CN115747252A - 一种基于基因编辑技术创制水稻新型两系不育系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于基因编辑技术创制水稻新型两系不育系的方法，属于基因工程领域和作物遗传育种领域。本发明方法为利用CRISPR/Cas9技术定点编辑两系不育系水稻中控制籼粳杂种胚囊败育基因S5，通过造成S5的移码突变，敲除水稻S5基因。本发明克服了水稻籼粳亚种间杂种的不育性，使得籼粳稻亚种杂交的杂种优势在杂交水稻中的应用成为可能，具有良好的开发和运用前景。

Description

一种基于基因编辑技术创制水稻新型两系不育系的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域和作物遗传育种领域，涉及一种基于基因编辑技术创制水稻新型两系不育系的方法。

背景技术

水稻是世界上最主要的粮食作物之一，也是我国最重要的粮食作物。随着人口的不断增加，耕地面积不断减少，如何提高水稻产量已成为学者们亟待解决的问题。1987年，袁隆平提出了杂交水稻的战略规划，以光温敏核不育水稻(以下简称“两系不育系”)为基础的两系法杂交水稻研究迅速展开，在两系杂交稻的选育、推广及应用上取得了重大突破。但杂交水稻的配制主要以亚种内杂交——籼籼杂交为主，而亚种间杂交一直未突破。籼稻和粳稻杂交产生的F1后代具有较强的杂种优势，主要表现在植株高大、根系发达、分蘖旺盛等方面；但是由于籼稻和粳稻之间存在生殖隔离，导致杂种F1的小穗育性很低，进而阻碍了亚种间杂种优势的利用，这也是两系法无法突破亚种杂交的原因之所在。

在“两系法”中，培育具有优良性状的不育系为杂交水稻的核心及重难点，其中分子标记辅助选择发挥着重要作用。分子标记辅助选择是利用与目的基因紧密连锁或者共分离的分子标记来选择个体。通过系统自交和回交，利用分子标记在分子水平确定材料中是否含有所需的目的基因，从而使供体染色体片段渗入到受体亲本，是将分子标记应用于作物品种改良过程中进行选择的一种有效手段。传统的水稻育种通过观察表型间接选择基因型，育种时间长且还受诸多因素的影响，具有盲目性和不可预测性；而分子标记辅助选择不受其他基因效应和环境因素的影响，是对目标性状在分子水平上的一种选择，选择结果可靠，但这些材料常常会含有较多的不利基因，有些甚至与目标基因连锁，通过常规的方法很难打破连锁。但这些材料常常会含有较多的不利基因，有些甚至与目标基因连锁，通过常规的方法很难打破连锁。

CRISPR-Cas9基因编辑技术能直接对目标性状的基因进行修饰，操作简单、敲除效率高、育种周期短，能大幅度提高目标性状聚合的精准度，从而加快育种进程。目前，利用CRISPR/Cas9技术在改良水稻产量、品质、抗性、育性、株型等重要性状方面已取得重要进展。基因编辑技术应用于作物遗传改良，主要是通过靶基因的定点突变造成基因功能缺失以实现性状改良，故敲除的基因必须都是目标性状负调控基因。S5是控制籼粳杂种F1雌配子败育的代表性位点，其编码一种天冬氨酸蛋白酶，而广亲和品种S5-n在编码区5’端缺失了136bp导致信号肽缺失，从而引起蛋白定位发生改变以及功能的丧失。通过对两系不育系S5位点的基因编辑，使其与籼稻、粳稻杂交的F1都正常可育，从而在两系不育系配组中能够利用亚种间的杂种优势。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种基于基因编辑技术创制水稻新型两系不育系的方法，以克服水稻籼粳亚种间杂种的不育性，从而利用籼粳亚种间强大的杂种优势提高水稻产量。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种基于基因编辑创制水稻新型两系不育系的方法，为利用CRISPR/Cas9技术定点编辑两系不育系水稻中控制籼粳杂种胚囊败育基因S5，通过造成S5的移码突变，敲除水稻S5基因，获得具有广亲和特性的两系不育系水稻。

