NL1007908C2

NL1007908C2 - Zilverhalide-emulsies met recombinant collageen die geschikt zijn voor fotografische toediening alsmede de bereiding daarvan.

Info

Publication number: NL1007908C2
Application number: NL1007908A
Authority: NL
Inventors: George Valentino Van Heerde; Alexis Cornelis Van Rijn; Jan Bastiaan Bouwstra; Frederik Anton De Wolf; Andreas Mooibroek; Marc Willem Theodoor Werten; Richele Deodata Wind; Tanja Jacoba Van Den Bosch
Original assignee: Fuji Photo Film Bv
Priority date: 1997-12-24
Filing date: 1997-12-24
Publication date: 1999-06-25
Also published as: JP5426135B2; DE69823790T2; JP2009045069A; EP0926543B1; EP0926543A1; DE69823790D1; JPH11338090A

Description

TITEL

5

Zilverhalide-emulsies met recombinant collageen die geschikt zijn voor fotografische toediening alsmede de bereiding daarvan.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op verbeterde fotografische films en verbeterde werkwijze ter vervaardiging van 10 genoemde films. In het bijzonder wordt de verbetering bewerkstelligd door toepassing van recombinant-DNA-technologie bij de vervaardiging van een bestanddeel van een fotografische film. Het bestanddeel van belang is collageen.

15 ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

De werkwijze ter vervaardiging van een film is een complexe procedure waarover veel is beschreven en geoctrooieerd. In algemene termen bestaat de werkwijze voor het bereiden van fotografisch papier 20 en negatieve film uit het bekleden van een aantal lagen op hetzij laminaatpapier, hetzij een negatieve filmdrager. Deze lagen staan bekend as emulsielagen die voor straling gevoelige zilverhalidekristallen als meest essentieel bestanddeel kunnen bevatten of intermediaire lagen zonder deze fotogevoelige 25 bestanddelen. De onderhavige uitvinding is gericht op het verbeteren van de fotogevoelige laag als zodanig en het verbeteren van de vervaardigingswerkwijze van fotografische lagen.

Er zijn drie stadia waarbij gelatine in de filmvervaardigingswerkwijze worden toegepast. De functie van het 30 gelatine verschilt in elk stadium en derhalve zijn de vereiste kenmerken voor elk stadium verschillend en kan worden verwacht dat collageenachtige stoffen specifiek op maat kunnen worden gemaakt om bij elke specifieke toepassing geschikt te zijn.

Veel aandacht is gericht op het proces van bereiding vein zilver-35 halide-emulsies voor fotografische toepassingen. Veel aandacht is besteed aan de rol van korrelmorfologie van zilverhalidekristallen en aspecten die het AgX kernvormingsproces en het daarop volgende rijpingsproces beïnvloeden. Het meest essentiële bestanddeel in een emulsielaag van een fotografische drager bestaat uit voor straling 40 gevoelige zilverbromide-microkristallen die eventueel jodium en/of chloride bevatten waarnaar in het algemeen gerefereerd wordt als zil- i Π O '*> Λ 1*1, 2 verhelidekorrels. Een peptiseermiddel wordt gedurende de precipitatie van de korrels toegevoegd teneinde ongecontroleerde coalescentie of flocculatie te vermijden. Het inbrengen van het peptiseermiddel kan echter een aantal nadelen vertonen, o.a. het beperken van de vorming 5 van dunne tabulaire korrelemulsies met gemiddelde en hoge aspectratio die op hun beurt nadelen vertonen bij fotografie. Gelatine is in diverse vormen toegepast in fotografische filmprocessen als peptiseermiddel. Het is algemeen bekend dat de tabulaire korrels met een hoge aspectratio diverse fotografische voordelen hebben zoals vergrote ' 10 scherpte, verbeterde snelheid-korreligheidverhoudingen, toegenomen blauwe en zonder blauwe snelheidsscheiding, snellere ontwikkelbaarheid en een hoger zilverkleurvermogen (Research Disclosure Vol. 225. Jan. 1983» onderwerp 22534; EP-A-0.6l0.796). Het is eveneens wenselijk geacht tabulaire korrels te produceren niet slechts met een hoge 15 aspectratio maar eveneens met een smalle korrelgrootteverdeling anders ~ uitgedrukt als een wens voor mono- of homodispersieteit.

Tot heden is het gelatine dat in commerciële processen wordt toegepast afgeleid vein dierlijke bronnen in het algemeen simpelweg door afleiding uit bot en huid van dieren. De nadelen vein dit materi-20 aal zijn de aanwezigheid van onzuiverheden, alsmede het feit dat de aard van het preparaat onduidelijk gedefinieerd is en derhalve niet reproduceerbaar is. Het is onduidelijk welke bestanddelen aanwezig zijn en in welke hoeveelheden. Daarnaast is het evenmin duidelijk welke bestanddelen eigenlijk vereist zijn voor optimale activiteit. De 25 reproduceerbaarheid van het filmvervaardigingsproces is twijfelachtig vanwege het ontbreken van consistentie van het gelatinepreparaat zoals in diverse stadia van het filmvervaardingsproces wordt toegepast.

De nadelen van gelatine in fotografische toepassingen zijn gedurende jaren in detail aangepakt en zijn het onderwerp geweest van 30 diverse octrooiaanvragen. De meeste vein deze documenten zijn gericht op het aanpakken van werkwijzen voor de ontwikkeling van gemodificeerde gelatines na het verkrijgen daarvan uit de dierlijke bron, teneinde specifieke verbeteringen in de karakteristieken van de gemodificeerde gelatines aan te brengen. US-4.439-520 van 1984 beschrijft de wense-35 lijkheid voor aspectratio's van meer dan 8 voor meer dan 50% van de kristallen, aangezien dit de blauwe snelheid zou verbeteren. In 1987 wordt in Amerikaans octrooi 4.713-320 het gebruik van gelatine met een methioninegehalte beneden 30 pmol per gram, bij voorkeur minder dan 5 1 00 7908 3 ymol per gram genoemd teneinde dunne trapezoidale hexagonale en driehoekige tabulaire korrels te verkrijgen. Een normale van bot afgeleide gelatine werd toegepast dat was geoxideerd teneinde een methionine-gehalte onder 30 ymol per gram gelatine te verkrijgen. Het lagere 5 methioninegehalte wordt eveneens beschreven in US-^.914.0l4 in 1990 omdat dit een breder traject van pBr gedurende preclpitatieomstandig-heden bood. Diverse publicaties hebben betrekking op werkwijzen voor het verlagen van het methioninegehalte van gelatine. ΕΡ-55δΛΐΟ die in 1993 is gepubliceerd beschrijft een oxiderende reagensreactie van 10 alkalihypochloriet of H202 evenals artikelen in J. Photo. Sci. 40 230-230 (Nippi), J. Photo. Sci 37. 1*1-18 (AGFA) van 1992 en J. Imag. Sci 33.1 3-17 van 1989. Zelf zo lang geleden als 1959 werd oxidatie gesuggereerd als een wijze om onzuiverheden te verwijderen.

Er is veel onderzoek uitgevoerd naar collageen en collageenachti-15 ge eiwitten per se onder toepassing van recombinant-nucleinezuurtech-nologie. Het gebruik van recombinant-DNA-technologie in combinatie met collageen en de toepassing daarvan in fotografische toepassingen is echter opmerkelijk afwezig geweest. De meeste documenten die op het gebied van recombinant collageen zijn gepubliceerd zijn gericht ge-20 weest op diagnostische toepassingen onder toepassing van PCR-technolo-gie op genomisch nucleinezuur, hetgeen zelfs de expressie van de voor collageen coderende sequentie niet vereist. Het slechts aanwezig zijn van de sequentie in het genoom voldoet voor diagnose in deze gevallen. Wanneer dergelijke documenten daadwerkelijk expressie van voor colla-25 geen coderende sequenties beschrijft hebben deze zeker geen vereiste van een hoge mate van expressie. Anderzijds waar expressie wordt genoemd zijn slechts gedeeltes van de coderende sequentie tot expressie gebracht, in tegenstelling tot de volledige sequentie. Vaak zijn deze gedeeltelijke sequenties toegepast voor het opwekken van antilichamen 30 waarvoor de hoeveelheden eiwitachtig materiaal die vereist zijn, minimaal zijn. Daarnaast zijn, wanneer eenmaal de antilichamen zijn verkregen, de sequenties niet verder noodzakelijk voor de farmaceutische toepassing. Derhalve is, onder deze omstandigheden, lage expressie geen relevant onderwerp. Tevens kan verwacht worden dat de expressie 35 van kleine gedeeltes van de coderende sequentie de expressieproblemen, die worden toegekend aan de hoge mate van herhaling van de coderende sequentie, elimineert.

Synthetisch nucleinezuur is ontwikkeld in een poging expressie- 1 00 7908 ij problemen die samengaan met langere zich herhalende sequenties te voorkomen en tevens in een poging nieuwe eiwittypes, dat wil zeggen j synthetisch eiwit, te ontwerpen. Zulke synthetische polypeptiden zijn echter extreem kostbaar om te produceren. Het is derhalve niet doen-5 lijk deze in toepassingen te gebruiken waarbij grootschalige productie is vereist, zoals noodzakelijk is in het gebied van fotografische filmproductie.

De toepassingen volgens de stand van de techniek vereisen derhalve hetzij niet de hoge mate van expressie die voor productie op indus-10 triële schaal noodzakelijk is, hetzij leveren zij in feite niet het gewenste resultaat. De documenten die deze toepassingstypen hebben, hebben dientengevolge het probleem van verkrijgen van hoge expressie van natieve collageensequenties of sequenties met overeenkomende lengte en structuur niet aangepakt of opgelost.

15 In het algemeen waar de stand van de techniek een suggestie heeft gedaan ten aanzien van het tot expressie brengen van natieve sequenties of gedeelten daarvan zijn algemene termen gebruikt en is verwezen naar handboeken voor algemene transformatieprotocollen zonder verder detail. Waar voorbeelden zijn gegeven zijn E. coli of S. cevevislae 20 als producerend organisme genoemd en is de mate van expressie niet van belang geweest.

Waar expressieproblemen van collageenachtig eiwit zijn aangepakt is dit gebeurd onder toepassing van hetzij gemodicifeerde E. coli, hetzij hogere diercellen en insectcellen. De laatstgenoemden zijn 25 eveneens gemodificeerd voor postverwerking. De toepassing van het laatste celtype voorkomt echter grootschalige productie vanwege de hoge kosten van de cellen, de media en de isolatie van het product. Het nadeel van E. coli is dat deze het gewenste product niet kan uitscheiden. Het is derhalve niet toepasselijk dergelijke productie-30 (micro)organismen toe te passen bij toepassingen die grootschalige productie vereisen zoals vereist is in het gebied van fotografische filmvervaardiging.

Veel onderzoek is gericht geweest op het bereiken van de post-transcriptiemodificatie die vereist is om tot fibrillair collageen te 35 komen of collageen met een drievoudige helix, hetgeen de toestand is van collageen zoals aanwezig is in dierlijke bronnen, d.w.z. de toestand is van collageen zoals momenteel op industriële schaal bij fotografische toepassingen wordt toegepast. Het is algemeen aanvaard dat 1007908 5 een gastheercel die een postverwerkingsapparaat als zodanig, danwel, door toevoeging van coderende sequenties voor postverwerkingsenzymen, dit bevat, dient te worden toegepast bij het tot expressie brengen van collageenachtig materiaal, teneinde te komen tot collageen met een 5 drievoudige helix, en meer in het bijzonder fibrillair collageen. Het is algemeen aanvaard dat deze vorm van collageen de bruikbare vorm is voor toepassing.

Waar in de stand van de techniek daadwerkelijk is gesuggereerd dat recombinant collageen kon worden toegepast bij fotografische toe-10 passingen is de relevantie van de specifieke vorm van collageen materiaal in het algemeen niet aangepakt vis a vis de vereisten die specifiek zijn voor dergelijke toepassing. Sommige octrooiaanvragen hebben in het voorbijgaan het gebruik van recombinant-collageen voor film genoemd, sommige hebben zelfs specifiek fotografische toepassing ge-15 noemd. De leer van zulke documenten is echter duidelijk gericht op andere aspecten en is niet specifiek gericht op fotografische toepassingen en de speciale vereisten daarvan. Geen van de voorbeelden die in dergelijke aanvragen zijn gegeven zijn om diverse redenen zelfs in feite geschikt voor toepassing in fotografische films. De octrooiaan-20 vragen worden derhalve geacht niet nawerkbaar te zijn en slechts speculatief van aard te zijn wanneer het erop aankomt recombinant-collageen in fotografische film toe te passen. Voorbeelden van dergelijke documenten worden nu verschaft.

In W090/05177 wordt de vervaardiging van nieuwe polymeren be-25 schreven die kleine, zich herhalende sequenties omvatten, in het bijzonder zich herhalende groepen zoals bij zijde worden beschreven. Collageen wordt gesuggereerd als één van de structuren die in staat zijn een zich herhalende eenheid te verschaffen. Er wordt gezegd "de eigenschappen van CLP werden zodanig ontworpen dat zij thermoreversi-30 bele gelering bij hoge temperaturen konden ondergaan, alsmede zodanig dat zij non-immunogeen waren. De hoge stabiliteit van de helices zou hoge treksterkte in vezels of membranen die uit CLP werden geformuleerd creëren. Deze keteneigenschappen zouden het scheppen van hydro-geencolloïden in waterige oplossingen mogelijk moeten maken die ver-35 volgens op harde substraten bij toepassing zouden kunnen dienen als zachte bekledingen." Vervolgens wordt een suggestie gegeven van een zacht bekledingsmateriaal met een ligand voor een cellulaire receptor. De sequentie GLPGPGKGDRGDAGPKGADGSP zou aan het CLP-monomeer moeten 1 0 0 79 0 8 6 worden toegevoegd en een voorbeeld van een construct die tot expressie moest worden gebracht vanuit E. coli wordt verschaft. Met betrekking tot dit preparaat wordt beschreven "de onderhavige preparaten kunnen toepassing vinden als wondverbanden, hetgeen neovascularisatie moge-5 lijk maakt, oogtoepassingen, als matrices voor kunstmatige organen en dergelijke". De combinatie van CLP met andere repetitieve functionele eenheden waarbij functies worden gecombineerd wordt eveneens gesuggereerd. Er worden geen voorbeelden verschaft van toegepaste sequenties.

10 De enige voorbeelden die zijn verschaft tonen een via recombi nant- technologie geproduceerd synthetisch CLP-polypeptide [[GAP(GPP)3“ ! ]2[GPVGSP]n met N-terminale en C-terminale spacers. De spacers hebben een lengte van 33 aminozuren en 25 aminozuren. Dus is het zich herha-- lende GPP-gedeelte van het polymeer dat een lengte heeft van 24 amino- 15 zuren gescheiden door 33+25+6 aminozuren. Op deze wijze kon blijkbaar E. coli een CLP-eiwit van 760 aminozuren tot expressie brengen, d.w.z. met een molecuulgewicht 63·800. Het celbindende CLP had dezelfde basisstructuur maar de hexameer werd door de celbindingsequentie vervangen die boven is gegeven, hetgeen resulteerde in een aminozuurleng-20 te van 8l4 aminozuren en een molecuulgewicht van 70.560. Het zich herhalende GXY-motief is kort en wordt gescheiden door lange, zich niet herhalende sequenties. Verondersteld wordt dat dit expressie door E. coli mogelijk zal maken. Het spacer-DNA codeert voor twee cysteïne-groepen en eveneens voor drie methioninegroepen.

25 Het geciteerde document vermeldt in het inleidende gedeelte met betrekking tot collageen " chemisch gehydrolyseerde natuurlijk collageen kan worden gedenatureerd en worden gerenatureerd door verwarming en afkoeling om gelatine te vervaardigen dat kan worden toegepast in fotografische en medische toepassingen onder andere toepassingen. De 30 keteneigenschap van collageen dat voor dit fenomeen verantwoordelijk is, is het vermogen ervan spontaan interketenaggregaten te vormen met een conformatie die wordt aangeduid als een drievoudige helix". Het werd in het bijzonder opgemerkt dat helixstructuur vereist was. De daarop volgende tekst zwijgt over enige fotografische toepassingen en 35 is duidelijk gericht op compleet andere zaken. De daarop volgende tekst zwijgt eveneens over de mate van expressie die door E. colt wordt verkregen. De zich herhalende structuur is aanwezig in een dusdanig lage hoeveelheid dat het onwaarschijnlijk is dat het voldoende 1 00 7908 7 collageenachtige activiteit zal behouden om in fotografische toepassingen bruikbaar te zijn. Daarnaast maakt de aanwezigheid v ïïcysteïne- en methioninegroepen in de hoeveelheden die daarin worden verschaft, dergelijke structuren ongeschikt voor toepassing in foto-5 grafische toepassingen. Derhalve zal een deskundige op het gebied van fotografische toepassingen worden afgeraden de leer van dit document bij fotografische toepassingen toe te passen.

Dezelfde uitvinders als in de vooraf geciteerde octrooiaanvrage beschrijven in W093/10154 collageenachtige eiwitpolymeren met een hoog 10 molecuulgewicht met zich herhalende triadsequenties met een verlaagd prolinegehalte. Er wordt gezegd dat zij tot productie in ééncellige microorganismen bij hoge molecuulgewichten en met een hoge mate van efficiëntie in staat zijn. Zij geven aan "het uniek zijn van het collageen zich herhalende tripeptide is een uitdaging voor recombinant-15 technologie in het licht van de hoge mate van repetitiviteit van de sequentie en het frequente gebruik van de aminozuren, glycine en pro-line in de samenstelling. Genen die coderen voor eiwitten met een hoge mate van glycine en proline zijn per definitie samengesteld uit hoge hoeveelheden van de nucleotiden, guanidine en cytidine in aan zichzelf 20 complementaire sequenties. Dus, naarmate men het gen synthetiseert is er een grote gelegenheid voor de strengen lussen te vormen, enkel-strengig DNA uit te knippen, recombinatiegebeurtenissen te laten optreden die in verlies van gensegmenten, alsmede inefficiënte transcriptie en/of translatie kan resulteren. Er bestaat derhalve aanzien-25 lijke interesse in het ontwikkelen van technieken en preparaten die de voordelige eigenschappen van collageen verschaffen, terwijl zij tegelijkertijd stabiele expressie van collageenachtige eiwitten met een hoog molecuulgewicht mogelijk maken." Daarnaast wordt genoemd "de polymeren zullen verder worden gekenmerkt door net zoals collageen 30 helices te verschaffen die in staat zijn tot denaturatie en renatura-tie, het vormen van gelen enz." Een molecuulgewicht tussen 30-150 kD wordt gesuggereerd en ten minste in aantal van de aminozuren tussen de glycines zijn proline, ten minste 80# van de triadsequenties heeft glycine als eerste aminozuur, ten minste 40# in aantal van de 35 triadsequenties omvat ten minste één proline. Het voorbeeld toont het gebruik van drie typen zich herhalende GX0 coderende sequenties en N-terminale en C-terminale spacersequenties. Dezelfde spacersequenties uit de vorige octrooiaanvrage werden toegepast. De structuur van de 10 0 79 0 8 8 zich herhalende sequenties was [[GAHGPAGPK]2(GAPGPAGPP) 24 (GAHGPAGPK)2]2=[[C]2[A]24[C]2]2. De lengte I van het vervaardigde polypeptide bedroeg 561 aminozuren met een mole- j cuulgewicht van 46.409 Dalton. In een ander voorbeeld was de represen- 5tatieve sequentie [[GAHGPAGPK]2](GAPGPAGPP)12(GAHGPAGPK)2]5=[[C]2[A]12[C]2]5· De lengte van het vervaardigde polypeptide was 777 aminozuren met een molecuul-gewicht van 64.094 Dalton met een waargenomen eiwitband op 100 kD. In - het derde voorbeeld was de structuur [[GAHGPAGPK]2(GAPGPAGPPGSRDPGPP)- 10 12{GAHGPAGPK)2]4=[[C]2[AB]12[C]2]4. Het voorbeeld had IO65 aminozuren en een molecuulgewicht 91.966 met een eiwitband die zichtbaar was bij 135 kD. Ogenschijnlijk kleinere versies werden eveneens vervaardigd met eiwitbandgewichten va 28 kD, 64 en 98 kD. Met betrekking tot expressie zijn de enige details die worden verschaft dat detectie met 15 antisera door middel van Western blot werd uitgevoerd en dat de expressie van het polymeer met volledige lengte afnam met gengrootte terwijl de synthese van mRNA met volledige lengte op vergelijkbare niveaus bleef. Een andere groep polymeren met twee andere zich herhalende eenheden werd eveneens vervaardigd [[C]2]DB]12[C]2]4, 20 [[C]2[DB]6[C]2]4 en [[C]2[D]24[C]2]4, waarbij B en C hetzelfde zijn als hierboven en D = GAQGPAGPG. Deze drie eiwitten die respectievelijk zijn getoond hadden 1065 aminozuren en MW 91-533 D, 633 aminozuren en MW 55-228 D, IO65 aminozuren en MW 85-386 D met een eiwitband die zichtbaar was bij 140 kD. Van de voorbeelden is slechts informatie met 25 betrekking tot de kenmerken van het product gegeven voor nummer 6. Het product is extreem oplosbaar in water. Bij kamertemperatuur of daarboven zijn oplossingen van meer dan 8% in water viskeus, doch vloeibaar en vormen bij afkoelen tot 0°C een vaste gel. Bij verwarming boven 28°C vormt de gel een dikke oplossing. Een thermoreversibele overgang 30 tussen vloeistof en gel is dus geïllustreerd. Het laatste voorbeeld had betrekking op een structuur (GAPSQGAPGLQ)68, eveneens met dezelfde spacers en 1077 aminozuren met een molecuulgewicht 91-266 D. Met betrekking tot toepassing van dit polypeptide wordt niets meer genoemd dan in de vorige geciteerde aanvrage van dezelfde uitvinders. Blijk-35 baar door het variëren van de blokcopolymeerstructuur van het zich herhalende GXO-motief is het mogelijk geworden expressie van langere, zich herhalende sequenties te laten optreden. Hoe efficiënt een dergelijk eiwit tot expressie wordt gebracht is echter niet duidelijk. Er 1 1007908 9 is geen specifieke leer met betrekking tot fotografische toepassingen gegeven. In het bijzonder gebruiken alle voorbeelden een spacer met cysteïne en methionine, hetgeen ongewenst is bij fotografische toepassingen. Derhalve zou een deskundige op het gebied van fotografische 5 toepassingen worden weggeleid van het toepassen van de leer van dit document bij fotografische toepassingen.

