CN116589550B - 固定水稻杂种优势的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了固定水稻杂种优势的方法，所述方法包括将PAR基因和用于靶向敲除REC8基因、OSD1基因及PAIR1基因的核酸片段导入杂交水稻种子中，筛选得到REC8、OSD1和PAIR1三个基因都为双等位突变的三突变体以及PAR基因成功异位表达的转基因杂交水稻套袋自交，收获自交结实种子。本发明的方法可以使杂交水稻自交，形成能够固定水稻杂种优势的种子，解决之前在利用杂种优势中由于花期不一致等原因导致的亲本间杂交困难、制种产量低、杂交种成本高等问题，极大地提高杂交水稻配组效率，结实率和二倍体诱导率高，消除杂交水稻制种风险，应用价值高。

Description

固定水稻杂种优势的方法
技术领域
本发明涉及农业领域。具体地，本发明涉及固定水稻杂种优势的方法。
背景技术
杂种优势是指在杂种后代中大部分农艺性状超越亲本的表现，是现代农业改良的基础。但是传统的杂种优势仅能在F1中表现出超越亲本的优势，在随后F2代中因为基因型的分离而出现优势的丢失。目前杂交水稻生产必须依靠不育系，三系法杂交水稻育性受恢保关系的制约，恢复系很少，保持系更少，选育到优良组合的概率较低；而两系不育系受到气温高低的影响，制种过程中遇到异常低温或高温都会导致失败；最终追求的是实现水稻的一系法制种，将杂交稻的杂种优势固定下来，从而大大提高杂交水稻的配组效率，消除杂交水稻的繁重制种风险。
无融合生殖是指通过不完全的减数分裂和激发卵细胞进行孤雌生殖等生殖过程，进而使后代为母体植物克隆的过程。将人工组装的无融合生殖过程引入到作物中，实现杂种植物的克隆生殖。水稻固定杂种优势目前都是通过MiMe体系创制二倍体雌配子的方式实现。MiMe体系可以将水稻生殖细胞减数分裂转化为有丝分裂，获得雌雄配子全部都是和亲本基因型相同的二倍体，其主要涉及三个与减数分裂相关的基因（PAIR1、REC8和OSD1）同时突变，即把同源染色体之间配对和重组、第一次减数分裂时姐妹染色单体不分离、一次DNA复制后发生两次分裂3个点同时突变，使减数分裂过程类似于有丝分裂，产生的配子保留了母本所有的遗传信息。但是该体系会严重影响水稻的结实率，也很难保证二倍体配子不会加倍，导致本来就结实很少的水稻种子大部分都是四倍体，很难应用于生产中。
已经在研究中发现水稻中广泛存在不定胚生殖的现象，它是通过株心组织体细胞直接发育而成，基因型和亲本相同，只是由于发生的频率极低，而且通常卵细胞受精后也会发育成胚，常以双胚或多胚苗的形式出现，在生产中不能用于杂种优势的固定。
然而，目前固定水稻杂种优势的方法仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
研究报道，利用蒲公英的PAR基因已经成功在生菜和向日葵中进行孤雌生殖。但是，通过氨基酸序列比对发现，并未在水稻中找到与蒲公英的PAR基因类似的同源基因。因此，研究者们通常不会考虑将蒲公英的PAR基因应用于水稻。然而，本发明的发明人创造性的发现，将蒲公英的PAR基因应用于水稻中，可以有效地诱导水稻产生孤雌生殖。
进一步地，发明人经深入研究发现，通过将参与减数分裂的关键基因（PAIR1基因、REC8基因和OSD1基因）进行编辑敲除后可实现将生殖细胞的减数分裂转变为类似有丝分裂，从而得到与杂交种基因型和染色体倍型一致的配子；再启动PAR基因表达以诱导配子发育成种子或植株。由此，该方法可以使杂交水稻自交，形成能够固定水稻杂种优势的种子，解决之前在利用杂种优势中由于花期不一致等原因导致的亲本间杂交困难，制种产量低、杂交种成本高等问题，极大地提高杂交水稻配组效率，结实率和二倍体诱导率高，消除杂交水稻制种风险，应用价值高。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了PAR基因在固定水稻杂种优势中的应用。
本发明的发明人发现，PAR基因可以诱导水稻产生孤雌生殖，通过敲除种子或植物参与减数分裂的PAIR1基因、REC8基因和OSD1基因进行编辑后实现将生殖细胞的减数分裂转变为类似有丝分裂，从而得到与杂交种基因型和染色体倍型一致的配子；再启动PAR基因表达以诱导配子发育成种子或植株。相较三突变体与BBM1基因诱导的孤雌生殖（二倍体诱导率不到30%），三突变体与PAR基因诱导的孤雌生殖后代中二倍体诱导率有显著的升高，二倍体诱导率可达50%以上。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体包括：PAR基因；核酸片段，所述核酸片段用于靶向敲除REC8基因、OSD1基因及PAIR1基因。
根据本发明实施例的表达载体导入杂交水稻种子内，表达载体中的核酸片段可以靶向到REC8基因、OSD1基因及PAIR1基因，将基因的至少部分敲除以使其功能丧失，得到双等位突变的三突变体，以将生殖细胞的减数分裂转变为类似有丝分裂，从而得到与杂交种基因型和染色体倍型一致的配子。表达载体的PAR基因可诱导配子发育成种子或植株。由此，极大地提高杂交水稻配组效率，结实率和二倍体诱导率高，消除杂交水稻制种风险。
