KR20020059719A - 재조합 젤라틴 - Google Patents

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KR20020059719A
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recombinant gelatin
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로버트 씨. 창
케리 아이. 키버리코
토마스 비. 네프
데이비드 알. 올센
제임스 더블유. 폴라렉
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추후보정
피브로겐, 인크.
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Abstract

본 발명은 재조합 젤라틴, 그를 포함하는 조성물, 및 이들의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 젤라틴 {RECOMBINANT GELATINS}
본 출원은 본원에 명세서 내용의 전체가 참고로 포함되는, 2000년 5월 15일 출원된 미국 가출원 번호 제60/204,437호 및 1999년 11월 12일 출원된 동 제60/165,114호를 우선권으로 주장한다.
젤라틴은 동물의 주요 구조 및 결합 단백질인 콜라겐의 유도체이다. 젤라틴은 콜라겐의 변성으로부터 유도되며, Gly-X-Y (여기서, X 및 Y는 가장 흔하게는 프롤린 및 히드록시프롤린 잔기임) 반복부를 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 이러한 서열은 3중 나선 구조에 기여하며, 젤라틴 폴리펩티드의 겔화 능력에 영향을 준다. 현재 이용되는 젤라틴은 동물의 피부 및 뼈의 가공을 통해, 통상적으로는 소 및 돼지 공급원으로부터 추출되는 것이다. 젤라틴의 생물리적 특성으로 인해 젤라틴은 각종 분야 및 산업에 있어서 폭넓게 사용되는 다용도의 물질이다. 젤라틴은 예를 들어 수많은 약제 및 의료 용품, 사진용 재료, 산업 용품, 화장품, 식품 및 음료, 및 이들의 제조 방법에 사용된다. 따라서, 젤라틴은 상업적으로 가치있는 다용도의 물질이다.
<젤라틴의 제조>
젤라틴은 통상적으로 소 및 돼지 공급원, 특히 피부 및 뼈의 자연 발생적인 콜라겐으로부터 제조된다. 어떤 경우, 젤라틴은 예를 들어 어류, 닭 또는 말 공급원으로부터 추출될 수 있다. 통상의 젤라틴 제조에 있어서 예를 들어 소의 피부 및 뼈와 같은 통상의 원료는 정부의 공인된 검사를 통과하고 인간을 위한 사용에 적합하게 맞추어진 동물로부터 형성된다. 이러한 원료는, 전염성 해면상 뇌병증 (TSE), 특히 소의 전염성 해면상 뇌병증 (BSE), 및 스크래피 (scrapie) 등과 같은 오염성 물질의 존재로 인해 감염의 위험이 있다 (예를 들어, 문헌 (Rohwer, R. G. (1996), Dev Biol Stand 88: 247-256) 참조). 이러한 문제점은 특히 제약 및 의료 분야에서 사용되는 젤라틴의 경우 특히 중요하다.
최근, 상당한 부분이 소 공급원으로부터 유도되는 이러한 물질의 안정성에 대한 염려가 증가되어, 인간의 치명적인 신경병인 새로운 변형 크루이츠펠트-야콥 병 (nvCJD)과 관련된 소 해면상 뇌병증 (BSE)의 전염에 대한 위험 가능성을 줄이기 위한 여러 조절 방법에 있어서 각종 젤라틴-함유 제품들이 초점이 되고 있다. 동물의 조직 및 뼈로부터 젤라틴을 추출하는 현재의 방법에 사용되는 정제 단계는 오염성 SE-운반 조직 (즉, 뇌 조직 등)으로 인해 감염 가능성을 제거하기에 충분하지 않을 수 있다는 염려가 있다. 미국 및 유럽의 제조업자들은 인간 또는 동물용 식품, 또는 제약, 의료 또는 화장품 분야에 포함되는 젤라틴용 원료가 늘어나는 숫자의 BSE 국가로부터 입수되어서는 안됨을 명시하고 있다. 또한, 어떤 재료, 예를들어 소의 뇌 조직은 젤라틴의 제조에 사용되어서는 안됨을 명시하고 있는 법규도 있다.
현재의 제조 방법은 여러 정제 및 정화 단계를 포함하고 있으며, 엄격하고 장시간의 추출 방식을 필요로 할 수 있다. 동물의 피부 및 뼈는 정제 (rendering) 방법으로 처리되며, 추출되는 물질에는 고도로 산성 또는 알칼리성인 용액에 장시간 노출시키는 것을 비롯하여 다양한 화학적 처리를 수행한다. 많은 정제 단계들은 세척 및 여과, 및 각종 열 처리를 포함할 수 있다. 산 탈염처리 (demineralization) 및 석회 처리를 이용하여 비-콜라겐 단백질과 같은 불순물을 제거한다. 뼈에서는 유분을 제거해야만 한다. 다른 세척 및 여과 단계, 이온 교환, 및 다른 화학 및 멸균 처리를 추가 수행하여 물질을 추가로 정제한다. 또한, 오염원 및 불순물은 처리후에도 여전히 남아있을 수 있으며, 따라서 생성되는 젤라틴 제품은 통상적으로 정화, 정제하여야 하며, 종종 사용에 앞서 추가로 농축시켜야만 한다.
시판 젤라틴은 일반적으로 타입 A 또는 타입 B로 분류된다. 이러한 분류는 추출 방법의 일부로서 전처리 추출 공급원의 수용을 반영한다. 타입 A는 일반적으로 산-처리된 물질, 통상적으로는 돼지 피부로부터 유래하며, 타입 B는 일반적으로 알칼리- 또는 석회-처리된 물질, 대개는 소의 뼈 (골질) 및 피부로부터 유래한다.
타입 A 젤라틴의 추출에 있어서, 이 방법은 일반적으로 신선한 또는 동결된 돼지 피부를 물로 연속 세척하고 묽은 산으로 처리하는 것을 포함한다. 산-처리된 피부를 다시 세척한 다음, 추출 단계를 반복하는데, 이 때 피부를 뜨거운 물로 처리하여, 존재하는 콜라겐을 부분적으로 가수분해한다. 생성된 추출물인 젤라틴 희석 용액을 여과 및 증발시키고, 생성된 농축물을 냉각 또는 냉장하여 겔화한다. 이어서, 겔을 건조 깔때기, 또는 연속 건조기 또는 기타 건조 장치에서 처리한다.
석회처리 방법에서, 타입 B 젤라틴을 공여자 피부 및 피부 조각으로부터 유도하고, 이어서 석회로 처리한다. 석회 처리는 1개월부터 3개월까지 걸릴 수 있으며, 일반적으로는 대략 6일이다. 석회처리된 피부를 세척하고, 묽은 산으로 처리한다. 이어서, 피부를 뜨거운 물로 가수분해하고, 생성된 추출물을 상기 기재된 바와 같이 산-처리 방법으로 처리한다.
타입 B 젤라틴은 또한 골질 공급원으로부터 가공될 수도 있다. 경골 (hard bone)을 세척, 탈지 및 여과하고, 염산 등의 묽은 산으로 연속 처리한다. 산 처리를, 산 용액을 사용하여 제거된 뼈의 미네랄 함유물, 잔류 골질 또는 탈염처리된 뼈와 함께 반응시켰다. 잔류 산이 없도록 세척된 이러한 유기 뼈 물질을 보관을 위해 건조하거나 또는 즉시 석회처리한다. 석회화 후에, 이어서 골질을 상기 기재된 바와 같이 처리하여 소의 피부로부터 젤라틴을 제조하였다. 모든 경우에서, 최종 여과, 탈염처리, 농축 및 건조 단계 후에, 생성된 젤라틴 산물을 배치로 나누고, 각종 물리적, 화학적 및 세균학적 시험에 의해 등급 및 순도를 결정하고, 상업적인 요건에 따라 분쇄 및 혼합하였다. 타입 A 및 B 추출 방법에서, 생성된 젤라틴 제품은 통상적으로 젤라틴 분자의 혼합물을 수천 내지 수십만 달톤의 크기로 포함한다.
겔화 또는 비-겔화 타입으로 분류되고, 통상적으로는 타입 A 젤라틴으로 가공되는 어류 젤라틴은 또한 여러 상업적으로 용도로 사용된다. 겔화 타입은 일반적으로는 난류성 어류의 피부로부터 유도되지만, 비-겔화 타입은 통상적으로 한류성 어류로부터 유도된다. 어류 젤라틴은 아미노산 조성이 폭넓게 변화하며, 통상적으로는 프롤린 및 히드록시프롤린 잔기 비율이 더 낮다는 점에서 동물 젤라틴과 구별된다. 동물 젤라틴과는 달리, 어류 젤라틴은 통상적으로 훨씬 더 낮은 온도에서, 유사한 분자량에서 조차도 액상으로 유지된다. 다른 동물 젤라틴과 마찬가지로, 어류 젤라틴은 어류 피부를 처리한 다음, 가수분해처리하여 추출한다. 또한, 동물에서의 추출 방법에서와 같이, 어류 젤라틴을 추출하는 방법에 의해서는 균일성이 결여된 생성물이 얻어진다.
<발명의 개요>
젤라틴은 광범위 분야에 사용되는 필수적인 제품이다. 젤라틴의 여러 용도는 이러한 편재성 혼합물의 여러 특징 및 특성에 의존한다. 현재의 추출 방법은 다양한 범위의 분자량 분포를 갖는 폴리펩티드를 함유하는 비균질 단백질 혼합물인 젤라틴 산물을 생성한다. 때때로, 목적하는 분야에 사용되는 적절한 물리적 특성을 갖는 젤라틴 혼합물을 얻기 위해서는 다양한 많은 생성물을 혼합하는 것이 필요하다.
더 균질한 생성물, 및 재현가능한 더 많은 방법에 의해 생성된 생성물이 바람직하다. 재현가능한 물리적 특징을 갖는 균질한 물질의 이용가능성은, 예를 들어, 다양한 생성물 및 방법에서 바람직하며, 구체적인 특징, 예를 들어 고정된 범위의 분자량을 갖는 젤라틴의 이용가능성은 재현가능하고 조절되는 수행성을 가능케 할 것이다. 따라서, 조절된 특징을 갖는 균질한 생성물을 제공하는 믿을만 하고 재현가능한 젤라틴 제조 방법이 요구된다.
또한, 특히 약제, 화장품, 및 식품 및 음료 산업에서는, 동물 공급원, 예를 들어 소 및 돼지의 뼈 및 조직으로부터의 추출을 통해 얻어지는 것과는 다른 젤라틴 공급원이 필요하다. 또한, 현재 이용가능한 젤라틴은 동물 공급원, 예를 들어 뼈 및 조직으로부터 제조되기 때문에, 젤라틴을 포함하는 제품의 바람직하지 못한 면역원성 및 감염성에 대한 염려가 있다 (예를 들어, 문헌 (Sakaguchi, M. et al. (1999) J. Aller. Clin. Immunol. 104: 695-699; Miyazawa et al. (1999) Vaccine 17: 2176-2180; Sakaguchi et al. (1999) Immunology 96: 286-290; Kelso (1999) J Aller. Clin Immunol. 103 : 200-202 ; Asher (1999) Dev Biol Stand 99: 41-44; and Verdrager (1999) Lancet 354: 1304-1305) 참조). 또한, 동물 공급원, 예를 들어 조직 및 뼈로부터의 추출을 수행하지 않는 대체 물질의 이용가능성은 여러가지 윤리적, 종교적 및 사회적 요구를 불러일으킬 것이다. 동물 공급원, 예를 들어 조직 및 뼈로부터의 추출을 필요로 하지 않는 재조합 물질은, 예를 들어 섭취에 제한이 따르는 사람, 예를 들어 코쉐르 (Kosher) 및 할랄 (Halal) 법을 따르는 사람이 사용하기에 적합한 캡슐화 약제를 비롯하여 식품 및 다른 섭취용 제품의 제조에 사용될 수 있다.
젤라틴 생산자 및 최종 사용자가 현재 이용되는 동물 출처의 젤라틴을 대용할 많은 천연 및 합성 대용물을 조사하여 시험하였지만, 보편적인 대용물은 아직 발견되지 않았다. 몇몇 분야, 예를 들어 VCAPS 캡슐 (CAPSUGEL; Morris Plains,NJ)에서 셀룰로스 원료의 사용, 또는 사진용 에멸전에서 마우스 및 래트 콜라겐 서열 유래의 비-천연의 젤라틴-유사 단백질의 제안된 사용에 대하여 다른 것들을 확인하였다 (예를 들어, 문헌 (Werten, M. W. et al. (1999) Yeast 15: 1087-1096; and De Wolf, Anton et al., European Application No. EP1014176A2) 참조). 그러나, 젤라틴을 기초로 한 대부분의 방법 및 생성물의 경우, 이러한 주요 물질의 수행 특성은 반복되지 않았으며, 대용물은 채택되지 않았다. 따라서, 생성된 산물이 목적하는 수행 특징을 갖는 합리적인 대용물로 작용할 수 있는, 합성 및 재현가능한 방식으로 젤라틴을 제조하는 방법이 요구된다.
요컨대, 젤라틴의 수행 특징을 제공하면서 더 재현가능하고 조절되는 제품 공급원을 허용하는 보편적인 대체물이 요구된다. 엄격한 장시간의 가공을 요하지 않는 젤라틴 제조 방법, 및 다양한 용도에 적합한 상당량의 다른 타입의 젤라틴을 안정하게 제조할 수 있는 보다 균질한 생성물을 얻는 젤라틴 제조 방법이 요구된다. 여러 용도로 쉽게 변형할 수 있으며 존재하는 건강 및 다른 염려가 없는 다용도의 젤라틴 제품이 요구된다.
본 발명은 젤라틴이 현재 사용되는 특별한 다양한 범위의 분야에 사용하기에 적합한, 재조합적으로 얻어지는 보편적인 대체 물질을 제공함으로써 이러한 문제 및 기타 요구사항을 해결하기 위한 것이다. 이러한 물질은 특정 분야에 요구되는 특성 및 특징을 보유하도록 설계할 수 있으며, 따라서 본 발명의 이전에는 이용할 수 없었던 새로운 특성 및 용도를 제공할 수 있다.
<발명의 요약>
본 발명은 재조합 젤라틴, 그를 함유하는 조성물 및 물질, 및 그의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.
한 측면으로, 본 발명은 재조합 젤라틴을 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 약 5 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 14 kDa, 16 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 36 kDa, 44 kDa, 및 65 kDa으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자량을 갖는다. 다른 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 약 0 내지 50 kDa, 약 10 내지 30 kDa, 약 30 내지 50 kDa, 약 10 내지 70 kDa, 약 50 kDa 내지 70 kDa 약 50 내지 100 kDa, 약 100 내지 150 kDa, 약 150 내지 200 kDa, 약 200 내지 250 kDa, 약 250 내지 300 kDa, 및 약 300 내지 350 kDa으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자량 범위를 갖는다. 한 측면으로, 재조합 젤라틴은 300 kDa을 넘는 분자량을 갖는다.
다른 측면으로, 본 발명은 50, 100, 150, 200, 250 및 300으로 이루어진 군으로부터 선택되는 블룸 (Bloom) 강도를 갖는 재조합 젤라틴을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 블룸 강도는 0 내지 100이다.
어떤 실시양태에서, 본 발명은 비히드록실화, 완전 히드록실화 또는 부분적으로 히드록실화된 재조합 젤라틴을 포함하는 조성물을 제공한다. 다양한 측면으로, 재조합 젤라틴은 20 내지 80%, 30 내지 80%, 40 내지 80%, 60 내지 80%, 20 내지 60%, 30 내지 60%, 40 내지 60%, 20 내지 30%, 20 내지 40%, 및 30 내지 40%로 이루어진 군으로부터 선택되는 히드록실화 비율을 갖는다. 다른 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 완전히 히드록실화되거나, 부분적으로 히드록실화되거나 또는 비히드록실화된다.
한 측면으로, 본 발명은 재조합 젤라틴 폴리펩티드의 균질 혼합물을 포함하는 재조합 젤라틴을 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 측면으로, 재조합 젤라틴은 재조합 젤라틴 폴리펩티드의 비균질 혼합물을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 임의의 다른 콜라겐이 섞이지 않은 한가지 타입의 콜라겐으로부터 유도된 재조합 젤라틴을 포함하는 조성물을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 한가지 타입의 콜라겐은 타입 I, 타입 II, 타입 III, 타입 IV, 타입 V, 타입 VI, 타입 VII, 타입 VIII, 타입 IX, 타입 X, 타입 XI, 타입 XII, 타입 XIII, 타입 XIV, 타입 XV, 타입 XVI, 타입 XVII, 타입 XVIII, 타입 XIX, 및 타입 XX 콜라겐으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 1.000 EU/mg 미만, 0.500 EU/mg 미만, 0.050 EU/mg 미만, 및 0.005 EU/mg 미만의 내독소 수준을 갖는 재조합 젤라틴 조성물이 고려된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 재조합 젤라틴은 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 30, 서열 31, 및 서열 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 이러한 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 숙주 세포가 제공된다. 어떤 측면으로, 본 발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵세포이다. 한 실시양태에서, 진핵 숙주 세포는 효모 세포, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명은 또한 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자전환 동물및 유전자전환 식물을 제공한다.
서열 26, 서열 27, 서열 28 및 서열 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 젤라틴이 또한 제공된다.
한 측면으로, 본 발명은 재조합 젤라틴의 제조 방법을 포함한다. 한 방법은 재조합 콜라겐, 프로콜라겐, 또는 그의 단편 또는 변이체를 제공하는 단계, 및 이러한 재조합 콜라겐, 프로콜라겐, 또는 그의 단편 또는 변이체를 가공하여 제조합 젤라틴을 생성하는 단계를 포함한다. 한 측면으로, 재조합 젤라틴으로 가공된 재조합 콜라겐은 재조합 인간 콜라겐이다. 추가의 측면으로, 콜라겐 또는 프로콜라겐을 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드와, 콜라겐 번역후 효소 (collagen post-translational enzyme) 또는 그의 서브유닛을 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드를 공동 발현시켜 재조합 콜라겐을 제조한다. 어떤 실시양태에서, 번역후 효소는 프롤릴 히드록실라제이다.
본 발명에 따른 다른 방법에서, 재조합 젤라틴은 변형된 콜라겐 구조물로부터 직접 제조된다. 추가의 실시양태에서, 변형된 콜라겐 구조물과, 번역후 효소 또는 그의 서브유닛을 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드를 공동 발현시켜 재조합 젤라틴을 제조한다. 한 실시양태에서, 번역후 효소는 프롤릴 히드록실라제이다.
소정의 용융 온도를 갖는 재조합 젤라틴의 제조 방법이 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 이 방법은 소정의 용융 온도에 상응하는 히드록실화 비율을 재조합 젤라틴에 부여하는 것을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 부여 단계는 프롤릴 히드록실라제의 존재하에 변형 콜라겐 구조물로부터 재조합 젤라틴을 제조하는 것을 포함한다. 다른 측면으로, 상기 부여 단계는 히드록실화된 재조합 콜라겐으로부터 재조합 젤라틴을 유도하는 것 또는 비히드록실화 재조합 젤라틴을 히드록실화하는 것을 포함한다.
본 발명의 재조합 젤라틴의 다양한 용도가 고려된다. 특히, 본 발명은 재조합 젤라틴을 함유하는 캡슐화제, 안정화제, 피막형성제, 보습제, 유화제, 증점제, 겔화제, 콜로이드화제, 접착제, 응집제 및 정화제를 포함한다.
본 발명은 한 실시양태에서 재조합 젤라틴을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 인간 재조합 젤라틴이다. 또다른 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 비-면역원성이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 재조합 젤라틴을 함유하는 경질 겔 캡슐, 연질 겔 캡슐, 정제 코팅, 혈장 증량제, 콜로이드성 혈량 보충제, 이식편 코팅, 의료용 스펀지, 의료용 플러그, 약제 안정화제, 미세 담체를 제공한다. 한 측면으로, 본 발명은 재조합 젤라틴을 포함하는 조성물을 포함하는 킷트, 및 이러한 조성물을 대상에게 전달하는 장치를 포함한다.
재조합 젤라틴을 포함하는 식용 조성물, 및 재조합 젤라틴을 함유하는 단백질 보충제, 지방 대용제, 영양 보충제, 식용 코팅 및 각종 마이크로캡슐화제가 고려된다. 재조합 젤라틴이 부분적으로 또는 완전히 히드록실화된 실시양태로서 재조합 젤라틴을 함유하는 사진용 조성물이 또한 고려된다. 본 발명은 또한 재조합 젤라틴을 포함하는 화장제 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 재조합 젤라틴을 포함하는 화장제 조성물, 재조합 젤라틴을 포함하는 산업용 조성물, 재조합 젤라틴을 포함하는 세포 배양용 조성물, 및 재조합 젤라틴을 포함하는 실험실용 조성물을 포함한다. 본 발명의 재조합 젤라틴을 포함하는 마이크로어레이 또는 이러한 재조합 젤라틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 같은 추가의 실시양태가 고려된다.
본 발명은 재조합 젤라틴, 그를 함유하는 조성물 및 물질, 그의 제조 방법, 및 여러 분야에서 이러한 젤라틴의 용도에 관한 것이다.
도 1은 재조합 젤라틴의 발현을 보여주는 결과를 나타낸다.
도 2A 및 2B는 재조합 젤라틴이 세포 부착을 지지한다는 사실을 입증하는 결과를 나타낸다.
도 3은 단백질분해에 대해 안정한 재조합 젤라틴의 제조를 입증하는 결과를 나타낸다.
도 4는 히드록실화된 재조합 젤라틴의 제조를 입증하는 결과를 나타낸다.
도 5는 시험관내 히드록실화 이후의 재조합 젤라틴의 정제를 보여주는 결과를 나타낸다.
도 6은 프롤릴 4-히드록실라제의 존재 또는 부재하에 발현되는 재조합 젤라틴의 안정성을 보여주는 결과를 나타낸다.
도 7은 발현용 배지의 보충에 의한 재조합 젤라틴의 발현 증가를 입증하는 결과를 나타낸다.
도 8은 시판 젤라틴을 가교 재조합 젤라틴과 비교한 결과를 나타낸다.
도 9는 시판 젤라틴의 분자량 분포를 비교한 결과를 나타낸다.
도 10A, 10B, 10C, 10D, 10E 및 10F는 120 ℃에서 수행된 시판 젤라틴의 가수분해를 보여주는 결과를 나타낸다.
도 11A, 11B, 11C 및 11D는 150 ℃에서 수행된 시판 젤라틴의 가수분해를 보여주는 결과를 나타낸다.
도 12A 및 12B는 재조합 인간 콜라겐 타입 I 및 타입 III의 산 가수분해 및 열 가수분해를 보여주는 결과를 나타낸다.
도 13은 재조합 인간 콜라겐 타입 I의 효소 가수분해를 보여주는 결과를 나타낸다.
도 14는 재조합 인간 콜라겐 타입 I으로 면역화된 기니 피그 (Guinea pig)로부터의 항-혈청을 사용한, 재조합 인간 콜라겐 및 재조합 인간 젤라틴의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 15A 및 15B는 재조합 인간 콜라겐 타입 I으로 면역화된 기니 피그로부터의 항-혈청이 콜라겐 타입 I의 시아노겐 브로마이드 특이적 단편에 대해 반응성임을 보여주는 결과를 나타낸다.
도 16은 재조합 인간 콜라겐 타입 I으로 면역화된 기니 피그로부터의 항-혈청이 재조합 인간 젤라틴에대해 반응성이 없음을 보여주는 ELISA 결과를 나타낸다.
본 발명의 단백질, 뉴클레오티드 서열 및 방법의 개시에 앞서, 본 발명은 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 벡터 및 시약에 한정되지 않는 바와 같이, 변형될 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 실시양태의 설명을 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 생각되어서는 안된다.
본원 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 바와 같이, 단일한 형태의 "어떤 것" 및 "그것"이란 명백하게 달리 설명되지 않는 한 복수의 의미를 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "어떤 숙주 세포"란 당업자에게 공지된 하나 이상의 숙주 세포 및 그의 동등물을 말하며, "어떤 항체"란 당업자에게 공지된 하나 이상의 항체 및 그의 동등물을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련인에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 의미를 가진다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의 방법 및 재료들이 본 발명을 실시 또는 시험하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료들은 하기에 기재되어 있다. 본원에 언급된 모든 간행물은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 간행물에 보고된 세포주, 벡터 및 방법 등을 기재하고 개시할 목적으로 본원에 참고로 포함된다. 본원에 개시된 어떠한 내용도 본 발명의 개시가 선행 발명에 의한 개시를 앞서는 것으로 인정되지 않는다. 본원에 인용된 각 참고문헌은 본원에 그의 전체가 참고로 포함된다.
본 발명을 실시하는데는 달리 지시되지 않는 한 당업계의 기술 범위내의 통상의 화학, 생화학, 분자생물학, 면역학 및 약학적 방법을 이용될 것이다. 이러한 기술은 문헌 (예를 들어, 문헌 (Gennaro, A. R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, BlackwellScientific Publications); Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag) 참조)에 전체적으로 설명되어 있다.
<정의>
"콜라겐"이라는 용어는 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 여부에 관계 없이 콜라겐 타입 I 내지 XX뿐만 아니라 임의의 다른 콜라겐을 비롯하여 공지된 콜라겐 타입의 어떤 것을 의미한다. 이 용어는 또한 프로콜라겐을 포함한다. 콜라겐이라는 용어는 단일 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 어떤 단쇄 폴리펩티드뿐 아니라 콜라겐 쇄의 호모트리머 및 헤테로트리머 어셈블리를 포함한다. "콜라겐"이라는 용어는 구체적으로 그의 변이체 및 단편, 및 그의 기능성 동등물 및 유도체를 포함하며, 이들은 바람직하게는 콜라겐의 하나 이상의 구조 또는 기능적 특징, 예를 들어 (Gly-X-Y)n도메인을 보유한다.
"프로콜라겐"이라는 용어는 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 여부에 관계 없이 콜라겐 타입 I 내지 XX의 어느 하나에 상응하는 프로콜라겐뿐만 아니라 임의의 다른 콜라겐에 상응하는 프로콜라겐을 의미하며, 트리머 어셈블리, 가용성, 정제또는 임의의 다른 기능을 보조하여 그 결과 N-프로테이나제, C-프로테이나제, 또는 다른 효소, 예를 들어 콜라겐 생산과 관련된 단백질분해 효소에 의해 절단되는 추가의 C-말단 및(또는) N-말단 프로펩티드 또는 텔로펩티드를 보유한다. 프로콜라겐이라는 용어는 구체적으로 그의 변이체 및 단편, 및 그의 기능성 동등물 및 유도체를 포함하며, 바람직하게는 콜라겐의 하나 이상의 구조 또는 기능적 특징, 예를 들어 (Gly-X-Y)n도메인을 보유한다.
본원에 사용된 "젤라틴"은 본래 전통적 방법, 또는 재조합 또는 생합성 방법에 의해 추출된 임의 젤라틴, 또는 젤라틴의 하나 이상의 구조 및(또는) 기능적 특징을 갖는 임의 분자를 의미한다. 현재, 젤라틴은 동물 (예를 들어, 소, 돼지, 닭, 말, 어류) 공급원, 예를 들어 뼈 및 조직으로부터 유도된 콜라겐으로부터 추출하여 얻는다. 젤라틴이라는 용어는 젤라틴 산물 중에 포함된 하나 이상의 폴리펩티드의 조성물뿐만 아니라 젤라틴 물질에 기여하는 각 폴리펩티드를 둘 다 포함한다. 따라서, 본 발명에 대하여 사용된 바와 같은 재조합 젤라틴이라는 용어는 본 발명의 젤라틴 폴리펩티드를 포함하는 재조합 젤라틴 물질뿐 아니라 본 발명의 각각의 젤라틴 폴리펩티드를 모두 포함한다.
젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드는 콜라겐, 프로콜라겐, 및 콜라겐의 하나 이상의 구조 및(또는) 기능적 특징을 갖는 다른 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 단일 콜라겐 쇄, 또는 콜라겐 호모트리머 또는 헤테로트리머, 또는 이들의 임의 단편, 유도체, 올리고머, 폴리머 또는 서브유닛을 포함할 수 있으며, 이들은 하나 이상의 콜라겐성 도메인 (Gly-X-Y 영역)을 포함한다. 이 용어는 특히 자연에 존재하지 않는 조작된 서열, 예를 들어 변형된 콜라겐 구조 등을 포함한다. 변형된 콜라겐 구조란 자연 발생적인 콜라겐 유전자로부터 결실, 부가, 치환 또는 다른 변화를 통해 변형되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
"보조제"란 용어는 약물 또는 백신에 첨가되어 그의 효과를 증가, 개선 또는 보조하는 물질이다. 백신 제제에 사용되는 보조제는 비-특이적인 면역 반응 자극제를 생산함으로써 면역 반응을 증가시키는 면역성 물질일 수 있다. 보조제는 종종 비-생 (living) 백신으로 사용된다.
"대립유전자" 또는 "대립유전자 서열"이라는 용어는 유전자 서열의 다른 형태를 의미한다. 대립유전자는 핵산 서열에서 하나 이상의 돌연변이로부터 발생할 수 있으며, 구조 또는 기능이 바뀌거나 바뀌지 않을 수 있는 변형된 mRNA 또는 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 임의 주어진 천연 또는 재조합 유전자는 대립유전자 형태를 전혀 포함하지 않거나 하나 또는 다수의 대립유전자 형태를 포함할 수 있다. 대립유전자를 생성하는 통상의 돌연변이 변화는 일반적으로 자연적인 뉴클레오티드 결실, 부가 또는 치환으로 인한 것이다. 이러한 유형의 변화 각각은 단독으로 또는 주어진 서열에서 하나 이상의 다른 변화와 함께 발생할 수 있다.
"변형된" 폴리뉴클레오티드 서열은 동일하거나 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 생성하는, 다른 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환부를 갖는 것을 포함한다. 이러한 정의에 포함되는 서열은 대상 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 정상적인 염색체 로커스 이외의 다른 로커스를 가지며, 특정 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 또는 대립유전자에 부적절하게 또는 예상치 못하게 혼성화하는 것을 배제시켜 쉽게 검출되거나 검출되지 않을 수 있는 다형성 (polymorphism)을 나타낸다.
"변형된" 폴리펩티드는 사일런트 변화를 나타내어 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 생성하는, 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은 코딩되는 폴리펩티드의 생물학적 또는 면역학적 활성이 유지되는 한 잔기의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성 및(또는) 양친매성 특성에서의 유사성을 기초로 하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함할 수 있고; 양으로 하전된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함할 수 있으며; 유사한 친수성 값을 갖는 비하전된 극성 헤드 기를 갖는 아미노산은 루이신, 이소루이신, 및 발린, 글리신 및 알라닌, 아스파라긴 및 글루타민, 세린 및 쓰레오닌, 및 페닐알라닌 및 티로신을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "아미노산" 또는 "폴리펩티드" 서열 또는 "폴리펩티드"라는 용어는 올리고펩티드, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열, 및 이들의 단편, 및 자연적으로 발생하거나 합성된 분자를 의미한다. 폴리펩티드 또는 아미노산 단편은 폴리펩티드의 하나 이상의 구조 및(또는) 기능적 특징을 보유하는 폴리펩티드의 어떤 부분이다. 본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 폴리펩티드 단편은 하나 이상의 (Gly-X-Y)n영역을 보유하는 것들이다.
예를 들어 "동물 콜라겐"에 대하여 사용되는 "동물"이라는 용어는 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 여부에 상관 없이 동물 공급원으로부터 유도되는 임의 콜라겐을 포함한다. 동물 공급원은 예를 들어 소, 돼지 및 양을 포함하지만 이에 한정되지 않는 포유동물 공급원, 및 닭, 어류, 설치류 및 비척추동물 공급원을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다른 동물 공급원을 포함한다.
