的启动子中，优选地使得MYB结合位点和插入物(优选插入物的3’-末端)之间的距离在0-200bp之间，优选最多0、10、20、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200bp。优选地，所述插入物定位成使得插入物的3’末端核苷酸位于与SEQ ID NO：2的核苷酸1798和/或SEQ ID NO：5的核苷酸1798的位置同源的位置。优选地，所述插入物没有开放阅读框。
所述插入物可以是非自主可转座元件，优选hAT衍生的非自主转座子元件。插入物可以包含增强子元件，优选雌配子体特异性增强子元件。甚至更优选地，所述插入物是微型反向重复转座元件(MITE)或MITE样序列，其中所述MITE或MITE样序列是非自主元件，优选非自主可转座元件，其特征在于包含没有开放阅读框的内部序列，其侧翼是末端反向重复(TIR)，其侧翼是小的直接重复(靶位点重复，TSD)。TIR可以具有序列CAGGGCCGG和/或CCGGCCCTG。TSD可能具有ACTGCTAC序列。关于MITE、TIR和序列的进一步描述，参考Guo etal,Scientific Reports.2017Jun 1；7(1):2634，其通过引用并入本文。所述插入物，优选所述MITE或MITE样序列，可与SEQ ID NO：60具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更多的相同性。插入物可以通过重组和/或靶向基因组编辑合成引入。
任选地，所述突变基因包含修饰的莴苣的启动子，其中所述启动子包含SEQ IDNO：18的序列或由SEQ ID NO：18的序列组成。任选地，所述突变基因包含可操作地连接到编码莴苣PAR蛋白的序列的所述启动子，优选地，所述编码序列包含SEQ ID NO：33的序列或由SEQ ID NO：33的序列组成。任选地，所述突变基因包含SEQ ID NO：36的序列或由SEQ IDNO：36的序列组成。任选地，所述突变基因包含莴苣的修饰的启动子，其中所述启动子包含SEQ ID NO：18的序列或由SEQ ID NO：18的序列组成并且所述启动子可操作地连接到编码药蒲公英PAR蛋白的序列，优选所述编码序列包含SEQ ID NO：3的序列或由SEQ ID NO：3的序列组成。任选地，所述突变基因包含SEQ ID NO：64的序列或由SEQ ID NO：64的序列组成。本发明还包括包含所述突变基因和/或构建体的植物或植物细胞，优选莴苣植物或植物细胞。
任选地，所述突变基因包含药蒲公英的Par启动子，其中所述启动子包含SEQ IDNO：2的序列或由SEQ ID NO：2的序列组成。任选地，所述突变基因包含可操作地连接到编码PAR蛋白的序列的所述启动子，其中所述PAR蛋白不是(天然)蒲公英PAR蛋白。任选地，所述突变基因包含与编码如上文所定义的直系同源PAR蛋白的序列可操作地连接的所述启动子。任选地，所述突变基因包含蒲公英的Par启动子，其中所述启动子包含SEQ ID NO：2的序列或由SEQ ID NO：2的序列组成，并且其中所述启动子可操作地连接到编码莴苣PAR蛋白的序列，优选所述编码序列包含SEQ ID NO：33的序列或由SEQ ID NO：33的序列组成。任选地，所述突变基因包含SEQ ID NO：65的序列或由SEQ ID NO：65的序列组成。
在另一个实施方案中，有性基因优选par基因的启动子可以通过在一个或多个MYB结合位点的上游引入缺失来修饰。所述缺失可以在一个或多个MYB结合位点附近或直接旁边引入。缺失和MYB结合位点(或者在多个MYB结合位点的情况下，位于编码序列最上游的MYB结合位点)之间的距离优选为最多200、150、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。优选地，将缺失直接引入一个或多个MYB结合位点的上游。在本发明的方法中可以引入基因启动子的缺失优选包括核酸缺失，优选双链DNA缺失，其中所述缺失的长度为10至1000bp、50至900bp、100至800bp、200至700bp、350至600bp、优选约400bp。优选地，所述缺失没有开放阅读框。缺失可以通过重组和/或靶向或随机基因组编辑来引入。任选地，所述突变基因包含莴苣的修饰的启动子，其中所述启动子包含SEQ ID NO：20的序列或由SEQ IDNO：20的序列组成。任选地，所述突变基因包含可操作地连接到编码莴苣PAR蛋白的序列的所述启动子，优选地，所述编码序列包含SEQ ID NO：33的序列或由SEQ ID NO：33的序列组成。任选地，所述突变基因包含SEQ ID NO：61的序列或由SEQ ID NO：61的序列组成。本发明还包括包含所述突变基因和/或构建体的植物或植物细胞，优选莴苣植物或植物细胞。
优选地，本发明方法的步骤a)的基因和可通过本发明方法获得的突变基因是核酸分子、优选DNA分子、甚至更优选基因组DNA分子，或者是其一部分。任选地，所述基因组DNA分子在植物细胞中，优选植物原生质体中。与对照植物相比，通过本发明方法修饰有性基因的启动子并且当位于植物细胞中时，可以导致来源于所述植物细胞的植物的单性生殖表型显著增加，其中优选地，所述对照植物不显示单性生殖表型，而包含本发明突变基因的植物显示单性生殖表型。所述对照植物优选仅与来源于所述植物细胞的植物的不同之处在于par等位基因的启动子没有如本文所定义的那样被修饰。优选地，所述对照植物或对照植物细胞分别与本发明的植物细胞或植物的不同之处仅在于所述对照植物或者对照植物细胞不包含本文定义的遗传修饰。
优选地，步骤(a)的基因是par等位基因并且如本文所定义的par等位基因的启动子的修饰并且当位于不能单性生殖的植物细胞中时，导致显示单性生殖表型的植物。由于可通过本发明的方法获得的突变基因在单性生殖中具有功能，因此所述突变基因可被认为是Par等位基因，并且本发明的方法也可被认为是将par等位基因转化为Par等位基因的方法。
任选地，通过本发明方法对启动子的修饰影响转录因子MYB与启动子的结合，导致由包含所述启动子的基因编码的PAR蛋白的表达增加。任选地，所述修饰导致转录因子MYB的结合减少或消除。转录因子MYB与启动子的结合可以通过本领域技术人员已知的任何合适的测定来评估，例如但不限于体内酵母单杂交系统(例如参见Kelemen et al.,PLoSOne.2015；10(10):e0141044)。
随机诱变可以是但不限于化学诱变、γ辐射、X射线或快中子辐射。化学诱变的非限制性实例包括但不限于EMS(甲磺酸乙酯)、MMS(甲磺酸甲酯)、NaN3(叠氮化钠)D)、ENU(N-乙基-N-亚硝基脲)、AzaC(氮胞苷)和NQO(4-硝基喹啉1-氧化物)。任选地，诱变系统如TILLING(Targeting Induced Local Lesions IN Genomics；McCallum et al.,2000,NatBiotech 18:455和McCallum et al.2000,Plant Physiol.123,439-442，两者通过引用并入本文)可用于产生具有本文定义的修饰的基因的植物系。TILLING使用传统化学诱变(例如EMS诱变)，然后对突变进行高通量筛选。因此，包含具有一种或多种所需突变的基因的植物、种子和组织可以使用TILLING获得。靶向诱变是可以设计成改变特定核苷酸或核酸序列的诱变。靶向诱变可以选自但不限于选自以下的技术：寡定向诱变、RNA引导的核酸内切酶(例如CRISPR技术)、TALENs或锌指技术及其组合。
任选地，本发明方法的步骤(a)的基因是天然序列。本发明方法的步骤(a)的基因优选包含或由可操作地连接到编码PAR蛋白的序列的启动子组成，其后任选地跟随3’UTR序列。步骤(a)中提供的基因可以是植物细胞的一部分，优选植物原生质体，其不包含单性生殖基因的单性生殖等位基因。优选地，所述植物细胞或原生质体是非单性生殖的，即，从所述细胞或原生质体再生的植物不显示单性生殖表型。换句话说，步骤(a)中提供的基因优选包含在植物细胞、优选植物原生质体中，其中如本文所定义的突变导致植物细胞的诱导或增加的单性生殖，即从所述突变细胞或原生质体再生的植物显示单性生殖表型。