Frans octrooi 26853^7 bespreekt de wenselijkheid van het produceren van recombinant materiaal met vergelijkbare eigenschappen als gelatine. Het voordeel zou een meer homogeen product zijn die de re-10 produceerbaarheidsproblemen zou oplossen en de mogelijkheid zou bieden chemische functies daarvan te modificeren. Het idee was het bereiden van oligopeptiden als gelatinesubstituten. Het gekozen microorganisme was E. colt en er wordt vermeld dat het afwezig zijn van posttransla-tie-modificaties zoals glycoliserlng die kenmerkend zijn voor coli 15 geen probleem vormt. Eveneens wordt genoemd dat andere gastheren mogelijk zijn. Er worden geen voorbeelden gegeven van dergelijke gastheren. De toe te passen nucleïnezuursequentie dient een voor gelatine-peptide coderende sequentie voor (glyX-Y)n, gekoppeld aan Met-Cys-His-His-His-Leu-Met codons te omvatten, teneinde selectie te laten plaats-20 vinden. De sequentie die bij wijze van voorbeeld wordt gegeven codeert voor Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Arg-Gly-Pro-Lys-Gly-Trp-Met. In een later proefschrift van de uitvinder is duidelijk dat de mate van expressie onvoldoende was voor industriële toepassing van enig soort. Het proces van terugvinden van het geproduceerde aminozuur was ingewikkeld. E. 25 coli was de gastheercel met de reeds daarvoor genoemde nadelen bij belangstelling voor productie op industriële schaal. Uiteindelijk werd niets daadwerkelijk geïllustreerd met betrekking tot toepassing van het voorgestelde collageen in een fotografische film. Derhalve zou een deskundige op het gebied van fotografische toepassingen worden wegge-30 leid van het toepassen van de leer van dit document bij fotografische toepassingen.

Uiteindelijk is een Amerikaans octrooi verleend aan Kodak in 1990 die betrekking had op specifiek gemodificeerde collageenachtige poly-peptiden en de toepassing daarvan voor fotografische doeleinden waarin 35 wordt beschreven dat collageenachtige peptiseermiddelen met zilverbin-dingssterkte beneden 50 mV kunnen leiden tot een hoge mate van dunne tabulaire korrel. Dit document laat dit zien voor een aantal synthetisch geproduceerde polypeptiden met een lengte van 25 aminozuren. Dit 1 0 0 7 a 0 8 10 document noemt eveneens een polypeptide met een collageenachtige structuur dat zou zijn bereid onder toepassing van recombinant-technologie. Het recombinante polypeptide is een synthetisch polypep-I tide met een blokcopolymeerstructuur bestaande uit slechts aminozu- 5 ren. Er worden geen daadwerkelijke expressiedetails gegeven voor dit recombinant-polypeptide, er wordt slechts verwezen naar standaard moleculaire biologie vervaardigingsprotocollen, alsmede het gebruik van S. cerevisiae als expressiegastheer. Het molecuulgewicht is bij ; benadering 26 kDa. Het is derhalve de vraag of een moleculair bioloog 10 die op de hoogte was van de expressieproblemen die in detail in andere documenten van dezelfde datering zijn gegeven, alsmede van een latere datering, serieus een dergelijke vervaardiging zal overwegen. Daar-- naast zijn geen details met betrekking tot bindingssterkte van het recombinant geproduceerde product verschaft, zodat het eveneens de 15 vraag is of een deskundige op het gebied van fotografische toepassingen serieus in overweging zou nemen dit product in een zilverhali-de-emulsie toe te passen voor fotografische film, of serieus zou verwachten dat het de kenmerken van de korte synthetische polypeptiden die zijn beschreven, zou vertonen. Het document suggereert eveneens 20 dat de specifieke polypeptiden die zijn beschreven histidine, methionine en isoleucine op specifieke punten omvatten, namelijk op Xaa van de volgende formule die hoge bindingssterkte zullen vertonen en geen tabulaire korrelvorming zullen vertonen. De formule van de verbinding is 25 Gly Pro Xaal Gly Leu Xaa2 Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ala Ser Gly Ala Pro Gly Phe Gin Gly. Analyse van de tabel die details van de verbindingen, die door Kodak zijn onderzocht verschaft laat zien dat alle verbindingen met hoge bindingssterkte ten minste één reducerend aminozuur per 25 aminozuren bevatte, derhalve resulterend in gehaltes met 30 meer dan 400 pmol methionine per gram polypeptide. De verbindingen die worden geïllustreerd met lage bindingssterkte en tabulaire korrelvorming omvatten geen reducerende aminozuren Met of His.

BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

35

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op het gebruik van I recombinant-DNA-technologie, waardoor nu uiteindelijk productie van grote hoeveelheden in hoofdzaak zuiver collageen materiaal mogelijk 1007908 11 wordt, waarbij de bovengenoemde moeilijkheden worden overwonnen. Voor de eerste keer is een bereidingsproces van recombinant~collageen uitgevoerd waarbij een hoge mate van expressie wordt verschaft zonder dure media, expressiegastheren of niet uitscheidende expressiegast-5 heren nodig te hebben. Daarnaast is het eveneens mogelijk geworden collageen dat gekozen is en/of is aangepast voor optimale toepassing in elk specifiek stadium van het productieproces van de fotografische film waar gelatine tot dusver is toegepast te produceren. Hierdoor wordt nog verdere verbetering van film mogelijk gemaakt. Een verbeterd 10 filmproductieproces is eveneens nu mogelijk, hetgeen leidt tot een afname in productiekosten.

De onderhavige uitvinders hadden interesse in het verkrijgen van een meer uniform filmmateriaal en besloten de mogelijkheid het produceren van natief collageen te onderzoeken dat identiek was met colla-15 geen dat uit dierlijke bronnen werd afgeleid, zoals tegenwoordig in het industriële fotografische filmproductieproces wordt toegepast. Zij verwachtten dat het gebruik van via recombinant-technologie geproduceerd collageen kon leiden tot verbeteringen in de zilverhalide-emul-sieproductie vanwege de meer uniforme aard ten opzichte van de natuur-20 lijke bron die een groot aantal contaminanten en een mengsel van collageentypes van niet gedefinieerde en wisselende aard met collageen type 1 als hoofdbestanddeel omvat. Het idee was een stof te gebruiken die zo dicht mogelijk bij het natuurlijke collageen kwam in plaats van synthetisch ontworpen collageenachtge polypeptiden met blokcopolymeer-25 structuur te gebruiken. Men hoopte dat expressieproblemen voor een sequentie die overeenkwam met de natieve sequentie kleiner zouden zijn dan die welke zijn gevonden bij het synthetisch ontworpen collageenachtig polypeptide, zoals reeds in detail in de stand van de techniek is beschreven.

30 Echter in tegenstelling tot de natieve situatie voor collageen werd besloten pogingen helixachtige structuren los te laten onder toepassing van de recombinant-technologie. In het licht van pagina 1, W093/07889 die meldt "tenzij een geschikt aantal y-positie propylgroe-pen wordt gehydroxyleerd tot 4-hydroxyproline door propyl-4-35 hydroxylase kunnen de nieuw gesynthetiseerde ketens niet vouwen tot een drievoudige helixconformatie bij 37*C. Indien de hydroxylering niet geschiedt blijven de polypeptiden in een non-helixvorm, worden slecht uitgescheiden door de cellen en kunnen zichzelf niet tot colla- 100 7908 12 geenfibrillen assembleren". Het is derhalve verrassend dat onze recom-binante sequenties resulteren in expressieproducten die zeer goed worden uitgescheiden door de expressiegastheer. Op basis van dit document konden problemen worden verwacht bij toepassing van uitscheidende 5 cellen, teneinde uitscheiding te bewerkstelligen. Wij hebben eveneens recombinant-collageen geproduceerd onder omstandigheden, dusdanig dat het de recombinant-collageenverbinding de fibrilstructuur of de drie-I voudige helix die kenmerkend is voor natief collageen zoals tegenwoor dig bij fotografische toepassingen wordt gebruikt niet kan vormen. Met 10 het oog op dit verschil met het huidige commerciële product was het de vraag of de resulterende recombinantverbinding even bruikbaar zou zijn voor fotografische toepassing als een helix omvattende verbinding, s Daarnaast konden problemen worden verwacht bij de expressie en de afscheiding van een dergelijk expressieproduct. De open structuur kon 15 het expressieproduct extreem kwetsbaar laten voor een aanval door proteasen in de cel.

= De resultaten na een aanzienlijke hoeveelheid zware arbeid bij het kloneren van een genomische sequentie voor collageentypes I en III, waarbij expressieproblemen werden overkomen teneinde voldoende 20 hoeveelheden te produceren om testen in fotografische toepassingen te kunnen beginnen waren onverwacht goed. Ten eerste was de mate van expressie onverwacht hoog. Het was hoger dan 0,95 B per liter en bedroeg zelfs meer dan 3 S per liter in totaal. Dit werd totaal onverwacht geacht, allereerst met het oog op alle problemen die in de stand 25 van de techniek waren beschreven. De mate van expressie was zelfs groter dan de productiehoeveelheden die werden bereikt met de gastheer Pichia pastoris voor andere eiwitten, waarvan bekend was dat deze niet zo notoir moeilijk in hoge hoeveelheden te produceren waren zoals collageen. Ten lange leste leek het mogelijk een vorm van recombinant-30 collageen te produceren in een economisch interessante hoeveelheid met een economische interessante expressiegastheer. Het feit dat productie op grote schaal mogelijk was maakte uiteindelijk het daadwerkelijk uitvoeren van testen op het gebied van fotografische toepassing uitvoerbaar. Testen voor fotografische toepassingen werden slechts moge-35 lijk gemaakt nadat voldoende recombinant collageen kon worden geproduceerd in betrekkelijk grote hoeveelheden, hetgeen in contrast staat ten opzichte van de kleine hoeveelheden die vereist zijn voor de far-I ί maceutische toepassingen. Na het uitvoeren van deze testen werd ont- ' .100 79 0 8 13 dekt dat tabulaire korrelvorming hoog was (zie tabel 1).

Voor het eerst werd de toepassing van in hoofdzaak zuiver collageen type III in een fotografische emulsie als peptiseermiddel toegepast. De resultaten waren uitstekend. Volkomen onverwacht vonden wij 5 een mate van tabulaire korrelgrootte hoger dan 95%· Dit was zelfs beter dan de prestaties van het Kodak-polypeptide met polypeptiden met een lage bindingssterkte en dit werd zeer verrassend geacht met het oog op het feit dat een bindingssterkte van 69,5 mV werd gevonden voor dit product en in lijn met de Kodak leer werd daarvoor geen tabulaire 10 korrelvorming verwacht. Derhalve werd de theorie die door Kodak is gesteld met betrekking tot de vereisten van de bindingssterkte beneden 50 mV, teneinde 80% tabulaire korrelvorming te krijgen omver geworpen. Aldus werd de route geopend een aantal peptiseermiddelen te ontwikkelen met zilverbindingssterkten hoger dan die, die in de stand vein de 15 techniek zijn genoemd als zijnde geschikt voor toepassing in zilverha-lide-emulsies die tabulaire korrels in een hoeveelheid van meer dan 80% vereisen. De route werd eveneens geopend om andere typen collageen dan type I als voornaamste collageenbestanddeel van peptiseermiddel in fotografische emulsies toe te passen. Aangezien de mate van homologie 20 tussen de diverse natieve collagenen 40 tot 50% bedraagt kan men goede resultaten van eveneens in kleine mate gemanipuleerde natieve sequenties verwachten. Een aminozuursequentie die meer dan 50% homologie vertoont met een natieve collageenaminozuursequentie kan derhalve verwacht worden goede resultaten te verschaffen. Mutaties van natieve 25 sequenties kunnen inserties, deleties en substituties vis a vis de natieve sequentie omvatten. De sequenties die bruikbaar zijn volgens de uitvinding moeten echter een minimale mate van variabiliteit hand-”haven, teneinde expressieproblemen van de daarvoor coderende nucleïne-zuursequenties te voorkomen. Derhalve dienen de mutaties altijd in een 30 aminozuursequentie met meer dan vier verschillende aminozuren te resulteren. Het GXY-motief dient niet de vorm van een blokcopolymeer te hebben en dient evenmin spacersequenties te omvatten tussen een aantal GXY-motieven. Bij voorkeur zijn meer dan 8, zelfs meer dan 9 verschillende aminozuren aanwezig. In het voorbeeld wordt een eiwit toegepast 35 met 19 verschillende aminozuren. Er zijn slechts 20 aminozuren die in de natuur voorkomen. Geschikt kunnen 10-20 aminozuren of 10-19 aminozuren worden toegepast (bij voorkeur wordt echter cysteine vermeden).

De uitvinding omvat derhalve een dunne tabulaire zilverhalide- 1 00 7908 i ill emulsie waarbij de tabulaire korrels meer dan 75% uitmaken van het totale korrel geprojecteerde oppervlak van de emulsie die zilverhali-de-korrels omvat die bij aanwezigheid van een peptiseermiddel een kern hebben gevormd en daarna bij aanwezigheid van peptiseermiddel zijn 5 gegroeid waarbij het peptiseermiddel in hoofdzaak zuiver collageenachtig materiaal is dat is bereid door genetische manipulatie van voor natief collageen coderend nucleïnezuur, welk peptiseermiddel een ami-nozuursequentie heeft die meer dan 4 verschillende aminozuren omvat. Een dergelijke emulsie kan op geschikte wijze een peptiseermiddel 10 omvatten met een aminozuursequentie die meer dan 50% homologie vertoont met natief collageen, bij voorkeur meer dan 60%. De emulsie kan peptiseermiddel omvatten met een aminozuursequentie equivalent aan die welke in de natuur voorkomt voor collageen, waarbij "equivalent" impliceert een aminozuuridentiteit van ten minste 80%, bij voorkeur ten 15 minste 90%, met meer voorkeur voor een aminozuursequentie die dezelfde is als die welke in de natuur voorkomt. De emulsie kan een peptiseermiddel omvatten met een aminozuursequentie die in hoofdzaak dezelfde is als die welke in de natuur voorkomt, waarbij "in hoofdzaak" impliceert mutatie van minder dan 5 aminozuren, bij voorkeur minder dan 3-20 Geschikte collageen types zijn I, II en III. Een voorkeur bestaat voor sequenties die zo dicht mogelijk bij de natieve sequentie zijn, teneinde activiteit te garanderen en expressieproblemen te vermijden. Een collageen type III aminozuursequentie volgens de uitvinding omvat op geschikte wijze of heeft de sequentie van figuur 3· Een collageen-25 type-I-aminozuursequentie volgens de uitvinding omvat of heeft de sequentie van figuur 18 of 12. Collageentype III heeft de aminozuursequentie die in referentie 5 van voorbeeld 1 is gedefinieerd en is hierin dcor verwijzing opgenomen. Een emulsie volgens de uitvinding waarbij het peptiseermiddel aanwezig is in in hoofdzaak zuivere vorm 30 betekent dat het peptiseermiddel in hoofdzaak vrij is van nucleïnezuur, polysachariden en ander eiwit. De voorbeelden illustreren dat dat inderdaad mogelijk is. De aanwezigheid van suikers en nucleïnezuur in zelfs spoorhoeveelheden kan desastreuze effecten hebben op kristalvorming en het was de vraag of afdoende zuiver recombinant-materiaal 35 voor de specifieke fotografische toepassing kon worden geproduceerd. De mate van verontreiniging met eiwit moet lager zijn dan met commer-: ciële. producten.

Het is voordelig bij toepassing van Pichia pastoris als expres- 1 0 G 7 9 0 3 15 siegastheer een nucleïnezuursequentie te gebruiken die codeert voor een aminozuursequentie die vrij is van de sequentie MGPR, hoewel dit in de natieve sequentie van collageen-type-I aanwezig is omdat wij onverwacht hebben gevonden dat deze sequentie een nieuwe herkennings-5 sequentie is van een protease die zich in Pichia pastor is bevindt.

Het peptiseermiddel hoeft niet identiek te zijn met de natieve sequentie maar kan een fragment met gedefinieerde lengte en samenstelling zijn die is afgeleid van een voor natief collageen coderende sequentie, welk fragment het GXY-motief omvat dat kenmerkend is voor 10 collageen, welke lengte zodanig is dat het fragment op aminozuurbasis gewicht ten minste 2,5 kDa bedraagt. Geschikte gewichten kunnen liggen tussen 2,5 en 100 kDa. Fragmenten van diverse grootte zijn geschikt. 5“50 kDa, zelfs 20-50 kDa zijn geschikte uitvoeringsvormen die kunnen worden toegepast.

15 Diverse manieren zijn beschikbaar om de afwezigheid van helix- structuur te verzekeren. Bijvoorbeeld door te verzekeren dat het peptiseermiddel vrij is van hydroxyproline en/of vrij is van procollageen en telopeptiden. Bij voorkeur dient voor fotografische toepassingen het peptiseermiddel vrij te zijn van cysteïne. Een emulsie volgens de 20 uitvinding waarin het peptiseermiddel niet gedeamineerd is, is een interessante verdere uitvoeringsvorm van de uitvinding evenals een peptiseermiddel met een isoelektrisch punt van 7“10.

