JP2009524409A - 胚中で母系ゲノムの完全二倍体補完物を有する種子を作出するための核酸及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は胚中で母系ゲノムの完全二倍体補完物を有する種子を作出する目的のために配偶子形成及び種子発達を操作するためのArabidopsis、Boechera、イネ及び他の植物のDYAD遺伝子の対立遺伝子及び遺伝子産物の使用に関する。本発明はまた花粉発達に対して実質的な影響なしに減数されていない雌性配偶体を作出するための変えられたDYAD遺伝子の使用にも関する。
植物の生活環は二倍胞子体世代及び半数配偶体世代の間を交替する。減数分裂は植物生活環の二倍胞子体及び半数配偶体相の間の変遷を代表する。減数分裂は半数体胞子の形成を導く。動物とは違って、植物においては、減数分裂生成物は多細胞半数配偶体を形成するために追加の分裂を経験する。配偶子の分化は、減数分裂生成物の分裂後、配偶体発達の後期段階に向かって起こる。受精前の性プロセスはそれゆえ2の明確な段階:減数分裂及び半数体胞子の形成を含む胞子生殖;及び受精に及び胚の生長を支持するために必要とされる配偶子及び関連細胞を含む配偶体への胞子の発達をいう配偶子形成を含む。
栽培作物に無配偶生殖を導入するために考えられうる2の一般的な策がある。第一は栽培種への野生近縁系統からの遺伝子移入による。第二は無配偶生殖の局面を与えうる性種からの遺伝子の同定、続いて無配偶生殖の完全なレパートリーを作出するためにこれらの遺伝子をピラミッド状にすることによる。これらの遺伝子はその後トランスジェニック法を用いて栽培作物に導入されうる。したがって、例えば、1以上の遺伝子の発現はアポマイオシスを誘導するために使用されることができ、及びこれらの遺伝子は単為生殖胚発達を誘発するためにもう一つのセットの遺伝子及び他の処置と合わせられうる。植物において単為生殖を誘発する方法は本分野において知られる(例えば、米国特許第5,840,567号を参照のこと)。本発明での使用のために単為生殖発達を誘発するための好ましい方法は、照射することにより受精について花粉を不活性化し、照射された花粉を用いて植物に授粉することである。(Pandey K.K. and Phung M., Theoret. Appl. Genet., Vol. 62:295−300, 1982; Lofti M. et al., Plant Cell Reprod., Vol. 21:1121−1128, 2003)。
句「核酸配列」は5’から3’末端まで読まれるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の重合体の構造をいう。二重鎖核酸の場合、「核酸配列」はもう一方の鎖上のその相補物を含む。
「プロモーター」は使用可能につなげられた核酸の転写を指揮する核酸制御配列の並びとして定義される。本明細書中で使用されるとき、「植物プロモーター」は植物において機能するプロモーターである。プロモーターは、基礎的なポリメラーゼII型プロモーターの場合には、TATAエレメントの如き、転写開始部位の近くに必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた場合により、転写開始部位から何千塩基対も離れて位置されうる遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含む。「構成的」プロモーターはほとんどの環境的及び発達的条件下で活性であるプロモーターである。「誘導可能」プロモーターは環境的又は発達的調節下で活性であるプロモーターである。用語「使用可能につなげられる」は(プロモーター又は転写因子結合部位の配列の如き)核酸発現制御配列及び第二の核酸配列の間での機能的つながりをいい、ここで、上記発現制御配列は上記第二の配列に対応する核酸の転写を指揮する。
DYAD遺伝子はArabidopsisDYAD遺伝子(配列ID番号:1)によりコードされるポリペプチドと実質的な配列同一性を有する及びイネ(Genbank ID:62733414)及び他の植物において同定されているポリペプチドをコードするタンパク質コード部分を含む転写産物を生成する植物遺伝子の1のクラスである。DYAD遺伝子はまたブラックコットンウッド及びトウモロコシにおいても同定されている(実施例9)。DYAD遺伝子は野生型Arabidopsisにおいて単一コピーで存在する。さらに、それは生殖組織内の非常に小集団の細胞を構成する胞子母細胞においてのみ発現されるので、転写産物の豊富さは非常に低い。ArabidopsisDYAD遺伝子は減数分裂染色体組織化において重要な役割を果たすことが以前に示されている(Agashe B., Prasad C. K., and Siddiqi I., Development Vol. 129(16):3935−3943 2002)。したがって、その機能はイネにおける親密に関連する遺伝子の存在により示されるように、他の植物種において高く保存されているようである。本出願におけるデータはBoecheraもまたArabidopsisDYAD遺伝子に配列において親密に関連するDYAD遺伝子を有することを確立する。
