CN105143243B - 三螺旋蛋白的纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于纯化从细菌、酵母或植物宿主细胞重组产生的三螺旋或胶原蛋白状蛋白质的方法。

Description

三螺旋蛋白的纯化
其他申请的交叉参考
本文所引用的所有公开案、专利、专利申请和其他参考均以全文引用的方式并入，如同表明每个个别公开案、专利、专利申请或其他参考具体且单独地以引用的方式并入一般。
本申请要求2013年3月21日申请、标题为“Purification of triple helicalproteins”的澳大利亚专利申请号2013900990的优先权。此申请的全部内容以引用的方式并入本文。
序列表
本申请与电子形式的序列表一起提交。序列表的全部内容以引用的方式并入本文。
公开领域
本发明涉及一种用于纯化从细菌、酵母或植物宿主细胞重组产生的三螺旋或胶原蛋白状蛋白质的方法。
背景
胶原蛋白是动物的细胞外基质中的主要结构蛋白，且定义为需要(Gly-Xaa-Yaa)n重复序列的特征性三螺旋结构。在Xaa和Yaa位置中发现的氨基酸常为脯氨酸，其中Yaa位置中的Pro经翻译后修饰为羟脯氨酸(Hyp)，所述羟脯氨酸提升三螺旋稳定性。在人类中，存在至少28种胶原蛋白类型的家族，各自具有类型特异性生物学功能和结构功能。三螺旋基序也存在于其他蛋白质中，诸如巨噬细胞清道夫受体、胶原凝集素和C1q。
最丰富的胶原蛋白为间质、原纤维形成胶原蛋白，尤其是I型胶原蛋白。这些胶原蛋白经由形成通过特异性交联稳定的纤维束网状物来在动物中形成主要组织结构，以使组织具有稳定性和强度。与‘大’原纤维形成胶原蛋白(I型、II型和III型)相反，‘小’胶原蛋白分布一般较不广泛，且通常发现于其中小胶原蛋白可为重要和关键成分的特定组织位置中；例如肥大软骨中的X型胶原蛋白或基底膜中的IV型胶原蛋白。
已显示胶原蛋白在各种临床应用中的多种医学产品中安全且有效(Ramshaw等人，J Materials Science,Materials in Science,(2009)，20(1)第3-8页)。对医学应用而言，胶原蛋白一般以两种明显相异的形式使用。在一种形式中，在化学稳定化之后使用完整组织，诸如在主动脉瓣膜替换中使用戊二醛固定的猪心瓣膜。另一种形式为经由制备经纯化的可溶性胶原蛋白(诸如适用于伤口涂剂的无水稳定化薄片或挤压纤维、用于半月板修复的粘附屏障或装置)，所述可溶性胶原蛋白复原为各种产品且加工得到产品的所需形状或形式。必要时，胶原蛋白装置可通过化学固定(例如戊二醛)或通过物理方法(例如干热交联)而稳定化。经纯化的可溶性胶原蛋白也广泛用作用于软组织加强以及还用于治疗尿失禁的胶原蛋白浆。复原产品的特征在于较高生物化学纯度，所述较高生物化学纯度与组织中的生物学功能中至关重要的低免疫原性、受控转换(常经较短时间段)、受控孔隙度和细胞-基质相互作用的滞留相关。
为纯化来自动物胶原组织的胶原蛋白，典型方法包括经由使用酶消化步骤以移除交联区而保留三螺旋完整，来使组织初始消化和溶解。溶解的胶原蛋白可随后经纯化以移除潜在免疫原性污染物。例如，US6548077描述来自组织的胶原蛋白的制备，其涉及使胶原蛋白与第一蛋白水解酶接触，接着与还原剂和第二蛋白水解酶接触。
Addad等人(Mar.Drugs(2011),9(6),967-983)描述使用组织提取物的酸性胃蛋白酶溶解作用来纯化来自水母的胶原蛋白。然而，为获得稳定和适用的最终产物，需要交联步骤。用酸且具体地用乙酸处理导致组织膨胀，并且在胃蛋白酶消化之后得到可溶性胶原蛋白。所得可溶性胶原蛋白产物将是可能需要复原为不溶形式以用于许多医学应用的弱的非纤维材料。
已公开的替代性方法包括将富含胶原蛋白的天然动物组织研磨成极精细粒子，所述粒子可在加工成适用的医学材料之前或之后经洗涤为无杂质。
大部分商业量的胶原蛋白来源于动物(诸如牛来源)，但担心可具有可传染的疾病，尤其牛海绵状脑病(‘疯牛病’)，已在产生重组形式的胶原蛋白上花费研究努力。此外，来源于动物的胶原蛋白受到限制，因为所提取的胶原蛋白无法经设计和修饰以增强或改变特定生物学特性。胶原蛋白在沉积于细胞外基质中之前和之后经受大量翻译后修饰。具体地，原纤胶原蛋白在细胞外空间中经受持续分子寿命的分子内和分子间交联。因此，存在于胶原蛋白中的交联量除了其他以外还受到收集胶原蛋白的组织的寿命和生理学影响。这些差异影响来自组织的胶原蛋白的可提取性和这些胶原蛋白的生物物理学特征。因此，从组织分离的胶原蛋白表现出显著批次间变化，且作为块状材料在分析上常常难以处理。
因此，关注已从动物胶原蛋白的分离转移至重组胶原蛋白的产生。
此外，需要使用重组DNA技术，因为所述技术可能允许产生合成胶原蛋白和胶原蛋白片段，所述胶原蛋白和胶原蛋白片段可包括例如外源性生物活性结构域(即提供额外蛋白质功能)和其他适用的特征(例如改善的生物相容性和稳定性)。
已探索诸如酵母的宿主系统来重组产生人类编码的胶原蛋白。然而，酵母系统是复杂的，因其需要引入脯氨酸-4羟化酶的基因来形成哺乳动物胶原蛋白的稳定性所需要的Hyp残基。通常，重组哺乳动物编码的胶原蛋白表达在毕赤酵母(Pichia)中，需要添加氧气来得到最大羟基化，以及添加甲醇用于诱导，这产生对增强的潜在防火工程的需要。
