BRPI0620572A2 - ácidos nucléicos e métodos para produzir sementes tendo um complemento diplóide cheio do genoma materno no embrião - Google Patents

Abstract

ACIDOS NUCLéICOS E MéTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLóIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIãO. A presente invenção descreve os genes de DYAD, e seus mutantes, e uso deles para fazer plantas que retêm hetero-zigositos da planta fêmea. A invenção também emgloba plantas, tecidos de plantas, e sementes de plantas que têm um fenótipo de dyad e assim retém hetero-zigositos da fêmea, constitutivamente ou condicionalmente. A invenção é útil para propagar fenótipos híbridos desejado até certo ponto de uma planta apomictica e por aumentar o manejo de um genótipo de uma planta que pode resultar em plantas que têm a biomassa aumentada.

Description

ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO.

Campo da Invenção:

A atual invenção se relaciona com o uso dos alelos do gene do DYAD e do produto genético do Arabidopsis, de Boechera, do arroz e de outras plantas de manipular gametogenesis e o desenvolvimento da semente com o fim de produzir as sementes que levam a um complemento diploid completo do genoma maternal no embrião. A atual invenção também se relaciona com o uso de um gene alterado do DYAD para produzir um gametophyte não reduzido da fêmea sem efeito substancial no desenvolvimento do pólen.

Antecedente da invenção;

O ciclo da vida de planta se alterna entre uma geração diploid do sporophyte e uma geração haploid do gametophyte. A meiosis representa a transição entre o sporophyte diploid e as fases haploid do gametophyte do ciclo da vida de planta. A meiosis conduz à formação de esporos haploid. Em plantas, desemejante de animais, os produtos meiotic experimentam a divisões adicionais à forma um gametophyte haploid multicelular. A diferenciação dos gametas ocorre para as fases mais posteriores do desenvolvimento do gametophyte, seguindo à divisão dos produtos meiotic. O processo sexual antes da fertilização, portanto compreende dois períodos características: sporogenesis que inclui meiosis e a formação de esporos haploid; e gametogenesis que refere ao desenvolvimento dos esporos em um gametophyte, compreendendo ao gamete e às células associadas necessários para a fertilização e para o crescimento de suporte do embrião.

A maioria da espécie vegetal experimenta a reprodução sexual; no entanto alguma espécie vegetal fica capaz da reprodução assexuada. O apomixis do termo fica geralmente aceitado como a substituição da reprodução sexual por quaisquer de determinadas formas de reprodução assexuada (Koltunow A. e Grossniklauss U. Annu. Investidor de corrente. Biol da planta. Vol. 54: 547-74. O Apomixis fica um método genético controlado de reprodução em plantas, implicando a formação da semente na qual o embrião fica formado sem a união de um ovo e de um esperma. Ficam três tipos básicos de reprodução apomictic: 1) , nas quais o embrião se desenvolve parthenogenetically de um ovo cromossômico não reduzido em um saco do embrião derivado do nucellus, 2 apospory) diplospory, nos quais um embrião se desenvolve A CÓPIA de GOISJFIRMATiOlS- parthenogenetically de um ovo não reduzido em um saco do embrião derivou da célula da mãe do megaspore, e de 3) embryony adventicios, nas quais um embrião se desenvolve diretamente de uma célula somática. Os primeiros dois tipos de são do apomixis juntos classificados baixo apomixis gametophytic porque em casos que o embrião desenvolve de um saco do gametophyte ou do embrião da fêmea, enquanto em embryony adventicio o embrião se desenvolve diretamente de uma célula somática sem uma etapa intermédia do gametophyte da fêmea. O apomixis de Gametophytic, portanto implica dois componentes: i) apomeiosis, ou a produção de um gametophyte não reduzido da fêmea (saco do embrião) que conserva o genotipo parental, e ii) desenvolvimento parthenogenetic do embrião, com ou sem a fertilização da célula da central que desenvolve no endospermo.

O Apomixis fica assim um processo reprodutivo que meiosis da fêmea das derivações e syngamy, produzir os embriões genético idênticos à progenitora maternal. Os três tipos de apomixis têm potencial econômico porque eles causam do bote qualquer genotipo, sem importar como são heterozygous, de criar verdade. Com a reprodução apomictic, a progenie de genotipos especialmente adaptativos ou híbridos manteria seu genotipo através de ciclos vitais repetidos. Além de fixar vigor híbrido, o bote do apomixis há a produção híbrida industrial possível nos cultivos onde os sistemas masculinos eficazes da restauração da esterilidade ou da fertilidade para produzir híbridos ficam não sabido ou desenvolvido. O bote do Apomixis, portanto há o desenvolvimento híbrido mais eficaz. O Apomixis também simplifica a produção híbrida e aumenta diversidade genética em espécie vegetal com os bons sistemas masculinos da esterilidade. Fica altamente desejável para introduzir os genes que o controle obriga ou um de alto nível do apomixis em espécie cultivada e fica capaz de cruzar facilmente genotipos por hibridação sexuais e apomictic compatíveis cruzados para produzir a verdadeiro-criação de híbridos da Florida. A transferência do apomixis aos cultivos importantes faria o desenvolvimento possível de híbridos de criação verdadeiros e a produção comercial de híbridos sem uma necessidade da esterilidade masculina citoplásmico-nuclear e do alto custo, processos de produção dependentes de trabalho. Um híbrido obligately apomictic da Florida criaria verdade através da semente indefinidamente e poderia fica considerado para proporcionar um método vegetativo ou clônico de reprodução através da semente. O desenvolvimento apomictically de reproduzir cultivos cultivados também proporcionaria uma contribuição importante para a segurança dos alimentos em desenvolver as nações (Spillane C, SteimerA1 e Grossniklaus U, sexo. Planta Reprod. 14: 179-187, 2001). [0005] Na verdade, a maioria do são sabido do apomixis do controle dos genes achado na espécie selvagem, que o são relacionou distante com a espécie cultivada. Mesmo que podem os cruzamentos interespecíficos fique possível entre o cultivado e as espécies selvagens, cromossomo o apareamiento entre os genomas fica geralmente baixo ou não existente, conduzindo ao erro desta aproximação. Breve descrição dos desenhos;

A figura 1 representa a semente reduzida fraguada em plantas dos mutantes do dyad. A gama gestos fica a semente 1-10 pela planta. A figura 2 representa viabilidade normal do pólen ao usar das plantas do mutante do dyad. O manchar-se de Alexander. (Figura 2A) tipo selvagem. (Figura 2B) dyad.

A-figura 3 representa meiosis do varão e da fêmea em tipo selvagem e o mutante do dyad. (Figura 3A-C) tipo selvagem. (Figura 3D-F) dyad. (Figura 3A, D) meiocytes masculinos no extremo da meiosis 1 (telophase). (Figura 3B, E) meiocyte masculino na etapa tétrada. (Figura 3 C1 F) meiocyte da fêmea no anaphase 1. o dyad experimenta uma meiosis da fêmea do equational. A figura 4 representa o cromossomo ploidy de progenie representativa de uma planta diploid do mutante do dyad. (Figura 4A) célula somática de mostrar da planta da progenie do triploid 15 cromossomos. (Figura 4B) meiosis masculina 1 em uma planta da progenie do triploid que leva a 15 cromossomos que mostram a segregação de 9:6. (Figura 4C) célula somática de uma planta diploid da progenie que amostra 10 cromossomos. A figura 5 representa a complementação do mutante do dyad pelo homologue do DYAD do holboelli de Boechera: (Figura 5A) o mostrar do mutante do dyad unelongated siliques. (Figura 5B) mutante do dyad transformado com o gene de BhDYAD que amostra os siliques alongados que contêm as sementes. (Figura 5C) comparação de siliques de uma planta do mutante do dyad (1), uma planta complementada (2) e um tipo selvagem de planta (3). (Figura 5D) o silique dissecado de uma planta complementada, mostrando a semente completa frágua. (Figura 5E) silique dissecado de um tipo selvagem planta.

A figura 6 fica um diagrama que amostra o pbi101.3:: Dyad:: ([Delta]) o casete de GR construía uma linha condicional da complementação do DYAD.

A figura 7 fica um gel do polyacralymide que amostra o polimorfismo dos REMATES para genotyping o lugar geométrico endógeno do DYAD como descrito no exemplo 6. Figura 7A: HinFI resolvido digeriu fragmentos de produtos amplificados as cartilhas de KNEF/KNER. Figura 7B: HinFI resolvido digeriu fragmentos de produtos amplificados as cartilhas de KKF/KKR.

A figura 8, ilustra a complementação condicional do phenotype do dyad no exemplo 6. Figura 8A: Inflorescencia que amostra o tratamento não-alongado da dexametasona do silique {phenotype do dyad) antes e depois. A seta indica a posição da flor aberta mais jovem no começo do tratamento. 5-7 dias depois do partir dos siliques do tratamento mostraram a elongação (tipo selvagem phenotype). Figura 8B: Siliques isolados que mostram phenotype estéril (do dyad) antes do tratamento da dexametasona. Figura 8C: as mostras restabeleceram o tipo selvagem phenotype depois- da complementação condicional pelo tratamento da dexametasona. Figura 8D: O silique aberto da fratura que mostrava a semente completa frágua depois do tratamento da dexametasona.

A figura 9 amostra a morfologia do óvulo depois da complementação condicional do phenotype do dyad no exemplo 6. Figura 9A: Óvulo eliminado que amostra phenotype do dyad e a ausência de saco do embrião na etapa madura do óvulo antes do tratamento da dexametasona. Figura 9B: Saco do embrião restabelecido depois do tratamento da dexametasona.

A figura 10 amostra a variação de tamanho das sementes produzidas pelo mutante e as diferenças do dyad de tamanho das sementes obtidas de cruzamentos recíprocos entre as tensões diploid e tetraploid do Arabidopsis. Figura 10A: As sementes de selfed o tipo selvagem de Coi-Ou das plantas do são normal diploid uniformemente de tamanho. Figura 10B: Sementes de uma planta tetraploid. Figura 10C: O tamanho de sementes de selfed as plantas do dyad varia entre (I) grande, (n) normal, e (s) contraído. Figura 10D: Sementes maternais do ~ do excesso de uma fêmea tetraploid cruzada a um são masculino diploid contraído. Figura 10E: As sementes paternales do excesso de um cruzado masculino tetraploid a uma fêmea diploid ficam maior de tamanho quando estão comparadas às sementes de um cruzamento,,rnaternal do excesso.

Afigura 11 amostra um alinhamento das seqüências da proteína da proteína do DYAD do Arabidopsis (NÃO SEQ do ID: 5), Boechera (NÃO SEQ do ID: 18), arroz (NÃO SEQ do ID: 51), e do álamo (trichocarpa) de Populus (NÃO SEQ do ID: 26), com Clustal W como em http://www.ebi.ac.uk/clustalw com parâmetros do defeito. [

Alinhamento das amostras da figura 12 das seqüências do polipéptido do DYAD do arroz (NÃO SEQ do ID: 51) com as seqüências supostas do polipéptido do DYAD do milho (ID SEQ Não.: 55 e 54) que usam Clustal W (1.82). Figura 12A: Alinhamento dos amínoácidos do DYAD do arroz 1-147. Figura 12B: Alinhamento dos aminoácidos do DYAD do arroz 317-803. [0020] [0021] Mapeamento das amostras da figura 13 da seqüencia do politeptidio do DYAD do arroz sobre dois contigo de Zea Mayz identificados para comprender as secuencias de DYAD-codificação.

Exposição da invenção

Ficam duas estratégias do general que possa fique considerado para introduzir apomixis em cultivos cultivados. O primeiro fica pelo introgression de parentes selvagens em espécies cultivadas. O segundo fica pela identificação de genes de espécies sexuais que confere o bote os aspectos do apomixis, seguidos por pyramiding estes genes para produzir o repertório completo do apomixis. Estes genes poderiam então ficam introduzidos em cultivos cultivados usando métodos transgenic. Assim por exemplo, a expressão de uns ou mais genes poderia fica utilizado ao apomeiosis do engenheiro, e estes genes poderiam ficam combinado com outro fraguado de genes ou de outros tratamentos para induzir o desenvolvimento parthenogenetic do embrião. Métodos para induzir partenogénesis no são das plantas sabido na técnica (veja-se, e.g. Patente do Norte-americano. No. 840.567). Um método preferido para induzir o desenvolvimento parthenogenetic para o uso com a atual invenção fica para polinizar uma planta usando o pólen que ficou propagado, de tal modo fazendo- a inativo para a fertilização. (Pandey K.K. e Phung M., Theoret. Appl. Genet., vol. 62:295 - 300, 1982; Lofti M. e outros, célula Reprod da planta., vol. 21:1121 - 1128,2003).

Este método fica preferido em que ficou utilizado em um número de espécie vegetal e aparece fica geralmente aplicável, o mais facilmente possível às plantas que têm flores incompletas (monoecious e dioecious). No entanto, bote fica aplicado às plantas hermafroditas que têm flores você completa que ficaram feito malé-sterile ou de quais ficou o pólen fértil tirado mecanicamente ou segregado.

A dose específica da radiação para esterilizar o pólen variará depender sobre os detalhes da espécie. Geralmente uma dose de cerca de 10 a 2000 cinzentos fica suficiente. Preferivelmente, a dose fica o perto de cinzento 100 a 500, preferivelmente a partir o cinzento o 200 a 250. [0025] A indução acertada do bote da partenogénesis fica detectada pelo crivado das sementes para a presença de embriões, por exemplo pela dissecação ou pela observação das sementes em uma caixa leve depois que cultivo em meio líquido como descrito por Lofti M. e outros., Célula Reprod da planta., Vol. 21: 1121-1128, 2003. Introduzir o rasgo apomictic em cultivos normalmente sexuais ficou tentado. Asker S. (Hereditas, vol. 91; 231-241, 1979) divulga que as tentativas ficaram fracassado com trigo, as beterrabas, e o milho. A publicação WO 89/00810 (Maxon e outros, 1989) do PCT divulga induzir uma forma apomictic de reprodução nas plantas cultivadas que usam extratas de nondomesticated as plantas estéreis da alfafa. Quando da indução da esterilidade masculina ficou avaliado em zahína, girassol, espécie de milho de pérola, e tomate que ficou divulgado que ficou o semente reduzido fraguado em zahína, espécie de milho de pérola, e girassol e reduziu o fruto fraguado em tomate. Mesmo que o apomixis fica utilizado com eficácia em cítrico produzir o uniforme e doença-e o rizoma vírus-livre (Parlevliet J. E. e outros., em cítrico. Proc. Fique. Soe. Hort. Sci., vol. 74: 252-260, 1959) e nos buffelgrass (Bashaw, ciência do cultivo, vol. 20: 112, o an ou 80) e Poa (Pepin e outros., ciência do cultivo, vol. 11: 445-448, 1971) produzir melhorou os cultivares, ele não tem ficado transferido com sucesso a uma planta de cultivo cultivada.

A segunda aproximação para apomixis da engenharia implica a identificação e a manipulação de genes relacionados apomixis de espécies sexuais. Uma vista de desenvolvimento do apomixis sugeriu que o apomixis fica relacionado à reprodução sexual e implica a ação dos genes que também jogam uma missão na via de acesso sexual (Tucker M.R. e outros., célula da planta, vol. 15(7): 1524- 1537,2003).

Na reprodução sexual, uma célula da mãe do megaspore que se apresenta da capa hypodermal para o ápice do óvulo que se desenvolve aumenta e vai geralmente através de meiosis e de duas divisões celulares à forma uma tétrada linear de megaspores cada um com um número haploid do cromossomo. O mais comumente possível entre diferente espécie vegetal, as mais três esporos apical degeneram enquanto que o esporo chalazal funcional experimenta três redondas de divisão nuclear acompanhadas pela expansão da célula à forma um saco do embrião com um ovo, dois núcleos polares, dois synergids, e três células antipodal. O Apomixis fica um processo que requeira os passos múltiplos e o controle da via de acesso completa do apomixis como ficou mostrado em determinada espécie para requerer a ação dos genes múltiplos (Vão Dijk e outros., a herança, vol. 83: 715-721.1999; Matzk F., e outros., célula da planta, 17 (I): 13-24, 2005). Ficou considerado que os passos individuais do componente controlados por um ou um subconjunto de genes no operando da via de acesso no isolamento teriam um efeito negativo na fertilidade (Spillane, C, Steimer A. e Grossniklaus U., sexo. Planta Reprod. Vol. 14: 179-87, 2001), e este fica somente o ação arrumado do jogo completo de genes compreendendo a via de acesso completa que fica capaz de promover eficientemente apomixis. A análise genética e molecular dos mutantes do Arabidopsis conduziu à identificação de um número de genes que jogam uma missão em períodos do sporogenesis e do gametogenesis (Yang W. C. e Sundaresan V., Curr. Opin. Biol da planta. Vol. 3(1): 53-57, 2000). O mutante do dyad do Arabidopsis ficou identificado como causar a esterilidade da fêmea (Siddiqi I. e outros., desenvolvimento, vol. 127 (1): 197 - 207, 2000) e sua análise mostrada que o mutante do dyad planta o são defeituoso em meiosis da fêmea. A maioria de meiocytes da fêmea no mutante do dyad experimenta única meiosis da divisão para dar a duas células em vez de quatro, seguido por um deter em outros períodos do desenvolvimento incluindo gametogenesis. A meiosis masculina, o desenvolvimento do pólen, e a fertilidade masculina no mutante do dyad foram achados ficam o normal (Siddiqi I. e outros., desenvolvimento, vol. 127 (I): 197-207, 2000; Reddy Τ. V., e outros., desenvolvimento, vol. 130 (24): 5975-5987, 2003). A análise de cromossomos meiotic durante meiosis da fêmea indicou que os cromossomos homólogos não experimentam sinapse e que a divisão reductiva da meiosis 1 fica substituiu por um equational um (Agashe B., Prasad R. K., e Siddiqi L, desenvolvimento, vol. 129 (16), 3935-3943, 2002). Um estudo independente conduziu à identificação do gene de SWII (Motamayor J. C, e outros., sexo. Planta Reprod. Vol. 12:209 - 218, 2000; Mercier R., e outros., genes e revelador. Vol. 15: 1859-1871, 2001), que fica idêntico ao DYAD. O gene identificado por estes estudos fica daqui em antecipe designado o gene do DYAD. O tipo selvagem gene do DYAD do Arabidopsis codifica uma proteína de 639 aminoácidos (NÃO SEQ do ID: 5). Três alelos do gene do DYAD em Arabidopsis ficaram descrito. Estes ficam: i) dyad, tendo um truncamiento no aminoácido 508; a proteína que resulta fica portanto faltando os aminoácidos do C-terminal 130 presentes no tipo selvagem proteína; ii) swil.l que dá lugar à produção de quantidades reduzidas do tipo selvagem proteína que faz alguns meiocytes da fêmea experimentar uma meiosis do equational 1 divisão enquanto que outros experimentam a divisão reductiva; e iii) swil.2 que cria um codón da parada na posição 394 e as causas um phenotype da fêmea similar aos defeitos do dyad mas além disso também das causas na meiosis masculina dando por resultado a esterilidade masculina. A posição correspondente ao alelo do dyad em Boechera fica uma mutação que as causas um frameshift na posição 508 da seqüência de aminoácidos e dos resultados em um codón da parada depois que dez codones adicionais (ou seja, posição 518). As posições correspondentes em arroz ficam em 563 e 572, respectivamente. Sem ficar unido por qualquer teoria da invenção, os inventores sugerem que uma redução na quantidade de proteína do DYAD que tem a porção do carboxy-terminal do polipéptido para colocar 394 (em Arabidopsis, e posições correspondentes em outras espécies) produz um phenotype no qual os meiocytes da fêmea experimentem a divisão da meiosis 1 do equational, dando por resultado a retenção do genotipo da fêmea (e portanto do heterozygosity) em gametas da fêmea. A retenção (ou aproximadamente tão) de uma quantidade normal da proteína do DYAD que tem o domínio da posição 394 à posição 508 (em Arabidopsis e posições correspondentes em outras espécies) preve o desenvolvimento normal do pólen, enquanto a eliminação deste domínio na planta produz um phenotype estéril masculino.