アミノ酸配列について、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸又は小さい割合のアミノ酸を変える、付加する又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列への個々の置換、欠失又は付加は、上記変化が化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらすとき、「保存的に改変された変形」であることを認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は本分野において周知である。
1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);及び
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。(例えば、Creighton, Proteins(1984)を参照のこと)。
句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブが典型的には核酸の複合的な混合物中で、その標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしないであろう条件をいう。ストリンジェント(厳密な)条件は配列依存的であり、及び異なる状況において異なるであろう。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲なガイドはTijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”, Elsevier(1993)中に見られる。一般的に、高ストリンジェントな条件は定義されたイオン強度pHで特異的配列についての熱融解点(Tm)より約5〜10℃低いように選択される。低ストリンジェント条件は一般的にTmより約15〜30℃低いように選択される。Tmは標的に相補的なプローブの50%が平衡で上記標的配列にハイブリダイズする(定義されたイオン強度、pH、及び核酸濃度下での)温度である(上記標的配列は過剰に存在するので、Tmで、プローブの50%は平衡で占有される)。ストリンジェントな条件は、塩濃度がpH7.0〜8.3で約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的には約0.01〜1.0Mナトリウムイオン濃度(又は他の塩)であり、及び温度は短いプローブ(例えば、10〜50ヌクレオチド)については少なくとも約30℃及び長いプローブ(例えば、50ヌクレオチド超)については少なくとも約60℃である条件であろう。ストリンジェントな条件はまたホルムアミドの如き不安定化剤の添加でも達成されうる。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルは少なくともバックグラウンドの2倍、好ましくはバックグラウンドの10倍ハイブリダイゼーションである。
「種間ハイブリッド」は異なる種の2の植物を交配することにより得られる植物として定義される。
生殖事件における「雌親」は種子を有する植物として定義される。
一般的に、以下に示される組換えDNA技術における名称及び研究室手順は本分野において周知の及び通常使用されるものである。標準の技術がクローニング、DNA及びRNA単離、増幅及び精製のために使用される。一般的にDNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を含む酵素反応は製造者の仕様書にしたがって行われる。これらの技術及びさまざまな他の技術は一般的にSambrook et al., Molecular Cloning−A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.,(1989)にしたがって行われる。
DYAD遺伝子は減数分裂及び雌性配偶体の倍数性の制御に関連しているので、内因性DYAD活性又は遺伝子発現の阻害はいくつかの事情において有用である。例えば、上記に示されるC−末端欠損を有する対立遺伝子の使用による発現の阻害又はDYAD活性の改変は(「種なし果実」と本明細書中で呼ばれる)種なし又は小/退化種子の果実の生成のために使用されうる。ほとんどの植物種において、三倍体の作出は減数分裂における不均衡な染色体分離のために生殖細胞の形成において欠陥を引き起こし、及び種子の欠損又は小/退化種子の形成を導く。内因性DYAD発現又は活性の阻害は倍数性の制御を許容しうる。したがって、DYAD活性が阻害される又は改変される本発明に係る植物のいくつかの態様において、種子は欠損し又は退化し、及び種なし果実が作出される。
本明細書中に示されるように調製される単離された配列はまた内因性遺伝子発現を高める又は増大させるために特定のDYAD核酸の発現を導入するために使用されうる。高められた発現はまた、例えば、植物が種子を有するのを妨害することにより、栄養器官の生長を増大させるために使用されうる。遺伝子の過剰発現が所望される場合、異なる種からの所望の遺伝子は可能性のあるセンス抑制効果を減少させるために使用されうる。
上記技術において単離された配列を使用するために、植物細胞の形質転換に好適な組換えDNAベクターが調製される。広くさまざまなより高度な植物種を形質転換する技術は周知であり、及び技術及び科学文献中に示される。例えば、Weising et al. Ann. Rev. Genet.22:421−477(1988)を参照のこと。所望のポリペプチドをコードするDNA配列、例えば、全長タンパク質をコードするcDNA配列又は細胞内局在化配列へのDYADの融合タンパク質又は切り取られたDYADタンパク質は形質転換された植物の意図される組織中で上記遺伝子からの配列の転写を指揮するであろう転写及び翻訳開始調節配列と好ましく結合されるであろう。