进一步地，所述的基于基因编辑创制水稻新型两系不育系的方法，包括如下步骤：针对两系不育系S5基因的信号肽编码区域设计两对靶点，构建含有靶点序列的pCRISPR/Cas9-S5-gRNA重组表达载体，将重组表达载体利用农杆菌介导的方法转化水稻两系不育系，使两系不育系中的S5基因的信号肽缺失或使该基因的功能丧失，从而获得具有广亲和特性的两系不育系水稻。

进一步地，所述的两系不育系为Bph68S。

进一步地，所述的两对靶点分别为靶点1和2、靶点3和4，其序列分别为：

1)靶点1：TACTCAGGGGCAGGATTCGT，

2)靶点2：GTAGCAGCTGCAGCTGCAAC；

3)靶点3：AGTCATTGTTACTCAGGGGC，

4)靶点4：GGGACACTCCAACTCGTCGT。

通过上述方法得到具有广亲和特性的两系不育系水稻可作为母本与具有优良性状的两系恢复系父本配成两系杂交水稻组合，进行杂交制种。所述的两系恢复系父本包括9391、7375武科粳、南粳83111、南粳83043、金香玉1号、宁香粳11。

一种使水稻S5基因信号肽缺失或使水稻S5基因功能丧失的基因编辑位点，为靶点1和2、靶点3和4，其序列分别为：

1)靶点1：TACTCAGGGGCAGGATTCGT，

2)靶点2：GTAGCAGCTGCAGCTGCAAC；

3)靶点3：AGTCATTGTTACTCAGGGGC，

4)靶点4：GGGACACTCCAACTCGTCGT。

上述因编辑位点可用于制备杂交水稻两系不育系材料。

传统的水稻育种往往以依赖于表型选择和育种家经验，育种周期长、选择效率低下。本发明利用基因编辑技术定向改良水稻育性，大大地缩短了育种周期，提高了育种效率，同时为选育水稻新种质提供了强有力的技术支撑。

通过本发明克服了水稻籼粳亚种间杂种的不育性，所得籼粳交F1代植株的结实率超过了80％。本发明使得籼粳稻亚种杂交的杂种优势在杂交水稻中的应用成为可能，具有良好的开发和运用前景。

附图说明

图1是Bph68S的S5位点基因型鉴定。

图2是pYLCRISPR/Cas9-S5-gRNA载体构建。A，pYLCRISPR/Cas9-S5-gRNA载体构建示意图；B，S5基因结构和靶点序列；C，sgRNA表达盒的扩增；D，PCR扩增鉴定阳性S5敲除载体。

图3是CRISPR/Cas9系统诱导的S5突变体。其中，#B-1～B-13为T0代单株；PAM结构以绿色字体表示，红色字体显示的插入突变或缺失突变，蓝色表示信号肽编码序列，黄色表示起始密码子。WT，野生型；Bi.M，双等位突变；Ho.M，纯合突变；Het，杂合突变。

图4是Bph68S与Balilla杂交F1代的育性。

图5是亲本及F1的植株形态比较。从左到右、从上到下依次为Bc-1与9391、7375武科粳、南粳83111、南粳83043、金香玉1号、宁香粳11的组合。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