Antes da fabricação da atual invenção, as plantas homozygous para o dyad ou os alelos swil. 2 não tinham ficado divulgado à semente da amostra fraguada. As plantas que levavam ao alelo de swil.I ficaram divulgado para mostrar a semente reduzida fraguada quando é homozygous, mas as sementes que o são produzido ficou analisado com relação a sua constituição cromossômica e encontrou fique diploid, de tal modo mostrando que as sementes se apresentam de um megasporogenesis e de um megagametogenesis normais (Motamayor J. C, e outros., sexo. Planta Reprod. Vol. 12:209 - 218, 2000). Como descrito previamente, os esporos produzidas como resultado do equational, a única meiosis da divisão em dyad, swil.I, e swil.2 seguem sendo bloqueados e até a fabricação da atual invenção, ficou não sabido se nenhum destes tido o potencial de desenvolver-se em gametas da fêmea. Ficou também não sabido até a fabricação da atual invenção se a recombinación experimentada dos cromossomos durante a única meiosis da fêmea da divisão do equational e conseqüentemente os produtos da divisão perdeu heterozygosity parental. A plausibilidad da recombinación associada uma divisão do equational fica apoiado pelos estudos em levedura que demonstram esse a células diploid que o bote entra meiosis, recombinación meiotic da experiência, depois se retiram de meiosis sobre transferência ao meio de crescimento e dividem mitotically. Um bote tão mitotic da divisão conduz à perda de heterozygosity para um marcador genético se a recombinación ocorreu entre o gene e o centromere (Esposito R. E. e Esposito M. S., Proc. Nacional. Acad. Sei. USA vol. 71(8): 3172-3176 1974). A atual invenção se relaciona com o achado que os produtos da divisão da meiosis 1 do equational vista em mutante homozygous do diferente dyad plantam o são capaz de dar lugar a um saco não reduzido funcional do embrião, que tem as características do apomeiosis, um componente importante do apomixis.

A atual invenção se relaciona com o uso do gene do DYAD, especialmente alelos do mutante disso, e seus produtos genéticos, de Arabidopsis1 Boechera, arroz, Populus e outras plantas de manipular gametogenesis e o desenvolvimento da semente para produzir as sementes que genotipo embrionário contém um complemento diploid completo do genoma maternal.

Em uma realização o triploid sementeira são produzidos em Arabidopsis e outros tipos da planta.

A atual invenção também proporciona um método para a produção de uma planta heterótica usando os alelos do mutante do gene e do produto genético do DYAD. Em algumas realizações, as plantas e a semente contêm um complemento diploid completo do genoma maternal, e nenhuma contribuição do genoma paternal, e representam assim apomicts verdadeiros. Às vezes destas realizações, a planta que contribui o genoma maternal fica um híbrido que tem um sortido de alelos que têm um phenotype desejável, e o método dá invenção permite a fixação e a propagação fácil dessa combinação de alelos.

A atual invenção se relaciona com o uso do gene do DYAD e de seu produto genético que conduza à formação de sementes que contêm um complemento diploid completo do genoma maternal. Esta invenção fica útil para fazer as plantas do triploid que o bote fica utilizado para produzir o fruto sem sementes, porque construir as linhas trisomic para os estudos do mapeo, e para a manutenção do heterozygosity da planta e do apomixis da progenitora. Os alelos do DYAD usados na atual formação da causa da invenção de um saco (diploid) não reduzido do embrião. A invenção também se relaciona com o uso do gene do DYAD para causar a formação de um saco não reduzido do embrião sem substancialmente afetar ao desenvolvimento do pólen. A invenção mais futura se relaciona com o uso do gene do DYAD para produzir polyploids de mais uma ordem alta pelo ng do um mesmo [iota] dos triploids, que ficam útil com o fim das plantas da geradora com a biomassas crescente. [0030] [0034] Deve fica entendido que as várias modalidades da invenção exibirão diferentes aspectos da invenção, e pode proporcionar diferentes vantagens da invenção. Não cada realização desfrutará todas as definições das vantagens da invenção:

A frase seqüência de ácido nucleico refere à estrutura de um polímero das bases do desoxirribonucleótido ou do ribonucleotide lidas no extremo aos 5 ' 3'. Em casos de um ácido necleico double-stranded, uma seqüência de ácido nucleico inclui seu complemento no outro filamento.

Um ácido nucleico ou o polinucleotídeo se refere a um polímero trançado único-trançado ou duplo da DNA ou RNA (ou às vezes a análogos de desoxirribonucleótidos ou os ribonucleotides tais como thiophosphate ou os análogos de PNA1 ou aos nucleotides que têm derivados das bases do necleotideos) e inclui a DNA cromossômica, um mesmo-recuando plasmids, os polímeros infecciosos da DNA ou RNA (ou os análogos) e a DNA ou o RNA (ou os análogos) que realizam uma missão sobretudo estrutural.

O final de seqüência do polinucleotídeo fica a miúdo permutable com polinucleotídeo, mas pode referir às vezes à informação da seqüência da molécula, pelo contrário que à molécula por si mesmo.

Um promotor fica definido como agrupamento de seqüências de controle necleico do ácido essa transcrição direta de um ácido necleico operably unido. Segundo o utilizado adjunto, um promotor da planta fica a promotor esse as funções em plantas. Os promotores incluem seqüências de ácido necleico necessárias cerca do lugar do partir da transcrição, por exemplo, no-caso-de um tipo basal promoter, um elemento da polimérase II de TATA. Um promotor também inclui opcionalmente os elementos distais do potenciador ou do repressor, que o bote fica localizado tanto como vários dos mil pares de bases do lugar do partir da transcrição. Um promotor constitutivo fica a promotor que fica condições mais ambientais e mais de desenvolvimento inferiores você ativa. Um promotor inducible fica a promotor que fica o regulamento ambiental ou de desenvolvimento inferior ativa. O termo operably enlaçou refere a um acoplamento funcional entre uma seqüência necleico do controle da expressão do ácido (tal como um promotor ou um agrupamento de lugares de união do fator da transcrição) e uma segunda seqüência de ácido necleico, em onde a seqüência do controle da expressão dirige a transcrição do ácido necleico correspondente à segunda seqüência.

Um casete de expressão compreende três elementos principais: I) um promotor; II) um segundo polinucleotídeo, que pode fica chamado um polinucleotídeo da codificação ou a seqüência codificante que fica operably unido ao promotor e que transcrição fique dirigido do promotor dito quando o casete de expressão fica introduzido em uma célula; e III) um polinucleotídeo da adaptada que dirige a cessação da transcrição e fica imediatamente descendente localizado do segundo polinucleotídeo nomeado. O termo planta inclui as plantas, os órgãos da planta (e.g., folhas, vástagos, flores, raízes, etc.), as sementes e as células da planta e progenie inteiros iguais. A classe de plantas que o bote fique utilizado no método da invenção fica geralmente tão largo como a classe de plantas mais altas suscetíveis às técnicas da transformação, incluindo as angioespermas (você planta monocotyledonous e dicotyledonous), assim como gimnospermas. Inclui as plantas de uma variedade de níveis ploidy, incluindo polyploid, diploid, e haploid. Em algumas modalidades da invenção, fica preferido que a planta fica uma planta monoecious.

Um polinucleotídeo fica heterólogo um organismo ou um segundo polinucleotídeo se tem uma diferente seqüência e origina de uma espécie estranha, ou, se da mesma espécie, fica modificado de sua forma original. Por exemplo, um promotor operably enlaçado a uma seqüência codificante heteróloga refere a uma seqüência codificante de uma espécie diferente da das quais o promotor ficou derivado, ou, se da mesma espécie, uma seqüência codificante que fique diferente de qualquer variante alélica natural.

Um polinucleotídeo exógeno uma planta individual fica um polinucleotídeo que fique introduzido na planta por qualquer meio com exceção perto de um cruzamento sexual. Os exemplos do meio pelas quais este bote fica o são realizado descrito mais abaixo, e incluem a transformação Agrobacteria- mediada, métodos biolistic, a electroporación, e os similares.-Tal planta que contém o ácido necleico exógeno fica designado aqui uma planta transgenica da geração de RI. Você planta de Transgenic que se apresentam de cruzamento sexual ou vendendo a descendentes do são de tal planta. Um ácido nucleico do DYAD ou uma seqüência do polinucleotídeo do DYAD usada na invenção fica uma seqüência do polinucleotídeo do subsequence ou da longitude completa de um ácido nucleico que codifique um polipéptido implicado no controle da meiosis e que, quando é transformado, permita aspectos do apomixis com relação à formação não reduzida do gametophyte da fêmea.

Um gene do DYAD compreende um ácido necleico do DYAD junto com um promotor e outras seqüências de controle da transcrição e da tradução que prevejam a expressão de um produto genético do DYAD em uma célula do anfitrião, preferivelmente em uma planta.

São dos genes do DYAD uma classe de genes da planta que produzem transcrições compreendendo as porções da proteína-codificação que codificam os polipéptidos que têm identidade substancial da seqüência ao polipéptido codificado pelo gene do DYAD do Arabidopsis (NÃO SEQ do ID: 1) e ficou identificado no arroz (ID de Genbank: 62733414) e outras plantas. Um gene do DYAD também ficou identificado no trichocarpa e Zea Mayz (exemplo 9) de Populus. O gene do DYAD fica o presente em uma única cópia no selvagem- tipo Arabidopsis. Por outra parte a abundância da transcrição fica muito baixa enquanto que fica expressado somente nos sporocytes, que compõem a população muito pequena de células nos tecidos finos reprodutivos. O gene do DYAD do Arabidopsis ficou previamente mostrado para jogar um papel crítico na organização meiotic do cromossomo (Agashe B., Prasad R. K., e Siddiqi L, desenvolvimento vol. 129(16): 3935-39432002). Portanto sua função fica fica altamente provavelmente conservado na outra espécie vegetal segundo o indicado pela presença de um gene de perto relacionado em arroz. Os dados na atual aplicação estabelecem que Boechera também tem um gene do DYAD relacionado de perto na ordem com o gene do DYAD do Arabidopsis. No caso da expressão de transgenes e da inibição de genes endógenos (e.g., por interferência de RNA1 antisentido, ou a supressão do sentido) uma de perícia reconhecerá que a seqüência do polinucleotídeo usada não necessita fica idêntico, mas pode fica somente substancialmente idêntico a uma seqüência do gene do qual ficou derivado ou do polinucleotídeo que fica fique inibido. Segundo o explicado abaixo, são substancialmente idênticos destas variantes coberto especificamente pelo ácido necleico do DYAD do termo. No caso onde uma seqüência do polinucleotídeo fica transcrita e traduzida para produzir um polipéptido funcional, um de perícia reconhecerá que devido a degeneração do codón um número de seqüências do polinucleotídeo codificarão o mesmo polipéptido. São destas variantes coberto especificamente pelos termos ácido nucleico do DYAD. Além disso, o termo inclui especificamente essas seqüências substancialmente idênticas (determinado como descrito mais abaixo) com uma seqüência do polinucleotídeo do DYAD descrita adjunto e este codifica os polipéptidos que ficam mutantes do tipo selvagem polipéptidos do DYAD ou conservam a função do polipéptido do DYAD (e.g., o resultar de substituições conservadoras de aminoácidos no polipéptido do DYAD).

Além disso, o bote das variantes fica os que codifiquem mutantes negativos dominantes como descrito mais abaixo, assim como mutantes do absurdo ou os mutantes do frameshift que dão lugar à terminação prematura da tradução. Dois ácidos ou polipéptidos necleico seriam idênticos se a seqüência de nucleotides ou de restos de aminoácidos, respectivamente, nas duas moléculas fica igual quando está alinhada para a correspondência máxima que descrita mais abaixo. Os termos idênticos ou a identidade dos por cento, no contexto de ácidos dois ou mais necleico ou as seqüências do polipéptido, referem a dois ou mais seqüências ou subsequences que fiquem iguais ou têm uma porcentagem especificado dos restos de aminoácidos ou dos nucleotides que ficam iguais, quando é comparado e alinhado para a correspondência máxima sobre uma janela da comparação, segundo o medido o usar de um dos algoritmos da comparação da seqüência da continuação ou pelo alinhamento manual e a inspeção visual. Quando a porcentagem da identidade da seqüência fica utilizado em referência às proteínas ou aos peptídicos, fica reconhecido que as posições do resíduo que ficam não idêntico diferem a miúdo pelas substituições de aminoácidos conservadoras, onde não o há o são dos resíduos dos aminoácidos substituído para outros restos de aminoácidos com as propriedades químicas similares (e.g., cargo ou hydrophobicity) e portanto mudança as propriedades funcionais da molécula. Onde as seqüências diferem em substituições conservadoras, a identidade da seqüência dos por cento pode fica ajustado para em cima a correto para a natureza conservadora da substituição. O meio para fazer este ajuste fica bem conhecido aos da perícia na técnica. Isto implica tipicamente o anotar de uma substituição conservadora como parcial mais bem que de uma união logo que feita completa, de tal modo aumentando a identidade da seqüência da porcentagem. Assim, por exemplo, onde um aminoácido idêntico fica dado uma conta de 1 e uma substituição não-conservadora fica dado uma conta de zero, uma substituição conservadora fica dado uma conta entre zero e 1. O anotar de substituições conservadoras fica calculado segundo, e.g., o algoritmo de Meyers e de Moleiro, computador Applic. Biol. Sei. 4:11 - 17 (1988) e.g., segundo o posto em execução no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif., USA).

A frase substancialmente idêntica, no contexto de dois .acids ou polipéptidos necleico, refere às seqüências ou aos subsequences que têm pelo menos 60%, preferivelmente 80%, preferivelmente identidade do necleotideos 90-95% ou dos restos de aminoácidos quando são alinhados para a correspondência máxima, sobre uma janela da comparação segundo o medido o usar de um dos algoritmos da comparação da seqüência da continuação ou pelo alinhamento manual e a inspeção visual. Esta definição também refere ao complemento de uma seqüência de prova, que tem complementaridade substancial da seqüência ou do subsequence quando a seqüência de prova tem identidade substancial a uma seqüência da referência.

Para a comparação da seqüência, atos de tipicamente uma seqüência como seqüência da referência, à qual o são das seqüências de prova comparou. Ao usar um algoritmo da comparação da seqüência, o são das seqüências da prova e da referência entrou em um computador, o são das coordenadas do subsequence designou, em caso de necessidade, e são dos parâmetros do programa do algoritmo da seqüência designado. Os valores do defeito para os parâmetros do programa ficam utilizado geralmente, mas os valores alternativos para o bote dos parâmetros ficam designado. O algoritmo da comparação da seqüência então calcula as identidades da seqüência dos por cento para as seqüências de prova concernente à seqüência da referência, baseadas nos parâmetros do programa.

Uma janela da comparação, segundo o utilizado adjunto, inclui referência a um segmento de posições contíguas, tipicamente a partir o 20 a 600, geralmente cerca de 50 a cerca de 200, mais geralmente cerca de 100 a cerca de 150 posições contíguas, nas quais uma seqüência pode fica comparado a uma seqüência da referência do mesmo número de posições contíguas depois do são de duas seqüências alinhado ótimo. Os métodos de alinhamento das seqüências para a comparação ficam bem conhecidos na técnica. O alinhamento ótima das seqüências para o bote da comparação fica conduzido, e.g., pelo algoritmo local da homología de Smith e do Waterman, Adv. Appl. Matemáticas. 2:482 (1981), pelo algoritmo do alinhamento da homología de Needleman e de Wunsch, J. Moi. Biol. 48:443 (1970), pela busca para o método da semelhança de Pearson e de Lipman, Proc. Nacional. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), por implementações computerizadas destes algoritmos (ESPAÇO DE SEPARAÇÃO, BESTFIT, FASTA, e TFASTA na pacote de software da genética do Wisconsin, o grupo do computador da genética, o Dr. de 575 ciências, Madison, Wis.), ou pelo alinhamento manual e a inspeção visual.

Um exemplo de um algoritmo útil fica PILEUP. O PILEUP cria um alinhamento múltiplo da seqüência de um grupo de seqüências relacionadas usando a progressista, em casais alinhamentos para mostrar a relação e os por cento ordenam identidade. Também planta uma árvore ou um dendogram que amostra as relações que arraciman usadas para criar o alinhamento. O PILEUP utiliza uma simplificação do método progressivo do alinhamento de Feng D. F., e Doolittle, R.F., J. Moi. Evol. Vol. 35:351 - 360 (1987). O método usado fica similar ao método descrito por Higgins e agudo, CABIOS 5:151 - 153 (1989). O bote do programa alinha até 300 seqüências, cada um de um comprimento máximo de 5.000 nucleotides ou os aminoácidos. O procedimento múltiplo do alinhamento começa com em casais o alinhamento das mais duas seqüências similares, produzindo um grupo de duas seqüências alinhadas. Este grupo fica então alinhado à seqüência ou ao grupo mais relacionada seguinte de seqüências alinhadas. Dois grupos de são das seqüências alinharam por uma extensão simples em casais do alinhamento de duas seqüências individuais. O alinhamento final fica conseguido de uma série de progressista, em casais alinhamentos. O programa fica funcionamento designando seqüências específicas e seu aminoácido ou as coordenadas do necleotideos para as regiões da comparação da seqüência e designando os parâmetros do programa.

Por exemplo, um bote da seqüência da referência fica comparado a outras seqüências de prova para determinar a relação da identidade da seqüência dos por cento usando os parâmetros da continuação: peso do espaço de separação do defeito (3.00), peso da longitude do espaço de separação do defeito (0.10), e espaços de separação carregados do extremo.

Outro exemplo de um algoritmo que fica conveniente para determinar identidade da seqüência dos por cento e semelhança da seqüência fica o algoritmo do BLAST, que fica descrito em Altschul S.F., e outros., J. Moi. Biol. Vol. 215: 403-410 (1990). O software para realizar análise do BLAST fica público disponível com o centro nacional para a informação da biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica primeiro o identificar dos pares da seqüência do cúmulo que anotam (HSPs) identificando palavras curtas da longitude W na seqüência da pergunta, que emparelhe ou satisfaça alguma conta positivo-valorada T do umbral quando está alinhado com uma expressão da mesma longitude em uma seqüência das bases de dados. T fica designado o umbral da conta da expressão da vizinhança (Altschul S. F., e outros., J. Moi. Biol. Vol. 215: 403- 410 (1990).). Este a expressão inicial da vizinhança bate o ato enquanto que as sementes para iniciar buscam para encontrar um HSPs mais longo que os contém. A expressão bate o são estendido em ambas direções ao longo de cada seqüência para por isso o bote acumulativa da conta do alinhamento fica aumentado. A extensão da expressão bate em cada são da direção detido quando: a conta acumulativa do alinhamento cai apagado pela quantidade X de seu valor conseguido máximo; a conta acumulativa vai a zero ou abaixo, devido à acumulação de umas ou mais alinhamentos do resíduo negativo-que anotam; ou o extremo de qualquer seqüência fica alcançado. O W3 T dos parâmetros do algoritmo do BLAST, e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. As aplicações do programa do BLAST como defeitos um wordlength (w) de 11, a matriz que anota BLOSUM62 (veja-se Henikoffe Henikoff1 Proc. Nacional. Acad. Sei. USA 89:10915 (1989)) alinhamentos (b) de 50, expectativa (e) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos filamentos.

O algoritmo do BLAST também realiza uma análise estatística da semelhança entre duas seqüências (veja-se, e.g., a Karlin e a Altschul, Proc. Nacional. Acad. Sei. USA 90:5873 - 5787 (1993)). Uma medida de semelhança proporcionada pelo algoritmo do BLAST fica a probabilidade menor da soma (P (N)), que proporciona uma indicação da probabilidade pela qual um fósforo entre dois necleotideos ou seqüências de aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido necleico fica similar considerado a uma seqüência da referência se a probabilidade menor da soma de uma comparação do ácido necleico da prova ao ácido nucleico da referência fica menos que perto de 0.2, preferivelmente menos que a cerca de 0.01, e preferivelmente menos que a cerca de 0.001.

As variantes conservadoras modificadas aplicam ao aminoácido e às seqüências de ácido nucleico. Com relação a seqüências de ácido necleico particulares, as variantes conservador modificadas referem a esses ácidos necleico que codifiquem seqüências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido necleico não codifica uma seqüência de aminoácidos, às seqüências essencialmente idênticas. Devido à degeneração do código genético, uma grande quantidade de ácidos necleico funcionalmente idênticos codificam qualquer proteína dada. Por exemplo, os codones GCA, GCC, GCG e GCU tudo codificam a alanina do aminoácido. Assim, em cada posição onde uma alanina fica especificado por um codón, o bote do codón fica alterado aos codones correspondentes uces dos descritos sem alterar o polipéptido codificado. Essas variações necleico do ácido ficam as variações silenciosas, que faltam uma espécie de variações conservador modificadas. Cada seqüência de ácido necleico adjunto que codifica um polipéptido também descreve cada variação silenciosa possível do ácido necleico. Um de perícia reconhecerá que cada codón em um bote necleico do ácido (a menos que AGOSTO, que fica ordinariamente o único codón para o methionine) fica modificado para render uma molécula funcionalmente idêntica. Por conseguinte, cada variação silenciosa de um ácido necleico, que codifica um polipéptido, fica implícito em cada seqüência descrita.

Uma seqüência essencialmente idêntica fica um no qual a variação na ordem não afete à função prevista da molécula.

Quanto a seqüências de aminoácidos, uma de perícia reconhecerá que as substituições, as deleciones ou as adições individuais a um ácido, a um peptídico, a um polipéptido, ou a uma seqüência necleico da proteína que altere, acrescente ou suprima um único aminoácido ou uma porcentagem pequeno de aminoácidos na seqüência codificada faltam uma variante conservador modificada quando a alteração dá lugar à substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. A substituição conservadora tabula o abastecimento do são funcionalmente similar dos aminoácidos bem conhecido na técnica.