本発明に係るDNA構築物はさまざまな慣用の技術により所望の植物ホストのゲノムに導入されうる。例えば、上記DNA構築物は植物細胞プロトプラストのエレクトロポーレーション及びマイクロインジェクションの如き技術を用いて植物細胞のゲノムDNAに直接的に導入されうる又は上記DNA構築物はDNA粒子衝撃の如き衝撃方法を用いて植物組織に直接的に導入されうる。
以下の実施例は本発明の例示のために与えられ、及び本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
dyad変異体をEMS変異M2植物の集団中のArabidopsisの不稔性変異体についてのスクリーニングにおいて単離した(Siddiqi I. et al. Development Vol. 127(1):197−207(2000))。相反交配による稔性の分析は、上記変異体は雌性不稔性であるが、雄性稔性であることを示した。雌性胞子生殖及び胚珠発達の分析は、dyadは欠陥雌性減数分裂を経験し、減数分裂細胞周期をとおした欠陥のある進行のために単一の減数分裂分割、続いて大多数の胚珠における雌性配偶子の発達の停止及び失敗をもたらしたことを示した。減数母細胞の染色体スプレッドの観察による雌性減数分裂の分析は、雌性減数分裂はdyad変異体において異常であることを示した:染色体はシナプスを形成することに失敗し、及び通常減数分裂1で起こりうる減数分割の代わりに等分割を経験した(Agashe B., Prasad C. K., and Siddiqi I., Development Vol. 129(16):3935−3943(2002))。
花粉生存能力をAlexander染色を用いて調べ、及び花粉は完全に生存能力があり、及び野生型に匹敵することがわかった(図2)。減数母細胞の染色体スプレッドの分析による雄性減数分裂の調査は、雄性減数分裂は正常であり、及び四分子の半数体胞子の生成をもたらしたことを示した(図3)。雄性減数分裂、雄性稔性、及び花粉発達及び機能はそれゆえdyad変異体において正常であった。一方、雌性減数分裂はdyadにおいて異常である。相同染色体のシナプス形成が起こるのは見られず、及び野生型雌性減数分裂の減数分裂1分割(図3C)はdyadにおいて等分割により置換される(図3E)。
dyad変異体において生成される種子が少数の雌性減数母細胞における正常な減数分裂から生じ、正常な機能的胚のうを生ずるよう進み、正常な機能的胚のうがその後半数体花粉により受精され種子に発達することは可能である。これが事実であった場合、これらの種子はdyad変異体において起こる異常な雌性減数分裂から逃避した種子を代表しうる。この可能性を調べるために、dyad植物からの種子(n=169)を発芽させ、及び高い効率(>90%)で発芽し及び異常な種苗を与えたいくつか(10%)を除いては形態学的に正常な種苗を生成することを見出した。子葉の形、対称性及び数における変化の例は発芽する種苗において観察されなかった。これは、減数分裂1における染色体のランダム分離を経験し、種苗段階である範囲の発達異常を示すより高い割合の異数性子孫をもたらすAtSpo11−1及びAtDmc1の如き、他の減数分裂変異体に由来する種苗とは対照的である(Grelon M. et al., The EMBO J., Vol 20:589−600,2001,Couteau F. et al., Plant Cell, Vol. 11(9):1623−1634,1999)。土壌への移行に際しての続く種苗の栄養器官の生長もまた正常であり、及び栄養器官の生長が親dyad変異体植物はもちろん野生型に同様である植物を生じた。観察された主な相違は、上記植物がとう立ちし始めたときの花の大きさにおいてであった。大多数の植物(n=41/52)において花の大きさにおける相対的増大は野生型に対して観察された。増大した花の大きさは可能性として生長力における増大又は好ましい環境の影響に帰することができる。上記植物は制御された環境において生育されるので、私たちは後者の可能性を除外した。花器官の大きさにおける増大についての他の可能性のある理由は倍数性における増大でありうる。倍数性における増大は栄養器官及び花の構造、特に花粉粒の大きさにおける増大により表される(Altmann T., et al., Plant Cell Reports. Vol. 13:652−656,1994)。ランダムに摘まれた植物からの花のつぼみを体細胞中の及び雄性減数母細胞中の染色体の分析によりそれらの倍数性の値について調べた。減数分裂染色体スプレッドの調査により、17/19の場合において、上記植物は三倍体であることが発見され、及び残りの2は二倍体であることがわかった(図4)。花粉発達及び雄性減数分裂はdyad変異体において正常であるが、一方で減数雌性減数分裂は等分割により置換されるので、これらの結果は、三倍体である大多数の上記種子は正常な半数体精子による減数されていない(二倍体)卵細胞の受精から生じ、及び少数の胚珠における正常な雌性減数分裂からは生じない、すなわち、上記大多数の種子は異常な減数分裂から逃避した種子を代表しないことを示す。