已寻找到不需要翻译后修饰的其他胶原蛋白状物质来作为羟基化的人类胶原蛋白的替代。最近，对细菌基因组的研究已表明，存在许多每三个残基含有一个Gly且脯氨酸含量较高的假定的细菌蛋白，表明胶原蛋白状三螺旋结构可存在于某些来源于细菌的蛋白质中(Peng Y等人(2010)Biomaterials 31(10):2755-2761；Yoshizumi A等人(2009)Protein Sci 18:1241-1251)。此外，已显示若干这些蛋白质形成即使不存在Hyp也在约37℃下稳定的三螺旋。已在多种情况下确认三螺旋组合物。实例包括某些细菌细胞上的细胞表面蛋白和炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)孢子上的长丝。已假定所述胶原蛋白状构建体在存在于病原性大肠杆菌(E coli)菌株中的原噬菌体中的表达似乎为造成毒性相关的基因经由感染传播的原因(Bella J等人(2012)7(6)PLoS 1e37872)。
然而，使用重组技术仍具有其缺点和障碍。使用宿主细胞来产生外来蛋白增加挑战，诸如移除存在于所需蛋白质的最终制剂中的污染性宿主细胞蛋白可导致有害毒性或免疫反应。如果重组蛋白是在细胞内制得，那么纯化方法的第一步骤涉及裂解或破坏细胞，这将细胞的内容物释放至匀浆物中且另外产生亚细胞片段。如果重组蛋白是从细胞分泌的，那么细胞的自然死亡和将细胞内宿主细胞蛋白释放至上清液中也可产生毒性和免疫原性污染。为移除这些污染物，通常需要许多不同的纯化步骤。通常采用亲和层析法来达到高纯度水平。此后续加工一般是劳动和资源密集型的，且对大规模商业生产而言成本过高。
重组胶原蛋白状蛋白质的大规模生产仍处于其发展初期。存在大规模生产必须处理的某些挑战，包括工艺的可缩放性、生产成本、提取方法的复杂性、对GMP需求的顺应性、对调控需求的顺应性、污染性宿主细胞蛋白的移除、纯化方法的复杂性、宿主细胞的适合性。例如，人类细胞系仅促成中度产率，对有成本效益的更大规模的生产而言是不适合的。
因此，需要用于纯化重组产生的胶原蛋白的方法，其中所述方法具有成本效益且促成以高产率和用于各种应用的足够纯度来生产胶原蛋白。
公开概述
本发明人已开发出一种用于纯化由非动物宿主细胞(诸如细菌、酵母或植物细胞)表达的重组三螺旋蛋白的方法。所述方法提供在整个纯化方法中保持可溶的可溶性三螺旋蛋白的纯化。此外，所述方法不导致三螺旋蛋白的变性、降解或水解。
本公开的方法提供重组三螺旋蛋白(来自任何来源)的纯化，所述纯化导致所产生的溶解的三螺旋蛋白(例如胶原蛋白)是稳定且不含污染性蛋白(其可损害三螺旋蛋白的稳定性)的，并且因工艺步骤最少化而可以高产率来进行生产。有利的是，所述方法提供一种用于纯化三螺旋蛋白(例如胶原蛋白)的有成本效益的方法，所述三螺旋蛋白在酸性条件下稳定且以用于多种不同应用的足够纯度来进行生产。
本公开因此提供一种用于纯化在非哺乳动物宿主细胞培养提取物或均质物内含有的重组表达三螺旋蛋白的方法，所述方法包括：
(i)在酸性条件下和在所述三螺旋蛋白保持热稳定的温度下从所述三螺旋蛋白质沉淀宿主细胞物质；接着；
(ii)通过添加蛋白酶来消化存在于所述经沉淀的宿主细胞培养提取物或匀浆物中的宿主细胞物质，其中所述三螺旋蛋白对所述蛋白酶具有抗性；以及
(iii)收集所述经纯化的三螺旋蛋白；并且
任选地在所述沉淀步骤与所述消化步骤之间还包括额外分离步骤，所述分离步骤以物理方式从不溶性宿主细胞物质分离所述三螺旋蛋白；并且
其中所述三螺旋蛋白在至少步骤(i)和(ii)中均保持可溶。
在一个实例中，所述三螺旋蛋白在步骤(i)至(iii)中均保持可溶。
在一个实例中，宿主细胞物质的所述消化步骤使用酸性蛋白酶来进行。
在一个实例中，所述方法还包括收集宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为细菌、酵母或植物宿主细胞。用于培养本发明的宿主细胞的方法对本领域技术人员而言将为熟悉的，且描述于本文中其他地方。
在一个实例中，所述酸性条件是指培养提取物或匀浆物的pH值在小于7的pH值下，优选地在小于约6的pH值下。
根据本发明的方法，三螺旋蛋白有利地保持热稳定。本领域技术人员将了解可向培养提取物或匀浆物中添加用于辅助维持三螺旋蛋白的热稳定性的某些试剂或添加剂。例如，可添加抗冷冻剂(诸如NaCl)或提供稳定性的其他添加剂，诸如聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙二醇(PEG)或其衍生物、甲基纤维素、琼脂糖、糊精、羟乙基淀粉、N-氧化三甲胺(TMAO)等。在一个实例中，如果在小于三螺旋蛋白的熔化温度的温度下进行所述沉淀步骤，那么所述三螺旋蛋白的热稳定性得以维持。在另一个实例中，在酸性沉淀条件下在比三螺旋蛋白的Tm低至少10℃的温度下维持所述三螺旋蛋白质的热稳定性。测定三螺旋蛋白的热稳定性的方法描述于例如US 8,280,710中。
本公开的方法包括任选的中间分离步骤，所述分离步骤用于从所沉淀的宿主细胞物质诸如宿主细胞蛋白和/或宿主细胞DNA分离三螺旋蛋白。可在此任选的步骤中采用任何分离工艺来移除这些物质中的一种或两种。所述工艺优选为粗分离或浓缩技术，诸如离心、过滤、交叉流过滤或沉降。
在另一个实施方案中，在根据本发明的方法的消化步骤之前或与其同时可必需另一个pH值调节。根据用于消化步骤的蛋白酶，可能需要向上或向下调节pH值，其限制条件为三螺旋蛋白保持在溶液中。例如，如果使用胃蛋白酶作为蛋白酶，则可能必需在添加胃蛋白酶之前降低培养提取物或匀浆物的pH值。所述调节完全处于本领域技术人员的技能内。