"항원성"은 체내에 도입되는 경우 면역 반응 및 항체 생산을 자극하는 물질의 능력에 관한 것이다. 항원 특성을 나타내는 물질은 항원성인 것으로 언급된다. 항원성 물질은 예를 들어 단백질, 지단백질, 폴리사카라이드, 핵산, 박테리아 및 박테리아 성분, 및 바이러스 및 바이러스 성분과 같은 다양한 거대분자를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "상보적" 또는 "상보성"이라는 용어는 염기쌍 형성에 의한 폴리뉴클레오티드의 자연적인 결합을 의미한다. 예를 들어, 서열 "A-G-T"는 상보적인 서열 "T-C-A"에 결합한다. 두개의 단일 가닥 분자 사이의 상보성은 핵산의 일부만이 결합하는 경우에는 "부분적"일 수 있으며, 단일 가닥의 분자들 사이에 전체적인 상보성이 존재하는 경우 완전한 것일 수 있다. 핵산 가닥들 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥들 사이의 혼성화 효과 및 강도에 상당한 영향을 준다. 이 사실은 핵산 가닥 사이의 결합에 의존하는 증폭 반응, 및 예를 들어 펩티드 핵산 (PNA) 분자의 설계 및 사용에 있어서 특히 중요하다.
"결실"이란 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 부재를 나타내는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서의 변화를 의미한다.
폴리뉴클레오티드에 적용되는 "유도체"라는 용어는 특정 폴리펩티드를 코딩하거나 또는 특정 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 화학적 변형을 의미한다. 이러한 변형으로는 예를 들어 알킬, 아실 또는 아미노기에 의한 수소의 치환이 포함된다. 본원에서 폴리펩티드를 언급하는데 사용된 바와 같이, "유도체"라는 용어는 예를 들어 히드록실화, 글리코실화, 페길화 (pegylation) 또는 임의 유사한 방법에 의해 변형된 폴리펩티드를 의미한다. "유도체"라는 용어는 유도체가 유도되는 분자의 하나 이상의 구조 및(또는) 기능적 특징을 포함하는 분자를 포함한다.
분자가 다른 분자의 "화학적 유도체"라고 명명되는 것은 그가 정상적으로는 해당 분자의 일부가 아닌 다른 화학 잔기를 포함하는 경우를 말한다. 이러한 잔기는 분자의 가용성, 흡수성 및 생물학적 반감기 등을 향상시킬 수 있다. 또는, 이러한 잔기는 분자의 독성을 감소시키거나, 분자의 바람직하지 못한 어떤 부작용 등을 제거하거나 또는 약화시킬 수 있다. 이러한 효과를 매개할 수 있는 잔기는 일반적으로 당업계에서 이용되는 것이며, 예를 들어 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra)에 나타나 있다. 이러한 잔기를 분자에 커플링하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 "부형제"라는 용어는 약물, 백신 또는 제약 조성물에 적절한 밀도 또는 형태를 부여하기 위해 약물, 백신 또는 기타 제약 조성물에 희석제 또는 비히클로 사용되는 어떤 불활성 물질이다.
본원에 사용된 바와 같은 "기능적 동등물"이란 용어는 특정 폴리펩티드 또는폴리뉴클레오티드의 기능 및(또는) 구조적 특징을 하나 이상 보유하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 기능적 동등물은 특정 기능을 수행할 수 있는 변형을 포함할 수 있다. "기능적 동등물"이라는 용어는 분자의 단편, 돌연변이체, 하이브리드, 변이체, 유사체 또는 화학적 유도체를 포함하는 것으로 의도된다.
"융합 단백질"이란 다른 단백질 유래의 펩티드 서열이 작동가능하게 연결된 단백질이다.
"혼성화"라는 용어는 핵산 서열이 염기쌍 형성을 통해 상보적 서열에 결합하는 방법을 의미한다. 혼성화 조건은 예를 들어 예비혼성화 및 혼성화 용액 중 염 또는 포름아미드의 농도에 의해 정의될 수 있으며, 당업계에 잘 알려져 있다. 혼성화는 여러 엄격도 조건하에 일어날 수 있다.
특히, 엄격도는 염 농도를 낮추거나, 포름아미드 농도를 높이거나 또는 혼성화 온도를 상승시켜 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 목적을 위해, 엄격 조건하의 혼성화는 약 37 ℃ 내지 42 ℃에서 약 50%의 포름아미드 중에서, 줄어든 엄격 조건하의 혼성화는 약 30 ℃ 내지 35 ℃에서 약 35% 내지 25%의 포름아미드 중에서 일어난다. 특히, 가장 높은 엄격 조건하의 혼성화는 42 ℃에서 50% 포름아미드, 5 X SSPE, 0.3% SDS, 및 200 ㎍/ml의 절단 및 변성된 연어 정액 DNA 중에서 일어난다.
특정 엄격도 수준에 상응하는 온도 범위는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 대상 핵산의 퓨린 대 피리미딘 비율을 계산하고 이에 따라 온도를 조정하여 추가로 좁힐 수 있다. 비특이적 신호를 제거하기 위해, 블롯을 예를 들어 실온에서 0.1 X SSC 및 0.5% SDS까지의 증가된 엄격 조건하에 연속적으로 세척할 수 있다. 상기 범위 및 조건에 대한 변화는 당업계에 잘 알려져 있다.
"면역원성"이란 생물체내에서 면역 반응을 형성시키는 능력에 관한 것이다. 면역원 특성을 나타내는 물질은 면역원성인 것으로 언급된다. 이러한 물질은 예를 들어 단백질, 지단백질, 폴리사카라이드, 핵산, 박테리아 및 박테리아 성분, 및 바이러스 및 바이러스 성분과 같은 각종 거대분자를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 면역원성 물질은 흔히 꽤 높은 분자량 (일반적으로는 10 kDa을 넘음)을 갖는다.
"감염성"이란 박테리아와 같은 미생물 또는 바이러스의 체내로의 침입 및 증식을 의미하는, 감염 능력 또는 감염 유발 능력을 의미한다.
"삽입" 또는 "부가"란 용어는 자연 발생적인 분자에 비해 각각 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 부가를 형성하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변화를 의미한다.
본원에 사용된 "단리된"이라는 용어는 천연 단백질 공급원에 존재하는 단백질 등 뿐만 아니라 다른 성분들로부터 분리된 분자를 의미하며, 바람직하게는 용매 단독, 완충액, 이온, 또는 동일 용액 중에 일반적으로 존재하는 다른 성분의 존재하에 발견되는 분자를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "단리된" 및 "정제된"이라는 용어는 이들의 천연 공급원에 존재하는 분자는 포함하지 않는다.
"마이크로어레이 (microarray)"라는 용어는 기판상의 핵산, 아미노산, 항체 등의 어떤 배열을 의미한다. 기판은 임의 적절한 지지체, 예를 들어 비즈, 유리,종이, 니트로셀룰로스, 나일론, 또는 임의 적절한 막 등일 수 있다. 기판은 막, 필터, 웨이퍼, 칩, 슬라이드, 섬유, 비즈 (자성 또는 비자성 비즈 포함), 겔, 관, 플레이트, 폴리머, 미세입자, 모세관 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 어떤 강직형 또는 반강직형 지지체일 수 있다. 기판은 표면에 코딩을 제공하고(하거나) 핵산 아미노산 등이 결합될 수 있는 다양한 표면 형태, 예를 들어 웰, 핀, 홈, 채널 및 공극을 가질 수 있다.
"미생물"이라는 용어는 바이러스, 박테리아, 클라미디아 (Chlamydia), 리케챠 (rickettsia), 마이코플라스마 (mycoplasmas), 우레아플라스마 (ureaplasma), 진균, 및 원생동물 등의 감염성 기생충을 비롯한 기생충을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 서열 또는 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 천연 또는 합성 기원의 펩티드 핵산 (PNA), 또는 어떤 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질에 대한 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 임의 단편, 및 천연 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 의미한다. 폴리뉴클레오티드 단편은 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 구조 또는 기능적 특징을 보유하는 폴리뉴클레오티드 서열의 어떤 부분이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 단편은 하나 이상의 (Gly-X-Y)n영역을 코딩하는 것들이다. 폴리뉴클레오티드 단편은 변하는 길이, 예를 들어 뉴클레오티드 60개 초과, 뉴클레오티드 100개 이상, 뉴클레오티드 1,000개 이상, 또는 뉴클레오티드 10,000개 이상의 길이일 수 있다.
"유사성 비율" (유사성 %)이라는 용어는 둘 이상의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 비교시 발견되는 서열 유사성 비율을 의미한다. 유사성 비율은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 사이의 유사성 비율은 문헌의 방법 (예를 들어, 문헌 (Higgins, D. G. and P. M. Sharp (1988) Gene 73 : 237-244) 참조)을 이용하여 계산할 수 있다. 알고리즘은 모든 서열 쌍 사이의 거리를 조사하여 서열을 클러스터로 그룹핑한다. 클러스터는 쌍으로 배열되고, 이어서 그룹으로 배열된다. 아미노산 서열, 예를 들어 서열 A와 서열 B 사이의 유사성 비율은 [ (서열 A의 길이 - 서열 A의 갭 잔기수 - 서열 B의 갭 잔기수) / 서열 A와 서열 B 사이에서 매치되는 잔기의 합 ] x 100으로 계산한다. 두 아미노산 서열 사이에 갭이 적거나 상동성이 전혀 없는 것은 유사성 비율을 결정하는데 포함시키지 않는다. 유사성 비율은 당업계에 공지된 다른 방법, 예를 들어 혼성화 조건을 변화시켜 계산할 수 있으며, MEGALIGN 프로그램 (DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin)과 같은 프로그램을 사용하여 전자적인 방법으로 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "식물"이라는 용어는 하나 이상의 식물, 즉 대두, 면화, 알팔파, 아마, 토마토, 당, 사탕무, 해바라기, 감자, 담배, 옥수수, 밀, 쌀, 상추, 바나나, 카사바, 홍화, 평지씨유, 겨자, 캐놀라, 대마, 조류, 켈프 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 속씨식물, 겉씨식물, 단자엽 및 쌍자엽식물과 같은진핵 독립영양 생물을 포함한다. "식물"이라는 용어는 또한 하나 이상의 식물 세포를 포함한다. "식물 세포"라는 용어는 씨, 현탁 배양물, 배, 분열조직 부위, 캘러스 조직, 잎, 뿌리, 슈트, 배우체, 포자체, 화분, 괴경, 구경, 인경, 꽃, 과실, 구과, 소포자 등과 같은 식물 조직 및 기관을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
"번역후 효소"라는 용어는 예를 들어 임의 콜라겐 또는 프로콜라겐의 번역후 변형을 촉매하는 어떤 효소를 의미한다. 이 용어는 예를 들어 프롤릴 히드록실라제, 펩티딜 프롤릴 이소머라제, 콜라겐 갈락토실 히드록실리실 글루코실 트랜스퍼라제, 히드록실리실 갈락토실 트랜스퍼라제, C-프로테이나제, N-프로테이나제, 리실 히드록실라제, 및 리실 옥시다제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로모터"라는 용어는 일반적으로 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 개시, 지시 및 조절할 수 있는 핵산 서열의 조절 영역을 의미한다. 프로모터는 전사 속도에 영향을 줄 수 있는 인식 서열, 예를 들어 상류 또는 하류 프로모터 요소를 추가로 포함할 수 있다.
"비-구성적 프로모터"라는 용어는 특정 조직을 통해 전사를 유도하거나 또는 다르게는 환경 또는 발생 조절하에 있을 수 있는 프로모터를 의미하며, 억제성 및 유도성 프로모터, 예를 들어 조직에 바람직한 프로모터, 조직 특이적인 프로모터 및 세포 유형 특이적인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 저산소성 또는 냉각성 스트레스에 의해 유도되는 AdH1 프로모터, 열 스트레스에 의해 유도되는 Hsp70 프로모터 및 빛에 의해 유도되는 PPDK 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
"조직에 바람직한" 프로모터란 특정 조직에서 주로 전사를 개시하는 프로모터이다. "조직 특이적인" 프로모터는 특정 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터이다. "세포 유형 특이적" 프로모터란 적어도 하나의 기관내의 특정 세포 유형, 예를 들어 도관 세포에서 발현을 주로 유도하는 프로모터를 말한다.
"유도성" 또는 "억제성" 프로모터란 환경 조절하의 프로모터를 말하는데, 전사는 예를 들어 혐기성 조건, 빛의 존재, 생물의 스트레스 등에 의해 또는 내부의 화학 또는 생물 신호, 예를 들어 글리세르알데히드 포스페이트 데히드로게나제, AOX1 및 AOX2 메탄올-유도 프로모터 또는 물리적 손상에 대해 반응하여 수행된다.
본원에 사용된 바와 같이, "구성적 프로모터"란 용어는 전사를 개시, 지시 또는 조절하고 발생 또는 세포 분화에 대한 대부분의 환경 조건 및 상태하에 활성이 있는 프로모터를 의미한다. 구성적 프로모터의 예로는 아그로박테리움 투마파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 T DNA로부터 유도된 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMv) 35S, 1'- 또는 2'-프로모터, 유비퀴틴 1 프로모터, Smas 프로모터, 신나밀 알콜 데히드로게나제 프로모터, 글리세르알데히드 데히드로게나제 프로모터 및 Nos 프로모터 등이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "정제된"이라는 용어는 지시된 분자가 다른 생물학적 거대분자, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 및 단백질 등의 실질적인 부재하에 존재하는 것을 의미한다. 이 용어는 바람직하게는 대상 분자가 용액 또는 조성물 중에 80 중량% 이상, 바람직하게는 85 중량% 이상, 보다 바람직하게는 95 중량% 이상, 가장 바람직하게는 99.8 중량% 이상 존재하는 것을 포함한다. 물, 완충액, 및 다른 소분자, 특히 약 1 kDa 미만의 분자량을 갖는 분자가 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 "실질적으로 정제된"이라는 용어는 이들의 자연 환경으로부터 제거, 단리 또는 분리되고, 이들과 자연적으로 결합하는 다른 성분이 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 존재하지 않는 핵산 또는 아미노산 서열을 의미한다.
"치환"이란 각각 다른 아미노산 또는 뉴클레오티드에 의한 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 대체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "트랜스펙션"이라는 용어는 발현 벡터를 세포에 도입하는 과정을 의미한다. 예를 들어 미세주입, 리포펙션, 또는 유전자 건 (gun)의 사용과 같은 각종 트랜스펙션 기술이 당업계에 공지되어 있다.
본원에 정의된 바와 같은 "형질전환"이란 외생 핵산 서열, 예를 들어 DNA가 수용 세포로 진입하여 그를 변화시키는 방법을 기술한다. 형질전환은 당업계에 잘 알려진 다양한 방법을 이용하여 자연 또는 인공 조건하에 수행할 수 있다. 형질전환은 외래 핵산 서열을 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 삽입시키는 임의 공지된 방법에 의존할 수 있다. 이 방법은 형질전환될 숙주 세포의 유형을 기준으로 선택되며, 바이러스 감염, 일렉트로포레이션, 열 충격, 리포펙션 및 입자 충격을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 "형질전환된" 세포는 삽입된 DNA가 자가 복제성 플라스미드 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제될 수 있는 안정하게 형질전환된 세포를 포함하며, 또한 정해진 시간 동안 삽입된 핵산을 일시적으로 발현시키는 세포를 포함하기도 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "백신"이라는 용어는 사멸 또는 변형된 미생물, 살아있는 약화된 생물, 또는 살아 있는 맹독성 생물의 제제, 또는 천연, 합성 또는 반합성의 펩티드, 단백질, 생물학적 거대분자 또는 핵산을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 임의의 다른 물질을 의미하며, 유사한 존재에 의한 향후의 감염을 막기 위해 이들을 투여하여 특정 질환에 대한 면역성을 형성하거나 또는 인공적으로 증진시키게 된다. 백신은 살아있거나 또는 비활성인 미생물, 또는 바이러스 및 박테리아뿐만 아니라 서브유닛, 합성, 반합성 또는 재조합 DNA류를 비롯한 다른 물질을 포함할 수 있다.
백신은 미생물 또는 물질 (예를 들어, 폴리오바이러스 백신) 또는 하나의 미생물 또는 물질의 항원으로 구성되는 1가 (단일 종/미생물/질병 백신)일 수 있다. 백신은 또한 다가 (multivalent), 예를 들어 2가, 3가 등 (조합 백신)일 수 있으며, 하나 이상의 미생물 또는 물질 (예를 들어, 홍역-이하선염-풍진 (MMR) 백신), 또는 하나 이상의 미생물 또는 물질의 항원으로 구성된다.
생 (live) 백신은 살아있는 미생물로부터 제조된다. 약화된 백신은 물리적 변형 (예를 들어, 조사 또는 온도 조절), 또는 실험 동물 숙주 또는 감염된 조직/세포 배양물에서 일련의 계대배양, 예를 들어 무독성 균주 또는 독성이 감소된 균주를 생성하지만 보호 면역성을 유도할 수 있는 능력은 유지하는 처리를 수행한 미생물로부터 제조된다. 약화된 생 백신의 예는 홍역, 이하선염, 풍진 및 개의 병을 포함한다. 실활화된 백신이란 감염성 미생물 성분이 예를 들어 바이러스 코트 또는 박테리아 외부막 단백질의 항원성 또는 면역원성에 영향을 주지 않으면서 화학또는 물리적 처리 (예를 들어, 포르말린, 베타-프로피올락톤 또는 감마선 조사)에 의해 파괴된 백신을 말한다. 실활화된 백신 또는 서브유닛 백신의 예로는 인플루엔자, A형 간염 및 급성 회백수염 (IPV) 백신이 포함된다.
서브유닛 백신은 예를 들어 바이러스, 박테리아 또는 면역 반응을 유도하는 다른 물질로부터의 주요 거대분자로 구성된다. 이들 성분은 많은 방법으로, 예를 들어 미생물로부터의 정제, 재조합 DNA 기술을 이용한 발생 등에 의해 얻을 수 있다. 서브유닛 백신은 임의 감염성 물질의 합성 모방체를 포함할 수 있다. 서브유닛 백신은 박테리아 단백질 독소 (예를 들어, 파상풍균, 디프테리아), 바이러스 단백질 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스 유래의 단백질), 싸여진 박테리아 유래의 폴리사카라이드 (예를 들어, 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumonia) 유래의 폴리사카라이드), 및 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 바이러스-유사 입자 (예를 들어, B형 간염 표면 항원) 등과 같은 거대분자를 포함할 수 있다.
합성 백신은 병원체의 표면 항원을 모방하는 면역원성인 작은 합성 펩티드로 구성된 백신이거나, 또는 핵산이 변형된 바이러스의 전체를 포함하는, 재조합 DNA 기술의 도움으로 제조된 백신일 수 있다.
반합성 백신 또는 컨쥬게이트 (conjugate) 백신은 단백질 운반 분자에 부착된 미생물로부터의 폴라사카라이드 항원으로 구성된다.
DNA 백신은 항원을 코딩하는 재조합 DNA 벡터를 포함하며, 해당 DNA를 보유하는 숙주 세포에서 그에 의해 코딩되는 항원이 발현되는 경우, 코딩된 항원에 대해 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도한다.
다양한 감염성 물질에 대한 백신이 개발되어 왔다. 본 발명은 포함되는 물질에 관계 없이 백신 조성물 중에 사용될 수 있으며, 따라서 본원에 예로서 구체적으로 기재된 백신 중에 사용되는 것에 한정되지 않는 재조합 젤라틴에 관한 것이다. 백신은 백시니아 바이러스 (천연두), 폴리오바이러스 (Salk 및 Sabin), 이하선염, 홍역, 풍진, 디프테리아, 파상풍, 수두대상포진 (Varicella Zoster; 수두/대상포진), 백일해 (심한 기침병), 바실레 칼메테-구에린 (Bacille Calmette-Guerin; BCG, 투베르쿨로시스), 해모필루스 인플루엔자 수막염, 공수병, 콜레라, 일본 뇌염 바이러스, 살모넬라 티피 (salmonella typhi), 시겔라 (shigella), A형 간염, B형 간염, 아데노바이러스, 황열병 (yellow fever), 아구창 (foot-and-mouth) 병, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 로타바이러스, 뎅그열, 웨스트 니일 (West Nile) 바이러스, 터키 헤르페스 바이러스 (마렉 (Marek's) 병), 인플루엔자 및 탄저병에 대한 백신을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 백신이라는 용어는 각종 감염성, 자가면역성 질환 및 암에 대하여 개발되었거나 향후 개발될 백신, 예를 들어 HIV, HCV 및 말라리아에 대한 백신 및 유방암, 폐암, 결장암, 신장암, 방광암 및 난소암에 대한 백신을 포함한다.
폴리펩티드 또는 아미노산 "변이체"란 특정 아미노산 서열로부터 하나 이상의 아미노산이 변형된 아미노산 서열을 말한다. 폴리펩티드 변이체는 치환되는 아미노산이 대체 아미노산에 대하여 유사한 구조 또는 화학적 특성을 갖는 보존적 변화를 가질 수 있다 (예를 들어, 루이신을 이소루이신으로 대체함). 변이체는 비보존적 변화를 가질 수도 있는데, 이 때 치환되는 아미노산은 대체 아미노산과는 다른 물리적 특성을 갖는다 (예를 들어, 글리신을 트립토판으로 대체함). 유사한 작은 변화는 아미노산의 결실 또는 삽입, 또는 둘 다를 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 아미노산 변이체는 특정 폴리펩티드의 구조 또는 기능적 특징을 보유한다. 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 결정하는데 있어서의 지침을 찾을 수 있는데, 예를 들어 당업계에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 LASERGENE 소프트웨어 (DNASTAR Inc., Madison, WI)를 사용한다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 특정 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 유사성을 갖는 특정 폴리뉴클레오티드 서열의 변이체이다. 당업자라면 유전자 코드의 다의성으로 인해 특정 단백질을 코딩하는 많은 다양한 폴리뉴클레오티드 서열 (일부는 임의 공지 및 자연 발생적인 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 최소한의 상동성을 보유함)이 생산될 수 있음을 알 것이다. 따라서, 본 발명은 가능한 코돈 선택을 기초로 한 조합을 선택함으로써 만들어질 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 각각의 모든 가능한 변화를 포함한다. 이러한 조합은 표준 코돈 트리플렛 유전자 코드에 따라 형성되며, 이러한 모든 변화는 구체적으로 개시된 것으로 생각된다.
<본 발명>
본 발명은 재조합 젤라틴 및 이러한 젤라틴의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 젤라틴은 일관되고 개선된 기능을 제공하며, 다양한 건강 및 다른 관심사에 대하여 다루어질 수 있다. 장시간의 엄격한 과정을 통해 동물 공급원으로부터 추출하기 보다는 본 발명의 방법을 이용하여 젤라틴을 직접 제조할 수 있다. 본 발명의 재조합 젤라틴은 병원체, 예를 들어 병원성 박테리아, 전염성 해면상뇌병증 (TSE) 등이 없다. 본 발명의 방법은 변화성을 최소로 한 것이며, 현재의 추출 방법에서는 달성할 수 없는 정도의 재현가능성을 허용한다.
동물로부터 유래하는 생성물의 사용에 대하여, 잠재적인 면역원성, 예를 들어 항원성 및 알러지유발성 반응에 대한 염려와 같은 안전상의 문제점이 제기되어 왔다. 현재 사용되는 동물 공급원으로부터의 젤라틴 혼합물을 완전하게 특성화, 정제 또는 재생할 수 없다는 것은 제약 및 의료 분야에 있어서 계속되고 있는 관심사이다. 다른 안전상의 문제점은 추출 및 정제 과정으로부터 발생하는 박테리아 오염 및 내독소 존재에 대한 것이다.
본 발명의 재조합 젤라틴은 이들이 박테리아 오염 또는 내독소를 실제적으로 포함하고 있지 않기 때문에 상기와 같은 관심사에 대해 다루어진다. 또한, 천연 인간 서열로부터 유도된 젤라틴의 사용에 의해 비-인간, 동물 유래의 단백질의 사용으로 인한 면역 반응의 위험을 제거할 수 있기 때문에, 본 발명의 젤라틴은 현재 사용되는 동물 유래의 젤라틴에 비해 두드러진 이점을 제공한다.
또한, 본 발명의 젤라틴은 특정 용도를 위해 최적화된 특성을 갖는 다양한 독특한 물질로서 제조될 수 있다. 생성된 산물은 동물 공급원으로부터 유도되는 현재 이용되는 젤라틴보다 내부적으로 보다 견고하며 균일하다.
한 실시양태에서, 본 발명은 재조합 젤라틴을 제공한다. 젤라틴은 인간,소, 돼지, 말, 설치류, 닭, 양 및 어류 종을 포함하지만 이에 한정되지 않는 여러 종, 또는 비-척추동물 종으로부터의 서열을 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 젤라틴은 통상의 제조 방법에 의한 젤라틴 생성물에 비해 순도가 높으며, 로딩 단백질, 및 내독소 및 다른 오염원 (핵산, 폴리사카라이드, 프라이온 등)의 수준이 낮다. 따라서, 본 발명의 젤라틴은 현재의 방법에 의해 제조된 젤라틴보다 사용하기에 더 안전하며, 이롭지 못한 부작용의 위험을 최소로 하면서 보다 높은 투여량으로 인간 및 동물에게 투여 또는 이들에 의해 섭취될 수 있다.
본 발명의 젤라틴은 특정 용도를 위해 최적화된 특징을 갖도록 직접 제조되어 젤라틴을 사용하고 제제화하는 능력을 개선시킬 수 있기 때문에, 본 발명의 젤라틴은 시판 젤라틴에 비해 증가된 활성 및 수행성을 갖는다. 동물 공급원으로부터 추출된 현재의 젤라틴은 소정의 배치 또는 시료에서 넓은 범위의 분자량을 갖는 비균질 생성물이지만, 본 발명의 젤라틴은 일관되고 균질하며 재생가능한 생성물을 포함한다.
본 발명의 재조합 젤라틴은 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 한 방법에서, 재조합 젤라틴은 재조합 콜라겐의 처리를 통해 생산된다 (예를 들어, 실시예 7, 10 및 11 참조). 다른 방법에서, 재조합 젤라틴은 변형된 콜라겐 구조물, 즉 하나 이상의 콜라겐 도메인을 코딩하지만 자연 발생적인 콜라겐은 코딩하지 않는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 구조물의 발현으로부터 직접 제조된다 (예를 들어, 실시예 1, 4 및 6 참조). 다른 측면으로, 재조합 젤라틴은 전장의 자연 발생적인 콜라겐 또는 프로콜라겐이 아니라 하나 이상의 콜라겐 도메인을 포함하는 폴리펩티드로부터유도된다 (예를 들어, 서열 15 내지 서열 25, 서열 30, 서열 31 및 서열 33 참조). 재조합 젤라틴은 추가의 N-말단 또는 C-말단 프로펩티드를 포함하는 서열을 포함할 수도 있다 (예를 들어, 서열 26 내지 서열 29 참조).
한 측면으로, 본 발명의 재조합 젤라틴은 재조합 콜라겐 또는 프로콜라겐으로부터 유도된다. 콜라겐 분자는 일반적으로 정상 생물학적 조건하에 삼중 나선 도메인을 형성하는 (Gly-X-Y-)n반복부를 함유하는 폴리펩티드 쇄의 트리머 어셈블리로부터 형성된다 (예를 들어, 문헌 (van der Rest et al., (1991), FASEB J. 5: 2814-2823) 참조). 현재, 소, 양, 돼지, 닭 및 인간 콜라겐을 비롯하여 약 20가지 다른 콜라겐 타입이 척추동물에서 확인되었다. 다양한 유형의 자연 발생적인 콜라겐의 구조 및 생물학적 기능에 대한 상세한 설명은 문헌 (Ayad et al., The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press, San Diego, CA; Burgeson, R. E., and Nimmi (1992) "Collagen types: Molecular Structure and Tissue Distribution,"Clin. Orthop. 282: 250-272; Kielty, C. M. et al. (1993)"The Collagen Family: Structure, Assembly And Organization In The Extracellular Matrix,"in Connective Tissue And Its Heritable Disorders, Molecular Genetics, And Medical Aspects, Royce, P. M. and Steinmann, B., Eds., Wiley-Liss, NY, pp. 103-147; and Prockop and Kivirikko (1995) "Collagens: Molecular biology, diseases, and potentials for therapy", Annu Rev Biochem 64: 403-434)에서 찾을 수 있다.
타입 I 콜라겐은 생물의 전체 콜라겐의 약 80 내지 90%를 포함하는 뼈 및 피부의 주요 섬유성 콜라겐이다. 타입 I 콜라겐은 다세포 생물의 세포외 매트릭스에 존재하는 주요 구조 거대분자이며, 총 단백질 질량의 약 20%를 포함한다. 타입 I 콜라겐은 각각 COL1A1 및 COL1A2 유전자에 의해 코딩되는 두개의 α1 (I) 쇄 및 하나의 α2 (I) 쇄를 포함하는 헤테로트리머 분자이다. 다른 콜라겐 타입은 타입 I 콜라겐이 덜 풍부하며, 다른 분포 패턴을 나타낸다. 예를 들어, 타입 II 콜라겐은 연골 및 유리질 체액내의 주요 콜라겐이지만, 타입 III 콜라겐은 혈관내에 높은 수준으로 존재하며 피부에는 이보다 적은 정도로 존재한다.
타입 III 콜라겐은 피부 및 도관 조직에 존재하는 주요 섬유상 콜라겐이다. 타입 III 콜라겐은 COL3A1 유전자에 의해 코딩되는 세개의 동일한 α1 (III) 쇄를 포함하는 호모트리머 콜라겐이다. 조직으로부터 다양한 콜라겐을 정제하는 방법은 예를 들어 문헌 (Byers et al. (1974) Biochemistry 13: 5243-5248; and Miller and Rhodes (1982) Methods in Enzymology 82: 33-64)에서 찾을 수 있다.
번역후 효소는 프로콜라겐 및 콜라겐의 생합성에 있어 중요하다. 예를 들어, 프롤릴 4-히드록실라제는 세포에 의한 프로콜라겐 또는 콜라겐의 합성에 필요한 번역후 효소이다. 이 효소는 반복하는 Gly-X-Y 서열의 Y 위치의 프롤릴 잔기를 4-히드록시프롤린으로 히드록실화한다 (예를 들어, 문헌 (Prockop et al., (1984) N. Engl. J. Med. 311: 376-386) 참조). 적절한 수의 Y-위치의 프롤릴 잔기가 프롤릴 4-히드록실라제에 의해 4-히드록시프롤린으로 히드록실화되지 않으면, 새로 합성된 쇄는 안정한 삼중 나선 형태를 유지할 수 없다. 또한, 히드록실화가 전혀일어나지 않거나 적게 일어난다면, 폴리펩티드는 적절하게 분비되지 않거나 변질될 수 있다.
척추동물 프롤릴 4-히드록실라제는 α2β2테트라머이다 (예를 들어, 문헌(Berg and Prockop (1973) J. Biol. Chem. 248: 1175-1192; and Tuderman et al. (1975) Eur. J. Biochem. 52: 9-16) 참조). α서브유닛은 프롤릴 잔기의 히드록실화에 관여하는 촉매 부위를 포함하지만, β서브유닛의 부재시에는 불용성이다. β서브유닛, 단백질 디술피드 이소머라제는 티올/디술피드 교환을 촉매하여 안정한 단백질을 확립하는데 필수적인 디술피드 결합의 형성을 초래한다. β서브유닛은 프롤릴 4-히드록실라제 테트라머의 부분인 경우 단백질 디술피드 이소머라제 활성의 50%를 보유한다 (예를 들어, 문헌 (Pihlajaniemi et al. (1987) Embo J. 6: 643-649; Parkkonen et al. (1988) Biochem. J. 256: 1005-1011; and Koivu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 6447-6449)을 참조).
활성 재조합 인간 프롤릴 4-히드록실라제는 예를 들어 Sf9 곤충 세포 및 효모 세포에서 α및 β서브유닛을 동시에 발현시켜 제조한다 (예를 들어, 문헌 (Vuori et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7467-7470; U. S. Patent No. 5,593,859) 참조). 프롤릴 4-히드록실라제 이외에, C-프로테이나제, N-프로테이나제, 라이실 옥시다제, 라이실 히드록실라제 등을 포함한 다른 콜라겐 번역후 효소가 확인되었으며, 문헌 (예를 들어, 문헌 (Olsen et al. (1991) Cell Biology of Extracellular Matrix, 2nd ed., Hay editor, Plenum Press, New York) 참조)에보고되었다.