dyad変異体において形成された三倍体種子は、dyadにおいて起こる等しい雌性減数分裂と一致しうる、正常な半数体花粉による減数されていない胚のうの受精の産物でありうる。上記減数されていない胚のうが大胞子母細胞の等分割の産物から生ずる減数されていない大胞子から形成され、ここで、染色体は一価として残り、及び組換えを経験しない場合、上記減数されていない胚のうの遺伝子型は二倍体親植物のそれと同一であろう。それゆえ、上記親植物が分子マーカーについてヘテロ接合である場合、三倍体子孫もまたそのマーカーについてヘテロ接合であろう。セントロメアに結合されていないマーカーがヘテロ接合状態で考えられる場合、組換えの完全な不在において、親のヘテロ接合性の100%伝達は生ずる雌性配偶子及び三倍体子孫において達成されるであろう。組換え及び交差が起こる場合、100%ヘテロ接合性は生ずる三倍体子孫において維持されないであろう。セントロメアに結合されていないマーカーについては、減数されていない胚のうにおいてホモ接合性を33%の頻度で、及び三倍体子孫において16.7%の頻度で期待することができるが、一方で組換えの完全な不在においてはホモ接合体は全くないであろう。ヘテロ接合性の喪失を伴わない減数されていない胚のうの形成は無配偶生殖を作出すること及び雑種強勢の固定のために高く所望される。私たちはdyad変異体植物の三倍体子孫中でヘテロ接合性の喪失を計測するためにマイクロサテライトを使用した。dyad変異体植物を野生型Nossen(No−O)及びdyad変異体Columbia(Col)生態型の間での交配の分離するF2集団において同定した。5のArabidopsis染色体のそれぞれにわたり分布し、及びセントロメアに結合しない(>35cM)候補マーカーをTAIRデータベースから得た(www.arabidopsis.org)。F2集団を作出するために使用される親植物を多形性を確かめるために調べ、及び上記結果に基づいて私たちは遺伝子型50 F2dyad変異体植物に対する4の異なる染色体上の5の異なるマーカー(表1)を選択し、及びそれぞれの植物がヘテロ接合であるそれらのマーカーを同定する。自家受粉させた種子を個々に50 F2植物から集め、及びさまざまな数の同胞から成る50の異なるファミリーとして生育させた。これは50ファミリーにわたり分布される全部で196の植物を与えた。それぞれのファミリーの全てのメンバーは、親植物がヘテロ接合であるそれらのマーカーについて遺伝子タイピングされ、それぞれのマーカーについて50 F2ファミリーの全てにわたり分布される74〜119植物を与えた。
条件的に無配偶生殖のBoechera holboellii accessions Diploid Greenland及びTriploid Colorado(Naumova T. N., et al., Sex. Plant Reprod. Vol. 14:195−200,2001)からのDYADホモログの3kBゲノムコード領域をBho5Bam(配列ID番号:39)及びBho3Bam(配列ID番号:40)プライマーを用いてクローニングした。BhDYADゲノムクローン(配列ID番号:16)をArabidopsisDYADプロモーターに使用可能につなげ、及び補完について試験するためにdyad変異体植物を形質転換するために使用した。上記BhDYAD cDNAをまた増幅し及びシークエンスした(配列ID番号:17)。土壌細菌仲介in planta減圧浸潤形質転換はdyadについてヘテロ接合であるF1植物に発現構築物を動員させた。私たちは42の形質転換体を得、そのうち9の形質転換体はdyad位置の側面に位置するCAPS及びマイクロサテライトマーカーにより決定されるようにdyad変異体対立遺伝子についてホモ接合であった(Agashe B, Prasad C. K., and Siddiqi I., Development Vol. 129(16):3935−3943(2002))。9の形質転換体のうち4の形質転換体は、完全な種子セットを含むことがわかった十分に伸長した長角果(図5)により判断されうるdyad変異体表現型の補完を示した。残りの5植物はおそらく共抑制のために不稔性であった。
dyad変異体を含むArabidopsis株はより初期に示されるとおりであった(Siddiqi I., et al., Development. Vol.127(1):197−207(2000))。マイクロサテライトマーカー分析について使用されるF2集団は示されるように(Siddiqi I., et al., Development. Vol.127(1):197−207(2000))株No−O(Nossen 生態型)及びCol−0生態型バックグラウンドにおけるdyad変異体の間の交配に由来した。植物を示されるように(Siddiqi I., et al., Development. Vol.127(1):197−207(2000))制御された環境で生育させた。
Col−0生態型バックグラウンド中にdyad変異を有するF2分離集団をdyadホモ接合植物中の種子セットの頻度をスコアリングするために使用した。dyad変異体植物を上記植物が花を咲かせ終わるそれらの最終段階まで生育させた。この段階後、水やりを長角果が収穫完熟に達するようwitheldさせた。その間、黄色くなった及びこなごなになりそうな最も低い長角果を個々に裂け開き、及び存在する場合は種子を単一の植物ベースで収穫した。そのようにして、必要な種子を可能性のある種子損失を避けるために規則的な間隔で収穫した。最後に、回収した種子を単一の植物ベースで集め、植物当たりの種子の総数をカウントした。