本领域技术人员应了解，将用包含编码三螺旋蛋白的序列的重组构建体转化或转染的宿主细胞在适合于使得所述三螺旋蛋白表达的条件下培养。在一些实例中，将以细胞内方式产生三螺旋蛋白，在此情况下，必需从细胞提取三螺旋蛋白。提取方法将需要使宿主细胞破裂。提取可通过本领域技术人员已知的机械或化学(例如酶)手段来达到。机械提取工艺的实例可包括以下中的一种或多种：声波处理、微流体化、在弗氏压碎器(FrenchPress)或相似设备中裂解、渗透猝震、和通过与玻璃、陶瓷或钢珠一起剧烈搅拌/研磨来破坏。作为替代方案，或与机械提取结合，也可采用酶提取。适合于酶提取的试剂的实例包括溶菌酶、溶葡球菌酶、消解酶、纤维素、变溶菌素、聚糖酶、蛋白酶、甘露糖等。
在一些实例中，三螺旋蛋白是从宿主细胞分泌的(即，如在一些酵母系统中的情况下，以细胞外方式产生)。在那些情况下，不必需提取，然而，细胞培养提取物可经浓缩，由此通过本领域中已知的方法产生匀浆物或滤液，以获得包含所回收的可溶性三螺旋蛋白的溶液。在另一实例中，细胞培养基与三螺旋蛋白一起通过交叉流过滤来浓缩。
相应地，本公开的方法可包括一种产生含有三螺旋蛋白的宿主细胞培养提取物或匀浆物的额外步骤。
根据本公开的方法，通过酸性沉淀步骤来从含有重组三螺旋蛋白的细胞培养提取物或均质物中移除细胞污染物和碎片。本发明人已发现，通过在三螺旋蛋白保持热稳定的温度下将溶液的pH值调节为酸性条件，在许多污染性(即不溶性)物质沉淀的同时，重组三螺旋蛋白质不变性且保持在溶液中。因此，本发明具有在此第一纯化步骤中三螺旋蛋白的pH值稳定性的优势。
优选地，温度在整个方法中为恒定的。在一个实例中，温度维持在室温下(即在约18℃与24℃之间)。
在一个实例中，在酸性沉淀步骤期间，温度比重组三螺旋蛋白的熔化温度(Tm)低至少10℃或更多。
含有重组三螺旋蛋白的溶液的酸化可通过任何适合的酸(包括强酸或弱酸)来达到。可使用单一酸，或者可使用不同酸的组合。根据所述方法合适的酸的实例包括盐酸、硫酸、乙酸、甲酸或乳酸，但本领域技术人员熟悉的其他酸也将是合适的。相应地，根据重组蛋白在酸化溶液的pH值下的Tm，酸化发生的温度可在4℃与30℃之间变化。
在下表中提供各种细菌物种的三螺旋胶原蛋白状(CL)结构域的熔化温度的实例。
表1胶原蛋白状(CL)结构域的熔化温度
Figure BDA0000807470280000081
Figure BDA0000807470280000091
在酸性沉淀步骤期间，含有重组三螺旋蛋白的细胞培养提取物或匀浆物的经调节的pH值将取决于宿主细胞和三螺旋蛋白序列。在一个实例中，包含三螺旋蛋白的细胞培养提取物或匀浆物的pH值调节至小于7。在另一个实例中，对细菌宿主细胞，介于2与4之间的pH值优选，而对酵母宿主细胞，介于4与6之间的pH值较佳。在对植物宿主细胞的另一个实例中，介于2与4.5之间的pH值优选。
在某些实例中，对重组三螺旋蛋白的植物细胞表达而言，酸性沉淀步骤可在两种不同的pH值下进行。例如，在提取物中最丰富的植物蛋白为核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)的情况下，其最优选在约4.5的pH值下沉淀。然而，此pH值通常不足以移除所有污染性植物蛋白，在此情况下，可必需接着进行pH值2.5下的另一个沉淀。
因此，酸性沉淀步骤可需要调节pH值以使存在于提取物中的连续污染性蛋白质沉淀。优选地，所沉淀的蛋白质将根据上述方法在后续pH值调节之间移除。
根据本公开的方法，在酸性沉淀步骤之后为消化步骤。本发明人已发现，消化步骤移除在提取工艺(其中产生培养提取物或匀浆物)中生成的宿主细胞污染物或在沉淀步骤回收三螺旋蛋白期间未移除的宿主细胞污染物。通常，消化步骤将导致移除易于酶消化的污染性宿主细胞蛋白，例如膜蛋白。在另一个实例中，使用蛋白酶，优选酸性蛋白酶来进行消化步骤。适用于根据本公开的方法的酸性蛋白酶的实例包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜蛋白酶状酶(诸如菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶或奇异果蛋白酶)、或佐氏曲霉酸性蛋白酶。
非酸性蛋白酶也可用于本发明的消化步骤，诸如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。根据所采用的蛋白酶，可必需将pH值调节至酸性较弱条件(例如对诸如木瓜蛋白酶的蛋白酶)。本领域技术人员将熟悉所述策略。
在一些实例中，蛋白酶消化可通过将培养提取物或匀浆物的pH值调节至中性pH值来终止。
应了解所述方法产生对蛋白水解稳定的三螺旋蛋白的纯化。三螺旋蛋白也可包括对经选择以用于移除宿主蛋白的酶为蛋白水解稳定的额外非螺旋蛋白序列，和/或天然地或通过设计以对所述酶为蛋白水解稳定的非三螺旋序列插入。因此，本公开的方法也具有相比于对蛋白水解不稳定的蛋白质，选择性纯化对蛋白水解稳定的蛋白质的优势，且因此选择性纯化三螺旋蛋白超过其他非三螺旋蛋白。