在本发明方法的步骤(a)中提供的基因可以是天然基因，优选天然存在于植物细胞中。天然序列是在自然界中发现的序列，本文也表示为“野生型”或“天然”。因此，在该实施方案中，启动子、编码序列和任选的3’UTR来自单一植物物种。
替代地，在本发明方法的步骤(a)中提供的基因是非天然的和/或合成的基因，本文也称为嵌合基因。任选地，在所述嵌合基因中，启动子可操作地连接到编码PAR蛋白和/或3’UTR的编码序列，其中所述编码序列和/或3’UTR对于所述启动子是异源的。作为非限制性实例，启动子可以如编码序列和/或3’UTR是另一种植物物种的。任选地，启动子和3’UTR来自单一植物物种，编码序列来自另一植物物种。
优选地，本发明方法的步骤(a)中提供的基因存在于植物细胞或原生质体中。因此，本发明的方法可以包括在修饰基因启动子的步骤之前提供包含步骤(a)的基因的原生质体或植物细胞的步骤。优选地，该基因是存在于原生质体或植物细胞的基因组中的内源基因。优选地，所述原生质体或植物细胞分离自植物，优选非单性生殖植物。优选地，所述植物在其基因组中不具有Par等位基因。优选地，步骤(a)中提供的原生质体或植物细胞内的基因的启动子如本文所定义通过靶向或随机诱变、优选靶向诱变进行修饰。
在本发明方法的特定实施方案中，包含步骤(a)的基因的植物细胞可以位于植物种子中。优选地，所述种子在其基因组中不具有Par等位基因。优选地，在本发明的方法中通过靶向或随机诱变、优选随机诱变修饰所述种子内的基因的启动子。
在修饰基因的启动子的步骤之后，本发明的方法可以包括从所述原生质体再生植物的步骤或从所述种子生长植物的步骤。
此外，本发明的方法可以包括筛选和/或基因分型的步骤。基因分型可以通过在修饰步骤后对至少部分启动子进行测序(任选之前进行基因组DNA和/或包含感兴趣启动子的靶序列的PCR扩增)或通过本领域已知的任何基因组变异分析方法或分子标记分析例如但不限于基于序列的基因分型(SBG)或SNPSelect分析进行。也可以开发“事件特异性”PCR诊断方法，其中PCR引物基于在修饰侧翼的植物DNA，参见US6563026。类似地，可以开发事件特异性AFLP指纹或RFLP指纹，其鉴定转基因植物或源自其的任何植物、种子、组织或细胞。基因分型可以在修饰步骤之后直接进行，或者在从原生质体或种子生长出愈伤组织、组织或植物之后进行。
可以通过比较包含通过本发明方法获得的突变基因的植物(本文表示为测试植物)从未受精卵细胞生长和发育胚胎的能力，直接评估单性生殖功能的筛选。优选地，将这种能力与对照植物的这种能力进行比较，对照植物优选不同于测试植物仅在于它不包含通过本发明方法获得的突变基因。优选地，所述对照植物是不包含Par等位基因的植物。
可替代地或另外地，通过本发明方法获得的突变基因在单性生殖中的功能可以通过具有无配子生殖缺失的植物补充包含本发明突变基因的构建体的植物来评估。这种失去无配子生殖的植物可以是已经通过修饰功能性Par等位基因(例如通过缺失或敲除)而被修饰以丧失无配子生殖表型的药蒲公英分离物A68。这种丧失无配子生殖的植物可以是包含Par等位基因的蒲公英分离物A68，其中本文定义的SEQ ID NO：23(编码SEQ ID NO：32的PAR蛋白)已经被修饰为SEQ ID NO：24-27中的任何一个以分别编码SEQ ID NO：28-31的蛋白(见表1)。蒲公英分离物A68的这种无配子生殖植物的丧失可以通过使用CRISPR-Cas9/引导RNA复合物的靶向基因组编辑来获得，其中所述引导RNA(在本文中也表示为gRNA)包含SEQID NO：19的靶向特异性序列，如本文所示例的。蒲公英分离物A68的Par等位基因的缺失导致单性生殖的丧失，从而导致无配子生殖的丧失。通过本发明方法获得的突变基因具有诱导单性生殖的能力，并且在引入或转染包含所述突变基因的构建体或载体时，无配子生殖表型将被恢复(或挽救)。对于蒲公英分离物A68，在没有异花授粉的情况下，高结实率是无配子生殖的明确指示。这种分离物中的自交可以被排除作为替代解释，因为由于不平衡的三倍体雄性和雌性减数分裂，有性产生的卵细胞和花粉粒将具有非常低的生育力。优选地，在上述互补分析中，与原始非突变基因相反，本发明的突变基因能够恢复功能丧失植物中的无配子生殖。优选地，所述能力意味着在用突变基因转化的200株中至少有1株、100株中有1株、100株中有10株、100株中有20株、100株中有30株、100株中有40株、100株中有50株、100株中有60株、100株中有70株、100株中有80株、100株中有90株或所有功能丧失的植物中恢复无配子生殖，优选与用原始非突变基因(即本发明方法的步骤a)中提供的基因)转化的少于500株中有1株、600株中有1株、700株中有1株、800株中有1株、900株中有1株或1000株中有1株相比。
本发明还提供了通过本发明的方法获得或可通过本发明的方法获得的突变基因。优选地，所述突变基因不同于内源或天然基因(仅)在于它包括本文定义的启动子中的插入或缺失和/或一个或多个修饰或去除的MYB结合位点。优选地，包含本文定义的修饰的启动子的本发明突变基因能够诱导植物的单性生殖表型。换句话说，优选地，包含本发明的修饰的启动子的突变基因在单性生殖中是功能性的。
任选地，本发明方法的步骤(a)的基因和/或通过本发明方法获得的突变基因是分离的核酸分子或核酸构建体或(表达)载体，或者是其一部分。本发明还提供了包含所述突变基因的这种分离的核酸分子、构建体或(表达)载体，其中所述构建体或载体能够在用所述载体构建体转染所述植物时将突变基因转化到植物。所述核酸分子可以是但不限于DNA，并且可以是基因组DNA或可以衍生自基因组DNA。本发明还提供了本发明的突变基因和/或包含所述突变基因的分离的核酸、构建体或载体在用于增加或诱导原生质体、植物细胞或植物的单性生殖表型中的用途。
本发明的突变基因可以是本文定义的嵌合基因，其任选是遗传构建体或核酸载体的部分。本发明的突变基因任选地包含在分离的核酸、构建体或载体中。在本发明的一个实施方案中，包含或由本发明突变基因组成的核酸可用于制备包含该核酸的构建体和/或载体，用于将该核酸转移到宿主细胞中并在宿主细胞中产生由所述核酸编码的功能性(优选能够诱导单性生殖)蛋白质。
适合于在植物细胞中引入本发明突变基因的载体在本文被称为即“表达载体”。宿主细胞优选是植物细胞。用于任选瞬时但优选稳定地将突变基因序列引入宿主细胞基因组的突变基因、构建体和/或载体的构建在本领域中是公知的。
本发明还提供了包含通过本发明方法获得或可通过本发明方法获得的突变基因和/或包含所述核酸分子或载体的植物细胞、植物原生质体、植物组织、种子或植物。
本发明还提供了包含突变基因的植物细胞、植物原生质体、植物组织、种子或植物，包含本文定义的突变基因的核酸分子、构建体或载体。任选地，所述植物细胞、植物原生质体、植物组织、种子或植物能够进行不完全减数分裂，优选无配子生殖。
优选地，本发明的核酸是分离的核酸。在一个实施方案中，本发明的核酸可以来源于蒲公英系(例如广义的药蒲公英(Taraxacum officinale sensu lato))或来源于其他植物物种。在一个实施方案中，本发明的核酸来自不同于蒲公英属(Taraxacum)或广义的药蒲公英的来源。
任选地，包含通过本发明方法获得或可通过本发明方法获得的突变基因或由该突变基因组成的本发明的核酸或核酸构建体可以稳定地插入单个植物细胞的核基因组中，并且如此转化的植物细胞可以用于产生具有改变的表型即单性生殖表型的转化植物。在非限制性实例中，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中包含本文教导的突变基因的T-DNA载体可用于转化植物细胞，此后，可使用例如EP0116718、EP0270822、PCT公开WO84/02913和公开的欧洲专利申请EP0242246以及Gould et al.(1991)所述的方法从转化的植物细胞再生转化的植物。用于农杆菌介导的植物转化的T-DNA载体的构建在本领域中是公知的。T-DNA载体可以是如EP0120561和EP0120515所述的二元载体或如EP0116718所述的可通过同源重组整合到农杆菌Ti质粒中的共整合载体。例如，Michelmore et al.(1987)和Chupeau et al.(1989)已经描述了莴苣转化方案。