본 발명은 특히 목적하는 바에 따라 히드록실화, 예를 들어 프롤린 히드록실화 및(또는) 라이실 히드록실화 등을 본 발명의 재조합 젤라틴에 제공하는 생물 또는 화학적 임의 화합물의 사용을 포함한다. 이들로는, 예를 들어, 천연, 합성 또는 반합성 여부에 상관 없이 프롤릴 4-히드록실라제 및 목적하는 활성을 갖는 프롤릴 4-히드록실라제의 임의 변이체 또는 단편 또는 서브유닛의 다양한 이소폼을 비롯하여 내부 또는 외부에서 제공되는 임의 종으로부터의 프롤릴 4-히드록실라제, 및 프롤릴 3-히드록실라제 등과 같은 다른 히드록실라제가 포함된다 (예를 들어, 문헌 (본원에 내용이 참고로 포함되는 미국 특허 제5,928,922호)을 참조). 한 실시양태에서, 프롤릴 히드록실라제 활성은 재조합 젤라틴 또는 재조합 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 동일한 종으로부터 유도되는 프롤릴 히드록실라제에 의해 제공된다. 추가의 실시양태에서, 프롤릴 4-히드록실라제는 인간의 것이고, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인간 서열로부터 유도된다.
본 발명은 목적하는 물리적 특징을 갖는 물질을 제조하기 위해 젤라틴의 열가소성을 조작하는 방법을 제공한다. 한 방법에서, 코딩 폴리뉴클레오티드는 내생 프롤릴 히드록실라제 또는 다른 히드록실라제를 갖는 숙주계, 예를 들어 어떤 포유동물 또는 곤충 세포, 또는 유전자전환 동물, 또는 식물 또는 식물 세포에서 발현된다. 이러한 계에서, 본 발명은 어떤 히드록실화 비율 범위, 즉 비히드록실화, 부분 히드록실화 및 완전 히드록실화된 부분을 갖는 재조합 젤라틴의 혼합물을 제조하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 변화하는 히드록실화 비율을 갖는 재조합 젤라틴을 제조하는 한 방법에서, 히드록실화는 예를 들어 유전자전환 동물에서 내생 프롤릴 히드록실라제에 의해 부여되며, 히드록실화 비율의 분포는 비히드록실화로부터 완전 히드록실화에 이르기 까지의 범위에 걸쳐 있으며, 제조된 물질의 용융 온도는 28 ℃ 내지 36 ℃의 범위인데, 중간값 Tm은 약 30 ℃ 내지 32 ℃의 범위이다. 원하는 경우, 다운스트림 사용이 예를 들어 체온 (37 ℃)에서 삼중 나선 구조를 보유하도록 충분히 히드록실화된 것과 같은 보다 완전히 히드록실화된 물질을 선택하는 것을 필요로 한다면, 온도 구배를 따라 다른 비율의 물질을 분리할 수 있다.
다른 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 예를 들어 히드록실화가 외생 프롤릴 히드록실라제에 의해 보충되는 유전자전환 동물과 같은 시스템에서 제조된다. 한 측면으로, 재조합 젤라틴의 제조 방법은 비히드록실화에서부터 완전히 히드록실화된 범위의 재조합 젤라틴을 제공한다. 보다 완전히 히드록실화된 재조합 젤라틴의 비율은 단지 내생 프롤릴 히드록실라제의 존재하에서만 생산된 재조합 물질에서보다 외생 프롤릴 히드록실라제의 존재하에 생산된 재조합 물질에서 실질적으로 더 클 것이다. 따라서, 제조된 물질의 용융 온도는 예를 들어 28 ℃ 내지 40 ℃의 범위이며, 약 34 ℃ 내지 36 ℃의 중간값 Tm을 가질 수 있다. 이러한 젤라틴 혼합물은 다르게 히드록실화된 부분의 어떤 분획화 또는 분리 없이도 겔 캡슐 제조와 같은 다양한 용도에 사용하기에 적합할 수 있을 것이다.
상기 방법은 예를 들어 특정 온도에서 액체인 것들로부터 특정 온도, 예를 들어 36 ℃에서 고체인 물질들을 분리하기 위해 온도 구배를 사용하여 쉽게 나눌 수 있는, 일정 범위의 용융 온도를 갖는 재조합 물질의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 분리 과정 없이 대량 사용의 용도에 적합한 비용 효율적인 물질 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 겔 캡슐의 제조는 상기 방법에 의해 제조된 재조합 젤라틴의 사용을 포함할 수 있으며, 여기서 일정 범위의 용융 온도를 갖는 재조합 물질은 약 33 ℃의 바람직한 용융 온도를 가지며, 이러한 젤라틴은 체온에서 녹기 때문에, 따라서 삼켜서 소화시키기에 적합하다. 본 발명의 방법에서, 재조합 젤라틴은 바람직한 시스템, 예를 들어 유전자전환 동물에서 직접 제조되거나 또는 목적하는 시스템에서 제조되는 재조합 콜라겐으로부터 예를 들어 산, 열 또는 효소 등에 의한 가수분해를 통해 유도될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 재조합 콜라겐을 제조하고, 재조합 콜라겐으로부터 재조합 젤라틴을 유도하는 것을 포함하는, 재조합 젤라틴의 제조 방법을 제공한다. 한 측면으로, 이 방법은 콜라겐 또는 프로콜라겐을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체, 및 콜라겐 번역후 효소 또는 그의 서브유닛을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현을 포함한다 (예를 들어, 본원에 내용 전체가 참고로 포함되는 미국 특허 제5,593,859호 참조). 본 발명의 재조합 젤라틴은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 재조합 콜라겐으로부터 유도될 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Veis (1965) Int Rev Connect Tissue Res, 3: 113-200) 참조). 예를 들어, 콜라겐에서 젤라틴을 추출하는 모든 방법의 공통적인특징은 콜라겐 단백질의 2차 구조의 상실, 및 많은 경우에 있어서 콜라겐 구조의 변형이다. 본 발명의 젤라틴 제조에 사용된 콜라겐은 목적하는 젤라틴 유형에 따라 다른 방법을 이용하여 처리될 수 있다.
본 발명의 젤라틴은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해, 재조합적으로 생산된 콜라겐, 또는 프로콜라겐 또는 다른 콜라겐성 폴리펩티드로부터 또는 예를 들어 척추동물 세포 배양물과 같은 세포 배양물로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 젤라틴은 승온에서 젤라틴의 가용성, 및 낮거나 높은 pH, 낮거나 높은 염 농도, 및 고온 조건하의 그의 안정성을 이용하여 세포 집단 또는 배양 배지로부터 직접 유도될 수 있다. 콜라겐으로부터 젤라틴 조성물을 제조하는 방법, 과정 및 기술은 승온에서 단백질분해 효소로 절단하고, 디터전트, 열 또는 당업계에 잘 알려진 변성제 등을 사용하여 콜라겐의 삼중 나선 구조를 변성시키는 것을 포함한다. 또한, 석회 또는 산으로의 처리, 수용액 중 열 추출, 이온 교환 크로마토그래피, 크로스-플로우 (cross-flow) 여과 및 다양한 건조 방법을 비롯하여 동물 또는 도살장으로부터 얻은 젤라틴의 추출에 관여하는 다양한 단계들을 이용하여 재조합 콜라겐으로부터 본 발명의 젤라틴을 유도할 수 있다.
한 측면으로, 본 발명의 젤라틴은 변성된 삼중 나선으로 구성되며, 하나 이상의 콜라겐 서브유닛, 콜라겐 쇄 또는 이들의 단편을 포함한다. 특정 콜라겐 쇄, 서브유닛 또는 이들의 단편내의 Gly-X-Y 서브유닛은 동일하거나 다를 수 있다. 바람직하게는, X 및 Y는 프롤린 또는 히드록시프롤린이며, 글리신은 성분 쇄의 약 세번째 잔기 위치마다 있는 것으로 보인다. X 및 Y의 아미노산은 프롤린 또는 히드록시프롤린이며, 각 Gly-X-Y 유닛은 동일 또는 상이하다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 젤라틴은 X 및 Y가 임의 아미노산인 아미노산 서열 (Gly-X-Y)n을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 임의의 다른 유형의 콜라겐이 실질적으로 없는 한가지 유형의 재조합 콜라겐으로부터 유도된다. 한 측면으로, 재조합 콜라겐은 타입 I 콜라겐이다. 다른 측면으로, 재조합 콜라겐은 타입 III 콜라겐이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 재조합 콜라겐은 인간 재조합 콜라겐이다. 특히, 재조합 콜라겐이 어떤 한가지 콜라겐 타입인, 예를 들어 천연, 합성 또는 반합성의 콜라겐 타입 I 내지 XX의 어느 하나, 또는 임의의 다른 콜라겐인 본 발명의 추가의 실시양태가 고려된다. 특히, 재조합 젤라틴이 천연, 합성 또는 반합성의 콜라겐 타입 I 내지 XX의 어느 하나 이상, 또는 임의의 다른 콜라겐의 특정 혼합물로부터 유도된 실시양태가 고려된다.
재조합 젤라틴을 제조하는 본 발명의 방법은 전통적인 젤라틴 추출 방법에 비해 많은 이점을 갖는다. 가장 중요하게, 본 발명의 방법은 천연 콜라겐 서열을 포함하는 믿을만한 비-조직성 젤라틴 공급원을 제공한다. 또한, 현재의 추출 방법은 다양한 의료 분야에 사용하기에 이로울 수 있는 인간 젤라틴에 대한 어떤 천연 공급원도 허용하지 않는다. 본 발명의 방법은 인간 서열로부터 유도된 재조합 젤라틴, 재조합 인간 젤라틴을 포함하는 조성물, 및 이러한 젤라틴의 제조 방법을 제공한다. 이 재조합 인간 젤라틴은 제약 및 의학적 방법에 적용된 바로는 비-면역원성이며, 또한 그의 다양한 용도가 고려된다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 젤라틴을 다양한 형태로 발현시킬 수 있는 조작된 구조물로부터 본 발명의 젤라틴을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 특히 재조합 프롤릴 히드록실라제, 및 비-천연 콜라겐 구조물을 포함한 다양한 합성 구조물을 사용하여 젤라틴을 제조하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명의 방법은 특정 용도에 필요한 구체적인 특징을 보유하도록 설계될 수 있는 재조합 젤라틴을 제공한다. 이러한 젤라틴의 제조 방법이 또한 고려된다. 당업자라면 현재의 방법을 이용하여 목적하는 겔 농도, 점도, 용융 특징, 등전점 프로파일, pH, 히드록실화 정도, 아미노산 조성, 냄새, 색깔 등을 갖는 젤라틴을 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 한 방법에서, 비-가수분해된 젤라틴이 제조되며, 이어서 원한다면 완전히 또는 부분적으로 가수분해할 수 있다.
젤라틴의 특성
젤라틴의 다양한 물리적 특성은 특정 분야에서 그의 유용성을 정의한다. 젤라틴은 예를 들어 그의 양쪽성 성질, 그의 열-가역성 겔 형성 능력, 그의 보호적 콜로이드 및 표면 활성 특성, 및 점도 및 안정성에 대한 그의 기여를 기초로 한 톡특한 기능을 제공한다. 많은 분야에서, 젤라틴은 예를 들어 유화제, 증점제 또는 안정화제; 피막 또는 코팅 형성제; 결합제; 접착제 또는 아교; 또는 응집제로서 사용된다.
원료, 전처리 유형 및 추출 방법은 모두 통상의 제조 동안 얻어지는 젤라틴 폴리펩티드 조성물을 형성한다. 따라서, 현재 이용되는 동물 생성물은 폴리펩티드 쇄의 비균질 단백질 혼합물이다. 젤라틴 분자는 꽤 크며, 특정 샘플내에서 몇백내지 수백 kDa 범위의 분자량을 가질 수 있다. 특정 로트에서 젤라틴의 분자량 분포는 분자량 분포가 예를 들어 젤라틴 샘플의 점도 및(또는) 겔 농도에 영향을 줄 수 있기 때문에 중요할 수 있다.
일반적으로, 젤라틴 용액의 점도는 농도 증가 및 온도 감소에 따라 증가한다. 예를 들어, 안정화제 또는 증점제로 사용되는 젤라틴에 대하여는 보다 높은 점도의 용액이 바람직하다. 어떤 경우, 다양한 유화 액체 등과 같은 액상 젤라틴이 바람직하다. 젤라틴 용액의 점도는 젤라틴 성분의 분자량 증가에 따라 증가한다. 따라서, 높은 점도의 젤라틴 용액은 고농도의 저분자량 젤라틴 또는 저농도의 고분자량 젤라틴으로 구성될 수 있다. 점도는 또한 세팅점 및 용융점을 포함한 겔 특성에 영향을 준다. 고점도의 젤라틴 용액은 저점도의 젤라틴 용액보다 겔에 보다 높은 용융 및 세팅 속도를 제공한다.
젤라틴의 열가역성 및 열가소성은 많은 분야, 예를 들어 겔 캡슐 및 정제의 제조에 이용되는 특성이다. 젤라틴은 적절하게 가열, 형성 또는 성형시킬 수 있고, 냉각시켜 항상성 온도에서 독특한 특성을 갖는 캡슐 또는 정제 코팅을 형성시킬 수 있다. 젤라틴은 입속 온도에서 용융되기 시작하므로 삼키기 쉬우며 체온에서는 액체로 된다.
다양한 겔 강도의 젤라틴은 여러 분야에 사용하기에 적합하다. 세트 (set) 겔의 경도 또는 강도는 통상적으로, 국제 표준 및 방법을 이용하여 결정될 수 있는 블룸 (Bloom) 값을 계산하여 측정한다. 요컨대, 블룸 강도는 18시간에 걸쳐 일정 온도의 조에서 6.67%의 젤라틴 용액에 의해 형성된 겔의 강도에 대한 측정치이다.표준 직물 분석기 (Texture Analyzer)를 사용하여 표준 AOAC (Association of Official Agricultural Chemists) 플런저를 겔에 대해 4 밀리미터 누르는데 필요한 그램 중량을 측정한다. 플런저를 누르는데 필요한 그램 중량이 200 그램인 경우, 특정 젤라틴은 200의 불룸 값을 갖는다 (예를 들어, 문헌 (United States Pharmacopoeia and Official Methods of Analysis of AOAC International, 17th edition, Volume II) 참조).
따라서, 시판 젤라틴은 블룸 강도에 따라 등급을 매겨서 판매할 수 있다. 젤라틴의 다른 용도에는 다른 범위의 블룸 값이 적절하며, 예를 들어 다양한 산업적 용도, 예를 들어 실제적인 안정화, 샌드 캐스팅, 몰드, 아교, 코팅 등에 사용되는 젤라틴은 목적하는 수행 특징에 따라 넓은 범위의 변화하는 블룸 강도로부터 선택될 것이다. 다양한 블룸 강도를 갖는 젤라틴은 또한 다양한 약제 생성물의 제조에 있어서 바람직하다. 예를 들어, 연질 겔 캡슐은 통상적으로 약 150 내지 175의 블룸 값을 갖는 골질 또는 피부 젤라틴 및(또는) 약 190 내지 210의 블룸 값을 갖는 돼지로부터 유래하는 젤라틴, 또는 이들의 혼합물을 사용하여 제조하지만, 경질 겔 캡슐은 약 220 내지 260의 블룸 값을 갖는 젤라틴을 사용할 수 있다. 식품 분야에서, 예를 들어 마쉬멜로우 또는 다른 과자 제품 중에서 증점제로 사용되는 젤라틴은 약 250의 블룸 강도를 가질 수 있다. 사진에 쓰이는 어떤 유화 액체 및 다양한 산업성 코팅을 비롯한 여러 용도는 비-겔화 젤라틴의 사용을 포함한다.
본 발명은 다른 블룸 강도를 갖는 재조합 젤라틴의 제조 방법을 제공한다. 한 측면으로, 본 발명은 예를 들어 약 50, 100, 150, 200, 250 및 300의 블룸 강도를 갖는 젤라틴의 제조에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 약 400의 블룸 강도를 갖는 재조합 젤라틴의 제조 방법을 제공한다. 이러한 젤라틴은 예를 들어 겔 캡슐의 제조에 사용될 수 있으며, 충분한 강도의 겔을 제공하는데 더 적은 물질이 필요하기 때문에 더 가볍고 더 얇은 캡슐의 제조를 가능케 할 수 있다. 100 미만, 및 0 내지 100의 블룸 강도를 갖는 재조합 젤라틴이 또한 고려된다.
본 발명은 특정 용도에 바람직한 물리적 특성을 갖는 재조합 젤라틴의 설계 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 특정 분자량 또는 분자량 범위를 갖는 균질한 분자를 포함하는 재조합 젤라틴, 및 이러한 재조합 젤라틴의 제조 방법을 제공한다. 이러한 동종의 균질한 물질은 이들이 제품 수행성 및 제조 파라메타에서 변수를 최소화하면서 예상가능한 수행성을 갖는 믿을만한 제품 공급원을 제공한다는 점에서 이롭다. 현재, 목적하는 물리적 특징, 예를 들어 특정 분자량 또는 분자량 범위에 의해 제공되는 점도 또는 겔 강도 등을 갖는 혼합물을 제조하기 위해서는 다른 로트로부터의 젤라틴을 때때로 혼합하여야 한다.
특정 분자량을 갖는 재조합 젤라틴에 대해 특정 분자량 범위의 재조합 젤라틴이 바람직한 경우, 본 발명은 이러한 물질을 제공한다. 제조자는 본 발명의 재조합 젤라틴을 사용하여, 예를 들어 특정 분자량을 갖는 로트로부터의 재조합 젤라틴을 어떤 비율로 혼합하여 목적하는 분자량 범위를 갖는 혼합물을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 젤라틴은 현재 이용되는 시판 제품보다 본래 더 균질하며 더 큰 농도를 갖는다. 본 발명의 한 방법에서, 재조합 콜라겐을 예를 들어 산 또는 열 가수분해에 의해 처리하여 현재 이용되는 젤라틴 제품보다 더 좁은 분자량범위의 재조합 젤라틴을 제조한다. 안정하고 조절가능한 가수분해 조건을 이용하여, 본 발명의 방법에 의해 시판 젤라틴과 유사한 분자량 분포를 갖는 재조합 인간 젤라틴뿐만 아니라 현재 이용되는 제품의 분자량 범위보다 더 좁은 범위를 갖는 재조합 젤라틴을 생성하였다 (예를 들어, 실시예 9 및 10 참조).
본 발명은 변수 및 비예측성을 제거하고 프로세스 및 예상되는 거동을 미세조정하여 균일한 분자량 또는 특정 범위 분자량의 재조합 젤라틴을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 어떤 바람직한 분자량 또는 분자량 범위를 갖는 재조합 젤라틴을 제조할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 300 kDa을 넘는 분자량을 갖는다. 다른 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 약 150 내지 250 kDa, 또는 약 250 내지 350 kDa의 분자량 범위를 갖는다. 약 0 내지 50 kDa, 약 50 내지 100 kDa, 약 100 내지 150 kDa, 약 150 내지 200 kDa, 약 200 내지 250 kDa, 약 250 내지 300 kDa, 및 약 300 내지 350 kDa의 분자량 범위를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 분자량 범위가 특히 고려된다.
다른 측면으로, 약 10 내지 70 kDa의 몇몇 시판 젤라틴과 유사한 분자량을 갖는 재조합 젤라틴을 제조할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 현재 시판 제품으로 이용되지 않는 더 좁은 분자량 범위, 예를 들어 약 10 내지 30 kDa, 약 30 내지 50 kDa, 및 약 50 내지 70 kDa의 재조합 젤라틴을 제공한다. 특정 실시양태에서, 목적하는 용도에 적절한 구체적인 특성을 부여하는 쇄 길이를 갖는 재조합 젤라틴이 제공된다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 약 1 kDa, 5 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 14 kDa, 16 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 44 kDa, 및 65 kDa의 균일한 분자량을 갖는 재조합 젤라틴이 고려된다 (예를 들어, 표 2 참조).
특히, 본 발명의 한 방법에서, 젤라틴은 짧아진 콜라겐 서열, 예를 들어 표 2에 나타낸 서열로부터 제조된다. 이러한 서열은 특이적 콜라겐성 도메인을 나타내며 짧은 형태의 젤라틴을 코딩한다.
본 발명의 젤라틴은 종래에 유도된 동물 젤라틴보다 더 낮거나 더 높은 평균 분자량을 가지며, 젤라틴의 중요한 물리적 특징, 예를 들어 피막형성능을 보유할 수 있다. 예를 들어 콜라겐, 콜라겐 쇄, 서브유닛 또는 이들의 단편의 변성, 또는 히드록실화 정도의 변화를 포함하는 콜라겐 서열의 다양한 변형을 수행하여 특이적인 물리적 특성, 즉 종래의 젤라틴보다 더 높거나 더 낮은 융점, 다른 아미노산 조성, 특이적 분자량 또는 분자량 범위 등을 갖는 젤라틴을 제조할 수 있으며, 이러한 변화는 본원에 구체적으로 포함된다.
통상의 원섬유-형성 콜라겐 분자, 예를 들어 타입 I 콜라겐의 분자량은 300 kDa이다. 고분자량 젤라틴이 사용되는 것과 같은 어떤 경우, 현재 이용되는 추출된 젤라틴보다 더 높은 분자량을 갖는 젤라틴을 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 현재 시판되는 젤라틴이 추출되는 콜라겐 보다 더 큰 분자를 포함하는 젤라틴을 제조할 수 있다. 생성된 더 높은 분자량의 젤라틴 제품은 그의 물리적 특성이 바람직한 여러 분야에 직접 사용하거나, 또는 분류한 다음 처리하여 더 작은 크기의 분자를 제조할 수 있다.
한 실시양태에서, 종래의 동물 공급원에서 이용되는 것보다 더 큰 콜라겐을 사용하여 젤라틴을 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제조 방법을 변형시켜베스티멘티페란 튜브 웜 리프티아 파치프틸라 (vestimentiferan tube worm Riftia pachyptila)(분자량 약 2,600 kDa) 및 안넬리드 알비넬라 폼페자나 (annelid Alvinella pompejana)(분자량 약 1,700 kDa)의 체벽으로부터 유도되는 산-용해성 각질 콜라겐을 제조할 수 있다. 이러한 콜라겐을 본 발명의 제조 방법에 맞도록 변형시켜 현재 이용되는 젤라틴이 추출되는 콜라겐보다 더 큰 분자를 생성시킬 수 있으며, 생성된 산물을 처리하여 목적하는 젤라틴을 제조할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 다양한 방법에 의해 다양한 분자량을 갖는 젤라틴을 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 젤라틴의 특징, 예를 들어 히드록실화 비율, 가교 정도 등을 변화시켜 목적하는 분자량을 갖는 재조합 젤라틴을 생성시킬 수 있다. 한 측면으로, 예를 들어, 본 발명은 가교 젤라틴 폴리펩티드에 대해 당업계에 공지된 가교 물질을 사용하여 더 큰 분자량의 재조합 젤라틴을 제조하는 방법을 제공한다 (하기 논의 참조).
본 발명의 다른 측면으로, 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드는 천연 콜라겐 서열의 전체 또는 그의 단편의 다수의 카피를 포함하는 조작된 구조물로부터 발현된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 타입 I 콜라겐의 콜라겐성 도메인의 다수의 카피를 포함하는 변형된 콜라겐 구조물을 제공한다. 다른 실시양태에서, 구조물은 타입 III 콜라겐의 콜라겐성 도메인의 다수의 카피를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 구조물은 타입 I 및 타입 III 콜라겐성 도메인의 카피를 포함한다. 본 발명은 콜라겐 타입 I 내지 XX를 포함하여 임의 콜라겐을 코딩하는 서열의 전부 또는 일부의 단일 카피 또는 다수 카피의 용도를 제공한다. 특히, 본 발명의 방법은 하나 이상의 콜라겐 타입으로부터 유도되는 젤라틴을 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 콜라겐 타입으로부터 유도되는 재조합 젤라틴은 발현계, 예를 들어 숙주 세포, 유전자전환 동물 등에서 공동 발현되어, 젤라틴 혼합물이 생성된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 콜라겐 또는 프로콜라겐 삼중 나선 단계로부터의 유도 없이 젤라틴을 제조하는 방법을 제공한다. 한 측면으로, 이 방법은 고온 발현계, 예를 들어 삼중 나선 구조를 형성시키지는 않지만 프롤릴 히드록실라제의 활성은 허용하는 고온성 생물에 의존하는 발현계에서 다양한 구조물을 발현시켜 재조합 젤라틴을 제조하는 것을 포함한다. 본 발명의 젤라틴은 또한 삼중 나선의 형성을 방해하는 돌연변이, 부가 또는 결실 함유 콜라겐 구조물로부터 유도될 수도 있다. 다른 측면으로, 이 방법은 규정 온도, 즉 37 ℃에서 삼중 나선을 형성시키지 않는 짧아진 구조물로부터 젤라틴을 제조하는 것을 포함한다. 또는, 젤라틴은 삼중 나선 형성의 저해제, 예를 들어 생합성 콜라겐 구조물과 공동 발현되는 다가음이온의 존재하에 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 생합성 젤라틴은 삼중 나선을 형성시키지 않는, 재조합적으로 생산된 콜라겐 쇄로부터 유도될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 비히드록실화된 콜라겐 또는 프롤린 잔기가 완전히 히드록실화되었다기 보다는 부분적으로 히드록실화된 콜라겐으로부터 젤라틴을 유도하는 방법을 제공한다. 한 측면으로, 이 방법은 프롤릴 히드록실라제의 부재하에, 예를 들어 프롤릴 히드록실라제가 없는 곤충 발현계에서 발현되는 콜라겐으로부터 젤라틴을 유도하는 것을 포함한다 (예를 들어, 문헌 (Myllyharju etal. (1997) J. Biol. Chem. 272,21824-21830) 참조). 본 발명에 따른 한 방법에서, 젤라틴은 부분적으로 히드록실화되거나 또는 비히드록실화된 콜라겐으로부터 유도된다. 히드록실화는 예를 들어 시험관내 히드록실라제 투여에 의해 제공될 수 있다. 한 방법에서, 히드록시프롤린을 예를 들어 박테리아 또는 효모 숙주 세포에 제공함으로써 프롤린을 히드록시프롤린으로 낮은 정도로 치환시킬 수 있다.
본 발명은 완전 히드록실화, 부분 히드록실화 및 비히드록실화된 재조합 젤라틴을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 특정 정도로 히드록실화된 젤라틴 또는 젤라틴 전구체를 제조하는 것을 포함한다. 추가의 측면으로, 본 발명은 20 내지 80%, 바람직하게는 약 30 내지 60%, 가장 바람직하게는 약 40%가 히드록실화된 젤라틴의 제조 방법에 관한 것이다 (실시예 4 및 5 참조). 본 발명의 부분적으로 히드록실화된 재조합 젤라틴은 히드록실화가 다른 정도로 된 특정 비율의 재조합 젤라틴을 혼합하여 얻거나 또는 직접 얻을 수 있다 (실시예 4 및 5 참조). 또한, 본 발명은 시험관내에서 프롤릴 히드록실라제를 비히드록실화된 재조합 젤라틴에 투여하고 반응의 길이를 조절함으로써 재조합 젤라틴의 부분적 히드록실화를 달성하는 방법을 제공한다.
현재 이용되는 동물 출처의 젤라틴의 열 특징은 변경될 수 있는 정도에 대한 제한이 있다. 특히, 본 발명은 특정 용도에 바람직한 특이적 열 특징을 갖는 재조합 젤라틴의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 이용하여, 재조합 젤라틴의 융점 및(또는) 겔 강도를 다양한 방법으로 조작할 수 있다. 재조합 젤라틴의 온도 안정성 및(또는) 겔 강도는 당업계에 잘 알려진 다양한 기술에 의해측정할 수 있다.
일반적으로, 젤라틴의 융점은 히드록실화가 증가함에 따라 높아진다. 본 발명의 방법을 이용하여, 히드록실화 및(또는) 가교 등의 조작으로 인해 현재 이용되는 동물 출처의 젤라틴보다 더 낮은 겔 강도 및(또는) 더 낮은 융점을 갖는 고분자량 젤라틴을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 증가된 피막 강도를 제공하기 위해 더 높은 분자량의 젤라틴이 요구되지만, 비-겔화 또는 저강도 겔 제품이 요구되는 경우에 사용하기에 적합한, 각종 시판 제품에서는 얻을 수 없는 특성을 갖는 재조합 젤라틴을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 프롤린 잔기의 불완전한 히드록실화로 인해 저온 안정성을 갖는 재조합 젤라틴을 제공한다.
이러한 재조합 젤라틴은 다양한 분야에 유용할 수 있다. 현재의 추출 방법에 의해 생성된 젤라틴 중에서, 어류 젤라틴만이 높은 평균분자량의 비-겔화 피막형성 단백질을 제공한다. 비-겔화 어류 젤라틴에 의해 제공되는 비-겔화 및 냉 수용성 특징은 현재 이용되는 가수분해된 소 및 돼지의 젤라틴에 의해 매치될 수 있지만, 가수분해된 젤라틴은 평균분자량이 더 작기 때문에, 피막 강도 및 유연성이 상응하게 손실된다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 현재 이용되는 동물 출처의 물질에 의해 제공되는 것보다 더 낮은 겔 강도 및 더 높은 분자량을 갖는 부분적으로 히드록실화된 재조합 젤라틴을 제공한다.
보다 높은 분자량, 보다 낮은 겔 강도의 재조합 젤라틴은 또한 안정성이 요구되는 다양한 제약 분야에 유용할 수도 있지만, 약제 제품의 전성 (malleability) 및 일체성을 유지하기 위해서는 비- 또는 저-겔화 특성이 요구된다. 이러한 재조합 젤라틴은 예를 들어 혈장 증량제로서 사용될 수 있으며, 그의 분자량은 안정성을 제공할 수 있기 때문에 혈중 체류 시간을 증가시키고, 변경된 세팅점은 물질이 실온에서 겔화하는 것을 방지하여, 상기 증량제를 가열하지 않고 투여할 수 있도록 한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어 혈장 증량제로서 제약 용도에 사용하기에 적합한 부분 히드록실화된 재조합 젤라틴을 제공한다.
다른 측면으로, 부분 히드록실화된 재조합 젤라틴은 프롤릴 히드록실라제의 부재하에, 예를 들어 프롤릴 히드록실라제가 없는 곤충 발현계에서 재조합 젤라틴의 발현을 통해 또는 재조합 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드의 발현을 통해 얻어진다 (예를 들어, 문헌 (Myllyharju et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 21824-21830) 참조). 히드록실화는 제조시에 일어나거나 또는 이후에 예를 들어 시험관내 생물 또는 화학적 변형을 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 한 방법에서, 재조합 젤라틴은 부분 히드록실화되거나 또는 완전 히드록실화된 콜라겐으로부터 유도된다.
현재 이용되는 방법에 의해 천연 공급원으로부터 유도된 젤라틴은 구성 요소인 콜라겐 분자의 라이신 잔기 사이의 공유 가교 연결의 존재에 의해 크게 강화된다. 가교는 콜라겐 분비 및 원섬유 형성 이후에 세포외 공간에서 자연적으로 형성되며, 분비에 앞서 몇몇 라이신 잔기가 라이실 히드록실라제 효소에 의해 히드록실화된다. 세포외 효소인 라이실 옥시다제는 이후에 콜라겐 분자에서 몇몇 라이신 및 히드록시라이신 잔기를 탈아미드화하여, 자연적으로 반응하여 공유 결합을 형성하는 매우 반응성인 알데히드기를 생성한다. 생성되는 가교 콜라겐은 증가된 겔강도 및 증가된 점도를 갖는 젤라틴을 형성한다. 특히, 보다 높은 정도의 가교는 보다 높은 융점 및 보다 큰 겔 강도를 갖는 젤라틴을 생성시킨다.