Os seguintes seis grupos por cada um contêm os aminoácidos as substituições conservadoras para uma outras desse são:

1) Alanina (a), Serine (s), Threonine (t);

2) Ácido aspártico (d), ácido glutámico (e);

3) Asparagina (n), glutamina (q);

4) Arginin (r), Iisina (k);

5) Isoleucine (i), Ieucin (I), Methionine (m), Valine (v); e

6) Phenylalanine (f), Tyrosine (e), Tryptophan (w). (veja-se, e.g., a Creighton, a Proteína (1984)).

Uma indicação que duas seqüências de ácido ou polipéptidos necleico ficam substancialmente idêntico fica que o polipéptido codificado pelo primeiro ácido necleico fica imunológico o cruzamento reativo com os anticorpos levantados contra o polipéptido codificado pelo segundo ácido necleico. Assim, um polipéptido fica tipicamente substancialmente idêntico a um segundo polipéptido, por exemplo, onde os dois peptídicos diferem somente pelas substituições conservadoras. Outra indicação que duas seqüências de ácido necleico ficam substancialmente idêntico fica que as duas moléculas ou seus complementos cruzam por hibridação o um ao outro baixo condições estritas, como descrito mais abaixo. A frase cruzamento por hibridação seletivamente (ou especificamente) refere ao atascamiento, a duplicação, ou o cruzamiento por hibridação de uma molécula somente a uma seqüência particular do necleotideos baixo condições rigorosas da hibridação quando essa seqüência fica o presente em uma mistura complexa (DNA ou RNA e.g., celular ou da biblioteca total).

A frase condições rigorosas da hibridação refere às condições sob as quais uma ponta de prova cruzará por hibridação a seu subsequence do branco, tipicamente em uma mistura complexa de ácido necleico, mas a nenhumas outras seqüências. O são das condições estritas seqüência-dependente e a vontade ficam diferente em diferentes circunstâncias. Seqüências mais compridas cruzam por hibridação especificamente em temperaturas mais altas. Uma guia extensa ao hibridação de ácidos necleico fica achado em Tijssen, técnicas em bioquímicas e o hibridação molecular da biologia com as pontas de prova Nucleic, a descrição de princípios da hibridação e a estratégia do ácido necleico analisa, Elsevier (1993). Geralmente, o são das condições estritas selecionado fica altamente o < perto de 5-10; 0> C. rebaixe que o ponto de fusão termal (Tm) para a seqüência específica em uma fortaleza iônica definida ph. O são baixo das condições do rigor selecionado geralmente fica o < perto de 15-30; 0> C. debaixo de theTm. O Tm fica a temperatura (sob fortaleza iônica definida, o ph, e concentração necleico) na qual os 50% das pontas de prova complementares à branco cruzam por hibridação à seqüência do branco no equilíbrio (como a branco ordena atual superior do são, atTm, 50% do são das pontas de prova ocupado no equilíbrio). As condições estritas querem ficam os nas quais a concentração do sal fique o íon do sódio menos que do perto de 1.0M, tipicamente perto de concentração do íon do sódio de 0.01 a do 1.0M (ou outras sales) em ph 7.0 a 8.3 e a temperatura fica pelo menos o < perto de 30; 0> C. para os nucleotides curtos das pontas de prova (e.g., 10 a 50) e pelo menos o < perto de 60; 0> C. para as pontas de prova compridas (e.g., 50 nucleotides maior que). As condições estritas podem também ficam conseguido com a adição de agentes de desestabilização tais como formamida. Para o hibridação seletivo ou específico, um sinal positiva fica pelo menos o antecedente de duas vezes, hibridação do antecedente de preferivelmente 10 vezes. Os ácidos Nucleic que não cruzam por hibridação o um ao outro baixo condições estritas ainda ficam substancialmente idêntico se os polipéptidos que codificam o são substancialmente idêntico. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido necleico fica criado usando a degeneração máxima do codón permitida pelo código genético. Em tais casos, os ácidos necleico cruzam por hibridação tipicamente baixo condições moderado rigorosas de hibridação.

Na atual invenção, a DNA genômica ou o cDNA que compreende os ácidos necleico do DYAD fica utilizado no bote da invenção fica identificado em manchas meridionais da standard baixo condições estritas usando as seqüências de ácido necleico descritas aqui.

Para os propósitos desta divulgação, as condições estritas convenientes para tais hibridações ficam os que incluam um hibridação em uma almofada de formamida de 40%, IM NaCI1 1% SDS no < 37; 0> C, e pelo menos uma filtragem em 0.1 X IX a SSC1 preferivelmente 0.5X SSC, preferivelmente 0.2X SSC em uma temperatura pelo menos do < perto de 50; 0> C, geralmente < perto de 55; 0> C, até o < perto de 60; 0> C, para 20 minutos, ou as condições do equivalente. Uma hibridação positiva fica pelo menos duas vezes o antecedente. Os dos conhecimentos normais reconhecerão facilmente essa hibridação alternativa e o bote das condições da filtragem fica utilizado para proporcionar condições do rigor similar.

Outra indicação que dois polynucleotides ficam substancialmente idêntico fica se a seqüência da referência, amplificada por um par de cartilhas do oligonucleotide, bote então fica utilizado enquanto que uma ponta de prova sob condições rigorosas da hibridação isolar a seqüência de prova de um cDNA ou de uma biblioteca genômica, ou identificar a seqüência de prova dentro, uma mancha e.g., nortista ou meridional.

Um híbrido da planta fica definido como planta obtida pela cruz dois dos cultivars da mesma espécie vegetal.

Um híbrido interespecífico fica definido como planta obtida pela cruz dois das plantas de diferentes espécies.

Uma progenitora da fêmea em um evento reprodutivo fica definido como a planta que leva a semente. A atual invenção proporciona o gene do DYAD e seu produto e métodos que implicam a aplicação das aproximações genéticas moleculares para o controle do desenvolvimento e do apomixis da semente. A invenção mais futura se relaciona com os alelos do mutante do gene do DYAD que expressam uma forma truncada do polipéptido do DYAD que carece a porção do C-terminal da proteína nativa, e de causas o desenvolvimento de um gametophyte não reduzido da fêmea enquanto que ao mesmo tempo deixa o desenvolvimento do pólen substancialmente inalterado segundo o determinado por ensaios da viabilidade do pólen e o exame microscópico da segregação do cromossomo na meiosis masculina. Também se relaciona com as seqüências do necleotideos para um alelo específico do mutante da fêmea do gene do DYAD1 este codifica um polipéptido do DYAD que carece o a.C. - a porção terminal do polipéptido nativo do DYAD, e tal que a expressão do polipéptido do mutante em plantas conduz especificamente ao desenvolvimento não reduzido do gametophyte da fêmea mas não afeta substancialmente ao desenvolvimento do pólen. Tal alelo do mutante expressaria um polipéptido do DYAD que, por exemplo no caso de um alelo do mutante do Arabidopsis, carece o tudo ou uma parte da porção das seqüências nativas do polipéptido entre o aminoácido 509 e o aminoácido 639 em NÃO SEQ do ID: 5 mas contém todas as seqüências de codificação do polipéptido da região até o aminoácido 394. Também proporciona mais longe as seqüências do necleotideos que cruzam por hibridação, baixo condições estritas à seqüência dada em NÃO SEQ do ID: 4 e que codificam os derivados da deleción do C-terminal dos polipéptidos nativos do DYAD em onde a deleción corresponde a uma região entre o aminoácido 509 e 639 em NÃO SEQ do ID: 5 segundo o determinado por comparação com NÃO SEQ do ID: 5 usando uma janela da comparação. As porções correspondentes bote das proteínas do DYAD de Boechera, do arroz, e de Populus ficam identificado pela referência à figura 11. As composições da invenção também compreendem os derivados da deleción do C-terminal das seqüências nativas do polipéptido do DYAD, e as proteínas de fusão e os ácidos necleico que as codificam, formados dos polipéptidos do DYAD e das seqüências antedichos da proteína, tais como proteínas do receptor do hormônio da glucocorticoide, que transportam condicional a proteína de fusão no núcleo de uma célula da planta.

Os métodos da invenção compreendem a expressão das seqüências do polinucleotídeo do DYAD em plantas para produzir os gametas não reduzidos da fêmea que conservam o genotipo da progenitora. A produção de tais gametas não reduzidos da fêmea fica útil para o apomixis da engenharia e para fixar heterosis, assim como para a produção das plantas do triploid. Em uma modalidade da invenção uma seqüência do polinucleotídeo do DYAD pode fica introduzido no genoma de uma planta por quaisquer de vários métodos bem conhecidos para a transformação em onde fica expressado na planta como antisentido ou como RNA double-stranded de tal modo que conduz à inibição do gene endógeno do DYAD e que causa a produção dos gametas não reduzidos da fêmea. Em outro a.C. da modalidade da invenção - a delecíón terminal das seqüências do polinucleotídeo do DYAD fica introduzido no genoma de uma planta como parte de um casete de expressão e conduz à formação de gametophytes não reduzidos da fêmea, enquanto ao mesmo tempo deixa o desenvolvimento do pólen substancialmente inafectado. A expressão das seqüências do polinucleotídeo do DYAD nas plantas que conduzem ao bote não reduzido da formação do gametophyte da fêmea então fica utilizado gerar as sementes apomictic pelo desenvolvimento parthenogenetic da célula do ovo em um embrião. A expressão de tais seqüências do polinucleotídeo do DYAD em híbridos da planta conduz à formação de gametas não reduzidos da fêmea que conservem o genotipo da progenitora de tal modo que conduz à fixação do heterosis na geração seguinte. A fixação do heterosis fica muito útil pois permitiria a multiplicação de sementes híbridas selfing sem ter de recorrer aos cruzamentos entre dois cultivars da progenitora de diferir genotipo.

Ainda outra modalidade da invenção fica a expressão das seqüências do polinucleotídeo do DYAD em híbridos interespecíficos da espécie vegetal que conduce a a formación de un gamete no reducido da fêmea, que o bote fica utilizado para a semente apomictic da generadora. A generación de tales semillas apomictic fica útil para introgressing Ios genes agronômico útiles a partir da especie vegetal a uma en otras especies. Otra modalidad da invención implica a expresión condicional o controlada Ias secuencias das secuencias do polinucleotídeo do DYAD o do polipéptido do DYAD y/o Ias actividades de eso. Tal expresión condicional puede fica utilizado promover a generación de gametas no reducidos da fêmea y por Io tanto de semillas apomictic solamente cuando es deseada. Los métodos para efectuar a expresión condicional o a actividad das secuencias do polinucleotídeo y do polipéptido en plantas quedan bien conocido en a técnica y Io incluyen pero son no limitado a a expresión génica inducible do etanol (Devaux y otros., a planta J., vol. 36(6): 918-930, 2003), control inducible da hormônio esteroide da actividad (Schena M., Lloyd A: M. y Davis R. W., Proc. Nacional. Acad. Sei. USA vol. 88(23): .10421-10425, 1991), y Tetracycline medió o control da expresión (Bohner S. y otros., planta J. Vol. 9(1): 87-95, 1999).

O EXEMPLO 6 abajo describe uma modalidad da invención en donde puede uma población homogenous de plantas que muestra o phenotype do mutante do dyad fica desarrollado. Iguales pueden quedan realizado empleando o DYAD condicional RNAi o o antisentido en o cual o DYAD RNAi o o antisentido construye fica o control inferior expresado de un promotor condicional. Otra manifestación da invención fica uno en o cual uma copia que complementa do gen do DYAD fique expresado en uma planta bajo control de un promotor condicional, en un antecedente genético que fique homozygous para un alelo do mutante do dyad 5. Todavia otra manifestación da invención emplearía cruz uma primera planta que Ileva a un DYAD RNAi o o antisentido construye o control inferior expresado de un promotor que fique o control inferior expresado de un transactivator y en donda primera planta carece o transactivator, a uma segunda planta que expresse o transactivator. As seqüências isoladas preparadas como adjunto bote descrito ficam utilizado em um número 10. de técnicas, por exemplo, suprimir ou alterar a expressão genética endógena do DYAD. A modulação da expressão genética do DYAD ou da atividade do DYAD em plantas fica particularmente útil, por exemplo como parte de um sistema para gerar a semente apomictic.

Isolamento dos ácidos Nucleicos do DYAD 15 geralmente, a nomenclatura e os procedimentos do laboratório em são descrito mais abaixo da tecnologia de DNA recombinant isso bem conhecido e comumente empregado na técnica. São das técnicas da standard usado para a reprodução, isolamento da DNA e do RNA1 amplificação e purificação. Geralmente as reações enzimáticas que implicavam o ligasse da DNA1 a polimérase da DNA1 as endonucleasas da restrição e o são dos similares se realizaram segundo 20 especificações do fabricante. Estas técnicas e são outro das técnicas se realizaram geralmente segundo Sambrook e outros., manual daboratório molecular da Reprodução- UM, laboratório do porto da mola do frio, porto da mola do frio, N. E., (1989). O isolamento dos-ácidos-necleico-dO DYAD pode fica realizado por um número de técnicas. Por exemplo, o oligonucleotide sonda baseado nas seqüências descritas aqui o bote 25 fica utilizado identificar o gene desejado em um cDNA ou uma biblioteca genômica da DNA. Para construir as bibliotecas genômicas, segmentos grandes do são genômico da DNA gerado pela fragmentação ao acaso, e.g. usar as endonucleasas da restrição, e o são ligado com a DNA do vetor aos concatemers da forma que o bote fica encheu no vetor apropriado. Para preparar uma biblioteca de ADNc1 o mRNA fica isolado do órgão desejado, tal como óvulos, e de uma biblioteca de ADNc, 30 que contém a transcrição do gene do DYAD, fica preparado do mRNA. Alternativamente, o cDNA pode fica preparado do mRNA extraído de outros tecidos finos nos quais os genes ou os homologs do DYAD fiquem expressado. O bote do cDNA ou da biblioteca genômica então fica defendido usando uma ponta de prova baseada sobre a seqüência de um gene clonado do DYAD descrito aqui. As pontas de prova podem ficam utilizado cruzar por hibridação com a DNA genômica ou as seqüências de cDNA para isolar os genes homólogos no mesmo ou a diferente espécie vegetal. Alternativamente, os anticorpos levantados contra um bote do polipéptido do DYAD ficam utilizado à tela uma biblioteca da expressão do mRNA.

Alternativamente, os ácidos necleico do bote do interesse ficam amplificado de amostras necleico do ácido usando técnicas da amplificação. Por exemplo, o bote da tecnologia da reação em corrente da polimérase (PCR) fica utilizado amplificar as seqüências dos genes do DYAD diretamente da DNA genômica, do cDNA, das bibliotecas genômicas ou das bibliotecas de ADNc. PCR e outros métodos in vitro da amplificação podem também ficam útil, por exemplo, às seqüências de ácido necleico do clono que o código para as proteínas fica expressado, para fazer os ácidos necleico para utilizar como sonda para a detecção da presença do mRNA desejado em amostras, para o ácido necleico que ordena, ou para outros propósitos. Para uma descrição do general de PCR veja os protocolos de PCR: Uma guia aos métodos e às aplicações. (Innis, M, Gelfand, D., Sninsky, J. e branco, T., eds.), imprensa acadêmica, San Diego (1990).

Cartilhas apropriadas e pontas de prova para identificar seqüências do DYAD do são dos tecidos finos de planta gerado das comparações das seqüências proporcionadas aqui com outros genes relacionados DYAD ou as proteínas que codificam. Por exemplo, o bote do DYAD do holboelli de Boechera fica comparado ao gene de perto relacionado do arroz (não do ID de Genbank. 50917243). Usando estas técnicas, uma do bote da perícia identifica regiões conservadas nos genes ou os polipéptidos descritos aqui para preparar a cartilha apropriada e para sondar seqüências. As cartilhas que cruzam por hibridação especificamente às regiões conservadas em bote relacionado DYAD dos genes ficam utilizado amplificar seqüências da espécie vegetal extensamente divergente. As técnicas necleico da hibridação do ácido da standard que usam as condições descritas sobre o bote então ficam utilizado identificar o cDNA ou clones genômicos da longitude completa. Controle da atividade ou da expressão genética do DYAD.

Desde são dos genes do DYAD implicado em meiosis do controle e ploidy dc gametophyte da fêmea, a inibição da atividade endógena do DYAD ou a expressão genética fica útil em um número de contextos. Por exemplo, inibição da expressão ou modificação da atividade do DYAD por meio de um a.C. do transporte do alelo - o bote terminal da deleción como se descreve anteriormente fica utilizado para a produção do fruto com ausente ou pequeno/degradou a semente (designada aqui o fruto sem sementes). Na maioria da espécie vegetal a criação dos defeitos das causas dos triploids na formação de células do germe devidas à segregação desequilibrada dé cromossomos em meiosis e conduz à ausência de sementes ou a formação de pequeno/degradou as sementes. A inibição do bote endógeno da expressão ou da atividade do DYAD permite o controle de ploidy. Assim, em algumas realizações das plantas da invenção na qual a atividade do DYAD fica inibido ou modificado, sementeira o são ausente ou degradado e o são sem sementes do fruto produzido.

Outro uso dos ácidos necleico da invenção fica no desenvolvimento da planta apomictic alinha (isto é, as plantas nas quais os processos reprodutivos asexuales ocorrem no óvulo, vem, KoIrunowA., a célula da planta, Vol.5: 1425- 1437 (1993) para uma discussão do apomixis). O Apomixis proporciona meio de uma novela para selecionar e para fixar os genotipos heterozygous complexos que o bote não fica mantido facilmente pela criação tradicional. Assim, por exemplo, as novas linhas híbridas com o bote desejado dos rasgos (e.g., vigor híbrido) ficam obtido e mantido facilmente. Um de perícia reconhecerá que um número de bote dos métodos fica utilizado modular atividade ou a expressão genética do DYAD. O bote da atividade do DYAD fica modulado na célula da planta no gene, o transcriptional, o posttranscriptional, o de translação, ou posttranslational, níveis. As técnicas para modular atividade do DYAD em cada um destes níveis ficam geralmente bem conhecido a um de perícia e algumas ficam discutido brevemente abaixo.

Métodos para introduzir mutações genéticas no são dos genes da planta bem conhecido. Por exemplo, as sementes ou o outro bote do material de planta ficam tratado com uma substância química mutágena, segundo técnicas da standard. Essas substâncias químicas incluem, somente são não limitado a, a continuação: sulfato, imina do etileno, methanesulfonate do etil e N-nitroso-N- ETHYLUREa diethyl. Alternativamente, a radiação de ionização de fontes por exemplo, por exemplo, as radiografias, os raios gamma, ou o bote dos nêutrons rápidos ficam utilizado. As plantas que levavam a mutações em seqüências genéticas do DYAD que o bote fica identificado pelo crivado molecular das povoações reunidas de mutagenized as plantas usando as cartilhas de PCR para amplificar as seqüências do necleotideos do DYAD seguidas pela análise dos produtos de PCR para identificar as plantas que levavam a mutações genéticas em seqüências do polinucleotídeo do DYAD. Os métodos para o crivado e as plantas o identificar que levavam a mutações em seqüências genéticas específicas ficaram descrito (Henikoff S., Bradley T. J. e Comai L., planta Physiol. Vol. 135(2): 630-636, 2004). [0064] [0080] Alternativamente, o bote homólogo da recombinación fica utilizado induzir interrupções apontadas do gene especificamente suprimindo ou alterando o gene do DYAD in vivo (veja-se, geralmente, Grewal e Klar, genética 146: 1221-1238 (1997) e Xu e outros., revelador dos genes. 10: 2411- 2422 (1996)). A recombinación homóloga ficou demonstrado nas plantas (Puchta e outros., Experientia 50: 277-284 (1994), Swoboda e outros., EMBO J. 13: 484-489 (1994); Offringa e outros., Proc. Nacional. Acad. Sei. USA 90: 7346-7350 (1993); e Kempin e outros. Natureza 389:802 - 803 (1997)). Em aplicar tecnologia homóloga da recombinación aos genes da invenção, as mutações em porções selecionadas de seqüências genéticas do DYAD (5 incluindo contra a corrente, 3 descendentes, e as regiões intragenic) por exemplo isso aqui são descrito fizeram in vitro e então introduzido na planta desejada usando técnicas da standard. Já que a eficácia da recombinación homóloga fica sabido fica dependente nos vetores usados, uso do gene dicistronic que aponta vetores como descritos por Mountford e outros. Proc. Nacional. Acad. Sei. USA 91: 4303-4307 (1994); e Vaulont e outros. Transgenic Cabeça de gado. 4: 247-255 (1995) são convenientemente aumentavam a eficácia de selecionar para a expressão genética alterada do DYAD em plantas transgenic. O gene transformado agirá reciprocamente com o selvagem-tipo gene do branco de uma maneira tal que a recombinación homóloga e a substituição apontado do selvagem-tipo gene ocorram em células transgenic da planta, dando por resultado a supressão da atividade do DYAD. Alternativamente, os oligonucleotides compostos de um contíguo estiram do RNA e os resíduos da DNA em uma conformação da duplex com os remates duplos do grampo no bote dos extremos ficam utilizado. A seqüência de RNA/DNA, fica desenhada para alinhar com a seqüência do gene do DYAD do branco e para conter a mudança desejado do necleotideos. A introdução do oligonucleotide quimérico em um plasmid extrachromosomal de T-DNA dá lugar à conversão eficaz e específica do gene do DYAD dirigida pelas moléculas quiméricas em uma pequena quantidade de células transformadas da planta. Este método fica descrito em Cole-Strauss e outros. Ciência 273:1386 - 1389 (1996) e Yoon e outros. Proc. Nacional. Acad. Sei. USA 93: 2071-2076 (1996). O bote da expressão genética fica feito inativo usando as técnicas de DNA recombinant transformando a células da planta com constrói compreender transposons ou seqüências de T-DNA. Os mutantes do DYAD se prepararam pelo são destes métodos identificado segundo técnicas da standard. Por exemplo, o bote dos mutantes fica detectado por PCR ou por detecção da presença ou a ausência de mRNA do DYAD, e.g., pelas manchas nortistas ou a transcrição reversa seguida por PCR (RT-PCR). O bote dos mutantes também fica selecionado analisando para as alterações em fertilidade, meiosis da fêmea, e o desenvolvimento do megaspore.