Verder onderzoek werd uitgevoerd teneinde te bepalen wat verder kon worden ontdekt teneinde te definiëren welke andere parameters 25 konden worden toegepast om de resultaten te verbeteren. Teneinde dit te bewerkstelligen werd een aantal gemodificeerde collagenen geanalyseerd, dat wil zeggen, niet recombinant geproduceerde collagenen met onze recombinant-collagenen in testen teneinde relevante parameters te bepalen. Wij definieerden vervolgens diverse categorieën verbindingen 30 die geschikt zijn voor het produceren van zilverhalide-emulsies met de vereiste mate van tabulaire korrelvorming.

Een emulsie volgens de uitvinding in één van de andere uitvoeringsvormen die reeds boven zijn genoemd met het peptiseermiddel die verder geoxideerde reducerende aminozuren omvat, d.w.z. in een mate 35 zodanig dat reducerende aminozuren aanwezig zijn in een hoeveelheid equivalent aan een reducerende sterkte van tussen 0,1 en 200 pmol methionine per gram van het peptiseermiddel, is een geschikte uitvoeringsvorm. Een lagere mate reducerend vermogen verdient de voorkeur 1 00 79 08 16 zodat voorkeursemulsies volgens de uitvinding peptiseermiddel zullen omvatten die geoxideerde reducerende aminozuren omvatten in een mate, zodanig dat reducerende aminozuren aanwezig zijn in een hoeveelheid equivalent met een reducerend vermogen van tussen 0,1-80 pmol methio- i 5 nine per gram van het peptiseermiddel. Redelijk hoge hoeveelheden geoxideerde reducerende aminozuren in een mate zodanig dat reducerende aminozuren aanwezig zijn in een hoeveelheid, equivalent aan een reducerend vermogen van tussen 30“80 pmol methionine per gram van het , peptiseermiddel zijn eveneens in staat afdoende resultaat te geven.

10 Dit is redelijk verrassend gezien de eerdere leer met betrekking tot de vereisten voor lage waarden van reducerend vermogen voor tabulaire korrelvorming van diverse publicaties uit de stand van de techniek. De uitvinding dekt eveneens zulk gemodificeerd collageen met hogere hoeveelheden methionine dan 80 ymol, bijvoorbeeld gemodificeerd type I. ~ 15 De modificatie bijvoorbeeld van type I collageen hoeft niet per se door oxidatie plaats te vinden maar kan eveneens het resultaat zijn van mutatie van de coderende sequentie, zodanig dat reducerende aminozuren worden vervangen tot de vereiste mate door niet reducerende aminozuren. Dit betekent dat een chemische behandelingsstap van het 20 collageen voorafgaand aan toepassing in zilverhalide-emulsie kan worden overgeslagen met de daarbij behorende voordelen qua tijd en kosten voor het productieproces. Uiteraard kan men een natief collageen toepassen dat niet meer dan 80 ymol reducerend aminozuur bevat, bijvoorbeeld collageen type III.

25 Daarnaast hebben wij in tegenstelling tot de leer van Kodak die eerder is genoemd en in 1990 is gepubliceerd ontdekt dat een emulsie volgens de uitvinding in één van de andere uitvoeringsvormen die is genoemd, die een peptiseermiddel omvat met een bindingssterkte voor zilver die hoger is dan 50 mV uitermate goed kan functioneren als een 30 emulsie met een hoge mate van tabulaire korrelvorming. Een geschikt peptiseermiddel zal een bindingssterkte hebben voor zilver beneden 100 mV. In tegenstelling tot de leer van de stand van de techniek kan het peptiseermiddel een bindingssterkte voor zilver hebben tussen 50-100 mV en een emulsie verschaffen met uitstekende tabulaire korrelpercen-35 tage.

De zilverhalide-emulsie die resulteert uit toepassing van dergelijk collageenachtig materiaal zal op geschikte wijze meer dan 80# tabulaire korrels vertonen, bij voorkeur meer dan 90%. De meeste voor- i i J 00 73 0 8 17 keur verdient een tabulair korrelpercentage hoger dan 95%· De korrels zullen een gemiddelde aspectratio hoger dan 3 vertonen bij bepaling onder toepassing van de afzonderlijke jet-methode onder de reactie-omstandigheden zoals in die in het voorbeeld zijn beschreven. Opge-5 merkt wordt dat deze reactieomstandigheden nietde geoptimaliseerde reactieomstandigheden zijn die in daadwerkelijke filmproductieproces-sen worden toegepast ter verkrijging van de hoge aspectratio’s doch slechts een indicatie verschaffen of het materiaal geschikt is om hoge aspectratio's te verkrijgen wanneer dergelijke geoptimaliseerde om-10 standigheden worden toegepast. In het algemeen kunnen aspectratio's hoger dan 5 worden verwacht onder toepassing van de methode. De verbindingen volgens de uitvinding bij toepassing van geoptimaliseerde omstandigheden die tegenwoordig worden gebruikt op normaal collageen, bijvoorbeeld onder toepassing van de dubbele jet-methode worden ver-15 wacht veel hogere aspectratio's te vertonen. Een andere factor die de mate van aspectratio kan vergroten is de toevoeging van meer zilver dan in ons voorbeeld is gebruikt. De test die is toegepast geeft slechts een snelle indicatie van hoge aspectratiovormingscapaciteit en de deskundige zal zich realiseren welke maatregelen kunnen worden 20 genomen teneinde het resultaat verder te verbeteren.

In onze test wordt het rijpingsproces uitgevoerd zonder enige verdere toevoeging van peptiseermiddel of additioneel zilver. Duidelijk zal zijn dat in een proces volgens de uitvinding de rijpingsstap eventueel een dergelijke verdere toevoeging kan omvatten. Bij voorkeur 25 zal het peptiseermiddel hetzelfde materiaal zijn voor zowel nucleatie-als rijpingsstap. Een additionele toevoeging in de rijpingsstap zou voordelig kunnen zijn vanwege een vergrote sterische stabiliteit in dit stadium.

Een voorkeursemulsie volgens de uitvinding omvat een peptiseer-30 middel dat stabiel is ten opzichte van tabulaire zilverhalide-korrel-vorming bij een pH tussen 4-8. Conventioneel gelatine dat is afgeleid van alkalisch bot en gehydrolyseerde gelatine vertonen niet zulke goede tabulaire korrelvormingsresultaten bij een pH hoger dan 5,5. De peptiseermiddelen volgens de uitvinding, bijvoorbeeld natief recombi-35 nant collageen III en natief recombinant collageen type I vertonen een dergelijk kenmerk waardoor de vereiste voor strenge pH-controle gedurende emulsieproductie, opslag en toepassing overbodig wordt. Een emulsie volgens de uitvinding kan derhalve een pH hebben tussen 4-8 100 7908 18 zonder negatief de tabulaire korrelvorming te beïnvloeden. Bij het proces van emulsiebereiding zal een variatie in pH niet op negatieve i wijze de uitkomst beïnvloeden bij verdere verwerking van de resulte rende emulsie voor fotografische elementproductie.

5 Een emulsie volgens de uitvinding biedt het voordeel boven con ventioneel collageen omvattende zilverhalide-emulsies, dat het pepti-seermiddel een homodisperse aard heeft. Het kristallisatieproces zal , vanwege dit feit eveneens meer homogeen zijn met alle voordelen die hierboven zijn genoemd. Het is mogelijk op diverse stadia van de nu-10 cleatie en groei van de zilverhalide kristallen een verder homogeen J peptiseermiddel toe te voegen dat eveneens duidelijk gedefinieerd is en in hoofdzaak zuiver is waardoor kosteffectiviteit en het regelen van kristallisatie-eigenschappen in een geregelde wijze die voorheen ί niet mogelijk was, met een collageenachtig peptiseermiddel mogelijk 15 maakt. Aangezien er diverse collageentypes zijn kunnen deze uiteraard worden toegepast in fotografische zilverhalide-emulsies volgens de uitvinding.

Er zijn tot dusver 23 collageengenen die zijn ontdekt. De meeste hiervan zijn gedeeltelijk of geheel gesequenced. De databanken omvat-20 ten de diverse sequenties daarvan. Genbank bijvoorbeeld heeft de consequentie onder toegangsnummer U08020 en de colIII-sequentie wordt gegeven in referentie 5 van voorbeeld 1. Deze natieve collageengenen vertonen homologieën bij onderlinge vergelijking van 40-50#. De relevante informatie van de geciteerde literatuurplaatsen met betrekking 25 tot sequentiedata is hierbij opgenomen door verwijzing, zie bijvoorbeeld eveneens W095/31473. pagina 5· Toepassing van één van deze natieve sequenties als zodanig of gemodificeerd teneinde een collageenachtige verbinding zoals hierboven is gedefinieerd volgens de uitvinding te vervaardigen waarbij de verbinding vervolgens wordt toegepast 30 in een zilverhalide-emulsie voor fotografische toepassing wordt gedekt door de onderhavige uitvinding. Op geschikte wijze kunnen de natieve sequenties worden toegepast, dat wil zeggen sequenties die coderen voor polypeptiden met de natuurlijke aminozuursequenties zolang het gecodeerde polypeptide binnen de hierboven beschreven parameters valt. 35 Het type I is het type dat het meest veelvuldig is toegepast in zilverhalide-emulsies, aangezien de bron voor zilverhalide-emulsiegelati-ne dierlijke botten was waarvan type I collageen het meest voornamelijk aanwezige collageentype is. Nu is het echter mogelijk geworden ! ΐ 1 00 7908 19 eveneens andere collageentypes te testen voor hun geschiktheid en toe te passen in zilverhalide-emulsies. De andere collageentypes zijn niet als zodanig in de stand van de techniek in de fotografische toepassingen gebruikt en zeker niet als zodanig in zilverhalide-emulsies.

5 Uiteraard is een aantal ervan in dierlijk weefsel dat tot dusver is toegepast aanwezig geweest. Echter is het nu mogelijk geworden om te kijken of deze collageentypes inderdaad verantwoordelijk kunnen zijn voor of kunnen bijdragen aan nog meer gunstige eigenschappen voor fotografische film die voorheen niet waren herkend. Een fotografische 10 film die collageenachtig recombinant-polypeptide anders dan type I als collageenachtig bestanddeel omvat wordt eveneens geacht een geschikte uitvoeringsvorm van de uitvinding te zijn zo lang als aan de specifieke vereisten die hierboven uiteen zijn gezet wordt voldaan. Specifieke toepassing in een zilverhalide-emulsie wordt gedekt. In het geval vein 15 zilverhalide-emulsies verwacht men dat een 100% uniforme bron van collageen maximale homodispersietijd van kristalvorming zal verschaffen. De vereisten van homodispersieteit en de waarde daarvan zijn elders in de beschrijving van de uitvinding besproken.

Naast de hierboven genoemde emulsies heeft de uitvinding eveneens 20 betrekking op een werkwijze voor het bereiden van dunne tabulaire zilverhalide-emulsies waarbij de tabulaire korrels meer dan 75% van het totale korrel geprojecteerde oppervlak in beslag nemen, welke werkwijze het vormen van de kern van zilverhalide korrels bij aanwezigheid van peptiseermiddel en het daarna groeien van de zilverhalide 25 korrels bij aanwezigheid van peptiseermiddel omvat, waarbij beide peptiseermiddelen aanwezig zijn in een gedefinieerde hoeveelheid en beide peptiseermiddelen collageenachtig materiaal zijn dat is bereid door genetische manipulatie van voor natief collageen coderend nucleïnezuur welke peptiseermiddelen een aminozuursequentie hebben die 30 meer dan vier verschillende aminozuren omvat. Een dergelijke werkwijze volgens de uitvinding kan toevoeging van het peptiseermiddel in de nucleatiestap en/of gedurende de korrelgroeistap omvatten, welk peptiseermiddel kan worden gekozen uit één van de uitvoeringsvormen die hierboven of in de conclusies is beschreven. In een bijzondere uitvoe-35 ringsvorm omvat de werkwijze toevoeging van het peptiseermiddel zowel in de nucleatiestap als gedurende de korrelgroeistap. Het peptiseermiddel dat dient te worden gebruikt wanneer beide stappen worden genomen kan hetzelfde zijn of verschillend, afhankelijk van de omstandig- 100 7908 20 heden van het geval.

I Na het bereiden van een emulsie volgens de uitvinding kan de emulsie de standaardprocedures ondergaan voor het bereiden van een fotografisch element. De emulsie kan bijvoorbeeld worden behandeld ter 1 5 verwijdering van het peptiseermiddel en de resulterende emulsie kan in een op zich bekende wijze worden toegepast voor het bereiken van een zilverhalide-emulsielaag op fotografisch materiaal waarbij de zilver-halide-kristallen van de lagen aspectratio van 5 of meer hebben. Het j fotografische element is op geschikte wijze een materiaal dat gevoelig 10 is voor licht, laser of röntgenstraling, welk element wordt gekozen uit zwart-wit-positieve film, zwart-wit-negatieve film, kleur-negatie-ve film, kleur-positieve film, digitale film, zwart-wit-positief papier, zwart-wit-negatief papier, kleur-negatief papier, kleur-positief papier, digitaal papier. Een fotografisch element verkregen volgens 15 een dergelijk proces wordt eveneens gedekt door de uitvinding.

Een ander aspect van de uitvinding is gelegen in een werkwijze voor het bereiden van collageenachtig recombinant-polypeptide die expressie van een voor een collageenachtige polypeptide coderende nucleïnezuursequentie door een microorganisme in een hoeveelheid, 20 groter dan 0,95 g/L omvat, welk recombinant-collageen vrij is van helixstructuur. Bij voorkeur geschiedt de expressie in een microorganisme anders dan E. coli of S. cerevisiae ten einde hoge mate van expressie, en bij voorkeur uitscheiding te verzekeren. De werkwijze kan op geschikte wijze worden uitgevoerd met een gistcel. Bij voorkeur 25 is het microorganisme vrij van actief postverwerkingsmechanisme voor het verwerken van collageenachtige sequenties tot fibrillen waarbij afwezigheid van helixstructuur in het expressieproduct wordt verzekerd. Eveneens kan een dergelijk proces optreden wanneer het microorganisme vrij is van actief postverwerkingsmechanisme voor het ver-30 werken van collageenachtige sequenties tot drievoudige helices en/of wanneer de tot expressie te brengen nucleinezuursequentie vrij is van voor procollageen en telopeptide coderende sequenties. Een voorkeurswerkwijze volgens de uitvinding omvat het gebruik van het microorganisme P. pastovis als expressiegastheer.

35 Teneinde productie van een niet gesplitste sequentie te verzeke ren omvat een werkwijze volgens de uitvinding voor bereiden van collageenachtig recombinant-materiaal het gebruik van een nucleïnezuursequentie die voor recombinant-collageen-aminozuursequentie codeert, 1007908 21 vrij van protease-splitsingsplaatsen van een protease die in de expressiegastheercel actief is. De werkwijze verschaft op geschikte wijze expressie die leidt tot peptideoogst groter dan 3 g/L. De werkwijze kan op geschikte wijze worden uitgevoerd met één van de colla-5 geenachtige recombinant-peptiseermiddelen zoals hierboven voor de emulsie volgens de uitvinding is gedefinieerd. Meer geschikt wordt het product resulterend uit microbiële expressie geïsoleerd en gezuiverd tot het in hoofdzaak vrij is van ander eiwit, polysachariden en nucleïnezuur. Zoals blijkt uit de voorbeelden zijn diverse werkwijzen 10 voor de deskundige beschikbaar teneinde dit te bewerkstelligen. De werkwijze volgens de uitvinding kan het expressieproduct in geïsoleerde en gezuiverde vorm in tenminste de volgende mate verschaffen: een gehalte aan nucleïnezuur minder dan 100 ppm, gehalte aan polysacharide minder dan 5X . gehalte aan ander eiwit minder dan in commerciële 15 producten. DNA-gehalte minder dan 1 ppm, RNA-gehalte van minder dan 10 ppm zelfs minder dan 5 PP® en een polysacharidegehalte van minder dan 1% kan worden verkregen.

Een ander aspect van de uitvinding heeft betrekking op nieuwe collageenachtige recombinant-peptiden. In het bijzonder dekt de uit-20 vinding een in hoofdzaak zuiver collageenachtig materiaal dat is bereid door genetische manipulatie van voor natief collageen coderend nucleïnezuur, welk peptiseermiddel een aminozuursequentie met meer dan h0% homologie met natief collageen vertoont en meer dan vier verschillende aminozuurtypes omvat. Andere geschikte uitvoeringsvormen zijn de 25 peptiseermiddelen die beschreven zijn in de uitvoeringsvormen van de emulsie volgens de uitvinding. Een homologie zo dicht mogelijk verdient de voorkeur, homologieën van meer dan 50% bij voorkeur zelfs in de orde van 80 tot 100# zijn gewenst. Wij wijzen specifiek op het feit dat de producten bij voorkeur vrij zijn van blokcopolymeerstructuur 30 binnen de GXY-motiefsequentie.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding omvat het collageenachtige materiaal geen cysteïnegroepen. De aanwezigheid van cysteïne in fotografische film zal het filmmaakproces verstoren. Het verdient aldus de voorkeur dat cysteïne in een zo klein mogelijke 35 hoeveelheid aanwezig is. Bij voorkeur zijn geen S-bevattende groepen in de collageenachtige structuur aanwezig. Dit kan worden bereikt, hetzij door chemische modificatie van het recombinante product, danwel door mutatie in de nucleïnezuursequentie die voor het product codeert i oo ?9oy 22 of door mutatie of deletie van een voor cysteïne coderende sequentie zodanig dat cysteïne niet langer meer daardoor wordt gecodeerd. Ge-i schikt zullen fotografische toepassingen materiaal gebruiken met min- I der dan 0,1# cysteïne.

i 5 In het bijzonder is voor optimale zilverhalide-emulsie homogeni teit van het collagene materiaal van uiterste belang. Het is niet slechts een kwestie van afwezigheid van onzuiverheden die een verbete-j ring verschaft, het is eveneens de mogelijkheid moleculen te verschaf fen met exact dezelfde samenstelling en lengte die goede regeling van 10 het extreem gevoelige proces van kristallisatie mogelijk maakt en eveneens meer uniforme kristalgroei mogelijk maakt. Om deze reden zal collageenachtig recombinant-materiaal van onschatbare waarde zijn voor dit gedeelte van het filmproces. Daarnaast is de afwezigheid van fi-brilvorming en zelfs van drievoudige helices vereist voor deze speci-15 fieke toepassing in het filmmaakproces, een aspect dat tot dusver volledig over het hoofd was gezien. Het inzicht in de relevantie van het aantal reducerende groepen in het fotografische materiaal is eveneens van groot belang. Dit is niet de strenge lage hoeveelheid die in de stand van de techniek wordt gesuggereerd als vereist voor tabulaire 20 korrelvorming. Derhalve vormt de afname in cysteïne en methionine-gehalte in het collageenachtige materiaal dat wordt toegepast een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding.