한 측면으로, 본 발명은 가교 연결되어 더 높은 분자량의 젤라틴을 형성하는 재조합 젤라틴을 제공한다 (실시예 7 참조). 가교 연결은 다른 방법에 의해, 예를 들어 생물 또는 화학적 변형에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 재조합 젤라틴, 또는 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드는 라이실 히드록실라제 및 라이실 옥시다제의 존재하에 발현된다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 발현 이후에 가교 연결에 의해 변형된다. 추가의 측면으로, 본 발명은 화학적 방법, 예를 들어 반응성 화학 가교 연결제, 예를 들어 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC)에 의한 가교 연결의 수행 방법을 제공한다 (실시예 7 참조). 당업계에 잘 알려진 다양한 물질이 사용될 수 있는 바와 같이, 다른 화학적 가교 연결제, 예를 들어 비스(술포숙신이미딜)수베레이트 (BS3), 3,3'-디티오비스(술포숙신이미딜)프로피오네이트 (DTSSP) 및 트리스-술포숙신이미딜 아미노트리아세테이트 (술포-TSAT)를 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명은 목적하는 융점, 겔 강도 및 점도를 갖는 재조합 젤라틴을 얻는데 유용한, 가교 연결 정도가 변하는 재조합 젤라틴의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 재조합 젤라틴의 분자량, 히드록실화 수준 및 가교 연결 정도를 조작하여 다른 특정의 블룸 강도를 갖는 재조합 젤라틴뿐 아니라 다른 특정의 점도 수준을 갖는 재조합 젤라틴을 생성시키는 방법을 제공한다.
프롤린 히드록실화는 천연 콜라겐 형성에 있어서 중심적인 역할을 한다. 서열 X-Lys-Gly에서 특정 라이실 잔기의 히드록실화는 또한 콜라겐 합성 및 원섬유 형성에서 중요한 기능을 수행한다. 변형된 라이신 잔기상의 히드록실기는 탄수화물에 대한 부착 부위 및 안정한 분자간 가교 형성을 위한 필수적인 부위로서 작용한다. 이러한 변형은 특정 효소, 즉 라이실 히드록실라제 및 라이실 옥시다제의 발현을 필요로 한다.
따라서, 본 발명의 한 측면으로, 이러한 효소와 본 발명의 폴리펩티드의 공동 발현이 고려된다. 라이실 히드록실라제를 코딩하는 유전자 (Hautala et al. (1992) Genomics 13: 62-69)는 숙주 세포에서 발현되며 이후에, 본원에 기재된 바와 같이, 젤라틴 또는 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 도입에 의해 추가로 변형된다. 따라서, 본 발명의 재조합 젤라틴은 번역후에 내생적으로 발현되는 라이실 히드록실라제 및 라이실 옥시다제의 활성에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 재조합 젤라틴은 또한 외생 라이실 히드록실라제 및 라이실 옥시다제의 발현에 의해 변형될 수도 있다. 한 실시양태에서, 제조된 재조합 젤라틴은 비히드록실화되고, 이어서 라이실 히드록실라제의 효소 활성에 의해 라이신 잔기가 목적하는 정도로 히드록실화되어 변형된다. 라이실 히드록실화의 정도를 변경하는 능력은, 목적하는 겔 강도 및 점도를 초래하는 다양한 가교 연결 정도와 함께, 젤라틴 및 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드를 제조하는데 있어 바람직하다.
추가의 실시양태에서, 히드록시라이신 잔기를 포함하는 폴리펩티드는 또한 예를 들어 효모 세포에서 발현될 수 있으며, 이 때 히드록시프롤린은 프롤릴 히드록실라제의 활성에 의해 생성된다 (실시예 1 및 4 참조). 일부 실시양태에서, 변형된 재조합 젤라틴 또는 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드는 제제화되어 동물 또는 인간에게 투여됨으로써 라이실 옥시다제와 같은 내생 효소의 활성에 대한 기질로서 작용하며, 따라서 콜라겐성 폴리펩티드가 조직내에 안정화된 가교 연결 형태로 혼입되게끔 한다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 라이실 히드록실라제 또는 라이실 옥시다제의 활성 없이도 상업적인 용도로 바람직한 겔 강도 및 점도를 갖는 재조합 젤라틴의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 특정 겔화점을 갖는 젤라틴의 제조 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 15 내지 35 ℃의 세팅점 또는 겔화점을 갖는 젤라틴의 제조 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 15 내지 25 ℃, 25 내지 35 ℃, 및 20 내지 30 ℃의 세팅점을 갖는다.
다양한 측면으로, 본 발명은 비가수분해되거나, 완전히 가수분해되거나 또는 다양한 정도로 가수분해된, 가수분해 및 비가수분해된 생성물의 혼합물인 재조합 젤라틴을 제공한다. 또한, 본 발명은 다양한 가수분해 정도를 갖는 재조합 젤라틴의 제조 방법을 제공한다 (실시예 9 및 10 참조). 젤라틴 가수분해물은 통상적으로 냉 수용성으로, 다양한 용도, 특히 제약 및 식품 산업에서 사용되며, 비-겔화 특성을 지닌 젤라틴이 바람직하다. 젤라틴 가수분해물은 제약 산업에서 피막형성제, 미세-캡슐화 프로세스, 관절염 및 관절 완화 처방, 타정, 및 다양한 영양 처방에서 사용된다. 화장품 산업에서, 젤라틴 가수분해물은 샴푸 및 컨디셔너, 로션, 및 립스틱을 비롯한 다른 조성물, 및 손톱용 조성물 등에서 사용된다. 젤라틴 가수분해물은 단백질, 에너지 드링크 및 식품 중의 영양 보충물인 것으로 보이고, 와인, 맥주 및 쥬스 정화시 정련제로 사용되며, 식품 향미제 및 착색제와 같은 첨가제의 미세-캡슐화에 사용된다. 젤라틴 가수분해물은 이들의 피막형성 특징으로 인해 반도체 제조 등에서의 소자의 코팅과 같은 산업 분야에서 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 젤라틴은 발현되는 산물의 작용을 바꾸기 위해 특정의 천연 도메인이 결실 또는 부가된 콜라겐 서열로부터 생성된다. 본 발명은 또한 무손상 삼중 나선 콜라겐의 생성 없이 변형된 콜라겐 산물로부터 직접 생성되는 재조합 젤라틴의 제조 방법을 포함한다. 특히, 본 발명은 표준 삼중 나선 콜라겐을 코딩하지 않는 다양한 조작된 구조물의 발현을 포함하는, 재조합 젤라틴의 제조 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 특이적 결실은 콜라게나제-반응성 영역, 및 면역원성, 예를 들어 항원성 및 알러지성 반응을 유도하는 다양한 영역을 제거할 수 있다.
다양한 콜라겐의 특정 도메인은 특이적 활성과 관련된다 (예를 들어, 본원에 전체 내용이 참고로 포함되는 문헌 (Shahan et al. (1999) Con. Tiss. Res. 40: 221-232; Raffet al. (2000) Human Genet 106: 19-28) 참조). 특히, 본 발명은 특이적 활성과 관련된 콜라겐 유전자의 특정 영역을 제거하거나, 감소 또는 증가시키도록 변형된 콜라겐 구조물로부터 유도되는 재조합 젤라틴의 제조 방법을 구체적으로 제공한다. 특히, 이러한 영역을 완전히 또는 부분적으로 결실시켜 특이적 활성이 결여되었거나 저하된 젤라틴을 제조하거나 또는 특정 영역의 추가의 카피를 부가하여 증가된 활성을 갖는 젤라틴을 제조할 수 있다. 예를 들어, 혈소판 세포 표면의 α2β1인테그린 수용체에 의해 인식되는 타입 I 및 III 콜라겐 서열이 확인되었다 (Knight et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 33287-33294; and Morton et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 11044-11048, 이들 참고문헌은 본원에 그의 전체 내용이 참고로 포함되어 있음).
본 발명의 한 측면으로, 혈소판 활성 영역이 결여된 콜라겐 구조물로부터 합성된 단편으로 구성된 균일한 젤라틴을 생성시키는 것이 바람직하다. 이러한 젤라틴은 예를 들어 스텐트 (stent) 및 이식 장치에 대한 코팅을 비롯하여 접합 및 혈관 이식 등과 관련된 제품에 포함될 수 있다. 이러한 제품은 해로운 부작용, 예를 들어 콜라겐성 산물에 존재하는 혈소판-응집 영역으로 인해 상기 제품의 사용과 관련하여 발생될 수 있는 혈전증과 관련이 있을 수 있다. 한 측면으로, 본 발명은 스텐트 또는 유사한 장치에 사용되는 경우 세포 부착에 대한 지지체를 제공할 수 있지만, 혈소판 반응성 영역은 포함하고 있지 않아서 혈소판 응집 위험을 최소화하는 재조합 젤라틴의 제조 방법을 제공한다 (실시예 2 참조). 따라서, 본 발명은 한 실시양태에서 재조합 젤라틴을 포함하는 스텐트 코팅을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 재조합 인간 젤라틴이다. 어떤 경우, 다양한 상처 치유 용도와 같이, 특이적 응집 활성을 유도할 수 있는 도메인을 포함하는 재조합 젤라틴을 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 젤라틴은 α2β1수용체에 의해 인식되는 영역을 코딩하지 않는 콜라겐 구조물 또는 이러한 영역의 하나 또는 여러 카피를 갖는 구조물로부터 발현될수 있으며, 따라서 혈소판 응집 및 활성화의 감소가 있거나 없는 균질한 일관된 젤라틴 산물을 제공한다. 한 측면으로, 본 발명은 매우 효율적인 재조합 발현을 이용하는, 젤라틴의 직접적 발현 또는 콜라겐성 폴리펩티드로부터 젤라틴의 프로세싱을 통한 재조합 젤라틴의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 종래의 추출 방법과 반대되는 것으로서 많은 발현계 중 어느 하나가 이용될 수 있는 바와 같이, 매우 큰 유연성을 제공한다. 생성 물질은 예를 들어 효모 또는 식물 바이오매스에서 사용할 수 있다. 특정 제조 시스템에서의 분비는 예를 들어 본 발명에 따라 균일한 크기의 특정 젤라틴 분자가 생성되도록 하여 최적화할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴 또는 이러한 젤라틴이 유도되는 폴리펩티드는 원핵생물 발현계, 예를 들어 박테리아 발현계, 및 진핵생물 발현계 (효모, 동물, 식물 및 곤충 발현계 포함)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 발현계에서 제조된다. 유전자전환 동물 및 유전자전환 식물과 같은 발현계가 고려된다.
본 발명은 세포에서 젤라틴 또는 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 세포에서 젤라틴 또는 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현을 제공하여, 균질 또는 비균질 폴리펩티드인 재조합 젤라틴이 생성된다. 본 발명은 또한 세포에서 콜라겐 프로세싱 또는 번역후 효소 또는 그의 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 제공한다. 다른 번역후 변형, 및 다른 번역후 효소, 예를 들어 프롤릴 히드록실라제, 라이실 히드록실라제 등은 예를 들어 블룸 강도 및 본 발명의 젤라틴의 다른 물리적 특징에영향을 줄 수 있다.
본 발명의 재조합 젤라틴은 콜라겐성 서열로부터 유도된다. 본 발명의 코딩 폴리뉴클레오티드가 유도되는 서열은 최종 젤라틴 산물의 목적하는 용도에 대해 바람직한 특징에 따라 인간 또는 비인간 서열로부터 선택될 수 있다. 제약 및 의학적 용도의 경우, 재조합 인간 젤라틴이 바람직하다. 비인간 공급원은 비인간 포유동물 공급원, 예를 들어 소, 돼지 및 말 공급원, 및 다른 동물 공급원, 예를 들어 닭 및 어류 공급원을 포함한다. 비천연 서열이 특히 고려된다.
콜라겐을 코딩하는 핵산 서열은 일반적으로 당업계의 기술 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 (Fuller and Boedtker (1981) Biochemistry 20: 996-1006; Sandell et al. (1984) J Biol Chem 259: 7826-34; Kohno et al. (1984) J Biol Chem 259: 13668-13673; French et al. (1985) Gene 39: 311-312; Metsaranta et al. (1991) J Biol Chem 266: 16862-16869; Metsaranta et al. (1991) Biochim Biophys Acta 1089: 241-243; Wood et al. (1987) Gene 61: 225-230; Glumoff et al. (1994) Biochim Biophys Acta 1217: 41-48 ; Shirai et al. (1998) Matrix Biology 17: 85-88; Tromp et al. (1988) Biochem J 253: 919-912; Kuivaniemi et al. (1988) Biochem J 252: 633640; and Ala-Kokko et al. (1989) Biochem J 260: 509-516.) 참조). 또한, 본원에 전체 내용이 참고로 포함되는, 본 출원과 동시 계류중인 발명의 명칭 "Animal Collages and Gelatins"로 2000년 11월 10일 공동 출원된 미국 특허 출원 제 호를 참조).
유전자 산물의 프로세싱 및 발현을 변경시키는 변화를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다양한 목적을 위해, 본 발명의 핵산 서열을 조작하여 재조합 젤라틴 또는 재조합 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드를 제조하는데 사용되는 코딩 서열을 변형할 수 있다. 예를 들어, 어떤 천연 분비 신호를 다른 분비 신호로 대체시킬 수 있다. 당업계에 잘 알려진 기술, 예를 들어 부위 지시적 돌연변이유발, PCR-지시적 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 및 새로운 제한 부위를 삽입하거나 글리코실화 패턴, 인산화, 단백질분해 턴오버 (turnover)/파괴 등을 변경시키는 당업계에 잘 알려진 다른 기술을 이용하여 변이를 도입할 수 있다. 또한, 특정 숙주 세포를 사용하여 발현계에서 젤라틴을 제조하는 경우, 특정 숙주 생물의 코돈 선택을 더 잘 일치시키기 위해 어떤 트리플렛 아미노산 코돈의 사일런트 위치에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 변형된 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 콜라겐 서열에서 뉴클레오티드 잔기의 결실, 부가 또는 치환을 함유하는 서열을 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 동일 또는 기능적으로 동등한 유전자 산물을 코딩할 수 있다. 유전자 산물 자체는 콜라겐 서열내의 아미노산 잔기의 결실, 부가 또는 치환을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 코딩된 폴리펩티드의 변이체를 코딩하는 서열에 관한 것이다. 코딩된 아미노산 변이체는 변이체 폴리펩티드를 코딩하는데 있어서 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하기 위해 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조할 수 있다. 아미노산 서열 변이체의 구성에서 두가지 중요한 변수는 돌연변이의 위치 및 돌연변이의 특성이다. 본 발명의 젤라틴 또는 이러한 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 바람직하게는 자연에 존재하지 않는 아미노산 서열을 제공하는 폴리뉴클레오티드를 돌연변이시켜 제작한다. 이러한 아미노산 변형은 예를 들어 다른 종 유래의 콜라겐 (가변 위치) 또는 고도로 보존된 영역 (불변 영역)이 다른 부위에서 수행할 수 있다. 통상적으로 이러한 부위는 예를 들어 먼저 보존적 선택물로 (예를 들어, 소수성 아미노산을 다른 소수성 아미노산으로) 치환하고, 이어서 더 먼 선택물로 (예를 들어, 소수성 아미노산을 하전된 아미노산으로) 치환하여 연속으로 변형시킨 다음, 목적 부위에서 결실 또는 삽입을 수행할 수 있다.
유전자 코드의 고유의 다의성으로 인해, 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 기원의, 실질적으로 동일하거나 또는 기능적으로 동등한 아미노산 서열 또는 폴리펩티드를 코딩하는 다른 핵산 서열을 사용하여 청구된 발명을 실시할 수 있다. 특히, 본 발명에는 코돈-최적화 서열을 포함하여 다의성 변이체가 포함된다. 또한, 본 발명은 엄격 조건하에 특정 서열과 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
발현
본 발명의 방법은 당업자가 이용가능한 발현계의 범위로 적합하게 응용된다. 이러한 발현계 중 많은 것들이 하기에 기재되어 있지만, 본 발명의 적용은 하기 기재된 특정 실시양태에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 젤라틴을 코딩하거나 또는 또는 이러한 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하고 이를 발현시키는 다양한 발현계를사용할 수 있다. 이들로는 미생물, 예를 들어 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 핵산 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 진균 벡터로 형질전환된 사상 진균; 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV); 담배 모자이크 바이러스 (TMV)) 또는 박테리아 발현 벡터 (예를 들어, pET 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계; 또는 동물 세포계가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는데 사용하기에 적합한 조절 요소 또는 조절 서열은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 인핸서, 프로모터 및 5' 및 3' 비번역 영역을 포함하는, 벡터의 비번역 영역이다. 이러한 요소들은 길이 및 특성에 있어서 다를 수 있다. 이용되는 벡터계 및 숙주에 따라, 특정 개수의 적합한 전사 및 번역 요소를 이용할 수 있다.
프로모터는 그의 조절하에 있는 핵산의 전사를 조절하는, 구조 유전자의 개시 코돈으로부터 상류쪽에 위치하는 비번역 서열이다. 유도성 프로모터란 배양 조건의 변화, 예를 들어 영양원의 존재 또는 부재에 대해 반응하여 이들의 전사 개시 수준을 변경시키는 프로모터를 말한다. 당업자라면 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 숙주 세포에서 인식되는 다수의 프로모터를 알고 있을 것이다.
프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소는 당업자에 의해 적합한 것으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 박테리아계에서 클로닝하는 경우, BLUESCRIPT 파지미드 (Stratagene, La Jolla, Calif.) 또는 pSPORT1 플라스미드 (GIBCO BRL)의 하이브리드 lacZ 프로모터 등과 같은 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 곤충 세포에서는, 바쿨로바이러스 폴리헤드린 프로모터를 사용할 수 있다. 식물계에서는, 식물 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터 또는 인핸서 (예를 들어, 열 충격 프로모터, RUBISCO의 작은 서브유닛에 대한 프로모터; 클로로필 a/b 결합 단백질에 대한 프로모터; 각종 저장 단백질 유전자에 대한 프로모터 등) 또는 식물 바이러스로부터 유도된 프로모터 또는 인핸서 (예를 들어, 바이러스 프로모터 또는 리더 서열, CaMV의 35S RNA 프로모터, TMV의 코트 단백질 프로모터 등)를 벡터에 클로닝할 수 있다. 포유동물 세포계에서는, 포유동물 유전자 유래의 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터, -액틴 프로모터 등) 또는 포유동물 바이러스 유래의 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, CMV, SV40, LTR, TK, 및 백시니아 바이러스 7.5 K 프로모터 등)가 바람직하다. 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 여러 카피를 포함하는 세포주를 생성시키는 것이 필요할 경우, 적절한 선택적 마커를 갖는 SV40 또는 EBV계 벡터를 사용할 수 있다.
이러한 프로모터는, 예를 들어 천연 유전자로부터 프로모터를 제거하고 코딩 폴리뉴클레오티드를 프로모터 서열의 3' 말단에 위치시켜 본 발명의 젤라틴 또는 젤라틴 전구체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결할 수 있다. 본 발명에 유용한 프로모터는 예를 들어 락토스 프로모터, 아라비노스 프로모터, 알칼리 포스파타제 프로모터, 트립토판 프로모터, 및 tac 프로모터 등의 하이브리드 프로모터를 비롯한 원핵세포 프로모터; 예를 들어 3-포스포글리세레이트 키나제, 다른 당분해 효소 프로모터 (헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토스키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 등), 알콜 데히드로게나제 프로모터, 알콜 옥시다제 (AOX) 1 또는 2 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 말토스 프로모터 및 갈락토스 프로모터를 비롯한 효모 프로모터; 및 예를 들어 바이러스 폴리오마, 계두, 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, SV40으로부터의 프로모터, 및 대상 진핵생물로부터의 프로모터, 예를 들어 아스페르길루스 (Aspergillus)로부터의 글루코아밀라제 프로모터, 액틴 또는 유비퀴틴 프로모터, 포유동물로부터의 이뮤노글로불린 프로모터, 및 천연 콜라겐 프로모터를 비롯한 진핵세포 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다 (예를 들어, 문헌 (de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25; Hitzeman et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 2073); Fiers et al. (1978) Nature 273: 113; Mulligan and Berg (1980) Science 209: 1422-1427; Pavlakis et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7398-7402; Greenway et al. (1982) Gene 18: 355-360; Gray et al. (1982) Nature 295: 503-508; Reyes et al. (1982) Nature 297: 598-601; Canaani and Berg (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 51665170; Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777-6781; and Nunberg et al. (1984) Mol. and Cell. Biol. 11 (4): 2306-2315) 참조).
본 발명의 방법에 있어서 젤라틴 및 젤라틴 전구체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 일반적으로 발현을 지시하는 구성적 프로모터의 전사 조절하에 있을 수 있다. 또는, 본 발명의 방법에 이용되는 폴리뉴클레오티드는 특정 조직 또는세포 유형에서 또는 보다 정밀한 환경 조건 또는 발생 조건하에 발현된다. 이러한 경우에 발현을 지시하는 프로모터는 유도성 프로모터로 알려져 있다. 조직 특이적 프로모터가 사용되는 경우, 단백질 발현은 단백질의 추출이 바람직한 조직에서 특히 높다. 식물에서는, 예를 들어 목적하는 조직에 따라, 발현을 배유, 호분층, 배 (또는, 배반 및 자엽과 같은 그의 일부), 과피, 줄기, 잎, 도관, 뿌리 등으로 표적화할 수 있다. 식물에서 공지된 조직-특이적 프로모터의 예로는 괴경-지시된 클래스 I 파타틴 (patatin) 프로모터, 감자 괴경 ADPGPP 유전자 관련 프로모터, 종자-지시된 전사를 유도하는 β-콘글리시닌 (7S 단백질)의 대두 프로모터, 및 옥수수 배유의 제인 (zein) 유전자로부터의 종자-지시된 프로모터가 포함된다 (예를 들어, 문헌 (Bevan et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4625-4638; Muller et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 224: 136146; Bray (1987) Planta 172: 364-370; and Pedersen et al. (1982) Cell 29: 1015-1026.) 참조).
프로모터에 의해 본 발명의 젤라틴 또는 젤라틴 전구체를 코딩하는 서열을 전사시키는 것은 종종 벡터내에 인핸서 서열을 삽입하여 증가시킨다. 인핸서는 시스-작용성 요소로 일반적으로 약 10 내지 300 bp이며, 프로모터에서 전사 개시 속도를 증가시키는 작용을 한다. 진핵생물 및 원핵생물 둘 다에 대하여 많은 인핸서가 알려져 있으며, 당업자라면 대상 숙주 세포에 대하여 적절한 인핸서를 선택할 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Yaniv (1982) Nature 297: 17-18) 참조).
본 발명의 젤라틴 및 젤라틴 전구체는 분비 단백질로 발현될 수 있다. 단백질의 발현에 사용되는 조작된 세포가 비인간 숙주 세포인 경우, 흔히, 숙주 세포의분비 표적화 기작에 의해 보다 효과적으로 인식되는 다른 분비 신호 펩티드로 콜라겐 단백질의 분비 신호 펩티드를 대체하는 것이 종종 이로울 수 있다. 적절한 분비 신호 서열은 특히 포유동물 유전자의 적절한 진균 발현을 달성하는데 있어서 특히 중요하다 (예를 들어, 문헌 (Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642) 참조). 원핵세포, 효모, 진균, 곤충 또는 포유동물 세포에 대한 다른 신호 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자라면 선택된 숙주 세포에 대해 적절한 신호 서열을 쉽게 선택할 수 있을 것이다.
사용되는 특정 세포계에 적절한 인핸서, 예를 들어 문헌 (예를 들어, 문헌 (Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162) 참조)에 기재된 것들을 포함시켜 발현 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 삽입되는 서열의 발현을 조절하거나 또는 발현되는 단백질을 바람직한 방식으로 처리하는 능력에 대하여 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 이러한 폴리펩티드 변형으로는 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화, 프레닐화 및 아실화가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 단백질의 "프리프로 (prepro)" 형태를 절단하는 번역후 프로세싱을 이용하여 정확한 삽입, 폴딩 및(또는) 기능을 촉진시킬 수도 있다. 이러한 번역후 활성에 대한 특이적 세포 기작 및 특정 메카니즘을 갖는 CHO, HeLa, MDCK, HEK293 및 WI38과 같은 여러 숙주 세포를 선택하여 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장할 수 있다.
본 발명에 따라, 재조합 젤라틴 또는 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 적절한 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 인간 젤라틴이다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 임의의 다른 타입의 콜라겐에 대한 코딩 서열이 없는 타입 I 콜라겐 서열, 임의의 다른 타입의 콜라겐에 대한 코딩 서열이 없는 타입 II 콜라겐, 또는 임의의 다른 타입의 콜라겐에 대한 코딩 서열이 없는 타입 III 콜라겐으로부터 유도된다. 다른 실시양태에서, 코딩 폴리뉴클레오티드는 타입 I 및 타입 III 콜라겐으로부터 특정량으로 유도되며, 코딩된 폴리펩티드에 의해 생산되거나 그로부터 유도된 젤라틴은 소정량의 타입 I 및 타입 III 콜라겐의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 젤라틴이 유도되는 콜라겐을 발현시키거나 또는 본 발명의 젤라틴의 생성을 초래하는, 천연 콜라겐 서열 이외의 서열을 발현시키기 위해, 콜라겐, 또는 기능적 동등물 또는 다른 서열, 예를 들어 표 2에 제시된 것과 같은 짧아진 콜라겐 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 적절한 발현 벡터, 즉 삽입되는 코딩 서열의 전사 및 복제에 필요한 요소 또는 RNA 바이러스 벡터의 경우 복제 및 번역에 필요한 요소를 포함하는 벡터내에 삽입한다.
당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 목적하는 코딩 서열 및 적절한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 이러한 방법은 표준 DNA 클로닝 기술, 예를 들어 시험관내 재조합 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합을 포함한다 (예를 들어, 문헌 (Maniatis et al., supra ; Ausubel et al., supra ; and Ausubel, F. M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York, NY)에 기재된 기술 참조).
다양한 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 통상의 발현 벡터는 복제 기점 코딩 요소; 외생 뉴클레오티드 서열의 삽입을 위한 클로닝 부위; 외생 유전자의 전사 개시를 조절하는 요소, 예를 들어 프로모터; 및 전사체의 프로세싱을 조절하는 요소, 예를 들어 전사/종결/폴리아데닐화 서열을 포함한다. 본 발명에 사용되는 발현 벡터는 또한 염색체내로 벡터의 실제적인 통합에 필요한 이와 같은 서열을 포함할 수도 있다. 또한, 전사 개시를 조절하는 프로모터에 기능적으로 연결된 선별 마커를 코딩하는 유전자는 또한, 발현 벡터내에서 예를 들어 숙주에서 발현 벡터의 증식 및 선별을 제공하는 항생제 내성 유전자일 수도 있다.
본 발명의 벡터는 숙주 세포에서 자동적으로 복제되거나 또는 숙주 염색체내로 통합될 수 있다. 자동적으로 복제하는 서열을 갖는 적합한 벡터는 다양한 박테리아, 효모, 및 원핵생물 및 진핵생물 둘 다에 대한 다양한 바이러스 복제 서열에 대하여 잘 알려져 있다. 벡터는 이들이 숙주 세포의 게놈 DNA에 존재하는 서열과 상동성인 DNA 서열을 갖는 경우 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있다.
재조합 단백질을 장기간 고수율로 생산하기 위해서는, 적절한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 적절하게 발현시키는 세포주는 동일 또는 별도의 벡터상에 바이러스 복제 기점 또는 적절한 발현 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택적 마커 유전자를 포함하는 발현 벡터를 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 벡터의 도입 이후에, 세포를 풍부 배지에서 1 내지 2일 동안 증식시킨 다음, 선택적 배지로 옮길 수 있다. 재조합 플라스미드내의 선택적 마커는 선별에 대한 내성을 부여하여, 도입된 서열을 성공적으로 발현시키는 세포의 증식 및 회수를 가능케 한다. 세포 타입에 대해 적절한 조직 배양 기술을 이용하여, 안정하게 형질전환된 세포의 내성 클론을 증식시킬 수 있다. 이 방법은 목적하는 폴리펩티드를 발현시키는 세포주를 생성하는데 사용하기에 이로울 수 있다.
예를 들어, 갈락토스 프로모터에 의해 유도되는, 본 발명의 방법에 사용되는 다양한 서열의 발현은, 갈락토스의 첨가 이후에 매우 빠르게 유도되도록 배양물에서 비-억제성의 비-환원당을 증가시키고; 글루코스 배지에서 배양물을 증식시킨 후에 세포를 원심분리 및 세척하여 글루코스를 제거한 다음, 갈락토스 배지중에 재현탁시키고; 갈락토스 유도가 일어나기 전에 글루코스가 주로 대사되도록 글루코스 및 갈락토스 둘 다를 함유하는 배지에서 세포를 증식시켜 유도할 수 있다.
임의 수의 선별계를 사용하여 형질전환된 세포주를 회수할 수 있다. 이들로는 각각 tk-또는 aprf-세포에서 사용될 수 있는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 및 아데닌 포스포리보실-트랜스퍼라제 유전자가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다 (예를 들어, 문헌 (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223-32; Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-23) 참조). 또한, 선별 기준으로 항대사물질, 항생제 또는 제초제 내성을 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 선별 마커, 예를 들어 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr; 아미노글리코시드 네오마이신 및 G-418에 대한 내성을 부여하는 npt; 및 각각 클로르술푸론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제에 대한 내성을 부여하는 als 또는 pat의 용도가 포함된다 (예를 들어, 문헌 (Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567-3570; and Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14) 참조).
다른 선별 유전자, 예를 들어 세포가 트립토판 대신 인돌을 이용할 수 있도록 하는 trpB 또는 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 이용할 수 있도록 하는 hisD가 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 (Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8047-51) 참조). 최근, 시각적 마커의 사용은 보편화되고 있으며, 안토시아닌, β-글루쿠로니다제 및 그의 기질인 GUS, 및 루시퍼라제 및 그의 기질인 루시페린과 같은 마커는 형질전환체를 확인하는데 뿐만 아니라 특정 발현계에 기인하는 일시적이거나 안정한 단백질 발현량을 정량하는데 널리 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Rhodes, C. A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55: 121-131) 참조).
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 제조 방법에 사용되는 발현 벡터는 통상적으로 세포에 대한 선택적인 표현형을 부여하는 마커 유전자를 포함할 수 있다. 일반적으로, 선별 마커 유전자는 항생제 내성을 코딩할 것이며, 적합한 유전자로는 항생제 스펙티노마이신, 스트렙토마이신 내성을 코딩하는 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제 (SPT) 유전자, 카나마이신 및 제네티신 내성을 코딩하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (NPTH) 유전자, 히그로마이신 내성 유전자, 아세토아세테이트 신타제 (ALS)의 작용을 억제하는 작용을 하는 제초제, 특히 술포닐우레아계 제초제에 대한 내성을 코딩하는 유전자 (예를 들어, S4 및(또는) Hra 돌연변이), 글루타민신타제의 작용을 억제하는 작용을 하는 제초제, 예를 들어 포피노트리신 (phophinothricin) 또는 바스타 (basta)에 대한 내성을 코딩하는 유전자 (예를 들어, bar 유전자), 또는 당업계에 공지된 다른 유사한 유전자 중 적어도 한 세트를 포함한다. bar 유전자는 제초제 basta에 대한 내성을 코딩하며, nptII 유전자는 항생제인 카나마이신 및 제네티신에 대한 내성을 코딩하며, ALS 유전자는 제초제 클로르술푸론에 대한 내성을 코딩한다. 형질전환 이후의 숙주 세포가 목적 폴리뉴클레오티드를 포함하는지를 결정하는 다른 방법으로는 당업계에 공지된 다양한 방법이 포함된다. 이러한 방법으로는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화를 포함한 핵산 혼성화, 및 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 검출 및(또는) 정량화를 위한 막-, 용액- 또는 칩-계 기술을 비롯한 다양한 단백질 생분석 또는 면역분석법을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 또는 유전자 산물을 목적하는 특정 방식으로 변형 및 처리하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형 (예를 들어, 글리코실화) 및 프로세싱 (예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 있어서 중요할 수 있다. 다른 숙주 세포는 단백질의 번역후 프로세싱 및 변형에 대한 특징적이고 특이적인 기작을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주계를 선택하여 발현되는 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장할 수 있다. 이를 위해, 단백질 폴딩, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 및 유전자 산물의 인산화와 같은 다양한 변형을 포함하여 일차 전사체의 적절한 프로세싱을 위한 세포 기작을 보유하는 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포로는 CHO,VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38 등이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
특이적 개시 신호를 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 번역을 보다 효율적으로 달성할 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 번역에 필요한 어떤 개시 또는 상류 서열 등과 함께 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열이 적절한 발현 벡터내에 삽입되는 경우, 추가의 전사 또는 번역 조절 신호는 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 단지 코딩 서열 또는 그의 일부만이 삽입되는 경우, ATG 개시 코돈을 포함하는 외생 번역 조절 신호가 제공되어야 한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입체의 번역을 보장하기 위해서는 정확한 리딩 프레임내에 있어야만 한다. 외생 번역 요소 및 개시 코돈은 다양한 기원의 것으로서 천연 및 합성에 의한 것일 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Bittner et al. (1987) Meth. in Enzymol. 153: 516-544) 참조).