在发明的又一方面，本发明提出了一种重组菌。根据本发明的实施例，所述重组菌包括：PAR基因和核酸片段，所述PAR基因和核酸片段是如前面所述表达载体中所限定的。
在发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括下列至少之一：（a）前面所述表达载体；（b）分别携带有PAR基因和核酸片段的至少两个表达载体；（c）前面所述重组菌。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述表达载体或所述重组菌在固定水稻杂种优势中的应用。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种固定水稻杂种优势的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：（1）将PAR基因和核酸片段转化到杂交水稻种子中，得到T0代植株，其中，所述PAR基因和核酸片段是如前面所述表达载体中所限定的；（2）筛选出REC8、OSD1和PAIR1三个基因均为双等位突变的三突变体以及PAR基因成功异位表达的T0代植物套袋自交，收获自交种子。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的嘉丰优2号转基因水稻中PAR基因电泳图；
图2显示了根据本发明一个实施例的嘉丰优3号转基因水稻中PAR基因电泳图；
图3显示了根据本发明一个实施例的父本P025、母本嘉禾212A、杂交种嘉丰优2号以及固定杂种优势后的3个单株的全基因组测序结果分析图；
图4显示了根据本发明一个实施例的父本G1143、母本嘉禾112A、杂交种嘉丰优3号以及固定杂种优势后的3个单株的全基因组测序结果分析图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提出了PAR基因在固定水稻杂种优势中的应用、表达载体、重组菌、试剂盒及其应用和固定水稻杂种优势的方法，下面将分别对其进行详细描述。
PAR基因在固定水稻杂种优势中的应用
在本发明的一个方面，本发明提出了PAR基因在固定水稻杂种优势中的应用。
PAR基因编码一个具有170个氨基酸的蛋白质，含有一个罕见的拟南芥K2-2类的C2H2锌指结构域，预测具有核酸结合活性。具体地，PAR基因的CDS序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
ATGGCAGATAATGGCAACACCGGCCGTCAAAAGGATGACGACGGTGGCCATGATGGACCACGCCAAAACCCAACTACTCCACCCTCCCCTTCCCGCACCCCTCGAAGACCAAGGCGGAACACATCACCGCCCAAACATTCTCCGGGGGCGTCTTCAAGCACCATGCCAGCGCCGCCTACTCCCCCTGCGCCGACGGGAATCACCGGTGCTTCTAGTTCTTCTGTGGGTACTAATATAATTTCATTTATTCCACCCAAAACCAAAAGAACGAAGTCGGTGATCTGCCCGATCTGCAACAAAGATATGTGCCATGAGAAGGCGCTGTGTGGCCACATCCGGTGGCATACACAGGAGGAAAGATTGGCGGCCAGCATCGCTATAGCAAGAGCGCTATCTTCTAACGTTGTTGTTTCTGGCAATGGCGATGAAGATGAAGGTCCATCTAAAAAGTATAAACTCCCGGACCTGAACAAATCTCCACCGCCGGAGGAGGAGGACGAGGACGCTGCCTGA（SEQ ID NO：1）
MADNGNTGRQKDDDGGHDGPRQNPTTPPSPSRTPRRPRRNTSPPKHSPGASSSTMPAPPTPPAPTGITGASSSSVGTNIISFIPPKTKRTKSVICPICNKDMCHEKALCGHIRWHTQEERLAASIAIARALSSNVVVSGNGDEDEGPSKKYKLPDLNKSPPPEEEDEDAA（SEQ ID NO：2）
本发明的发明人发现，PAR基因可以诱导水稻产生孤雌生殖，通过敲除种子或植物参与减数分裂的PAIR1基因、REC8基因和OSD1基因进行编辑后实现将生殖细胞的减数分裂转变为类似有丝分裂，从而得到与杂交种基因型和染色体倍型一致的配子；再启动PAR基因表达以诱导配子发育成种子或植株。相较三突变体与BBM1基因诱导的孤雌生殖（二倍体诱导率不到30%），三突变体与PAR基因诱导的孤雌生殖后代中二倍体诱导率有显著的升高，二倍体诱导率可达50%以上。
表达载体
在本发明的另一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，该表达载体包括：PAR基因；核酸片段，该核酸片段用于靶向敲除REC8基因、OSD1基因及PAIR1基因。