Gielen et al.(1984)描述了边界序列。当然，其它类型的载体可用于转化植物细胞，使用诸如直接基因转移(如EP0223247所述)、花粉介导的转化(如EP0270356和WO85/01856所述)、原生质体转化(如US4,684,611所述)、植物RNA病毒介导的转化(如EP0067553和US4,407,956所述)、脂质体介导的转化(如US4,536,475所述)和其它方法。
在另一个实施方案中，本发明的突变基因可以通过体细胞杂交引入。体细胞杂交可以通过原生质体融合来完成(例如参见Holmes,2018)。
本发明的突变基因也可以整合到基因组中，例如通过使用一种或多种特异性核酸内切酶(如CRISPR-核酸内切酶/引导RNA复合物)在基因组中的适当位点引入双链断裂以及使用包含本发明突变基因的供体构建体整合到基因组中。本领域技术人员知道如何设计这种CRISPR-核酸内切酶/引导RNA复合物，以用于引入适合整合的双链断裂和供体构建体(综述参见Bortesi and Fischer,2015)。
同样，从转化细胞中选择和再生转化植物在本领域中是众所周知的。显然，对于不同的物种，甚至对于单个物种的不同变种或栽培品种，方案特别适用于高频再生转化体。本发明还包括显示单性生殖并包含本发明突变基因的转化植物的后代。
除了核基因组的转化，质体基因组、优选叶绿体基因组的转化也包括在本发明中。质体基因组转化的一个优点是可以降低转基因传播的风险。质体基因组转化可以如本领域已知的进行，参见例如Sidorov et al.(1999)或Lutz et al.(2004)。
所得到的转化植物可用于常规植物育种方案以产生更多含有所述突变基因的转化植物。可以使用例如Southern印迹分析或基于PCR的方法或技术分析(ThirdWave Technologies,Inc.)来选择单拷贝转化体。通过本发明突变基因的存在，转化的细胞和植物可以容易地与非转化的细胞和植物区分，其特征在于包含本文定义的修饰的启动子。突变基因插入位点侧翼的植物DNA序列也可以被测序，由此可以开发“事件特异性”检测方法，以用于常规使用。参见例如WO0141558，其描述了例如基于整合序列和侧翼(基因组)序列的优良事件检测试剂盒(例如PCR检测试剂盒)。
在一个实施方案中，本发明包含来源于par等位基因的突变基因，该等位基因来源于本质上是非单性生殖(和非无配子生殖)的植物，并通过本发明的方法修饰。这种植物可以是野生或栽培植物。所述突变基因优选通过本发明方法修饰启动子获得，其特征在于它包括启动子中的插入或缺失和/或本文定义的启动子中的一个或多个修饰或去除的MYB结合位点。
在一个实施方案中，本发明的突变基因或包含所述突变基因的核酸、载体或构建体具有(遗传上的)显性功能，优选通过(过)表达具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的功能蛋白或其变体或功能片段如在另一种植物(即除了蒲公英属或广义的药蒲公英以外)中发现的直系同源物或其片段来提供。
优选地，本发明的突变基因或包含所述突变基因的核酸、载体或构建体编码蛋白质或其功能片段，当在植物中产生时，其是功能性的并诱导和/或增强单性生殖。
优选地，所述修饰的启动子、突变基因、核酸、载体和/或构建体不天然地存在，即在自然中不存在。
本发明方法的步骤(a)中提供的基因可以是存在于植物细胞或原生质体基因组中的内源基因。优选地，所述植物细胞或原生质体是不具有单性生殖表型的植物(此处表示为起源植物)的部分或从其分离。包含通过本发明方法获得的突变基因的植物细胞或原生质体可以是具有单性生殖表型或与原始植物相比显示单性生殖表型显著增加的植物的部分或再生成该植物。因此，本发明还提供了为植物转化单性生殖表型的方法或为植物增加单性生殖表型的方法。换句话说，本发明的方法提供了产生单性生殖植物的方法。
因此，本发明提供了一种产生单性生殖植物的方法，包括以下步骤：
(A)从植物细胞或原生质体再生和/或生长植物组织或植物，所述植物细胞或原生质体包含可通过产生本文定义的突变基因的方法获得的突变基因；和
(B)任选地，对步骤(A)中获得的植物组织或植物进行筛选和/或基因分型。
因此，本发明还提供了一种产生单性生殖植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)提供一个或多个植物、植物原生质体、植物细胞、植物组织或植物种子，其包含与启动子可操作地连接的编码PAR蛋白的基因，其中所述启动子优选包含一个或多个转录因子MYB结合位点；
b)通过修饰所述一个或多个转录因子MYB结合位点中的至少一个和/或所述一个或多个转录因子MYB结合位点上游的序列来修饰所述启动子，以增加所编码的PAR蛋白的表达；
c)任选地，从步骤b)中获得的修饰的植物原生质体、植物细胞、植物组织或种子生长一个或多个植物；和
d)任选地，对步骤b)中获得的植物原生质体、植物细胞、植物组织或种子或步骤b)或c)中获得的植物进行筛选和/或基因分型。
替代地或另外地，本发明提供了一种产生单性生殖植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)提供一个或多个植物、植物原生质体、植物细胞、植物组织或植物种子，其包含编码PAR蛋白的基因，其可操作地连接到任选地包含一或多个转录因子MYB结合位点的启动子；
(b)修饰所述启动子以增加编码的PAR蛋白的表达，优选通过以下至少一种：
i)在编码如本文所定义的PAR蛋白的序列的起始密码子上游、优选在一个或多个转录因子MYB结合位点的上游或直接上游的启动子序列中引入插入，其中所述插入优选引入增强子序列或去除阻遏子序列；
ii)在编码如本文所定义的PAR蛋白的序列的起始密码子上游、优选在一个或多个转录因子MYB结合位点的上游或直接上游的启动子序列中引入取代和/或缺失，其中所述取代和/或缺失优选引入增强子序列或去除阻遏子序列；和
(iii)(i)和(ii)的组合。
c)任选地，从步骤b)中获得的修饰的植物原生质体、植物细胞、植物组织或种子生长一个或多个植物；和
d)任选地，对步骤b)中获得的植物原生质体、植物细胞、植物组织或种子或步骤b)或c)中获得的植物进行筛选和/或基因分型。
通过本发明的方法生产的单性生殖植物可以是具有正常减数分裂功能的植物，即不显示不完全减数分裂，优选不是双孢子的和/或不显示倍数孢子形成的植物。优选地，所述植物的配子体与其体细胞相比可以具有降低的倍性。在二倍体植物(即具有二倍体体细胞)的情况下，所述降低的倍性可以是单元单倍体。通过本发明的方法诱导植物单性生殖后，所述植物的配子体可在倍性降低的植物中发育，优选单倍体植物。因此，本发明的方法可以是产生倍性降低的植物的方法，优选产生单倍体植物的方法。该方法优选包括提供可通过上述方法获得的单性生殖植物的步骤，以及允许所述植物在不受精的情况下产生种子的后续步骤，允许所述种子中的一个或多个萌发并再生为倍性降低的植物，优选单倍体植物。所述方法可包括诱导本文定义的单性生殖的步骤，随后允许所述植物在不受精的情况下产生种子，并允许一或多个所述种子萌发并再生为倍性降低的植物，优选为单倍体植物(具有单倍体体细胞的植物)。
具有降低倍性的基因组，优选单倍体基因组，可以自发或诱导加倍，优选通过化学处理。优选的化学处理例如在Touchell DH et al,Front Plant Sci.2020Jun 3；11:722中描述，其通过引用并入本文。化学处理可以是用秋水仙碱、氨磺乐灵(oryzalin)、氟乐灵(trifluralin)和一氧化二氮中的至少一种进行的处理。植物的化学处理优选产生具有二单倍体基因组的植物。