蛋白酶将许多污染性蛋白质消化为因分子量比完整可溶性重组三螺旋蛋白小得多而均可通过渗滤或沉淀来移除的肽。随后可收集所得经纯化的重组三螺旋蛋白。这些工艺均具有浓缩重组三螺旋蛋白的附加优势。重组三螺旋蛋白的沉淀可通过添加硫酸铵、通过调节pH值和/或调节温度、或通过使用聚合物(例如聚乙二醇)来达到。
在另一个实例中，也可通过本领域中已知的方法来从所收集的三螺旋蛋白中移除污染性宿主细胞核酸。
根据三螺旋蛋白的最重用途，可采用所收集的三螺旋蛋白的精制步骤以在已移除宿主污染物之后立即进一步浓缩和/或纯化所述重组三螺旋蛋白。层析为常用以精制蛋白溶液的一种此类技术。可采用的层析工艺的实例包括离子交换层析、高效液相层析、电泳、凝胶过滤层析、亲和层析和疏水性相互作用层析。如果已通过中性聚合物沉淀重组三螺旋蛋白，则沉淀的盐分将较低，且因此若必需进一步精制纯化，则可直接用于离子交换层析。
应了解所述方法促成经纯化的三螺旋蛋白的生成。在一个实例中，经纯化的三螺旋蛋白为稳定化的。在另一个实例中，三螺旋蛋白通过戊二醛而稳定化；然而，可使用本领域中已知的其他稳定剂。
用于表达重组三螺旋蛋白的合适的宿主细胞包括细菌、酵母或植物细胞。在这些细胞中重组产生三螺旋蛋白的方法对本领域技术人员而言将为熟悉的。
细菌宿主细胞可选自(但不限于)埃希菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)和副球菌属(Paracoccus)。在一个实例中，细菌宿主为大肠杆菌(Escherchia coli)。合适的大肠杆菌(E.coli)宿主包括大肠杆菌BL21菌株(LifeSciences)\大肠杆菌W3110(ATCC27,325)\大肠杆菌294(ATCC31,446)和大肠杆菌X1776(ATCC31,537)。
酵母宿主细胞可选自毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyceslactis)、许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、瑞氏木霉(Trichoderma reesei)和耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
植物宿主细胞可选自烟草、玉米、小麦、大麦，以及诸如微藻的较低等植物，诸如普通小球藻(Chlorella vulgaris)。
包含编码根据本公开的方法纯化的重组三螺旋蛋白的核酸序列的表达构建体为包含编码如本文所定义的重复基序(Gly-X-Y)n的序列的一个表达构建体。通过所述表达构建体编码的三螺旋蛋白优选为在哺乳动物体温下(即在35℃与40℃之间)热稳定的或可在通过修饰纯化后变得稳定的。n值可在5至600之间或在1至350之间，且(Gly-X-Y)表示细菌或动物(哺乳动物)或昆虫来源的三螺旋形成结构域。其中对每个重复单位，X和Y独立地为任何天然或非天然亚氨基或氨基酸。在一个实例中，X或Y均不为羟脯氨酸。然而，在一些实例中，三螺旋结构域可包括羟脯氨酸。插入或连接序列可定位于包含超过一个胶原蛋白状(CL)结构域的构建体中的每个三螺旋形成结构域(在本文中又称为“胶原蛋白状(CL)形成结构域”)之间，或定位于个别CL结构域内。插入序列由约1至50个任何亚氨基或氨基酸构成。优选地，插入序列不是酶/蛋白酶不稳定的。
在一个实例中，三螺旋蛋白为胶原蛋白。
重组三螺旋序列可来源于任何三螺旋蛋白或含有三螺旋的蛋白质，不论其来自细菌、酵母、植物、昆虫或蚕，且可为羟基化或非羟基化的。
如果三螺旋蛋白呈羟基化形式，则在进行本发明的方法之前可采用需要修饰脯氨酸残基的额外步骤。所述方法对本领域技术人员而言将为熟悉的。
编码重组三螺旋状蛋白且可用于设计本发明的适当构建体的实例序列包括：
(i)来自病原性或非病原性细菌有机体的序列，其中例如，三螺旋序列可包括来源于以下各者中的一种或多种的CL结构域：化脓性链球菌(S.pyogenes)、甲基杆菌4-46、Solibacter usitatus、equi S cIC链球菌(Streptococcus equiScIC)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽杆菌(Bacillus cereus)、产气荚膜梭菌、沼泽红假单胞菌、肺炎链球菌A(Streptococcus pneumoniae A)，其在天然状态中或在通过化学交联稳定化之后均展现所需热稳定性。序列也可包括在US 6,953,839中识别的三螺旋胶原蛋白状序列；
(ii)从选自(但不限于)以下各者的有机体分离的一个或多个DN A序列：白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、放线菌纲(Actin obacteria)(例如淡黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、范巴伦分支杆菌(Mycobacterium vanba alenii)、类诺卡氏菌(Nocardioides species)种、红色杆菌(Rubrobacter xylanophilus)、栖沙盐水孢菌(Salinispora arenicola)、热带盐水孢菌(Salinispora tropica)和链霉菌种、α变形菌纲(Alphaproteobacteria)(例如边虫(Anaplasma)种、耐幅射性甲基杆菌(Methylobacterium