根据本发明实施例的表达载体导入杂交水稻种子内，表达载体中的核酸片段可以靶向到REC8基因、OSD1基因及PAIR1基因，将基因的至少部分敲除以使其功能丧失，得到双等位突变的三突变体，以将生殖细胞的减数分裂转变为类似有丝分裂，从而得到与杂交种基因型和染色体倍型一致的配子。表达载体中的PAR基因可诱导配子发育成种子或植株。由此，极大地提高杂交水稻配组效率，结实率和二倍体诱导率高，消除杂交水稻制种风险。
在本文中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。表达载体可包括主要用于将DNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA的载体、主要用于DNA的转录和/或翻译的表达的载体。示例性地，表达载体可以为质粒、噬菌体、粘粒或病毒等。
根据本发明的实施例，表达载体进一步包括：PAR基因的启动子和PAR基因的终止子，所述PAR基因的启动子和PAR基因的终止子与所述PAR基因相连。具体地，PAR基因的启动子位于PAR基因的上游，PAR基因的终止子位于PAR基因的下游。
PAR基因的启动子可以启动PAR基因表达，包括但不限于AtEC1启动子，例如AtEC1.1启动子和/或AtEC1.2启动子。PAR基因的终止子可以终止PAR基因表达，包括但不限于NOS终止子和/或35S终止子。
根据本发明的实施例，表达载体还含有有限数目的有用的限制性位点，用于插入启动子、终止子等核酸片段，这些限制性位点优选为NotI、Aarl和BamHI等位点。
在本文本中，术语“敲除基因”是指通过基因编辑实现基因功能的丧失，既可以指敲除基因的部分序列，也可以指敲除基因的全部序列。根据本发明的实施例，靶向敲除REC8基因的位点选自SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的第21-23位；靶向敲除OSD1基因的位点选自SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的第21-23位；靶向敲除PAIR1基因的位点选自SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列的第21-23位。由此，通过对上述三个基因的对应位点进行敲除，可以有效地抑制其功能。
REC8基因敲除位点（下划线）：TTTGAACCCGTCGGTACCCATGG（SEQ ID NO：3）
OSD1基因敲除位点（下划线）：AGGAGAACGTGCCGCCGTCCTGG（SEQ ID NO：4）
PAIR1基因敲除位点（下划线）：GAGGGGTTCCAGCGGTGCACTGG（SEQ ID NO：5）
根据本发明的实施例，核酸片段包括：编码第一gRNA的核酸片段及其互补片段，第一gRNA用于靶向敲除REC8基因；编码第二gRNA的核酸片段及其互补片段，第二gRNA用于靶向敲除OSD1基因；编码第三gRNA的核酸片段及其互补片段，第三gRNA用于靶向敲除PAIR1基因；编码Cas9蛋白的核酸片段。由此，采用具有上述gRNA和Cas9的CRISPER-Cas9基因编辑技术可以特异性地靶向敲除三个基因，使其功能丧失。
根据本发明的实施例，编码第一gRNA的核酸片段（REC8-FP）及其互补片段（REC8-RP）具有如SEQ ID NO：6和7的核苷酸序列，编码第二gRNA的核酸片段（OSD1-FP）及其互补片段（OSD1-RP）具有如SEQ ID NO：8和9的核苷酸序列，编码第三gRNA的核酸片段（PAIR1-FP）及其互补片段（PAIR1-RP）具有如SEQ ID NO：10和11的核苷酸序列。
REC8-FP：5`-TTTGAACCCGTCGGTACCCA-3`（SEQ ID NO：6）
REC8-RP：5`-TGGGTACCGACGGGTTCAAA-3`（SEQ ID NO：7）
OSD1-FP：5`-AGGAGAACGTGCCGCCGTCC-3`（SEQ ID NO：8）
OSD1-RP：5`-GGACGGCGGCACGTTCTCCT-3`（SEQ ID NO：9）
PAIR1-FP：5`-GAGGGGTTCCAGCGGTGCAC-3`（SEQ ID NO：10）
PAIR1-RP：5`-GTGCACCGCTGGAACCCCTC-3`（SEQ ID NO：11）
进一步地，在REC8-FP、OSD1-FP和PAIR1-FP的5’端上分别连接5’-GGCA-3’，在REC8-RP、OSD1-RP和PAIR1-RP的5’端上分别连接5’-AAAC-3’，合成的上下游引物退火后，形成带有粘性末端的片段，使用T4连接酶可连接到酶切线性化的载体上。
重组菌
在本发明的另一方面，本发明提出了一种重组菌。根据本发明的实施例，该重组菌包括：PAR基因和核酸片段，PAR基因和核酸片段是如前面所述表达载体中所限定的。