As seqüências de ácido necleico isoladas preparadas como adjunto bote descrito também ficam utilizado em um número de técnicas à expressão genética endógena do DYAD do controle nos vários níveis. Subsequences do bote descrito das seqüências aqui fica utilizado à transcrição do controle, à acumulação do RNA, à tradução, e aos similares.

Um número de bote dos métodos fica utilizado inibir a expressão genética em plantas. Por exemplo, o bote da tecnologia de interferência do RNA (RNAi) fica utilizado convenientemente. Para conseguir isto, um segmento necleico do ácido do gene desejado fica clonado como uma repetição invertida na qual o são de duas cópias se separou por um espaciador que pode fica comumente entre 5 e 2000 nucleotides em longitude, preferivelmente entre 30 e 500 nucleotides, e preferivelmente entre 50 e 200 nucleotides. A repetição invertida fica operably unido a um promotor seguido por uma adaptada tais que ambas cópias querem ficam transcrito e dão lugar a uma espécie do RNA que fique um mesmo-complementar ao longo de tudo ou uma parte de sua longitude. O construir fica então transformado nas plantas e o RNA bicatenario fica produzido.

Como outro caso, bote da tecnologia do antisentido fica utilizado convenientemente inibir a expressão genética do DYAD. Para conseguir isto, um segmento necleico do ácido do gene desejado fica clonado e operably unido a um promotor tais que o filamento do antisentido da vontade do RNA fica transcrito. O construir fica então transformado nas plantas e o filamento do antisentido do RNA fica produzido. Em células da planta, ficou sugerido que ato do bote da supressão do antisentido em todos os níveis do regulamento do gene incluindo a supressão da tradução do RNA (veja-se, planta Sci de Bourque. (Limerick) 105: 125-149 (1995); Pantopoulos em marcha na investigação Nucleic e a biologia molecular, vol. do ácido. 48. Cohn, W. E. e K.

Moldave (edição.). Imprensa acadêmica, inc.: San Diego, a Califórnia, USA; Londres, a Inglaterra, O REINO UNIDO. p. 181-238; Heiser e outros. Planta Sei. (Shannon) 127: 61-69 (1997)) e prevenindo a acumulação do mRNA que codifica a proteína do interesse, (veja-se, planta Moi de Baulcombe^ Bio. 32:79 - 88 (1996); Arco de Prins e de Goldbach. Virol. 141: 2259-2276 (1996); Metzlaff e outros. Célula 88: 845-854 (1997), Sheehy e outros., Proc. Nacional. Acad. Sei. USA, 85:8805 - 8809 (1988), e Hiatt e outros., os Eua Patente. Não. 4.801.340).

O segmento necleico do ácido fica geralmente introduzida vontade fica substancialmente idêntico pelo menos a uma porção do gene endógeno do DYAD ou os genes ficam reprimido. A seqüência, no entanto, não necessita fica perfeitamente idêntico para inibir a expressão. Os vetores do atual bote da invenção ficam desenhado tais que o efeito inibitório aplica a outros genes dentro de uma família de genes que exibe a homología ou a homología substancial ao gene do branco.

Para a supressão do antisentido, a seqüência introduzida também não necessita fica longitude completa concernente ao produto primário da transcrição ou ao mRNA inteiramente tratado. Geralmente, mais um bote alto da homología fica utilizado compensar o uso de mais uma seqüência curta. Além disso, a seqüência introduzida não necessita ter o mesmo patrão do intron ou do exón, e a homología dos segmentos do não-codificação pode fica igualmente eficaz. Normalmente, uma seqüência entre de cerca de 30 ou 40 nucleotides e sobre os nucleotides integrais fique utilizado, mesmo que uma seqüência pelo menos de cerca de 100 nucleotides fica preferido, uma seqüência pelo menos de cerca de 200 nucleotides fica preferido, e uma seqüência de cerca de 500 a cerca de 1700 nucleotides fica preferido especialmente.

Um número de bote das regiões do gene fica apontado para suprimir a expressão genética do DYAD. O bote dos brancos inclui, por exemplo, as regiões codificantes, os introns, as seqüências de ensambladuras do exón/do intron, 5 ' ou 3 ' regiões sem traduzir, e os similares. Em algumas realizações, constrói o bote ficam desenhado para eliminar a capacidade de proteínas reguladoras de atar às seqüências genéticas do DYAD que ficam necessário para sua expressão da célula e/ou do específico do tecido fino. Essas seqüências reguladoras do transcriptional que o bote fica localizaram ou 5 reguladores negativos reguladores positivos ' -, 3 ' -, ou dentro da região codificante do gene e o bote fica promove (elemento)-ou reprime (a transcrição do gene do elemento). O bote destas seqüências fica identificado usando a análise da deleción da standard, bem conhecida às da perícia na técnica. Uma vez que o são das seqüências identificado, um antisentido construa apontar estas seqüências fique introduzido nas plantas ao tecido fino da transcrição do gene do controle particularmente, por exemplo, em desenvolver os óvulos e/ou a semente.

O bote Oligonucleotide-baseado da formação do triplo-hélice fica utilizado romper a expressão genética do DYAD. O bote da DNA de Triplex inibe a transcrição e a réplica da DNA, gera mutações lugar-específicas, cinde a DNA, e induz a recombinación homóloga (veja-se, e.g., Havre e Glazer J. Virologia 67:7324 - 7331 (1993); Scanlon e outros. FASEB J. 9:1288 - 1296 (1995); Giovannangeli e outros. Bioquímicas 35:10539 - 10548 (1996); Chan e Glazer J. Moi. Medicina (Berlim) 75: 267-282 (1997)). O bote triplo de DNAs da hélice fica utilizado apontar as mesmas seqüências identificadas para o regulamento do antisentido.

As moléculas de ARN catalíticas ou o bote dos ribozymes também ficam utilizado inibir a expressão dos genes do DYAD. Fica possível aos ribozymes do design que especificamente par com virtualmente qualquer RNA do branco e cinde a corrente principal do phosphodiester em uma localização específica, fazendo inativo de tal modo funcionalmente o RNA do branco. Em realizar esta cisão, o ribozyme fica não sim mesmo alterado, e fica assim capaz de reciclar e de escindir outras moléculas, fazendo-lhe uma enzima verdadeira. A inclusão das seqüências do ribozyme dentro do antisentido RNAs confere RNA-cindindo atividade sobre elas, de tal modo aumentando a atividade do constrói. Assim, o bote dos ribozymes fica utilizado apontar as mesmas seqüências identificadas para o regulamento do antisentido. Um número de classes de ribozymes ficaram identificado. Uma classe de ribozymes fica derivado de um número de RNAs circular pequeno que fiquem capaz do um mesmo-cisão e da réplica em plantas. O RNAs recua ou só (viroid RNAs) ou com um vírus do ajudante (RNAs baseado nos satélites). Os exemplos incluem RNAs do viroid do sunblotch do abacate e o RNAs baseado nos satélites do vírus do ringspot do tabaco, do vírus transitório da raia de alfafa, do vírus da cópia moteada do tabaco do-veludo, do-vírus-da cópia moteada do nodiflorum da solanácea e do vírus subterrâneo da cópia moteada do trébol. O design e o uso dos ribozymes RNA-específicos dó branco fica descrito em Zhao e a natureza 365:448 - 451 da seleção (1993); Eastham e Ahlering J. Urologia 156:1186 - 1188 (1996); Sokol e Murray Transgenic Res. 5:363 - 371 (1996); Sun e outros. Mol. Biotecnologia 7:241 - 251 (1997); e Haseloff e outros. Natureza, 334:585 - 591 (1988). [0091] Outro método de supressão fica o cosuppression do sentido. A introdução do ácido necleico configurada na orientação do sentido ficou mostrado fica o meio eficaz pelas quais ao bloco a transcrição dos genes do branco. Para um exemplo do uso deste método de modular a expressão de genes endógenos (veja-se, Assaad e outros. Planta Moi. Bio. 22: 1067-1085 (1993); Flavell Proc. Nacional. Açad. Sei. USA 91: 3490-3496 (1994); Stam e outros. Os anais BOT. 79: 3-12 (1997); Napoli e outros., a célula 2:279 - 289 da planta (1990); e os Eua Patente. Não. 5.034.323, 5.231.020, e 5.283.184). O efeito repressivo pode ocorrer onde a seqüência introduzida não contém nenhuma seqüência codificante por si mesmo, mas somente intron ou as seqüências sem traduzir homólogas às seqüências presentes na transcrição primária da seqüência endógena. A vontade introduzida da seqüência fica geralmente substancialmente idêntica à seqüência endógena prevista fica reprimido. Esta vontade mínima da identidade fica tipicamente o perto de 65% maior que, mas mais uma identidade alta pôde exercer mais uma repressão eficaz da expressão das seqüências endógenas. Uma identidade substancialmente maior de mais que o perto de 80% fica preferido, mesmo que o perto de 95% à identidade absoluta fica preferido. Como com o regulamento do antisentido, o efeito deve aplicar a qualquer outra proteína dentro de uma família similar de genes que exibe a homología ou a homología substancial. Para a supressão do sentido, a seqüência introduzida, necessitando identidade menos que absoluta, também não necessita fica longitude completa, concernente ao produto primário da transcrição ou ao mRNA inteiramente tratado. Isto pode fica preferido evitar a produção concorrente de algumas plantas que fiquem overexpressers. Mais uma identidade alta em um mais curto que seqüência da longitude completa compensa mais uma seqüência comprida, menos idêntica. Além disso, a seqüência introduzida não necessita ter o mesmo patrão do intron ou do exón, e a identidade não dos segmentos de codificação quer fica igualmente eficaz. Normalmente, uma seqüência dos intervalos de tamanho notados em cima para o regulamento do antisentido fica utilizado. Além disso, as mesmas regiões do gene notadas para o bote de regra do antisentido ficam apontado usando tecnologias do cosuppression.

Alternativamente, eliminar as proteínas que ficam necessário para a expressão genética específica da célula do DYAD pode modular atividade do DYAD.

Assim, a expressão de proteínas reguladoras e/ou das seqüências que o bote da expressão genética do DYAD do controle fica modulou com os métodos descritos aqui.

Outro método fica uso da supressão construída do tKNA da tradução do mRNA do DYAD. Este método implica o uso dos tKNAs do supressivo aos genes do branco do transactivate que contêm codones prematuros da parada (veja-se, Betzner e outros. Planta J.I 1:587-595 (1997);

e Choisne e outros. Planta J.l 1: 597-604 (1997). Uma linha da planta que contém um gene constitutivo expressado do DYAD que contenha um codón ambarino da parada fica primeiro criado. As linhas múltiplas de plantas, cada gene do supressivo do tRNA que contém constroem sob direção do tipo são específico da célula dos promotores também gerado. O gene do tRNA constrói fica então cruzado na linha do DYAD para ativar atividade do DYAD de uma maneira apontada. Estas linhas do supressivo do tRNA poderiam também ficam utilizado apontar a expressão de qualquer tipo de gene aos mesmos tipos da célula ou do tecido fino.

A produção de formas dominante-negativas de polipéptidos do DYAD que fiquem defeituoso nas suas capacidades de atar a outras proteínas fica o meio conveniente para inibir atividade endógena do DYAD. Esta aproximação implica a transformação de plantas com constrói os polipéptidos de codificação do DYAD do mutante que os complexos defeituosos da forma com as proteínas endógenas e de tal modo evitam que o complexo forme corretamente. O polipéptido do mutante pode variar da seqüência natural no nível primário da estrutura pelas substituições de aminoácidos, as adições, as deleciones, e os similares. O bote destas modificações fica utilizado em um número de combinações produzir a corrente modificada final da proteína. O uso de mutantes negativos dominantes de fazer inativo os genes do branco fica descrito em Mizukami e outros. Célula 8:831 - 845 da planta (1996). Outra estratégia para afetar à capacidade de uma proteína do DYAD de agir reciprocamente com sim mesmo ou com outras proteínas implica o uso dos anticorpos específicos ao DYAD. Neste método a expressão célula-específica do ABS DYAD-específico fica utilizado há inativo domínios funcionais através de anticorpo: reconhecimento do antígeno (veja-se, Hupp e outros. Célula 83:237-245 (1995)).

Uso dos ácidos Nucleic da invenção de potenciar a expressão genética do DYAD.

As seqüências isoladas preparadas como adjunto bote descrito também ficam utilizado introduzir a expressão de um ácido necleico do DYAD particular para potenciar ou para aumentar a expressão genética endógena. O bote potenciado da expressão também fica utilizado, por exemplo, aumentar crescimento vegetativo evitando que a planta fragüe a semente. Onde o overexpression de um gene fica desejado, o gene desejado de uma diferente espécie pode fica utilizado aos efeitos potenciais da supressão do sentido da diminuição.

Um de perícia reconhecerá que os polipéptidos codificados pelos genes da invenção, como outras proteínas, têm diferentes domínios que realizem diferentes funções. Assim, as seqüências genéticas não necessitam ficam longitude completa, sempre e quando o domínio funcional desejado da proteína fica expressado.

O bote modificado das correntes da proteína também fica as várias técnicas de DNA recombinant que utilizam facilmente desenhadas bem conhecidas aos expertos na matéria e descritas detalhadamente, abaixo. Por exemplo, o bote das correntes varia da seqüência natural no nível primário da estrutura pelas substituições de aminoácidos, as adições, as deleciones, e os similares. O bote destas modificações fica utilizado em um número de combinações produzir a corrente modificada final da proteína.

Preparação de vetores Recombinantes

Para utilizar seqüências isoladas nas técnicas antedichas, vetores de DNA recombinant convenientes para a transformação do são das células da planta preparado. As técnicas para transformar uma variedade ampla de uma espécie vegetal mais alta ficam bem conhecido e descrito na literatura técnica e cientista. Veja, por exemplo, a Weising e outros. Anúncio. Investidor de corrente. Genet. 22:421 - 477 (1988). Uma codificação para o polipéptido desejado, por exemplo uma seqüência de cDNA da seqüência de DNA que codifica uma proteína integral, ou uma proteína de fusão do DYAD a uma seqüência intracelular da localização, ou a uma proteína truncada do DYAD, vontade fica preferivelmente combinado com as seqüências reguladoras do transcriptional e da iniciação de translação que direto a transcrição da seqüência do gene nos tecidos finos previstos da planta transformada. Por exemplo, para o overexpression, um fragmento do promotor da planta pode fica empregado que expressão direta do gene em todos os tecidos finos de uma planta regenerada. Tal são dos promotores se referiu adjunto como promotores constitutivos e fica inferior ativo a maioria das condições ambientais e dos estados do desenvolvimento ou da diferenciação celular. Os exemplos de promotores constitutivos incluem a região da iniciação da transcrição 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV). O 1 - ou o promotor do t derivou de T- DNA dos tumafaciens do Agrobacterium, e de outras regiões da iniciação da transcrição dos vários genes da planta sabidos aos da perícia. Essas genes incluem por exemplo, ACTI 1 do Arabidopsis (Huang e outros. Planta Moi. Biol. 33:125 - 139 (1996)), Cat3 do Arabidopsis (não de GenBank. U43147, Zhong e outros., Moi. Gerador. Genet. 251:196 - 203 (1996)), a desaturasa de codificação da proteína portadora do stearoyl-Acilo do gene do napus da Brassica (não de Genbank. X74782, Solocombe e outros. Planta Physiol. 104:1167 - 1176 (1994)), GPcI do milho (não de GenBank. X15596, Martinez e outros. J. Moi. Biol 208:551 - 565 (1989)), e Gpc2 do milho (não de GenBank. U45855, Manjunath e outros., planta Moi. Biol. 33:97 - 112 (1997)). Alternativomente, o promotor da planta pode expressão direta do ácido necleico do DYAD em um tecido fino específico ou pode fica de outra maneira sob controle ambiental ou de desenvolvimento mais exato. Exemplos das condições ambientais que podem transcrição do efeito dos promotores inducible incluir condições anaeróbicas, temperatura elevada, ou a presença da luz. Tal são dos promotores se referiu aqui como promotores inducible ou tecido-específicos. Um de perícia reconhecerá que um promotor tecido- específico pode impulsionar a expressão de seqüências operably unidas em tecidos finos com exceção do tecido fino do branco. Assim, segundo o utilizado adjunto um promotor tecido-específico fica um que impulsione a expressão preferencial no tecido fino do branco, mas pode também dirigir a uma certa expressão em outros tecidos finos também. A expressão condicional, a expressão tecido-específica, ou uma combinação dos dois podem também ficam conseguido usando um transactivator, em onde pode um ácido necleico do DYAD fica colocado sob controle de um promotor sintético que fique impulsionado por um transactivator heterólogo ou sintético, a expressão Tecido-específica e/ou condicional do transactivator então impulsionaria a expressão correspondente do ácido necleico do DYAD. Os exemplos dos sistemas transactivatable e inducible que ficaram utilizado em plantas incluem mGal4: VP16/UAS, estalo/LhG4, GVEAAGE, GVG, pop6/LhGR, e XVE (repassado em Moore e outros., o diário 45 da planta: 651-683 (2006)). Os exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem a promotores que transcrição iniciada somente (ou sobretudo somente) em determinados tecidos finos, tais como fruto, sementes, ou flores. Promotores que expressão direta de ácidos necleico em óvulos, flores, ou o são das sementes particularmente útil na atual invenção. Segundo o utilizado adjunto um promotor semente-específico fica um que dirija a expressão em tecidos finos da semente. Essas promotores podem ficam, por exemplo, óvulo- específico (que inclua a promotores que expressão direta nos tecidos finos maternais ou o gametophyte da fêmea, tal como células do ovo ou a célula da central), embrião-específico, endospermo-específico, integument-específico, a semente revestimento-específica, ou uma certa combinação disso. Os exemplos incluem a promotor do gene óvulo-específico do sino descrito em Reiser e outros. Célula 83:735 - 742 (1995) (não de GenBank. U39944), e o promotor do gene específico do DUET do meiocyte masculino (Reddy Τ. V., e outros., desenvolvimento, vol. 130 (24): 5975-5987, 2003). O outro são específico dos promotores da semente conveniente derivou dos genes da continuação: MACI do milho (Sheridan e outros. Genética 142:1009 - 1020 (1996), Cat3 do milho (No. de GenBank. L05934, Abler e outros. Planta Mol. Biol. 22:10131 - 1038 (1993), o oleosin de codificação 18kD do gene do milho (No. de GenBank. J05212, Lê e outros. Planta Moi. Biol. 26:1981 - 1987 (1994)), viviparous-1 do Arabidopsis (No. de Genbank. U93215), o oleosin de codificação do gene do Arabidopsis (não de Genbank. Z17657), Atmycl do Arabidopsis (Urao e outros. Planta Moi. Biol. 32:571 - 576 (1996), a família do gene da proteína da armazenagem da semente 2S do Arabidopsis (Conceicao e outros. Planta J. 5:493 - 505 (1994)) o oleosin de codificação 20kD do gene do napus da Brassica (não de GenBank. M63985), napa do napus da Brassica (não de GenBank. J02798, Josefsson e outros. JBL 26:12196 - 1301 (1987), a família do gene do napin do napus da Brassica (Sjodahl e outros. Andar 197:264 - 271 (1995), o gene que codifica a proteína da armazenagem 2S do napus da Brassica (Dasgupta e outros. Gene 133:301 - 302 (1993)), os genes que codificam o oleosin A (não de Genbank. U09118) e oleosin B (não de Genbank. U09119) da soja e do gene que codifica a proteína rico em enxofre de pouco peso molecular da soja (Choi e outros. Moi. Gerador, Genet. 246:266 - 268 (1995)). [00106] Além disso, as seqüências do promotor do bote descrito dos genes do DYAD aqui ficam utilizado impulsionar a expressão dos polynucleotides do DYAD da invenção ou das seqüências heterólogas. Se a expressão apropriada do polipéptido fica desejado, uma região do polyadenylation nos 3'- o extremo da região codificante fique incluído. O bote da região do polyadenylation fica derivado do gene natural, de uma variedade de outros genes da planta, ou de T-DNA.