radiotoler ans)、维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)、脱氮副球菌(Paracocc us denitrificans)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas pa lustris)、维氏鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas wittichii)和沃尔巴克氏细菌(Wolbachia)种)、拟杆菌门(例如多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron))、β变形菌纲(Betaproteobacteria)(例如固氮弧菌(Azoarcus)种、须芒草伯克氏菌(Burkholderia ambifaria)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkhol deria cenocepacia)、结瘤伯克氏菌(Burkholderia phymatum)、越南伯克氏菌(Burkholderia vietnamiensis)、芳族脱氯单胞菌(Dechloromonas aromatica)、萘降解极地单胞菌(Polaromonasnaphthalenivorans)、罗尔斯通氏真氧菌(Ralstonia eutropha)、罗尔斯通氏贪铜菌(Ralstonia met allidurans)、皮氏罗尔斯通氏菌(Ralstonia pickettii)和铁还原红育菌(R hodoferax ferrireducens))、蓝藻菌属(例如蓝杆藻(Cyanothece)种、集胞藻(Synechocystis)种、红海束毛藻(Trichodesmium erythraeum))、奇异球菌属(Deinococcus)(例如抗辐射奇异球菌(Deinococcus radioduran s))、(δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)(例如厌氧性细菌(Anaeromyxoba cter dehalogenans)、ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)(例如弯曲杆菌(Campylobacter curvus))、厚壁菌门(Firmicutes)(例如克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、耐盐芽孢杆菌(Bacillushalodurans)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、肉毒芽孢梭菌(C lostridium botulinum)、植物发酵梭菌(Clostridium phytofermentans)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、嗜热地芽杆菌(Geobacillus kaustoph iius)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、胚芽乳杆菌(Lactobacillus pla ntarum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysi nibacillus sphaericus)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和肺炎链球菌(Streptococcus pne umoniae))、和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)(例如克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri))、肠杆菌种、大肠杆菌、克雷伯氏氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺性退伍军人杆菌(Legionella pneumophila)、发光杆菌(Photorhabdus luminescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas a eruginosa)、嗜虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、嗜冷杆菌(Psychrobacter cryohalolentis)、降解糖菌(Saccharophagus degradans)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、变形斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans)、亚马逊希瓦氏菌(Shewanella amazonensis)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)、冷海希瓦氏菌(Shewanella frigidima