利用该重组菌侵染植物，可以有效地将PAR基因和核酸片段导入植物中，获得的转基因植物配组效率高，结实率和二倍体诱导率高，消除杂交水稻制种风险。
根据本发明的实施例，PAR基因和核酸片段是以前面所述表达载体的形式提供的。PAR基因和核酸片段构建在同一表达载体上，仅需一次转化即可将水稻杂种优势固定下来，效率高。
根据本发明的实施例，PAR基因和核酸片段分别独立地存在于至少两个表达载体上。例如，PAR基因和核酸片段分别构建在两个表达载体上；或者核酸片段中编码第一gRNA的核酸片段及其互补片段、编码第二gRNA的核酸片段及其互补片段、编码第三gRNA的核酸片段及其互补片段和编码Cas9蛋白的核酸片段分别构建在多个表达载体上，PAR基因单独构建在一个表达载体上或者与其它核酸片段的至少一个共同构建在同一表达载体上。
本发明的重组菌为能够使目的基因转入植物中的菌，例如农杆菌等。
需要说明的是，前面针对表达载体所描述的特征和优点，同样适用于该重组菌，在此不再赘述。
试剂盒
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，试剂盒包括下列至少之一：（a）前面所述表达载体；（b）分别携带有PAR基因和核酸片段的至少两个表达载体；（c）前面所述重组菌。利用该试剂盒可以使PAR基因和核酸片段导入植物中，获得的转基因植物配组效率高，结实率和二倍体诱导率高，消除杂交水稻制种风险。
需要说明的是，前面针对表达载体和重组菌所描述的特征和优点，同样适用于该试剂盒，在此不再赘述。
应用
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述表达载体或重组菌在固定水稻杂交优势中的应用。表达载体或者重组菌种含有的核酸片段可以靶向到REC8基因、OSD1基因及PAIR1基因，将基因的至少部分敲除以使其功能丧失，得到双等位突变的三突变体，以将生殖细胞的减数分裂转变为类似有丝分裂，从而得到与杂交种基因型和染色体倍型一致的配子。表达载体或重组菌含有的PAR基因可诱导配子发育成种子或植株。由此，极大地提高杂交水稻配组效率，结实率和二倍体诱导率高，消除杂交水稻制种风险。
需要说明的是，前面针对表达载体和重组菌所描述的特征和优点，同样适用于该应用，在此不再赘述。
固定水稻杂种优势的方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种固定水稻杂种优势的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：（1）将PAR基因和核酸片段转化到杂交水稻种子中，得到T0代植株，其中，PAR基因和核酸片段是如前面所述表达载体中所限定的；（2）筛选出REC8、OSD1和PAIR1三个基因均为双等位突变的三突变体以及PAR基因成功异位表达的T0代植物套袋自交，收获自交种子。由此，利用该方法可以有效地固定水稻杂种优势，极大地提高杂交水稻配组效率，结实率和二倍体诱导率高，消除杂交水稻制种风险。
根据本发明的实施例，PAR基因和核酸片段是以前面所述重组菌的形式提供的。
根据本发明的实施例，步骤（1）包括：将前面所述重组菌侵染杂交水稻种子的愈伤组织；将侵染后的愈伤组织进行培养，收集抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织进行培养，得到T0代植株。由此，以便将PAR基因和核酸片段导入植物中。
根据本发明的实施例，步骤（2）包括：提取步骤（1）所得T0代植株的基因组DNA；对基因组DNA中的REC8基因、OSD1基因、PAIR1基因、PAR基因的启动子、PAR基因的CDS序列进行扩增，得到扩增产物；对扩增产物进行测序，对测序结果进行分析；选择同时满足下列要求的植株作为目标植株：A、扩增产物中含有启动子和PAR基因的CDS序列所对应的植株；B、测序结果中REC8、OSD1和PAIR1三个基因均为双等位突变的三突变体所对应的植株。由此，得到的种子并未发生基因分离，基因型与母细胞（用以转基因的背景材料杂交种）是一模一样的，最终达到固定杂种优势的目的。
需要说明的是，前面针对重组菌和表达载体所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。
有益效果
本发明将参与植物减数分裂的关键基因（REC8基因、OSD1基因和PAIR1基因）进行基因编辑后实现将生殖细胞的减数分裂转变为类似有丝分裂，从而得到与杂交种基因型和染色体倍型一致的配子；以及利用AtEC1基因启动子启动PAR基因，诱导配子发育成种子或植株。大大提高杂交水稻配组效率，消除杂交水稻制种风险。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