본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 젤라틴 또는 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 이외에 번역후 효소를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴크레오티드로 감염, 트랜스펙션 또는 형질전환시킬 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 콜라겐 번역후 효소, 예를 들어 프롤릴 4-히드록실라제, 콜라겐 글리코실 트랜스퍼라제, C-프로테이나제, N-프로테이나제, 라이실 옥시다제 또는 라이실 히드록실라제를 코딩하는 것을 포함하며, 번역후 효소를 자연적으로 생성하지 않는 세포, 예를 들어 효모 세포, 또는 충분량의 번역후 효소를 자연적으로 생성하지 않을 수 있는 세포, 예를 들어 다양한 곤충 및 포유동물 세포에 삽입할 수 있으며, 외생 효소는 어떤 번역후 효과를 나타내는 것을 필요로 할 수있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 번역후 효소는 프롤릴 4-히드록실라제이며, 이 폴리뉴클레오티드는 프롤릴 히드록실라제의 α또는 β서브유닛을 코딩한다. 바람직한 실시양태에서, 프롤릴 4-히드록실라제 효소의 α또는 β서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포내에 삽입하여, 젤라틴 또는 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 공동 발현되는 생물학적으로 활성인 프롤릴 4-히드록실라제를 생성시킨다.
번역후 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 천연, 합성 또는 재조합의 임의 공급원으로부터 유도될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 번역후 효소는 생성되는 재조합 젤라틴과 동일한 종으로부터 유도된다. 한 실시양태에서, 생산되는 재조합 젤라틴은 인간 재조합 젤라틴이며, 번역후 효소는 인간 프롤릴 4-히드록실라제이다.
본 발명의 발현된 젤라틴 또는 젤라틴 전구체는 바람직하게는 배양 배지중으로 분비되어 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 균질하게 정제될 수 있다. 한 실시양태에서, 재조합 젤라틴 또는 젤라틴 전구체는 크기 배제 (size exclusion) 크로마토그래피에 의해 정제된다. 그러나, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 및 역상 크로마토그래피를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 당업계에 공지된 다른 정제 기술을 사용할 수도 있다 (예를 들어, 문헌 (Maniatis et al., supra ; Ausubel et al., supra ; and Scopes (1994) Protein Purification: Principes and Practice, Springer-Verlag New York, Inc., NY) 참조).
원핵생물
원핵생물계, 예를 들어 박테리아계에서, 발현되는 폴리펩티드에 대해 목적하는 용도에 따라 많은 발현 벡터 중 어떤 것을 선택할 수 있다. 예를 들어, 다량의 본 발명의 재조합 젤라틴 또는 이러한 재조합 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드가 다량 필요한 경우, 쉽게 정제할 수 있는 융합 단백질의 발현을 높은 수준으로 지시하는 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 벡터로는 다관능성 이. 콜라이 (E. coli) 클로닝 및 발현 벡터, 예를 들어 BLUESCRIPT (Stratagene)를 포함하지만 이에 한정되지는 않으며, 여기서 코딩 서열은 하이브리드 단백질이 생산되도록 β-갈락토시다제의 아미노 말단의 Met 및 이후의 7개의 잔기에 대한 서열과 함께 벡터, 즉 pIN 벡터 (Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509) 등의 프레임내에 라이게션할 수 있다. pGEX (Promega, Madison, Wis.) 및 pET (Invitrogen) 벡터를 사용하여 외래 폴리펩티드를 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)와 함께 융합 단백질로 발현시킬 수도 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 글루타티온-아가로스 비즈로의 흡착 이후에 유리 글루타티온의 존재하에 용출시켜 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. 이러한 계에서 제조된 단백질은 클로닝된 대상 폴리펩티드가 GST 잔기로부터 방출될 수 있도록 헤파린, 트롬빈 또는 인자 XA 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계할 수 있다.
효모
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 효모 발현계를 사용한 재조합 젤라틴의제조 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 젤라틴은 변형된 콜라겐 구조물로부터 직접 제조되거나 또는 콜라겐성 폴리펩티드의 프로세싱으로부터 유도된다. 구성적, 비구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 많은 벡터를 효모계에서 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Ausubel et al., supra, Chapter 13) 참조). 어떤 측면으로, 염색체로 DNA 통합을 지시하는 서열을 포함하는 벡터가 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)에서의 발현에 사용된다.
한 실시양태에서, 효모 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)로부터의 숙주 세포를 사용하여 본 발명의 재조합 젤라틴 또는 이러한 젤라틴이 유도될 수 있는 폴리펩티드를 발현시킨다. 사카로마이세스 세레비지애는 α인자, AOX, GAL1-10 및 PGH와 같은 구성 프로모터 또는 유도 프로모터를 함유하는 다수의 벡터를 비롯하여 당분야에 사용되는 많은 발현 벡터 중 임의의 벡터와 함께 사용할 수 있다 [상기 문헌 (Ausubel et al.) 및 문헌 (Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544)]. 통상적으로 사용되는 발현 벡터는 외부 유전자의 효율적인 전사를 위한 효모 프로모터 및 터미네이터를 포함하는, 효모에서 증식하기 위한 2 μ복제 기점, 및 이. 콜라이에서 증식하기 위한 ColE1 복제 기점을 함유하는 셔틀 벡터이다. 2 μ플라스미드를 포함하는 벡터에는 2 μORI-STB 요소, GAL1-10 등을 갖는 pWYG4 및 pYES2가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 목적하는 생성물이 수산화 생성물인 본 발명의 한 방법은 콜라겐 번역후 효소, 예를 들어, 프롤릴 4-히드록실라제의 동시발현을 수반한다. 상기 방법에서, pWYG4 벡터를 사용하는 경우, NcoI 클로닝 부위를 사용하여 프롤릴 4-히드록실라제의 α또는 β서브유닛의 유전자를 삽입하고 상기 α서브유닛 또는 β서브유닛에 대한 ATG 개시 코돈을 제공한다. 한 방법에서, 숙주의 염색체 내로 직접 삽입되는 발현 플라스미드가 사용된다.
무손상 2α ORI, STB, REP1 및 REP2, GAL7 프로모터 및 FLP 터미네이터가 있는 발현 벡터 pWYG7L도 사용할 수 있다. 번역후 효소, 예를 들어, 프롤릴 4-히드록실라제의 동시발현을 원하는 경우, 프롤릴 4-히드록실라제의 α또는 β서브유닛의 유전자를 BamHI 또는 NcoI 부위에 5' 말단이 있는 폴리링커 내로 삽입한다. 프롤릴 4-히드록실라제 유전자를 함유하는 벡터는 세포벽을 제거하여 칼슘 및 폴리에틸렌 글리콜로 처리하거나 리튬 이온으로 무손상 세포를 처리할 때 DNA를 받아들이는 스페로플라스트를 만들기 전 또는 만든 후에 사카로마이세스 세레비지애 내로 형질전환시킨다. 별법으로, DNA는 일렉트로포레이션으로 도입시킬 수 있다. 형질전환체는 LEU2, TRP1, URA3, HIS3 또는 LEU2-D와 같은 선별 마커 유전자와 함께 류신, 트립토판, 우라실 또는 히스티딘에 대한 영양요구성 숙주 효모 세포를 사용하여 선별할 수 있다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 재조합 젤라틴의 제조 방법은 재조합 단백질을 고수준으로 대량 생산하는 데 유리한 효모 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 또는 비-사카로마이세스 효모의 다른 종으로부터 유래된 숙주 세포를 사용한다. 피키아 발현 시스템은 원핵세포 (예를 들어, 이. 콜라이) 발현 시스템 (고수준 발현, 용이한 대량 생산 및 저렴한 생장) 및 진핵세포 발현 시스템 (단백질 프로세싱, 폴딩 및 번역후 변형) 둘다의 장점을 갖는다. 이러한 발현 시스템은 당업자가 사용할 수 있는 다양한 방법 및 키트, 예를 들어, 인비트로겐 코포레이션 (San Diego, CA)으로부터 시판되는 피키아 발현 키트를 사용하여 제작할 수 있다.
피키아 파스토리스 또는 피키아 메탄올리카 등과 같은 메틸로트로픽 (methylotrophic) 효모에는 다수의 메탄올 반응 유전자가 있고, 이들 각각의 발현은 메탄올 반응 조절 영역 (프로모터로도 불림)에 의해 조절된다. 이러한 메탄올 반응 프로모터 중 임의의 프로모터도 본 발명의 실시에 사용하기에 적합하다. 특정 조절 영역의 예로는 피키아 파스토리스의 1차 알코올 옥시다제 유전자 AOX1에 대한 프로모터, 피키아 파스토리스의 2차 알코올 옥시다제 유전자 AOX2에 대한 프로모터, FLD1 프로모터, 피키아 파스토리스의 디히드록시아세톤 신타제 유전자 (DAS)에 대한 프로모터, P40 유전자에 대한 프로모터 등이 포함된다. 대표적으로, 엄격히 조절되는 AOX1 유전자의 프로모터로 피키아 파스토리스에서의 발현을 달성하였다 (Ellis et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 1111; 미국 특허 제4,855,231호). 구성 발현은 예를 들어, GPH 프로모터를 사용하여 달성할 수도 있다.
본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 또다른 효모 발현 시스템은 메틸로트로픽 효모 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha)를 사용한다. 이 시스템은 예를 들어, 고수율을 원하는 본 발명의 제조 방법에 사용할 수 있다. 메탄올을 사용한 생장은 MOX (메탄올 옥시다제), DAS (디히드록시아세톤 신타제) 및 FMHD (포르메이트 데히드로게나제)와 같은 핵심 효소를 유도시킨다. 이들 효소는 전체 세포 단백질의 30-40%를 구성할 수 있다. MOX, DAS 및 FMDH의 생산을 코딩하는 유전자는 메탄올을 사용한 생장에 의해 유도되고 글루코스를 사용한 생장에 의해 억제되는 강력한 프로모터에 의해 조절된다. 이들 프로모터 중 어느 것 또는 이들 3가지 프로모터 모두 당분야에 공지된 방법에 따라 한세눌라 폴리모르파에서 이종 서열을 고수준으로 발현시키는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 한 방법에서, 코딩 폴리뉴클레오티드를 한세눌라 폴리모르파 유도 프로모터의 조절 하에 발현 벡터 내로 클로닝한다. 생성물의 분비를 원하는 경우, 효모에서 분비시키기 위한 신호 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, MFα1을 본 발명의 폴리펩티드에 대한 코딩 서열과 인-프레임으로 융합시킨다. 발현 벡터는 바람직하게는 URA3 또는 LEU2와 같은 영양요구성 마커 유전자, 또는 영양요구성 숙주의 결핍을 보충하는 데 사용할 수 있는, 당분야에 공지된 임의의 다른 마커를 함유한다. 별법으로, 제오신 또는 블라스타신과 같은 우성 선별 마커를 사용할 수 있다.
그 다음으로, 발현 벡터는 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 한세눌라 폴리모르파 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용한다. 한세눌라 폴리포파 형질전환의 흥미롭고 유용한 특징은 100 카피 이하의 발현 벡터가 게놈 내로 자연적으로 삽입된다는 점이다. 대부분의 경우, 삽입된 서열은 헤드-투-테일 배열을 나타내는 멀티머를 형성한다. 삽입된 외부 DNA는 비-선별 조건 하에서 조차도 여러 재조합 균주에서 유사분열시 안정한 것으로 밝혀졌다. 이러한 고카피 삽입 현상은 이 시스템에 생산성 잠재력을 부가한다.
식물
본 발명은 식물 숙주 세포 및 형질전환 식물을 비롯한 식물 발현 시스템에서 본 발명의 재조합 젤라틴, 또는 이 재조합 젤라틴으로부터 유도될 수 있는 폴리펩티드를 생산하는 것도 고려한다 (Transgenic Plants: A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins, Owen and Pen, eds., John Wiley & Sons, 1996; Transgenic Plants, Galun and Breiman, eds., Imperial College Press, 1997; and Applied Plant Biotechnology, Chopra et al. eds., Science Publishers, Inc., 1999). 식물 발현 벡터를 사용하는 경우, 서열의 발현은 다수의 프로모터 중 임의의 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터를 단독으로 사용하거나 TMV의 오메가 리더 서열과 함께 사용할 수 있다 (Brisson et al. (1984) Nature 310: 511-514; and Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6: 307-311). 식물 발현 벡터 및 레포터 유전자는 일반적으로 당분야에 공지되어 있다 (Gruber et al. (1993) in Methods of Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press).
별법으로, RUBISCO 또는 열충격 프로모터의 작은 서브유닛, 예컨대, 대두 hspl7.5-E 또는 hspl7.3-B와 같은 식물 프로모터를 사용할 수 있다 (Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224: 838-843; Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105; and Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 559565). 이들 제작물은 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접적인 DNA 형질전환, 미세주입, 일렉트로포레이션, 병원체-매개 형질감염, 입자 충격 (bombardment), 또는 통상적으로이용가능한 다수의 문헌 (Hobbs, S. or Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N. Y., pp. 191-196; Weissbach and Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463; and Grierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9)에 기재된 방법과 같은 당분야에 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여 식물 세포 내로 도입할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 젤라틴, 또는 본 발명의 재조합 젤라틴으로부터 유도될 수 있는 폴리펩티드는 예를 들어, 캐놀라, 옥수수, 대두, 벼 및 보리 종자를 사용하는 이용가능한 종자-기재 생산 기술을 이용하여 종자로부터 생산한다. 이러한 실시양태에서, 상기 단백질은 종자 발아 / 탈피 과정 동안 회수한다. 다른 실시양태에서, 상기 단백질은 젤라틴을 추출하지 않고 식물 자체를 예컨대, 단백질의 공급원과 같은 식이 보충물로 사용할 수 있도록 식물의 배유 또는 다른 부위 내로 직접 발현시킨다.
폴리뉴클레오티드를 직접 발현시키는 데 사용할 수 있는 프로모터는 이종 프로모터 또는 비-이종 프로모터일 수 있다. 이들 프로모터는 원하는 경우 안티센스 핵산의 발현이 감소되거나, 증가되거나, 또는 바뀌도록 하는 데 사용할 수도 있다. 식물 또는 식물 세포에서 서열의 전사를 증가시키고(거나) 최대화시키기 위한 다른 변형은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열은 코딩된 폴리펩티드의 전사 속도를 변화시키는 하나 이상의 인자, 예컨대, 펩티드 엑스포트 (export) 신호 서열, 코돈 사용법, 인트론, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 부위도 포함할 수 있다. 식물에서 발현도를 증가시키기 위해 핵산 제작물을 변형시키는 방법은 당분야에 잘 공지되어 있다 (Rogers et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 3731; Comejo et al. (1993) Plant Mol Biol 23: 567-568). 폴리뉴클레오티드의 전사 속도에 영향을 주는 식물 시스템을 조작하는 데 있어서, 긍정적으로 작용하거나 부정적으로 작용하는 서열과 같은 조절 서열, 인핸서 (enhancer) 및 사일렌서 (silencer), 크로마틴 구조 등을 비롯하여 당분야에 공지되어 있는 다수의 인자를 사용할 수 있다.
식물에서 외부 유전자의 발현에 유용한 대표적인 벡터는 당분야에 잘 공지되어 있고, 이 벡터에는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 종양-유도 (Ti) 플라스미드로부터 유래된 벡터가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 이들 벡터는 형질전환시 DNA의 일부가 숙주 식물의 게놈 내로 삽입되는 식물 삽입 벡터이다 (Rogers et al. (1987) Meth. In Enzymol. 153: 253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61: 1-11; and Berger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 8402-8406).
식물 세포를 형질전환하는 방법은 당분야에 공지되어 있고, 이 방법에는 예를 들어, 직접적인 유전자 전달법, 시험관내 원형질체 형질전환법, 식물 바이러스 - 매개 형질전환법, 리포좀 - 매개 형질전환법, 미세주입, 일렉트로포레이션, 아그로박테리움 - 매개 형질전환법 및 발사 입자 가속화법이 포함된다 (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722; 미국 특허 제4,684,611호; 유럽 출원 제0 67 553호; 미국 특허 제4,407,956호; 미국 특허 제4,536,475호; Crossway et al.(1986) Biotechniques 4: 320-334; Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 5602-5606; Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6: 915-921; 및 미국 특허 제4,945,050호). 벼, 밀, 옥수수, 사탕수수 및 보리의 표준 형질전환 방법은 문헌 (Christou et al. (1992) Trends in Biotechnology 10: 239; Casas et al. (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 11212; Wan et al. (1994) Plant Physiol. 104: 37 ; and Lee et al. (1991) Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 88: 6389)에 기재되어 있다. 밀은 옥수수 또는 벼를 형질전환시키는 데 사용되는 기술과 유사한 기술로 형질전환시킬 수 있다 (Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8: 833; 및 상기 Gordon-Kamm et al.).
본 발명의 재조합 젤라틴, 또는 이들 재조합 젤라틴으로부터 유도될 수 있는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 식물 또는 식물 세포를 발생시키는 데 사용할 수 있는 다른 방법은 당분야에 잘 확립되어 있다 (미국 특허 제5,959,091호; 미국 특허 제5,859,347호; 미국 특허 제5,763,241호; 미국 특허 제5,659,122호; 미국 특허 제5,593,874호; 미국 특허 제5,495,071호; 미국 특허 제5,424,412호; 미국 특허 제5,362,865호; 및 미국 특허 제5,229,112호).
본 발명은 재조합 젤라틴, 또는 이들 재조합 젤라틴으로부터 유도될 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 또는 식물 세포로부터 얻은 바이오매스를 제공함으로써 폴리펩티드를 생산하는 방법도 제공하는데, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드의 발현에 영향을 주는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 추가 실시양태에서, 상기 방법은 번역후 변형을 촉매하는 효소 또는 그의 서브유닛을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 동시발현도 포함하는데, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 이들 방법에서, 재조합 젤라틴 또는 콜라겐성 폴리펩티드는 상기 바이오매스로부터 추출한다.
진균
사상 진균도 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 데 사용할 수 있다. 사상 진균에서 재조합 단백질을 발현하고(하거나) 분비하기 위한 벡터는 당분야에 잘 공지되어 있고, 당업자는 당분야에서 이용가능한 방법 및 제품을 사용하여 본원에 언급된 방법에서 이들 벡터를 사용할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,834,191호 참조).
곤충
곤충 세포 시스템은 본 발명의 폴리펩티드를 대량 생산할 수 있는 시스템이다. 한 곤충 세포 시스템에서, 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica)핵 폴리헤드론형성 바이러스 (AcNPV)는 예를 들어, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아 (Trichoplusia) 유충에서 외부 유전자를 발현하기 위한 벡터로 사용한다. 본 발명의 젤라틴 또는 젤라틴 전구체를 코딩하는 서열을 바이러스의 비-필수 영역, 예를 들어, 폴리헤드론 유전자 내로 클로닝하여 AcNPV 프로모터, 예컨대, 폴리헤드론 프로모터의 조절 하에 둘 수 있다. 코딩 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드론 유전자를 불활성화시키고 폐색되지 않은 재조합 바이러스 (즉, 폴리헤드론 유전자에 의해 코딩되는 단백질코트가 없는 바이러스)를 생산시킬 것이다. 그 다음으로, 이들 재조합 바이러스를 사용하여 스포도프테라 프루기페르다 세포 또는 트리코플루시아 유충을 감염시키는데, 상기 세포 또는 유충에서 젤라틴 또는 젤라틴 전구체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현된다 (Engelhard, E. K. et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 3224-3227; Smith et al. (1983) J. Virol. 46: 584; 및 미국 특허 제4,215,051호). 이 발현 시스템의 다른 예는 예를 들어, 상기 문헌 (Ausubel et al. (1995))에서 찾을 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어, 필수 효소일 수 있는 임의의 번역후 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 비롯한 적당한 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 바큘로바이러스 벡터로 곤충 세포를 감염시켜 곤충 세포에서 재조합 생산할 수 있다. 바큘로바이러스는 곤충 세포에서 다양한 재조합 단백질을 대량 생산하는 데 매우 효율적인 발현 벡터이다. 당분야에 공지되어 있는 다양한 방법을 이용하여 본 발명의 젤라틴 또는 젤라틴 전구체를 코딩하는 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 함유하는 발현 벡터를 제작할 수 있다 (Luckow et al. (1989) Virology 170: 31-39; and Gruenwald, S. and J. Heitz (1993) Baculovirus Expression Vector System: Procedures & Methods Manual, Pharmingen, San Diego, CA.).
동물
본 발명은 본 발명의 재조합 젤라틴, 또는 이 재조합 젤라틴으로부터 유도될 수 있는 폴리펩티드를 동물 시스템에서 발현시키는 방법을 제공한다. 이러한 시스템에는 포유동물 및 비-척추동물 숙주 세포 및 형질전환 동물이 포함된다. 포유동물 숙주 세포에서, 다수의 발현 시스템을 사용할 수 있다. 아데노바이러스를 발현 벡터로 사용하는 경우, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 후기 프로모터, 및 3 부분으로 나누어진 리더 서열로 구성된 아데노바이러스 전사/번역 결합체와 라이게이션시킬 수 있다. 그 다음으로, 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 E1 또는 E3 영역 내로 삽입시켜 감염된 숙주 세포에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 생존가능한 바이러스를 얻을 수 있다 (Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659). 별법으로, 백시니아 7.5 K 프로모터를 사용할 수 있다 (Mackett et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419 (1982); Mackett et al. (1984), J. Virol. 49: 857-864; and Panicali et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931). 또한, 당분야에 공지되어 있는 다양한 전사 인핸서, 예컨대, 로우스 육종 바이러스 (RSV) 바이러스를 사용하여 예컨대, 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 증가시킬 수 있다.
포유동물 세포주의 감염이 가능할 정도로 넓은 숙주 범위를 갖는 바이러스인 셈리키 포레스트 바이러스 (Semliki Forest virus)가 바람직한 발현 시스템이다. 이러한 바이러스 벡터를 사용하여 포유동물 숙주 세포, 예를 들어, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포 및 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포를 감염시키면 재조합 발현도가 매우 높아질 수 있다. 보다 구체적으로, 셈리키 포레스트 바이러스 시스템은 염색체 삽입을 토대로 한 시스템이 아니기 때문에 광범위한 숙주에 사용할 수 있으므로, 구조-기능 관계를 확인하는 것이 목적인 연구에서 재조합 젤라틴을 변형시키기고 다양한 하이브리드 분자의 효과를 시험하는 빠른 방법일 것이다. 포유동물 숙주 세포에서 외부 단백질을 발현시키기 위한 셈리키 포레스트 바이러스 벡터를 제작하는 방법은 당분야에 공지되어 있고 예컨대, 문헌 (Olkkonen et al. (1994) Methods Cell Biol 43: 43-53)에 기재되어 있다.
또한, 디히드로폴레이트 리덕타제 (dhfr) 유전자가 결핍된 CHO 세포는 dhfr 유전자를 함유하는 발현 플라스미드 및 원하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시킬 수 있다. 증가된 농도의 메토트렉세이트에 대한 내성을 나타내는 CHO 세포를 선별하여 당분야에 공지되어 있는 바와 같이, 원하는 재조합 단백질의 더 높은 발현도를 제공하는 유전자 증폭을 수행할 것이다.
형질전환 동물 시스템도 본 발명의 재조합 젤라틴, 또는 이들 재조합 젤라틴으로부터 유도될 수 있는 폴리펩티드를 발현시키는 데 사용할 수 있다. 이러한 시스템은 프로모터, 및 유선에서의 발현에 영향을 줄 수 있는 다른 필요한 조절 서열 또는 임의적 조절 서열에 코딩 폴리펩티드를 작동가능하게 연결시킴으로써 예컨대, 포유동물에서 제작할 수 있다. 마찬가지로, 번역후 변형에 영향을 주는 필요한 번역후 효소 또는 임의적 번역후 효소는 적당한 발현 시스템을 사용하여 표적 세포에서 동시에 생산할 수 있다. 형질전환 동물을 사용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법은 당분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,736,866호; 미국 특허 제5,824,838호; 미국 특허 제5,487,992호; 및 미국 특허 제5,614,396호; 및 공동계류 중인 미국 출원 제08/987,292호 참조).
젤라틴의 용도
젤라틴은 다양한 제약 및 의학 제품과 장치의 제조에서, 또는 상기 제품 및 장치의 성분으로서 사용된다. 약 85%의 제약 제품이 다양한 제품, 예를 들어, 제약 안정화제, 혈장 증량제, 스펀지, 경질 및 연질 젤라틴 캡슐, 좌약제 등에 현재 사용되는 소의 젤라틴을 비롯한, 몇몇 형태로 소-유래 물질을 함유하는 것으로 추정된다. 젤라틴 피막형성 능력은 조절 방출형 캡슐제 및 정제를 비롯한 제약 경구 고상물 투여 형태, 및 젤라틴이 투여 및 전달 등의 용이함을 개선시키기 위한 코팅제로 사용되는 다른 다수의 제약 제품을 위해 특정하게 디자인된 다양한 피막 코팅 시스템에 이용된다. 젤라틴은 예를 들어, 제약 산업, 예컨대, 약물 및 백신, 식품 및 음료 제품과 공정, 공업 분야, 예컨대, 콘크리트 안정화에 있어서 다양한 형태의 안정화제로, 그리고 다양한 연구용 용액, 예컨대, 다양한 세포 제제의 안정화제로 작용하는 것 같다.
다양한 식용 형태의 젤라틴은 식품 및 음료 산업에서 오랫동안 사용되어 왔다. 젤라틴은 다양한 제과 제품 및 디저트 제품, 특히 푸딩, 프로스팅, 크림속, 유제품 및 동결 제품에 널리 사용되고 있다. 젤라틴은 다양한 휩 (whip) 토핑뿐만 아니라 수프 및 소스에 있어서 유화제 및 증점제로 사용된다. 젤라틴은 와인 및 과일 쥬스를 비롯한 다양한 음료를 정화하거나 정제하는 데 있어서 응집제로 사용된다. 젤라틴은 증점제 및 안정화제로서 마요네즈 및 샐러드 드레싱과 같은 다양한 저지방 제품 및 지방이 감소된 제품에 사용되고, 다른 경우에는 지방 대용물로 사용된다. 젤라틴은 향미제, 색소 및 비타민의 마이크로캡슐화에도 널리 사용된다. 또한, 젤라틴은 체중 감량 및 운동 산업에서 유행하는 다양한 고에너지 및 영양 음료 및 식품에서 단백질 보충물로서 사용할 수 있다. 젤라틴은 피막형성제로서 과실, 고기, 조제 제품, 및 다양한 제과 제품 (캔디 및 검 등을 포함함)을 코팅하는 데 사용된다.
젤라틴은 화장품 산업의 다양한 두발 보호 및 피부 보호 제품에서 사용할 수 있다. 젤라틴은 다수의 샴푸, 무스, 크림, 로션, 안면 마스크, 립스틱, 매니큐어 용액 및 제품, 및 다른 화장용 장치 및 연고에서 증점제 및 증점제로 사용된다. 또한, 젤라틴은 화장품 산업에서 다양한 제품의 마이크로캡슐화 및 포장에 사용한다.
젤라틴은 넓은 범위의 산업 분야에서 사용한다. 예를 들어, 젤라틴은 다양한 제조 공정에서 아교 및 접착제로서 널리 사용된다. 젤라틴은 재가습될 수 있는 고무질 종이 포장 테이프의 제조, 아교를 사용한 목재 접착, 다양한 등급의 상자판과 종이의 종이 결합, 및 재가습에 의해 재활성화될 수 있는 접착 표면을 제공하는 다양한 분야와 같은 다양한 접착제 및 아교 제제에 사용할 수 있다.
젤라틴은 다양한 전자 장치에서 감광성 코팅제로 작용하고 다양한 사진 석판술, 예를 들어, 칼라 텔레비젼 및 비디오 카메라 제조에서 포토레지스트 베이스로 사용된다. 반도체 제조에 있어서, 젤라틴은 납 구조물의 제작 및 다양한 반도체 요소의 코팅에 사용된다. 젤라틴은 다양한 인쇄 공정 및 특수한 질의 종이, 예컨대, 보증 및 공채 증서 등에 사용되는 종이의 제조에 사용된다.
젤라틴이 사진 분야에 사용된지는 오래되었다. 젤라틴은 X-선 및 사진 필름현상에 사용되는 용액을 비롯한 사진 용액에서 다양한 활성 성분의 캐리어로 사용된다. 다양한 사진제판술에 오랫동안 사용되어 온 젤라틴은 다양한 유형의 필름의 성분으로서도 포함되고, 다중층 필름 및 종이 제품의 할로겐화은 화학반응에 주로 사용된다. 은 젤라틴 필름은 마이크로필름 카드의 형태 및 정보 저장물의 다른 형태로 사용된다. 젤라틴은 다양한 필름의 자가-밀봉 요소 등으로 사용된다.
젤라틴은 다양한 연구 분야에 사용되는 가치있는 물질이기도 하다. 예를 들어, 젤라틴은 세포 부착 및 생장에 적합한 표면, 예를 들어, 플레이트, 플라스크, 마이크로-비즈 또는 다른 기재에 대한 코팅 표면을 제공하거나, 생장 배지에서 적당한 단백질 공급원을 제공한다. 가수분해되거나 겔 강도가 낮은 젤라틴은 다양한 공정, 예를 들어, 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA) 및 다른 면역분석과 같은 분석에 사용되는 코팅 및 블로킹 용액에서 생물학적 완충액으로 사용된다. 또한, 젤라틴은 효소사진 겔을 비롯한, 생화학적 분석 및 전기영동 분석에 사용되는 다양한 겔의 성분이다.
제약물
본 발명은 다양한 제약 분야 및 의학 분야에서 재조합 젤라틴을 사용하는 것도 고려한다. 특히, 한 실시양태에서, 본 발명은 재조합 젤라틴을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 인간 공급원으로부터 유래된다. 본 발명의 재조합 젤라틴은 이전에 당분야에서 얻을 수 없었던 이점, 즉 천연 인간 콜라겐 서열로부터 유도된 젤라틴을 사용하여 젤라틴 재료에 대한 면역원성이 일어날 위험을 감소시킨다는 이점을 제공한다. 또한, 본 발명의 젤라틴은 조절된 환경 하에서 재조합 생산되기 때문에, 프로세싱 동안에 TSE와 같은 물질 또는 병원체 및 내독소로 감염될 위험이 최소화된다.
시판되는 젤라틴의 내독소 함량은 전형적으로 젤라틴 1 mg 당 약 1.0 내지 1.5 EU이다 (Schaegger, H. and G. von Jagow (1987) Anal. Biochem. 166: 368-379; Friberger, P. et al. (1987) in "Detection of Bacterial Endotoxins with the Limulus Ameobocyte Lysate Test,"Prog. Clin. Biol. Res. 231: 149-169). 본 발명의 방법에서, 내독소 함량은 그 크기가 2 내지 3 차수만큼 감소될 수 있다 (실시예 8 참조). 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 실질적으로 내독소가 없는, 인간 공급원으로부터 유래된 재조합 젤라틴을 제공한다.