1、两系不育系母本的基因型鉴定

水稻第六号染色体上的S5位点，由3个紧密连锁的基因组成：ORF3、ORF4、ORF5。ORF5编码一种天冬氨酸蛋白酶，籼稻和粳稻存在两个核苷酸的差异，但都定位细胞壁；ORF4编码一个未知蛋白，粳稻ORF4定位于细胞膜和高尔基体，籼稻ORF4由于11bp缺失导致提前终止而定位于内质网；ORF3编码一个HSP70，粳稻的ORF3与籼稻ORF3相比在终止密码子前缺失了13bp导致翻译提前终止，两者都定位于内质网。因此将籼稻ORF5表示为有功能的ORF5+，粳稻表示为ORF5-；粳稻的ORF4表示为有功能的ORF4+，籼稻的表示为ORF4-；籼稻的ORF3表示为有功能的ORF3+，粳稻的表示为ORF3-。ORF5被认为是“killer”，ORF4是其“partner”，ORF3是“protector。当ORF5+和ORF4+同时存在并且ORF3为ORF3-时会杀死配子，但如果存在ORF3+，则配子存活。因此，期望通过破坏籼稻ORF5+的功能，使其失去“killer”的作用。

通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov/)获得S5位点(EU889295、JX138498、JX138499、JX138502、JX138503、EU889293、EU889294)的基因序列，根据等位基因的序列差异设计针对ORF3、ORF4、ORF5的特异性引物3-F/3-R、4-F/4-R、5-F/5-R进行扩增。

3-F：GAGCACATCAAGGAGCAGCAT，

3-R：TCGTCGTAGCCAAAGCATAAG；

4-F：GTCGTGGCTGCTCCTCCTTGTGCT，

4-R：GCTGGACTGAAGAAGATGTGGTAG；

5-F：CTGCCCCTGAGCAAGCAAGAAAG，

5-R：ATGTGTAGGATCTGCCGGGATCGA。

采用CTAB法提取两系不育系叶片的基因组DNA：将叶片剪碎放至2mL EP管中，加入100μL CTAB溶液，每管中加入一粒钢珠后磨样1min；加入700μL CTAB溶液，剧烈摇晃混匀后放入65℃水浴锅中水浴1h，期间每15min进行一次混匀；加入500μL氯仿摇匀，12000rpm离心10min；吸取上清转移至新的EP管中，并加入700μL异丙醇，于-20℃沉淀30min，12000rpm离心10min；弃尽上清，加入500μL 75％乙醇溶液，12000rpm离心10min；待乙醇挥发完后，加入50μL ddH₂O溶解DNA。

对10种两系不育系(培矮64S、K7S、8801S、1892S、57-4S、Bph68S、W6154S、W7415S、5460S、8902S)的S5位点中ORF5的基因型进行扩增并测序。测序结果表明，培矮64S和1892S扩增片段长度为938bp，即存在136bp缺失的为含有广亲和基因S5-n；而K7S、8801S、57-4S、Bph68S、W6154S、W7415S、5460S、8902S扩增片段大小为1074bp为S5-i。

以基因型为S5-i的不育系Bph68S为例作为母本，对Bph68S的ORF3和ORF4基因进行鉴定，测序结果表明Bph68S在S5位点处的基因型为：ORF3+/ORF4-/ORF5+。如图1所示为Bph68S与广亲和品种S5-n的序列对比，Bph68S在ORF5处不存在136bp的缺失，可对该材料的ORF5基因进行编辑使其信号肽缺失或功能丧失。

2、基于pYLCRISPR/Cas9系统的S5敲除表达载体的构建

(1)S5基因敲除靶点的设计。ORF5编码一种天冬氨酸蛋白酶，该蛋白N端的28个氨基酸残基编码信号肽，介导ORF5入核发挥功能；而广亲和品种由于缺失了N端的信号肽，导致亚细胞定位的错误不能入核，最终定位在细胞质中，不能正常发挥其功能。因此，本实施例期望通过多靶点sgRNAs的设计策略敲除N端的信号肽。针对ORF5第一个外显子即信号肽编码序列区域设计打靶位点，一个位点在ATG的上游，另一位点靠近信号序列末端，从而使缺失片段的大小尽可能接近S5-n的缺失片段。敲除靶点的选择设计根据以下原则：敲除的片段大小尽可能贴近N端的136bp缺失；Off-target<0.6且越低越好；GC含量在50％-70％之间；且同源序列的下游靶点位于CDS区域的原则，最终设计了如图2B所示的两对(T1T2和T3T4)靠近MHSs(microhomologous sequences,MHSs)的靶点：