该实施例中，分别以商业化的杂交稻品种嘉丰优2号和嘉丰优3号作为F1杂交种进行研究，嘉丰优2号是利用嘉禾212A×P025配组育成的感温籼型三系杂交水稻品种，该品种长势旺，株型适中，植株较高，分蘖力中等，区试平均全生育期135.3天。嘉丰优3号是利用嘉禾112A×G1143配组育成的籼粳交三系杂交水稻品种，该品种植株较高，株型适中，分蘖力中等偏弱，平均生育期为138.2天。本实施例中所用的遗传转化背景材料是杂交稻品种嘉丰优2号和3号种子诱导获得的愈伤组织，未经过有性繁殖阶段，因此，经转基因后获得的转基因T0代材料在遗传背景上是与杂交稻F1植株一致的。
固定水稻杂种优势的方法具体步骤如下：
1. 多基因敲除载体与PAR过表达融合载体的构建。
将AtEC1启动子和NOS终止子与PAR基因串联后整合到pC1300-Cas9载体中，构建出Pc1300-Cas9-PAR的表达载体；再将包含REC8、OSD1及PAIR1靶位点的3个SK-gRNA串联到pC1300-Cas9-PAR的表达载体中。具体的构建方法如下：
1.1单个目的SK-gRNA的构建：
选择以下三个位点作为CRISPR-Cas9基因编辑系统敲除REC8、OSD1及PAIR1的位点（下划线表示）
REC8基因敲除位点：TTTGAACCCGTCGGTACCCATGG（SEQ ID NO：3）
OSD1基因敲除位点：AGGAGAACGTGCCGCCGTCCTGG（SEQ ID NO：4）
PAIR1基因敲除位点：GAGGGGTTCCAGCGGTGCACTGG（SEQ ID NO：5）
设计两个互补的DNA序列，在正向序列前加GGCA，在反向互补序列前加AAAC，分别为：
REC8-FP: 5`-GGCATTTGAACCCGTCGGTACCCA-3`（SEQ ID NO：12）
REC8-RP: 5`-AAACTGGGTACCGACGGGTTCAAA-3`（SEQ ID NO：13）
OSD1-FP: 5`-GGCAAGGAGAACGTGCCGCCGTCC-3`（SEQ ID NO：14）
OSD1-RP: 5`-AAACGGACGGCGGCACGTTCTCCT-3`（SEQ ID NO：15）
PAIR1-FP: 5`-GGCAGAGGGGTTCCAGCGGTGCAC-3`（SEQ ID NO：16）
PAIR1-RP: 5`-AAACGTGCACCGCTGGAACCCCTC-3`（SEQ ID NO：17）
SK-gRNA 载体上面有两个AarI酶切位点，用AarI酶切后，形成具有粘性末端的线性化载体；将合成的靶点序列正向和反向引物变性退火后，使用T4连接酶连入之前酶切的SK-gRNA线性化载体，形成单个目的gRNA载体。
1.2 pC1300-Cas9-PAR的载体构建：
pC1300-Cas9载体使用BamHI酶切线性化，使用同源重组的方法将AtEC1基因的启动子片段、PAR基因CDS片段及NOS终止子片段连接到上面线性化的pC1300-Cas9载体中，构建pC1300-Cas9-PAR载体。
AtEC1基因的启动子DNA序列为：
GATGAAGCAGCTGGTCCAATTGCTATTGCCTTCGGTAAATTTTCTCTTTTACAGACATCTAAGCAATTTCCAGGTGTTAATTATTATATTGGGATACTCTCGACTAATTACTGCTTCTACTAAATCCATTCTCACAGTTAAAGCTATGTCTCTGACTCCTGATGAATTGACTGTTAAGAATCACATGAATGAAAAAGGTTAGATTTCTTACAGATGATATGCCTCTTATATTCAAAACAATGACTAATCTCTAGAATCATTTACCTTTATGTTTCTTTTTAAAATAGCTGCAGATGAGGAAATGATCACGAGAGAAACTACTCCAATTCCTGAAGAAACCATCAATGAGTCTTCTGAGAACAGGAAGGAGTATTCAAGCATTGATGAATCAGCTACGTTATCCGAGATGCAAGTAAGAAGAGAACCAACCTTGATTTTCAGAACACAAGTGAAGCCTACGAAGCATGACATGAAAGAGAATGCACCAAACTCAAAAATTGTGCATAATCTTAACGTAACAGCTCCAAGAACATCAAAGAGACAGCCTCTCCAAGACTTGAACAAGAACTAGATGACGGAATTAGCATATCTCATGCACGTTAAGACCTTGTCTAAAACTTCTCTTCTTCTCTTATATATTTATGTGTTATGAAACGCCTATCATGAATTAGCTCTACTAAATCTAGCAACCTTTCAAATTTGCAGTATTGCtGGTGTCTCTGTGTCTTTAAAATAGTTGCCTTATGATTTCTTCGGTTTCAAGATGATCAAATAGTTATAGATTTCATGCTCACACATGCTCATTAGATGTGTACATACTTTACTTACCCAAATCTATTTTCTCGCAAAGATTTTGATGGTAAAGCTGATTTGGTTCTATTGAACTAAATCAAACGAGTTTCAGACTGAGTGATTCTAATCCGGCCCATTAGCCCCTAAACAGACCCACTAATTACGCAGCTTTTAATAGAGTAATTACACCTAGTTTACCCACTAAACCACTAAGCACTAATTATCTCACAATCTAATGAGCTTCCCTCGTAATTACTTGGGCTTTCACTCTACCATTTATTTGTAACAGTCAAGTCTCTACTGTCTCTATATAAACTCTCTAAAGTTAACACACAATTCTCATCACAAACAAATCAACCAAAGCAACTTCTACTCTTTCTTCTTTCGACCTTATCAATCTGTTGAGAA（SEQ IDNO：18）