rina)、哈里法克斯希瓦氏菌(Shewanella halifaxensis)、光伏希瓦氏菌(S hewanella loihica)、奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)、匹里那希瓦氏菌(Shewanella pealeana)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefacie ns)、沉积希瓦氏菌(Shewanella sediminis)、武氏希瓦氏菌(Shewanella woodyi)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、宋内氏志贺氏菌(Shigel la sonnei)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi))；
(iii)为以下各者编码的DNA序列：C1q、乙酰胆碱酯酶、巨噬细胞清道夫受体、肺表面活性蛋白、甘露糖结合蛋白、冬眠蛋白(hibernation protein)、足丝贻贝(Mytilusbyssus)、外异蛋白A或神经胶质蛋白；
(iv)编码来源于以下各者中丝叶蜂族膜翅目的锯蜂丝蛋白的序列：在赤杨条纹叶蜂(Hemichroa)、落叶松叶蜂(Pristiphora)、Pachynemalus、黄头叶蜂(Pikonema)和叶蜂(Nematus)种(丝角叶蜂(Nematinae)亚科)、桂花叶蜂(Tomostethus)和黑头叶蜂(Tethida)种(蔺叶蜂(Blennocampinae)亚科)中；以及
(v)编码包括以下各者中的一种或多种的哺乳动物胶原蛋白的序列：I型、II型、III型、IV型、V型、VI型、VII型、VIII型、IX型、X型、XI型、XII型、XIII型、XIV型、XV型、XVI型、XVII型、XVIII型、XIX型、XX型、XXI型、XXII型、XXIII型、XIV型、XXV型、XXVI型、XXVII型、XXVIII型胶原蛋白。
插入序列可在重组构建体中经工程改造以改良三螺旋蛋白的弹性，或以其它方式充当天然结合域或生物学分裂序列。适合于使用的构建体的实例公开于WO 2010/091251中。
在一个实例中，所表达的三螺旋蛋白和/或其三螺旋结构域为其中相同链经组合以形成三螺旋的同源三聚体。
在另一个实例中，所表达的三螺旋蛋白和/或其三螺旋结构域为由两个或三个经组合以形成三螺旋的相异链组成，例如在哺乳动物I型胶原蛋白中所见。
在另一个实例中，所表达的三螺旋蛋白为包含至少两个借助于连接序列连接的三螺旋结构域的嵌合蛋白。例如，编码蛋白质的嵌合构建体可包含两个或更多个的哺乳动物的三螺旋形成结构域和/或可通过接头分隔的细菌三螺旋序列或可通过连接序列分隔的不同细菌胶原蛋白的三螺旋形成结构域。所述嵌合体在表达时导致产生蛋白质链，所述蛋白质链能够形成三螺旋且可由以能够形成三螺旋的单一序列接合在一起的两个来源于细菌的链片段或一个来源于细菌的链片段与来源于哺乳动物的链片段组成。
每个三螺旋结构域序列重复可包括之前提及的序列的重复序列、片段、变体或组合。
虽然不限于此，但细菌表达载体可为冷休克载体，并且重组三螺旋蛋白可在低于37℃的温度下(且在某些实例中在约15℃至23℃的温度下)在微生物(例如大肠杆菌)中表达。在另一个实例中，表达载体为pET载体(Novagen)。
在另一个实例中，选择酵母表达载体。酵母表达载体的实例为本领域中已知的，且可选自例如pHIL-D2、pPIC3.5、pHIL-SI、pPIC9、pPICZ、pA0815、pBLADE、pBLARG、YepFlag1、pAMH110或pBLURA。
在另一个实例中，表达载体为植物表达载体。植物表达载体的实例为本领域中已知的，且可包括例如pB1121、pCAmbia2301、pEAQ-HT-DEST或PVX表达载体。
本公开还提供通过如本文所描述方法来纯化的三螺旋蛋白。
本公开还提供通过如本文所描述的方法来获得的经纯化的三螺旋蛋白。
在一个实例中，三螺旋蛋白为约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约98％纯的。
已根据本公开的方法经纯化的三螺旋蛋白在需要时可转变成可适用于各种应用的明胶。将三螺旋蛋白转变成明胶的方法对本领域技术人员而言将为已知的，且通常涉及例如通过热或化学变性工艺来使蛋白质变性。相应地，本公开还涵盖通过热或化学变性而转变成明胶的本公开的经纯化三螺旋蛋白。
附图说明
图1示出根据本发明的一个实施方案的纯化方案的流程图。
图2示出宿主蛋白在酸性提取和调节pH值和平衡16小时之后的可溶性。(A)细菌，大肠杆菌，(B)酵母，啤酒酵母菌，(C)植物，菠菜(Spinacia oleracea)。
图3示出SDS PAGE，所述SDS PAGE展示在酸性沉淀和随后蛋白酶消化之后的三螺旋蛋白最终纯化；S＝蛋白标准物；F＝发酵提取物和P＝在pH值2.0沉淀和胃蛋白酶消化之后的产物，对化脓性链球菌的初始DNA构建体V-CL和V-CL-CL得到沉淀和蛋白水解CL和CL-CL之后的产物。
图4示出化脓性链球菌胶原蛋白海绵和细胞评估，其显示(A)稳定化薄片(上部)和海绵(下部)，(B)在3小时时的细胞附接，和(C)在16小时之后的细胞活力。
序列表的关键词