De verbindingen volgens de uitvinding hebben eveneens een additioneel voordeel onthuld. De bekende collageen-materialen, d.w.z. regu-25 lier en gehydrolyseerd collageen van dierlijke bronnen zoals bot en huid resulteren in lage tabulaire korrelvorming van de fotografische filmemulsie bij een hogere pH dan 5.5· Van de nieuwe groep recombi-nant-collagenen is eveneens gevonden dat deze resulteren in dezelfde verrassend hoge mate van tabulaire korrelvorming niet slechts bij pH 30 5.5 maar ook bij hogere pH, bijvoorbeeld pH 7. Dit biedt de mogelijk heid zilverhalide-emulsies te bereiden die een minder streng geregelde pH hebben aangezien de nieuwe verbindingen blijkbaar minder pH afhankelijk zijn dan de niet recombinant collagenen. Derhalve is de uitvinding eveneens gericht op collageenachtige recombinant-verbindingen die 35 kunnen worden toegepast bij de bereiding van zilverhalide-emulsies bij een pH tussen 4-8 terwijl zij nog uitkomen op hoge tabulaire korrel-percentages i.c. hoger dan 50#, bij voorkeur hoger dan 80#. Een additioneel kenmerk van de recombinant- collagenen die bruikbaar geacht

M

j 1007908 23 kan worden is het feit dat de isoelektrische punten basisch zijn, in tegenstelling tot het Kodak-recombinant-polypeptide dat in 1990 is beschreven dat een zuur IEP heeft. Verwacht wordt dat het feit dat het recombinant-collageen volgens de uitvinding een aminozuursamenstelling 5 heeft waarin meer dan k aminozuren aanwezig zijn een vergrote variabiliteit biedt in de coderende sequentie en derhalve een hogere mate van expressie toestaat. Additionele variëteit wordt ingebracht door het gebruik van een sequentie met een GXY-motief van minder dan 33% proli-ne in de totale GXY-sequentie. De goede expressie wordt bereikt zonder 10 toepassing van een blokcopolymeeraminozuurstructuur in de GXY-sequentie. De uitvinding zal verder worden geïllustreerd door de voorbeelden.

VOORBEELDEN 15 Voorbeeld 1

Gelatinen, collageen of collageenfragmenten die tot expressie worden gebracht als heteroloog recombinant-eiwit in expressiegastheer-organismen zoals gist, schimmels en bacteriën voor fotografische toepassingen door middel van recombinant-DNA-technieken hebben diverse 20 voordelen, (i) In tegenstelling tot bijvoorbeeld traditionele gelatinen kunnen recombinant-moleculen als rigoureus niet-verknoopt worden geproduceerd, (ii) De moleculaire samenstelling is precies gedefinieerd. (iii) De geproduceerde moleculen zijn van een enkel type (of een goed gedefinieerd mengsel van slechts een paar moleculen), met 25 kleine of verwaarloosbare verontreiniging van andere eiwitachtige of niet eiwitachtige moleculen. De molecuulgewichtverdeling is zeer smal en monodispers (afzonderlijke component gelatinen) of oligodispers. (iv) Het product kan in een zeer reproduceerbare wijze worden vervaardigd, d.w.z. met constante kwaliteit. In het bijzonder zijn gisten 30 goed geschikte productie-organismen voor dergelijke polypeptiden met een zeer hoog repetitieve glycine- en prolinerijke sequentie, (a) Hoewel deze moleculaire kenmerken vaak genetische instabiliteit (bijvoorbeeld recombinatie en verschuiving van delen van het gen) in bac-teriële systemen veroorzaakt blijkt dit bij gist niet zo'n probleem te 35 geven [1,2]. (b) dit zijn eukaryote cellen waarbij post-translatie modificaties zoals hydroxylering kunnen worden teweeg gebracht en die de mogelijkheid geven te kiezen voor hetzij efficiënte uitscheiding danwel intracellulaire expressie, (c) Diverse species groeien effi- 1 00 7908 2k ciënt op goedkope substraten zoals methanol, in tegenstelling tot dierlijke celkweken. (d) Afgescheiden productie laat efficiënte winst van het product gedurende of na fermentatie toe (in tegenstelling tot planten), (e) Diverse sterk en strak gereguleerde induceerbare promo-, 5 toren zijn beschikbaar voor gistsystemen, hetgeen een zeer efficiënte expressie mogelijk maakt en mogelijke negatieve effecten op de viabi- liteit en groei van de gastheercellen minimaliseert. Als één van de diverse goed geschikte systemen die beschikbaar zijn is gekozen voor de uitgescheiden productie door de methylotrofe Pichia pastovts. Onze 10 expressiehoeveelheden zijn één van de hoogste die ooit zijn beschreven voor recombinant eiwitten hetgeen aanduidt dat deze expressiegastheer het vermogen heeft met de hiervoor genoemde gelatine/collageen om te _ gaan bij de genetische (DNA-, RNA- en eiwithoeveelheden. Na transfor matie van de gastheer wordt het geïntegreerde product opgenomen in het 15 genoom van de gist, resulterend in genetische stabiliteit van de transformanten (verlies van plasmiden is daarna niet van belang). Het is mogelijk transformanten te genereren (waarbij het heterologe doelgen geregeld wordt door bijvoorbeeld de alcoholoxidase (AOX) promoter), waarbij het recombinantgen hetzij in het HIS4 locus dan wel in het 20 A0X1 locus wordt opgenomen. In het laatste geval afhankelijk van het integratietype wordt het j40XI-gen verstoord, hetgeen leidt tot langzame opname van (en langzame groei op) methanol (Mut5 fenotype). Als het functionele A0X1-gen nog aanwezig is, is het fenotype Mut*. Hoewel beide fenotypen kunnen worden toegepast gaat onze voorkeur in het 25 algemeen uit naar snelle groei en werden onze protocollen derhalve in hoofdzaak gericht op de generatie en selectie van Mut* transformanten. Het is vanzelfsprekend dat gist- of schimmelexpressiesystemen anders dan het P. pastoris expressiesysteem in principe even goed zouden kunnen worden toegepast voor de efficiënte productie van recombinante 30 gelatinen, afhankelijk van het exacte type en de kwaliteit van het te produceren molecuul, afhankelijk van de productieschaal die voor ogen staat en afhankelijk van de productiekosten en toepasbare marktprijzen. Het Pic/u’a-systeem werd als snel en efficiënt systeem voor pilot-productie toegepast en vanwege betrekkelijk gemakkelijke productwinst. 35

MATERIALEN, METHODEN EN ANALYSES

1 0 0 7 δ G 8 25

Algemeen moleculair-biologische technieken

Kloneringsprocedures werden uitgevoerd in hoofdzaak volgens Maniatis et al. [3]· DNA werd geïsoleerd onder toepassing van Wizard Plus SV miniprep, of Qiagen midiprep systemen. DNA werd uit 5 agarosegelen geïsoleerd onder toepassing van de QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Alle toegepaste enzymen waren van Pharmcia tenzij anders vermeld is en werden toegepast volgens de instructies van de fabrikant. Transformatie van E. colt werd uitgevoerd door middel van standaard elektroporatie onder toepassing van de BioRad 10 GenePulser inrichting. Alle voorschriften met betrekking tot behandeling en transformatie van Pichia pastoris en de expressie van eiwitten in dit gastheerorganisme werden in hoofdzaak uitgevoerd volgens het handboek van de Pichia Expression Kit (van Invitrogen) [**].

15

Invoeging van een rat-C0L3Al-cDNA-fragment in een gist (Pichia pastoris) expressievector.

Plasmide pRGR5, die een gedeeltelijke rat-proal(III) collageen-cDNA bevat was een geschenk van Dr. Vuorio [5]. Dit plasmide werd aan 20 digestie onderworpen met PstI, hetgeen een opbrengst gaf van ongeveer 0,7 kB fragment van het helixdomein. Onder toepassing van de Z'~5'~ exonuclease activiteit van T^-DNA-polymerase werd het fragment stomp gemaakt en vervolgens geligeerd met T^-DNA-ligase en met SnaBI aan digestie onderworpen en met CIP gedefosforyleerde pPIC9 Pichia 25 pastoris expressievector geligeerd (Invitrogen). De ligatiereactie werd daarna toegepast voor transformeren van E. colt JM 109·

Het dient begrepen te worden dat de keuze van mogelijke en geschikte vectoren niet beperkt is tot pPIC9· Een deskundige op dit gebied zal een aantal andere mogelijke vectoren zoals pHIL-Sl kunnen 30 toepassen en aanpassen waarbij een Pichia pastoris zuurfosfatase 1 (Phol)-signaal in plaats van het van Saccharomyces cerevisiae afgeleide α-metingfactor (aMF) prepro-signaal, danwel pHIL-Dl voor intracellulaire expressie en vele andere worden toegepast.

Plasmide DNA werd geïsoleerd en de sequentie vein het pC0L3Al dat 35 aldus werd gevormd (fig. 1) werd geverifieerd door sequentie-analyse volgens de methode van Sanger [6], onder toepassing van een geautomatiseerde sequentie-inrichting (ALF-DNA-sequencer, Pharmacia) en onder toepassing van de sequentieprimers van 5'AOXl, 3'AOXl en a-Factor 1007908 26 (aMF), zoals voorgesteld in de Pichia Expression Kit (zie fig. 2). De verwachte eiwitsequentie voor het tot expressie gebrachte eiwit wordt aangegeven in fig. 3· 5 Transformatie van Pichia pastoris met pC0L3Al

Teneinde Mut* transformanten te verkrijgen bij transformatie van Pichia pastoris werd het construct lineair gemaakt met Sail. Teneinde Mut8 transformanten te verkrijgen werd het construct aan digestie onderworpen met het Bgllï. Na extractie met fenol en precipitatie met 10 ethanol werd het construct vervolgens toegepast voor het transformeren van Pichia pastoris stam GS115 (Invitrogen) onder toepassing van elek-troporatie volgens Becker en Guarente [7]. onder toepassing van de BioRad GenePulser inrichting (ingesteld op 1500V, 25 pF en 200Q en onder toepassing van 0,2 cm cuvetten. Het transformatiemengsel werd -15 uitgeplaat op Minimaal Dextrose platen (MD-platen; 1,34# YNB, 4xlO'5# biotine, 1% dextrose en 1,5# agar) teneinde op aanwezigheid van de vector die de His'-stam GS115 omzet in His* te selecteren. Na groei bij 30"C gedurende 3 dagen werden diverse kolonies geselecteerd voor bevestiging via PCR van het Mut genotype. Genomisch DNA werd geïsoleerd 20 volgens gist miniprep-methode van Lee [8] en met RNase A behandeld. PCR werd uitgevoerd onder toepassing van 100 ng genomisch DNA, 50 pmol 5’A0X1-primer, 50 pmol 3'A0X1-primer, 1,25 U Taq-polymerase (Pharmacia), 0,2 mM dNTPs (Pharmacia) en lx Taq-buffer (Pharmacia) in een totaal volume van 50 μΐ. Na een eerste denaturatie bij 94°C gedu-25 rende 5 minuten werden 30 cycli uitgevoerd die bestonden uit 1 minuut bij 94°C, 1 minuut bij 5“C en 2 minuten bij 72°C. Uiteindelijke verlenging vond plaats bij 72eC gedurende 10 minuten. De PCR-inrichting die werd toegepast was de Perkin-Elmer GeneAmp 480. Agarosegelelektro-forese zou een endogene A0X1 band van 2,2 kb voor Mut+ trans formanten 30 geven. Transformanten zonder 2,2 kb band zijn Mut*. Geverifieerde transformanten van zowel het Mut* als Mut8 genotype werden gekozen voor expressie op kleine schaal in conische buizen van 50 ml (die schuin werden geplaatst en waarvan de deksel los werd vastgemaakt), of in 100 ml of 1 1 (van schotten voorziene) flessen.

35

Expressie van C0L3Al-fragment

Expressie werd uitgevoerd in hoofdzaak zoals is beschreven in het Pichia Expression Kit Handbook. In het kort werden transformanten 1 00 7908 27 gedurende de nacht in BMG gekweekt (100 mm kaliumfosfaat pH 6,0, 1,34# YNB, 4x 10'5# biotine en 1# glycerol) tot een 0D6oo=2-6. Kweken werden daarna gecentrifugeerd en in BMM geresuspendeerd (als MBG waarbij 0,5% methanol de glycerol vervangt) tot een OD^oo van 1*0. Cellen werden 5 gedurende 4 dagen bij 30’C en 250 rpm gekweekt waarbij dagelijks methanol tot 0,5# werd toegevoegd.

10 μΐ van de kweeksupernatanten werd door SDS-PAGE volgens Laemmli [9] in een BioRad mini-PROTEAN-II-systeem geanalyseerd. Kleuring met Coomassie Brilliant Blue onthulde diverse banden waarvan 10 de hoogste de verwachte schijnbare lengte had van ongeveer 29 kD. Het dient te worden opgemerkt dat gelatine, collageen en collageenfragmenten migreren volgens een schijnbare Mw, dat ongeveer een factor 1,4 hoger ligt dan het ware mW, ten minste ten dele vanwege het betrekkelijk lage gemiddelde groep Mw [12].

15 T .-neinde hun identiteit vast te stellen werd een SDS-PAGE-gel die was voorzien van met aceton gefractioneerde C0L3A1 fermentatie- supernatant (zie hieronder voor het fractioneringsvoorschrift) op een Immobilon Psq membrane (Millipore) geblot onder toepassing van de BioRad Mini Trans-blot-cel. Kwantitatieve overdracht werd bereid door 20 100 volt gedurende 1 uur aan te brengen onder toepassing van CAPS- buffer (2,2 g CAPS per liter 10# MeOH, pH 11). Na kleuring met Coomassie Brilliant Blue werden de vier voornaamste banden uitgesneden en werd door middel van Edman-degradatie de N-terminale sequentie bepaald. De band van 29 kD gaf geen signaal en is waarschijnlijk N-25 terminaal geblokkeerd. Eén van de twee kleinere fragmenten was niet zuiver genoeg om gesequenced te worden. De twee andere kleinere banden gaven leesbare signalen en zijn in figuur 3 onderstreept. Het is duidelijk dat de banden worden veroorzaakt door een vorm van proteoly-se, hetgeen kan worden verklaard door het feit dat gelatine een zeer 30 open eiwit is in een willekeurige spoelconformatie en derhalve zeer vatbaar is voor proteolyse.

Protease-activiteit

Omdat toegenomen afbraak van het collageen werd waargenomen gedu-35 rende fermentatie bij pH 5.0 in vergelijking met pH 3*0 werden testen verricht teneinde deze degradatie verder te karakteriseren (zie hieronder voor een beschrijving van het fermentatievoorschrift). De testen werden uitgevoerd met de collageen bevattende supernatanten van een 1 00 7908 28 pC0L3Al-fermentatie bij pH 3.0, waarbij afbraak gedurende fermentatie minimaal was. Na verwijdering van de cellen door centrifugatie werd de pH van de supernatanten ingesteld op pH 5.0. Daarna werden parallel-incubaties uitgevoerd met de volgende toevoegingen: I 5 (1) verse Ptchia pastoris cellen (met MilliQ gewassen) (2) verse Pichia pastoris cellen (met MilliQ gewassen) en glazen kralen: dit mengsel werd door middel van een vortex gemengd (positieve controle I) • (3) zonder enige toevoeging (negatieve controle) 10 (4) trypsine (5 mg/ml) (positieve controle II).

Alle monsters werden gedurende 96 uur bij 30°C en pH 5,0 geïncubeerd. (Dit waren de omstandigheden die afbraak van het gelatine gedurende fermentatie veroorzaakten). Uiteindelijk werden de geïncubeerde mon-„ sters op een SDS-PAGE-gel volgens Laemmli [9] in een BioRad mini- 15 PROTEAN-II-systeem, gevolgd door Coomassie Brilliant Blue kleuring , geanalyseerd. De resultaten waren: (1) incubatie bij pH 5,0 met gewassen intakte cellen veroorzaakte afbraak van pC0L3Al (oorspronkelijk bij pH 3.0 geproduceerd) in 4-5 discrete banden waarschijnlijk ten gevolge van aan 20 celoppervlak geassocieerde proteolytische enzymactiviteit; (2) toevoeging van gebroken cellen veroorzaakte afbraak van beide collageentypes in een groot aantal proteolytische producten (positieve controle I); (3) er trad geen afbraak op bij afwezigheid van cellen bij pH 5,0; 25 (4) toevoeging van trypsine veroorzaakte grootschalige afbraak van he gelatine (positieve controle II).

Bij verschillende experimenten verifieerden wij dat na verwijdering van de cellen aan het eind van de fermentaties de recombinante gelatines in de celvrije fermentatiebouillon gedurende een aantal 30 dagen stabiel waren in het temperatuurtraject van 0-30*C en in het pH-traject van 3.0-7,0. Aldus vond enige proteolytische afbraak van gelatine plaats gedurende fermentatie, doch blijft na verwijdering van cellen geen relevante proteolytische activiteit over en zijn verder geen maatregelen nodig het product te stabiliseren. Een soortgelijke 35 stabiliteit werd waargenomen voor de C0L1A1-producten die hieronder worden beschreven. Deze stabiliteit van de recombinante gelatines kwam als een verrassing aangezien zij niet gehydroxyleerd zijn (zoals getoond door analyse van de aminozuursamenstelling zoals hieronder is 1 00 7908 29 beschreven) en dienovereenkomstig non-helixstructuur hebben, dat wil zeggen geen secundaire structuur hebben. De totale afwezigheid van secundaire structuur (d.w.z. van het collageentype- helix) en van hydroxyproline werd geverifieerd, respectievelijk door middel van 5 circulaire dichroïsche spectroscopie (CD) volgens referentie [13] en door HPLC-analyse van de aminozuur-samenstelling na volledige hydrolyse van de peptidebindingen. De recombinante gelatines zijn dus extreem open moleculen (en als zodanig niet parallel polypeptiden!) die extreem gevoelig moeten zijn voor proteolytische afbraak. De onverwachte 10 stabiliteit van het product in deze expressiegastheer (eveneens na uitscheiding) vereenvoudigt ten zeerste de stroomafwaartse verwerking en isolatie van het product uit dit expressiesysteem en maakt de herhaalde toevoeging van kostbare en instabiele remmers van proteolytische activiteit (bijvoorbeeld para-methyl-sulfonylfluoride (PMSF)) 15 overbodig. Daarnaast biedt het mogelijkheden voor het minimaliseren van gelatineafbraak gedurende fermentatie met een hoge celdichtheid viz. door continu het product van de cellen te scheiden gedurende fermentatie onder toepassing van eenvoudige microfiltratie of dialyse tegen voedingsmedium en door het recirculeren van de cellen aan de 20 fermenteerinrichting. Voorheen waren slechts collageen met een drievoudige helix of gevouwen polypeptiden geproduceerd. Deze zijn meer bestand tegen proteasen. Drievoudige helix-collageen is zelfs volledig resistent tegen trypsine, pepsine en andere goed bekende proteasen. In tegenstelling hiermee werd vermoed dat de productie van intact niet 25 gehydroxyleerd en ongevouwen gelatine extreem moeilijk zou zijn.

Productie in een protease-deficiënte stam

Teneinde te onderzoeken of de pep*» voor proteinase A deficiënte stam SMD1168 (Invitrogen) beter geschikt is voor de expressie van de 30 voor protease gevoelige gelatinesequenties werd deze stam eveneens met het pC0L3Al-construct getransformeerd. De methodologie was zoals hierboven is beschreven. Helaas was er geen duidelijk positief effect in expressie-experimenten met schudfles of fermenteerinrichting.

35 Analyse van glycosylering

Teneinde vast te stellen of het eiwit geglycosyleerd is werd een kleuring met PAS onder toepassing van Schiff-reagens na oxidatie door perjodidezuur op een SDS-PAGE-gel uitgevoerd. De gel werd gedurende 1 1 00 7908 30 uur op 12,52 TCA, 1 uur in 1% perjodidezuur/32 azijnzuur, 1 uur in 152 azijnzuur (elke 10 minuten vervangen) en 1 uur in Schiff-reagens (bij 4°C in het donker) geïncubeerd. De gel werd daarna 2 maal gedurende 5 minuten in 0,5 2 natriumbisulfiet gewassen en in 72 azijnzuur ont- , 5 kleurd. De banden van tot expressie gebracht eiwit gaven geen signaal, terwijl er een signaal was van een positieve controle (carboxypep-tidase H). Zoals verwacht werd geen signaal verkregen met een negatieve controle (E. coli extract). Het kan worden geconcludeerd dat het tot expressie gebrachte eiwit niet geglycosyleerd is.