设计的AtEC1启动子序列的同源重组引物为：
AtEC1-promoter-FP：5`-atcatcaggtcgacgGATGAAGCAGCTGGTCCAATTG-3`（SEQ IDNO：19）
AtEC1-promoter-RP：5`-gccattatctgccatTTCTCAACAGATTGATAAGGTCGAAA-3`（SEQID NO：20）
以拟南芥的基因组DNA模板，以上面设计的引物进行PCR扩增得到AtEC1基因的启动子片段。
PCR反应体系为：DNA模板：1μL；上下游引物：各2μL；KOD-ONE高保真酶MIX：25μL；补ddH2O至50μL。
高保真PCR反应条件为：98℃3分钟；94℃10秒，60℃15秒，68℃15秒，共30个循环；68℃8分钟。
PAR基因CDS序列为：
ATGGCAGATAATGGCAACACCGGCCGTCAAAAGGATGACGACGGTGGCCATGATGGACCACGCCAAAACCCAACTACTCCACCCTCCCCTTCCCGCACCCCTCGAAGACCAAGGCGGAACACATCACCGCCCAAACATTCTCCGGGGGCGTCTTCAAGCACCATGCCAGCGCCGCCTACTCCCCCTGCGCCGACGGGAATCACCGGTGCTTCTAGTTCTTCTGTGGGTACTAATATAATTTCATTTATTCCACCCAAAACCAAAAGAACGAAGTCGGTGATCTGCCCGATCTGCAACAAAGATATGTGCCATGAGAAGGCGCTGTGTGGCCACATCCGGTGGCATACACAGGAGGAAAGATTGGCGGCCAGCATCGCTATAGCAAGAGCGCTATCTTCTAACGTTGTTGTTTCTGGCAATGGCGATGAAGATGAAGGTCCATCTAAAAAGTATAAACTCCCGGACCTGAACAAATCTCCACCGCCGGAGGAGGAGGACGAGGACGCTGCCTGA（SEQ ID NO：1）
设计的PAR基因CDS序列的同源重组引物为：
PAR-FP：5`-tcaatctgttgagaaATGGCAGATAATGGCAACACCG-3`（SEQ ID NO：21）
PAR-RP：5`-aatgtttgaacgatcTCAGGCAGCGTCCTCGTC-3`（SEQ ID NO：22）
以蒲公英的cDNA为模板，以上面设计的引物进行PCR扩增得到蒲公英PAR基因DNA片段。
PCR反应体系为：DNA模板：1μL；上下游引物：各2μL；KOD-ONE高保真酶MIX：25μL；补ddH2O至50μL。
高保真PCR反应条件为：98℃3分钟；94℃10秒，60℃15秒，68℃15秒，共30个循环；68℃8分钟。
NOS终止子DNA序列为：
GATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGGTGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATC（SEQ ID NO：23）
设计的NOS终止子序列同源重组引物为：
NOS-FP：5`-gaggacgctgcctgaGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTT-3`（SEQ ID NO：24）
NOS-FP：5`-gagctcggtaccaagGATCTAGTAACATAGATGACACCG-3`（SEQ ID NO：25）
以pC1300-Cas9载体为DNA模板，以上面设计的引物进行PCR扩增得到NOS终止子片段。
PCR反应体系为：DNA模板：1μL；上下游引物：各2μL；KOD-ONE高保真酶Mix：25μL；补ddH2O至50μL。
高保真PCR反应条件为：98℃3分钟；94℃10秒，60℃15秒，68℃15秒，共30个循环；68℃8分钟。
将扩增得到的AtEC1基因的启动子片段、PAR基因DNA片段及NOS终止子片段通过同源重组连接到BamHI酶切线性化的pC1300-Cas9载体中，构建pC1300-Cas9-PAR载体。
同源重组反应体系为：AtEC1基因的启动子片段：50ng；PAR基因DNA片段：50ng；NOS基因的终止子片段：50ng；线性化的pC1300-Cas9载体：100ng；全式金2XBasic AssemblyMix：5μL；补ddH2O至10μL；反应体系为50℃，30分钟。