葯中の小胞子についての生命力染色を示されるように(Alexander M. P., Stain Technol. Vol.44(3):117−122,1971)行った。
雄性及び雌性減数分裂スプレッドの分析は示されるとおりである(Agashe B, Prasad C. K., and Siddiqi I., Development Vol. 129(16):3935−3943(2002))。
マイクロサテライトマーカー分析のためのゲノムDNAを、少しの改変を伴うDellaporta S. L., et al., Plant Mol. Bio. Rep., Vol.1:19−21(1983)により示される方法にしたがって単離した。約500mgの葉組織を1.5mlエッペンドルフ管中に個々の植物から集め、及び液体窒素中で急速冷凍した。その後上記組織を微小乳棒を用いて細かい粉末になるまでひいた。この粉末に200μlの新たに調製した抽出緩衝液(100mM Tris(pH8)、50mM EDTA、500mM NaCl、1.4% SDS、及び10mM β−メルカプトエタノール)を添加し、及び微小乳棒で細かくホモジェナイズした。その後等体積の2×CTABを添加し、及び上記混合物をおだやかにヴォルテックスした。その後上記混合物を振騰水槽中で65℃で5分間インキュベートした。その後上記サンプルを冷却させ、及び等体積の24:1 クロロフォルム:イソアミルアルコールを添加し、及びおだやかに混合し、及び13000rmpで10分間遠心分離した。DNAを含む水相を新しいエッペンドルフ管に移し、及び2/3体積の氷で冷却したイソプロパノールを添加し、DNAを沈殿させた。上記DNAを4℃で13000rpmで20分間の遠心分離によりペレット化した。上記DNAペレットを70%エタノール洗浄し、及び上記ペレットを30分間風乾し、及びDNAseフリーRNAse(20μg/ml)を含む50μlの滅菌水又はTE緩衝液(pH8.0)中に懸濁した。
Col−0及びNo−O生態型の親調査に基づいて、セントロメアに理にかなって結合されていない、4の異なる染色体からの5のマイクロサテライトマーカーを選択した。これらのマーカーをあるマーカーについてヘテロ接合であるdyad植物を選択するためにF2(No−O×Col−0(dyad))分離集団について使用した。これらのdyad植物からの種子を集め、及びそれぞれの子孫が特定の母dyad植物の同胞を構成するよう個々のペトリ皿中で発芽させた。そのようにして、あるマーカーについてヘテロ接合であるさまざまな植物からの同胞についてのデータをマーカー分析について共に考慮した。
nga162
nga162F 配列ID番号:6
nga162R 配列ID番号:7
nga225
nga225F 配列ID番号:8
nga225R 配列ID番号:9
nga168
nga168F 配列ID番号:10
nga168R 配列ID番号:11
nga1107
nga1107F 配列ID番号:12
nga1107R 配列ID番号:13
nga6
nga6F 配列ID番号:14
nga6R 配列ID番号:15
Boechera holboelliiの条件的無配偶生殖二倍体Greenland及び三倍体Colorado accessionsはKim Boutilier(Naumova T. N., et al., Sex. Plant Reprod. Vol. 14:195−200,2001)からの好意的な贈与であった。植物をArabidopsisについて示される培地を含むポットで生育させ、及びArabidopsisについての条件と同一の条件下で生育させた。
1.8kbのDYADプロモーター領域をプライマーpg2r4(配列ID番号:48)及びPDYBAM(配列ID番号:47)を用いてCol−0生態型から増幅し、及び生成物を製造業者の教示によりpGEMTベクター(Promega)にクローニングした。
Boechera holboelliiからのArabidopsisDYADホモログのゲノムコード領域(BhDYAD)を5’末端上にBamHIサイトを有するプライマー:Bho5BAM(配列ID番号:39)及びBho3BAM(配列ID番号:40)で増幅した。生ずる3kb断片をpGEMTにクローニングした。
BhDYADを3kb BamHI断片としてpGEMTから放出させ、及び植物選択可能マーカーヒグロマイシンを有するpCAMBIA1300ベクターにクローニングした。方向をプライマーBDY3(配列ID番号:36)及びOCSR(配列ID番号:38)を用いてチェックした。1.6kb DYADプロモーター領域(配列ID番号:22)をpGEMTベクターからSacI断片として放出させ、及びpCAMBIA1300ベクター中のBhDYADの上流に挿入した。BhDYADゲノム配列についてのプロモーターの方向をプライマーismr4(配列ID番号:37)及びbdy1(配列ID番号:35)を用いて確認した。
上記構築された二種混合型ベクターpCAMBIAの土壌細菌(AGL1)への移行は示されるように(Agashe B, Prasad C. K., and Siddiqi I, Development, Vol. 129(16):3935−3943(2002))三親交配によった。
BhDYADの補完分析のために、Col−0×dyadのF1植物をArabidopsisDYADプロモーターにより駆動されるBhDYADを有する構築物で形質転換した。土壌細菌仲介in planta減圧浸潤形質転換をBechtold N. and Pelletier G., Methods Mol. Biol., Vol. 82:259−66(1998)にしたがって行った。