: ïo

Northern Blotting

Een Northern blot van op methanol gekweekte cellen werd uitgevoerd. RNA werd geïsoleerd volgens de werkwijze van Schmitt et al. [10]. De pC0L3Al vector werd aan digestie onderworpen met EcoRI/Sphl i? 15 ter verschaffing van een fragment van 0,5 kb C0L3A1. Het fragment werd met 32P willekeurige primer gemerkt en aan de blot gehybridiseerd waarna de blot werd gewassen bij een uiteindelijke strengheid van 0,2xSSC bij 65°C. Autoradiografie onthulde een boodschapper met de verwachte lengte (1,3 kb).

20

Pichia transformanten die meervoudige kopieën van het heterologe C0L3Al-gen bevatten

Teneinde te onderzoeken of gelatine-expressieniveau's verder kunnen worden verbeterd is de G418-multi-kopie-selectiewerkwijze van 25 Scorer et al [11] toegepast. De pPIC9K-vector werd aan digestie onderworpen met BamHI/EcoRI en de band van 9.0 kb werd geïsoleerd. De pC0L3Al-vector werd eveneens aan digestie onderworpen met BamHI/EcoRI en het resulterende fragment vein 1,0 kb werd aan de pPIC9K-band van 9.0 kb geligeerd waarna E. coli JM109 werd getransformeerd. Het con-30 struct pC0L3AlK (Fig. 4) dat aldus werd verkregen werd geverifieerd door middel van restrictiedigestie.

Pichia pastoris GS115 werd met de pC0L3AlK vector getransformeerd zoals hiervoor is beschreven (na digestie met Sail teneinde Mut* transformanten te verkrijgen). Teneinde op multikopie-transformanten te 35 selecteren werden de his+kolonies op MD-platen samen gebracht (ongeveer 6000) en aan secondaire screening onderworpen op platen die een reeks van 10 verschillende G4l8 (Gibco-BRL)-concentraties bevatten, lopend ! van 0,25 tot 4,0 mg/ml. De cellen werden uitgeplaat bij een dichtheid 1 00 7908 31 van ongeveer 105 cellen per plaat. Na incubatie gedurende 4 dagen bij 30’C werden diverse resistente kolonies bij elke G^llS-concentratie overgebracht naar verse platen bij de overeenkomstige hoeveelheid G4l8 teneinde hun resistentie te verifiëren.

5 Teneinde het kopie-aantal van de pC0L3AlK-vector in de G*ll8- resistente transformanten te bepalen werd een semi-kwantitatieve dot blot uitgevoerd. Genomisch DNA van de geverifieerde G*U8 resistente transformanten werden geïsoleerd volgens het protocol van Lee [8] en met RNase A behandeld. Bij benadering 200 ng genomisch DNA van elk van 10 40 transformanten (4 per concentratie G4l8) werd overgebracht naar een positief geladen nylon membraan (Boehringer Mannheim) door middel van een vacuüm blotting inrichting (GibcoBRL Convertible System). Als 1-kopie-controle werd een pC0L3Al transformant waarvan geverifieerd was dat deze slechts één kopie bevatte door middel van Southern blot 15 eveneens overgebracht op de blot (in duplo), naast een niet-getrans-formeerde controle (in duplo).

De pC0L3Al-vector werd aan digestie onderworpen met EcoRI/Sphl ter verschaffing vein 0,5 kb C0L3A1-fragment. Dit fragment werd voorzien van een label met 32P willekeurige primer en aan de dot-blot fil-20 ter gehybridiseerd. Na spoeling bij een uiteindelijke strengheid van 0,5xSSC bij 65°C werd autoradiografie uitgevoerd. Na strippen (waarvan de efficiëntie is gecontroleerd) werd het membraan gehybridiseerd aan een probe die was verkregen van een geverifieerd Pichia pastoris URA3-fragment, dat door middel van PCR met heterologe URA3-primers was 25 opgepakt. Deze controle dient ter normalisatie van de C0L3Al-signalen voor de hoeveelheid opgebrachte DNA. Het membraan werd gewassen en aan autoradiografie onderworpen zoals beschreven is voor de C0L3Al-probe. De signalen op beide autoradiogrammen werden densitometrisch gekwantificeerd onder toepassing van een gelscan-inrichting (PDI, Pharmacia). 30 Zoals verwacht was er geen C0L3A1-signaal voor de 0-kopie-controles, terwijl er een URA3-signaal was. Het kopie-aantal kan worden geschat door de verhouding van C0L3Al-signaal voor elke transformant en het gemiddelde C0L3A1-signaal die voor de 1-kopie-controles is verkregen, te berekenen als genormaliseerd door de verhouding van de respectieve-35 lijke URA2-signalen (d.w.z. om met verschillen in de hoeveelheid van DNA die op het membraan is geblot mee te nemen in de berekening). Transformanten die ongeveer 1 tot 15 kopieën bevatten werden aldus verkregen.

1 00 7908 32

Expressie van C0L3A1-fragmenten in multikopie-transformanten.

Een reeks transformanten die 1-15 kopieën bevatte werd aan ! expressie op kleine schaal onderworpen zoals hierboven is beschreven, i Aangezien SDS-PAGE een hogere opbrengst bij hoger kopie-aantal aangaf, ! 5 werden verdere testen uitgevoerd bij een schaal van 100 ml met de 2-, 5“· 10-, en 15-kopie-transformanten. Deze werden gedurende de nacht gekweekt in 100 ml flessen die 25 ml BMG (100 mM kaliumfosfaat pH 6,0, ^ 1,3**% YNB, . 10_5% biotine en 1% glycerol) bevatten. Na centrifugatie bij I5OO-3OOO g bij 5 minuten werden de cellen bij 100 ml BMM (als BMG ' 10 maar met 0,5% methanol in plaats van glycerol) geresuspendeerd. Zij werden in 1 1 flessen voorzien van schotten gekweekt bij 30eC en 250 rpm gedurende 4 dagen terwijl methanol elke dag tot 0,5% werd toegevoegd. Elke dag werden 1 ml monsters genomen en op SDS-PAGE geanalyseerd. Een hoger kopie-aantal resulteerde in een hogere hoeveelheid 15 gelatineproduct. Geselecteerde 5“ en 15-kopietransformrnten werden toegepast voor expressietesten in een fermenteerinrichting op een schaal van 1 1. De hoogste C0L3A1 -productie werd verkregen met de 15-kopie-trans formant (ongeveer 14,8 g gelatine/L in het extracellulaire medium bij een droge biomassa van 177 g/L en na ongeveer 184 uur fer-20 mentatie, d.w.z. ongeveer 7.7 g/L in totaal of 42 mg/(l.uur); bij een droge biomassa van 110 g/L en na ongeveer 120 uur fermentatie was het ongeveer 7 g gelatine/L in het extracellulaire medium, d.w.z. ongeveer 3.7 g/L totaal, of 31 mg/(l.uur)).

25 Kloning van een muis-COLlAl-fragment (COLlAl-muis)

Primers werden ontworpen voor de bekende sequentie (Fig. 5) PCR werd uitgevoerd op 17-daagse muisembryo met QUICK-Clond® (fibroblast) cDNA (Clontech), onder toepassing van 0,4 ng cDNA, 0,4 pM C1A1-FW-primer (Fig. 5). 0,4 pM C1A1-RVI-primer (Fig. 5). lx Advantage KlenTaq 30 polymerase mengsel (Clontec), 0,3 mM dNTP's (Pharmacia) en lx KlenTaq PCR-reactiebuffer (ClonTeq) in een totaal volume van 20 pl. Na een oorspronkelijke denaturatie bij 9^eC gedurende 4 minuten werden 35 cycli van 1 minuut bij 9^*0. 1 minuut bij 68’C en 2 minuten bij 72’C uitgevoerd. Uiteindelijke verlenging vond plaats bij 72’C gedurende 10 35 minuten. Agarosegelelektroforese toont een band van 1 kb, die de grootte heeft die voorspeld werd door de sequentie. DNA werd uit de agarosegel geïsoleerd en vervolgens aan digestie onderworpen met re-strictie-enzymen Ncol en Xhol. Het fragment werd na digestie uit aga- 1007908 33 rosegel geïsoleerd en in de Pichia pastoris expressie-vector pPIC9 gekloneerd volgens de volgende strategie (Fig. 6). Ten eerste werd een adapter die een Ncol en een Xhol plaats bevatte ingebracht in de meervoudige kloneringsplaats van pPIC9. hetgeen pPIC9’ gaf. De adapter werd 5 bereid door de synthetische oligonucleotiden N-X-FW en N-X-RV te koppelen zoals getoond in Figuur 5 en Figuur 6. De enkelstrengige overhang die afstamt van het 5' uiteinde van oligonucleotide N-X-RV werd ontworpen teneinde een EcoB I plaats te vormen na koppeling met de met Ecol aan digestie onderworpen vector. De 5' overhang van N-X-FW (Xho 10 I~) was complementair aan de overhang die werd gevormd door werking van

Xho I op de vector maar gaf geen aanleiding tot een Xhol plaats na ligering. Omdat de doelvector pPIC9 een Nco I plaats heeft buiten de meervoudige kloneringsplaats is pUCl8 toegepast als tussen-vector voor de klonering van dit fragment. De sectie tussen BamHI en 15 EcoBI van de gewijzigde meervoudige kloneringsplaats van pPIC9* werd overgebracht naar de meervoudige kloneringsplaats van pUCl8-vector, resulterend in pUCl8*. Het met Ncol-Xhol aan digestie onderworpen fragment C0L1A1-1 werd in de pUCl8*-vector geligeerd tussen de Ncol en Xhol-plaatsen. Uit dit pUCl8-C0LlAl-l construct werd het C0L1A1-1 20 fragment samen met het gedeelte van de meervoudige kloneringsplaats van de pPIC9 aan digestie onderworpen met BamHI en EcoBI en pPIC9 geligeerd, waarbij het construct pCOLlAl-1 (Fig. 7) werd verkregen. Aldus was een gedeeltelijke digestie met Ncol van de pPIC9 niet nodig. De correcte inbreng van pPIC9 werd eerst gecontroleerd door restric-25 tieanalyse en daarna door DNA-sequentievolgordebepaling.

Transformatie van Pichia met pCOLlAl-1 en expressie van het C0L1A1-1-fragment

Pichia pastoris GS115 werd getransformeerd met de pCOLlAl-1 vec-30 tor zoals beschreven is voor de pC0L3Al-vector. Het Sal I aan digestie onderworpen DNA werd toegepast teneinde specifiek Mut+ transformanten te genereren. Diverse transformanten werden toegepast voor expressie op kleine schaal in schudflessen en één hiervan werd gekozen voor expressie in de fermenteerinrichting op schaal van 1-100 1. Typische 35 opbrengsten liggen in het gebied van 4-5 g gelatine/L in het (extra-cellulaire) medium (zoals bepaald na fractionering met aceton, zoals hieronder beschreven), bij een droge biomassa van 100-120 g/L (ongeveer 3 g gelatine/L in totaal). Het doel gelatine (Fig. 8) heeft 1 00 7908 34 zijn theoretische Mw van 27.4 kD. Van collageenachtige eiwitten en gelatine is bekend dat zij migreren bij een schijnbaar Mw van ongeveer

1,4 maal hoger dan het ware Mw [10]. Daarmee in overeenstemming werd een band van SDS-PAGE die bij een schijnbaar mW van ongeveer 38 kD 5 migreren waargenomen (geïnterpoleerde waarde die verkregen is met globulaire eiwit Mw-markers). Daarnaast werden drie kortere producten met een schijnbaar molecuulgewicht van 24,18 en 15 kD waargenomen (geïnterpoleerde waarden). Deze konden het resultaat zijn van vroege proteolytische activiteit in de intracellulaire, met celoppervlak 10 geassocieerde of extracellulaire compartimenten of door problemen op het niveau van translatie. De afbraakproducten waren reeds in zeer vroege inductiestadia aanwezig en er trad geen verdere afbraak op. Zelfs incubatie bij aanwezigheid van gewassen intacte cellen bij pH

5.0 en gedurende 96 uur bij 30°C veroorzaakte geen verdere afbraak van 15 pCOLlAl-l met betrekking tot de situatie na fermentatie bij pH 3.0. (Grootschalige afbraak trad op bij aanwezigheid van trypsine als positieve controle). Teneinde te verifiëren dat problemen op mRNA-niveau niet verantwoordelijk waren voor het ontstaan van de producten van 24,18 en 18 kD werd Northern blotting uitgevoerd zoals beschreven 20 is voor C0L3A1 onder toepassing van een met 32P willekeurige primer gemerkte 1,0 kB NcoI/XhoI-COLlAl-fragment van pC0LlAl-l als probe. De verwachte boodschapper van 1,6 kb werd gevonden. Teneinde de identiteit van de waargenomen fragmenten vast te stellen werd een SDS-PAGE-gel beladen met met aceton gefractioneerde COLlAl-l-fermentatie-25 supernatans op een Immobilon- Pso-membraan (Millipore) geblot onder toepassing van de Biorad-Mini-Trans-blot-Cell. (Zie hieronder voor een beschrijving van het acetonfractioneringsvoorschrift). Kwantitatieve overdracht werd bereikt door 100 Volt gedurende 1 uur aan te brengen onder toepassing van CAPS-buffer (2,2 g CAPS per liter van 10# MeOH, 30 pH 11). Na kleuring met Coomassie Brilliant Blue werden de vier meest prominente banden uitgesneden en werd de N-terminale sequentie door Edman-afbraak bepaald. De sequentiesignalen die werden verkregen waren zeer laag vergeleken met de hoeveelheid opgebracht materiaal (gemiddeld rond 5#)· Het is derhalve waarschijnlijk dat de fragmenten 35 in het algemeen N-terminaal geblokkeerd waren. Dit ondersteunt het idee dat proteolyse van C0L1A1-1 intracellulair plaatsvindt. De grote hoeveelheid C0L1A1 die is geleverd liet niettegenstaande een eenvoudige bepaling van de N-terminale sequentie toe. De verkregen N- ï 1007908 35 terminale-sequenties worden onderstreept in de eiwit-sequentie (Fig.

8) zoals deze gecodeerd wordt door het getransfecteerde-COLlAl-l-gen. De fragmenten met een schijnbaar mW van 38 kD en 18 kD gaven beide de verwachte sequentie voor het N-uiteinde van het eiwit, echter verlengd 5 met "EA". Van deze verlenging (of EAEA) is bekend dat deze aanwezig is op sommige eiwitten die tot expressie worden gebracht in expressievec-toren onder toepassing van het van Saccharomyces cevevisiae afgeleide α-meating-factor (a-MF)-prepro-signaal. Van dit effect wordt aangenomen dat het te wijten is aan sterische hindering van STE13-splitsings-10 activiteit. Echter omdat het grootste gedeelte van het eiwit waarschijnlijk N-terminaal geblokkeerd is, kan het wellicht zo zijn dat deze verlengde versie slechts de minderheidsfractie voorstelt die te sequencen is. Op basis van de N-terminale en interne sequenties werd aan de fragmenten met een schijnbaar Mw 38, 24, 18 en 15 kD-fragmenten 15 toegewezen bestaande uit respectievelijk groep 1-310, 126-310, 1-125 e 42-125 van het doelproduct zoals getoond in Fig. 8, en theoretische Mw's van 28, 16, 12 en 8 kD, respectievelijk. Fragmenten die overeenkomen met groep 1 -41 (theoretisch Mw 4 kD) en 42-310 (theoretisch Mw 24 kD, schijnbaar Mw 3^ kD) werden niet waargenomen. Dit kon zijn 20 vanwege een (veel) frequentere splitsing tussen groep 125 en 126 dan tussen groep 4l en 42.

Kloning en expressie van muis-COLlAl-2 PCR is uitgevoerd op QUICK-ClonéS) cDNA van een 17~daagse muizen-25 embryo (Clontec) op dezelfde wijze als voor muis-C011Al-l onder toepassing van C1A1-FW en ClAl-RV2-primer. Na denaturatie bij 94*C gedurende 4 minuten, werden 35 cycli uitgevoerd bij 1 minuut bij 94eC, 1 minuut bij 65*C en 3 minuten bij 72*0. Uiteindelijke verlenging vond plaats bij 72*C gedurende 10 minuten. Agarosegelelektroforese toont 30 een band van 1,8 kB hetgeen de grootte is die wordt voorspeld uit de sequentie. De verdere klonering van C0L1A1-2 in de pPIC9 expressievec-tor is op dezelfde wijze uitgevoerd als voor C0L1A1-1, hetgeen pCOLAl-2 leverde (fig. 9)·

Pichia pastoris GS115 werd met de pC0LlAl-2 vector getransfor-35 meerd zoals is beschreven voor de pC0L3Al-vector. Met Sal I aan digestie onderworpen DNA werd toegepast teneinde specifiek Mut* transformanten te genereren. Diverse transformanten werden toegepast voor expressie op kleine schaal in schudflessen en één hiervan werd gekozen voor 1007908 36 expressie in de fermenteerinrichting op een schaal van 1-100 1. Figuur 10 toont de verwachte C0L1A1-2 aminozuursequentie. Typische opbrengsten liggen in het traject van 4-5 g gelatine/L in het (extracellu-lair) medium bij een droge biomassa van 100-120 g/L (ongeveer 3 g 5 gelatine/L in totaal). Het doelgelatine (Fig. 10) heeft een theoretisch Mw van 53 kD.

Klonering en expressie van muis-COLlAl-3 10 PCR is uitgevoerd op QUICK-Clone ™ cDNA van een muisembryo van 17 dagen (Clontech) op dezelfde wijze als voor muis-C0LlAl-l onder toepassing van C1A1-FW en ClAl-RV3-primer. Na denaturatie bij 94eC gedurende 4 minuten werden 35 cycli van 1 minuut bij 9^*C, 1 minuut bij 65°C en 3 minuten bij 72°C uitgevoerd. Uiteindelijke verlenging 15 vond plaats bij 72°C gedurende 10 minuten. Agarosegelelectroforese toont een band van 2,8 kb hetgeen de grootte is die voorspeld werd uit de sequentie.

De PUCl8*-plasmide werd aan digestie onderworpen met Ncol en 20 gedefosforyleerd. Het ClAl-FW/ClAl-RV3~PCR-product werd aan digestie onderworpen met Ncol en het resulterende fragment van 2,5 kb werd op een gel gezuiverd en in de met Ncol aan digestie onderworpen en defosforyleerde vector geligeerd. Na transformatie van E. colt XLlBlue, werd correcte oriëntatie van het ingevoegde stuk in de 25 resulterende clonen geverifieerd door digestie met PvuII. De verdere clonering van C0L1A1-3 in de pPIC9-expressie vector is uitgevoerd op dezelfde wijze als beschreven is voor C0L1A1-1 hetgeen pC0LlAl-3 (figuur 11) gaf.

30 Pichia pastorts GS115 werd met de pC0LlAl-3 vector getransformeerd zoals is beschreven voor de pC0L3Al-vector. Met Sal I aan digestie onderworpen DNA werd toegepast ten einde specifiek Mut*-transformanten te genereren. Diverse transformanten werden toegepast voor expressie op kleine schaal in schudflessen en één daarvan werd gekozen voor 35 expressie in de fermenteerinrichting op een schaal van 1-100 L. Figuur 12 toont de verwachte COLlAl-3-aminozuursequentie. Typische opbrengsten liggen in het gebied van 4-5 g gelatine/L in het extracellulaire compartiment (zoals bepaald na fractionering met

1 O 7 Γ* ' · P

» O · ·;* \j O

37 aceton zoals hieronder is beschreven) bij een droge biomassa van 100-120 g/L (ongeveer 3 g gelatine/L in totaal). Het doelgelatine (figuur 12) heeft een theoretisch Mw van 72 kD. In overeenstemming met deze waarde werd een SDS-PAGE band die migreerde bij een schijnbaar Mw van 5 ongeveer 100 kD waargenomen (geïnterpoleerde waarde verkregen met globulaire eiwit-Mw-markers). Daarnaast werden drie kortere producten met een schijnbaar Mw van 85. 18 en 15 kD waargenomen (geïnterpoleerde waarden). Indien de proteolytische splitsing op zou treden bij homologe plaatsen in de C0L1A1-1 en COLlAl-3-expressieproducten (Fig.