1)Target1(T1)：TACTCAGGGGCAGGATTCGT，

2)Target2(T2)：GTAGCAGCTGCAGCTGCAAC；

3)Target3(T3)：AGTCATTGTTACTCAGGGGC，

4)Target4(T4)：GGGACACTCCAACTCGTCGT。

根据上述4个靶点，设计靶点接头引物，如下表所示：

(2)基因表达载体的构建。利用边切边连的方法，先通过Overlapping PCR往sgRNA表达盒导入靶序列，扩增序列的大小分别为831bp、515bp、924bp和603bp，再利用GoldenGate克隆方法装载多个sgRNA表达盒组装到多克隆位点Bsa I位于靠近RB的双元载体pYLCRISPR/Cas9上。设计的扩增引物如下：

其中，Pps-GGL/Pgs-GG2、Pps-GG2/Pgs-GG3、Pps-GG3/Pgs-GG4、Pps-GG4/Pgs-GGR引物对扩增相应的U#-T1-gRNA、U#-T2-gRNA、U#-T3-gRNA、U#-T4-gRNA，其中T1为靶序列1，T2为靶序列2，T3为靶序列3，T4为靶序列4；U#为各启动子。

1)第一轮PCR：

每个sgRNA表达盒分别用一个PCR反应，在一个反应中使用4种引物：U-F和gRT#和U#T#-和gRT#+；即扩增OsU6a用引物U-F和gRT1和OsU6aT1和gR-R，扩增OsU6b用引物U-F和gRT2和OsU6bT2和gR-R，扩增OsU3用引物U-F和gRT3和OsU3T3和gR-R，扩增OsU6c用引物U-F和gRT4和OsU6cT4和gR-R。

反应程序：94℃，15s；58℃，15s；72℃，20s，扩增30个循环。

2)分别取1μL第一轮的PCR产物作为本轮PCR扩增的模板，每个靶点设置50μL的PCR扩增体系，加入终浓度为0.15μM的每种引物组合工作液(Pps-GGL/Pgs-GG2，Pps-GG2/Pgs-GG3，Pps-GG3/Pgs-GG4，Pps-GG4/Pgs-GGR分别为一组引物对)。

反应程序：94℃，5min；94℃，15s；58℃，15s；72℃，20s，扩增30个循环；72℃，5min。

取2-3μL产物通过琼脂糖凝胶电泳检查表达盒是否构建成功，其中OsU6a-gRNA、OsU6b-gRNA、OsU6c-gRNA、OsU3-gRNA的表达盒PCR扩增的长度分别为831bp、515bp、924bp和603bp，如图2C所示。

3)Golden Gate cloning策略组装sgRNA表达盒到pYLCRISPR/Cas9载体(ACCESSION:AF234296)：双元载体与sgRNA表达盒的酶切-连接反应。

酶切酶连体系(15μL)

变温循环酶切连接：3个循环(37℃，10min；10℃，5min；20℃，5min)；10个循环(37℃，3min；10℃，5min；20℃，5min)；最后37℃，5min。

3)连接产物转化至大肠杆菌：将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养并挑取单克隆，用引物SP-L/SP-R(引物SP-L：GCGGTGTCATCTATGTTACTA，引物SP-R：CCGACATAGATGCAATAACTTC)扩增表达盒并电泳(如图2D所示)检测表达盒长度并测序。测序正确的菌液进行保存菌种，并扩大培养提取质粒，获得含有双靶点pYLCRISPR/Cas9-eui-gRNA表达载体，如图2A所示。