동물-유래 물질과 관련된 면역원성 및 감염성의 문제가 없이 젤라틴을 제공하는 것 이외에, 본 발명은 생산물을 일정하게 재생산가능한 공급원을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 젤라틴은 동일한 분자의 균일한 혼합물로서 제공할 수 있다. 특히, 의학 분야에서 요구되는 물리적 특징이 구체적으로 도입되어 일관되게 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 현재의 젤라틴 제품의 유용성 및 용도와 관련된 변화성을 최소화하기 위해 믿을 수 있고 일관된 제품을 제공할 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 재조합 젤라틴은 전형적으로 젤라틴 용액으로부터 제조되는 경질 외피 또는 경질 캡슐, 및 전형적으로 젤라틴 피막으로부터 제조되는 연질 외피 또는 연질 캡슐을 비롯한 캡슐의 제조에 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시양태에서, 재조합 젤라틴을 포함하는 경질 겔 캡슐, 및 재조합 젤라틴을 포함하는 연질 겔 캡슐, 및 이들 캡슐을 제조하는 방법이 제공된다.젤라틴의 열가역성은 많은 분야, 예를 들어, 상기와 같은 겔 캡슐 및 정제의 제조에서 이용되는 성질이다. 젤라틴은 경우에 따라 열 처리되거나, 성형되거나, 형상화되고, 항산성 온도에서 독특한 성질을 나타내는 캡슐 또는 정제 코팅을 형성하는 데 사용할 수 있다. 선택된 젤라틴은 구강 온도에서 녹기 시작하여 삼키기 쉽고, 위 내의 온도와 같은 체내 온도에서 액체가 된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 시판되는 캡슐 및 코팅물의 용해 속도를 나타내는 재조합 젤라틴을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 캡슐 및 정제에 사용하기에 적합한 개선된 탄성을 나타내는 재조합 젤라틴을 제공한다.
겔 캡슐의 제조와 같은 일부 분야에서, 시간이 지남에 따라 젤라틴에 의해 발생되는 취성 (brittleness) 및 경성 (hardness)은 시판되는 동물-공급원 유래의 젤라틴의 유효 기간 및 유용성을 제한할 수 있는 중요한 파라미터이다. 장기간에 걸쳐 점성을 유지하는 능력은 특히, 현재 상당한 크기의 무더기로 젤라틴을 구입하는, 젤라틴-함유 제품의 제조자들이 제조된 제품의 일관성을 유지하는 데 유용한 성질일 수 있다. 또한, 경질 겔 캡슐의 제조와 같은 일부 제조 공정은, 타입 B 젤라틴만을 사용하면 예를 들어, 제조하고 사용하는 데 너무 부서지기 쉬운 경질 겔 캡슐이 만들어지기 때문에, 원하는 성질을 나타내는 물질을 생산하기 위해 젤라틴 타입의 혼합물 예를 들어, 타입 A 젤라틴과 타입 B 젤라틴의 혼합물을 필요로 한다.
본 발명의 재조합 젤라틴은 현재 시판되는 젤라틴보다 순도가 더 높고 더 우수한 특성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 젤라틴은 안정하며 그의 거동에 있어서보다 더 재현가능하고 예측가능한 물질을 제공할 수 있다. 또한, 당업자는 본 발명의 방법을 이용하여 단일 분자 또는 특징이 잘 규명되어 있는 분자 혼합물에서 두 타입의 젤라틴의 구조적 특징을 갖는 재조합 젤라틴을 생산할 수 있다.
본 발명의 재조합 젤라틴은 다양한 제약 제품, 예를 들어, 약물 또는 백신의 안정화제로 사용할 수도 있다 (예를 들어, 공동계류중인 미국 특허 출원 제 호, 제목: "Recombinant Gelatins in Vaccines," 참조 (2000년 11월 10일 출원; 그 전체 내용이 본원 명세서에 포함되는 것으로 함). 그러므로, 한 실시양태에서, 본 발명은 재조합 젤라틴을 포함하는 안정화제를 제공하는데, 여기서, 상기 안정화제는 제약 분야에 사용하기에 적합하다. 바람직한 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 재조합 인간 젤라틴이다.
다양한 콜라겐의 여러 영역이 다양한 활성과 관련되어 있는데, 예를 들어, 타입 III 콜라겐의 다양한 영역은 응고 캐스캐이드에 관여하는 활성 부위와 관련되어 있다. 그러므로, 한 실시양태에서, 본 발명은 특정한 콜라겐(들)의 특정한 활성 부위를 함유하는 재조합 젤라틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것을 고려한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 다양한 방식, 예를 들어, 마이크로어레이로 사용할 수 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 샘플 중에서 원하는 콜라겐성 도메인에 상응하는 mRNA 폴리뉴클레오티드의 변화된 결합을 확인하는 진단 수단으로 사용할 수 있다. 코딩된 폴리펩티드는 특정한 콜라겐성 도메인과 관련된 활성 및(또는) 발현을 억제하거나 상승시킬 수 있는 약물 또는 화합물을 스크리닝하는 다양한 방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 젤라틴은 마이크로캡슐화를 비롯한 캡슐화, 및 정제, 좌약제 및 다양한 의약 에멀젼에 사용할 수도 있다. 본 발명은 본원에 제공된 재조합 젤라틴을 의료용 스펀지, 예를 들어, 항산성 스펀지 등, 상처 치료 및 다양한 외과 분야, 예를 들어, 태아경 검사 및 다른 방법으로 출입구를 제거한 후 누출을 방지하기 위해 사용되는 스펀지에 사용하는 것도 고려한다. 그러므로, 한 측면에서, 본 발명은 재조합 젤라틴을 포함하는 스펀지를 포함하는데, 여기서, 상기 스펀지는 의료 처치에 사용하기에 적합하다. 바람직한 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 재조합 인간 젤라틴이다.
본 발명의 재조합 젤라틴은 특정한 분야에서 사용하기에 적합한 특정한 물성을 갖도록 디자인할 수 있다. 본 발명은 원하는 경우 특정한 성질을 갖는 젤라틴을 제조하여 현재 시판되는 젤라틴에서 얻을 수 없는 정도로 구매자를 만족시킬 수 있도록 하기 위해 분자량, 겔 강도, 및 최종 젤라틴 제제의 pH와 같은 특성을 변화시키는 방법도 제공한다. 또한, 이러한 젤라틴 제제는 구매자들이 기존 공정 및 제제를 개선시키기 위한 연구를 수행하도록 할 뿐만 아니라 본 발명의 재조합 젤라틴이 사용될 수 있는 새로운 분야를 개발하도록 한다.
백신의 제제에서 사용되는 젤라틴과 같은 시판되는 동물 유래의 가용성 젤라틴의 분자량 분포는 약 0 내지 30 kD 및 약 0 내지 60 kD이다 (실시예 7 및 9 참조). 본 발명은 시판되는 젤라틴과 상응하는 분자량 분포를 나타내고 동일한 목적을 위해 사용될 수 있는 재조합 인간 젤라틴을 적당한 가수분해 조건 하에서 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 시판되는 젤라틴으로부터는 얻을 수 없을정도로 분자량 분포가 더 좁은 젤라틴, 예를 들어, 분자량 분포가 약 10 내지 30 kDa 또는 약 30 내지 50 kDa의 젤라틴을 생산하는 방법도 제공한다.
본 발명의 재조합 젤라틴 및 그의 조성물은 직접적이고 지지적인 신경 재생을 위한 생분해성 도관; 주요 외과 수술에서의 콜로이드성 혈량 보충제; 다양한 출입구 부위, 예컨대, 카테터 삽입 부위 및 다른 절개 또는 상처의 봉합에 사용되는 젤라틴 스펀지 플러그; 내감염성 봉합제로서의 폴리에스테르 이식재를 비롯한 다양한 외과적 처치에서 사용될 수도 있다 (Mligilche, N. L. et al. (1999) East A & . Med. J. 76 (7): 400-406; Beyer et al. (1997) Br. J. Anaesth. 78 (1) : 4-50;
Luks et al. (1999) Am. J. Obstet. Gynecol. 181 (4): 995-996; and Farooq et al. (1999) J. Surg. Res. 87 (1) : 57-61).
본 발명의 제약 조성물을 대상체에게 투여하여 관절염, 연골 및 관절 유연성의 퇴화와 과련된 다른 질환을 비롯한 다양한 관절 질환을 치료할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 재조합 젤라틴은 보다 높은 농도의 아르기닌, 히드록시프롤린, 히드록시라이신, 및 연골에서의 콜라겐 및 프로테오글리칸의 생성과 관련된 다른 아미노산을 포함하는 변형 아미노산 서열을 함유한다 (Oesser et al. (1999) J. Nutr. 129 (10): 1891-1895). 본 발명의 젤라틴으로 합성된 마이크로스피어도 고려된다. 이러한 마이크로캡슐화된 입자는 예를 들어, 치료 단백질 또는 소분자의 간접적인 절단에 사용되어 비감염성 및 생체적합성 전달 시스템을 제공할 수 있다 (Brown et al., (1998) Arthritis Rheum, 41: 2185-2195). 또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 젤라틴을 경구 투여하여 류마티스성 관절염의 질환 활성을 완화시키는 것도 고려한다 (Arborelius et al. (1999) Rheumatol Int 18: 129-135). 섭취된 제약 제품의 경우, 위, 장 등의 산성 환경 하에서 분해에 대한 안정성을 나타내는 재조합 젤라틴을 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
캡슐화 기술, 다양한 제제 전달 시스템 및 다양한 약물 전달 시스템은 당분야에서 이용가능하고 다수의 문헌에 기재되어 있다 (Gennaro, A. R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18'h ed., Mack Publishing Co., Easton PA). 특정한 증상에 가장 효과적이고 편리한 투여 경루 및 가장 적합한 제제는 당분야에 공지된 방법으로 용이하게 결정할 수 있다.
적당한 투여 경로에는 예를 들어, 경구, 직장, 경점막, 또는 장 투여 및 비경구 전달 (근육내, 피하내, 척수내 주사뿐만 아니라, 경막내, 직접적인 심실내, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안내 주사를 포함함)이 포함될 수 있다. 백신은 예를 들어, 정맥내, 비강 또는 구강 전달할 수 있고 살아있는 독성약화 백신, 서브유닛 백신, 1가 백신, 2가 백신, 3가 백신 등의 형태를 취할 수 있다. 장 방출용 제제도 고려된다. 조성물은 전신 투여보다는 국소 투여할 수 있다. 본 발명은 분무 전달, 설하 또는 비강 전달에 적합한, 재조합 젤라틴을 포함하는 제약 조성물도 제공한다.
식품
식품 산업의 경우, 젤라틴의 물성 및 순수한 단백질 조성물은 젤라틴이 다양한 식용 제품 및 영양 보충물의 성분으로서 사용되는 것을 비롯하여 다양한 방식으로 사용되기에 적합하게 한다. 젤라틴은 그 자체가 탄수화물이 없는 순수한 단백질 공급원을 제공하는 식품일 수 있다. 또한, 젤라틴의 물리적 및 구조적 특성은 다양한 식품 제조 및 포장 분야에 유용하다. 예를 들어, 젤라틴은 겔화제 및 증점제; 유화제 및 발포제로 사용되고, 응고 또는 단백질-액체 분리를 방지하게 위해 사용되고, "촉감" 또는 일관성 및 질감을 개선시키기 위해 사용되고, 수분을 보유하기 위해 사용되고; 접착 및 포장, 예를 들어, 식용 필름으로 사용된다.
식용 젤라틴은 특히 순수한 단백질의 귀중한 공급원으로 작용할 수 있다. 그러므로, 한 측면에서, 본 발명은 재조합 젤라틴을 포함하는 단백질 보충물을 제공한다. 본 발명의 젤라틴은 예를 들어, 특정한 소정량의 필수 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명은 특정한 분야 또는 최종 생성물에 최적인 특징을 갖는, 겔, 박 또는 분말 형태의 다양한 식용 젤라틴의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 다양한 비율의 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 젤라틴 생성물을 제공한다. 전형적으로, 젤라틴은 예를 들어, 라이신, 아르기닌, 류신 및 이소류신을 비롯하여 인간에게 필수적인 대부분의 아미노산을 함유한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 특정한 비율의 원하는 아미노산을 포함하는 재조합 젤라틴을 제공한다. 예를 들어, 운동선수의 규정식을 보충하기 위한 식품에 사용되는 젤라틴은 근육 성장에 유익한 라이신과 같은 잔기, 및 근육 세포의 에너지 대사에 관여하는, 크레아틴의 전구체인 아르기닌을 보다 높은 함량으로 포함할 것이다. 젤라틴은 일반적으로, 다른 단백질 공급원, 예를 들어, 고기 및 유제품의 아미노산 조성을 완벽하게 하고 보강시킴으로써 식품의 영양 가치를 상승시킬 수 있다.
젤라틴은 최소한의 맛 또는 자극성이 적은 맛을 내므로, 입에 맞는 영양식품보충물로 작용할 수 있다. 가수분해된 젤라틴은 예를 들어, 디저트 및 캔디, 그리고 칼로리 함량이 감소된 기타 칼로리 식품에 있어서 보다 농축된 탄수화물 용액의 대용물로 사용한다. 젤라틴은 영양 가치가 높은 식품, 예를 들어, 규정식 산업에서 제조되는 저칼로리 식품 또는 고에너지 식품에서 단백질 공급원으로도 작용할 수 있다. 단백질 공급원으로 작용하는 것 이외에, 젤라틴은 예를 들어, 분무 또는 건조 즉석 식품 및 향미제에 있어서 탄수화물이 없는 캐리어 또는 충전제 물질로 작용하거나, 예를 들어, 와인 및 쥬스에 있어서 청정제 및 정화제로서 작용할 수 있다.
젤라틴이 예를 들어, 질감, 색상 및 투명도를 비롯한 바람직한 특성을 부여하는 능력은 그 가치가 매우 높다. 제품의 질감은 사용되는 성분의 타입, 제제 변화성, 및 제품이 가공되고 취급되는 방법에 주로 달려 있다. 제과 분야의 경우, 예를 들어, 젤라틴은 다양한 겔화 제품, 예컨대, 파스틸 (pastille) 및 일반적인 고무 제품에 사용된다. 젤라틴은 겔화제로 사용되어 연성 및 탄성부터 파삭파삭한 성질 및 경성까지 다양한 질감을 제공한다. 최종 생성물의 질감 및 입안 감촉은 사용된 젤라틴의 블룸 (bloom) 강도, 농도 및 제형에 달려 있다. 또한, 젤라틴의 콜로이드 성질은 색상 및 착색을 위한 기재를 제공하여 최종 생성물의 원하는 불투명도 또는 투명도뿐만 아니라 색상도 허용한다. 그러므로, 한 측면에서, 본 발명은 겔화된 제과 제품의 제조시 원하는 조직 성질, 광택 및 투명도를 제공하는 젤라틴의 사용을 가능케 한다. 한 측면에서, 점성도가 높은 젤라틴이 제조 과정동안 불량품을 생성시키는, 시럽을 침착시키는 바람직하지 못한 "테일링"을 발생시킬 수있기 때문에 점성도가 상대적으로 낮은 적합한 젤라틴을 선택한다. 일반적으로, 젤라틴의 블룸 값이 클수록 생성물의 경도가 더 높아지므로, 젤라틴의 함량이 증가되면 생성물의 질감은 더 딱딱하고 더 잘 씹히지 않게 된다.
예를 들어, 탄산으로 부풀려 구운 제과 제품의 생성에 널리 사용되는 젤라틴의 특성은 포말을 생성하고 지지하는 능력, 및 포획된 공기 버블 주위에 피막을 형성함으로써 공기/액체 계면에서 신속한 경화를 촉진하는 능력이다. 탄산으로 부풀려 구운 제품은 머쉬멜론, 프로스팅, 누가, 쿠기속 및 웨이퍼속을 비롯한 제과 제품의 큰 부류를 구성한다. 특정한 제품에 필요한 통기도 및 경화 시간은 최종 생성물의 젤라틴의 농도와 함께, 사용된 젤라틴의 타입 및 등급에 달려 있다. 사용된 젤라틴의 타입 및 비율을 변화시켜 탄산으로 부풀려 구운 제품의 질감을 바꿀 수 있다. 예를 들어, 블룸값 또는 겔 강도가 높은 젤라틴은 씹을 때 더 파삭파삭한 반면, 블룸값이 보다 낮은 젤라틴은 보다 높은 탄성 질감을 제공한다.
젤라틴은, 지방을 함유하며 다소 탄산으로 부풀려 구운 토피 및 카라멜과 같은 다른 슈가-뽑기 제과 제품 형태, 및 씹는 과일 제품의 제조에 있어서 많은 기능을 한다. 예를 들어, 젤라틴은 분산성 및 안정성을 향상시킴으로써 지방의 유화를 돕고, 바람직한 질감 및 저작성뿐만 아니라 발포성을 제공하고, 예컨대, 슈크로스 결정화를 조절함으로써 최종 생성물의 유효 기간에 기여한다. 전형적으로, 블룸값이 약 150 내지 200인 젤라틴이 0.5-1.5 중량%의 사용 함량으로 이들 제품에 사용된다. 그러므로, 한 측면에서, 본 발명은 식용 제품에 사용하기 위한, 블룸이 약 150 내지 200인 재조합 젤라틴을 고려한다.
젤라틴은 슈가 시럽에 분산된 분말 슈가 및 지방으로 구성된 고상 및 액상 둘다를 함유하는 크림 페이스트에서 점착 기질을 제공한다. 젤라틴은 푸석푸석한 질감을 방지하고 깨지는 것을 억제하기 위한 결합제로 작용한다. 젤라틴의 결합성은 로젠지 및 압축 정제에서도 활용된다. 감초와 같은 제품에서, 젤라틴은 종종 밀분과 같은 물질과 함께 혼합되어, 제조 과정동안 습기 보유성을 상당히 개선시키고 깨짐 및 부서짐을 막는 결합제로 작용한다. 또한, 젤라틴은 예를 들어, 감초와 같은 제과 제품이 저장 기간동안 건조되지 않도록 하여 제품의 유효 기간을 개선시킨다. 따라서, 본 발명은 한 실시양태에서, 식용 제품의 성분일 수 있는, 재조합 젤라틴을 포함하는 결합제를 제공한다. 또한, 본 발명은 식용 제품에 사용하기에 적합한, 재조합 젤라틴을 포함하는 보습제를 제공한다.
겔화된 제품은 슈가, 젤라틴, 산, 향미제 및 착색제가 용해되고 겔화된 즉석에서 먹을 수 있는 제품, 건조된 블렌딩 분말 혼합물 또는 정제를 비롯한 다양한 형태로 사용될 수 있다. 융점이 약 25-35℃인 탄성-질감의 열가역성 겔을 형성하는 젤라틴의 능력은 이러한 용도에서 활용된다. 이들 겔 제품의 최종 질감, 강도 및 경화율은 젤라틴의 농도 및 물성, 특히 블룸 강도 및 점성도에 의해 조절된다. 젤라틴 디저트의 제조에 있어서, 보다 높은 등급의 젤라틴을 보다 낮은 농도로 사용하여 특정한 강도의 겔화 제품을 제조하는 경우에는 보다 낮은 강도의 젤라틴을 보다 높은 농도로 사용한 경우와 비교할 때 경제적인 장점뿐만 아니라 향상된 투명도 및 현색능을 비롯한 장점이 제공된다. 그러므로, 한 실시양태에서, 본 발명은 식용 제품에 사용하기에 적합한, 재조합 젤라틴을 포함하는 겔화제를 제공한다.
젤라틴은 특정한 질감 및 입안 감촉이 요구되는 아이스크림, 요구르트 및 푸딩과 같은 다양한 유제품의 제조에 종종 사용되는데, 구체적으로, 젤라틴은 일관되게 매끄럽고 평평한 질감 및 크림과 같은 입안 감촉을 제공한다. 젤라틴은 저지방 마요네즈 및 샐러드 드레싱에서 증점제 및 안정화제로서 다른 히드로콜로이드와 함께 사용한다.
저지방 및 무지방 유제품의 수 및 요구도가 폭발적으로 증가하기 때문에, 젤라틴은 최종 제품의 제품 질감, 점성 및 입안 감촉에 현저한 기여를 할 수 있다. 젤라틴은 지방과 유사한 융용성을 나타내기 때문에, 융점이 약 25-35℃인 젤라틴은 바람직한 감각성 또는 "입안 내에서의 융용" 특성을 제공하여 완전-지방 제품의 질감을 자극한다.
건강을 의식하는 사회에서, 젤라틴은 저지방 또는 감소된 지방의 요구르트 제품 및 무지방 요구르트 제품에 있어서 점성 및 입안-촉감을 더해주고 지방의 부재 하에서 매끄럽고 부드럽고 크림 같은 질감을 생성시키는 안정화제로 사용하기에 매우 적합하다. 또한, 젤라틴은 액화 (syneresis), 또는 유장 단백질의 분리를 방해함으로써 이들 제품을 안정화시킨다. 이러한 면에서, 젤라틴 제품은 물에 결합하는 겔 네트워크를 형성함으로써 삼출 및 유장 단백질의 분리를 막아 제품의 유효 기간이 늘어나는 데 도움을 준다. 젤라틴은 젤라틴의 겔화성 및 유화성이 크림 점성을 증가시키는 데 사용되는 비후된 크림의 제조에도 사용한다. 또한, 젤라틴은 치즈케이크와 같은 시큼한 크림 연질 치즈 제품 및 산성 우유 디저트; 및 무스, 시퐁 및 수풀레와 같은 향기가 나는 우유-기재 디저트에서 널리 사용된다. 크림 점성도는 사용된 젤라틴의 농도 및 겔화성을 변화시킴으로써 원하는 만큼 변화시킬 수 있다. 이러한 용도를 위한 전형적인 젤라틴 함량은 0.2-0.8 중량%이지만, 이 보다 높거나 이 보다 낮은 겔 강도가 다양한 제품에서 바람직할 수 있다. 본 발명은 재조합 젤라틴을 포함하는 안정화제를 제공한다.
식품 및 건강 산업에서 지방 함량이 감소되었거나 지방이 없는 제품에 대한 요구는 증가하고 있다. 지방이 존재하지 않는 조건 하에 단백질을 제공하는 젤라틴의 능력을 비롯한 젤라틴의 영양학적 성질 때문에, 다이어트 산업뿐만 아니라, 특이식에 대한 민감성이 있거나 특이식을 필요로 하는 환자, 회복기 환자 및 개개인을 위해 디자인된 제품에서 젤라틴이 유용하다. 젤라틴의 단백질 함량은 탄수화물이 없는 영양학적 가치를 부여한다. 젤라틴의 영양학적 가치 이외에, 젤라틴은 소화가 매우 잘되므로 쉽게 흡수되는 액상 식품으로 투여할 수 있다. 순수한 젤라틴은 지방, 슈가, 퓨린 또는 콜레스테롤을 함유하지 않는다. 젤라틴의 물성, 단백질 함량, 및 강한 맛이 없다는 점 때문에 젤라틴은 많은 제품에서 바람직한 지방 대용물이다. 젤라틴은 예를 들어, 저지방 버터 및 마가린과 같은 제품에서 에멀젼 안정화제로 널리 사용된다. 증점제 및 결합제로서의 젤라틴은 다양한 식품에서 전체적으로 또는 부분적으로 지방 함량을 대체할 수 있다. 예를 들어, 젤라틴은 크림, 버터 및 기타 유제품과 같이 칼로리 함량이 매우 높은 결합제; 난황; 및 다른 녹말 제품을 대신할 수 있다. 또한, 젤라틴의 수분 보유량은 다량의 물과의 결합에 도움을 주어 식사 후의 만족감 및 포만감을 더 높인다.
젤라틴의 감각 또는 입안 감촉은 중요한데, 이는 지방이 없거나 지방 함량이감소된 많은 제품이 지방의 입안 감촉 및 맛과 가능한 비슷해야 하기 때문이다. 저지방 제제 중의 젤라틴을 사용하여 완전-지방 제품과 견줄만한 질감을 얻음으로써 바람직한 질감 및 입안-촉감을 보존하면서 칼로리 함량을 보다 더 낮출 수 있다. 사용된 젤라틴의 양은 최종 제품에 함유된 (존재한다면) 지방의 비율에 달려 있다. 예를 들어, 60%의 지방 함량에서 0.5 중량%의 젤라틴이 사용되지만, 25%의 보다 낮은 지방 함량에서는 대략 3.5 중량%의 젤라틴을 사용하여 제품의 통합성 및 감각 매력을 유지한다. 본 발명에 따라 제조된 젤라틴은 그가 포함된 식품의 융점과 유사한 융점을 갖거나, 바람직하게는 먹는 온도에서 젤라틴을 융용시키고 이와 동반된 풍부한 입안-촉감을 발생시키는 인간의 체온 또는 구강 온도와 유사한 융점을 가질 수 있다. 또한, 젤라틴의 부드러운 맛은 특정한 식품의 향미를 방해하지 않을 것이다. 마지막으로, 젤라틴은 소화가 매우 잘된다. 따라서, 지방 대용물로서 젤라틴을 사용하여 질감 및 윤택의 상응하는 감소, 및 맛과 소화력에 대한 상응하는 부정적 영향 없이 칼로리를 낮출 수 있다. 본 발명은 한 측면에서, 재조합 젤라틴을 포함하는 지방 대용물을 제공하는데, 여기서 상기 지방 대용물은 식용 제품에 사용하기 위한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 젤라틴의 융점은 약 25 내지 35℃이다.
젤라틴은 조직에서 임의의 캐비티 (cavity)를 침투하고 충전시킴으로써 요리된 햄과 같은 고기를 비롯한 다양한 캔 및 저장 음식의 외관 및 슬라이싱 (slicing) 특성을 개선시킨다. 캔 형태의 고기 제품의 경우, 젤라틴은 리토르팅 (retorting) 과정에서 방출된 즙을 흡수하여 제품의 슬라이싱 성질을 개선시키고제품에 좋은 외관을 부여한다. 이러한 경우, 고기즙 중의 포스페이트로부터 칼슘 포스페이트가 침전될 만큼 칼슘 함량이 낮은 젤라틴을 선택해야 한다. 캔 해산 식품과 같은 캔 식품 분야에서, 멸균 공정 동안 인가된 열 처리를 견디기 위해서는 겔 강도가 높은 젤라틴을 사용한다. 선택된 멸균의 정도 및 겔 강도에 따라, 젤라틴 함량은 보통 0.5-5.0 중량%이다. 젤라틴은 캔 형태의 해산 식품과 고기, 및 다양한 젤리 (요리용 젤리) 제품에서 결합제 및 겔화제로도 작용한다.
젤라틴은 소세지 코팅에 사용되는데, 소세지 코팅에서 젤라틴은 살라미스 (salamis)와 같은 제품의 표면에 양념을 결합시키는 접착제로 사용된다. 전형적으로, 젤라틴이 경화될 시간을 주고 제품 표면으로부터 액체가 흐르는 것을 억제할 만큼 높은 블룸 및 점도를 나타내는 고농도 젤라틴 용액에 소세지를 담구어 코팅한다. 이러한 코팅은 예를 들어, 대두 및 다른 고기 대용품의 제조, 및 다양한 과일, 고기 및 조제 식품의 코팅에도 사용된다. 한 측면에서, 본 발명은 재조합 젤라틴을 포함하는 식용 코팅을 제공한다.
젤라틴은 다양한 향미료, 색소 및 다른 첨가제, 및 비타민의 마이크로-캡슐에도 사용된다.
구체적으로, 안정화제; 증점제; 피막형성제; 결합제; 식용 코팅제; 겔화제; 단백질 보충물; 유화제; 색소, 향미료 및 비타민을 위한 마이크로-캡슐화제 등으로 사용할 수 있고 영양 및 식이 보충물을 비롯한 다양한 식품 보충물 및 지방 대용제에 사용할 수 있는 다양한 재조합 젤라틴이 고려된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 정결한 음식물, 식용육, 야채, 또는 특정한 동물-유래의 생성물을 함유하는 식품의 소화를 제한하는 다른 식사를 하는 소비자를 위해 제조된 식품의 가공 또는 포장에 사용되거나, 또는 상기 식품의 성분으로 사용된다.
인간이 소비하기 위한 식용 제품에 사용되는 것 이외에, 젤라틴은 애완동물의 사료, 스낵 및 씹는 과자의 바 (bar) 및 펠렛의 제조에 있어서 결합제로 사용된다. 젤라틴이 이들 제품에 부여하는 구조적 장점 이외에, 젤라틴의 높은 단백질 함량은 동물 골격 시스템의 퇴행성 질환의 증상을 완화시킬 뿐만 아니라 동물의 털가죽의 성장 및 질감을 개선시키는 긍정적 효과를 제공할 수 있다.
사진
또다른 측면에서, 본 발명은 재조합 젤라틴을 포함하는 사진용 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 재조합 젤라틴은 부분적으로 수산화된다. 젤라틴은 예를 들어, 필름 및 종이를 비롯한 다양한 사진 프로세스 및 제품의 핵심 성분이다. 젤라틴은 감광성 제품에서 결합제로 사용되는데, 젤라틴의 겔-경화 및 피막형성 성질이 단일 용도에서 다중 코팅을 수반할 수 있는 깨끗하고 균일하고 내구적인 코팅을 만든다. 결합제로서의 젤라틴은 균일한 일관성, 고화도 또는 원하는 점착도를 제공한다. 젤라틴은 칼라 사진 제품에서 커플러 및 염색 에멀젼을 안정화시키기도 한다.
젤라틴은 할로겐화은 에멀젼층, 상부 코트 또는 표면층, 계면층 및 후면 코트를 비롯한 사진 코팅에서 필요 불가결하다. 젤라틴의 화학적 성질 및 콜로이드 성질은 사진 할로겐화은 에멀젼의 정확한 침전 및 화학적 숙성을 가능케 한다. 몇몇 유화액은 40%만큼 높은 농도 및 20℃만큼 낮은 온도에서 용액 중의 액체 상태로남을 수 있는 비-겔화 어류 젤라틴을 사용한다.
한 실시양태에서, 재조합 젤라틴의 분자량 및 경화 시간은 작다. 또다른 실시양태에서, 재조합 젤라틴의 경화점은 낮지만, 분자량은 현재 비-겔화 어류 젤라틴 또는 동물-유래의 젤라틴 가수분해물의 분자량보다 더 높다.
본 발명의 재조합 젤라틴은 사진 분야에서 다양한 용도, 예를 들어, 필름 및 종이 둘다의 할로겐화은을 지지하는 데 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 재조합 젤라틴의 경화 온도는 15 내지 25℃이다. 재조합 젤라틴은 분무 건조하고 밀도가 낮은 냉각수 가용성 분말 또는 필름으로서 제공할 수 있으므로, 다양한 기술적 분야, 예를 들어, 포토레지스트 시스템에 사용하는 데 유리하다. 본 발명의 젤라틴은 젤라틴 필터로 사용될 수도 있다. 본 발명은 고객의 특정한 요구 각각의 정확한 성질을 만족시키도록 디자인된 사진용 젤라틴 제품뿐만 아니라 이러한 제품의 제조 방법도 고려한다.
기타
본 발명의 재조합 젤라틴은 그의 보다 구체적이고 통합된 화학적 구성 및 그의 물성에서의 상응하는 일관성 때문에 시판되는 젤라틴보다 우수한 다양한 기술적 장점을 제공한다. 따라서, 본 발명의 재조합 젤라틴은 현재 추출된 젤라틴을 수반하는 기술 분야에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 젤라틴은 종이 정립 (sizing) 및 그라비어인쇄, 콜로타이프, 스크린 인쇄 공정, 마이크로캡슐화 염색제, 카피 전사지 및 기타 종이, 및 아라비아 검과의 코아세르베이트 결합체의 형성을 통해 젤라틴으로 코팅된 보드를 비롯한 다양한 공업 공정 (이에 제한되는 것은아님)에서 사용할 수 있다. 본 발명의 젤라틴은 매끄럽게 침착시키는 일렉트로플레이트에서 사용할 수 있고, 몇몇 중합 반응에서 보호 콜로이드로 사용할 수 있고, 반도체 제조에서 코팅제 또는 피막형성제로 사용할 수도 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 공채 증서, 은행 지폐 등을 포함하는 특질의 종이를 위한 결합제로 사용한다. 본 발명의 젤라틴은 매치 페이스트에서 사용하기 위한 접착제로 사용되어 매치시 보다 낮은 밀도 및 보다 고른 연소를 제공하고, 마찰 종이를 생산하기 위해 캔버스 또는 종이 백킹시 마찰 입자의 고정제로 사용된다.