10 8, 12), kan men verwachten dat fragmenten bestaande uit groep 1-595.

126-595. 1-125 en *12-125 van het C0L1A1-3 product zou optreden. Deze zouden respectievelijk theoretische molecuulgewichten van 53. 42, 12 en 8 kD hebben die overeenkomen met schijnbare Mw's van 74, 58. 17 en 11 kD. Verrassenderwijs komt dit goed overeen met de waargenomen 15 schijnbare Mw's hetgeen aangeeft dat splitsing van C0L1A1-2 voornamelijk was beperkt tot een binding tussen groep 125 en 126 en (in een mindere mate) de binding tussen 4l en 42. Wederom werden fragmenten die overeenkomen met groep l-4l (theoretische Mw 4kD) en 42-812 (theoretisch Mw 68 kD, schijnbaar Mw 96 kD) niet waargenomen.

20 Dit kon zijn te wijten aan een (veel) frequentere splitsing tussen groep 125 en 126 dan tussen groep 4l en 42 zoals voor C0L1A1-1 is genoemd.

Tabel 1 vat de schijnbare COllAl-fragment-grootten die door 25 vergelijking van molecuulgewicht marker eiwitten zijn afgeleid (LMW Calibratie-kit; Pharmacia) samen met de grootte die uit de sequentie is berekend.

•j o f: 7 ς π h * «·' ·* 1 V X— 38

Tabel 1: schijnbare en theoretische molcuulgewichten van C0L1A1- fragmenten

Schijnbare Molecuul Molecuul I

5 molecuul- gewicht gewicht I

gewicht op gecorrigeerd berekend uit I

SDS-PAGE voor 40Ji de sequentie Genproduct I

gel langzamere Groep fl

migratie I

100 kD 71 kD 1-812 12 kD (1A1-3) I

10 85 kD 61 kD 125-812 61 kD (1A1-3) 1

74 kD 53 kD 1-595 54 kD (1A1-2) I

56 kD 40 kD 125-595 42 kD (1A1-2) 38 kD 27 kD 1-310 28 kD (1A1-1) 24 kD 17 kD 125-310 16 kD (1A1-1) 15 18 kD 13 kD 1-125 12 kD (1A1-1,2,3) 15 kD 11 kD 42-125 8 kD (1A1-1,2,3) |

Het is duidelijk uit tabel 1 dat het MGPR-model goed past bij de werkelijke fragmentgrootten.

20 Men kon eveneens fragmenten met groep l-4l (4 kD; 1A1-1,2,3) en 42-310 (theoretisch Mw: 24 kD schijnbaar Mw: 3^ kD;lAl-l)f 42-600 (theroetisch Mw: 50kD schijnbaar Mw: 70 kD; 1A1-2), of 42-600 (theoretisch Mw: 68 kD schijnbaar Mw: 96 kD; 1A1-3). Het feit dat deze fragmenten niet op gel worden gezien kan worden verklaard door aan te 25 nemen dat de splitsingssnelheid bij de tweede MGPR-plaats veel hoger is dan die bij de eerste plaats. Dit betekent dat wanneer het eiwitmolecuul wordt geknipt dit altijd eerst zal optreden bij de tweede plaats. Dit verschil in splitsingssnelheden kan worden verklaard door het feit dat de eerste plaats vooraf wordt gegaan door 30 een prolinegroep die mogelijk de protease-sterisch kan hinderen.

Muis-C0L1A1-1, C0L1A1-2 en C0L1A1-3 RGPM-mutanten

Wij hebben de mogelijkheid overwogen dat dezelfde aminozuursequentie die als herkenningsplaats voor proteolytisch enzym(en) dient 35 verantwoordelijk kon zijn voor de afbraak van alle C0L1A1-producten (C0L1A1-1, C0L1A1-2, C0L1A1-3). Verrassenderwijs werden beide interne en N-terminale sequenties die verkregen werden van de 15kD en 24kD

1007908 39 COLlAl-l fragmenten voorafgegaan door dezelfde seqentie MGPR. Bovendien verschijnt deze sequentie slechts twee maal in de C0L1A1-1, C0L1A1-2, of C0L1A1-3 genen van de muis te weten bij groep 83_itl en 122-125. (zoals vergeleken met C0L1A1-1, C0L1A1-2 en C0L1A1-3 bevatten 5 deze geen additionele MGPR-sites). Evenmin bevat het C0L3Al-fragment van de rat zo'n plaats. Dit komt mooi overeen met de waargenomen splitsingspatroon. Derhalve geloven wij dat MGPR een motief is dat wordt herkend door een specifieke protease resulterend in de splitsing van de COLlAl-eiwitten. Deze MGPR-protease-herkenningsplaats is nog 10 niet eerder beschreven. Een meer veralgemeniseerde voorstelling van het motief zou mogelijk kunnen zijn MXXR, MXX[RK] of zelfs [MLIV]XX[RKH]. De voorgaande motieven zijn inderdaad slechts tweemaal in het volledige muis COLlAl-gen aanwezig en ontbreken in het C0L3A1-fragment, terwijl het laatste motief zo breed is dat het ook niet-15 gesplitste plaatsen omvat: MKGH bij groep 85-88 en VGAK bij groep I69-172 in C0L1A1 en IKGH bij groep 198-201 in C0L3A1. Derhalve zijn MXXR of MXX[RK] meer ogenschijnlijk de veralgemeniseerde motieven dan [MLIV]XX[RKH]. Figuur 13 toont de MGPR-motieven in de C0L1A1-2-sequentie. Verwacht kan worden dat deze proteolytische 20 splitsingsplaats slechts wordt herkend door de enzymen die betrokken zijn indien het in betrekkelijk open niet-gevouwen structuren voorkomt (zoals in onze gelatines) maar niet zo eenvoudig in meer compact gevouwen structuren (zoals in globulaire eiwitten). Derhalve zou het slechts van belang kunnen zijn bij bepaalde klassen eiwitten en 25 polypeptiden waaronder gelatines en niet-gevouwen collagenen.

Teneinde C0L1A1-1, C0L1A1-2 en C0L1A1-3 met volledige lengte te kunnen produceren zonder het optreden van de drie andere grote banden dienen de MGPR-motieven door plaatsgerichte mutagenese te worden verwijderd. 30 Ten einde de oorspronkelijke aminozuursamenstelling van natuurlijk COLlAl-gelatine te bewaren werd het MGPR-motief verwijderd door omzetting naar RGPM. Twee paren complementaire primers werden gesynthetiseerd: 35 C0L1A1MUT1FW:

RGPM

5’-GAG-CCT-GGC-GGT-TCA-GGT-CCA-CGA-GGT-CCA-ATG-GGT-CCC-GGT-GG-3* 1007908 5 40 C0L1A1MUT1RV: 5’-CC-AGG-GGG-ACC-£AI-ÏGG-ACC-I£G-TGG-ACC-TGA-ACC-GCC-AGG-CTC-3' C0L1A1MUT2FW: R G P Μ 5'-GGA-GCT-CCT-GGC-CAG-CGA-GGT-CCA-ATG-GGT-CTG-CCC-GGT-GAG-An-?· 10 C0L1A1MUT2RV: 5'-CT-CTC-ACC-GGG-CAG-ACC-CAT-1GG-ACC-I2S-CTG-GCC-AGG-AGC-TCC-3 *

Let op: mutantposities zijn onderstreept; de oorspronkelijke C van de 15 Pro-groep is omgezet in A teneinde de vorming van een Ncol-plaats te voorkomen.

Drie primer-combinaties werden toegepast:

1. 5'AOXl primer en C0L1A1MUT1RV 20 2. C0L1A1MUT1FW en C0L1A1MUT2RV

3. C0L1A1MUT2FW en 3'AOXl

De reacties bevatten 1,25 U Pwo-polymerase (Eurogentec), 50 pmol van elke primer, 0,2 mM dNTPs (Pharmacia), lx Pwo-buffer (Eurogentec) en 15 ng pCOLlAl-l-mal-DNA in een totaal reactievolume van 50μ1. De PCR-25 inrichting die werd toegepast was de GeneAmp 9700 (Perkin-Elmer), Na een oorspronkelijke incubatie bij 94°C gedurende 5 minuten werden 18 cycli uitgevoerd die bestaan uit 30 seconden bij 94eC, 30 seconden bij 60°C en 45 seconden bij 72°C. Uiteindelijke verlenging werd uitgevoerd bij 72°C gedurende 10 minuten. Agarose-electroforese van de PCR-30 reacties onthulde producten met te verwachten grootten (resp. 0,5, 0,3 en 0,7 kg). De benden werden uit de gel gesneden en gezuiverd. De geïsoleerde fragmenten werden daarna aan overlapverlenging met PCR onderworpen. Bij benadering 0,1 pmol van elk fragment werd samen gemengd, 50pmol 5'AOXl en 3'AOXl primer werden toegevoegd alsmede Pwo-35 polymerase, dNTPs en buffer zoals hierboven beschreven. De cyclische condities waren dezelfde als hierboven is beschreven met uitzondering van het uitvoeren van de verlenging bij 72eC die gedurende 90 seconden in plaats van 45 seconden werd uitgevoerd. Agarosegel-electroferese 1 1 1007908 41 onthulde het verwachte 1,5 kb product. De rest van de PCR-reactie werd gezuiverd onder toepassing van de Qiaquick PCR-ZuiveringsKit (Qiagen). Het gezuiverde DNA werd daarna aan digestie onderworpen met BamHI/Apal waarna het resulterende fragment van 1,0 kb uit gel werd gezuiverd.

5 E.coli-stam JM110 werd met pCOLlAl-1, pCOLlAl-2 en pC0LlAl-3 getransformeerd teneinde de dcm-methylering van de Apal-site verwijderen. Na DNA-isolatie werden de plasmiden aan digestie onderworpen met BamHI/Apal. De resulterende vectorfragmenten respectievelijk van 7.9. 8,8 en 9,5 kb werden uit agarosegel gezuiverd 10 en in het met BamHI/Apal digestie onderworpen PCR-product geligeerd. E. coli XLlBlue werd getransformeerd met deze ligatiereacties en plasmide-DNA van met PCR geverifieerde insertie bevattende clonen werden geïsoleerd en geverifieerd door geautomatiseerde sequentievolgordebepaling. De mutant-plasmiden pCOLlAl-1*, pCOLlAl-2* 15 en pC0LlAl-3* die aldus werden gevormd werden aan digestie onderwerpen met Sail en toegepast voor het transformeren van Pichia pastoris stam GS115. Expressie op kleine schaal en op fermentorschaal werd uitgevoerd zoals beschreven is voor C0L1A1-1.

20 De SDS-PAGE-analyse toont duidelijk dat slechts één hoofdband van de verwachte grootte met volledige lengte wordt gevormd voor zowel C0L1A1-1* als C0L1A1-2* en C0L1A1-3’.

Expressie/productie van gelatine in een fermentor 25 Gevoede ladingsgewijze fermentaties werden uitgevoerd volgens de Pichia fermentatieprocesrichtlijnen van Invitrogen. Cellen werden gekweekt in een fermentor van 1-liter (Applikon) in de oorspronkelijke experimentele stadia ten einde eiwitproductie te optimaliseren. Daarna werden cellen in een 20-liter of in een l^O-liter fermentor gekweekt 30 (Biobench 20, Bio-pilo 14, Applikon) voor productie van collageen op pilot-schaal. Werkvolumes waren 1-liter, 15-liter en 100-liter respectievelijk. AD1020 controlleerinrichtingen (Applikon) werden toegepast om de fermentatieparameters te volgen en te controleren. Het programma BioXpert (Applikon) werd voor data-opslag gebruikt. De 35 hoeveelheid opgeloste zuurstof werd gevolgd in de fermentor onder toepassing van een zuurstofelectrode (Ingold voor fermentaties van 1-liter, Mettler Toledo voor fermentatie op grotere schaal). Schudden (500-1000 rpm) en beluchting (1-2 wm, d.w.z. l^LL^min*1) werden met 1 00 7908 42 de hand ingesteld om de opgeloste zuurstofconcentratie boven 20% te houden. pH werd gemeten met een pH-electrode (Broadly James

Cooperation) en automatisch door toevoeging van ammoniumhydroxide (25%) bij pH 3.0 of pH 5,0 gehouden hetgeen eveneens diende als 5 stikstofbron voor de groei van de micro-organismen. Een anti- schuimelectrode werd toegepast teneinde overmatige schuimvorming te voorkomen. Indien noodzakelijk werd anti-schuim Structol J673 (Schill en Seilachter, Hamburg, Duitsland) toegepast. Groei van de micro-organismen werd gevolgd door bepaling van het droge gewicht van de 10 cellen. Een calibratiecurve werd gemaakt waarbij het natte gewicht van de cel kan worden omgezet in het droge gewicht van de cel. Het droge gewicht van de cel werd bepaald na centrifugatie van monsters van 2 ml gedurende 5 minuten bij 15.000 rpm waarna het supernatant werd verwijderd. Het droge gewicht van de cel werd bepaald na toevoeging 15 van 200 μΐ cellen aan een voorgedroogde filter (0,45 pm membraan,

Schleichner & Schtill, Dassel, Duitsland) wassen met 25 ml gedeïoniseerd water en drogen in een magnetron gedurende 15 minuten bij 100 W. Het droge gewicht van de cel was bij benadering een factor 3 lager dan het natte gewicht van de cel. Voorcultures werden gestart 20 uit kolonies op een MGY-plaat in flessen met een totaal van 10% van het oorspronkelijke fermentatievolume van MGY. Het volume van het medium bedroeg < 20% van het totale flesvolume. Cellen werden gekweekt bij 30eC bij 200 rpm in een roterende schudinrichting (Gallenkamp) gedurende 24-60 uur.

25

Fermentatiemedium

Het basale zoutmedium voor fermentatie in de fermentor bevatte per liter; 26,7 ml fosfoorzuur (85#), 0,93 g calciumsulfaat, 18,2 g kaliumsulfaat, 14,9 g magnesiumsulfaat. 7H20, 4,13 g kaliumhydroxide en 30 40,0 g glycerol. Een hoeveelheid van 4,3 ml PTMj spoorzouten werd per liter basale zoutmedium voor fermentatie toegevoegd. ΡΤΜΧ spoorzouten bevatten per liter: 4,5 g koperchloride. 2H20, 0,09 g kaliumjodide, 3.5 g mangaanchloride. 4H20, 0,2 g natriummolybdaat. 2H20, 0,02 g boorzuur, 1,08 g kobaltsulfaat. 7¾. 42,3 g zinksulfaat. 7H20, 65.0 g 35 ijzersulfaat. 7°. 0,2 g biotine en 5.0 ml zwavelzuur. Spoorzouten werden over een filter gesteriliseerd (poriegrootte 0,22 pm, Costar, ~ USA).

i 1 00 7908 43

Fermentatie van mut*-kweken

De fermentor werd gesteriliseerd met het basale zoutmedium voor fermentatie. De 20-liter en 120-liter fermentor werden in situ gesteriliseerd met oorspronkelijke mediumvolumina van 5“7.5 liter en 5 50 liter respectievelijk. De 1-liter fermentor werd met 500 ml medium in een hoge drukpan gesteriliseerd. Na sterilisatie werd de temperatuur ingesteld op 30eC en werden schudden en beluchting ingesteld op 500 rpm en 1 wm (d.w.z. 1 LI/Hlmin'1) respectievelijk. De pH werd ingesteld op een vastgesteld punt (meestal pH 5.0) met 25% 10 ammonlumhydroxide. Spoorzouten werden aseptisch aan het medium toegevoegd. De fermentor werd geent met 10# van het oorspronkelijke fermentatievolume van pre-gekweekte cellen in MGY. De ladingsgewijze kweek werd gekweekt tot de glycerol volledig was verbruikt (18-24 uur). Dit werd aangeduid door een toename van de opgeloste 15 zuurstofconcentratie tot 100#. Het droge gewicht van de cel was in dit stadium 25-35 g/1. Daarna werd de gevoede ladingsgewijze fase met glycerol gestart door initiatie van een 50% (vol/vol) glyceroltoevoer die 12 ml PTMa-spoorzouten per liter glycerol bevatte. De glyceroltoevoer werd ingesteld op 18 ml/uur/liter oorspronkelijke 20 fermentatievolume. De glyceroltoevoer werd gedurende vier uur uitgevoerd of bij een lange lagfase gedurende de nacht. Gedurende de glycerolladingsfase werd de pH van het fermentatiemedium verlaagd tot 3.0. De eiwitinductiefase werd geïnitieerd door een methanoltoevoer van 100# die 12 ml PTMj spoorzouten per liter methanol bevatte te 25 starten. De toevoersnelheid werd ingesteld op 3 ml/uur/liter oorspronkelijk fermentorvolume. Gedurende de eerste uren hoopte methanol zich op in de fermentor. Na 2-4 uur namen opgeloste zuurstofhoeveelheden af vanwege aanpassing aan methanol. De methanoltoevoer werd verhoogd tot 6 ml/uur oorspronkelijk fermentorvolume in 30 het geval van een snelle piek van opgelost zuurstof. Indien de koolstofbron beperkend is veroorzaakt het afsluiten van de koolstofbron een afname van de metabolische snelheid van de kweek en stijgt de concentratie opgeloste zuurstof (piek). Na een additionele 2 uur werd de methanolhoeveelheid vergroot tot 9 ml/uur/liter 35 oorspronkelijk fermentorvolume. Deze toevoersnelheid werd gedurende de rest van de fermentatie gehandhaafd. De fermentatie werd na 70“130 uur methanol in de gevoerde ladingsgewijze fase gestopt. Gedurende de fermentatie werden monsters van 2 ml genomen, gecentrifugeerd (5 min, 100 7908 44 15.000 rpm) en werd het supernatant bij -20*C bewaard.

Concentratie van gelatine en totaaleiwit werd bepaald na filtratie van , de monsters (0,22 pm) en daarop volgende acetonfractionering (40 vol.# 5 gevolgd door 60-80 vol.# aceton). De BCA-eiwitassay (Pierce) werd routinematig toegepast met gelatine van Merck als referentie. Volgens SDS-PAGE en analyse van de aminozuursamenstelling precipiteerden de niet-collagene eiwitten bij 40# aceton terwijl de C0L3A1- en C0L1A1-fragmenten precipiteerden bij 60-80#. Bij 60# aceton precipiteerden 10 bij voorkeur de gelatinebestanddelen met een hoger molecuulgewicht. Bij toename van acetonconcentratie werd toegenomen precipitatie verkregen voor de hoofdafbraakproducten die boven zijn beschreven. Bij 80# waren alle hoofdafbraakproducten terug gevonden in het precipitaat (zoals gecontroleerd met SDS-PAGE).

15 Kleine peptiden en andere verontreinigingen met laag molecuulgewicht bleven bij 80# aceton in oplossing.

Aan het eind van de fermentatie werden de cellen door centrifugatie verwijderd (10.000 rpm, 30 min, 4°C) in het geval van de 1-liter 20 fermentatie. Cellen werden in het geval van de 20-liter fermentatie door microfiltratie verwijderd. Het celbouillon werd eerst aangebracht op een microfiltratiemodule die een polyethersulfonmembraan bevatte met 0,50 pm poriegrootte (type MF 05 M2 van X-Flow, die in een RX 300 filtratiemodule van X-Flow was aangebracht). Daarna werd het 25 supernatant aangebracht op een soortgelijk type microfiltratiemodule die een polyethersulfonmembraan met 0,2 pm poriegrootte bevatte (type MF 02 Ml, eveneens van X-Flow) ♦ In het geval van de 120-liter fermentatie werden cellen verwijderd door een microfiltratie-eenheid op de schaal van een pilot plant die een polyethersulfonmembraan met 30 0,2 pm poriegrootte bevatte (type MF 02 Ml van X-Flow die in een R-10 membraanmodule was gebracht). Deze filtratie-eenheden worden slechts als voorbeelden genoemd. Het dient te worden begrepen dat elk geschikt microfiltratiesysteem kan worden toegepast om de cellen te verwijderen. Eventueel werd het gros van de cellen en afval door 35 centrifugatie verwijderd en werden slechts het supernatant en het medium gebruikt om de cellen te wassen die op de microfiltratie-eenheden werden aangebracht. Als alternatief was het mogelijk het product uit het fermentatiebouillon te winnen en van de cellen te 1 00 7908 45 scheiden door direct het fermentatiebouillon aan te brengen op een geschikte uitgebreide bedchromotografiesysteem onder toepassing van een hars die specifiek het geproduceerde gelatine bindt. Met succes werd SP Sepharose XL Streamline van Pharmacia als kationuitwisselaar 5 in geëxpandeerde bedmode bij pH 3"4 toegepast.