加倍的单元单倍体植物是在所有基因座都实现纯合性的植物并且可以通过单元单倍体基因组的全基因组复制获得，优选使用本文所述的方法。这种完全纯合的植物对于用作F1杂交种种子生产中的亲本植物具有重要的商业价值。因此，本发明还提供了一种产生加倍的单元单倍体植物的方法，该方法包括产生本文定义的单性生殖植物的步骤，任选地包括化学诱导基因组复制、选择加倍的单元单倍体种子和任选地允许所述种子萌发并再生为加倍的单倍体植物的步骤。
本发明的方法不限于生产加倍的单元单倍体植物。本文所述的方法同样适用于生产其它加倍的单倍体植物，例如但不限于加倍的二单倍体、加倍的三单倍体、加倍的四单倍体、加倍的五单倍体和加倍的六单倍体植物。
作为非限制性实例，在多倍体作物(例如四倍体马铃薯)中，本发明的方法可用于产生二单倍体后代。这些二单倍体的杂合度将远低于多倍体亲本。因此，二单倍体水平的选择将比四倍体水平的选择有效得多。本发明的方法可进一步用于从这些完全纯合的二单倍体产生单元单倍体。二单倍体可以促进遗传图谱的构建并能够组装分阶段的全基因组序列。野生二倍体物种感兴趣的有价值性状可以通过使用来自由本发明方法产生的栽培品种的二单倍体进行渗入。所获得的具有有价值的渗入性状的二单倍体可以例如使用如上文所述的化学处理制成加倍的二单倍体，从而允许感兴趣的性状渗入到四倍体栽培品种中。本领域技术人员容易理解，类似的方法可用于生产具有渗入的野生种感兴趣性状的二倍体、三倍体、五倍体、六倍体、七倍体、七倍体等栽培品种。
优选地，在步骤a)中编码PAR蛋白的基因是par等位基因。优选地，基因的启动子在步骤b)中如本文所定义的被修饰，从而将par等位基因转化为Par等位基因。由于Par等位基因可能是显性的，将单个par等位基因改变为植物或植物细胞的Par等位基因，或者例如通过用包含本发明的突变基因的载体转染所述植物或植物细胞而在植物或植物细胞中引入所述突变基因，可以足以将植物从有性表型转化为单性生殖表型，即产生能够在不受精的情况下从卵细胞生长和发育胚胎的植物和/或其后代。因此，优选地，存在于植物细胞中的单个有性基因，优选地，内源基因，通过本发明的方法被修饰。任选地，通过本发明的方法修饰植物细胞中存在的多个基因，优选内源基因。
在修饰的启动子存在于植物细胞或原生质体中的情况中，所述植物细胞或原生质体可以是植物的一部分或再生为植物，从而从具有非单性生殖表型转化为具有单性生殖表型的植物。因此，本发明还提供了一种通过修饰par等位基因的启动子将单性生殖表型赋予未显示单性生殖表型的植物的方法。换句话说，本发明的方法是将不显示单性生殖的植物转化为显示单性生殖的植物的方法。优选地，步骤a)的一个或多个植物、植物原生质体、植物细胞、植物组织或植物种子缺乏Par等位基因和/或不显示单性生殖表型。类似地，本发明的方法是将显示有限单性生殖的植物转化为具有增加的单性生殖的植物的方法。单性生殖的增加或诱导优选地意味着200个中至少1个、100个中至少1个、100个中至少10个、100个中至少20个、100个中至少30个、100个中至少40个、100个中至少50个、100个中至少60个、100个中至少70个、100个中至少80个、100个中至少90个或所有用本发明突变基因转化的植物显示单性生殖，优选地与用原始非突变基因(即本发明方法的步骤a中提供的基因)转化的植物中少于500个中的1个、600个中的1个、700个中的1个、800个中的1株、900个中的1个或1000个中的1个相比。
优选地，本发明方法的步骤a)的基因是天然基因。任选地，通过本发明方法修饰的基因是药蒲公英的par等位基因或本文定义的任何一种直系同源单性生殖基因。优选地，所述par等位基因存在于缺乏Par等位基因及因此不具有单性生殖表型的植物、植物、植物原生质体、植物细胞、植物组织或植物种子中。通过将所述par等位基因赋予Par等位基因，本发明的方法优选导致不具有单性生殖表型的植物转化为具有单性生殖表型的植物。
任选地，在步骤a)中提供多种植物、植物原生质体、植物细胞、植物组织或植物种子，以及在步骤b)之后，选择一种或多种植物、植物原生质体、植物细胞、植物组织或植物种子，其包含本发明的修饰，即插入或缺失和/或修饰或去除的一个或多个MYB结合位点，优选通过本文定义的基因分型和/或筛选来确定。因此，步骤b)中的筛选可以是筛选单性生殖表型。
除了遗传修饰植物细胞(可以是植物组织、植物种子或整株植物的一部分)或植物原生质体中天然存在的par等位基因以将所述par等位基因赋予Par等位基因，以及将所述细胞或原生质体生长和/或发育成单性生殖植物之外，还可以通过用包含本发明突变基因的核酸、构建体或载体转化植物或植物细胞来获得单性生殖植物，即所述突变基因包含可操作地连接到编码如本文所定义的PAR蛋白的编码序列的修饰的启动子，任选地连接到3’UTR序列。
通过本发明方法获得的突变基因可以通过转化、渗入、体细胞杂交和/或原生质体融合引入一个或多个植物细胞。这种突变基因可以位于外源核酸上，即自然界中不存在于所述植物细胞中的核酸。
因此，本发明还提供了一种产生单性生殖植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.提供一个或多个植物、植物原生质体、植物细胞、植物组织或植物种子；
b.用包含本发明突变基因的核酸构建体转化所述一个或多个植物、植物原生质体、植物细胞、植物组织或植物种子；
c.任选地，从步骤b)中转化的植物原生质体、植物细胞、植物组织或种子生长一个或多个植物；和
d.任选地，对步骤b)中获得的植物原生质体、植物细胞、植物组织或种子或步骤b)或c)中获得的植物进行筛选和/或基因分型。
优选地，步骤a的一个或多个植物缺乏Par等位基因和/或不显示单性生殖表型。
在另一方面，本发明涉及通过以上定义的任何方法获得的植物(包括例如植物细胞、器官、种子和植物部分)。优选地，这些是单性生殖植物，或者与天然或未修饰的植物相比，显示出增加的单性生殖。优选地，本发明的植物通过技术手段获得，优选通过本文所述的方法获得。这种技术手段是本领域技术人员公知的，包括遗传修饰，例如随机诱变、靶向诱变和核酸插入或缺失中的至少一种。
优选地，本发明的植物不是通过基本上生物学方法获得的。优选地，本发明的植物不是仅通过基本上生物学方法获得的。优选地，本发明的植物不是通过在植物中引入单性生殖的任何基本上生物学方法获得的，优选地不是直接获得的。优选地，本发明的植物不是仅通过在植物中引入单性生殖的任何基本上生物学方法获得的。优选地，本发明的植物不是天然地存在的植物，即在自然中不存在的植物。
在一个实施方案中，本发明方法的基因的启动子是上游转录调控区，例如在基因的翻译起始密码子和/或转录起始位点上游约2000bp内并且可以使用已知方法例如TAIL-PCR(Liu et al.,1995；Liu et al.,2005)、接头-PCR或反向PCR(IPCR)从无配子生殖植物和/或其他植物中分离。本文定义的嵌合基因可以通过将启动子连接到本文教导的编码序列来产生，该编码序列优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其功能变体和/或片段，其任选地随后连接到合适的3’末端非翻译区(“3’末端”或3’UTR)的上游(即5’)。合适的3’末端包括CaMV 35S基因(“3’35S”)、胭脂碱合酶基因(“3’nos”)(Depicker et al.,1982)、章鱼碱合酶基因(“3’ocs”)(Gielen et al.,1984)和T-DNA基因7(“3’基因7”)(Velten andSchell,1985)的3’末端，其在转化的植物细胞中作为3’-未翻译DNA序列等等。在一个实施方案中，使用天然单性生殖基因的3’UTR，或衍生自其的3’UTR。例如，可以使用衍生自SEQID NO：4的任何3’UTR，或其变体或片段。3’UTR可以具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列。
将T-DNA载体引入农杆菌可以使用已知的方法进行，例如电穿孔或三亲本杂交。
本文教导的突变基因可以任选地作为框内连接到编码可选择或可量化标记的(US5,254,799；Vaeck et al.,1987)基因的杂交基因序列插入植物基因组中，例如编码卡那霉素抗性的neo(或nptII)基因(EP0242236)，使得包含该核酸的植物可易于检测。