減圧浸潤されたF1植物からのT0種子を20μg/mlヒグロマイシンを有する0.8% Bacto Agar、1mM KNO3及び1% Sucroseを含むペトリ皿上にまいた。3日間の冷却層化後、上記プレートを生育チャンバーに移した。ヒグロマイシンに対して耐性である形質転換体は十分に伸長した根、直立した胚軸及び十分に広がった子葉の葉によって早くも移行後5日で同定されうる。選択された形質転換体をヒグロマイシンを含むMSプレートにさらに移し、及び耐性が確立された後、それらを最終的に土壌培地に移した。さらに、上記植物を先に示されるようにbdy3及びOCSRプライマーを用いて挿入物の存在についてチェックした。
分離dyadF2集団からの3の遺伝子型を共ドミナントCAPSマーカー(Konieczny A. and Ausubel F. M., Plant J., Vol. 4(2):403−410, 1993)及び変動マイクロサテライトにより同定した。dyad変異体対立遺伝子のフランキング配列はLandsberg erecta生態型に由来し、及び野生型対立遺伝子からのフランキング配列はColombia生態型配列を有する。したがって、これらのフランキング配列中のSNPsをdyad位置のいずれかの側に密接に結合される及びフランキングするCAPsマーカー(KNEF(配列ID番号:31)及びKNER(配列ID番号:32)、KKF(配列ID番号:33)及びKKR(配列ID番号:34))及びDYADに密接に結合されるマイクロサテライトマーカープライマー(KMF(配列ID番号:29)及びKMR(配列ID番号:30))を開発するために利用した(Agashe B, Prasad C. K., and Siddiqi I., Development Vol. 129(16):3935−3943(2002))。上記マーカーを用いたdyad位置での遺伝子タイピングは示されるとおりであった(Agashe B, Prasad C. K., and Siddiqi I., Development Vol. 129(16):3935−3943(2002))。
二倍体Greenland植物からの十分に発達した単一のつぼみ(芽)を製造業者の教示によるTriZol試薬(Invitrogen)によるトータルRNA単離のために使用した。4μgのトータルRNAをcDNA合成のためのSuperscript(商標)Choiceシステム(GIBCO BRL)を用いたはじめの鎖cDNA合成のために使用した。上記cDNAをプライマー5RF3(配列ID番号:41)及びBho3BAM(配列ID番号:40)を用いることによりクローニングのためにさらに増幅させた。生ずる1.9KB断片をpGEMTにクローニングし、及びシークエンスした。結果は配列ID番号:17として配列リスト中に示される。対応するDYADタンパク質のアミノ酸配列は配列ID番号:18中に示される。
DYAD遺伝子の条件付き対立遺伝子を構築するために使用される策はDYADのC−末端にラットグルココルチコイド受容体(GR)のホルモン結合ドメイン(配列ID番号:27)を融合すること、及びdyad変異体対立遺伝子についてホモ接合である(dy/dy)植物のゲノムに上記融合構築物を統合することに基づいた。上記GRドメインはステロイドホルモンの不在下では細胞質局在を与えるが、一方でDYADの活動部位は核内であるので、DYAD−GR融合タンパク質はそれだけではdyad変異体を補完することができない。しかしながら、ステロイドホルモンの存在下では、上記融合タンパク質は細胞質結合部位から放出され、及び核へ移行することができるようになり、そこでそれはdyad変異体を補完しうる。上記構築における段階は以下のものであった:上記植物二種混合型ベクターpBI101.3を、GUS受容体遺伝子を除去し、及びGRドメインを含むBamHI−SacI断片でそれを置き換えるために、BamHI+SacIで消化した(A.M. Lloyd et al., Science 266, 436−439(1994))。
相反交配を四倍体(4n)及び二倍体(2n)野生型Arabidopsis植物の間で行った。両方の場合で、生成される種子は三倍体である。しかしながら、雄親が四倍体であり、及び雌親が二倍体であったとき、生成された種子は大きく、一方で雄親が二倍体であり、及び雌親が四倍体であったとき、種子は縮んでいた。これらの結果は図10中に示され、及び種子のそれぞれのカテゴリーについての100種子の重量は表2中に示される。
**1:1の割合についてのフィットのよさについての有意性試験は発芽しなかった種子を除いて計算される。
***5:1の割合についてのフィットのよさについての有意性試験はKanRカテゴリー中に発芽しなかった種子を含むことにより計算される。理論的には、発芽しなかった種子の50%のみが(得られたKanR及びKanS種苗の割合に基づいて)いずれかのカテゴリー中に含まれるべきであるが、有意性の値を増大させるために、私たちは全ての発芽しなかったロットをKanRカテゴリーに含めた。これは、私たちが全ての発芽しなかったロットをKanRカテゴリーに含んでも5:1の割合についてのフィットのよさは有意でないという可能性を排除し、及びしたがって1:1の割合のみを好む条件を強く支持する。
S それがある割合に従わないことを示す、χ2試験について有意
NS それがある割合に従うことを示す、χ2試験について有意でない