SEQ ID NO 1:凝血酶/胰蛋白酶分裂位点
SEQ ID NO:2:来自化脓性链球菌的细菌胶原蛋白Scl2片段的DNA序列
SEQ ID NO:3:来自化脓性链球菌的细菌胶原蛋白Scl2片段的蛋白序列
SEQ ID NO 4:插入序列
SEQ ID NO 5:正向引物
SEQ ID NO 6:反向引物
SEQ ID NO 7:编码来自化脓性链球菌的胶原蛋白的CL结构域的细菌胶原蛋白二聚体的DNA序列
SEQ ID NO:8:编码来自化脓性链球菌的胶原蛋白的CL结构域的细菌胶原蛋白二聚体的蛋白序列
SEQ ID NO 9:肝素结合序列
SEQ ID NO 10:正向引物
SEQ ID NO 11:反向引物
SEQ ID NO 12:正向引物
SEQ ID NO 13:反向引物
SEQ ID NO 14:正向引物
SEQ ID NO 15:反向引物
SEQ ID NO 16:编码包括用于肝素结合的经取代功能性序列的来自化脓性链球菌的细菌胶原蛋白Scl2的DNA序列
SEQ ID NO 17:编码包括用于肝素结合的经取代功能性序列的来自化脓性链球菌的细菌胶原蛋白Scl2的蛋白序列
SEQ ID NO 18:整合素结合序列
SEQ ID NO 19:正向引物
SEQ ID NO 20:反向引物
SEQ ID NO 21:正向引物
SEQ ID NO 22:反向引物
SEQ ID NO 23:编码包括用于整合素结合的经取代功能性序列的来自化脓性链球菌的细菌胶原蛋白Scl2的DNA序列
SEQ ID NO 24:编码包括用于整合素结合的经取代功能性序列的来自化脓性链球菌的细菌胶原蛋白Scl2的蛋白序列
SEQ ID NO 25:编码包括用于肝素和整合素结合两者的经取代功能性序列的来自化脓性链球菌的细菌胶原蛋白Scl2的DNA序列
SEQ ID NO 26:编码包括用于肝素和整合素结合两者的经取代功能性序列的来自化脓性链球菌的细菌胶原蛋白Scl2的蛋白序列
SEQ ID NO 27:使用来自沼泽红假单胞菌的V结构域来编码来自Solibacterusitatus的细菌胶原蛋白的DNA序列
SEQ ID NO 28:使用来自沼泽红假单胞菌的V结构域来编码来自Solibacterusitatus的细菌胶原蛋白的蛋白序列
SEQ ID NO 29:编码来自锯蜂寡斑叶蜂(Nematus oligospilus)基因A的昆虫胶原蛋白的DNA序列
SEQ ID NO 30:编码来自锯蜂寡斑叶蜂基因A的昆虫胶原蛋白的DNA序列
SEQ ID NO 31:引物
SEQ ID NO 32:引物
SEQ ID NO 33:引物
SEQ ID NO 34:引物
SEQ ID NO 35:引物
SEQ ID NO 36:引物
SEQ ID NO 37:编码人类III型胶原蛋白的片段的3个重复的DNA序列
SEQ ID NO 38:编码人类III型胶原蛋白的片段的3个重复的蛋白序列
SEQ ID NO 39:编码人类I型αI链CB3片段的DNA序列
SEQ ID NO 40:编码人类I型αI链CB3片段的蛋白序列
SEQ ID NO 41:编码由人类胶原蛋白I型和III型链的片段制得的嵌合体的DNA序列
SEQ ID NO 42:编码其中存在来自甲基杆菌种和S.usitatus的两种不同胶原蛋白状成分的不同细菌胶原蛋白链的嵌合体的DNA序列
SEQ ID NO 44:编码其中存在来自甲基杆菌种和S.usitatus的两种不同胶原蛋白状成分的不同细菌胶原蛋白链的嵌合体的DNA序列
一般技术和定义
除非另外具体定义，否则本文所用的所有技术和科学术语将视为具有与一般本领域技术人员通常理解(例如在细胞培养、分子遗传、重组生物学、真丝技术、免疫学、蛋白质化学和生物化学中)的含义相同的含义。
除非另外指明，否则在本发明中所利用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术为本领域技术人员所熟知的标准程序。所述技术描述和解释于诸如以下的来源的文献通篇中：J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning)，John Wiley and Sons(1984)；J.Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)；T.A.Brown(编者)，Essential Molecular Biology:APractical Approach，卷1和2,IRL Press(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编者)，DNACloning:A Practical Approach，卷1-4，IRL Press(1995和1996)；和F.M.Ausubel等人(编者)，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates和Wiley-Intersclence(1988年，包括直至目前的所有更新)；Ed Harlow和David Lane(编者)Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory,(1988年)；和J.E.Coligan等人(编者)Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons(包括直至目前的所有更新)。