O vetor que compreende as seqüências (e.g., os promotores ou as regiões codificantes) dos genes da invenção compreenderá tipicamente um gene do marcador, que confere um phenotype seleccionable às células da planta. Por exemplo, o marcador pode codificar a resistência do biocide, particularmente resistência a antibiótico, tal como resistência ao kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, ou resistência do herbicida, tal como resistência ao chlorosulfuron ou a Basta.

Produção das plantas de Transgenic

As construções de DNA da invenção podem ficam introduzido no genoma do anfitrião desejado da planta por uma variedade de técnicas convencionais. Por exemplo, a construção de DNA- pode-fiea-introduzido diretamente na DNA genômica da célula da planta que usa técnicas tais como electroporación e microinjection dos protoplastos da célula da planta, ou o bote das construções de DNA fica introduzido diretamente ao tecido fino de planta usando métodos balísticos, tais como bombardeio da partícula da DNA.

Microinjection techniques are known in the art and well described in the scientific and patent Iiterature.] A introdução das construções de DNA que usam a precipitação do polietilen glicol fica descrito em Paszkowski e outros. Embo J. 3:2717 - 2722 (1984). São das técnicas da electroporación descrito em Fromm e outros. Proc. Nacional. Acad. Sei. USA 82:5824 (1985). As técnicas balísticas da transformação ficam descrito em Klein e outros. Natureza 327:70 - (1987).

Alternativamente, as construções de DNA podem ficam combinado com regiões que ladeiam convenientes de T-DNA e introduzido em um vetor convencional do anfitrião da agrobacterium tumefaciens. As funções da virulência da vontade do anfitrião da agrobacterium tumefaciens direta a inserção do construir e do marcador adjacente na DNA da célula da planta quando a célula fica infectado pelas bactérias. As técnicas tumefaciens- mediadas Agrobacterium da transformação, incluindo desarmar e o uso de vetores binários, ficam descrito bem na literatura científica. Veja, por exemplo Horsch e outros. Ciência 233:496 - 498 (1984), e Fraley e outros. Proc. Nacional. Acad. Sei. USA 80:4803 (1983). As células transformadas da planta a que o são derivou por um dos sobre o bote das técnicas da transformação ficam cultivado para regenerar uma planta inteira que possua o genotipo transformado e assim o phenotype desejado tal como massa crescente da semente. Essas técnicas da regeneração confiam na manipulação de determinados phytohormones em um meio de crescimento do cultivo do tecido fino, tipicamente confiando em um marcador do biocide e/ou do herbicida que ficou introduzido junto com as seqüências desejadas do necleotideos. A regeneração da planta dos protoplastos cultivados fica descrito em Evans e outros., isolamento e cultivo, manual dos protoplastos do cultivo celular da planta, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e atando, regeneração das plantas, protoplastos da planta, pp. 21-73, imprensa do CRC, boca Raton, 1985. O bote da regeneração também fica obtido de calo, de explantes, de órgãos, ou de peças da planta disso. Essas técnicas da regeneração ficam descrito geralmente em Klee e outros. Anúncio. Investidor de corrente, da planta Phys. 38:467 - 486 (1987).

Os ácidos nucleicos do bote da invenção ficam utilizado conferir os rasgos desejados essencialmente a qualquer planta. Assim, a invenção tem uso sobre uma ampla gama de plantas, incluindo espécie dos gêneros Anacardium, Arachis, aspargo, Atropa, aveia, Brassica, cítrica. Citrullus, pimentão, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, glicina, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, nícociana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, solanácea, zahína, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, e Zea. [0089] [00113] Um de perícia reconhecerá que depois que o casete de expressão fique incorporado estável em plantas transgenic e confirmado fique operable, bote fica introduzido em outras plantas por cruz sexual. Qualquer de um número de standard que criança técnicas que o bote fica utilizado, dependendo sobre a espécie fica cruzado.

A semente obtida das plantas do atual bote da invenção fica analisado segundo procedimentos bem conhecidos para identificar as plantas com o rasgo desejado. Se o antisentido ou o outro são das técnicas utilizou à expressão genética do DYAD do controle, RT-PCR ou o bote nortista da análise de transferência ficam utilizado à tela para as plantas desejadas. Além disso, a presença do bote reprodutivo independente do desenvolvimento da fertilização fica detectado. O bote das plantas fica defendido, por exemplo, para: a capacidade à semente do embrião-menos da forma, semente da forma que aborta depois da fertilização, ou frágua o fruto na ausência de fertilização. Estes procedimentos dependerão em parte em ficar particular da espécie vegetal usado, mas a vontade fica realizado segundo os métodos bem conhecidos aos da perícia.

O são dos exemplos da continuação dado pela ilustração da atual invenção e não deve fica interpretado para limitar o alcance da atual invenção.

EXEMPLO 1: O mutante do dyad amostra fertilidade defeituosa da fêmea e a semente reduzida fraguadas.

O mutante do dyad ficou isolado em uma tela para os mutantes estéreis do Arabidopsis entre uma população do ccsme mutagenized as plantas do M2 (Siddiqi I. et. ao. Desenvolvimento vol. 127(1): 197-207 (2000)) A análise da fertilidade pelos cruzamentos recíprocos indicou que o mutante ficou à fêmea estéril mas a varão fértil. A análise do sporogenesis da fêmea e do desenvolvimento do óvulo indicou que o dyad experimentou uma meiosis defeituosa da fêmea dando por resultado uma única divisão meiotic devida à progressão defeituosa através do ciclo meiotic da célula, seguido cerca detenha e erro de desenvolver gametas da fêmea na maioria de óvulos. A análise da meiosis da fêmea por observações das extensões do cromossomo de meiocytes indicou que a meiosis da fêmea ficou anormal no mutante do dyad: os cromossomos falhados à sinapse e experimentaram a divisão do equational em vez de uma divisão reductiva, que ocorreria normalmente na meiosis I (Agashe B., Prasad R. K., e Siddiqi L, desenvolvimento vol. 129(16): 3935-3943 (2002)).

Segundo as indicações da figura 1, a semente fraguada no mutante do dyad fica reduzido altamente quando está comparada ao tipo selvagem e a variação ficou observado no nível de semente fraguado entre as diferentes plantas do mutante do dyad. A semente fraguada ficou esporádico e ao acaso tal que nenhuma uniformidade em termos de número ficou observou entre as plantas na população. O modo para a semente fraguada ficou 1-10 pela planta, mas se propagou até que um máximo de cerca de 275 que ficaram observado raramente (1 em 500 plantas). EXEMPLO 2: O normal masculino do são da meiosis e da fertilidade em viabilidades do pólen do mutante do dyad as 00118] [ficou a Alexander que usava examinado que se manchava e o pólen ficou achado fica completamente viável e comparável ao tipo selvagem (figura 2). O exame da meiosis masculina pela análise das extensões do cromossomo de meiocytes indicou que a meiosis masculina ficou normal e dada lugar à produção de uma tétrada dos esporos haploid (figura 3). A meiosis masculina, a fertilidade masculina, e o desenvolvimento do pólen assim como a função ficaram portanto normal no mutante do dyad. Por outra parte a meiosis da fêmea fica anormal em dyad. A sinapse de cromossomos homólogos fica não visto para ocorrer e a divisão reductiva da meiosis 1 de tipo selvagem meiosis da fêmea (figura 3C) fica substituído por um equational um no dyad (figura 3E).

EXEMPLO 3: As sementes obtidas do mutante do dyad germinam para dar as plantas do triploid

Fica possível que as sementes produzidas no mutante do dyad se apresentam de uma meiosis normal em uma minoria pequena dos meiocytes da fêmea, que vão aceso para dar lugar a um saco funcional normal do embrião que fique então fertilizado pelo pólen haploid para desenvolver-se na semente. Se isto ficasse o caso, estas sementes representariam a evadidos da meiosis anormal da fêmea que ocorre no mutante do dyad. Para examinar esta possibilidade, as sementes (n=169) das plantas do dyad ficaram germinado e achado para germinar com a alta eficiência (> os 90%) e produzem morfológico plantas de viveiro normais exceto alguns que deram as plantas de viveiro anormais (o 10%). Nenhuns casos de variações em forma, simetria e o número de cotiledones ficaram observado nas plantas de viveiro da germinação. Isto fica em contraste com as plantas de viveiro derivadas de outros mutantes meiotic tais como AtSpoll-1 e AtDmcI que experimentem a segregação ao acaso de cromossomos na meiosis 1, dando por resultado mais uma parte elevada da progenie do aneuploid que amostra uma gama de anormalidades de desenvolvimento na etapa de a planta de viveiro (Grelon M. e outros., O EMBO J., Vol 20: 589-600, 2001, Couteau Fl. e outros., célula da planta, vol. 11(9): 1623-1634, 1999). O crescimento vegetativo subseqüente de plantas de viveiro na transferência à sujeira também ficou normal e deu lugar às plantas nas quais o crescimento vegetativo ficou similar ao tipo selvagem assim como as plantas dy do mutante da progenitora [alfa] d. A diferença principal observada ficou de tamanho da flor quando as plantas partiram empernarse. Em uma maioria das plantas (n=41/52) um aumento comparativo de tamanho da flor ficou observado quanto a tipo selvagem. O tamanho crescente da flor poderia fica possivelmente atribuído ao aumento em vigor ou favoráveis influências ambientais. Já que o são das plantas crescido no ambiente controlado nós eliminou a última possibilidade. A outra razão possível do aumento em força floral do tamanho do órgão fica aumento em ploidy. O aumento em ploidy fica manifestado pelo aumento de tamanho de vegetativo e as estruturas florais, particularmente os grãos do pólen (Altmann T., e outros., célula da planta divulga. Vol. 13: 652 - 656, 1994). Os brotos da flor das plantas aleatoriamente escolhidas ficaram examinado para seu nível ploidy pela análise de cromossomos em células somáticas e nos meiocytes masculinos. Ficou achado pelo exame das extensões meiotic do cromossomo que em 17/19 dos casos as plantas ficaram o triploid e os 2 restantes ficaram achado ficam diploid (figura 4). Desde normal do são do desenvolvimento do pólen e da meiosis do varão no mutante do dyad enquanto que uma meiosis reductiva da fêmea fica substituído por uma divisão do equational, estes resultados sugerem que a maioria das sementes que ficam o triploid preséntese da fertilização de uma célula (diploid) não reduzida do ovo por um esperma haploid normal e não se presente de uma meiosis normal da fêmea em uma minoria de óvulos, ou seja. a maioria de sementes não representa a evadidos da meiosis anormal. EXEMPLO 4: As plantas de Triploid derivaram da retenção da amostra do dyad de todos os marcadores heterozygous As sementes do triploid formadas no mutante do dyad poderiam ficam o produto da fertilização de um saco não reduzido do embrião por um pólen haploid normal que fica consistente com a meiosis da fêmea do equational que ocorre em dyad. Se um saco tão não reduzido do embrião fica formado de um megaspore não reduzido que se presente do produto de um equational, a divisão da célula da mãe do megaspore em onde segue havendo como univalents e não falha os cromossomos para experimentar a recombinación, então o genotipo do saco não reduzido do embrião fica idêntico ao da planta diploid da progenitora. Portanto se a planta da progenitora fica heterozygous para um marcador molecular então a vontade da progenie do triploid também fica heterozygous para esse marcador. Se um marcador suscitado ao centromere fica considerado em condições heterozygous, então na ausência total da transmissão 100% da recombinación da vontade parental do heterozygosity fique conseguido no gamete resultante da fêmea e a progenie do triploid. Se ocorrem a recombinación e a cruz do excedente então o heterozygosity 100% não fica mantido nas progenies resultantes do triploid. Para um marcador que fica suscitou ao centromere, um bote espera com homozygosity no saco não reduzido do embrião em uma freqüência de 33% e na progenie do triploid em uma freqüência de 16.7% enquanto que na ausência total de vontade da recombinación não fica nenhum homozygotes. A formação de sacos não reduzidos do embrião sem a perda de heterozygosity fica altamente desejável para o apomixis da engenharia e a fixação do heterosis. Utilizamos o microsatellite para medir a perda de heterozygosity entre a progenie do triploid de plantas do mutante do dyad. As plantas do mutante do dyad ficaram identificado em uma população de segregação F2 de um cruzamento entre o tipo selvagem Nossen (Nenhum-o) e os ecotypes da Colômbia do mutante do dyad (couve). Marcadores do candidato distribuídos através de cada um dos cinco cromossomos do Arabidopsis e suscitados ao centromere (> o cm 35) ficou obtido das bases de dados de TAIR (www.arabidopsis.org). As plantas da progenitora usadas para gerar à população F2 ficaram examinado para determinar o polimorfismo e baseado nos resultados que escolhemos 5 diferentes marcadores (tabela 1) em 4 diferentes cromossomos às plantas do mutante do dyad F2 do genotipo 50 e que identificamos esses marcadores para os quais cada planta ficou heterozygous. As sementes de Selfed ficaram recolhido das 50 plantas F2 individualmente e crescido como 50 diferentes famílias que consistiam em um número variável de irmãos. Isto deu um total de 196 plantas distribuídas através de 50 famílias. Todos os membros de cada família ficaram genotyped com relação a esses marcadores para os quais a planta da progenitora ficou heterozygous para dar entre 74-119 plantas distribuídas através de todas as 50 famílias F2 para cada marcador. [0098] Tabela 1: Análise do marcador da progenie de plantas do dyad para medir a perda de heterozygosity e de recombinación. <a> A figura em colchetes na coluna 6 representa os homozygotes da porcentagem das plantas totais analisadas para esse marcador. EMI ID=38.1

Fora de 196 plantas defendidas obtivemos 35 plantas que ficaram homozygous para pelo menos um marcador para o qual a planta da progenitora ficou heterozygous. O ploidy de 22 destas 35 plantas ficou determinado por extensões meiotic do cromossomo que realizavam. Ficou-achado que 21 ficaram diploid e outro um hyperdiploid que tinha 13 cromossomos. Portanto segundo análise a perda de heterozygosity ficou achado quase exclusivamente somente em diploids. Das plantas que não mostraram a perda de heterozygosity, 15 plantas ficaram eleito ao acaso das famílias separadas F2 e examinado para seu ploidy. Os 15 ficaram achado ficam o triploid. [00122] Os resultados pelo tanto indicam que não fica nenhum perda de heterozygosity nos triploids que compõem a classe da maioria de progenie de uma planta diploid do mutante do dyad. O erro de encontrar a perda de heterozygosity em triploids também elimina um mecanismo possível alternativo para sua formação, a saber polyspermy, ou seja. fertilização de um gamete haploid da fêmea por dois gametas masculinos separados, que também prediriam a perda de heterozygosity. Nossos achados mostram que a progenie do triploid de plantas do mutante do dyad se apresenta da fertilização de um saco não reduzido do embrião que conserve o genotipo da planta da progenitora. A formação de um saco não reduzido do embrião fica um aspecto do código do apomixis.

EXEMPLO 5: Isolamento e caracterização funcional do homologue do DYAD do holboelli de Boechera.

A região codificante genômica de 3 KB do homolog do DYAD dos acessos facultativo apomictic Colorado Diploid da Groenlândia do holboellii de Boechera e de Triploid (Naumova T. N., e outros, sexo. Planta Reprod. Vol. 14: 195-200, 2001) ficou Bho5Bam que usava clonado (NÃO SEQ do ID: 39) e Bho3Bam (NÃO SEQ do ID: 40) cartilhas. O clone genômico de BhDYAD (NÃO SEQ do ID: 16) ficou operably unido ao promotor do DYAD do Arabidopsis e o utilizou transformar as plantas do mutante do dyad para provar para : a complementação. O cDNA de BhDYAD ficou também amplificado e ordenado (NÃO SEQ do ID: 17). O Agrobacterium intermediou na transformação da infiltração de vazio da planta mobilizou a expressão constrói às plantas de à Flórida que ficaram heterozygous para o dyad. Obtivemos 42 transformants fora dos quais 9 transformants ficaram homozygous para o alelo do mutante do dyad segundo o determinado pelos REMATES e os marcadores do microsatellite que flanco o lugar geométrico do dyad (Agashe B1 Prasad R. K., e Siddiqi L1 desenvolvimento vol. 129(16): 3935-3943 (2002)). Dos 9 transformants 4 transformants mostraram a complementação do phenotype do mutante do dyad, que o bote fica julgado pelos siliques alongados bem (figura 5) qual ficou achado para conter a semente completa fraguada. As 5 plantas restantes ficaram possivelmente devido estéril ao cosuppression. Crescimento das plantas do Arabidopsis.

A tensão do Arabidopsis que abrigaba o mutante do dyad ficou como mais cedo descrito (Siddiqi I., et. ao., desenvolvimento. Vol. 127(1): 197-207 (2000)). A população F2 usada para a análise do marcador do microsatellite ficou derivado de um cruzamento entre a tensão Nenhuma-ou (ecotype de Nossen) e o mutante do dyad no antecedente do ecotype de Coi-Ou como descrito (Siddiqi L, et. ao., desenvolvimento. Vol. 127(1): 197-207 (2000)). As plantas ficaram cultivado em um ambiente controlado como descrito (Siddiqi L, et. ao., desenvolvimento. Vol. 127(1): 197- 207 (2000)).

Para as sementes da germinação nas placas de Petri, as sementes ficaram superficial esterilizadas com o etanol por 10 minutos seguidos tratando-os com 0.025% cloretos mercúricos por 5 Min. As sementes ficaram mais longe lavado três vezes com água estéril de tirar qualquer rastro do cloreto mercúrico. As sementes ficaram suspendido de novo em 0.5% agares superiores tíbio e uniformemente a extensão nas placas de agar do MS (0.7%) supridas com sucrosa de 2%. As placas ficaram permitido a seco por uma hora em uma capela laminar do fluxo e as placas ficaram selado com o parafilm e mantido uma sala do frio em 4 [grau.]C para a estratificação por 3 dias. Depois que as placas ficaram mudou de posto a câmaras de crescimento. As freqüências da germinação ficaram contado depois que duas semanas depois disso. Para as sementes do crescimento nos potes, o meio sintético usado para as plantas em crescimento ficou preparado misturando uma proporção igual de Soilrite: Perlite: Vermiculite (energias Ltd., Karnataka 574 108, a índia de Keltech). A mistura do pote ficou aplicado uniformemente aos potes perfurados no fundo que permitia ascensão do tubo capilar e os potes ficaram embebido em IX O MS solução containg as sales importantes: CaCI2 (4mm), MgSo4 (1.5mm), KN03 (18.8mm), NH4N03 (20.6mm), KH2Po4 (1.25mm ph 5.6), FE- EDTA (20mm) ao qual sales de menor importância de 1 ml (1000X): (H3B03 (70mm), MnC12 (14mm), CuS04 (0.5mm), ZnS04 (ImM), NaMo04 (0.2mm), NaCl (10mm), CoC12 (O.OImM)) ficou acrescentado por litro. As sementes ficaram uniformemente a extensão na superfície do pote e coberta com o abrigo de Saran e guardada no < 4-8; 0> C por 3 dias para a estratificação e depois mudados de posto a câmaras de crescimento. Em caso do transplante, os potes ficaram coberto com o abrigo de Saran depois que as plantas de viveiro ficassem transferido ao meio da sujeira e colocado diretamente nas câmaras de crescimento. O abrigo de Saran ficou tirado uma vez que as plantas ficassem estabelecido na mistura do encapsulamiento. A rega ficou realizado nos intervalos você regular usando o água destilada.

Análise fraguada semente.

A população de segregação F2 que abrigaba uma mutação do dyad no antecedente do ecotype de Coi-Ou ficou utilizado para anotar a freqüência da semente fraguada nas plantas homozygous do dyad, você planta do mutante do dyad ficou permitido para crescer até sua etapa final quando a planta cessada à flor. Depois que esta rega da etapa ficasse o witheld para permitir os siliques ao alcance colhem maturidade. Enquanto isso os siliques mais baixos que dão volta a amarelo e ficaram ao redor para romper ficaram aberto individualmente partida e as sementes se quaisquer ficaram colhido em únicas bases da planta. Além disso as sementes necessárias ficaram colhido nos intervalos você regular para evitar perda possível da semente. Finalmente as sementes recolhidas ficaram reunido em únicas bases da planta à recontagem para o número total de sementes pela planta.

Viabilidade do pólen. O manchar-se vital para os microspores na antera ficou realizado como descrito (Alexander M. P., mancha Technol. Vol. 44(3): 117-122, 1971). Extensões de Meiotic.