3、农杆菌介导的水稻遗传转化

(1)水稻愈伤组织的诱导和继代培养

将Bph68S的种子去壳，选取胚结构完整且无霉菌的米粒，置于无菌的锥形瓶中，分别做好标记；先用ddH₂O冲洗干净，接着用75％的乙醇冲洗5min；加入50mL灭菌的ddH₂O，洗涤5次；加入50mL灭菌的ddH₂O和终浓度0.15％的HgCl₂浸没米粒，摇晃均匀后静置15min，最后再用灭菌的ddH₂O，摇晃洗涤4～5次；在超净工作台上，用灭菌的镊子夹取米粒均匀摆放在诱导培养基上，用封口膜或封瓶膜封好；置于暗处29℃培养4周；当愈伤组织变得质地紧实、颜色亮黄、体积生长适中后进行继代培养。

(2)根癌农杆菌介导的水稻遗传转化

将实施例2中构建好的S5敲除载体通过电激法转化农杆菌(EHA105)；在无菌操作台上，将亮黄色有硬度的愈伤组织转入无菌三角瓶中，加入适量的农杆菌悬浮静置孵育20min；用无菌滤纸沥干愈伤组织后用镊子将其摆放在共培养培养基上；将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/L Hygromycin的筛选培养基上，筛选存活下来的愈伤组织，放于二次筛选培养基上；将经过二次筛选存活的愈伤组织，放于含有50mg/L Hygromycin的分化培养基上分化出小苗；当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右。

4、阳性转基因植株的鉴定及T0代突变情况分析

(1)阳性转基因植株的鉴定

本研究中S5敲除植株构建所用载体为潮霉素抗性的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H系列的双元载体，因此，通过PCR扩增和电泳检测水稻植株中是否含有潮霉素基因，以检测双元载体是否成功转入敲除植株内。为了验证转入载体的再生植株是否为阳性转基因植株，取分蘖盛期再生植株的叶片，用CTAB法提取基因组DNA，用潮霉素抗性基因HPT的特异性引物HPT-F：ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTG和HPT-R：TTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGA对植株DNA进行PCR扩增。结果表明，转基因阳性率为100％(13棵单株分别命名为B-1～B-13)。

(2)转基因T0代单株的突变分析

设计位于S5目标靶点两侧的引物F5/R11(引物F5：CTGCCCCTGAGCAAGCAAGAAAG，引物R11：ATGTGTAGGATCTGCCGGGATCGA)，对阳性植株进行PCR扩增并对其产物测序。测序结果显示，4株为野生型基因型，2株无法测序，3株突变发生在5’-UTR区域，另外4株发生了S5-i编码区的移码。从图3可以看出，B-1发生了杂合突变，B-2和B-11发生了双等位突变，B-3发生了纯合突变。

(3)T1代无转基因成分植株的筛选。

选取3个T0代单株(B-2、B-3和B-11)，自交繁殖获得到T1代转基因成分分离群体。用CTAB法提取水稻T1代转化植株叶片的基因组DNA，并以此为模板，再用潮霉素抗性基因特异性引物进行PCR扩增，不能扩增出目的条带的植株为不含转基因成分的突变株。结果显示，在B-3的23株T1子代中，不含潮霉素抗性基因的有8株，且该突变类型造成S5-i翻译的移码，破坏基因的功能，因此B-3认为是S5-i无功能的突变体家系。S5-n由于N端136bp缺失导致其功能丧失，以上8个突变株均在S5-i编码区突变造成的移码会使蛋白质的翻译提前终止而不能发挥其功能。因此，将上述8株纯合突变体的无转基因成分的植株，分别命名为Bc-1～Bc-8

5、杂种F1的结实率

前期实验我们发现Bph68S与Balilla杂交产生的F1花粉的育性及花粉萌发正常，但结实率很低，说明雌配子败育可能是造成小穗育性下降的原因，如图4所示。为了验证S5-i无功能突变的两系不育系在籼粳杂交稻中的潜在应用价值，在实验基地将4中的S5纯合突变体Bc-1与粳型恢复系父本(9391、7375武科粳、南粳83111、南粳83043、金香玉1号、宁香粳11)进行籼粳F1的配组，并考察F1的结实率。结果(图5)显示，实验组中籼粳F1普遍表现出植株高大、穗子变大等杂种优势，且结实率大多超过80％，优势较为明显。

