CN117947046A - 一种水稻雄性不育基因chr5及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻雄性不育基因CHR5及其应用，属于分子育种领域。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对CHR5外显子进行定点敲除获得了雄性不育系。chr5突变材料纯合致死，正反交实验表明，chr5杂合突变体为父本时无法产生杂合基因型的后代。在CHR5的RNAi干扰株系中，花粉育性和萌发率显著降低，花粉管无法伸长至胚囊，结实率显著下降，表明该基因是雄性不育基因。利用该基因可创制水稻雄性不育系，丰富不育系资源，服务于杂交育种。

Description

一种水稻雄性不育基因CHR5及其应用

技术领域

本发明属于水稻分子育种领域，具体涉及一种水稻雄性不育基因CHR5及其应用。

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物，随着人口的逐步增加，对水稻产量的需求也日益上涨，杂交稻的高产量在农业生产和保障国家粮食安全上具有重要意义。

杂交稻(hybrid rice)是利用杂种优势，选用两个在遗传上有一定差异，同时它们的优良性状又能互补的水稻品种进行杂交，生产在生活力、生长发育速度、抗逆性以及形态大小等方面明显优于杂交双亲的杂交种。然而，杂种后代会出现性状分离，丧失杂种优势，因此杂交稻需要年年制种，同时水稻属于自花授粉植物，这为杂交制种又带来了困难。目前生产上采用三系法进行水稻杂交制种，通过利用雄性不育系花粉不育但雌蕊正常的水稻，人工授粉恢复系的花粉获得育性恢复的杂种后代，从而获得杂种优势，而通过将不育系与保持系杂交而获得雄性不育的后代。三系法需配套保持系、不育系和恢复系，因此水稻不育系的发掘和利用对三系杂交稻的发展具有重要意义。

发明内容

针对目前杂交育种需要的不育系材料，本发明发现水稻雄性不育基因CHR5，并利用日本晴为代表性水稻品种，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对CHR5基因进行编辑，可获得水稻雄性不育系。

为了实现上述之发明目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种水稻雄性不育基因CHR5，所述水稻雄性不育基因CHR5的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述水稻雄性不育基因CHR5的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第二方面，本发明还提供了一种水稻雄性不育蛋白CHR5，所述水稻雄性不育蛋白CHR5的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

第三方面，本发明还提供了上述第一方面或第二方面所述的水稻雄性不育基因CHR5或水稻雄性不育蛋白CHR5的应用，所述应用为以下任一，

a)水稻花粉育性调控或育性机制研究；

b)水稻雄性不育系的培育；

c)水稻杂种优势的利用。

第四方面，本发明还提供了一种培育水稻雄性不育系的方法，所述方法包括，敲除、改变或抑制所述的基因CHR5，使得常规水稻品种中的基因CHR5表达水平降低或蛋白CHR5丧失活性，进而获得水稻雄性不育株系。

进一步的，所述改变为采用CRISPR-CAS9基因编辑技术对权利要求1或2所述的基因CHR5进行定点缺失。

进一步的，所述基因CHR5的编辑靶点的合成引物序列为SEQ ID NO.4-7。

进一步的，所述定点缺失的位点为SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第10266bp-10268bp或第10266bp-10272bp。

进一步的，所述抑制为采用RNA干扰技术使基因CHR5的表达沉默，所述CHR5基因干扰片段引物的扩增引物序列为SEQ ID NO.8-9、SEQ ID NO.10-11。

第五方面，本发明还提供了一种水稻雄性不育系在水稻制种中的用途，以权利要求5-9任一获得的水稻雄性不育株系作为母本，配合具有杂交优势的父本，生产杂种F1代，进行杂交育种。

本发明相对于现有技术而言，发现了水稻雄性不育基因CHR5，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和RNAi基因干扰技术获得的突变株和沉默株系，它们均表现出花粉萌发率显著降低，且导致花粉管伸长受损。同时，利用日本晴为代表性水稻品种，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对CHR5基因进行编辑，可获得水稻雄性不育系。利用该基因可创制水稻雄性不育系，丰富不育系资源，服务于杂交育种。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

本发明中所述术语“转化”指将编码基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。

本发明中所述术语“CRISPR/Cas9基因编辑技术”是指由Cas9蛋白和gRNA共同构成的基因编辑系统，Cas9蛋白包含两个主要的核酸酶结构域——RuvC结构域和HNH结构域，前者切割非互补DNA链，后者切割互补DNA链；gRNA是起支架功能的反式激活的crispr RNA(tracrRNA)与特异性的crispr核糖核酸(crRNA)结合形成的嵌合RNA，用于将Cas9导向其靶标。

附图说明

图1为本发明通过基因编辑技术产生的chr5突变体，最终获得两种转基因突变材料chr5-20和chr5-20/-21，其中chr5-20/-21转基因材料为一个等位基因发生chr5-20基因编辑类型突变，而另一个等位基因发生chr5-21基因编辑类型突变。