Fermentatie van MutB-kweken

Glycerol ladingsgewijze en gevoede ladingsgewijze fasen werden 10 uitgevoerd zoals beschreven is voor de mut*-kweken. Aangezien Mut‘-kweken methanol slecht metaboliseren is hun zuurstofconsumptie zeer laag. Derhalve kunnen pieken van de opgeloste zuurstofconcentratie niet worden toegepast om de kweek te evalueren. De methanoltoevoer werd ingesteld om een overmaat methanol in het medium te handhaven die 15 echter 0,8% niet overschrijdt. De methanoltoevoer werd begonnen bij 1 ml/uur/liter oorspronkelijk fermentorvolume en langzaam verhoogd tot 3 ml/uur/liter. De totale fermentatietijd die vereist was bij het gebruik van Muts-kweken was aanzienlijk langer dein wanneer Mut*-kweken werden toegepast.

20

Preparatieve zuivering van collageen/gelatine op een preparatieve schaal

Na de microfiltratiestap werden twee alternatieve zuiveringsstrategieën gevolgd (zie I, II hieronder).

25 I. Zuivering door differentiële precipitatie

Aceton fractionering

Collageen type I en type III werden gedeeltelijk uit ladingen van 500 30 ml gezuiverd tot 2 liter supernatant door een acetonfractionering van 40-80?». Bij 40# aceton werden de niet-collagene eiwitten (uit Pichia) geprecipiteerd terwijl bij 60-80X aceton collageen alsmede collageenafbraakproducten werden geprecipiteerd zoals getoond door SDS-PAGE en analyse van de aminozuursamenstelling. Bij 60# aceton 35 worden bij voorkeur de gelatinebestanddelen met een hoger molecuulgewicht geprecipiteerd. Bij toenemende acetonconcentratie werd toenemende precipitatie verkregen voor de hoofdafbraakproducten die boven zijn beschreven. Bij 80% werden alle hoofdafbraakproducten in 1 00 7908 46 het precipitaat gewonnen {zoals gecontroleerd met SDS-PAGE). Kleine peptiden en andere laag-molecuulgewicht-verontreinigingen bleven in oplossing bij 80# aceton. Aceton werd gedurende 2 tot 4 uur bij -20 *C gekoeld. Een hoeveelheid van 40# ijskoude aceton (vol/vol) werd 5 langzaam aan het voorgekoelde supernatant van de fermentatie toegevoegd bij 4°C onder magnetisch roeren. Supernatant werd gedurende de nacht bij 4°C geroerd. Geprecipiteerde eiwitten en deeltjes werden door centrifugatie verwijderd (4*0, 10.000 rpm, 30 minuten). De pellet werd in 40# ijskoude aceton geresuspendeerd en nogmaals 10 gecentrifugeerd. Beide 40# aceton supernatantfracties werden samengebracht. Daarna werd het supernatant op 60-80# aceton gebracht (vol/vol) en gedurende de nacht geroerd. Geprecipiteerde eiwitten werden door centrifugatie verzameld. De pellet werd in 60-80# aceton geresuspendeerd en nogmaals gecentrifugeerd. De pellet werd opgelost 15 in een geschikte hoeveelheid 5 mM azijnzuur/ammoniumhydroxidebuffer bij pH 3,0 (buffer A) tot een eiwitconcentratie van 20-50 g/1.

AmmoniumsulfaatPreciDitatie

Polysacchariden werden daarna door precipitatie van het 20 gelatine/collageen verwijderd bij 60# verzadiging van ammoniumsulfaat, waarbij de polysacchariden in oplossing bleven. Ammoniumsulfaat werd langzaam tot 60# verzadiging toegevoegd bij 4°C. Na roeren gedurende 60 minuten werd het monster gecentrifugeerd (30 min, 4°C, 10.000 rpm). De pellet werd in 60# ammoniumsulfaat geresuspendeerd en nogmaals 25 gecentrifugeerd. Indien meer dan 1# (gew/gew) polysacchariden of suikers aanwezig bleven werd de volledige precipitatievoorschrift met ammoniumsulfaat zoals hierboven is beschreven herhaald na volledig opnieuw oplossen van het gelatine/collageen bij afwezigheid van ammoniumsulfaat. Uiteindelijk werd de pellet opgelost in gedeioniseerd 30 water of in buffer A tot een eiwitconcentratie van 20-50 g/1. De pH van het monster werd ingesteld op 3*0. Het monster werd door dialyse tegen buffer A ontzout welke buffer elke vier uur werd verversd. Dialysemembranen van geregenereerde cellulose (Spectra Por* werden toegepast met een moleculair afsnijgewicht van 8kD. De dialyse werd na 35 2-7 dagen gestopt op het moment dat de geleidbaarheid van het monster geschat werd voldoende laag te zijn (gewoonlijk 20-150 pS.cnf1 boven achtergrond). Geleidbaarheid werd gemeten met een digitale geleidbaarheidsmeter (radiometer) die met 1 mM en 10 mM KC1- I 1 00 7908 i .1 *»7 oplossingen was gecalibreerd (1*10 en 1*100 pS.cm-1, respectievelijk). Als alternatief voor dialyse werden ultrafiltratie en diafiltratie toegepast om de monsters te ontzouten en (eventueel de monsters te concentreren. Waar toepasbaar werd het product vervolgens voorgedroogd 5 (eventueel) door precipitatie met hoge concentraties aceton en verdamping van aceton en uiteindelijk gevriesdroogd.

II. Zuivering door kationuitwisselingschromotografie 10 De kationuitwisselingshars was SP Sepharose XL (Pharmacia Biotech) maar andere geschikte harsen konden eveneens worden toegepast. De zuivering werd op diverse schalen uitgevoerd. Aldus werd een 25 ml bed in een XK 16 kolom (Pharmacia) toegepast. Proeven werden uitgevoerd met een FLPLC (Pharmacia). Bedhoogte bedroeg 12,5 cm. Stroomsnelheden 15 bedroegen gewoonlijk 1 ml/min. Op een tussenschaal werd een bed van 100 mL toegepast waarbij de proeven werden geregeld door een Akta Explorer geïntegreerde pomp/processor/meervoudige klep/meervoudige detecteereenheïd (Pharmacia). Op pilotschaal werd een 2-liter bed in een Index 1*10/200 kolom toegepast. Bedhoogte bedroeg tenminste 13 cm. 20 Proeven werden uitgevoerd met de Akta explorer pompprocessor-unit (Pharmacia) of andere pompsystemen. Stroomsnelheden waren 50-100 ml/min of hoger. Bij wijze van voorbeeld werden het volgende buffersysteem en elutie-omstandigheden toegepast. Buffer X was een 5 mM citroenzuurbuffer bij pH 3.2, buffer Y een 5 ®M citroenzuurbuffer 25 met 1 M NaCl bij pH 3.0. De kolom werd in evenwicht gebracht met 2-5 bedvolumina buffer X. Het eiwit van belang werd met een lineaire gradiënt van 0-0,5 M NaCl in 5~10 kolomvolumina geëlueerd. De hoofdband van collageentype III elueerde bij 50-100 mM NaCl. De hoofdband van collageentype I elueerde bij 70 mM NaCl, de andere 30 banden tussen 30-150 mM NaCl, in overeenstemming met de theoretische iso-electrische punten, De kolom werd met 1 bedvolumebuffer Y gezuiverd. Op een pilotschaal werden de samengevoegde fracties ontzout en geconcentreerd bijvoorbeeld door toevoeging van 80% aceton en vervolgens gevriesdroogd.

35

Karakterisering van het gelatine/collageenproduct

De aminozuursamenstelling werd bepaald na volledige door HC1 uitgevoerde hydrolyse van de peptide-bindingen bij zeer lage pH en 1 00 7908 48 verhoogde temperatuur gevolgd door derivatisering van de aminozuren met een fluorofoor en HPLC.

Het verwachte van zuiver collageen percentage Gly is 33#· Dit biedt 5 een middel voor het schatten van de zuiverheid van geproduceerde recombinante gelatinen. Ten einde voor het percentage Gly in endogeen afgescheiden eiwitten van Pichia pastorie te corrigeren werd aminozuursamenstellingsanalyse uitgevoerd op fermentatiesupernatant van een Mut*-trans formant van pPIC9· Het percentage Gly dat werd 10 gevonden bedroeg 9#· De zuiverheid van een monster kan nu geschat worden door de formule: (%Gly-9)/(33-9) = (2Gly-9)/24.

Na oplossing van monsters in MilliQ-water werden de volgende assays 15 uitgevoerd.

Het eiwitgehalte werd bepaald door middel van de BCA-assay van Pierce onder toepassing van gelatine van Merck als referentie.

20 De verdeling van eiwit-Mw werd bepaald onder toepassing van SDS-PAGE.

Het suikergehalte werd bepaald door middel van een assay op basis van fenol. Monsters van 200 pL werden met 200 pL 3% (gew/gew) fenol gemengd. Na grondig mengen onder toepassing van een Vortex 25 menginrichting werd 1 mL geconcentreerd zwavelzuur toegevoegd. Na mengen werden de monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en daarna gedurende 20 minuten bij 30°C geïncubeerd. Na koeling werd de lichtabsorptie van de monsters bij 485 nm bepaald. Zetmeel, glucose en sucrose werden toegepast om calibratiecurves te bereiden.

30

Het DNA-gehalte werd bepaald door gelijke hoeveelheden verdund SYBR Green I nucleïne-zuurgel-kleur (10.000 x cone, in DMS0) van Molecular Probes met onze monsters te mengen. Na grondige spectrale analyse werd de excitatie-golflengte gekozen op 490 nm en de emissiegolflengte op 35 523 nm. De calibratie vond plaats door daarna bekende hoeveelheden DNA

als interne standaarden aan dit zelfde mengsel toe te voegen. Aldus werd een calibratiecurve geconstrueerd. Verder werd gecontroleerd dat daarop volgende toevoeging van DNA afbrekend enzym resulteerde in 1 00 7908 49 volledige afbraak van het fluorescentie-signaal.

Een kwantitatieve indicatie van het RNA- plus DNA-gehalte werd vervolgens verkregen onder toepassing van SYBR Green II ”RNA 5 gelkleuring" in plaats van SYBR Green I. Na grondige spectrale analyse werd de excitatiegolflengte gekozen op 94 nm en de emissie golflengte op 514 nm. Calibratie vond plaats door daarop volgende toevoeging van een bekende hoeveelheid RNA. De resulterende waarde werd het RNA-gehalte van een monster genoemd. Bij afwezigheid van DNA kwam dit 10 overeen met de ware RNA-gehalten. Indien aanwezig zou met DNA geassocieerde fluorescentie een afwijking voor de RNA-waarden hebben kunnen geven hoewel een uiteindelijke toevoeging van RNAse werd toegepast om de van DNA en RNA afgeleide bijdrage aan de fluorescentie te onderscheiden.

15

De geleidbaarheid van de monsters werd gemeten onder toepassing van een digitale radiometergeleidbaarheidsmeter waarbij gecontroleerd werd dat oplossing van 1 en 10 mM KCL in milliQ-water waarden gaven van respectievelijk van 140 en 1400 pS.cm'1.

20

Data over zuiverheid van sommige gelatineladingen die geproduceerd zijn in overeenstemming met de uitvinding (voorbeelden) 25 GAT04a (col3al) - ongeveer 2,4 gram - zuivering: microfiltratie, precipitatie (lx acetonfractionering (402 / 802), lx (NHi|)2S0A), dialyse tegen 5mM CH3C00H/CH3C00* -buffer voor het 30 onder pH 4 houden van het monster (aanvangs pH rond 3»5; buffer

werd bereid door verdunning van 500 mM azijnzuur ingesteld op pH

3,0 met 252 (NH)A0H), lyofilisatie - DNA: < 1 ppm (gew./gew.) - RNA: 12,7 ppm (gew./gew.) 35 - totale suikers: 4,52 (gew./gew.) - gelatine werd niet tijdens zuivering afgebroken (SDS-PAGE: figuur 14) 1 00 7908 5° GAT04b (col3al, verder gezuiverd dan GAT04a) - ongeveer 1 gram - zuivering:

verder gezuiverd uit GAT04a door het herhalen (additonele 2x) van 5 ammoniumsulfaatprecipitatie gevolgd door dialyse tegen 5mM

CH^COOH/CHjCOO -buffer voor het onder pH 4 houden van het monster (aanvangs pH rond 3»5ί buffer werd bereid door verdunning van 500 mM azijnzuur ingesteld op pH 3,0 met 25# (NH)40H), lyofilisatie - - DNA: < 0,56 ppm (gew./gew.) 10 - RNA: 3.2 ppm (gew./gew.) - totale suikers: 0,94% (gew./gew.) ' ~ gelatine werd niet tijdens zuivering afgebroken.

- specifieke geleiding na dialyse rond l80 pScm1 bij 10 g gelatine/L (specifieke geleiding van buffer rond 100 pScm'1) - 15 specifieke geleiding na lyofilisatie en het oplossen van een monster: 180 pScnfl

bij 10 g gelatine/L, 100 pScnf1 bij 5 g gelatine/L

GAT05 (collal-1) 20 - ongeveer 0,9 gram zuivering:

microfiltratie, precipitatie (lx acetonfractionering (40% / 80%), lx (NHi,) jSO;,), dialyse tegen 50M CH3C00H/CH3C00" -buffer voor het onder pH 4 houden van het monster (aanvangs pH rond 3·5ï buffer 25 werd bereid door verdunning van 500 mM azijnzuur ingesteld op pH

3,0 met 25% (ΝΗ^ΟΗ), lyofilisatie - DNA: < 1 ppm (gew./gew.) - RNA: 87 ppm (gew./gew.) - totale suikers: 4,5% (gew./gew.) 30 - gelatine werd niet tijdens zuivering afgebroken (SDS-PAGE: figuur 15) GAT06 (col3al gezuiverd door uitgebreid-bed-kationen-uitwisselings-chromotograf ie) 35 " rond 50 mg - zuivering: uitgebreid-bed- kationenuitwisselingschromotografie bij pH 3”3.5 (SP-Sepharose-XL "Streamline" hars van Pharmacia Biotech; 1 00 7908 51 suikergehalte na sub-optimaal spoelen van de kolom en elutie bij 0,3 M NaCl: 1,8% (gew./gew.), verdere verwijdering van suiker door een enkele precipitatie met (NH^jSOj,, gevolgd door dialyse tegen 5 mM ΝΗή+ / CH3C00* -buffer (pH rond 3.5). lyofilisatie 5 - DNA: < 1 ppm (gew./gew. reeds voor precipitatie met (NH^jSO/, en dialyse) - RNA: < 9 ppm (gew./gew. reeds voor precipitatie met (NH^gSOi, en dialyse) - totale suikers: 1,1%.

10 - specifieke geleiding na dialyse rond 94 pScm'1 bij 0,55 g

gelatine/L

(specifieke geleiding van buffer: rond 100 yScnf1).

- gelatine werd tijdens zuivering niet afgebroken.

15 CAT07 (collal-2) - 400 mg - zuivering: microfiltratie, precipitatie (lx aceton fractionering (40# / 71.5#). 3* (NH/JjSOi,), van tevoren ontzouten door aceton-20 precipitaties: lx 71.5#· 1χ 80#, dialyse tegen MilliQ-water, lyofilisatie - DNA: nog niet bekend, nog te bepalen - RNA: nog niet bekend, nog te bepalen 25 - totale suikers: 0,7# (gew./gew.)

- specifieke geleiding na dialyse rond 15,5 pScm'1 bij 4 g gelatine/L

- gelatine werd tijdens zuivering niet afgebroken REFERENTIES DIE IN VOORBEELD 1 ZIJN GECITEERD 30 [1] Capello, J. & Ferrari, F. (199*0 in: Plastics from microbes (Mobley, D. P., ed.) Hanser, Munich, pp. 35*92 [2] Strausberg, R. L. & Link, R. P. (1990) TIBTECH 8: 53-57.

35 [3] Maniatis T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J. (1982) Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

1007908 52 £**] Manual of the Pichia Expression Kit Version E (Invitrogen, San Diego, CA, USA).

[5] - Glumoff, V., Mëkelë, J. K. & Vuorio, E (199*0 Cloning of cDNA

5 for rat proal(III) collagen mRNA. Increased expression of type III collagen gene during induction of experimental granulation tissue. Biochim Biophys Acta 1217: 41-48.

EMBL/GenBank accession number X70369· 10

Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467.

[7] Becker, D. M. & Guarente, L. (1991) High efficiency 15 transformation of yeast by electoporation. Methods in Enzymology, vol. 194: I82-I87.

C8] Lee, F. J. S. (1992) Biotechniques 12 (5): 677 ^ [9] Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685· £10] Schmitt, Μ. E., Brown, T. A. and Trumpower, B. L. (1990) A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevlslae. Nucleic Acids Res. 18 (10): 3091· [11] Scorer, C. A., Clare, J. J., McCombie, W. R., Romanos, M. A. & Sreekrishna, K. (199*0 Rapid Selection using G4l8 of high copy number transformants of Pichia pastoris for high-level foreign 30 gene expression. Bio/Technology 12: l8l-l84. 1 2 1 00 7908

Butkowsky R. J., Noelken, Μ. E. & Hudson, B. G. (1982) Estimation of the size of colagenous proteins by electrophoresis and gel chromatography. Meth. Enzymol. 82: 410-423· 35 2

De Wolf, F. A.& Keller R. C. A (1996) Characterization of the helical structures in gelatin networks and model polypeptides by circular dichroism. Progr. Colloid Polym. Sci. 102: 9-l*J

53

Voorbeeld 2 (controle)

Bereiding van zilverbromide kristallen met conventionele reguliere gelatine type

Kernvorming: Bij een temperatuur van 35°C in een reactievat dat 2,1 5 g/1 reguliere gelatine bevat (een standaard gedeioniseerde IAG-bot gelatine van PB Gelatins, Tessenderlo, België) en 7,3 mM kaliumbromide is met natriumhydroxide of zwavelzuur de pH ingesteld op een waarde van 5,5. Door toevoeging met behulp van een enkele jet onder heftig roeren is een waterige oplossing van 1^4 mM zilvernitraat in een 10 constante hoeveelheid gedurende een periode van 10 sec. toegevoegd. Na toevoeging van het zilvernitraat is de gelatine-concentratie in het reactiemengsel 2,0 g/1 en bromide-concentratie ImM geworden.

RiIpingsstap; Na kernvorming wordt de inhoud van het vat overgebracht naar een rijpingsvat waar de temperatuur geleidelijk wordt verhoogd 15 tot een waarde van 3.^ M kaliumbromide-oplossing. De rijping wordt voortgezet gedurende 56 minuten waarna een standaard gedeioniseerde gelatine wordt toegevoegd tot een concentratie van 5 g/1; na 58 minuten is de Ostwald-rijpingsstap sterk verlaagd door het toevoegen van een oplossing van methyl-fenyl-tetraz ooi en door tot 20 kamertemperatuur af te koelen. Een monster van de bereide emulsie werd geanalyseerd door middel van directe transmissie electronenmicroscopie alsmede door herhaling daarvan.