任选地，可以改变本发明的突变基因以可能地(进一步地)修饰转录因子结合位点，优选地修饰抑制基因转录的转录因子的结合位点。
在一个实施方案中，由本文教导的本发明核酸编码的PAR蛋白与控制、优选增强或诱导单一宿主中的单性生殖、不完全减数分裂或无配子生殖的其它蛋白共表达，任选地在不同启动子的控制下。这种其他基因可以是用于赋予不完全减数分裂的基因，例如倍数孢子形成，如WO2017/039452A1中所述，其通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，本发明的突变基因渗入到优选包含其他感兴趣基因的种质中，例如用于赋予不完全减数分裂的基因(例如用于倍数孢子形成的基因)。通过杂交和选择，产生杂交种，其中可以叠加几个感兴趣的基因。
任选地，通过本发明的方法突变或转化的植物是能够进行不完全减数分裂的植物。优选地，能够进行不完全减数分裂的植物被修饰以包含在本文定义的单性生殖中是有功能的突变基因。这种突变或修饰将导致单性生殖植物或植物细胞。在这种情况下，本文定义的产生单性生殖植物的方法的步骤B)中的筛选可以是针对单性生殖表型的。能够进行不完全减数分裂的植物细胞可以通过引入能够赋予不完全减数分裂的核酸来获得。任选地，在引入本发明突变基因之前、一起或之后，将所述核酸引入植物细胞。
本发明还提供一种产生单性生殖杂交种子的方法，包括以下步骤：
(1)使有性繁殖的第一植物与第二植物的花粉杂交受精，以产生F1杂交种子；和
(2)任选地，从所述F1种子中选择包含单性生殖表型的种子；
其中所述第一和/或第二植物能够进行不完全减数分裂并且其中所述第二植物是通过本发明的方法获得或可获得的单性生殖植物，并且其中优选通过基因分型进行所述选择。任选地，所述方法还包括，优选通过基因分型，从所述F1中选择包含单性生殖表型的种子的步骤，并且任选地，从所述F1杂交种子生长至少一个F1植物。
优选地，为了选择目的，也为了杂草控制，本发明的转基因植物也用编码赋予除草剂抗性的蛋白质的DNA转化，例如广谱除草剂，例如基于草铵膦作为活性成分的除草剂(例如或BASTA；由PAT或bar基因赋予抗性；参见EP 0 242 236和EP 0 242246)或草甘膦(例如/>由EPSPS基因赋予抗性，参见例如EP0 508 909和EP 0 507 698)。使用除草剂抗性基因(或其他赋予所需表型的基因)作为选择性标记还具有可以避免引入抗生素抗性基因的优点。
替代地或另外地，可以使用其他选择性标记基因，例如抗生素抗性基因。由于通常不接受在转化的宿主植物中保留抗生素抗性基因，这些基因可以在选择转化体后再次去除。存在不同的去除转基因的技术。实现去除的一种方法是用lox位点在转基因的侧翼，并在选择之后，将转化的植物与表达CRE重组酶的植物杂交(参见例如EP506763B1)。位点特异性重组导致标记基因的切除。另一个位点特异性重组系统是EP686191和US5527695中描述的FLP/FRT系统。位点特异性重组系统如CRE/LOX和FLP/FRT也可用于基因叠加目的。此外，已经描述了单组分切除系统，参见例如WO9737012或WO9500555)。
优选地，本发明的突变基因用于产生转基因植物细胞、植物、植物种子等，及其任何衍生物/后代，其具有增强的单性生殖表型。优选地，与未修饰的对照植物相比，本发明的转基因植物包含增强的单性生殖。因此，提供了例如包含增强的单性生殖的转基因莴苣植物。因此，与不包含本发明突变基因的相同植物相比，包含所述突变基因的植物显示出单性生殖的显著增加。增强的单性生殖表型可以通过表达合适量的由能够在合适的时间和/或位置诱导单性生殖的本发明突变基因编码的蛋白质来微调。这种微调可以通过确定最合适的启动子修饰和/或通过选择显示所需表达水平的转基因“事件”来完成。
通过例如分析拷贝数(Southern印迹分析)、mRNA转录水平(例如使用能够扩增由本发明突变基因编码的蛋白质的引物对或侧翼引物的RT-PCR)或通过分析各种组织中单性生殖蛋白质的存在和水平(例如SDS-PAGE；ELISA测定等)来选择表达所需水平的由本发明突变基因编码的蛋白质的转化体、杂交种或近交系。例如出于调控原因，可以选择单拷贝转化体，并分析突变基因插入位点侧翼的序列，优选测序以表征“事件”。选择导致由本发明突变基因编码的蛋白质的高或中等表达的转基因事件用于进一步开发，直到获得具有稳定转基因的高性能优良事件。
包含本发明突变基因的转化体也可以包含(其他)转基因，例如赋予抗病性或赋予对其他生物和/或非生物胁迫的耐受性的基因，或赋予倍数孢子形成的基因。为获得这种具有“叠加”转基因的植物，可以将其他转基因引入所述转化体中，或者可以随后用一种或多种其他基因转化所述转化体，或者替代地可以使用几种嵌合基因来转化植物品系或品种。例如，若干转基因可以存在于单个载体上，或者可以存在于共转化的不同载体上。
在一个实施方案中，以下基因与本发明的突变基因组合：已知的抗病基因，特别是赋予对坏死性病原体增强抗性的基因、病毒抗性基因、昆虫抗性基因、非生物胁迫抗性基因(例如耐旱性、耐盐性、耐热或耐冷性等)、除草剂抗性基因等。因此，叠加的转化体可以具有甚至更广泛的生物和/或非生物胁迫耐受性，对病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性、盐度、冷胁迫、热胁迫、水胁迫等。
本文所述的任何植物的整株植物、植物部分(如种子、细胞、组织)和植物产品(如果实)和后代都包括在内，并且可以通过突变基因的存在来鉴定，例如通过使用总基因组DNA作为模板和使用对本发明突变基因特异的PCR引物对的PCR分析和/或通过使用基因组变异分析例如但不限于基于序列的基因分型(SBG)或SNPSelect分析。也可以开发“事件特异性”PCR诊断方法，其中PCR引物基于插入的修饰或转基因侧翼的植物DNA，参见US6563026。类似地，可以开发事件特异性AFLP指纹或RFLP指纹，其鉴定本发明的转基因或突变植物，或从其衍生的任何植物、种子、组织或细胞。
应当理解，根据本发明的转基因或突变植物优选不显示非期望的表型，例如产量降低、对疾病(尤其是对坏死因子)的增强易感性或不期望的结构变化(矮化、变形)等。并且，如果在初级转化体中看到这种表型，这些可以通过常规方法去除。本文所述的任何转基因或突变植物对于突变基因可以是杂合的、纯合的或半合的。
本发明还涉及通过本文详述的方法获得或可获得的植物、种子、植物部分(例如植物细胞)和植物产物，优选包含本发明的突变基因、本发明的核酸和/或本发明的构建体。优选地，所述突变基因、核酸和/或构建体能够诱导单性生殖和/或在单性生殖中是有功能的，如本文所详述。本发明的植物优选是本文列出的作为合适宿主植物的物种。这种获得本发明植物的方法包括但不限于随机或靶向诱变，将本发明突变基因从植物渗入后代，和/或通过本发明突变基因转化植物细胞，以及随后从所述植物细胞再生植物。
优选地，所述植物、植物部分和/或植物产品不是包含本发明突变基因的广义的药蒲公英物种。优选地，所述植物、植物部分和/或植物产品是双子叶植物。所述植物或植物细胞优选为本文所列作为合适宿主植物的物种，优选选自十字花科、葫芦科、豆科、禾本科、茄科和菊科。
优选地，包含本发明突变基因的植物、植物部分和/或植物产品通过遗传修饰或渗入获得，其中优选地，所述突变基因位于其基因组中。优选地，所述植物、植物部分和/或植物产品能够单性生殖和/或显示单性生殖。甚至更优选地，所述植物、植物部分和/或植物产品还能够进行不完全减数分裂。本发明提供本发明的植物或植物细胞的种子、植物部分或植物产品。
本发明还涉及源自本发明植物的植物部分和植物产品，其中植物部分和/或植物产品包含本文定义的本发明突变基因、本文定义的本发明核酸和/或本文定义的本发明构建体，其可以是本文定义的片段，其允许评估植物产品的植物部分来源的植物中这种蛋白质、突变基因、核酸或构建体的存在。这样的部分和/或产品可以是种子或果实和/或从其衍生的产品(例如糖或蛋白质)。这样的部分、产品和/或由此衍生的产品可以是非繁殖材料。