1.3 多个gRNA的串联及最终双元表达载体的构建：
利用BglII和BamHI，NheI和XbaI，SalI和XhoI是同尾酶的特性，进行gRNA的聚合：SK-gRNA REC8用KpnI和SalI进行酶切，提供REC8 gRNA片段；SK-gRNA OSD1用XhoI和XbaI酶切提供OSD1 sgRNA片段；SK-gRNA PAIR1用NheI和BamHI酶切提供PAIR1 sgRNA片段；pC1300-Cas9-PAR载体使用BamHI和KpnI酶切线性化。
将酶切好的REC8 gRNA片段、OSD1 sgRNA片段和PAIR1 sgRNA片段回收后使用T4连接酶连接到BamHI和KpnI酶切线性化的pC1300-Cas9-PAR载体上，构建pC1300-Cas9-PAR-gRNA-REC8-gRNA-OSD1-sgRNA-PAIR1载体，用于转化水稻愈伤组织。
2. 转基因植株的获得。
将双元表达载体pC1300-Cas9-PAR- gRNA-REC8-gRNA-OSD1-sgRNA-PAIR1通过电击的方法转入农杆菌株系EHA105中，利用农杆菌介导法将此双元表达载体转入水稻嘉丰优2号和水稻嘉丰优3号的愈伤组织中。转化的具体方法是将杂交稻嘉丰优2号和水稻嘉丰优3号的胚使用84灭菌后，接种到诱导愈伤组织的培养基中。培养15天后，挑选生长旺盛的，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。用含有pC1300-Cas9-PAR- gRNA-REC8-gRNA-OSD1-sgRNA-PAIR1质粒的EHA105菌株侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织和转基因植株。挑选在潮霉素选择培养基上正常生长的转基因植株。
3. 测序鉴定三基因突变体及同时成功异位表达PAR基因的T0代转基因植株。
3.1 利用分子生物学手段鉴定目的基因突变情况，CTAB法提取单株转基因水稻基因组DNA，PCR扩增目的条带。所用引物如下：
REC8-1FP：5`-CTCGCTCATCCATTCCCTCC-3`（SEQ ID NO：26）
REC8-1RP：5`-CCGAGACACATCATCTGCGA-3`（SEQ ID NO：27）
OSD1-1FP：5`-GGAAGAGGCAGGAGCCAAAT-3`（SEQ ID NO：28）
OSD1-1RP：5`-TCACCTTGACGACTGACGTG-3`（SEQ ID NO：29）
PAIR1-1FP：5`-TGCAATTGACACCCACCCTT-3`（SEQ ID NO：30）
PAIR1-1RP：5`-GCCTCCTTCATGGCTCTGTT-3`（SEQ ID NO：31）
得到的PCR产物送测序公司，分别用REC8-1FP、OSD1-1FP和PAIR1-1FP作为测序引物测序。所得结果与野生型序列进行对比。测序结果为双峰的，用简并密码子策略分析（http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/），直接获得突变信息。从中筛选出三个基因都为双等位突变的三突变体。
3.2 利用分子生物学手段鉴定转基因水稻是否含有PAR基因，引物PAR-1FP和PAR-1RP分别位于AtEC1基因的启动子序列和PAR基因的CDS序列上，只有在成功转入了pC1300-Cas9-PAR-gRNA-REC8-gRNA-OSD1-sgRNA-PAIR1载体的转基因植株中才能扩增出大小为702bp的条带。具体的电泳图参见图1和图2。
PAR-1FP：5`-GGCCCATTAGCCCCTAAACA-3`（SEQ ID NO：32）
PAR-1RP：5`-CGCCATTGCCAGAAACAACA-3`（SEQ ID NO：33）
3.3 将筛选到的REC8、OSD1和PAIR1三个基因都为双等位突变的三突变体以及PAR基因成功异位表达的转基因杂交水稻套袋自交，收获自交结实种子。将自交结实种子进行种植，通过观察植株表型是否分离来初步判断杂种优势固定是否成功。
通过对嘉丰优2号的父本P025和母本嘉禾212A、杂交种嘉丰优2号以及固定嘉丰优2号杂种优势后的3个单株、嘉丰优3号的父本G1143和母本嘉禾112A、杂交种嘉丰优3号以及固定嘉丰优3号杂种优势后的3个单株进行全基因组重测序，鉴定嘉丰优2号和嘉丰优3号中存在的杂合位点是否分离，以此准确判断杂种优势固定的二倍体诱导率。
4. 结果及分析
4.1 由图3可以看出，对嘉丰优2号、父本P025、母本嘉禾212A以及杂种优势固定后的植株进行高通量基因组重测序后发现，杂种优势固定后的植株的基因组和嘉丰优2号的基因组相一致，均一半来自父本P025一半来自母本嘉禾212A，后代基因型没有分离，成功地固定了F1的杂合基因型，固定了杂种优势。