ポプラからのDYAD遺伝子の追加の実施例はhttp://www.ornl.gov/sci/ipgcで見られる。
cDNA配列のコード部分の翻訳は図11中でClustal Wプログラムを用いてArabidopsis thalianaからの野生型DYADタンパク質のアミノ酸配列と比較されるアミノ酸配列を提供する。
http://www.ornl.gov/sci/ipgc中のとおり
ゲノム領域(配列ID番号:24)
INTRON
はじめのATGの2444bp上流を含む
ウェブサイト(www.plantgdb.org)でクエリーとしてTBLASTN及びイネDYADタンパク質(配列ID番号:51)を用いたトウモロコシゲノムの検索はコンティグZmGSStuc11−12−04.1016.1(配列ID番号:52)及びZmGSStuc11−12−04.1016.2(配列ID番号:53)に対応するトウモロコシゲノムの領域内の推定上のDYAD遺伝子の存在を明らかにした。手動編集との組み合わせのGENSCAN(http://genes.mit.edu)を用いた領域のアノテーションはイネDYADポリペプチド配列と整列されうる推定上のトウモロコシポリペプチド配列の同定を導いた(図12)。本発明は前記トウモロコシポリペプチド配列及び前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の使用を含む。
最適照射量の決定:
1.使用される予定の雌親植物と同種又は関連種の雄親植物から葯を集め、及び1、5、10、20、30、50、70、100、150、200kradを含む量範囲のイオン化照射で照射する。
2.1以上の劣性表現型マーカー又はDNAマーカーについてのその他(マイクロサテライト、CAPS又はRAPD)を有することで上記照射された花粉親とは異なる雌性植物からの除雄された花又は雌花に授粉する。好ましくはイオン化照射のそれぞれの量で授粉に10〜50の花を使用する。
3.授粉された花から種子を集め、及び同じ照射量を受けた花粉で授粉された花からの種子を集める。
4.種子を発芽させ、及び苗になるまで生育させ、照射のそれぞれの量について約20〜100の植物を得る。
5.表現型マーカー又はDNAマーカーについて植物の遺伝子型をスコア付けし、及び母親に似る植物の割合を計算する。
6.高い割合の生存力のある植物及び高い割合の母親に似る植物の両方の最適な組み合わせを与える量を選択する。
1.上記に示されるように決定される適切な量のイオン化照射を用いて照射された花粉でdyad変異体植物に授粉する。
2.種子を集める。
3.種子を発芽させ、及び苗になるまで生育させる。
1.雌親が有する劣性表現型マーカーについて植物をスコア付けする。劣性表現型を示す植物は単為生殖であるとして分類される。さらに、上記植物は植物組織からDNAを単離し、多形マーカーについてDNA分析することによりDNAマーカーについてスコア付けされうる。雌親に特徴的である及び雄親についてのマーカーバンドを欠くマーカーパターンを示す植物は単為生殖であるとして分類される。授粉実験からの単為生殖植物の割合はそのようにして計算されうる。
2.単為生殖植物は雌親がヘテロ接合であったマーカーについて調べられうる。雌性dyad変異体親がヘテロ接合であった全てのマーカーについてヘテロ接合性を保持するそれらの植物は無配偶生殖植物である。
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Claims (35)
- dyad対立遺伝子についてホモ接合であるゲノムを含み、及びその植物の細胞の核内でDYADタンパク質を条件付きで発現する植物。
- 前記植物は条件付きで雌性稔性になる、請求項1に記載の植物。
- 前記植物は前記植物が生成する種子中の雌親ヘテロ接合性の保持について条件付きになる、請求項1に記載の植物。
- 前記ゲノムはステロイドホルモン受容体リガンド結合ドメインに融合されたDYADタンパク質をコードする少なくとも1コピーのポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載の植物。
- 前記ステロイドホルモン受容体リガンド結合ドメインはグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインである、請求項4に記載の植物。
- 上記dyad対立遺伝子は、508〜572のアミノ酸位置で切り取られたDYADタンパク質が発現されるものである、請求項1に記載の植物。
- 上記dyad対立遺伝子は配列ID番号:1のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む又は37℃で40%ホルムアミド、1M NaCl、1% SDSの条件又はそれに相当する条件下で配列ID番号:1、配列ID番号:23又は配列ID番号:25のポリヌクレオチドの相補物とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する、請求項6に記載の植物。
- 上記DYADタンパク質は配列ID番号:4の又は配列ID番号:17の又は配列ID番号:23の又は配列ID番号:25のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにより又は37℃で40%ホルムアミド、1M NaCl、1% SDSの条件又はそれに相当する条件下で配列ID番号:1又は配列ID番号:23又は配列ID番号:25の相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、請求項1に記載の植物。