任何植物都可以是合适的宿主，但最优选的宿主植物物种应该是受益于增强的单性生殖的植物物种。合适的宿主包括任何植物物种。特别地，具有其他良好农艺特性的栽培品种或育种系是优选的。本领域技术人员知道如何通过产生转基因植物和评估单性生殖以及合适的对照植物来测试本文教导的突变基因和/或其变体或片段是否能赋予宿主植物所需的单性生殖的增加或减少。
合适的宿主植物包括例如属于十字花科、葫芦科、豆科、禾本科(Gramineae)、茄科、菊科、蔷薇科或禾本科(Poaceae)的宿主。
在优选的实施方案中，宿主植物可以是选自蒲公英属、莴苣属、豌豆属、辣椒属、茄属、黄瓜属、玉米属、棉属、大豆属、Tryticum、稻属和高粱属的植物物种。
在优选的实施方案中，本文教导的植物、植物部分、植物细胞或种子来自选自蒲公英属、莴苣属、豌豆属、辣椒属、茄属、黄瓜属、玉米属、棉属、大豆属、小麦属、稻属、葱属、芸苔属、向日葵属、菾属、菊苣属、菊花属、狼尾草属、黑麦属、大麦属、苜蓿属、菜豆属、蔷薇属、百合属、咖啡属、亚麻属、大麻属、木薯属、胡萝卜属、南瓜属、西瓜属和高粱属。
合适的宿主植物包括例如玉米/玉米(玉米属物种)、小麦(小麦属物种)、大麦(例如Hordeum vulgare)、燕麦(例如Avena sativa)、高粱(Sorghum bicolor)、黑麦(Secalecereale)、大豆(大豆属物种，例如黄豆(G.max))、棉花(棉花属物种，例如陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense))、芸苔属物种(如欧洲油菜(B.napus)、大叶芥菜(B.juncea)、羽衣甘蓝(B.oleracea)、芜菁等)、向日葵(Helianthus annus)、红花、山药、木薯、苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))、水稻(稻属物种，如O.sativa indica cultivar组或japonica cultivar组)、牧草、珍珠粟(狼尾草物种，如白毛狼尾草(P.glaucum))、树种(松、杨树、冷杉、车前草等)、茶、咖啡、油棕、椰子、蔬菜品种，如豌豆、西葫芦、豆类(如菜豆品种)、辣椒、黄瓜、朝鲜蓟、芦笋、茄子、花椰菜、大蒜、韭菜、生菜、洋葱、萝卜、芜菁、番茄、马铃薯、抱子甘蓝、胡萝卜、菜花、菊苣、芹菜、菠菜、苦苣、茴香、甜菜、肉质果树(葡萄、桃子、李子、草莓、芒果、苹果、梅子、樱桃、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、柑橘、猕猴桃、无花果、柠檬、酸橙、油桃、覆盆子、西瓜、橙子、葡萄柚等)、观赏植物(例如玫瑰、矮牵牛、菊花、百合、非洲菊)、草本植物(薄荷、欧芹、罗勒、百里香等)，木本树木(例如杨属、柳属、栎属、桉树属)、纤维物种如亚麻(栽培亚麻(Linum usitatissimum))和大麻(Cannabis sativa)。
通过本发明方法获得或可获得的突变基因或包含所述突变基因的本发明核酸可用于赋予单性生殖、赋予用于增加倍性的无配子生殖和/或用于产生二单倍体。优选地，所述用途在植物生物技术和/或育种中，即在植物或植物细胞中/上。
单性生殖是无配子生殖的一个要素，用于单性生殖的基因可以与用于不完全减数分裂(例如倍数孢子形成)的基因结合使用以产生无配子生殖，优选地将其用于本文列出的应用。这些基因可以通过转化、渗入或通过修饰内源合适的基因从而将它们转化为不完全减数分裂(或倍数孢子形成)基因而引入有性作物。关于无配子生殖基因的结构和功能的知识也可以用来修饰内源有性生殖基因，使它们成为无配子生殖基因。优选的用途是将无配子生殖基因置于可诱导启动子下，使得当有性生殖产生新的基因型时，无配子生殖可以被关闭，而当需要无配子生殖来繁殖优良基因型时，无配子生殖可以被开启。
本发明的突变基因可以用作无配子生殖的成分。功能性配子体无配子生殖需要不完全减数分裂和单性生殖。不完全减数分裂可以通过影响减数分裂的突变组合来实现(Crismani et al.,2013)，其结果是大孢子中的染色体不减少，即有丝分裂而不是减数分裂。通过表观遗传改变呈现配子体命运的体细胞(Grimanelli,2012)也会产生未减数的孢子样细胞，这些细胞可能会产生未减数的配子(卵细胞)。在另一个实施方案中，通过天然不完全减数分裂基因的转基因或非转基因表达来实现不完全减数分裂。无论通过何种方式形成未减数的卵细胞，来自本发明突变基因的适当时间和空间表达都可以诱导卵细胞表现为合子并在没有受精的情况下分裂。
本发明的突变基因可以以全新的方式使用，例如不直接作为无配子生殖的工具。例如，在无配子生殖中，单性生殖和不完全减数分裂都组合在单一植物中，而在一代中使用不完全减数分裂和在下一代中使用单性生殖将在二倍体和多倍体水平上连接作物的有性基因库，通过不完全减数分裂在倍性水平上上升，通过单性生殖在倍性水平上下降。这是非常有用的，因为多倍体群体可能更适合突变诱导，因为它们可以耐受更多的突变。多倍体植物也可以更有活力。然而，二倍体群体更适合选择，二倍体杂交更适合遗传作图、BAC文库的构建等。多倍体中的单性生殖可以产生可以与二倍体杂交的单倍体。二倍体的倍数孢子形成产生未减数的2n卵细胞，这些卵细胞可以通过多倍体的花粉受精产生多倍体后代。因此，在不同的繁殖世代中，不完全减数分裂和单性生殖的交替将二倍体和多倍体基因库联系起来。
本发明突变基因的另一用途是不利用不完全减数分裂产生单倍体后代，其可用于产生单倍体和通过加倍的单倍体(DHs)的基因组加倍(例如自发基因组加倍、秋水仙碱、叠氮化钠或其他化学物质)。加倍的单倍体可以作为亲本产生有性F1杂交种。加倍的单倍体是使植物纯合的最快方法。用加倍的单倍体，可以使植物是纯合的，而用第二快的方法，自交，需要5-7代才能在二倍体植株中达到足够高的纯合水平。有几种方法可以产生加倍单倍体。在一些植物物种中，单倍体可以通过小孢子培养产生。其他方法是通过用经辐照的花粉(甜瓜)授粉产生单倍体胚胎(雌核发育)，或用特定授粉种群(玉米、马铃薯)授粉。这些方法有其局限性，如成本、基因型难适应、劳动强度大等。在一些作物中，没有单倍体生产的方法(如番茄)。利用单性生殖基因的显性等位基因，可以显著提高雌核发育的频率，降低单倍体生产的成本。
以下非限制性实施例说明了本发明的不同实施方案。除非实施例中另有说明，所有重组DNA技术均根据Sambrook et al.(1989)和Sambrook and Russell(2001)；和Ausubel et al.(1994)第1卷和第2卷中所述的标准方案进行。BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications联合出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述了用于植物分子工作的标准材料和方法。
表1.本文使用的SEQ ID NO概述。
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附图说明
图1.蒲公英CRISPR/Cas9单性生殖缺失突变体和有性莴苣的互补和转化实验。A)用于蒲公英属LOP突变体互补的不同启动子-基因构建体和成功互补的品系数量。显示了具有蒲公英Par基因的ToPar启动子和来自莴苣(Lspar)的性同源物(Lspar)以及拟南芥卵细胞(EC1.1)启动子。B)用拟南芥卵细胞EC1.1启动子驱动的蒲公英属ToPar基因转化莴苣的相似性)。C),D),E),用pEC1.1::Par构建体转化的莴苣断头花序中的胚胎样结构。C)断头后75小时来自对照非转化莴苣的胚囊。可见未受精卵细胞(ec)和中央细胞(cc)核。D)胚胎断头后75小时具有发育的胚样结构的胚囊。E)具有多个胚样结构的胚囊。星号表示单个胚样结构。F)自花授粉后5天，来自对照非转化莴苣的胚囊的流式细胞术分析。G)在断头后5天，来自携带pEC1.1::Par构建体的转基因莴苣的胚囊的流式细胞术分析。