由此说明，本发明提供的两系不育系的基因编辑方法能够提高“两系法”杂交水稻的育性，在提高育种效率中有较大的应用价值。

以基因型为S5-i的不育系K7S、8801S、57-4S、W6154S、W7415S、5460S或8902S为母本，参照上述实施例获得的S5纯合突变体与粳型恢复系父本进行籼粳组合F1的配制，最终得到的籼粳交F1代植株的结实率均低于以编辑后的Bph68S为母本配制的F1代植株。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一种基于基因编辑技术创制水稻新型两系不育系的方法

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

tactcagggg caggattcgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

gtagcagctg cagctgcaac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 3

agtcattgtt actcaggggc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 4

gggacactcc aactcgtcgt 20

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tactcagggg caggattcgt gttttagagc tagaaat 37

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgaatcctg cccctgagta cggcagccaa gccagca 37

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tagcagctgc agctgcaacg ttttagagct agaaat 36

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gttgcagctg cagctgctac aacacaagcg gcagc 35

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcattgtta ctcaggggcg ttttagagct agaaat 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcccctgagt aacaatgact gccacggatc atctgc 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggacactcca actcgtcgtg ttttagagct agaaat 36

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acgacgagtt ggagtgtccc tgagcctcag cgcag 35

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa gg 42

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agcgtgggtc tcgtcttcac tccatccact ccaagctc 38

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttcagaggtc tctaagactt tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agcgtgggtc tcgagtcctt tccatccact ccaagctc 38

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttcagaggtc tctgactaca tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

agcgtgggtc tcgaccgacg cgtatccatc cactccaagc tc 42

Claims (8)

1.一种基于基因编辑创制水稻新型两系不育系的方法，其特征在于，所述的方法为利用CRISPR/Cas9技术定点编辑两系不育系水稻中控制籼粳杂种胚囊败育基因S5，通过造成S5的移码突变，敲除水稻S5基因，获得具有广亲和特性的两系不育系水稻。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：针对两系不育系S5基因的信号肽编码区域设计两对靶点，构建含有靶点序列的pCRISPR/Cas9-S5-gRNA重组表达载体，将重组表达载体利用农杆菌介导的方法转化水稻两系不育系，使两系不育系中的S5基因的信号肽缺失或使该基因的功能丧失，从而获得具有广亲和特性的两系不育系水稻。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的两系不育系为Bph68s。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的两对靶点分别为靶点1和2、靶点3和4，其序列分别为：

1)靶点1：TACTCAGGGGCAGGATTCGT，

2)靶点2：GTAGCAGCTGCAGCTGCAAC；

3)靶点3：AGTCATTGTTACTCAGGGGC，

4)靶点4：GGGACACTCCAACTCGTCGT。

5.通过权利要求1-4任一项所述的方法得到的两系不育系水稻在育种中的应用，其特征在于，将得到的两系不育系水稻作为母本与两系恢复系父本配成两系杂交水稻组合，进行杂交制种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的两系恢复系父本包括9391、7375武科粳、南粳83111、南粳83043、金香玉1号、宁香粳11。

7.一种使水稻S5基因信号肽缺失或使水稻S5基因功能丧失的基因编辑位点，其特征在于，为靶点1和2、靶点3和4，其序列分别为：

1)靶点1：TACTCAGGGGCAGGATTCGT，

2)靶点2：GTAGCAGCTGCAGCTGCAAC；

3)靶点3：AGTCATTGTTACTCAGGGGC，

4)靶点4：GGGACACTCCAACTCGTCGT。

8.权利要求7所述的基因编辑位点在制备杂交水稻两系不育系材料中的应用。

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