图2为野生型和chr5突变体花粉活力和萌发率的统计，结果显示CHR5的突变导致花粉萌发率显著降低。

图3为野生型和chr5突变体花粉管伸长的统计，结果显示CHR5的突变导致花粉管伸长受损。

图4为CHR5干扰株系CHR5基因表达量的鉴定及其农艺性状的统计，包括株高、穗长、一次枝梗数、二次枝梗数和每穗结实率。

图5为野生型和CHR5干扰株系花粉活力及花粉萌发率的统计，结果显示CHR5基因的沉默导致花粉萌发率显著降低。

图6为野生型和CHR5干扰株系花粉管伸长的统计，结果显示CHR5基因的沉默导致花粉管伸长受损。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1、对水稻CHR5基因序列设计CRISPR/Cas9基因编辑靶点，以pCBC-MT1T2为模板进行四引物PCR扩增，合成编辑靶点的引物核苷酸序列如表1所示，经过PCR扩增得到片段后与Cas9载体pHUE411片段进行连接反应，构建水稻CHR5基因编辑载体。

表1CHR5基因靶点引物

3、选取测序验证正确的CHR5基因编辑载体单克隆，提取其质粒用于转化农杆菌EHA105，通过农杆菌介导的水稻遗传转化获得转基因植株。

4、提取转基因植株的DNA，利用OsCHR5-CRISPR-target-F和OsCHR5-CRISPR-target-R扩增包含编辑靶点的片段，送公司进行测序，对突变类型进行鉴定。如图1所示，最终获得两种转基因突变材料chr5-20和chr5-20/-21，其中chr5-20/-21转基因材料为一个等位基因发生chr5-20基因编辑类型突变，而另一个等位基因发生chr5-21基因编辑类型突变。

实施例2

在水稻成熟时期，将chr5突变体chr5-20/-21分别作为父本和母本与野生型进行杂交，对获得的F1代杂合体进行基因型鉴定，分离比如表2所示。结果显示，chr5杂合突变体为父本时无法产生chr5-21杂合基因型的后代。

表2

实施例3

对chr5突变体的花粉活力、花粉萌发率以及花粉管伸长的鉴定。在花粉成熟后和散粉前，取花粉进行碘染，分别进行败育率和萌发率的统计。对人工授粉及自花授粉的柱头进行固定，进行苯胺蓝染色，对花粉管伸长进行统计。结果如图2-3所示，CHR5的突变导致花粉萌发率显著降低，且导致花粉管伸长受损。

实施例4

对水稻CHR5基因干扰片段设计引物，序列如表3，经过PCR扩增得到片段后与线性化的pTCK303质粒相连接，两个反向的片段形成发夹结构以产生双链RNA，从而引起RNAi效应。

表3CHR5基因干扰片段引物

选取测序验证正确的RNA干扰载体单克隆，提取其质粒用于转化农杆菌EHA105，通过农杆菌介导的水稻遗传转化获得转基因植株。

提取转基因植株的RNA并进行反转录得到cDNA，利用OsCHR5-RT-F和OsCHR5-RT-R通过实时荧光定量对CHR5的表达水平进行鉴定，引物见表4。

表4CHR5转基因植株鉴定引物

根据表达量敲低程度选择三个单株R2、R7、R20，表达量如图4所示，对这三个单株的农艺性状进行统计，分别对株高、穗长、一次枝梗数、二次枝梗数和每穗结实率进行测量。结果如图4所示，发现与野生型相比，干扰株系的株高降低，穗长变短，一次枝梗数和二次枝梗数减少，结实率显著降低。

实施例5

对干扰株系R2、R7、R20花粉活力、花粉萌发率以及花粉管伸长的鉴定。在花粉成熟后和散粉前，取花粉进行碘染，分别进行败育率和萌发率的统计。对人工授粉及自花授粉的柱头进行固定，进行苯胺蓝染色，对花粉管伸长进行统计。结果如图5-6所示，CHR5基因表达的沉默导致水稻花粉萌发率显著降低，花粉管无法伸长至胚囊，导致植株的雄性不育。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

Claims (10)

1.一种水稻雄性不育基因CHR5，其特征在于，所述水稻雄性不育基因CHR5的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的水稻雄性不育基因CHR5，其特征在于，所述水稻雄性不育基因CHR5的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种水稻雄性不育蛋白CHR5，其特征在于，所述水稻雄性不育蛋白CHR5的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求1-2任一所述的水稻雄性不育基因CHR5或权利要求3所述的水稻雄性不育蛋白CHR5的应用，其特征在于，所述应用为以下任一，

a)水稻花粉育性调控或育性机制研究；

b)水稻雄性不育系的培育；

c)水稻杂种优势的利用。

5.一种培育水稻雄性不育系的方法，其特征在于，所述方法包括，敲除、改变或抑制权利要求1或2所述的基因CHR5，使得常规水稻品种中的基因CHR5表达水平降低或蛋白CHR5丧失活性，进而获得水稻雄性不育株系。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述改变为采用CRISPR-CAS9基因编辑技术对权利要求1或2所述的基因CHR5进行定点缺失。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以pCBC-MT1T2为模板进行编辑靶点的四引物PCR扩增，所述四引物序列如SEQ ID NO.4-7所示。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述定点缺失的位点为SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第10266bp-10268bp或第10266bp-10272bp。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抑制为采用RNA干扰技术使基因CHR5的表达沉默，所述CHR5基因的干扰片段的扩增引物序列为SEQ ID NO.8-9、SEQ ID NO.10-11。

10.一种水稻雄性不育系在水稻杂种优势利用中的应用，其特征在于，

以权利要求5-9任一获得的水稻雄性不育株系作为母本，配合具有杂交优势的父本，生产杂种F1代，进行杂交育种。