Análise do são meiotic das extensões do varão e da fêmea como descrito (Agashe B1 Prasad R. K., e Siddiqi L, desenvolvimento vol. 129(16): 3935-3943 (2002)) Isolamento da DNA da planta.

A DNA genômica para a análise do marcador do microsatellite ficou isolado segundo o método descrito por Dellaporta S. L., e outros., planta Moi. Bio. Representante., vol. 1: 19-21 (1983) com pequenas modificações. O magnésio perto de 500 do tecido fino da folha ficou recolhido de uma planta individual em canos do eppendorf de 1.5 ml e do broche de pressão congelado em nitrogênio líquido. Então o tecido fino ficou o terreno a um pó fino usando um micropestle. A este pó ficou 200 [mu] I acrescentado da almofada de extração recém preparado (100 naco do milímetro (ph 8), EDTA de 50 milímetros, 500 milímetros NaCI5 SDS 1.4%, e IOmm [betas] - mercaptoethanol) e ficou homogeneizado finalmente com o micropestle. Então o volúmen igual de 2X CTAB ficou acrescentado e a mistura ficou vortexed suavemente. Então a mistura ficou incubado em 65 [os graus.]C por 5 minutos em um banho de água qüe sacudare. Depois que a mostra ficou permitido para esfriar e um volúmen igual de chlorofom de 24:1: o álcool do isoamilo ficou acrescentado e misturado suavemente e centrifugado por 10 minutos em 13000 RPM. A fase aquosa que continha a DNA ficou transferido a um tubo fresco do eppendorf e 2/3 volume do isopropanol sorvete ficou acrescentado para precipitar a DNA. A DNA ficou descendente granulado pela centrifugación em 4< 0> C em 13000 RPM por 20 Min. A bolinha da DNA ficou dado uma filtragem do etanol de 70% e a bolinha ficou secado ao ar por 30 minutos e suspendido em 50 [mu] I da água estéril ou da almofada de TE (ph 8.0) que continha o RNAse livre do DNAse (20 ug/ml). Análise do marcador.

Baseado no exame parental de Coi-Ou e de Nenhuns-ou ecotypes 5 marcadores do microsatellite a partir de 4 diferentes cromossomos que o são razoavelmente suscitou ao centromere ficaram eleito. Estes marcadores ficaram utilizado em um F2 (Nenhum-ou x Coi-Ou (o dyad)) a população de segregação para escolher as plantas do dyad essas fica heterozygous para um marcador dado. As sementes destas plantas do dyad ficaram recolhido e germinadas nas placas individuais de petri tais que cada progenie constitui um sib da planta particular do dyad da mãe. Além disso os dados em sibs das várias plantas que ficaram heterozygous para um marcador dado ficaram considerado juntos para a análise do marcador.

A lista dos marcadores do microsatellite e de seu são da localização como descrita na tabela 1. As seqüências superelegantes usadas para amplificar os microsatellites ficam do Site na web de TAIR (www.arabidopsis.org): NÃO SEQ do ID do nga 162 ngal62F: NÃO SEQ do ID de 6 ngal62R: 7 NÃO SEQ do ID de nga225 nga225F: NÃO SEQ do ID de 8 nga225R: 9 NÃO SEQ do ID de ngal68 ngal68F: NÃO SEQ do ID de 10 ngal68R: 11 NÃO SEQ ngal do ID do que7 ngall07F: NÃO SEQ do ID de 12 ngall07R: 13 NÃO SEQ do ID de nga6 nga6F: NÃO SEQ do ID de 14 nga6R: 15 PCR ficou realizado em IX a almofada de PCR (Perkin Elmer) que continha 2 milímetros MgCL1 0.2 milímetros cada dNTP, 1 unidade da polimérase da DNA de Taq (Perkin- Elmer/Cetus), e 5 pmoles de cartilhas que ladeavam dianteiras e reversas em uma temperatura de recocido do < 55; 0> C com uma extensão no < 72; 0> C por 20 segundos. Os produtos de PCR ficaram resolvido em um gel do pólyacrylamide de 8% em 150V para 3hrs e manchado com o brometo de etidio e capturado usando o sistema de documentação do gel de Syngene (Synoptics Inc. O REINO UNIDO). Os materiais da planta.

Os acessos diploíd facultativo apomictic do Colorado da Groenlândia e do triploid do holboellii de Boechera ficaram um presente bom de Kim Boutilier (Naumova T. N., e outros., sexo. Planta Reprod. Vol. 14: 195-200, 2001). As plantas ficaram cultivado nos potes que continham o meio segundo o descrito para o Arabidopsis e crescido baixo condições idênticas a ésas para o Arabidopsis.

Reprodução do promotor do DYAD.

Uma região do promotor do DYAD de 1.8 KB ficou amplificado do ecotype de Coi-Ou usando as cartilhas pg2r4 (NÃO SEQ do ID: 48) e PDYBAM (NÃO SEQ do ID: 47) e o produto ficou clonado em um vetor do pGEMT (Promega) segundo as instruções do fabricante. Reprodução do homolog do DYAD do holboellii de Boechera . A região codificante genômica do homolog do DYAD do Arabidopsis do holboellii de Boechera (BhDYAD) ficou amplificado com as cartilhas que abrigaban um lugar de BamHI no ' extremo os 5: Bho5BAM (NÃO SEQ do ID: 39) e Bho3BAM. (NÃO SEQ DO ID: 40) O fragmento resultante 3kb ficou clonado em pGEMT. Construção do accionamiento BhDYAD do vetor binário pCAMBIA1300 debaixo do promotor do DYAD do Arabidopsis [0122] [00137] O DYAD de Bh ficou lançado de pGEMT como fragmento de 3 KB BamHI y clonado en un vector pCAMBIA1300 que Ilevaba a un hygromycin seleccionable do marcador da planta. A orientación quedó comprobado usando las cartillas BDY3 (No. SEQ do IO: 36) y OCSR (No. SEQ DEL ID: 38). A región do promotor do DYAD de 1.6 KB (No. SEQ do ID: 22) quedó Ianzado como fragmento triste do vector do pGEMT e insertado contracorriente desde un BhDYAD en o vector pCAMBIA1300. A orientación do promotor con relação a a seqüencia genômica de BhDYAD quedó Ias cartillas que usaban confirmadas ismr4 (No. SEQ do ID: 37) y bdyl (No. SEQ do ID: 35). Acoplamiento de Triparental .

A transferencia do pCAMBIA arriba construído do vector binario en o Agrobacterium (AGLI) quedó por o acoplamiento triparental como descrito (Agashe B, Prasad C. K., y Siddiqi I1 desarrollo, vol. 129(16): 3935-3943 (2002)).

Trasformação das plantas do Arabidopsis

Para a análisis da complementación de BhDYAD1 Ias plantas da Florida do dyad de Col-O χ quedaron transformado con o transporte BhDYAD do construir impulsado por o promotor do DYAD do Arabidopsis. O Agrobacterium medió en a Trasformação da infiltración de vacío do planta quedó realizado según Bechtold N. y PeIIetier G., métodos Mol. BioL1 vol. 82: 259-66 (1998). A seleção dos transformantes

A las semillas das plantas infiltradas vacío da Florida quedó plateado sobre uma placa de petri que contenía 0.8% agares de Ios Bacto, ImM KN03 y sucrosa do 1% con hygromycin de 20 [mu] g/ml. Después da estratificación do frio por 3 dias Ias placas quedaron transferido a câmaras de crecimiento. Los transformants que quedan resistente al bote do hygromycin quedan identificado desde 5 dias de post-transferencia en virtud de raiz alargada bien, de hipocotila erguida y de hojas cotyledonary separadas pozo. Los transformants seleccionados quedaron transferido más Iejos a Ias placas do MS que contenían hygromycin y después de que a resistencia fique establecido quedaron finalmente transferido al médio da suciedad. Además Ias plantas quedaron comprobado para saber si hay o presente do relleno usando bdy3 y a cartilla de OCSR como más temprana descrito. Genotyping para o zygosity en o lugar geométrico do dyad

Os tres genotipos da población de segregación do dyad F2 quedaron identificado por Ios marcadores codominant de Ios REMATES (Konieczny A. y Ausubel F. Μ. , Planta J., vol. 4(2): 403-410, 1993) y microsatellites variables. Las secuencias que flanqueaban do son do alelo do mutante do dyad derivaron de ecotype do erecta de Landsberg y ésas do tipo salvaje alelo tienen seqüencia do ecotype de Colombia. Asi o SNPs en estas secuencias que flanqueaban quedo utilizado para desarrollar o marcador de Ios remates a Ias cuales fique enlazado de cerca y o lado que flanquea do lugar geométrico do dyad (KNEF (No. SEQ do ID: 31) y KNER (No. SEQ do ID: 32), KKF (No. SEQ DEL ID: 33) y KKR (No. SEQ do ID: 34)) y cartillas do marcador do microsatellite (KMF (No. SEQ do ID: 29 y KMR (No. SEQ do ID: 30)) ese fique enlazado de cerca al DYAD (Agashe B1 Prasad C. K., y Siddiqi L, desarrollo vol. 129(16): 3935-3943 (2002)). O genotyping en o lugar geométrico do dyad que usaba Ios marcadores antedichos quedó como descrito (Agashe B, Prasad C. K., y Siddiqi L, desarrollo vol. 129(16): 3935-3943 (2002)). [0130] Aislamiento do RNA y síntesis de Ios cDNAs Los únicos brotes bien desarrollados de uma planta diploid de Groenlandia quedaron utilizado para o aislamiento total do RNA por o reactivo de TriZoI (Invitrogen) según Ias instrucciones do fabricante. 4 [mu] g do RNA total quedaron utilizado para a primera síntesis do cDNA do filamento usando o sistema da elección do exponente (TM) para a síntesis do cDNA (GIBCO BRL). O cDNA quedó amplificado más Iejos para reproducirse usando Ias cartillas 5RF3 (No. SEQ do ID: 41) y Bho3BAM (No. SEQ do ID: 40). O fragmento resultante de 1.9 KB quedó clonado en pGEMT y Io ordeno. O son de Ios resultados presentó en o listado da seqüencia como No. SEQ do ID: 17.. A seqüencia de aminoácidos da proteína correspondiente do DYAD fica mostrado en No. SEQ do ID: 18.

EXEMPLO 6: A construcción de ün alelo condicional do DYAD y do desarrollo de uma población homogenous de plantas transgenic que mostraba al phenotype do mutante do dyad [00143] a estrategia usada para construir un alelo condicional do gen do DYAD quedó basado en a fusión do domínio de união da hormônio do receptor da glucocorticoide da rata (GR) (No. SEQ do ID: 27) al C-término do DYAD y de integrar a fusión construya en o genoma-das plantas que quedaron homozygous para o alelo do mutante do dyad (dy/dy). A proteína de fusión de DYAD-GR en sus a propia fica no capaz de complementar o mutante do dyad porque confiere o domínio de GR localización citoplásmica en a ausência de hormônio esteroide, mientras que o sitio da acción do DYAD fica en o núcleo. Sin embargo en a presencia da hormônio esteroide, a proteína de fusión fica Ianzado do sitio de união citoplásmico y Ilega a ser capaz do desplazamiento al núcleo donde él complemento do bote o mutante do dyad. Los pasos en a construcción quedaron a continuación: o vector binario pBI101.3 da planta quedó digerido con BamHI más triste quitar o gen do reportero de GUS y reemplazarlo con un BamHI - fragmento do saco 1 comprendiendo o domínio de GR (manana. Lloyd y otros., ciência 266, 436Λ139 (1994)).

plasmid resultante quedó pBI101.3 nombrado:: GR. Después las cartillas DyCF (No. SEQ do ID: 43) y DyPB (No. SEQ do ID: 42) (que contiene seqüencia para modificar o codón da terminación y para introducir los sitios da restricción para BamHI y Pstl) quedó utilizado a PCR amplifican uma región do C-terminal das pares de bases 304 do gen do DYAD. A seqüencia modificada quedó clonado como fragmento de Pstl das pares de bases 216 en o pBS (KS):: Plasmid do Dyad que llevó a un clon genómico de 5.8 KB (No. SEQ do ID: 28) que contuvieron o gen completo do DYAD correspondiente a las coordenadas 9684 a 3878 do clono MFG13 (No. do Pl do as. AB025621) para dar o pBS (KS):: Dyad*. O plasmid que resultaba contuvo un gen do DYAD que codón TGA da terminación había quedado reemplazado por GGG y que también llevó a un sitio de BamHI junto con o codón reemplazado. O fragmento de Sall- BamHI das pares de bases 269 do pBSII (KS):: Dyad* que los nucleotides contenidos 9684 a 9416 de MFG13 quedaron clonado en pBI101.3:: Digestión da continuación de GR con a vela más BamHI. A porción remanente de DYAD a partir da 9417-5335 quedó entonces clonado como fragmento de BamHI- BamHI do pBS (KS):: Dyad* en o producto da etapa anterior que dio lugar a en a fusión do marco do domínio de GR al C-término do DYAD. O plasmid final nombrado pBI101.3: O Dyad [delta] GR fica representado en a figura 6. [00145] O construir quedó introducido en a tensión AGLI do Agrobacterium por o acoplamiento triparental usando o ayudante E. tensión HB 101 [pRK2013] do coli. A región de T-DNA quedó transformado en Ias plantas do Arabidopsis () que quedaron heterozygous para o alelo do mutante do dyad (+/dy) cerca en- planta a Trasformação (Bechtold N. y Pelletier G., métodos Mol. Biol., vol. 82: 259-66, 1998). Las plantas de semillero resistentes do Tl do Kanamycin quedaron seleccionado plateando Ias semillas en Ias placas de agar do MS que contenían o kanamycin (50 mg/litre) y transferido a Ias placas do MS + do kanamycin para confirmar o phenotype resistente. Transformants quedó identificado más Iejos por PCR usando DyCF (No. SEQ do ID: 43) y GRrev (No. SEQ do ID: 44) cartillas. As plantas de viveiro resistentes do kanamycin confirmado ficaram transferido à sujeira e vindo a etapa do adulto. Seguindo a empernarse e ao desenvolvimento dos primeiros 8-10 siliques, as plantas ficaram regaram cada três dias com dexametasona de 10 [mu] M além de ficar diário borrifado com dexametasona de 10 [mu] M + 0.015% Silwet L-77. Ficou notado que várias plantas que mostraram esterilidade antes do tratamento da dexametasona desenvolveram siliques férteis 5-7 dias depois do partir do tratamento da dexametasona. A parte do material de planta ficou utilizado para a análise meridional determinar o número de cópias da inserção e também genotyped com relação ao lugar geométrico do dyad usando os marcadores baseados dos REMATES de PCR enlaçados de perto a e ladeando o lugar geométrico do dyad. O mutante do dyad ficou isolado originalmente no antecedente de Ler e depois introgressed na tensão da couve. Portanto o alelo de Ler dos marcadores dos REMATES fica o diagnóstico para o mutante do dyad enquanto que o alelo da couve fica indicative do tipo selvagem (figura 7). Os únicos inserções da cópia ficaram identificado entre as plantas que tinham pelo menos uma cópia do alelo do mutante do dyad e as sementes destas plantas ficaram prateado nas placas do MS + do kanamycin. As plantas de viveiro resistentes do Kanamycin ficaram transferido à sujeira e genotyped com relação ao lugar geométrico do dyad. As plantas que ficaram homozygous para o alelo do mutante do dyad ficaram idade adulta identificada e vinda. O que segue empernando todas as plantas ficou alimentado com água durante a fase intial até que a abertura das primeiras 8-10 flores seguidas regando com uma solução que continha a dexametasona como se descreve anteriormente. As linhas que mostraram esterilidade condicional ficaram identificado por diferentes únicas inserções da cópia do crivado. Como exemplo, uma linha não. 33 mostrados na figura 8 deram as plantas do mutante do dyad (dy/dy) qual mostraram esterilidade durante a fase inicial do crescimento reprodutivo e qual se transformou em tratamento fértil da dexametasona da continuação. Os óvulos dos brotos isolados antes do tratamento da dexametasona mostraram o phenotype do mutante do dyad, enquanto ésos isolados depois do tratamento da dexametasona mostraram o tipo selvagem phenotype (figura 9). As sementes ficaram recolhido das plantas homozygous do mutante do dyad para dar às famílias T3 e as famílias T3 que ficaram homozygous para a inserção de DYAD-GR ficaram identificado pelo crivado para as famílias, que deram a todo o kanamycin plantas de viveiro resistentes. Estes resultados exemplificam a construção de um alelo condicional do DYAD e de sua introdução nas plantas de tal modo que dão as plantas que mostram o phenotype do mutante do dyad debaixo de um fraguado das condições (a ausência de dexametasona) e do tipo selvagem phenotype quando são alimentados (ou borrifado) com dexametasona. Estes resultados também possibilitam o desenvolvimento de uma população homogenous das plantas que mostram o phenotype do mutante do dyad.

Seqüência do domínio do receptor da glucocorticoide usada neste estudo (914 pares de bases) (No. SEQ do ID: 27)

GGATCCTGAAGCTCGAAAAACAAAGAAAAAAATCAAAGGGATTCAGCAAG CCACTGCAGGAGTCTCACAAGACACTTCGGAAAATCCTAACAAAACAATAG TTCCTGCAGCATTACCACAGCTCACCCCTACCTTGGTGTCACTGCTGGAG GT

GATTGAACCCGAGGTGTTGTATGCAGGATATGATAGCTCTGTTCCAGATTC AGCATGGAGAATTATGACCACACTCAACATGTTAGGTGGGCGTCAAGTGAT TGCAGCAGTGAAATGGGCAAAGGCGATACCAGGCTTCAGAAACTTACACC T GGATGACCAAATGACCCTGCTACAGTACTCATGGATGTTTCTCATGGCATT T GCCCTGGGTTGGAGATCATACAGACAATCAAGTGGAAACCTGCTCTGCTTT GCTCCTGATCTGATTATTAATGAGCAGAGAATGTCTCTACCCTGCATGTAT G ACCAATGTAAACACATGCTGTTTGTCTCCTCTGAATTACAAAGATTGCAGGT ATCCTATGAAGAGTATCTCTGTATGAAAACCTTACTGCTTCTCTCCTCAGTT CCTAAGGAAGGTCTGAAGAGCCAAGAGTTATTTGATGAGATTCGAATGACT TATATC AAAG AG CTAG G AAAAGC C ATC G TC AAAAG G G AAG G G AACTCC AG TCAGAACTGGCAACGGTTTTACCAACTGACAAAGCTTCTGGACTCCATGCA TGAGGTGGTTGAGAATCTCCTTACCTACTGCTTCCAGACATTTTTGGATAA G

ACCATGAGTATTGAATTCCCAGAGATGTTAGCTGAAATCATCACTAATCAG ATACCAAAATATTCAAATGGAAATATCAAAAAGCTTCTGTTTCATCAAAAA TGACTGACCTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTC [0135] [00147] Sequencia genómica do Dyad usada para a reproducción como fragmento da vela no pBS (KS): Dyad (5807 pares de bases) (No. SEQ do ID: 28)

GTCGACTTTTTGTTTGACCAGTGTATTTGGTTTGACTTCAGATTTGGCAAGT ACGAAGCTTATGCGCTTTTGCAATCGAAACAAGGGAAAAATCTGTACTTTG TTAGCTGCGTGACTTGAGCTCTTTGGTCCGGAGACGGTAGAAGACGACAA A

GCACTGACCTTTCATCTCTCGGCGATCGAAAAAATCACTCTCTTTCCTCAT C

AGACCCGACCCGTTATGAAGGTATCCAGACCCGTTTATTTTGATCCATCTC A

TAGTCGGATCCCCAAAAAAATTCAGCTTAGATTGGCCCATTTAGGCCCGTT T

ACAGTTTTTTACTTTTTTCTTAATTATCTTTTTAACATCTTACATTATACATAT TTGACTCAACAAAAAAATATAACTTAAATGTATTGTTGACTGTTTTTGATAA TTAAGAAAAAAATATTTTTAAATTATTAAAAATATTGTTGACTCAACAAAA AAAT AT AACTT AAATGTATTGGGCAAATAATCATGGTCATAAGTCCTCAAG CTTATTATTTGTTTTGATTGGTTTAAATACTTTATAAAAAAAATATCAATTAT ATC ATGTTATTAC GTAAATTAAG CTTTTTG ATTTTAAAAAAG CTTC AG CTC A ATAAAGAAAAACAGATTCAGTTATCATTGGAGTATAAAATTGGTCGATACA TTAGAGACATTAATCCTTACATCATAAACAATTTAATGTGAATAAAACATC ATAAATCACATATCATTATCCGAAAATAATCATATGTAAGAATAATCACTG TGACAAAAAAAAAAAACAATTCCTCACGTGTGTAGTCGGTCCCCACTCTAG TAGCAGTAGCTTAATGATGCCTTCTCCGCACGTGTAACACGAAATTTATTC G

CTAC G G C C AATTAC ATTAAC CTTC AG GTCTTATC AC CGTTAAATTTTC A AAA TGACACACGTGGCATCAATCCGTAATATCACTACGTCTGCTTTCAATCTTTC ATTGTAGATGATTTCGTACACCAATTTCCGCGAACGTTTACAGTTTAGATAC AGTTTGAGGGCAAATCTGTCAATATACGCCAACTTGCTGCGAAAGCAATAT AGTCACGTGCCGTGCACACGCATATAAGACTCACACACTCACACCACTCTC TCTCTCTCTCTAACCTC ATAT ATAAAG CC ACCTC C C AG ATTC ATT AAATG C G ACATTTCAAAACTTTTCTTTTTGCTGTCTTCCCCATAAGCTCTCTGCTGATTA AAAAGATTTTCTGGTATAAAACAAAATTCTTCAAATATTTCTGGGTTTATGT TTTCTCTCTATTTCTC AG AAATG CTTTAATTTCTC C ATCC G C GTCC ATGTTTT TTTTTCTC CGTTG CTG ATTTTG ATTTTTTTAATCC AG TG AAAAG G AG G AACG AAGATTATCGAGAGCAAAAATCATGAGTGTAAGATCTCTCTCGCTCTCAGA TTTTATTTTTTTTC G CTGTG AT ATAAATG G CTC AGTC ACTATC AGTCTC ATG A TGAGAAAAATAAAACTCATCACCGCTTGATTCTGTTTCCTTAGTGTCTCCCA CGCGCGTACCAGAAAGCGCGTGTGTGTTTCTTGTTATACTCGCAGAGTCA G

GTTTTTTCAAATATATTCTCTCCAGGCAGCAGCAACAACAACAAACCGATTT TTTCATTATTCCTTATAACAATTTTTGATTCTCCAGAAAAAAAATATCTCTCT TAGTTTTTCTCTTGTTCTACAGAGTACGATGTTCGTGAAACGGAATCCGATT AGAGAAACCACCGCCGGGAAAATCTCTTCGCCGTCGTCACCGACTTTGAA T

GGTAAACTACTGAAGCTATAGTTTCTTCGTTTTTGTTGATTTTCTCGCTTCT C TTCTAATTTCTGAATTTTTGGTTTGGGTTTGTTCTTACAGTTGCAGTCGCGC A

TATAAGAGCTGGATCTTATTACGAAATCGATGCTTCGATTCTTCCTCAGAGA TCGCCGGAAAATCTTAAATCGATTAGAG

EXEMPLO 7: A semente de Selfed do mutante do dyad que ficam o triploid (3n) contém uma contribuição diploid (2n) do gamete da fêmea

Os cruzamentos recíprocos ficaram realizado entre (2n) o tipo selvagem tetraploid (4n) e diploid você planta do Arabidopsis. Em ambos casos as sementes que o são produziu o triploid do são. No entanto, quando a progenitora masculina ficou tetraploid e a progenitora da fêmea ficou diploid, as sementes que foram produzidas ficaram grandes, enquanto quando a progenitora masculina ficou diploid e a fêmea que a progenitora ficou tetraploid as sementes ficaram contraídas. Estes resultados ficam representado na figura 10 e os 100 pesos da semente para cada categoria de são da semente mostrada na tabela 2.