图2.蒲公英属Par/par启动子的多态性。Par等位基因和三个有性等位基因的ATG起始密码子(下划线)上游350bp区域的ClustalW比对：药蒲公英(Topar)和橡胶蒲公英橡胶草(Taraxacum koksaghyz)(Tkpar)的有性等位基因的par-1和par-2。1335bp的MITE插入已从ToPar启动子中去除。6bp直接重复序列，即MITE的插入位点，用下划线标出。在13个SNP中，3个位于PAR启动子和有性启动子之间(粗体和下划线)；十个发生在有性启动子之间。
实施例
实施例1
通过Par启动子的单性生殖的诱导
为了测试蒲公英属Par启动子是否在单性生殖的遗传控制中具有作用，我们测试了它是否可以与来自有性物种的Par编码序列同源物组合来诱导单性生殖。蒲公英属Par启动子用于驱动来自莴苣的同源基因(Lspar)的表达，莴苣是菊科的一个相关物种，也是一种重要的蔬菜作物。将该构建体转化为自交不亲和的四倍体蒲公英属CRISPR/Cas9单性生殖缺失(LOP)突变体，该突变体来源于来自A68系的3x PAR CRISPR突变体与来自二倍体植物FCH72的花粉之间的杂交，并且不能产生有活力的种子。由于Par等位基因是显性的，所以在原代转化植株上进行了测试(T0)。值得注意的是，Par::Lspar构建体在四个独立的转化体中导致种子形成和四倍体(由于显性倍数孢子形成基因的存在)后代(表2)。这表明蒲公英属Par启动子可以引起莴苣基因诱导单性生殖。在莴苣基因中没有发现ToPar编码序列特异性的遗传多态性(当与有性等位基因par1和par2相比时)，排除了编码序列多态性是单性生殖的原因。从Par ATG起始位点向上游移动，当与来自蒲公英的三个有性等位基因(par1,par2和parTKS，图2)相比时，MITE插入呈现无配子生殖等位基因特有的第一遗传多态性。在ATG上游350 bp的四个蒲公英启动子之间仅发现13个SNP(当MITE从PAR等位基因切除时)，其中只有3个是Par-等位基因特异性的。综合起来，这提供了强有力的证据，证明蒲公英等位基因Par基因之间的功能差异是由启动子引起的，而不是编码序列。如前所述，其中Par基因在卵细胞特异性拟南芥EC1(pEC1::Par)启动子下表达的不同构建体也可以导致CRISPR/Cas9 LOP突变体的互补，这与PAR的卵细胞表达可以引起单性生殖的假设一致(参见PCT/EP2020/064991的实施例2和表3)。
本实验证明，驱动有性莴苣基因表达的蒲公英属Par启动子挽救了失去单性生殖的蒲公英属植物的单性生殖表型。换句话说，驱动有性莴苣基因表达的蒲公英属Par启动子能够诱导单性生殖。
表二.药蒲公英4x CRISPR/Cas9 PAR缺失突变体与融合了莴苣Lspar基因的ToPar启动子的无配子生殖互补。
在温室中生长初级转化体，收集种子并进行多达三个种子穗的萌发试验(SH；每个种子穗30粒种子)。所有测试的后代植物都含有显性DIP基因的PCR标记，表明重组和减数在雌性减数分裂中没有发生。用流式细胞仪(FCM)测定后代的倍性水平。单性生殖产生的幼苗是四倍体；六倍体(6x)幼苗来自自花受精(四倍体倍数孢子形成卵细胞由减数的二倍体花粉粒受精)。八个品系中的四个产生了单性生殖四倍体后代。虽然药蒲公英是自交不亲和的，但已知SI系统可能是渗漏的(Morita et al.1990；和Tas and Van Dijk,1999)。不定期的从用35S::GUS构建体转化的对照植物中观察到六倍体后代，表明自花受精可以(很少)在这种遗传背景下发生。这可以解释非互补系yellow 12b的单个六倍体后代。
表3.拟南芥EC1.1启动子下ToPAR基因对药蒲公英4x CRISPR/Cas9 PAR缺失突变体的无配子生殖互补。解释见表2。
在用互补结构转化的植物中，一株植物由于自交产生了四个6x幼苗。
实施例2
植物材料
对于本实验，使用野生型莴苣：Iceberg型、Legacy、Takii Japan和Red Romaine型、Baker Creek Heirloom Seeds。
DNA构建体
用包含SEQ ID NO：34所示的构建体的T-DNA区域构建二元载体，所述构建体由以下连续元件组成：驱动莴苣的LSAT_8X112340 CDS序列(SEQ ID NO：33)表达的莴苣的LSAT_8X112340启动子(SEQ ID NO：16)，接着是药蒲公英Par等位基因3’UTR的前1000个碱基(SEQID NO：4的前1000个碱基)，接着是35S终止子和用于选择的新霉素磷酸转移酶基因(nptII)。产生这种二元载体的合适技术是Golden Gate或Gibson/>(例如参见Ma et al.,2015)。含有该T-DNA的转基因品系以代码pKG20001编号。
用包含SEQ ID NO：35所示的构建体的T-DNA区域构建第二二元载体，该构建体由以下连续元件组成：莴苣的LSAT_8X112340启动子，其经修正以去除两个MYB结合位点，该位点具有驱动莴苣的LSAT_8X112340 CDS序列(SEQ ID NO：33)表达的序列AACCGCCA和AACCGTC(SEQ ID NO：17)，接着是药蒲公英Par等位基因3’UTR的前1000个碱基(SEQ ID NO：4的前1000个碱基)，接着是35S终止子和用于选择的新霉素磷酸转移酶基因(nptII)。产生这种二元载体的合适技术是Golden Gate或Gibson/>(例如参见Ma etal.,2015)。含有该T-DNA的转基因品系以代码pKG20002编号。
用包含SEQ ID NO：36所示的构建体的T-DNA区域构建第三二元载体，所述构建体由以下连续元件组成：莴苣的LSAT_8X112340启动子，其中插入了驱动莴苣的LSAT_8X112340 CDS序列(SEQ ID NO：33)表达的药蒲公英MITE启动子元件(SEQ ID NO：18)Par等位基因，随后是药蒲公英Par等位基因3’UTR的前1000个碱基(SEQ ID NO：4的前1000个碱基)，随后是35S终止子和用于选择的新霉素磷酸转移酶基因(nptII)。产生这种二元载体的合适技术是Golden Gate或Gibson/>(例如参见Ma et al.,2015)。含有该T-DNA的转基因品系以代码pKG20003编号。
用包含SEQ ID NO：61所示的构建体的T-DNA区域构建第四二元载体，所述构建体由以下连续元件组成：莴苣的LSAT_8X112340启动子，其具有驱动莴苣的LSAT_8X112340CDS序列(SEQ ID NO：33)表达的两个MYB结合位点(SEQ ID NO：20)上游的缺失，接着是药蒲公英Par等位基因的3’UTR的前1000个碱基(SEQ ID NO：4的前1000个碱基)，接着是35S终止子和用于选择的新霉素磷酸转移酶基因(nptII)。产生这种二元载体的合适技术是Golden Gate或Gibson/>(例如参见Ma et al.,2015)。含有该T-DNA的转基因品系以代码pKG20003编号。
植物转化方法
农杆菌转化通过使用根癌农杆菌对莴苣进行基因型非依赖性转化进行。这种方法在本领域中是公知的，并且例如在Curtis et al.(1994)中教导。适用于莴苣遗传转化的任何其他方法可用于生产含有所需T-DNA的植物，如Michelmore et al.(1987)或Chupeau etal.(1989)所述。
结果
如上文“DNA构建体”部分所述，对转基因存在进行阳性测试的植物进行单性生殖发生评估。由于该性状是显性的，所以在初级转化植株上进行测试(T0)。在没有杂交或自体受精的情况下，单性生殖的卵细胞发育成胚胎。为防止任何携带转基因的植物受精，植物生长在温室中，在显微镜观察之前，所有的花都被人工去雄。去雄通过在花冠生长前修剪总苞来进行。通过Nomarski微分干涉显微镜(DIC)在显微镜下检测清除胚珠的非无配子生殖植物中的单性生殖。本文中，应用使用水合氯醛的清除方法；一种通常用于清除植物胚珠用于显微镜成像的方法(参见例如Franks RG,2016)。去雄后75小时，收获花蕾，用水合氯醛清除胚珠。在pKG20002和pKG20003的转基因品系中，在这些清除的胚珠中可以观察到多个胚胎。对胚囊池的流式细胞术可以显示这些胚胎是单倍体。在非转化的对照植物和评价的pKG20001转基因品系中，以相同方式去雄和成像，根本没有观察到胚胎。