- 上記DYADタンパク質は配列ID番号:4の又は配列ID番号:17の又は配列ID番号:23の又は配列ID番号:25のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにより又は37℃で40%ホルムアミド、1M NaCl、1% SDSの条件又はそれに相当する条件下で配列ID番号:1又は配列ID番号:23又は配列ID番号:25の相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、請求項7に記載の植物。
- i)dyadについてホモ接合である雌親植物に雄親植物からの花粉で授粉すること又はdyadについてホモ接合である前記植物を自家受粉させること;及び
ii)前記授粉された雌親植物からの種子を得ること
を含む、雌親のヘテロ接合性を保持する種子の作出方法。 - 前記種子は正常な大きさ又は縮んだ大きさである、請求項10に記載の方法。
- 段階i)で使用される花粉は照射された、請求項10に記載の方法。
- 段階i)で使用される花粉は稔性であり、及び段階ii)で得られる種子は三倍体である、請求項10に記載の方法。
- dyad対立遺伝子についてホモ接合であり、及び前記植物の細胞の核内のDYADタンパク質の発現について条件付きである植物を提供する、胚性ゲノムを有する種子を得る方法であって
i)dyad対立遺伝子についてヘテロ接合であり又はホモ接合であり、及び核内でDYADタンパク質を条件付きで発現する発現構築物を含む第一の植物を自家受粉させること及びdyadについて及び上記発現構築物についてホモ接合である第二の植物を得るために選択すること
ii)上記第二の植物の種子又は上記第二の植物に由来した植物の種子を得ること及び大きさが正常である又は縮んだ種子を選択すること
を含む方法。 - 前記第二の植物は前記第二の植物により生成される種子の胚中の雌親ヘテロ接合性の保持について条件付きである、請求項14に記載の方法。
- 前記第二の植物は雌性不稔性について条件付きである、請求項14に記載の方法。
- dyad対立遺伝子についてホモ接合である及びその植物の細胞の核内でのDYADタンパク質の発現について条件付きである植物を得る方法であって
i)dyad対立遺伝子について及び核内でDYADタンパク質を条件付きで発現する発現構築物についてヘテロ接合である又はホモ接合である第一の植物を自家受粉させること及びdyadについて及び上記発現構築物についてホモ接合である第二の植物を得るために選択すること
ii)上記DYADタンパク質が発現される条件に前記選択された第二の植物を導入すること
を含む方法。 - 前記第二の植物は前記T2植物により生成される種子の胚における雌親ヘテロ接合性の保持について条件付きである、請求項17に記載の方法。
- 前記第二の植物は雌性不稔性について条件付きである、請求項17に記載の方法。
- 請求項1に記載の植物の種子又は組織。
- 請求項10に記載の方法により得られる種子。
- 請求項13に記載の方法により得られる三倍体種子。
- 上記DYADタンパク質の発現について十分な条件下で請求項1に記載の植物を繁殖させることを含む、dyadについてホモ接合である植物系の維持方法。
- 上記DYADタンパク質の発現について十分な条件下で請求項4に記載の植物を繁殖させることを含む、dyadについてホモ接合である植物系の維持方法。
- 前記条件は前記植物にステロイドホルモンを適用することを含む、請求項24に記載の方法。
- 核内で条件付きで発現されるDYAD遺伝子のコピーを含む植物を得る方法であって
i)第二の植物を得るために前記植物の核内で条件付きでDYADタンパク質を発現する発現構築物を含む第一の植物を自家受粉させること又は2の前記第一の植物を交配すること、及び短くなった長角果若しくは縮んだ果実又は減数された種子セットを示す第二の植物を選択すること
ii)上記DYADタンパク質が発現される条件に前記選択された第二の植物を導入すること
を含む方法。 - 上記第一の植物はDYADについて野生型であり、dyadについてヘテロ接合である又はdyadについてホモ接合である、請求項26に記載の方法。
- 前記植物の細胞の核内で野生型DYADタンパク質を条件付きで発現する構築物を含むベクターで植物の細胞を形質転換することを含む、前記植物の細胞の核内で野生型DYADタンパク質を条件付きで発現する植物を得る方法。
- 上記植物はdyadについてホモ接合である植物である、請求項28に記載の方法。
- 上記植物はdyadについてヘテロ接合である植物である、請求項28に記載の方法。
- 前記植物の細胞の核内での野生型DYADタンパク質の条件付き発現を提供する構築物についてホモ接合である植物。
- 植物細胞の核内でDYAD遺伝子の条件付き発現を与える発現構築物。
- 前記植物細胞は大胞子母細胞である、請求項32に記載の構築物。
- 前記DYAD遺伝子はステロイドホルモン受容体リガンド結合ドメインに融合される、請求項32に記載の構築物。
- 前記ステロイドホルモン受容体リガンド結合ドメインはグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインである、請求項34に記載の構築物。
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