Tabela 2: O peso de 100 sementes obtidas das plantas de vários cruzamentos sementeira o peso da semente da categoria no ug Sementes Diploid do PESO da Colômbia - 2142 Tesa Tetraploid de Landsberg - 3352 a Colômbia Diploid χ A-er [mu] g Tetraploid (excesso paternal) - 3004

A-er χ Tetraploid a Colômbia Diploid (excesso maternal) - uma categoria maior de 1302 dyad sementeira - 3453 sementes contraídas d normais 2012 - 1379 da categoria do dya das sementes da categoria do dyad Estes achados se reproduzem que fica sabido na técnica anterior (Scott RJ e outros.,

Desenvolvimento 125, 3329-3341, 1998). Sem ficar unido por qualquer teoria do mecanismo, a operação de não equivalência dos genomas paternales e maternais no regulamento do desenvolvimento da semente ficou explicado segundo a teoria do conflito do progenitora-descendente (Haig D. e Westoby M., fica. Nacional. Vol. 134: 147-155, 1989) como apresentan-se da competição para a dotação do recurso entre a progenitora maternal que limita o crescimento do embrião favorecendo a distribuição equitativa de recursos entre todas as sementes, e cada embrião que aptidão fica aumentou em garnering de recursos maiores. Segundo Haig D. e Westoby M., fica. Nacional. Vol. 134: 147-155, 1989 imprimiram os genes que o são maternal expressado no embrião ato limitaria o crescimento do embrião enquanto que os genes paternal expressados crescimento crescente favor do embrião. Assim as sementes que contêm um equivalente paternal extra do genoma ficam mais em grande parte do devido normal a uma dose do excesso dos produtos genéticos que promovem o crescimento do embrião enquanto que as sementes que contêm um equivalente maternal extra do genoma fica menor do devido normal a uma dose do excesso dos produtos genéticos que limitam o crescimento do embrião. [00150] À direção as contribuições maternais e paternales dentro selfed as sementes do mutante do dyad que as sementes ficaram analisado com relação a tamanho. Selfed as sementes obtidas das plantas do mutante do dyad ficou heterogêneo de tamanho e classificado em qualquer de três categorias: grande, normal, e contraído como representado na Figure 10. A distribuição da classe do tamanho a partir de 7 plantas individuais do mutante do dyad fica mostrado abaixo:

Tabela 3: Classifique a distribuição da classe para as sementes das plantas do mutante do dyad:

<table>table see original document page 58</column></row><table>

O total 254 106 399 [00151] sementes de cada classe ficou muestreado das plantas múltiplas, germinado e crescido nas plantas. O ploidy de cada planta ficou determinado por recontagens cromossômicos em extensões meiotic. O são dos resultados indicado na tabela 4 abaixo:

Tabela 4: Ploidy de plantas de cada classe da semente dentro selfed mutantes do dyad

EMI ID=54.1 Os números em colchetes indicam a porcentagem das plantas totais examinadas em cada categoria

A mostra destes dados que a maioria do são dos triploids contraído de tamanho e compõe o grande parte da categoria contraída de semente. A observação que a maioria do são dos triploids contraído indica que se apresentam de uma contribuição maternal do excesso (2n) e não de uma contribuição paternal do excesso que portanto fica dentro nos triploids. Junto com o achado do exemplo 4 que todos os triploids co ns e r-va m h e te ro zy g o s i ty parental, estes resultados indicam que a retenção do heterozygosity fica obtido da progenitora da fêmea, e portanto que os triploids se apresentam de um gamete não reduzido da fêmea que conserve heterozygosity parental. 0158] [00153] Para confirmar que os triploids em dyad se apresentam de uma contribuição da fêmea 2n, nós cruzados um mutante do dyad como uma fêmea à linha ETC60 (tipo selvagem para o DYAD) como varão para dar a semente da Florida. A linha ETC60 (descrita no patente do norte-AMERICANO. Appl. Não. 10/857.539) leva a uma única cópia de um transposon do Ds que abriga um gene da resistência do kanamycin. Seguindo à segregação da cruz da continuação da resistência do kanamycin mais longe da Florida ao tipo sèlvagem você planta diploid, fica possível determinar a contribuição ploidy do gamete masculino na planta de à Flórida. As sementes do primeiro cruzamento ficaram germinado e as plantas de viveiro ficaram transferido à sujeira. Seis plantas de à Flórida ficaram provado para a presença do gene da resistência do kanamycin usando as cartilhas gene-específicas da resistência do kanamycin (Não. SEQ do ID de KanF: 49 e NÃO SEQ do ID de KanR: 50) assim como para uma cópia do transposon em ETC60 usando uma cartilha específica Ds5-2 do transposon (Não. SEQ do ID: 45) conjuntamente com uma cartilha gene-específica GLTF (Não. SEQ do ID: 46). As seis plantas ficaram o positivo para a resistência do kanamycin do transporte do elemento do Ds e ficaram também fértil como fica esperado para as plantas cruzadas conter um tipo selvagem cópia de DYAD. O ploidy das seis plantas ficou extensões que usavam examinadas de cromossomos meiotic. Ficou que 3 plantas ficaram o triploid com 15 cromossomos, as 2 plantas achadas tinha 16 cromossomos, e 1 tinha 17 cromossomos. Estes resultados sugerem a probabilidade que os gametas da fêmea se apresentassem dos esporos não reduzidas/do hyperdiploid. A fertilização dos gametas não reduzidos da fêmea por um pólen haploid daria (cerca) os triploids que ficam o simplex para o gene da resistência do kanamycin (Kkk). Os triploids poderiam apresentar-se Alternativamente da fertilização de um gamete haploid da fêmea por um gamete masculino não reduzido ou dois reduziram os gametas masculinos neste caso os triploids ficam o duplex para o gene da resistência do kanamycin (KKK). [0159] [00154] Se uma planta a uma-cara-da-condição-fica cruzado a um tipo selvagem planta que não leve a resistência do kanamycin então o quociente da segregação para a resistência do kanamycin à suscetibilidade nas plantas que resultam queira ficam 1:1. Se no entanto uma planta da condição da duplex fica cruzado a um tipo selvagem planta então o quociente da segregação fica esperado fica 5:1. Os cruzamentos ficaram realizado para dois das plantas do triploid obtidas em cima ao tipo selvagem e as sementes obtidas ficaram anotado para a segregação da resistência do kanamycin.

Os resultados mostrados na tabela 5 indicam a segregação de 1:1 para a eliminação da resistência do kanamycin polyspermy, e mostram que os triploids se apresentam de gametas não reduzidos da fêmea.

Tabela 5: Segregação de Kan< R> phenotype em cruzamentos EMI ID=55.1

Desde o resultado do são das sementes de um cruzamento de uma progenitora do triploid à uma progenitora diploid, são de algumas sementes não esperado para germinar por causa do aneuploidy. A prova do ** da significação para a qualidade de encaixa para o quociente de 1:1 fica as sementes sem germinar que se excluem das calculadas.

A prova do *** da significação para a qualidade de encaixa para o quociente de 5:1 fica calculado incluindo as sementes sem germinar no Kan< R> categoria. Teoricamente os somente 50% das sementes sem germinar fique incluído em ou a categoria (baseada no quociente de Kan< R> e Kan< s> as plantas de viveiro obtidas) mas para aumentar o nível da significação incluímos a grande quantidade sem germinar completa em Kan< R> categoria. Isto elimina isso mesmo que incluímos a grande quantidade sem germinar completa em Kan< R> a categoria que a qualidade de encaixa para o quociente de 5:1 fica não significativo e apóia assim fortemente uma condição que favorece somente o quociente de 1:1.

S significativo para o < [do chi]; 2> prove indicar que não segue ao quociente dado NS não significativo para o < [do chi]; 2> prove indicar que segue ao quociente dado

EXEMPLO 8: O gene e a seqüência codificante do DYAD do álamo (trichocarpa de Populus)

Um exemplo adicional de um-gene do DYAD do álamo fica achado em http://www.ornl.gov/sci/ipgc. A tradução da porção da codificação da seqüência de cDNA proporciona uma seqüência de aminoácidos que fique comparado à seqüência de aminoácidos do selvagem-tipo proteína do DYAD do thaliana do Arabidopsis usando o programa de Clustal W na figura 11.

Trichocarpa homólogo de AtDyad Populus como em http://www.ornl.gov/sci/ipgc

Região genômica (Não. SEQ do ID: 24) EXÓN INTRON Incluindo 2444 pares de bases contracorrente desde primeiro ATG tcgagtat do

tggtgcccaagtaagtgaaatgatgattttacataacaaaaaccacataattattatgctatgtaacggtatattct atacattctcta do

ttgtctcacgctcacacacataccaaatccacacgcgcgtcccctacaatttgttacgcaaatcaaaccccgct ctacacatcct do

cgtaacccacgcgctcttttatctctcaaatcaagtcgctgattactagtctactaaagttttcaaatactcaaccg aattcctaatct do

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CTTAAACCCGGCTCAACATTTTTTTCTCTCTGCTTTAAAATTTGTTGGTGTTT G [Upsilon] [gamma] [iota] CROMATOGRAFÍA GASEOSA de C [Upsilon] [Upsílon] [Upsilon] GAA [Upsilon] AAK [Upsilon] A [Upsilon] C [Upsilon] CAGGTGAATGAAAAGACCAGGATGAGAGTC

TCGCTGAGGTTTCCAAGCATCAATTCTCTAAGATGTTACTTCAATGAGATTG A

AGCTATTAATTACAAGAAAGACATGAAAACGAAGAAGCAGCAGCTACCAGC A

TTCGACGAGAAATACATTATAGGATCAGAAGTTGCAGGGGAAGCTCTTTAT A

GGAGAATCTCTTCTCAAGAAATGGCAGACAAGAGTTACTCATGGAGTTTCT G

GATGGTTAAACATCCTTCGGTTTCACCTCGAAAAGTGTCATACCCACCTAC AA

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CTCAACGGGACAGGCATGGTTAAGTGGGGTCAGCGCCGGCAGGTCAGGT TC

TTGGCTAAACACGTAGAGGATAAACGTGAAATAGTGATTGCATCGAAGGAT T

TGATT AAAAGCGAAGAAGAGAAAGACAGTGATGGTAGTGATGATGACACA GA

CGATGAGGACGAGGAGGAGGTCGATGTTAAGTTAGTAGTAAACAAGTCAA GT

GAAGCTAAAAGGAAATTACGTAAGAGAAAGTGTCAAGGTGGGTCTGGTATT A

GCAAATTATCACCAAAAAAGAAAAGGCGTAAAATTGAAAAGAAGAACCAGA T TGTGGTCTA TA GGCAAAA GAA GAA CAAA CTCA TCAA GAA TTCTA TTGA CA GA T

GGTCTGCGGGGAGGTAATAAAGCTrTTATTAGTTAATAAACTAAATTCAGA TCGTCATTTGTGTT AATAT ATTTTTTTGATTAGTGTCTATATGTAGCTAGCTA ATTTGGTTG G GTG ATTTCTGTG AAG GTAT AAATTG G CTG AG G AAAAC ATGT T

AAAGGTAATGAAAGAGCAAAATGCTGTGTTTCGACGCCCAATTTT AAGGCC A GAATTGAGAGCTGAGGCACGGAAGTTGATTGGGGATACTGGGCTGTTAGA CC

ACTTGTTGAAGCATATGTCAGGGAAGGTGGCTCCGGGAGGAGAAGAGAGA TT

CAGAAGGAGGCATAACGCAGATGGAGCAATGGAGTATTGGCTGGAGAAG GC TGA TTTGGTTGA TATCAGGAAAGAGGCTGGTGTGCAGGA TCCTTA TTGGACA

CCTCCACCTGGGTGGAAACCTGGTGATAATCCTAGTCAGGATCCAGTTTGT G

CTÀGAGAGATCAAGGAACTCAGAGAAGAAATTGCTAAAATTAAAGGGTACT G

GTCCTTCTGTTTTAACTAGGATTGATTGTCTTTCAATTTTGTGTGGTCTTTTA GCTTGTTAGTGCTGTTGATCTGGTAATGCCCACCAGTTTTTCTCTGTTACTC T

TGGGGTGAATTGTGTGCGCTACTGATTCCATCTCTCGCGTATGTGTTGTTC T

TATGGGGGGCAGGGAGATGGAGGCAATGGTGTCTAAAAAACACGGGGAG GA

ATTAGCAATGGTGGCAGCACCGAATTATTCTCCTACAAGTCAGGACATGGA G

CATGACAACTTCTTAATTCCACTGAAGGTAATAGATATGAAAGTTTGACCAG

ATTTTTGGACTGACCCAAGTTCTTCTCTTGACAATCCATGTACTATTTTTGC A

GGAAATGTACATTGATTTGGTGAATAAGAAGGTAAAGATGGAGGAACAACT A

AAGGAAATTTCAGAATCTTTGTATGGGATGAAGGTAGGAGAGCATGAGAAT T

CTTCCTTTAATAATTATCATTTTCTTTTCAATTGAAGTGTGTAAGATTTGATA TGAATGATTCTTTCCACGTTATGACGTTCTGGGTGCTACTAGTGTATATAAG ATTCGTTCAAATAAGAAATTCCTGGGTGATTGCATGATCCACATCATTGAA AGATGGTAGTAACAAACTGACCATCTGATGCATGTATCTATTCTAGATAAT AAGTTGATGCATAAATTGCCATGAAACCATTTGAGAAGCTGTTATATTTAG AG G CTTG ATATG G G AGTGTTG CTTATTCC AG ACTAG ATTTTTG C AATTATTT AGTTCAATTTAAAGCTCAAAATCCCACATTAAATAGTTTCATAAATGATGA ATGTTCT

Transcript/CDS como en Ias bases de datos (2493 pares de bases) (No. SEQ do ID: 25) cctgtcaccattccccaatccaca do

aacaatctcacttcctctttgctcctccatctcaaacccatacaccccaccgtactttccctgtgaagccattagct gagagaagg do

taacccctcaccctcaggttgtggtcctactagaagacctcattgcggtacaaacacctccctcagtgtcctcca ctacaccaa do

gcagcaaagatagagaggctgaaaagcgggtttagaatatgcaagccccagggaagtttcctgtggccgga tatgactacct do

agcacaagaacaatgcaagtcatcatcaggaggcatcatagcaccaagaacagaatcaccagcaccaac ggaggacagg do

caatcacgccagcaggaactggaagaaaggggaaaggagtaatgcatcaggaaaaagaagcaacggtt ttaggggaatc do

agaagctaaaaaccagagtggagaaatcaaacagagcagaatcaactgaaaagccagctttattaatggg ctcaacagagt do

tgatttggtgaataagaaggtaaagatggaggaacaactaaaggaaatttcagaatctttgtatgggatgaag gaagaaatgg do

caatggtggcagcaccgaattattctcctacaagtcaggacatggagcatgacaacttcttaattccactgaag gaaatgtacat do

tcaaggaactcagagaagaaattgctaaaattaaaggggagatggaggcaatggtgtctaaaaaacacgg ggaggaattag do

gtgtgcaggatccttattggacacctccacctgggtggaaacctggtgataatcctagtcaggatccagtttgtgc tagagaga do

tcagaaggaggcataacgcagatggagcaatggagtattggctggagaaggctgatttggttgatatcagga aagaggctg do

aagttgattggggatactgggctgttagaccacttgttgaagcatatgtcagggaaggtggctccgggaggag aagagagat do

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agagaaagtgtcaaggtgggtctggtattagcaaattatcaccaaaaaagaaaaggcgtaaaattgaaaag aagaaccagat do

acacagacgatgaggacgaggaggaggtcgatgttaagttagtagtaaacaagtcaagtgaagctaaaag gaaattacgta do

gaggataaacgtgaaatagtgattgcatcgaaggatttgattaaaagcgaagaagagaaagacagtgatgg tagtgatgatg do

tgtctctcatgtctgagctcaacgggacaggcatggttaagtggggtcagcgccggcaggtcaggttcttggct aaacacgta do

ggttaaacatccttcggtttcacctcgaaaagtgtcatacccacctacaagtactcatgttaataaatttgttggtgc aaggaagg do

gatcagaagttgcaggggaagctctttataggagaatctcttctcaagaaatggcagacaagagttactcatg gagtttctggat do

gagattgaagctattaattacaagaaagacatgaaaacgaagaagcagcagctaccagcattcgacgaga aatacattatag do

ccgggttgtgatggtgaatgaaaagaccaggatgagagtctcgctgaggtttccaagcatcaattctctaagat gttacttcaat do

ccagctgagcatattaaagtgagctctttttatgaagttgatcactccaagctgcctcataaatcccctgatcaact caacaaaac do

atgtcgttttccacgctaagagctcttgtttctgatcaaaataaggaattctctgattactctttgttttccatgcttaata atgaagac

Seqüencia da proteína como en Ias bases de datos (83 Oaa) (No. SEQ do ID: 26) > eugene3.00030791 [Poptrl: 554158]

MSFSTLRALVSDQNKEFSDYSLFSMLNNEDPAEHIKVSSFYEVDHSKLPHKSP D

QLNKTRVVMVNEKTRMRVSLRFPSINSLRCYFNEIEAINYKKDMKTKKQQLPA FDEKYIIGSEVAGEALYRRISSQEMADKSYSWSFWMVKHPSVSPRKVSYPPT ST

HVNKFVGARKVSLMSELNGTGMVKWGQRRQVRFLAKHVEDKREIVIASKDLI KSEEEKDSDGSDDDTDDEDEEEVDVKLVVNKSSEAKRKLRKRKCQGGSGISK L SPKKKRRKIEKKNQIVVYRQKKNKLIKNSIDRWSAGRYKLAEENMLKVMKEQ NAVFRRPILRPELRAEARKLIGDTGLLDHLLKHMSGKVAPGGEERFRRRHNAD GAMEYWLEKADLVDIRKEAGVQDPYWTPPPGWKPGDNPSQDPVCAREIKEL R

EEIAKIKGEMEAMVSKKHGEELAMVAAPNYSPTSQDMEHDNFLIPLKEMYIDL VNKKVKMEEQLKEISESLYGMKEEMEKLKTRVEKSNRAESTEKPALLMGSTE S

ITPAGTGRKGKGVMHQEKEATVLGESAQEQCKSSSGGIIAPRTESPAPTEDRA A

KIERLKSGFRICKPQGSFLWPDMTTLTPHPQVVVLLEDLIAVQTPPSVSSTTPK Q

SHFLFAPPSQTHTPHRTFPVKPLAERRPVTIPQSTAATTPTSCPPLDQMTHSQ YE

NSSISTSTTITTTTKTPLINLNEPLNTNQTDDYGLFYGSQSHAEASPHPVTYQR R

HHQNVTTSIAMPSLGPTKKGMMSQWEEGDRRKGMIRYCEQCEQQQGCSSA SS [iota] ASSSLPMGKGTWLALATSKASVEHKSKRG*

EXEMPLO 9: Identificação dos polynucleotides e dos polipéptidos do DYAD do milho.