젤라틴이 보호 콜로이드로 작용하는 능력, 및 젤라틴 pH 변화에 따라 그의 전하를 바꾸는 능력을 비롯한 젤라틴의 특수한 성질들이 조합되어 젤라틴이 마이크로캡슐화에 사용하기에 적합한 재료가 된다. 따라서, 젤라틴 및 그의 유도체는 다양한 마이크로캡슐화 장치 및 기술, 예를 들어, 탄소가 없는 종이용 인크; 광고 및 샘플 제조용 향수; 다성분 접착제에 사용되는 화학물질; 및 비타민 및 영양 보충물의 마이크로캡슐화에 사용할 수 있다. 젤라틴 및 그의 유도체의 마이크로캡슐화 능력은 산소, 아로마 및 수증기에 대한 투과성이 최소한 작은 포장을 비롯한 포장 재료의 제조에도 유용하다. 따라서, 젤라틴은 식품, 약제 및 다른 민감성 제품의 포장과 같은 유연성 포장에 널리 사용된다.
젤라틴에 의해 제공되는 표면 장력의 감소 및 접착 효과 때문에 젤라틴은 잎 비료에 유용하다. 젤라틴의 아미노산의 안정성 및 느린 분해 때문에, 비료에 의해 제공되는 정확히 조절된 질소 농도가 유지되고 보다 장기간 동안 사용될 수 있다.젤라틴은 비료 펠렛의 제조에서 생분해성 결합제로도 유용하다.
젤라틴의 아미노산 조성 때문에, 젤라틴은 예컨대, 페니실리움 크리소게눔 (Penicillium chrysogenum)에 의한 페니실린의 합성뿐만 아니라, 예를 들어, 다양한 출발 (starter) 배양물 및 항생제의 제조에 유용한 질소의 복합 공급원으로 작용할 수 있다 (Leonhartsberger, et al. (1993) J Biotechnol 30: 299-313).
본 발명의 재조합 젤라틴은 그의 재생산성 및 균일성 가치가 매우 높고 연구 과정 및 연구 조성물에서 원치않는 변화가 최소한 적어야 하는 다양한 연구 분야에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 젤라틴은 다양한 조직 배양 분야에 사용되어 생장 배지에서 적당한 단백질 공급원을 제공하고, 몇몇 분야에서는 세포 생장 매트릭스 또는 스카폴딩 (scaffolding), 또는 세포 부착 및 생장을 위한 다른 표면을 제공한다. 본 발명은 재조합 젤라틴을 포함하는 세포 보존 제제도 제공한다. 투여 및 사용할 때까지 상기 용액을 보호하는 이러한 제제는 예를 들어, 혈소판 세포의 용액을 보존하는 데 사용할 수 있다. 본 발명은 가수분해된 재조합 젤라틴 또는 겔 강도가 낮은 재조합 젤라틴을 포함하는 생물학적 완충제, 예를 들어, 블로킹 용액 및 코팅 용액도 고려한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 효소그래프 겔을 비롯하여 생화학적 및 전기영동적 분석에 사용되는 다양한 겔에 사용하기 위한 재생성 재조합 젤라틴을 제공한다.
본 발명은 재조합 젤라틴으로 코팅된 마이크로캐리어 비즈도 고려한다. 이러한 마이크로캐리어는 예를 들어, 포유동물 세포 배양에 사용되어 부착-의존성 세포를 위한 생장 표면을 제공한다. 예를 들어, 폴리사카라이드 및 폴리스티렌 비즈는 본 발명의 재조합 젤라틴으로 코팅하여 세포 부착 및 생장에 적합한 표면을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 마이크로캐리어 비즈는 특정한 세포의 분화 및 생장을 유도할 수 있는 활성 콜라겐성 도메인을 함유하는 특정한 재조합 젤라틴으로 코팅한다.
다양한 콜라겐의 여러 영역이 다양한 활성과 관련되어 있는데, 예를 들어, 타입 III 콜라겐의 다양한 영역이 응고 캐스캐이드에 관여하는 활성 부위와 관련되어 있다. 그러므로, 한 실시양태에서, 본 발명은 특정한 콜라겐 또는 특정한 콜라겐들의 특정한 활성 영역을 함유하는 재조합 젤라틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것도 고려한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 다양한 방식, 예를 들어, 마이크로어레이로 사용할 수 있다.
재조합 젤라틴, 폴리펩티드, 및 본 발명의 재조합 젤라틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 신규 마이크로어레이 기술 및 스크리닝 기술에 사용할 수 있다. 콜라겐 원섬유 및 부동화된 콜라겐은 혈소판에 강하게 결합하는데, 이는 혈소판이 서로 중합되는 여러 콜라겐 분자를 포함하는 콜라겐에 대한 다수의 결합 부위를 갖기 때문이다. 혈소판이 그의 콜라겐 수용체를 통해 콜라겐과 상호작용하여 혈소판을 활성화시킨 후 혈소판 응집물을 형성시킨다.
콜라겐 타입 III의 생활성 부위를 구성하는 재조합 젤라틴은 예를 들어, 현재의 콜라겐 및 젤라틴 공급원으로는 얻을 수 없는 균일성, 순도, 및 재생산성으로 구성된 미세섬유로서 제조할 수 있다. 본 발명의 재조합 젤라틴으로부터 유도된 미세섬유는 예컨대, 타입 III 콜라겐 또는 임의의 다른 원섬유-형성 콜라겐과의 상호작용을 통해 혈소판 응집을 방해하는 화합물을 스크리닝하는 데 사용되는 기재, 예를 들어, 어레이 또는 칩 상에 제공할 수 있다. 콜라겐 섬유 내의 특정한 영역, 예컨대, RGD 서열과 혈소판의 상호작용에 의해 매개되는 응괴 형성 또는 혈소판 응집의 과정을 방해하거나 감소시키거나 또는 늦추는 능력을 갖는 화합물, 소분자, 펩티드 또는 다른 생물학적 분자 (예컨대, 항체)를 스크리닝할 수 있다. 또한, 마이크로어레이는 콜라겐 및 젤라틴 미세섬유의 다양한 영역과 다양한 타입의 인테그린의 상호작용을 조사하는 데에도 유용할 것이다. 임의의 원섬유-형성 콜라겐, 예를 들어, 콜라겐 타입 I, 타입 II, 타입 III, 타입 V 또는 타입 XI로부터 유도된 재조합 젤라틴으로부터 제조된 미세섬유는 콜라겐-유도 혈소판 응집 길항제를 스크리닝하는 데 사용할 수 있다.
재조합 젤라틴 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 마이크로어레이도 고려된다. 이러한 마이크로어레이는 콜라겐-코딩 또는 젤라틴-코팅 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA의 변이체를 스크리닝하고 단리하는 데 유용하고, 예를 들어, 정상 조직 대 병든 조직에서의 발현 차이도를 측정하는 데 유용하다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 원시세포의 분화에 사용하기 위해, 조직 재생 요법에 사용하기 위해, 그리고 조직 조작에 사용하기 위해 정제한 재조합 인간 젤라틴을 제공한다. 세포외 매트릭스의 성분은 세포의 증식 및 분화의 조절에 관여한다. 기본 섬유아세포 생장 인자와 함께 이식된 젤라틴 마이크로스피어의 사용은 인공 피부 모델에서 섬유아세포의 증식 및 모세혈관의 형성을 촉진한다 (Kawaiet al. (2000) Biomaterials, 21: 489-499). 콜라겐 타입 IV는 세포 증식 및 아교 세포의 분화를 억제하지만 신경 원시세포의 분화를 촉진한다 (Ali et al. (1998) Brain Res Dev Brain Res 110: 31-38). 또한, 콜라겐 타입 I은 골수 스트로마 세포의 골형성 분화를 유도하지만, 콜라겐 타입 II, III 및 V는 그렇지 못하다 (Mizuno and Kuboki (1995) Biochem Biophys Res Commun 211: 1091-1098; and Mizuno et al. (1997) Bone 20: 101-107).
일반적으로, 세포 배양에서 젤라틴을 사용하면 세포의 밀도가 더 높아지고 조혈 줄기 세포 및 다른 원시세포의 세포 생존율이 증가되고 연장된다 (Tun et al. (2000) ASAIO J 46: 522-526). 캐리어 매트릭스 또는 전달 비히클로 사용되는 젤라틴은 골수-유래의 간엽 원시세포의 전달 및 간엽 기재 연골 재생 요법에서 골연골 분화를 지지한다 (Angele et al. (1999) Tissue Eng 5: 545-554; Ponticiello et al. (2000), J Biomed. Mater. Res. 52: 246-255; and Young et al. (1998) J. Orthop. Res. 16: 406-413). 본 발명은 예컨대, 세포 부착, 세포 증식 및 세포 분화를 촉진하는 데 사용하는 것과 같은 세포 배양에서 사용하기 위한 재조합 젤라틴을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 원하는 세포 부착, 세포 증식 또는 세포 분화 활성을 제공하도록 디자인한 특정한 재조합 젤라틴의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 신경 원시세포의 분화를 촉진할 필요가 있는 경우, 이러한 활성을 나타내는 콜라겐 타입 IV의 특정한 부위를 함유하는 재조합 젤라틴을 제조할 수 있다.
본 발명은 재조합 젤라틴을 포함하는 화장제용 조성물을 제공한다. 이 조성물을 대상체에게 투여하여 거칠고 부러진 손ㆍ발톱을 개질 및 회복시키고 머리결을 개질시킬 수 있다. 젤라틴의 저자극성, 수화성, 및 질감, 색 및 투명성을 제공하고 피막을 형성하는 능력 때문에, 젤라틴은 다양한 미용품 및 화장품의 필수 성분이다. 예를 들어, 젤라틴은 샴푸 및 컨디셔너와 같은 모발 보호 제품의 귀중한 성분이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 화장품 분야에 사용하기에 적합한 재조합 젤라틴을 포함하는 보습제를 제공한다. 젤라틴의 피막 형성 성질은 모발, 특히, 과거에 화학 제제로 처리된 손상된 모발의 광택 및 손질을 개선시킬 수 있다. 젤라틴은 젤라틴과 같은 단백질이 모발 구조를 보호하는 데 사용되는 영구 웨이빙 (waving) 및 브리칭 (bleaching)과 같은 모발 처리 공정을 포함하는 다양한 미용 공정에서도 사용할 수 있다. 젤라틴의 피막-형성 성질이 피부의 매끈함 및 부드러움에 기여하기 때문에, 로션, 마스크, 크림, 립스틱 및 기타 화장품에 재조합 젤라틴을 사용하는 것도 고려된다. 한 측면에서, 본 발명은 거칠고 약한 손ㆍ발톱 등을 치료하기 위해 투여되는 재조합 젤라틴을 포함하는 화장제 조성물도 고려한다.
보호 콜로이드로서 작용하는 젤라틴의 능력, 및 pH의 변화에 따라 그의 전하를 바꾸는 능력을 비롯한 젤라틴의 특이적 성질이 조합되면 젤라틴이 마이크로캡슐화에 사용하기에 적합한 재료가 된다. 따라서, 젤라틴 및 그의 유도체는 다양한 마이크로캡슐화 장치 및 기술, 예를 들어, 광고 및 샘플 제작용 향수의 마이크로캡슐화에 사용할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 제조예 및 실시예는 당업자가 본 발명을 보다 명료하게 이해하고 실시할 수 있도록 하기 위해 제공한다. 그러나, 본 발명은 본 발명의 한 측면만을 설명하고자 한 예시된 실시양태, 및 본 발명의 범위 내에 있는 기능적으로 동일한 방법에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 상기 설명 및 수반된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 있는 것이다.
달리 명시하지 않는 한, 본 발명의 실시예에서는 하기 재료 및 방법을 사용하였다.
실시예 1: 재조합 젤라틴의 직접적인 발현
인간 타입 I 콜라겐으로부터 얻은 α1(I) cDNA의 특정한 단편을 PCR로 증폭하고 플라스미드 pPICZαA 또는 pPIC9K (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)에 클로닝하였다. 클로닝에 사용된 특정한 PCR 프라이머는 아래 표 1에 기재되어 있다. 특정한 재조합 젤라틴은 서열 15 내지 25, 30, 31 및 33로서 표 2에 기재되어 있다. 이들 재조합 젤라틴은 인간 프리프로-α1(I) 콜라겐과 관련하여 추가로 동정하였다 (Genbank Accession No. CAA98968). 사용된 발현 플라스미드는 효모 교배 인자 알파 프리프로 분비 서열과 융합된 다양한 크기의 α1(I) cDNA 서열을 포함하고 있다. 당분야에 공지된 다른 신호 서열, 예를 들어, 효모 인버타제 (SUC2), 효모 산 포스파타제 (PHO) 서열, 천연 프로-콜라겐 신호 서열 및 인간 혈청 알부민의 신호 서열도 사용할 수 있다. 특정한 발현 시스템에서 특정한 젤라틴 단편의 최적 발현도를 제공하는 신호 서열을 선택해야 한다.
서열 번호 사용된 PCR 프라이머 아미노산 서열 분자량
15 서열 5 및 서열 6 잔기 179 내지 잔기 280 9,447 Da
16 서열 5 및 서열 8 잔기 179 내지 잔기 439 23,276 Da
17 서열 5 및 서열 9 잔기 179 내지 잔기 679 44,737 Da
18 서열 10 및 서열 11 잔기 531 내지 잔기 589 5,250 Da
19 서열 1 및 서열 2 잔기 531 내지 잔기 631 8,947 Da
20 서열 1 및 서열 7 잔기 531 내지 잔기 715 16,483 Da
21 서열 1 및 서열 4 잔기 531 내지 잔기 781 22,373 Da
22 서열 1 및 서열 12 잔기 531 내지 잔기 1030 44,216 Da
23 서열 3 및 서열 7 잔기 615 내지 잔기 715 8,213 Da
24 서열 3 및 서열 4 잔기 615 내지 잔기 781 14,943 Da
25 서열 3 및 서열 12 잔기 615 내지 잔기 1030 36,785 Da
30 서열 3 및 서열 13 잔기 615 내지 잔기 676 5,517 Da
31 서열 3 및 서열 14 잔기 615 내지 잔기 865 22,126 Da
33 서열 1 및 서열 32 잔기 531 내지 잔기 1192 ∼65 KDa
발현 플라스미드는 전기영동에 의해 피키아 파스토리스 세포 내로 도입하고 형질전환체는 his4 영양요구성의 보충성 (pPIC9K 벡터) 또는 제오신에 대한 내성 (pPICZαA 벡터)에 의해 선별하였다. 재조합 단백질 발현은 메탄올-유도성 알코올로 옥시다제 프로모터 (PAOX1)에 의해 조절되었다. 피키아 파스토리스 숙주 세포는 콜라겐의 히드록시프롤린의 번역후 합성을 책임지는 효소인 인간 프롤릴 4-히드록실라제 (P4H)의 삽입된 α및 β서브유닛 카피를 함유하고 이미 문헌 (Vuorela, M. et al. (1997) EMBO J 16: 6702-6712)에 기재되어 있다 .
효모 균주는 완충된 최소 글리세롤 배지에서 생장하고, 재조합 단백질의 발현은 인비트로겐 피키아 발현 메뉴얼에 기재되어 있는 바와 같이 탄소 공급원으로서 글리세롤 대신에 메탄올 (0.5%)이 함유된 상기 배지를 사용하여 유도하였다. 젤라틴 생산 균주는 진탕 플라스크 배양물로부터 얻은 추출물 중의 상태변화 배지 및 프롤릴 4-히드록실라제 활성을 10-20% 트리신 SDS-PAGE로 분석하여 확인하였다. 프롤릴 4-히드록실라제와 콜라겐 단편의 동시발현은 천연 인간 서열이 포함된 재조합 젤라틴을 발현시켰다.
상기 단편은 발현되어 배지 내로 분비되었다. 재조합 젤라틴은 아세톤 침전, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 이들 방법의 임의의 조합 방법에 의해 배지로부터 회수 및 정제하였다. 아세톤 침전은 아세톤을 40%의 최종 농도까지 세포가 없는 배양물 상등액에 첨가함으로써 4℃에서 수행하였다. 주로 내재 효소 단백질로 구성된 침전물을 원심분리하여 모았다. 이어서, 아세톤을 최종 농도 80%까지 상등액에 첨가하여 젤라틴을 침전시킨 후, 원심분리하여 젤라틴을 모으고 물에 대해 밤새 투석하고 동결건조하였다. 고순도의 젤라틴은 음이온 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피를 함께 사용하여 수득하였다. 크로마토그래피 정제는 실온에서 수행하였다.
아미노산 구성을 기준으로 한 분자량의 계산과 비교할 때 전기영동으로 콜라겐성 단백질의 크기를 측정하는 것은 당분야에 공지되어 있다 (Butkowski et al.(1982) Methods Enzymol 82: 410-423). 재조합 젤라틴의 N-말단 서열 분석은 단백질이 효모 분비 경로로 직접 가도록 하기 위해 젤라틴 단편에 융합된 프리프로 서열의 정확한 프로세싱이 일어난다는 것을 입증한다. 이 시스템에서 제조된 젤라틴은 인간 콜라겐으로부터 유도된 서열만을 포함하고 있다. 추가로, 재조합 젤라틴은 상태변화 배지의 주성분인데, 이는 피키아 파스토리스 세포가 매우 적은 단백질을 분비하기 때문이다.
발현된 재조합 젤라틴의 크기는 SDS-PAGE 상에서 측정시 약 5 kDa 내지 약 65 kDa까지 명확히 구별되는데, 예를 들어, 이 크기는 도 1에 나타낸 바와 같이 ∼5 kDa (레인 2, 서열 18), ∼10 kDa (레인 3, 서열 19), ∼16 kDa (레인 4, 서열 24), ∼18 kDa (레인 5, 서열 20), ∼20 kDa (레인 6, 서열 28) (표 1에는 기재되어 있지 않은 이론상 분자량은 17,914 Da임), ∼33 kDa (레인 7, 서열 27) (표 1에는 기재되어 있지 않은 이론상 분자량은 29,625 Da임), ∼41 kDa (레인 8, 서열 25) 및 ∼50 kDa (레인 9, 서열 22)에 상응한다 (레인 10은 실시예 10에 기재된 바와 같이 제조된 가수분해된 재조합 인간 인간 콜라겐 타입 I을 나타냄).
실시예 2: 세포 부착 활성을 지지하는 인간 재조합 젤라틴
본 발명의 재조합 인간 젤라틴 단편은 시험관내 세포 부착 활성을 나타내었다. 다음 분석에서, 96-웰 맥시소프 플레이트 (Nunc)를, 실시예 1에 기재되고 표 2에 나열된, 인간 타입 I 콜라겐의 α1쇄의 재조합 인간 젤라틴 도메인 (서열 19, 서열 20, 서열 21 및 서열 22)으로 코팅하였다. 비트로겐 소 콜라겐 (Cohesion Technologies; Palo Alto CA) 및 소 혈청 알부민을 각각 양성 대조구 및 음성 대조구로 사용하였다. 각각의 단백질을 0.1 M의 NaHC03(pH 10.0)으로 0.1 mg/ml까지 희석하고 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하였다. 인간 포피 섬유아세포 (HEF) 또는 인간 제정맥 내피세포 (HUVEC, 클로텍틱스로부터 입수, 계대배양 5)를 코팅된 플레이트에 시딩하고 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 실험을 3회 반복 수행하였다.
그 다음으로, ELISA 판독기, 450 nm에서 시약 WST-1의 흡광도를 판독하여 세포 부착도를 측정하였다. 도 2A는 재조합 인간 젤라틴이 HFF가 맥시소프 플레이트에 부착하는 것을 지지하고 이들 세포의 경우 세포 부착이 각 웰에 코팅된 재조합 인간 젤라틴의 분자량에 직접 비례함을 보여준다. 구체적으로, 서열 19, 서열 20 및 서열 21의 재조합 젤라틴은 BSA의 경우에 관찰된 것보다 더 높은 정도로 HFF 부착을 지지하였다. 도 2B는 다양한 재조합 인간 젤라틴이 내피세포 부착을 지지함을 보인다. 세포 부착 활성은 재조합 인간 콜라겐의 열 가수분해 (하기 실시예 9에 기재되어 있음)에 의해 제조된, 분자량 범위가 0-30 kDa 및 0-50 kDa인 재조합 인간 젤라틴의 경우에도 나타났다.
실시예 3: 단백질분해에 대해 안정한 젤라틴 단편의 확인
재조합 젤라틴 단편은 재조합 피키아 파스토리스 세포의 배지에서 발현되고 축적되는 동안 단백질 분해효소에 의해 변형되는 것으로 밝혀졌다. 타입 I 콜라겐의 α1쇄의 나선형 도메인의 여러 다양한 부위의 발현으로 단백질분해에 대해 우수한 안정성을 나타내는 재조합 젤라틴을 확인할 수 있다. 3가지 다른 젤라틴 단편을 플라스미드 pPICZαA에 클로닝하고, 피키아 파스토리스 세포에서 재조합 단백질이 발현되는 동안 상기 젤라틴 단편의 상대적 안정성을 측정하였다.
사용된 제1 균주는 상기 실시예 2에 기재되어 있고, 서열 19에 상응한다. 추가 균주는 인간 α1(I) 나선형 도메인 아미노산 잔기 179-280 (서열 15) 및 615-715 (서열 23)을 코딩하는 플라스미드를 사용하여 만들었다. 이들 재조합 젤라틴은 프라이머 서열 5와 서열 6, 및 서열 3과 서열 7을 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 제작하였다. PCR 생성물을 XhoI 및 XbaI으로 절단하고, 상술한 바와 같이 전기영동 준비를 하였다. 균주를 생장시키고 단백질 발현을 유도하고, 발현된 젤라틴 단편을 SDS-PAGE로 비교하였다. 도 3은 서열 15 (레인 2)의 재조합 젤라틴 및 서열 19 (레인 3)의 재조합 젤라틴이 단백질분해 효소에 의해 분해되지만 서열 23 (레인 4)의 재조합 젤라틴은 완전히 온전한 상태로 남아있음을 보여준다. 이 결과는 안정성이 우수한 본 발명의 재조합 젤라틴 단편을 제조할 수 있음을 입증하였다.
실시예 4: 수산화 재조합 인간 젤라틴의 발현
프롤릴 4-히드록실라제 활성은 효모에서는 검출되지 않았다. 피키아 파스토리스 균주는 활성 프롤릴 4-히드록실라제를 발현하도록 조작된 바 있고 수산화 콜라겐을 생산하는 데 이미 사용된 바 있다 (미국 특허 제5,593,859호). 수산화 재조합 인간 젤라틴을 발현하기 위해, 이 균주는 프라이머 서열 1 및 서열 2을 사용한 PCR에 의해 생성된, 재조합 인간 α1(I) 콜라겐 (서열 19, 표 2)의 100개 아미노산을 코딩하는 젤라틴 발현 카세트로 형질전환시켰다. PCR DNA 생성물 (∼330bp)을 XhoI-XbaI으로 절단하고 pPICZαA (Invitrogen)의 XhoI-XbaI 부위 내로 라이게이션시켜 플라스미드 pDO7을 만들었다.
AOX1 프로모터 영역의 3' 부위, 교배 인자 알파 분비 신호, 서열 19의 재조합 젤라틴, pPICZαA의 폴리링커 서열, 및 56개 염기쌍의 AOX1 전사 터미네이터를 함유하는 pDO7으로부터 1048 bp의 CelII-AgeI 단편을 단리하였다. 이 단편을 pPIC9K (Invitrogen)의 CelII-AgeI 부위 내로 라이게이션시켜 pDO41을 만들었다. 피키아 파스토리스 균주 αβ8(his4)를 StuI으로 선형화된 플라스미드 pDO41로 전기영동에 의해 형질전환시키고 최소 덱스트로스 플레이트 상에 플레이팅하고, his4 영양요구성을 보상하는 형질전환체를 선별하였다. 대략 20개의 his+ 형질전환체를 생장시키고 실시예 1에 기재된 바와 같이 메탄올로 유도하였다. 서열 19를 발현하는 균주를 상태변화 배지의 SDS-PAGE 분석으로 확인하였다 (도 4).
아세톤 침전에 의해 양성 균주로부터의 재조합 젤라틴 단편을 배지로부터 정제하고 예를 들어, 문헌 (Hare, PE. (1977) Methods in Enzymology 47: 3-18)에 기재된 바와 같이 아미노산 분석으로 더 분석하였다. 상기 양성 균주 중 하나로부터 얻은 젤라틴 생성물의 아미노산 분석은 분비된 재조합 젤라틴에 히드록시프롤린이 존재함을 입증한다. 도 4에 기재된 균주로부터 단리된 젤라틴 (단리물 #2)의 경우 프롤린에 대한 히드록시프롤린의 비율은 0.29인 것으로 측정되었는데, 이는 젤라틴과 프롤린 4-히드록실라제가 함께 발현됨을 의미한다.
비-수산화 재조합 젤라틴을 발현하고 프롤릴 4-히드록실라제를 발현하지 않는 피키아 파스토리스 균주로부터 정제하였다. 그 다음, 이 재조합 젤라틴 내의프롤린 잔기를 시험관내에서 프롤릴 4-히드록실라제 효소 활성을 이용하여 히드록시프롤린 잔기로 전환시켰다. 젤라틴 발현 플라스미드는 서열 24의 재조합 젤라틴을 발현시키는 프라이머 서열 3 및 서열 4를 사용한 PCR로 만들었다. 525개 염기쌍의 PCR 생성물을 정제하고 XhoI-XbaI으로 절단하고 XhoI-XbaI에 의해 절단된 pPICZαA에 라이게이션시켰다. 플라스미드를 PmeI으로 선형화하고 피키아 파스토리스 균주 X-33 (Invitrogen) 내로 전기영동시켰다. 형질전환체를 500 ㎍/ml의 제오신이 함유된 YPD 플레이트 상에서 생장시켜 선별하였다. 상술한 바와 같이 젤라틴 발현에 대해 균주를 시험하고 재조합 비-수산화 젤라틴을 양성 단리체의 배지로부터 정제하였다. 분자량이 10 kDa인 컷-오프 막을 사용한 압력 투석으로 상태변화 배지를 10배 농축시키고, 샘플을 완충액 A (50 mM Tris-HCl pH 9.0,50 mM NaCl)에 대해 투석하였다. 투석된 물질을 완충액 A 중에서 평형시킨 Q-세파로스 컬럼 상에서 크로마토그래피하였다. 젤라틴은 이러한 조건 하에서 상기 컬럼에 결합하지 않았으므로 관통하여 나오는 분획에 존재하였다. 오염시키는 효모 단백질의 대다수는 컬럼에 결합되어 있었고 완충액 B (완충액 A + 0. 5 M NaCl)로 용출되었다.
관통하여 나오는 분획을 50 mM의 아세트산나트륨 완충액 (pH 4.5)에 대해 투석하고, 이 완충액 중에서 평형시킨 SP-세파로스 컬럼 상에서 재조합 젤라틴을 더 정제하였다. 재조합 젤라틴을 컬럼에 결합시키고 0.2 M의 NaCl로 단계적으로 용출하였다. 정제된 젤라틴 (1 mg/ml)을 가열 변성시키고 (100℃에서 10분 동안), 50 mM 트리스-HCl (pH 7.8), 2 mM 아스코르베이트, 2 mM α-케토글루타레이트, 0.1 mMFeS04, 10 μM DTT, 10 mg/ml 소 혈청 알부민 및 100 유닛의 캐탈라제 (Sigma Chemical Co., St Louis, MO)의 존재 하에 1:30의 효소 대 기질의 비로 정제된 P4H와 혼합하였다 (Kivirikko, K. I. and Myllyla, R. (1982) Methods in Enzymology 82: 245-304; and Vuori, K., et. al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 7467-7470). 반응을 37℃에서 16시간 동안 진행시켰다.
그 다음으로, 재조합 젤라틴을 상술한 바와 같이 Q-세파로스 상 크로마토그래피로 정제하였다. 결합된 단백질을 0.5 M의 NaCl로 컬럼으로부터 용출하여 모았다 (도 5, 레인 7, 8 및 9). 관통하여 나오는 분획 및 용출한 분획을 SDS-PAGE로 분석하여 회수된 젤라틴의 순도를 입증하였다 (도 5). 관통하여 나오는 분획을 투석한 후 젤라틴의 아미노산 분석을 수행하였다 (도 5; 레인 3 내지 6). 아미노산 분석은 87%의 젤라틴이 수산화되었음을 보여준다. 젤라틴에 있는 히드록시프롤린의 몰수 / 프롤린의 몰수 + 히드록시프롤린의 몰수가 0.5일 때 100% 수산화가 달성된다.
실시예 5: 프롤릴 4-히드록실라제의 존재 또는 부재 하의 젤라틴의 안정성
18 kDa의 재조합 젤라틴 (서열 20)을 상술한 방법에 따라 발현시켰다. 발현된 단편을 겔 전기영동으로 분석하였다. 프롤릴 4-히드록실라제의 존재 하에 발현된 재조합 젤라틴의 안정성은 프롤릴 4-히드록실라제의 부재 하에 발현된 젤라틴의 안정성보다 현저히 더 높았다 (도 6).
프롤릴 4-히드록실라제를 발현하는 피키아 파스토리스 균주에서 재조합 인간젤라틴의 안정성 및 안정성의 상승에 대한 프롤린 수산화의 역할을 조사하였다. 서열 20 (pD032)을 코딩하는 플라스미드는 프라이머 서열 1 및 서열 6을 사용한 PCR로 제작하였다. PCR 생성물을 상술한 바와 같이 정제하고 절단하고 클로닝하였다. 동일한 α1(I) cDNA 단편을 프롤릴 히드록실라제가 없는 숙주 세포, 그리고 α및 β프롤릴 4-히드록실라제 서브 유닛을 함유하는 숙주 세포에서 발현시켰다. 미국 특허 제5,593,859호 및 문헌 (Vourela et al. (1997) EMBO J 16: 6702-6712)에 기재되어 있는 바와 같이 3종의 피키아 파스토리스 균주 (2 가지 프롤릴 4-히드록실라제-발현 균주인 균주 X-33 (야생형 피키아 파스토리스), 균주 P4H-2 및 균주 αβ8를 PmeI에 의해 선형화된 pD032로 전기영동시켰다.
500 ㎍/ml의 제오신에 대한 내성을 나타내는 형질전환체를 선별하였다. 각 형질전환으로부터 얻은 8개의 단리체를 상술한 바와 같이 생장시키고 유도하고, 발현된 재조합 인간 젤라틴의 안정성을 SDS-PAGE로 분석하였다 (도 6). 야생형 피키아 파스토리스 균주 X-33에서, 대략 등몰량의 무손상 재조합 젤라틴 및 단백질분해 단편 (도면의 우측 화살표로 표시된, 겔 상의 재조합 젤라틴 바로 아래에 이동되어 있음)을 관찰하였다 (도 6, 균주 X-33). 프롤릴 4-히드록실라제를 동시발현하는 두 균주에서, 단백질분해 단편의 양이 상당히 감소되었는데, 이는 재조합 인간 젤라틴과 함께 프롤릴 4-히드록실라제가 동시 발현되면 젤라틴의 단백질분해가 상당히 감소되어 젤라틴의 안정성이 증가된다는 것을 의미한다 (도 6, 균주 P4H-2 및 균주 αβ8).
실시예 6: 발현 배지의 보충에 의해 상승된 재조합 인간 젤라틴 발현
카사미노산으로 보충된 배지가 피키아 파스토리스에서 특정 단백질이 발현되는 동안 단백질분해의 양을 감소시킨다는 것은 이미 보고되어 있다 (Clare, J. J. et al. (1991) Gene 105: 202-215). 발현 배지를 다양한 보충물로 강화한 후 피키아 파스토리스에서 발현된 본 발명의 재조합 인간 젤라틴의 분해를 측정하였다. 이러한 특정 연구에서, 서열 20의 재조합 인간 젤라틴 단편을 발현하는, 실시예 5에 기재된 피키아 파스토리스 균주 αβ8를 사용하였다 (실시예 5 및 표 2). 재조합 젤라틴은 카사미노산, 카시톤, 효모 추출물, 펩톤, 펩타민, 트립톤, 겔라톤, 락트알부민 및 소이톤을 비롯한 0-2% 농도의 다양한 보충 성분으로 보충된 배지에서 유도하였다. 락트알부민 가수분해물, 소이톤, 카시톤 및 펩타민 (Difco Laboratories, Detroit, MI)을 비롯한 여러 제제가 재조합 젤라틴 발현도를 증가시켰다 (도 7, 락트알부민 및 소이톤).