这些结果表明，无论是插入药蒲公英的Par等位基因的MITE启动子元件还是从莴苣的LSAT_8X112340启动子中去除MYB结合位点都足以改变LSAT_8X112340基因的表达，使其能够诱导莴苣单倍体胚胎形成。
实施例3
植物材料
对于本实验，使用野生型莴苣：Red Romaine型，Baker Creek Heirloom Seeds。
DNA构建体
用包含SEQ ID NO：63所示的构建体的T-DNA区域构建二元载体，所述构建体由以下连续元件组成：驱动药蒲公英Par CDS序列(SEQ ID NO：3)表达的莴苣的LSAT_8X112340启动子(SEQ ID NO：16)，接着是药蒲公英Par等位基因3’UTR的前1000个碱基(SEQ ID NO：4的前1000个碱基)，接着是35S终止子和用于选择的新霉素磷酸转移酶基因(nptII)。产生这种二元载体的合适技术是Golden Gate或Gibson/>(例如参见Ma etal.,2015)。含有该T-DNA的转基因品系以代码pKG20004编号。
用包含SEQ ID NO：64所示的构建体的T-DNA区域构建第二二元载体，所述构建体由以下连续元件组成：具有驱动药蒲公英Par CDS序列(SEQ ID NO：3)表达的药蒲公英MITE启动子元件(SEQ ID NO：18)的Par等位基因插入的莴苣LSAT_8X112340启动子，随后是药蒲公英Par等位基因3’UTR的前1000个碱基(SEQ ID NO：4的前1000个碱基)，随后是35S终止子和用于选择的新霉素磷酸转移酶基因(nptII)。产生这种二元载体的合适技术是Golden Gate或Gibson/>(例如参见Ma et al.,2015)。含有该T-DNA的转基因品系以代码pKG20006编号。
用包含SEQ ID NO：65所示的构建体的T-DNA区域构建第三载体，所述构建体由以下连续元件组成：驱动莴苣的LSAT_8X112340CDS序列(SEQ ID NO：33)表达的药蒲公英Par等位基因启动子(SEQ ID NO：2)，接着是药蒲公英Par等位基因3’UTR的前1000个碱基(SEQID NO：4的前1000个碱基)，接着是35S终止子和用于选择的新霉素磷酸转移酶基因(nptII)。产生这种二元载体的合适技术是Golden Gate或Gibson/>(例如参见Ma et al.,2015)。含有该T-DNA的转基因品系以代码pKG20008编号。
植物转化方法
农杆菌转化通过使用根癌农杆菌对莴苣进行基因型非依赖性转化来进行。这种方法在本领域中是公知的并且例如Curtis et al.(1994)教导。适用于莴苣遗传转化的任何其他方法可用于生产含有所需T-DNA的植物，如Michelmore et al.(1987)或Chupeau etal.(1989)所述。
结果
如上文“DNA构建体”部分所述，对测试转基因存在阳性的植物进行单性生殖发生评估。由于该性状是显性的，所以在初级转化植株上进行测试(T0)。在没有杂交或自体受精的情况下，单性生殖的卵细胞发育成胚胎。为防止任何含有转基因的植物受精，将植物生长在温室中，在显微镜观察之前，所有的花都被人工去雄。去雄通过在花冠生长前修剪总苞来进行。通过Nomarski微分干涉显微镜(DIC)在显微镜下检测清除胚珠的非无配子生殖植物中的单性生殖。本文中，应用了使用水合氯醛的清除方法；一种通常用于清除植物胚珠以进行显微镜成像的方法(参见例如Franks RG.2016)。去雄后75小时，收获花蕾，用水合氯醛清除胚珠。在pKG20005、pKG20006、pKG20007和pKG20008的转基因品系中，在这些清除的胚珠中观察到多个胚胎(见表3)。对胚囊池的流式细胞术可以显示这些胚胎是单倍体。在标准GUS构建体转化的对照植物和评价的pKG20004转基因品系中，以相同方式去雄和成像，根本没有观察到胚胎。
这些结果表明，药蒲公英Par等位基因的MITE启动子元件足以改变表达，使得LSAT_8X112340基因可以诱导莴苣单倍体胚形成。这是通过莴苣LSAT_8X112340基因的启动子修饰诱导莴苣单性生殖的明显实例，因为在没有杂交或自体受精的情况下，卵细胞发育成胚胎。
表3：莴苣转基因品系去雄后75小时的花蕾中的胚胎观察。指示“是”意味着在所有芽中至少有一个胚胎。
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参考文献
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Claims (15)
1.一种产生能够诱导单性生殖表型的突变基因的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码SEQ ID NO：1、6或11的PAR蛋白或其任何直系同源物的序列的基因，所述序列可操作地连接到包含一个或多个转录因子MYB结合位点的启动子；以及
(b)通过修饰所述一个或多个MYB结合位点的上游的序列来修饰所述启动子，以增加编码的PAR蛋白的转录。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过在所述一个或多个MYB结合位点的直接上游向所述启动子中引入插入或缺失来修饰所述启动子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述启动子通过随机或靶向诱变来修饰。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中步骤(a)中提供的所述基因包含在植物细胞内，优选植物原生质体内，并且其中优选所述突变基因诱导或增加所述植物细胞的单性生殖。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在步骤(a)中提供的所述基因是内源性基因。
6.根据权利要求4所述的方法，其中在步骤(a)中提供的所述基因是转基因，其任选地是天然基因或嵌合基因。
7.一种能够诱导单性生殖表型的突变基因，其包含编码SEQ ID NO：1、6或11的PAR蛋白或其任何直系同源物的序列，其中所述突变基因包含权利要求1-6任一项中所定义的修饰。
8.一种核酸分子、构建体或载体，其包含权利要求7所述的突变基因。
9.一种植物细胞，优选植物细胞原生质体，其包含权利要求7所述的突变基因和/或权利要求8所述的核酸分子、构建体或载体。
10.一种植物，其包含权利要求7所述的突变基因和/或权利要求8所述的核酸分子、构建体或载体，其中所述植物是单性生殖植物，其中所述植物优选可通过产生权利要求1-6任一项中所定义的突变基因获得。
11.根据权利要求10所述的植物，其中所述植物还能够进行不完全减数分裂，优选其中所述植物是不完全减数分裂的。
12.一种产生单性生殖植物的方法，包括以下步骤：
(a)从权利要求9所述的植物细胞再生和/或生长植物组织或植物；和
(b)任选地，对步骤(A)中获得的植物组织或植物进行筛选和/或基因分型。
13.一种产生不完全减数分裂植物的方法，包括权利要求12所述的步骤，其中步骤a)的基因包含在能够进行不完全减数分裂的植物细胞中，优选植物原生质体中。
14.一种产生不完全减数分裂F1杂交种种子的方法，包括以下步骤：
(I)使有性繁殖的第一植物与第二植物的花粉杂交受精，以产生F1杂交种种子，其中所述第二植物包含权利要求7所述的突变基因和/或权利要求8所述的核酸分子、构建体或载体，并且其中所述第一和/或第二植物能够进行不完全减数分裂；和
(II)优选通过基因分型，任选地从所述F1杂交种种子中选择包含不完全减数分裂表型的种子。
15.权利要求8所述的突变基因、核酸、构建体或载体用于诱导原生质体、植物细胞或植物的单性生殖表型的用途。
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