Uma busca do genoma do milho usando TBLASTN e a proteína do DYAD do arroz (Não. SEQ do ID: 51) enquanto que a pergunta no Site na web (www.plantgdb.org) revelou a presença de um gene suposto do DYAD dentro de uma região do genoma do milho correspondente aos contigs ZmGSStucI 1- 12-04.1016.1 (Não. SEQ do ID: 52) e ZmGSStucI 1-12-04.1016.2 (Não. SEQ do ID: 53). Anotação da região usando GENSCAN (http://genes.mit.edu) conjuntamente com corrigir manual conduzido à identificação das seqüências supostas do polipéptido do milho que poderiam fica alinhado com as seqüências do polipéptido do DYAD do arroz (figura 12). A atual invenção abrange o uso das seqüências ditas do polipéptido do milho e das seqüências do polinucleotídeo que codificam os polipéptidos ditos. As seqüências do polipéptido obtidas do Ζ. o são de mayos traz às seqüências do necleotideos do contig como se amostra por coordenadas do necleotideos abaixo. O polipéptido parcial ensamblado do DYAD de Zm ordena codificado pelo são das seqüências do contig também mostrado. ZmGSStucI 1-12-04.1016.1 (Não. SEQ do ID: 52) Coordenadas e tradução conceptual 5335 ESKDGDPR GVKRYI 4882; 4724 EQLLCK DYSSLK 4662; 4142 EKYQRA?. QVLCLK 4080; 3805 DMCEN EVSSFK 3743; 3605 EKYEHI FLSFK 3522; 3413 DQLVVAL GLTRRDV 2865: 2697 DTSSS LATPSYC 2563;

Ζ. polipéptido ensamblado de mayos: (No. SEQ DEL ID: 54)

ESKDGDPRHGKDRWSAERYAAAEKSLLNIMRSRDARFGAPVMRQVLREEAR K

HIGDTGLLDHLLKHMAGRVPEGSVHRFRRRHNADGAMEYWLEPAELAEVRK QAGVSDPYWVPPPGWKPGDDVSLVAGDILVKRQVEELTEEVNGVKRYIEQLL CKDDGDFGAERDYSSLKEKYQRAVRANEKLEKQVLCLKDMCENVVQMNGEL KKEVSSFKEKYEHIADKNDKLEEQVTYLSSSFLSFKDQLVVALKLELAPSEAVP RTALFVASGEQMTGTVIQGGQDRAERKSSFRVCKPQGKFLLPSMASGMTIGR G

ASSTCPAAATPGPGIPRSTSFPSMPGLPRSSRGPVEVVAAASGLDEHVMFGA HF

STPPSASSTNDAAKLQLSLPSPRSPLQPQKLFDTVTAAASGFSPQKLMHFSGL TR RDVDTSSSSSGACGSGLLEGKRVLFDADAGGISAVGTELALATPSYC [0189] [00164] ZmGSStucI 1-12-04.1016.2 (No. SEQ do ID: 53) Coordenadas y traducción conceptual

774 MSLFIS 757; 574 KPQVKK PTYHA 418; 315 GAFYEID SIRVVK 237; 144 VSECTN SNHAAR I; Z. polipéptido ensamblado de mayos: (No. SEQ DEL IO: 55)

MSLFISKPQVKKYYFKKKTSSSHSRNGKDDVNHDSTIQPRSPLSRQSLTFDAIP T

YHAGAFYEIDHDKLPPKSPIHLKSIRVVKVSECTNLDITVKFPSLQALRSFFSSY P APGTGPELDERFVMSSNHAAR

EXEMPLO 10: Um procedimento geral para a partenogénesis

Determinação da dose ótima da irradiação:

1. Recolha as anteras de uma planta masculina da progenitora da mesma espécie ou da espécie relacionada que a planta da progenitora da fêmea fica utilizado e propaga com a radiação de ionização em um intervalo de dose compreendendo 1, 5, 10, 20, 30, 50, 70, 100, 150, 200 krad.

2. Polinice as flores emasculated ou as flores da fêmea da planta da fêmea que difere da progenitora irradiada do pólen em levar cerca de ou mais marcadores phenotypic recessivos ou com relação aos marcadores da DNA (microsatellite, VOCÊ REMATE, ou RAPD). Utilize preferivelmente 10-50 flores para a polinização em cada dose da radiação de ionização.

3. Recolha as sementes de flores e de sementes polinizadas do charco das flores que ficaram polinizado com o pólen que recebeu a mesma dose da radiação.

4. Germine as sementes e cresça nas plantas para dar perto de 20-100 plantas para cada dose da irradiação.

5. Anote o genotipo de plantas com relação ao marcador phenotypic ou a marcadores da DNA e calcule a proporção das plantas que se assemelham à progenitora maternal.

6. Escolha uma dose que dê uma combinação ótima de uma porcentagem alta de plantas viáveis assim como uma elevada proporção de plantas que se assemelhem à progenitora maternal.

Indução da partenogénesis em uma planta do mutante do dyad: 1. Polinice uma planta do mutante do dyad com o pólen propagado usando uma dose apropriada da radiação de ionização determinada como se descreve anteriormente.

2. Recolha as sementes.

3. Germine as sementes e cresça nas plantas. Identificação de plantas parthenogenetic:

1. Anote as plantas com relação a um marcador phenotypic recessivo levado pela progenitora da fêmea. Você planta que mostram o são recessivo do phenotype classificado como parthenogenetic. Além disso as plantas podem ficam anotado para os marcadores da DNA isolando a DNA do tecido fino de planta seguido pela análise da DNA com relação a marcadores polimórficos. Planta mostrar patrões do marcador que característica do são da progenitora e do são da fêmea que carecem às bandas do marcador para o são da progenitora do varão classificado como parthenogenetic. A porcentagem de plantas parthenogenetic de um experimento da polinização pode fica assim calculado.

2. O bote das plantas de Parthenogenetic fica examinado para os marcadores para os quais a progenitora da fêmea ficou heterozygous. Essas plantas que conservam o heterozygosity para todos os marcadores para os quais a progenitora do mutante do dyad da fêmea ficou as plantas apomictic do são : heterozygous.

As referências para os marcadores moleculares possíveis que podem ficam utilizado para o diferente são da espécie do cultivo enumerado abaixo: Trigo: www.gramene.org 1. Tourada e outros. (2006). mapa SSR-baseado do acoplamento com os marcadores novos usando uma população do intraspecif [iota] c do trigo comum. TheorAppI Genet. No dia 2006 de abril; 112 (6): 1042-51. 2. Song e outros. (2005). Desenvolvimento e mapeo dos marcadores do microsatellite (SSR) em trigo. Theor Appl Genet. No dia 2005 de fevereiro; 110 (3): 550-60. Arroz: www.gramene.org 1. Harushima e outros. (1998). Um mapa genético do acoplamento do arroz de alta densidade com genética 148 de 2275 marcadores: 479-494.

2. Causse e outros. (1994). Mapa molecular saturado do genoma do arroz baseado em uma população interespecífica do cruzamento. Genética. DEC 1994; 138 (4): 1251-74.

Milho: Coe e outros. (2002). Acesso ao genoma do milho: um mapa físico e genético integrado ". Planta Physiol. 128: 9-12. www.gramene.org Cevada: www.gramene.org:

Wenzl e outros. (2006). Um mapa de alta densidade do consenso da cevada que enlaça marcadores do dardo aos lugares geométricos de SSR, de RFLP e do STS e aos rasgos agrícolas. BMC Gênomics. 12 Ago 2006; 7 (I): 206 Aveia: WWW, gramene.org

De Koeyer e outros. (2004). Um mapa molecular do acoplamento com QTLs associado de um χ hulless cobriu a população da aveia da mola. Theor Appl Genet. Maio 2004; 108 (7): 1285-98.

Espécie de milho de pérola: WWW, gramene.org um mapa genético integrado e um novo fraguado dos marcadores simples da repetição da seqüência para o milho de pérola, glaucum de Pennisetum. Theor Appl Genet. O 2004 de nov; 109 (7): 1485-93.

Zahína: Chittenden e outros. (1994). Um mapa detalhado de RFLP da zahína bicolor. Theor. Appl. Genet. 87: 925-933.

Brassica oleracea: Bohuon e outros. (1998). ?Comparação de um mapa genético de brassica oleracea com o genoma do thaliana do Arabidopsis?. Genética 150: 393-401.

Brassica juncea: Pradhan e outros. (2003). Um mapa de alta densidade do acoplamento em brassica juncea (mostarda indiana) que usa marcadores de AFLP e de RFLP. Theor Appl Genet. No dia 2003 de fevereiro; 106 (4): 607-14. Napus da Brassica: Piquemal e outros. (2005). Construção de um mapa

genético da violação da gárgula (napus L. da Brassica) com os marcadores de SSR. TheorAppI Genet. O 2005 de nov; I 11 (8): 1514-23. Rapa da Brassica: Kole e outros. (1997). Mapa genético do acoplamento de uma população inata recombinant do rapa da Brassica. J. Hered. 88:553 - 557 Algodão: Rong e outros. (2004). Um mapa genético da recombinación de 3347 lugares geométricos Genética 166: 389-417.

Tomate: Zhang e outros. (2002). Um mapa molecular do acoplamento do tomate que exibe situações cromossômicas dos análogos do gene da resistência baseados em um cruzamento esculentum do hirsutum de Lycopersicon x Lycopersicon. Genoma no dia 2002 de fevereiro; 45 (I): 133-46. Beringela: Doganlar e outros. (2002) Um mapa genético comparativo do acoplamento da beringela

(Melongena da solanácea) e suas implicações para a evolução do genoma nos solanaceae. Genética 161 (4): 1697-711

Pimentão: Mapeo do genoma em pimentão e a evolução da estrutura do genoma nos solanaceae. Genética 152 (3): 1183-202.

Batata: Tanksley e outros. (1992). Mapas moleculares de alta densidade do acoplamento dos genomas do tomate e da batata. Genética 132 (4): 1141- 1160.

Soja: Ferreira e outros. (2000). Mapa genético da soja dos marcadores de RAPD atribuídos a um mapa existente do andaime RFLP. J. Hered. 91(5): 392- 396.

Populus: Yin e outros. (2001). Mapas genéticos interespecíficos preliminares do genoma do populus construído de marcadores de RAPD. Genoma no dia 2001 de agosto; 44 (4): 602-9.

Tuskan e outros. (2004). Caracterização dos microsatellites revelados por ordenar genômico do trichocarpa de Populus. J. canadense. Floresta Cabeça de gado. 34(1): 85-93. Uma mostra do Ε. o coli filtra DH5 [alfa] transformado com o plasmid pbil 01.3: O Dyad [delta] GR ficou depositado nas autoridades internacionais do armazém,

Tipo microbiano tipo microbiano coleção da coleção do cultivo do cultivo e banco do gene

(MTCC, instituto da tecnologia microbiana (IMTECH), conselho de cientista e Investigação industrial (CSIR), Setor-39A, Chandigarh - 160 036, a índia). A mostra ficou depositado no dia 1 de dezembro de 2006 e leva o número de referência interno. Amostra de BI507.A compreendendo pelo menos 2500 sementes de uma população F2 de um cruzamento entre o mutante W 2 do dyad

66 como varão a um tipo selvagem planta da fêmea, e que segrega para o mutante do dyad ficou depositado com a coleção de tipo americano do cultivo (Manassas, VAI20108, USA). A mostra ficou aceso enviado 1< st> O dezembro de 2006 e leva o número de referência interno. ISDYF2R. Uma mostra compreendendo pelo menos 2500 sementes (derivadas da linha não. 33) que são homozygous para o dyad e para a inserção do Dyad [delta] GR e daí fertilidade condicional das amostras em resposta à dexametasona ficou depositado com a coleção de tipo americano do cultivo (Manassas, VAI20108, USA). A mostra ficou aceso enviado 1<st> O dezembro de 2006 e leva o número de referência interno. 33-5DYGR.

Vários artigos do são cientista do jornal e da literatura de patentes citado adjunto. Cada tal artigo fica incorporado por este meio pela referência na sua totalidade e para todos os propósitos por tal citação.

Claims (35)

1. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: A planta A compreendendo um genoma homozygous para um alelo do dyad e condicional expressando uma proteína do DYAD no núcleo das células da planta.

2. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: A planta da reivindicação 1 em onde a dita planta se transforma em condicional fêmea fértil.

3. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: A planta da reivindicação 1 em onde a dita planta chega em ser condicional para a retenção do heterozygosity parental da fêmea na planta dita as sementes produz.

4. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: A planta da reivindicação 1, na qual o dito genoma compreende pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo que codifica uma proteína do DYAD fusionada a um domínio de união esteróide do ligand do receptor do hormônio.

5. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: A planta da reivindicação 4, na qual o domínio de união esteróide do dito ligando receptor do hormônio fica um domínio de união do Iigand do receptor da glucocorticoide.

6. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: A planta da reivindicação 1, na qual o alelo do dyad fica um no qual uma proteína do DYAD truncada em uma posição do aminoácido a partir do 508 a 572 fique expressado.

7. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: A planta da reivindicação 6, na qual o alelo do dyad compreende um polinucleotídeo que tem a seqüência do necleotideos de NÃO SEQ do ID: 1, ou tem uma seqüência do necleotideos que cruzamento por hibridação com o complemento de um polinucleotídeo de NÃO SEQ do ID: -1, NÃO SEQ DO ID: 23, ou NÃO SEQ do ID: 25 condições inferiores da formamida de 40%, IM NaCI1 1% SDS no < 37; 0> C, ou equivalente além disso.

8. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: A planta da reivindicação 1, na qual a proteína do DYAD fica codificado por um polinucleotídeo compreendendo a seqüência do necleotideos de NÃO SEQ do ID: 4 ou de NÃO SEQ do ID: 17 ou de SEQ NÃO DO ID: 23 ou de NÃO SEQ do ID: 25 ou por um polinucleotídeo que cruzamento por hibridação ao complemento de NÃO SEQ do ID: 1, ou NÃO SEQ do ID: 23, ou NÃO SEQ do ID: 25 condições inferiores da formamida de 40%, IM NaCI, 1% SDS no < 37; 0> C, ou equivalente além disso.

9. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: A planta da reivindicação 7, na qual a proteína do DYAD fica codificado por um polinucleotídeo compreendendo a seqüência do necleotideos de NÃO SEQ do ID: 4 ou de NÃO SEQ do ID: 17or de NÃO SEQ do ID: 23 ou de NÃO SEQ do ID: 25 ou por um polinucleotídeo que cruzamento por hibridação ao complemento de NÃO SEQ do ID: 1, ou NÃO SEQ do ID: 23, ou NÃO SEQ do ID: 25 condições inferiores da formamida de 40%, IM NaCI, 1% SDS no < 37; 0> C, ou equivalente além disso.

10. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: Um método para fazer um heterozygosity de retenção da semente de compreender da progenitora da fêmea: i) polinizando uma planta parental da fêmea que fica homozygous para o dyad com pólen de uma planta parental masculina, ou selfing a planta dita homozygous para o dyad; e ii) obtendo a semente da planta parental polinizada dita da fêmea.

11. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO, caracterizado por: O método da reivindicação 10, em onde são dito da semente do tamanho normal ou são contraído de tamanho.

12. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: O método da reivindicação 10, em onde o pólen usado no passo i) ficou propagado.

13. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por:.O método da reivindicação 10, em onde o pólen usado no passo i) fica fértil e a semente obtida no passo ii) fica o triploid.

14. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: Um método para obter a semente que tem um genoma embrionário que fique homozygous para um alelo do dyad e preveja uma planta que fique condicional para a expressão de uma proteína do DYAD no núcleo de células da planta dita, compreendendo i) selfing uma primeira planta que fique heterozygous u homozygous para um alelo do dyad e compreenda uma expressão constrói que expresse condicional a proteína do DYAD no núcleo e selecionar de obter uma segunda planta que fique homozygous para o dyad e para a expressão constrói, ii) que obtinha as sementes da segunda planta ou as sementes de uma planta desceu da segunda planta e de selecionar essas sementes que ficam normal ou contraídas de tamanho.

15. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: O método da reivindicação 14 em onde a segunda planta dita fica condicional para a retenção do heterozygosity parental da fêmea no embrião das sementes produzidas pela segunda planta dita.

16. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO. O método da reivindicação 14 em onde a segunda planta dita fica condicional para a esterilidade da fêmea.

17. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: Um método para obter uma planta que fique homozygous para um alelo do dyad e fique condicional para a expressão de uma proteína do DYAD no núcleo das células da planta, compreendendo i) selfing uma primeira planta que fique heterozygous u homozygous para um alelo do dyad e para uma expressão constrói que expresse condicional a proteína do DYAD no núcleo e selecionar de obter uma segunda planta que fique homozygous para o dyad e para a expressão constrói, ii) que introduz as segundas plantas selecionadas ditas à condição sob a qual a proteína do DYAD fica expressado.

18. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: O método da reivindicação 17 en donda segunda planta dicha fica condicional para a retención do heterozygosity parental da fêmea en o embrión das semillas producidas por a planta dicha do T2.

19. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: O método da reivindicação 17 en donda segunda planta dicha fica condicional para a esterilidad da fêmea.

20. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: Uma semente ou um tecido fino da planta da reivindicação 1.

21. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: Uma semente obtida por o método da reivindicação 10.

22. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: Uma semente do triploid obtida por o método da reivindicação 13.

23. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: Un método para manter uma linha da planta homozygous para o dyad comprendiendo propagando uma planta das condiciones inferiores da reivindicação 1 suficientes para a expresión da proteína do DYAD.

24. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por:Un método para mantener uma línea da planta homozygous para o dyad comprendiendo propagando uma planta das condiciones inferiores da reivindicação 4 suficientes para a expresión da proteína do DYAD.

25. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por:O método da reivindicação 24, en o cual a condición dicha comprende aplicar uma hormônio esteroide a a planta dicha.

26. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: Um método para obtener uma planta comprendendo uma copia de un gene do DYAD que fique condicional expresado no núcleo, comprendiendo i) por si, uma primera planta que comprende uma expresión construye que exprese condicional a proteína do DYAD en o núcleo da planta dicha o da cruz dos das primeras plantas dichas para obtener Ias segundas plantas y seleccionar uma segunda planta que exhibe síliques acortados o Ios frutos contraídos, o a semente reducida fragua ii) que introducía a segunda planta seleccionada dicha a a condición bajo a cual A proteína do DYAD fica expresado.

27. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: O método da reivindicação 26, no qual a primera planta fica o tipo selvajem com relação ao DYAD1 heterozygous para o dyadou homozygous para o dyad.

28. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por:Un método para obtener uma planta que expresa condicional un salvaje-tipo proteína do DYAD en o núcleo de células de planta dicha comprendiendo a células que transforman de uma planta con un vector comprendiendo un construir que exprese condicional un salvaje-tipo proteína do DYAD en o núcleo de células de planta dicha.

29. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: O método da reivindicação 28, en o cual a planta fica uno que fique homozygous para o dyad.

30. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por.O método da reivindicação 28, en o cual a planta fica uno que fique heterozygous para o dyad.

31. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por:Uma planta que fica homozygous para un construir que proporciona a expresión condicional do salvaje-tipo proteína do DYAD en o núcleo de células de planta dicha.

32. Uma expresión construye a expresión condicional que confiere de un gen do DYAD en o núcleo de uma célula da planta.

33. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: Segundo o exposto na reivindicação 32 donda célula dicha da planta fica a célula da mãe do megaspore.

34. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: O construir da reivindicação 32 donde o gen dicho do DYAD fica fusionado a un domínio de união esteroide do Iigand do receptor da hormônio.

35. ÁCIDOS NUCLÉICOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR SEMENTES TENDO UM COMPLEMENTO DIPLÓIDE CHEIO DO GENOMA MATERNO NO EMBRIÃO caracterizados por: segundo a reivindicação 34 donde o domínio de união de tal esteroide ligando do receptor do hormônio fica un domínio de união do ligando receptor da glucocorticoide.