이러한 결과는 재조합 젤라틴이 발현되는 동안 사용된 특정한 배지 보충 성분이 젤라틴의 생성을 증가시킬 수 있음을 의미한다. 한 측면에서, 배지 보충 성분으로서 소이톤을 사용한 것은 재조합 젤라틴의 발현을 증가시키는 (동물-유래보다는) 식물-유래의 배지 성분을 제공하였다. 이는 다양한 분야에 사용할 수 있는 재조합 젤라틴의 생산을 위한, 동물 유래의 물질이 없는 환경을 제공할 것이다.
실시예 7: 재조합 인간 젤라틴의 가교
재조합 인간 콜라겐 (미국 특허 제5,593,859호에 기재된 바와 같이 수득함)의 슬러리는 10.8 mg의 재조합 인간 콜라겐 타입 I을 5 ml의 물에 용해시킨 후 20 mM의 인산나트륨 (pH 7.2)에 대해 투석하여 제조하였다. 상기 슬러리의 최종 재조합 인간 콜라겐 농도는 대략 2 mg/ml이었다. 가교된 재조합 인간 젤라틴은 10 ㎕ 또는 5 ㎕의 20% 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 용액 (EDC, Pierce Chemical Co.)을 상기 재조합 인간 콜라겐 슬러리 1 ml에 첨가하여 제조하였다. 가교 반응은 실온에서 밤새 일어났다. 반응하지 않은 EDC는 물에 대해 투석하여 제거하였다.
생성된 가교 결합 재조합 인간 젤라틴은 6% 글리신 SDS-PAGE 분석으로 분석하였다. 도 8은 재조합 인간 젤라틴 (레인 6, 표지된 UNL-5-4), 가교된 재조합 인간 젤라틴 (레인 5, 표지된 UNL 5-4, 0.1% EDC; 레인 4, 표지된 UNL 5-4, 0.2% EDC), 시판되는 경질 캡슐 젤라틴 (레인 3) 및 시판되는 젤라틴 (타입 A, 돼지 피부로부터 얻음, 대략 300 블룸, 레인 2; 시그마 케미칼 코포레이션으로부터 구입함)의 SDS-PAGE 비교를 보여준다. 도 8의 SDS-PAGE 분석에 나타낸 바와 같이, 시판되는 캡슐 젤라틴 및 시그마 젤라틴은 주성분으로서 α-쇄를 함유할 뿐만 아니라, 고분자량의 젤라틴 성분 (분자량이 대략 200-250 kDa임)도 함유하였다. 재조합 인간 콜라겐은 α-쇄로만 구성되어 있었다. 그러나, 가교 후, 시판되는 젤라틴 및 시판되는 캡슐 젤라틴에서 관찰된 것과 유사하게, 가교 재조합 젤라틴은 α-쇄 및 고분자량의 젤라틴으로 구성되어 있었다. 이는 시판되는 캡슐 젤라틴의 분자량 분포와 유사한 분자량 분포를 보이는 재조합 인간 젤라틴이 재조합 인간 콜라겐을 가교시켜 제조할 수 있음을 의미한다. 가교된 재조합 젤라틴은 증가된 겔 강도 및 증가된 점성도가 바람직한 분야에 사용할 수 있다.
실시예 8: 시판되는 젤라틴 및 가용성 재조합 인간 젤라틴의 내독소 함량
카인드 앤드 크녹스 (Kind & Knox (K & K))로부터 구입한 가용성 젤라틴 및 본 발명의 재조합 인간 젤라틴 (실시예 9에 기재된 바와 같이 제조됨)의 내독소 함량은 당분야에 공지된 바와 같이 리물루스 아메오보사이트 라이세이트 (Limulus Ameobocyte Lysate) 시험을 이용하여 측정하였다 (Friberger, P. et al. (1987) Prog. Clin. Biol. Res. 231: 149-169). 3 가지 다른 젤라틴 농도에서 조사하였다. 표 3에 기재된 바와 같이, 본 발명의 재조합 인간 콜라겐 타입 I (rgcI)의 열 가수분해에 의해 생성된 재조합 인간 젤라틴에는 실질적으로 내독소가 없었다. 시판되는 젤라틴의 내독소 함량은 단백질 1 mg 당 약 1 내지 1.5 EU이었다. 본 발명에 기재된 바와 같이 젤라틴을 제조하는 방법은 내독소 함량이 시판되는 젤라틴 제제의 내독소 함량보다 2 내지 3 차수만큼 더 낮은 젤라틴을 생성시켰다. 이러한 낮은 내독소 함량 때문에 본 발명의 재조합 젤라틴은 제약학적 안정화에서 사용하는 것과 같은 특정한 분야에 사용하기에 매우 적합하다.
젤라틴 농도 (mg/ml) K & K 젤라틴 (EU/mg) 재조합 인간 젤라틴 (EU/mg)
3 1.03 <0.005
1.5 1.41 <0.005
0.75 1.29 <0.006
실시예 9: 열 및 산 가수분해에 의한 젤라틴의 유도화
예를 들어, 백신 제제에서 안정화제로 사용되는, 현재 시판되는 가용성 동물-유래의 젤라틴의 분자량 분포와 유사한 분자량 분포를 나타내는 가용성 재조합 인간 젤라틴을 생성시키기 위해 가수분해 방법 (산, 열 및 효소)을 이용하였다.이 실험의 경우, 무손상 재조합 인간 콜라겐 타입 I 및 타입 III를 출발 물질로 사용하였다. 가수분해 조건을 다양하게 함으로써, 최종 물질의 분자량을 변화시켜 정해진 분자량의 물질을 생산할 수 있었다.
시판되는 젤라틴의 분자량 분포:
이들 재조합 인간 젤라틴을 시판되는 젤라틴과 비교하였다. 레이너 데이비스 (Leiner Davis), 그레이트 레이크 (Great Lake), 카인드 앤드 크녹스 (Kind & Knox) 및 다이나겔 (Dynagel)에 의해 제조된 4종의 저분자량 젤라틴 샘플을 구입하여 그들의 특징을 규명하였다. 조사된 모든 젤라틴이 실온에서 가용성이었다. 트리신 SDS-PAGE 겔 상의 젤라틴의 분자량 분포는 도 9에 나타내었고 표 4에 기재하였다. 겔 프로필은 분자량 분포가 0-30 kDa인 다이나겔-1 샘플을 제외하고 시판되는 젤라틴의 분자량 분포가 대략 0-55 kDa임을 보여주었다. 또한, 겔 프로필은 2가지 패턴의 분자량 분포를 나타내었다. 한 예에서, 레이너 데이비스 및 그레이트 레이크로부터 입수한 샘플로부터 유래된 명확히 구별되는 여러 분자 밴드가 SDS-PAGE에 의해 관찰되었다. 다이나겔 및 카인드 앤드 크녹스 샘플로부터 유래된, 두번째 예의 패턴은 명확히 구별되는 밴드 없이 겔 상에서 물질의 연속적인 분포를 보였다. 다이나겔-1 및 다이나겔-2의 분자량 분포는 동일한 분야에 사용하기 위해 동일한 제조기로 제조되었음에도 불구하고 상당히 달랐다. 이 결과는 시판되는 젤라틴의 배치-투-배치 (batch-to-batch) 변화가 상당히 크다는 것을 의미한다.
회사 상대적 이동률 최대 겉보기 분자량 (Da) 분자량*분포 (Da)
K & K 0.3410 70,000 0-55,500
레이너 데이비스 0.3410 70,000 0-55,500
그레이트 레이크 0.3693 60,000 0-47,600
Sol-U-Por, #1 0.3483 65,000 0-51,600
Sol-U-Por, #2 0.4972 37,000 0-29,400
*분자량은 콜라겐성 단백질의 평균 잔기 중량 (91.6)에 대한 표준 단백질의 평균 잔기 중량 (115)의 비인 1.26의 계수로 조절하였음.
젤라틴의 열 가수분해를 다음과 같이 수행하였다. 시판되는 건조 젤라틴을 40-50℃의 물에 용해시켜 5% 젤라틴 용액을 제조하였다. 이 용액의 pH를 열 가수분해용 제제 중의 0.1 N NaOH 또는 0.1 N HCl로 조절하였다. 타입 I 및 타입 III 재조합 인간 콜라겐 둘다를 미국 특허 제5,593,859호에 기재된 바와 같이 피키아 파스토리스에서 발현시키고 정제하였다. 최종 재조합 인간 콜라겐을 10 mM의 HCl에 용해시키고, 물에 대해 투석하고 동결건조하였다. 동결건조된 재조합 인간 콜라겐을 40-50℃의 물에 용해시켜 3% 용액을 제조하였다. 열 가수분해 전, 이 용액의 pH를 아래에 기재한 바와 같이 조절하였다.
열 가수분해를 1 ml 리엑티-비이알 (Pierce)에서 수행하였다. 가수분해 온도는 실험에 따라 100℃부터 150℃까지 변화시켰다. 가수분해 용액의 pH를 기재된 바와 같이 pH 2부터 pH 7까지 변화시켰다. 가수분해 시간도 용액의 온도 및 pH에 따라 1시간부터 32시간까지 변화시켰다. 젤라틴 가수분해물의 샘플을 다양한 시간 간격으로 채취하고 SDS-PAGE로 분석하였다.
120℃에서의 시판되는 젤라틴의 가수분해:
시그마의 고분자량 젤라틴 샘플 (돼지 피부로부터 유래된 타입 A, 250 kDa)을 6가지 상이한 pH 용액에 용해시키고 (5% 젤라틴) 120℃에서 가수분해하였다. pH 2의 용액 및 pH 3의 용액을 2시간 30분동안 가수분해하고 30분마다 샘플을 채취하였다. pH 4의 용액을 5시간동안 가수분해하고 한 시간마다 샘플을 채취하였다. pH 5의 용액, pH 6의 용액 및 pH 7의 용액을 24시간동안 가수분해하고 가수분해로부터 14시간 후 2시간마다 샘플을 채취하였다.
가수분해 패턴은 도 10A, 10B, 10C, 10D, 10E 및 10F에 나타낸 바와 같이 트리신 10-20% SDS-겔 상에서 분석하였다. 겔 프로필은 용액의 pH가 낮을수록 젤라틴의 가수분해가 보다 빨리 일어남을 보인다. 또한, 겔 프로필은 가수분해물 사이의 두 가수분해 패턴을 보였다. 한 패턴은 겔 상에서 명확히 구별되는 여러 분자 밴드를 보였지만 (pH 2 용액 및 pH 3 용액의 산 가수분해 결과를 참조, 도 10A 및 10B), 다른 한 패턴은 겔 상에서 물질의 연속적인 분포를 보였다 (pH 4 용액, pH 5 용액, pH 6 용액 및 pH 7 용액의 산 가수분해 결과를 참조, 도 10C, 10D, 10E 및 10F).
이 결과는 상기 요약된 방법 또는 그의 변법이 시판되는 젤라틴의 분석에서 보여진 바와 같이 두 가지 상이한 타입의 물질을 생성시킴을 나타낸다 (SDS-PAGE 상에서 물질의 구별되는 밴드 대 연속적인 분포). 또한, 이 실험 결과는 고분자량 젤라틴의 열 분해가 다양한 크기의 가용성 젤라틴을 생성시킴을 의미한다. 표 5는 시그마 젤라틴을 120℃, pH 6.0 용액에서 가수분해한 후 시그마 젤라틴을 사용하여 얻은 분자량 분포를 보여준다.
150℃에서의 시판되는 젤라틴의 가수분해:
시그마의 고분자량 젤라틴 샘플 (돼지 피부로부터 유래된 타입 A, 250 kDa)을 4가지 상이한 pH 용액에 용해시키고 (5% 젤라틴) 150℃에서 최대 10시간동안 가수분해하였다. 분석을 위해 가수분해물의 샘플을 2시간마다 채취하였다. 가수분해 패턴을 도 11A, 11B, 11C 및 11D에 나타낸 바와 같이 10-20% SDS-겔 상에서 분석하였다. 겔 프로필은 젤라틴의 분해가 120℃보다는 150℃에서 훨씬 더 빠르게 일어남을 보인다. 또한, 150℃에서 수행된 젤라틴의 가수분해는 저분자량의 젤라틴 단편을 생성시켰다. 표 6은 시그마 젤라틴을 150℃, pH 6.0 용액에서 가수분해한 후 시그마 젤라틴의 분자량 분포를 보여준다.
실시예 10: 재조합 인간 콜라겐 I 및 III의 산 및 열 가수분해
재조합 인간 콜라겐 타입 I을 중성 pH 조건 (pH 7) 하에 120℃에서 최대 8시간동안 가수분해하거나, 산성 pH 조건 (pH 2) 하에 최대 3시간동안 가수분해하였다. 또한, 재조합 인간 콜라겐 타입 III는 중성 및 산성 조건 하에 120℃에서 최대 6시간동안 가수분해하였다. 가수분해는 실시예 9에 기재된 바와 같이 수행하였다. 인간 재조합 타입 I 및 타입 III 가수분해물을 도 12A 및 12B에 나타낸 바와 같이 트리신 10-20% SDS-PAGE 겔로 분석하였다. SDS-PAGE 겔 패턴은 재조합 인간 콜라겐의 열 가수분해가 천연 공급원으로부터 유래된 고분자량 젤라틴의 가수분해 패턴과 동일함을 보인다 (도 9, 도 10A 내지 10F, 도 11A 내지 11D, 도 12A 및 12B). 천연 젤라틴 (pH 7)의 가수분해와 유사하게, 재조합 인간 콜라겐의 산 가수분해물은 명확히 구별되는 여러 분자량 밴드를 보인 반면, 중성 가수분해물은 보다 연속적인 분자량 분포를 보였다. 재조합 인간 젤라틴의 중성 가수분해물의 분자량 분포는 열 분해로부터 6시간 내지 8시간 후 약 0-70 kDa이었다. 산성 조건 하의 가수분해는 훨씬 더 빨리 일어났다. 재조합 인간 젤라틴의 산성 가수분해물의 분자량 분포는 열 처리로부터 2시간 내지 3시간 후 훨씬 더 좁은 약 0-10 kDa이었다.
열 가수분해된 재조합 인간 젤라틴의 추가 정제를 논의하면서, 본 발명자들은 효모 멀티-유전자 재조합 발현 기술이 인간 타입 I 콜라겐의 α1(I) 쇄의 단편들과 함께 인간 젤라틴의 생성에 유용함을 입증하였다. 본 발명자들은 이 기술을 사용하여 크기가 6-65 kDa인 잘 정의된 매우 균질한 젤라틴 단편을 생산할 수 있었다. 이것은 특정한 분야에 사용할 수 있는 젤라틴의 크기 및 생물리학적 성질의 관점에서 매우 뛰어난 유연성을 제공한다.
실시예 11: 재조합 인간 콜라겐 타입 I의 효소 가수분해
재조합 인간 콜라겐 타입 I은 표 7에 기재된 프로테아제 효소를 사용하여 가수분해하였다. 재조합 인간 콜라겐 타입 I은 표 7에 기재된 바와 같은 기질 대 효소의 비율 (중량/중량)을 사용하여 37℃에서 각 효소와 인큐베이션하였다. 처리하여 얻은 인간 재조합 타입 I 가수분해물을 트리신 10-20% SDS-PAGE 겔로 분석하였다. 파파인 및 프로테아제 X 처리로부터 얻은 생성물은 도 13에 나타나 있다. SDS-PAGE 겔 패턴은 재조합 인간 콜라겐의 효소 가수분해가 젤라틴의 다양한 분자량 분포를 형성시킴을 나타낸다. 파파인을 사용한 효소 가수분해는 도 13 및 표 7에 기재된 바와 같은 연속적인 가수분해 패턴을 형성시켰지만, 프로테아제 X를 사용한 가수분해는 명확히 구별되는 여러 분자량 밴드를 생성시켰다. 표 7에 기재된 바와 같이, 이 방법에 의해 생산된 재조합 젤라틴은 특정한 효소를 처리하여 가수분해할 때 다양한 가수분해 패턴을 갖는다. 이것은 특정한 분야에 사용할 수 있는 크기 및 생물리학적 성질을 나타내는 젤라틴의 생산에 높은 유연성을 제공한다.
효소 효소 활성 / 단백질 (mg) 기질 대 효소 비율 가수분해 패턴
키모-파파인 1 U @ 37℃, pH 6.5 500 : 1 연속
브로멜라인 8 U @ 37℃, pH 4.6 5,000 : 1 밴딩 & 연속
프로테아제 VIII 12 U @ 37℃, pH 8.5 7,000 : 1 밴딩
파파인 17 U @ 37℃, pH 6.5 10,000 : 1 연속
프로테아제 X 42 U @ 37℃, pH 8.5 20,000 : 1 밴딩
실시예 12: 다양한 재조합 젤라틴에 대해 유도된 재조합 인간 콜라겐 타입 I에 대한 항체
최대화 연구로서 알려진 바와 같이, 효모 피키아 파스토리스에서 생산된 인간 재조합 타입 I 콜라겐이 접촉 감작제 (sensitizer)로서 기니아 피그에 대한 알레르기 반응을 나타낼 수 있는 잠재력이 있는지를 시험하였다. 이 연구 기간 후, 혈청을 모아 기니아 피그에서 재조합 인간 타입 I 콜라겐의 면역원성을 조사하였다. 1 그램의 rhCI을 0.9% 염화나트륨 주사액 (SCI) 또는 참깨유 10 ml에 침지시키고 37℃에서 72 시간동안 인큐베이션하였다. 그 다음으로, 추출물을 3000 rpm에서 15 분동안 원심분리하고, 투여하기 위한 상등액을 모았다.
하트리 피그 (Hartley pig)를 유도기까지 시험 제품 및 대조구 용액에 노출시켰다. 이 유도기는 3쌍의 피내 (ID) 주사를 짧게 깎여진 영역에 투여하는 것을 수반한다. 제1 쌍의 ID 주사 (두개)는 동일한 부피의 SCI 중의 프로인트 완전 면역보강제 (FCA) 에멀젼으로 구성되었다. 제2 쌍의 ID 주사 (몸통)는 시험 추출물 (재조합 인간 타입 I 콜라겐)로 구성되었다. 제3 쌍의 ID 주사 (꼬리)는 시험 추출물 제품과 동일한 부피의 FCA의 에멀젼으로 구성되었다. 양성 및 음성 대조구 동물은 시험 추출물이 제2 및 제3 쌍의 주사에 포함되지 않는다는 점을 제외하고 시험 동물과 유사한 방식으로 처리하였다.
ID 주사 후 6일째 되는 날, 시험 부위에 염증이 있는지 조사하였다. 그 다음, 시험 부위를 석유 중의 10% SLS로 전처리하고 유리 막대를 사용하여 피부 내로 전달한 후, 24 시간동안 커버를 덮지 않은 상태로 놓아 두었다. 7번째 날, 시험 제품 추출물 0.4 ml에 담군 4.25 cm 직경의 원형 와트만 #3 필터 페이퍼를 각 시험 동물의 면도된 영역에 국소 투여하였다. 국소 유도 투여로부터 13일 후, 동물을챌린지하였다. 각 동물이 우측에 있는 영역을 짧게 깎았다. 다음 날, 시험 추출물, 비히클 대조구 추출물 또는 양성 대조구 용액 0.3 ml를 함유하는 힐 탑 챔버 (Hill Top chamber)를 짧게 깎여진 영역에 도포하고, 24시간 동안 동물을 그 상태로 유지하였다. 챔버를 제거한지 24, 48 및 72시간 후에 투여 부위의 홍반 및 부종에 대해 등급을 매겼다.
72시간 후, 혈액을 모아 응고시킨 후, 2800 rpm에서 15 분동안 원심분리하였다. 혈청을 각 튜브로부터 제거하고 혈청 샘플을 사용할 때까지 -70℃에 보관하였다.
이어서, 재조합 인간 콜라겐 타입 I (rhcI), 재조합 인간 콜라겐 타입 III (rhcIII), 비트로겐 소 콜라겐 (Cohesion Technologies; Palo Alto, CA), 및 본 발명의 다양한 재조합 인간 젤라틴 단편 [6 kDa (서열 18), 10 kDa (서열 19), 18 kDa (서열 20), 33 kDa ( 서열 27), 50 kDa (서열 22) 및 65 kDa (서열 33) 단편을 포함함)에 대한 항체가 면역화된 기니아 피그로부터 얻은 혈청에 존재하는지를 분석하였다 (표 2 및 실시예 1 참조). 재조합 콜라겐 및 재조합 젤라틴을 8% 트리스-글리신 또는 10-20% 트리신 SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동시켰다. 본 연구에 사용된 기니아 피그 각각으로부터 얻은 항-혈청을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 14는 재조합 인간 타입 I 콜라겐 - 특이적 항체가 재조합 인간 타입 I 콜라겐으로 면역화시킨 기니아 피그의 혈청에 존재한다는 것을 보인다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석된 임의의 재조합 젤라틴에 대한 항체 반응성은 조사된 혈청 중 어떤 것에서도 전혀 관찰되지 않았다. 도 14는 본 연구에서 기니아 피그로부터 얻은 항혈청을 사용한 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 4 가지 이상의 여러 기니아 피그로부터 얻은 혈청을 분석한 결과, 각각의 혈청이 도 4에 개시된 결과와 동일한 결과를 보였다.
rhcI을 기니아 피그에 주사한 후 관찰된 항원 반응의 원인이 되는 타입 I 콜라겐의 가능한 에피토프를 밝힐 필요가 있었다. 변성 및 컬럼 크로마토그래피 후 재조합 인간 콜라겐 타입 I을 α1(I) 성분과 α2(I) 성분으로 분리하였다. 문헌 (Bornstein and Piez (1966) Biochemistry 5: 3460)에 기재된 바와 같이 재조합 타입 I 콜라겐의 α1(I) 쇄와 α2(I) 쇄를 시아노겐 브로마이드 (CNBr)로 절단하였다. 무손상 α쇄 및 생성된 펩티드 단편은 SDS-PAGE로 분리하고 상술한 기니아 피그 혈청에 대한 반응성에 대해 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다. 도 15A는 무손상 재조합 인간 타입 I 콜라겐, 및 CNBr에 의해 절단된 재조합 인간 타입 I 콜라겐의 α1(I) 쇄와 α2(I) 쇄를 코마시에 블루로 염색한 SDS-PAGE를 나타낸다. 웨스턴 블롯 분석은 rhcI에 대한 반응성을 나타내는 기니아 피그 항혈청이 타입 I 콜라겐의 α2 쇄 및 그의 특정한 CNBr 단편에 대해 유도됨을 보여준다. 타입 I 콜라겐의 α1 쇄에 대한 반응성은 검출되지 않았다 (도 15).
상기 웨스턴 블롯 분석은 SDS-PAGE 상의 전기영동 분리를 통해 재조합 인간 타입 I 콜라겐, CNBr 단편 및 재조합 인간 젤라틴에 대한 기니아 피그 혈청의 반응성을 조사하였다. 비-변성 조건 하에 이들 폴리펩티드에 대한 기니아 피그 항혈청의 반응성을 조사하기 위해, 직접적인 ELISA 분석을 수행하였다 (도 16). 데이타는 기니아 피그의 항혈청이 rhcI의 천연 입체구조를 인식함을 보인다. 젤라틴 단편이 열 변성 전에 제공되든지 아니면 열 변성 후에 제공되든지 관계없이 본 발명의 재조합 젤라틴 중 어떤 것도 ELISA에 의해 기니아 피그 항혈청과 반응하지 않았다. rhcI은 분석 전에 열-변성되는 경우 ELISA에서 훨씬 더 높은 반응성을 보였다 (데이타는 나타내지 않음). 이것은 혈청 중의 폴리클로날 항체가 나선형 구조보다는 주로 서열 에피토프를 인식한다는 것을 의미한다. 또한, 이 결과는 본 발명의 방법이 인간 콜라겐 타입 I 상, 특히 본 실시예에 나타낸 바와 같은 α2 쇄에 존재하는 항원 부위를 갖는 것에 관심을 가질 필요성을 없게 한다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명은 항원성이 낮은 젤라틴이 필요한 특정한 분야에 유용할, 항원성 부위가 없는 재조합 젤라틴을 생성시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 진의 및 범위를 벗어나지 않는, 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변경은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명이 바람직한 특정 실시양태와 관련하여 기술되어 있다 하더라도, 본 발명이 청구하는 바가 이러한 특정 실시양태에 부당하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 본 기술분야 및 관련 분야의 숙련된 자에게 명백한, 본 발명을 수행하기 위해 기술된 방식의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있는 것이다. 본원에서 언급된 모든 참고문헌은 그 내용 전체가 본원에 포함되는 것으로 한다.

Claims (74)

  1. 재조합 젤라틴을 포함하는 조성물.
  2. 약 5 kDa, 약 8 kDa, 약 9 kDa, 약 14 kDa, 약 16 kDa, 약 22 kDa, 약 23 kDa, 약 36 kDa, 약 44 kDa 및 약 65 kDa로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자량을 갖는 재조합 젤라틴.
  3. 약 0 내지 50 kDa, 약 10 내지 30 kDa, 약 30 내지 50 kDa, 약 10 내지 70 kDa, 약 50 kDa 내지 70 kDa, 약 50 내지 100 kDa, 약 100 내지 150 kDa, 약 150 내지 200 kDa, 약 200 내지 250 kDa, 약 250 내지 300 kDa, 및 약 300 내지 350 kDa로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자량 범위를 갖는 재조합 젤라틴.
  4. 300 kDa을 넘는 분자량을 갖는 재조합 젤라틴.
  5. 50, 100, 150, 200, 250 및 300으로 이루어진 군으로부터 선택되는 블룸 (Bloom) 강도를 갖는 재조합 젤라틴.
  6. 0 내지 100 사이의 블룸 강도를 갖는 재조합 젤라틴.
  7. 제1항에 있어서, 재조합 젤라틴이 부분적으로 히드록실화된 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 재조합 젤라틴이 20 내지 80%, 30 내지 80%, 40 내지 80%, 60 내지 80%, 20 내지 60%, 30 내지 60%, 40 내지 60%, 20 내지 30%, 20 내지 40%, 및 30 내지 40%로 이루어진 군으로부터 선택되는 히드록실화 비율을 갖는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 재조합 젤라틴이 비히드록실화된 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 재조합 젤라틴이 완전히 가수분해된 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 재조합 젤라틴이 부분적으로 가수분해된 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 재조합 젤라틴이 재조합 젤라틴 폴리펩티드의 균질 혼합물을 포함하는 것인 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 재조합 젤라틴이 재조합 젤라틴 폴리펩티드의 비균질 혼합물을 포함하는 것인 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 재조합 젤라틴이 임의의 다른 콜라겐이 섞이지 않은 한가지타입의 콜라겐으로부터 유도되는 것인 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 한가지 타입의 콜라겐이 타입 I, 타입 II, 타입 III, 타입 IV, 타입 V, 타입 VI, 타입 VII, 타입 VIII, 타입 IX, 타입 X, 타입 XI, 타입 XII, 타입 XIII, 타입 XIV, 타입 XV, 타입 XVI, 타입 XVII, 타입 XVIII, 타입 XIX 및 타입 XX 콜라겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 재조합 젤라틴이 1.000 EU/mg 미만의 내독소 수준을 갖는 것인 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 재조합 젤라틴이 0.500 EU/mg 미만의 내독소 수준을 갖는 것인 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 재조합 젤라틴이 0.050 EU/mg 미만의 내독소 수준을 갖는 것인 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 재조합 젤라틴이 0.005 EU/mg 미만의 내독소 수준을 갖는 것인 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 재조합 젤라틴이 재조합 인간 젤라틴인 조성물.
  21. 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 30, 서열 31 및 서열 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 젤라틴.
  22. 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 30, 서열 31 및 서열 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 단리 및 정제된 폴리뉴클레오티드.
  23. 제22항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  24. 제22항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  25. 제24항에 있어서, 원핵 세포인 숙주 세포.
  26. 제24항에 있어서, 진핵 세포인 숙주 세포.
  27. 제24항에 있어서, 효모 세포, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 진핵 숙주 세포.
  28. 제22항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자전환 (transgenic) 동물.
  29. 제22항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자전환 식물.
  30. 서열 26, 서열 27, 서열 28 및 서열 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 젤라틴.
  31. (a) 재조합 콜라겐, 프로콜라겐, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 제공하는 단계, 및
    (b) 재조합 콜라겐, 프로콜라겐, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 처리하여 재조합 젤라틴을 제조하는 단계를 포함하는, 재조합 젤라틴의 제조 방법.
  32. 제31항에 있어서, 재조합 콜라겐이 재조합 인간 콜라겐인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 콜라겐 또는 프로콜라겐을 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드와, 콜라겐 번역후 (post-translational) 효소 또는 그의 서브유닛을 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드를 공동 발현시켜 재조합 콜라겐 또는 프로콜라겐을 제조하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 번역후 효소가 프롤릴 히드록실라제인 방법.
  35. 변형된 콜라겐 구조물로부터 재조합 젤라틴을 직접 제조하는 것을 포함하는, 재조합 젤라틴의 제조 방법.
  36. 제35항에 있어서, 변형된 콜라겐 구조물과, 번역후 효소 또는 그의 서브유닛을 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드를 공동 발현시켜 재조합 젤라틴을 제조하는 방법.
  37. 제35항에 있어서, 번역후 효소가 프롤릴 히드록실라제인 방법.
  38. 소정의 용융 온도에 상응하는 히드록실화 비율을 재조합 젤라틴에 부여하는 것을 포함하는, 상기 용융 온도를 갖는 재조합 젤라틴의 제조 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 부여 단계가 프롤릴 히드록실라제의 존재하에 변형 콜라겐 구조물로부터 재조합 젤라틴을 제조하는 것을 포함하는 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 부여 단계가 히드록실화된 재조합 콜라겐으로부터 재조합 젤라틴을 유도하는 것을 포함하는 방법.
  41. 제38항에 있어서, 상기 부여 단계가 비히드록실화된 재조합 젤라틴을 히드록실화하는 것을 포함하는 방법.
  42. 재조합 젤라틴을 포함하는 결합제.
  43. 재조합 젤라틴을 포함하는 캡슐화제.
  44. 재조합 젤라틴을 포함하는 안정화제.
  45. 재조합 젤라틴을 포함하는 피막형성제.
  46. 재조합 젤라틴을 포함하는 보습제.
  47. 재조합 젤라틴을 포함하는 유화제.
  48. 재조합 젤라틴을 포함하는 증점제.
  49. 재조합 젤라틴을 포함하는 겔화제.
  50. 재조합 젤라틴을 포함하는 콜로이드화제.
  51. 재조합 젤라틴을 포함하는 접착제.
  52. 재조합 젤라틴을 포함하는 제약 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 재조합 젤라틴이 인간 재조합 젤라틴인 제약 조성물.
  54. 재조합 젤라틴을 포함하는 경질 겔 캡슐.
  55. 재조합 젤라틴을 포함하는 연질 겔 캡슐.
  56. 재조합 젤라틴을 포함하는 혈장 증량제.
  57. 재조합 젤라틴을 포함하는 콜로이드성 혈량 보충제.
  58. 재조합 젤라틴을 포함하는 이식편 코팅.
  59. 재조합 젤라틴을 포함하는 의료용 스펀지.
  60. 재조합 젤라틴을 포함하는 의료용 플러그.
  61. 재조합 젤라틴을 포함하는 약제 안정화제.
  62. 재조합 젤라틴을 포함하는 미세 담체.
  63. (a) 재조합 젤라틴을 포함하는 조성물; 및 (b) 이 조성물을 대상에게 전달하는 장치를 포함하는 킷트.
  64. 재조합 젤라틴을 포함하는 식용 조성물.
  65. 재조합 젤라틴을 포함하는 단백질 보충제.
  66. 재조합 젤라틴을 포함하는 지방 대용제.
  67. 재조합 젤라틴을 포함하는 영양 보충제.
  68. 재조합 젤라틴을 포함하는 식용 코팅.
  69. 부분적으로 히드록실화된 재조합 젤라틴을 포함하는 사진용 조성물.
  70. 완전히 히드록실화된 재조합 젤라틴을 포함하는 사진용 조성물.
  71. 재조합 젤라틴을 포함하는 화장제 조성물.
  72. 재조합 젤라틴을 포함하는 산업용 조성물.
  73. 재조합 젤라틴을 포함하는 세포 배양 조성물.
  74. 재조합 젤라틴을 포함하는 실험실용 조성물.
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