嘉丰优2号自交共获得300粒种子，将这些种子种植在田间，通过观察没有发现表型的分离，其中二倍体株系的结实率基本恢复到和野生型一致的水平，为78%-89%，与杂交稻的正常结实率一致，四倍株系的结实率较差，为5%左右。对其中的二倍体植株进行全基因组测序，结果显示检测二倍体植株与嘉丰优2号的基因型一致，为杂交稻。仍存在部分四倍体植株，通过统计显示300株植株中二倍体植株有171，四倍体植株有129株，二倍体诱导率为57%。
4.2 由图4可以看出，对嘉丰优3号、父本G1143、母本嘉禾112A以及杂种优势固定后的植株进行高通量基因组重测序后发现，杂种优势固定后的植株的基因组和嘉丰优3号的基因组相一致，均一半来自父本G1143一半来自母本嘉禾112A，后代基因型没有分离，成功的固定了F1的杂合基因型，固定了杂种优势。
嘉丰优3号自交共获得300粒种子，将这些种子种植在田间，通过观察没有发现表型的分离，其中二倍体株系的结实率基本恢复到和野生型一致的水平，结实率为78%-89%，与杂交稻的正常结实率一致，四倍株系的结实率较差，为5%左右。对其中的二倍体植株进行全基因组测序，结果显示检测到的5株二倍体植株与嘉丰优3号的基因型一致，为杂交稻。仍存在部分四倍体植株，通过统计显示300株植株中二倍体植株有183，四倍体植株有117株，二倍体诱导率为61%。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，包括：
（1）将PAR基因和核酸片段转化到杂交水稻种子中，得到T0代植株；
（2）筛选出REC8、OSD1和PAIR1三个基因均为双等位突变的三突变体以及PAR基因成功异位表达的T0代植物套袋自交，收获自交种子；
所述PAR基因的CDS序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
所述核酸片段用于靶向敲除REC8基因、OSD1基因及PAIR1基因；
所述靶向敲除REC8基因的位点选自SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的第21-23位；
所述靶向敲除OSD1基因的位点选自SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的第21-23位；
所述靶向敲除PAIR1基因的位点选自SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的第21-23位。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PAR基因和核酸片段是以表达载体的形式提供的，所述表达载体进一步包括：
PAR基因的启动子和PAR基因的终止子，所述PAR基因的启动子和PAR基因的终止子与所述PAR基因相连；
所述PAR基因的启动子选自AtEC1启动子；
所述PAR基因的终止子选自NOS终止子和/或35S终止子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PAR基因和核酸片段分别独立地存在于至少两个表达载体上。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸片段包括：
编码第一gRNA的核酸片段及其互补片段，所述第一gRNA用于靶向敲除REC8基因；
编码第二gRNA的核酸片段及其互补片段，所述第二gRNA用于靶向敲除OSD1基因；
编码第三gRNA的核酸片段及其互补片段，所述第三gRNA用于靶向敲除PAIR1基因；
编码Cas9蛋白的核酸片段。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PAR基因和核酸片段是以重组菌的形式提供的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组菌选自农杆菌。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）包括：
将含有PAR基因和核酸片段的重组菌侵染杂交水稻种子的愈伤组织；
将侵染后的愈伤组织进行培养，收集抗性愈伤组织；
将所述抗性愈伤组织进行培养，得到T0代植株。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）包括：
提取步骤（1）所得T0代植株的基因组DNA；
对所述基因组DNA中的REC8基因、OSD1基因、PAIR1基因、PAR基因的启动子、PAR基因的CDS序列进行扩增，得到扩增产物；
对所述扩增产物进行测序，对测序结果进行分析；
选择同时满足下列要求的植株作为目标植株：
A、所述扩增产物中含有所述启动子和PAR基因的CDS序列所对应的植株；
B、所述测序结果中REC8、OSD1和PAIR1三个基因均为双等位突变的三突变体所对应的植株。
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