Resultaat: Zoals in tabel II kan worden gezien wordt een hoog % niet-tabulaire korrels gevormd.

25

Voorbeeld 3 (controle)

Bereiding van zilverbromidekristallen met conventionele gehydrolyseerde gelatines.

Kernvorming; De kernvorming wordt uitgevoerd onder toepassing van 30 dezelfde omstandigheden (eveneens pH=5,5) als in voorbeeld 2 met uitzondering van het feit dat de gelatine in het reactiemengsel wordt vervangen door een conventionele gehydrolyseerde gelatinemonster (eveneens gedeioniseerd en door PB Gelatins, Tessenderlo in België geleverd).

35 Rijping: Rijping wordt uitgevoerd volgens hetzelfde voorschrift als in voorbeeld 2 is toegepast.

Resultaat; Een gemiddeld % tabulaire korrels van $0-70% wordt in tabel II getoond.

1 00 7908 54

Voorbeeld 4 (controle)

Bereiding van zilverbromidekristallen met geoxydeerde gelatines.

Kernvorming: De kernvorming wordt uitgevoerd onder toepassing van dezelfde omstandigheden (eveneens pH=5,5) als in voorbeeld 1 met 5 uitzondering van het feit dat de gelatine in het reactiemengsel wordt vervangen door een conventionele geoxydeerde gelatinemonster (geleverd door Nitta Gelatines in Japan).

Rijping: De rijping wordt uitgevoerd volgens hetzelfde voorschrift als in voorbeeld 2 is toegepast.

10 Resultaat: Een hoog % tabulaire korrels van 90% met een gemiddelde aspect ratio van 4:1 wordt in tabel II getoond voor de geoxydeerde gelatines bij pH 5*5· Het betere resultaat dan met de gehydrolyseerde en reguliere gelatines kan worden uitgelegd wegens het lagere methionine-gehalte van deze gelatine (11 pmol/gram gelatine vs. 50-60 15 pmol/gram voor conventionele gelatines).

Voorbeeld 5 (de onderhavige uitvinding)

Bereiding van zilverbromidekristallen met de uitgevonden natieve recombinant-gelatines.

20 Kernvorming: De kernvorming wordt uitgevoerd onder toepassing van dezelfde omstandigheden (eveneens pH=5.5) als in voorbeeld 2 met uitzondering van het feit dat de gelatine in het reactiemengsel wordt vervangen door een monster van het uitgevonden natieve C0L3A1 gelatine.

25 Rijping; De rijpingsstap wordt uitgevoerd volgens hetzelfde voorschrift als is toegepast in voorbeeld 2.

Resultaat: Een hoog % tabulaire korrels van 90-100% met een gemiddelde aspect-ratio van 4:1 wordt getoond in tabel II.

30 Voorbeeld 6 (controle)

Bereiding van zilverbromidekristallen met conventionele reguliere regelatines bij een ander pH.

Kernvorming: de kernvorming wordt uitgevoerd onder toepassing van de toestand met pH=7 terwijl andere omstandigheden hetzelfde blijven als 35 in voorbeeld 2.

Rijping: De rijping wordt uitgevoerd volgens hetzelfde voorschrift als is toegepast in voorbeeld 2 met uitzondering van het feit dat de pH hetzelfde blijft als gedurende de kernvorming dat wil zeggen pH=7.

i 1007908 i 55

Resultaat: Een zeer laag percentage tabulaire korrels van <<5% was het resultaat zoals in tabel I is getoond voor conventionele commerciële gelatine.

5 Voorbeeld 7 (controle)

Bereiding van zilverbromidekristallen met conventionele gehydrolyseerde gelatines bij een andere pH.

Kernvorming: De kernvorming wordt uitgevoerd onder toepassing van een andere toestand pH=7 terwijl de andere omstandigheden hetzelfde bleven 10 als in voorbeeld 2.

Rijping; De rijping wordt uitgevoerd volgens hetzelfde voorschrift als is toegepast in voorbeeld 2 met uitzondering van het feit dat de pH hetzelfde bleef op pH=7 als gedurende de kernvorming.

Resultaat: Een zeer laag % tabulaire korrels rond 5% was het

15 resultaat zoals getoond wordt in tabel II

Voorbeeld 8 (controle)

Bereiding van zilverbromidekristallen met geoxideerde gelatine bij een ander pH.

20 Kernvorming; De kernvorming wordt uitgevoerd onder toepassing van een ander pH-toestand. Dat wil zeggen pH=7 terwijl de andere omstandigheden hetzelfde bleven als in voorbeeld 3·

Rijping; De rijping wordt uitgevoerd volgens hetzelfde voorschrift als is toegepast in voorbeeld 3 met uitzondering van het feit dat de 25 pH hetzelfde bleef als tijdens de kernvorming dat wil zeggen op pH=7.

Resultaat: Een zeer laag % tabulaire korrels rond 5X met aspect-ratio 4:1 zoals getoond is in tabel II.

Voorbeeld 9 (deze uitvinding) 30 Bereiding van zilverbromidekristallen met uitgevonden natieve recombinante gelatines bij een ander pH.

Kernvorming; De kernvorming wordt uitgevoerd onder toepassing van een andere pH-toestand dat wil zeggen pH=7 terwijl de andere omstandigheden hetzelfde bleven als in voorbeeld 4.

35 Rijping; De rijping wordt uitgevoerd volgens hetzelfde voorschrift als in voorbeeld 4 is toegepast met uitzondering van het feit dat de pH hetzelfde blijft als gedurende de kernvorming dat wil zeggen pH=7·

Resultaat: Een zeer hoog percentage tabulaire korrels > 90% wordt 1 00 7908 56 verrassenderwijs gevonden bij deze toestand hetgeen duidelijk hoger i ligt dan voor de stand van de techniek gelatines zoals getoond wordt in tabel II.

5 Voorbeeld 10

Verhouding tussen bindingssterkte en tabulaire korrelmorfologie.

45 ®g gelatine wordt nauwkeurig afgewogen en 15 g 0,1M fosfaatbuffer met pH=7t00 die 0,1M kaliumnitraat bevat wordt toegevoegd. De oplossing wordt in een waterbad geplaatst gedurende 15 minuten bij 10 45eC. De oplossing wordt tot kamertemperatuur afgekoeld (23*C).

10 ml van deze fosfaatbufferoplossing met pH 7.0 (die gelatine bevat) - wordt bij 23”C gemengd met 100 μΐ 0,5 mM zilvernitreat. Het potentiaal van deze oplossing wordt betiteld als "vAg" en wordt gemeten onder toepassing van een Ag-electrode (Orion model 97~8l) tegen een Ag/AgCl 15 dubbele overgangsreferentie-electrode (Orion model 90-02). Dezelfde bufferoplossing zonder gelatine wordt eveneens met de zilvernitraatoplossing gemengd en via dezelfde methode wordt het potentiaal "vAg" gemeten. Het verschil tussen de twee gemeten potentialen wordt berekend en uitgedrukt als "delta VAg" hetgeen de 20 bindingsafiniteit is van gelatine voor het zilverion.

Op basis van de waarneming met de electronenmicroscoop dat de Ag-kristallen van het geoxideerde gelatine een lager aspectratio (4:1) hebben dan de andere gelatinegroep met een hogere aspectratio (5:1) werd de bindingssterkte gescheiden in twee verschillende groepen 25 namelijk de groepen betiteld lage en hoge bindingssterkte.

De geoxideerde gelatinereferentie heeft verreweg het laagste methioninegehalte van 11 pmol/gram gelatine hetgeen resulteert in minder binding en derhalve ook de vorming van meer kernen die twinning hebben ondergaan. Aangezien geen additionele zilverionen in de 30 rijpingsstap worden toegevoerd zal het hogere aantal tabulaire kernen die twinning hebben ondergaan dezelfde hoeveelheid zilverionen verbruiken en dientengevolge zullen meer tabulaire korrels worden verkregen die minder kunnen groeien en derhalve een lager aspectratio hebben.

35 Tabel II hieronder toont de geteste peptizeermiddelen, de % tabulaire korrels en gelatine bindingsaffiniteiten "delta VAg" voor pH 5.5 en pH 7: 1 00 7908 57

Type Bindingssterkte % tabulair bij % tabulair bij 8

gelatine "delta VAg" kernvorming/ kernvorming/ I

__(mV)__rijping pH=5,5 rijping pH=7,0 aspect ratio ---_>iii----

geoxideerd__55.**___70-80___<_5__I

5 gehydrolyseerd 7**. **___50-70___> 5__ regulier__78.5___0~30___<< 5__ nat.rec C0L3__69.5___90-100___> 90__ 1 00 7908

Claims

1. Een dunne tabulaire zilverhalide-emulsie waarbij de tabulaire , korrels meer dan 75# van de totale korrel geprojecteerde oppervlak 5 voor hun rekening nemen welke emulsie zilverhalidekorrels omvat die kernvorming hebben ondergaan bij aanwezigheid van peptiseermiddel en daarna zijn gegroeid bij aanwezigheid van peptiseermiddel, waarbij het peptiseermiddel in hoofdzaak zuiver collageenachtig materiaal is dat is bereid door genetische manipulatie vein voor natief collageen 10 coderend nucleïnezuur, welk peptiseermiddel een aminozuursequentie heeft die meer dan verschillende aminozuren omvat.

2. Emulsie volgens conclusie 1, welk peptiseermiddel een aminozuursequentie heeft die meer dan 3· zelfs meer dan 10 aminozuren 15 omvat die verschillend zijn.

3· Emulsie volgens conclusie 1 of2, waarbij de aminozuursequentie van het peptiseermiddel meer dan 40# homologie vertoont met natieve collageen bij voorkeur meer dan 50#. 20

4. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, welk peptiseermiddel een aminozuursequentie heeft die equivalent is met die die in de natuur voor collageen voorkomt, waarbij equivalent een aminozuuridentiteit van ten minste 80# bij voorkeur ten minste 90# met 25 meer voorkeur een aminozuursequentie die hetzelfde is als in de natuur voorkomt impliceert.

5· Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het peptiseermiddel een aminozuursequentie heeft die in hoofdzaak 30 hetzelfde is als voorkomt in de natuur, waarbij in hoofdzaak een mutatie van minder dan 5 aminozuren bij voorkeur minder dan 3 impliceert.

6. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het 35 peptiseermiddel een aminozuursequentie heeft in hoofdzaak hetzelfde als in de natuur voorkomt voor collageentype I, II of III.

7. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het 1007908 peptiseermiddel een aminozuursequentie heeft die equivalent is met de aminozuursequentie die in de natuur voorkomt voor collageentype I, II of III.

8. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het peptiseermiddel een aminozuursequentie heeft hetzelfde als voorkomt in de natuur voor collageentype I, II of III.

9· Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het 10 collageen type I de aminozuursequentie van figuur 8, 10 of 12 of Genbank toegangsnummer U08020 omvat of heeft.

10. Emulsie volgens één van de conclusies 1-7. waarbij het collageentype III de aminozuursequentie van figuur 3 of EMBL 15 toegangsnummer X70369 omvat of heeft.

11. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, welk peptiseermiddel een aminozuursequentie heeft in hoofdzaak hetzelfde als voorkomt in de natuur voor collageentype I, welk peptiseermiddel 20 vrij is van de sequentie MGPR.

12. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het peptiseermiddel een fragment is met gedefinieerde lengte en samenstelling dat is verkregen van een sequentie die voor een natieve 25 collageen codeert, welk fragment het GXY motief dat kenmerkend is voor collageen omvat, welke lengte zodanig is dat het fragment een gewicht heeft van ten minste 2,5 kDa betrokken op aminozuur.

13. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het 30 peptiseermiddel vrij is van hydroxyproline.

14. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het peptiseermiddel niet gedeamineerd is. 35 15· Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het peptiseermiddel een iso-elektrisch punt van 7_10 heeft. 1 1 00 7908 Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het peptiseermiddel een gewicht van 2,5-100 kDa heeft betrokken op aminozuur.

17. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, welk 5 peptiseermiddel vrij is van procollageen en telopeptiden.

18. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, welk peptiseermiddel vrij is van helixstructuur.

19. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, welk peptiseermiddel vrij is van cysteïne.

20. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, welk peptiseermiddel (geoxideerde) reducerende aminozuren omvat in een 15 zodanige mate dat reducerende aminozuren aanwezig zijn in een hoeveelheid die equivalent is met een reducerende sterkte tussen 0,1-200 micromol methionine per gram van het peptiseermiddel.

21. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, welk 20 peptiseermiddel (geoxideerde) reducerende aminozuren omvat in een zodanige mate dat reducerende aminozuren aanwezig zijn in een hoeveelheid die equivalent is met een reducerende sterkte van tussen 0,1-80 micromol methionine per gram van het peptiseermiddel.

22. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, welk peptiseermiddel (geoxideerde) reducerende aminozuren omvat in zodanige een mate dat reducerende aminozuren aanwezig zijn in een hoeveelheid die equivalent is met een reducerende sterkte tussen 30-80 micromol methionine per gram van het peptiseermiddel. 30

23. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, welk peptiseermiddel een bindingssterkte voor zilver heeft hoger dan 50 mV. 2*1. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, welk 35 peptiseermiddel een bindingssterkte heeft voor zilver beneden 100 mV. 1 1007908 Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, welk peptiseermiddel een bindingssterkte voor zilver heeft tussen 50-100 mV.

26. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij de zilverhalidekorrels een gemiddelde aspectratio vertonen groter dan 3· 5

27. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het peptiseermiddel stabiel is vis a vis zilverhalide tabulaire korrelvorming bij een pH tussen ^-8.

28. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, die tabulaire korrels omvat in een hoeveelheid groter dan 90% bij voorkeur groter dan 95%.

29. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het 15 peptiseermiddel van homodisperse aard is.

30. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het peptiseermiddel aanwezig is in in hoofdzaak zuivere vorm dat wil zeggen in hoofdzaak vrij van nucleïnezuur, polysacchariden en ander 20 eiwit.

31. Emulsie volgens één van de voorgaande conclusies, welke emulsie geschikt is voor fotografische toepassing en verdere verbindingen omvat die aanvaardbaar zijn voor een dergelijke toepassing 25 bijvoorbeeld een tweede duidelijk gedefinieerde hoeveelheid peptiseermiddel.

32. Werkwijze voor het bereiden van een dunne tabulaire zilverhalide-emulsie waarbij de tabulaire korrels meer dan 75% van de totale korrel 30 geprojecteerde oppervlak voor hun rekening nemen welke werkwijze de kernvorming van zilverhalidekorrels bij aanwezigheid van peptiseermiddel en het daarna groeien van de zilverhalidekorrels bij aanwezigheid van peptiseermiddel omvat waarbij beide peptiseermiddelen aanwezig zijn in een gedefinieerde hoeveelheid en beide 35 peptiseermiddelen collageenachtig materiaal zijn dat is bereid door genetische manipulatie van nucleïnezuur dat codeert voor natief collageen welke peptiseermiddelen een aminozuursequentie hebben die meer dan 4 verschillende aminozuren omvat. 1 00 7908

33· Werkwijze voor het bereiden van een emulsie volgens conclusie 32 , die toevoeging van het peptiseermiddel in de kernvormingstap en/of gedurende de korrelgroeistap omvatten welk peptiseermiddel wordt , gekozen uit één van de uitvoeringsvormen zoals beschreven in één van 5 de conclusies 1-31. 51 of 52.

34. Werkwijze voor het bereiden vein een emulsie volgens conclusie 32 of 33. welke toevoeging vein het peptiseermiddel omvat in zowel de kernvormingsstap als gedurende de korrelgroeistap. 10 ^ 35· Werkwijze voor het bereiden van een emulsie volgens één van de conclusies 32-3*1 die toevoeging van hetzelfde peptiseermiddel in de kernvormingsstap als gedurende de korrelgroeistap omvat. " 15 36. Werkwijze van fotografische elementproductie die toepassing van een emulsie volgens één van de conclusies 1-31 of zoals verkrijgbaar uit een werkwijze volgens één van de conclusies 32-35 voor het verkrijgen van een zilverhalide-emulsie omvat voor toepassing in een op zich bekende wijze voor fotografische elementproductie met ten 20 minste één zilverhalide-emulsielaag, waarbij de zilverhalidekristallen van de laag een aspectratio van 5 of meer hebben.

37· Werkwijze volgens conclusie 36 welk fotografisch element een materiaal is dat gevoelig is voor licht-, laser- of röntgenstralen, 25 welk element bijvoorbeeld wordt gekozen uit zwart-wit positieve film, zwart-wit negatieve film, kleur-negatieve film, kleur-positieve film, digitale film, zwart-wit-positief papier, zwart-wit-negatief papier, kleur-negatief papier, kleur-positief papier, digitaalpapier. 30 3Ö. Fotografisch element verkregen volgens de werkwijze volgens conclusie 36 of 37·

39· Werkwijze ter bereiding van collageenachtige recombinant-polypeptide welke werkwijze expressie van een voor collageenachtig 35 polypeptide-coderende necleïnezuur sequentie door een micro-organisme omvat tot een mate die 0,95 gram/liter overschrijdt, welk recombinant ! j collageen vrij is van helixstructuur waarbij bij voorkeur de expressie plaatsvindt in een micro-organisme anders dan E. coli of Saccharomyces 1007908 cerevisiae.

40. Werkwijze volgens conclusie 39 waarbij de expressie 3 gram/liter overschrijdt. 5

41. Werkwijze volgens conclusie 39 of 40 waarbij het collageenachtige recombinant poly-peptide wordt gekozen uit één van de uitvoeringsvormen die is beschreven in één van de conclusies 1-31» 51 of 52. 10

42. Werkwijze volgens één van de conclusies 39_iH waarbij het micro-organisme in staat is expressieproduct uit te scheiden. *13· Werkwijze volgens één van de conclusies 39-42 waarbij het micro-15 organisme een gistcel is.

44. Werkwijze volgens één van de conclusies 39-43 waarbij het micro- organisme vrij is van actief postverwerkingsmechanisme voor het verwerken van collageenachtige sequenties tot fibrillen. 20

45. Werkwijze volgens één van de conclusies 39-kk waarbij het micro- organisme vrij is van actief postverwerkingsmechanisme voor het verwerken van collageenachtige sequenties tot drievoudige helices.

46. Werkwijze volgens één van de conclusies 39_i*5 waarbij de tot expressie te brengen nucleïnezuursequentie vrij is van voor procollageen en telopeptide coderende sequenties.

47. Werkwijze volgens één van de conclusies 39*^6 waarbij het micro-30 organisme Pichia pastorie is.

48. Werkwijze volgbns één van de conclusies 39_i*7 waarbij het recombinant collageen een aminozuursequentie heeft vrij van protease-splitsingsplaatsen voor een protease die actief is in de 35 expressiegastheercel.

49. Werkwijze volgens één van de conclusies 39-^8 waarbij het expressieproduct wordt eiwit, polysaccharide geïsoleerd en gezuiverd 1 00 79 08 tot het in hoofdzaak vrij is van ander eiwitpolysaccharide en nucleïnezuur.

50. Werkwijze volgens één van de conclusies Dl-Dll waarbij het 5 expressieproduct wordt geïsoleerd en gezuiverd tot tenminste de volgende mate: gehalte aan nucleïnezuur minder dan 100 ppm, gehalte polysaccharide minder dan 5%, gehalte aan RNA geschikt minder dan 10 ppm, gehalte aan DNA minder dan 1 ppm en polysaccharidegehalte minder dan 1%. 10

51. In hoofdzaak zuiver collageenachtig materiaal dat is bereid door genetische manipulatie van nucleïnezuursequentie coderend voor natief collageen welk peptiseermiddel een aminozuursequentie heeft die meer dan k0% homologie met natief collageen vertoont en meer dan 4 15 verschillende aminozuurtypes omvat.

2. Recombinant-collageenverbinding gedefinieerd in één van de conclusies 1-31· .1 1007908