在本说明书通篇中，除非另外具体陈述或上下文另外需要，否则提及单一步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组将视为涵盖这些步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组中的一个和多个(即一种或多种)。因此，如本文所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一种/一个(a/an)”和“所述(the)”包括复数方面。例如，提及“一种/一个(a)”包括单个以及两个或更多个；提及“一种/一个(an)”包括单个以及两个或更多个；提及“所述(the)”包括单个以及两个或更多个等。
除非另外具体陈述，否则本文所描述的本公开的每个实施例可在细节上作必要的修改之后应用于其他实施例中的每个和全部。
本领域技术人员将了解，本文中的公开内容除具体描述的那些外允许进行变型和修改。应理解本公开包括所有所述变型和修改。本公开还包括在本说明书中单独或共同地提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，和所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或更多个。
本公开不限于本文所描述的特定实施例的范围，所述特定实施例仅欲出于范例的目的。如本文所描述，功能等效的产物、组合物和方法明确处于本发明的范围内。
术语“和/或”(例如“X和/或Y”)应理解为表示“X和Y”或“X或Y”，且应视为提供对两种含义或任一含义的明确支持。此外，在倒数第二和最后特征之间包括词组“和/或”的列表或特征表示所列特征中的任何一种或多种可以任何组合形式存在。
在本说明书通篇中，词语“包含(comprise)”或变型(comprises/comprising)应理解为暗示涵盖所陈述的要素、整数或步骤、或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤、或元素、整数或步骤的组。
术语“在非哺乳动物宿主细胞培养提取物或匀浆物内含有”理解为提及从本公开的宿主细胞制备的细胞培养提取物或匀浆物已由编码三螺旋蛋白序列的构建体转染或转化。
术语“植物”包括整个植物、无性结构(例如叶片、茎、根)、开花器官/结构、种子(包括胚芽、内胚乳和种衣)、植物组织(例如脉管组织、地面组织和其类似组织)、细胞和其后代。
“热稳定”表示三螺旋蛋白(或蛋白质的三螺旋部分)在所给定的温度下维持其三维结构的程度。根据本发明的方法允许三螺旋结构以所容许的程度不稳定，然而，优选至少70％的三螺旋蛋白维持三维三螺旋形式。
如本文所用的术语“三螺旋蛋白”理解为提及如本文所描述包含至少一个区(在本文中根据上下文称为“三螺旋结构域”或“胶原蛋白状结构域”)的同源三聚、嵌合或异源三聚蛋白质。术语“三螺旋蛋白”还包括如本文所提及的“胶原蛋白状(CL)蛋白”。所述术语涵盖三螺旋蛋白的变体和片段和其功能等效物和衍生物，其优选均保留至少一个结构或功能性特征或三螺旋或胶原蛋白状蛋白(即Gly X Y)n序列。本公开的三螺旋蛋白理解为对蛋白水解稳定的。三螺旋蛋白也可包括对经选择用于移除宿主蛋白的蛋白酶酶为蛋白水解稳定的额外非三螺旋蛋白序列，和/或天然地或通过设计以对所述酶为蛋白水解稳定的非三螺旋插入序列。
如本文所用，术语“胶原蛋白状(CL)”是指多肽包含Gly-X-Y三联体，其中X和Y可为任何氨基酸。本公开的丝蛋白以及天然产生的细菌胶原蛋白也包括在术语“胶原蛋白状”内。本公开的胶原蛋白状丝蛋白不具有任何羟脯氨酸。在一个实例中，胶原蛋白状丝蛋白包含至少约40个，更优选至少约50个Gly-X-Y三联体。此外，在另一个实例中，Gly-X-Y三联体构成蛋白质的主要氨基酸序列的至少约40％，更优选至少约50％。在另一个实例中，胶原蛋白状丝多肽具有或在适合的条件下能够形成三螺旋结构。此外，应理解包括在重组三螺旋蛋白中的任何插入序列或接头均对蛋白酶具有抗性。
术语“三螺旋结构域”或“胶原蛋白状结构域”是指包含肽通式(Gly X Y)n的蛋白质，其中Gly为甘氨酸，X和Y表示相同或不同的氨基酸(其具体情况可在不同Gly X Y三联体的范围内变化)，其中n可在5与600之间。三螺旋结构域由三个链组成，所述链的特征在于折叠为三螺旋蛋白构象的重复(Gly X Y)n基序。
如本文所用，术语“三螺旋形成结构域”或“胶原蛋白状形成结构域”是指编码包含(Gly-X-Y)n基序的氨基酸序列的核苷酸序列，其中X和Y为任何其他氨基酸残基，所述(Gly-X-Y)n基序能够折叠或与其他两个链缔合以形成三螺旋。
术语“同源三聚”是指三螺旋蛋白和/或其三螺旋结构域所含有的三螺旋的所有三个链均相同。
术语“异源三聚”是指三螺旋蛋白和/或其三螺旋结构域含有至少两个不同的形成三螺旋的链。
如本文所用的术语“培养”是指在培养基中繁殖宿主细胞以使之生长和所有继代培养物。
如本文所用的术语“宿主细胞培养提取物”意指其中三螺旋蛋白分泌至培养基中的宿主细胞培养物。宿主细胞培养提取物可包括例如其中生长有用三螺旋蛋白转化/转染/转导的宿主细胞的浓缩细胞培养基。如本文所描述，可从所分泌性的三螺旋蛋白中移除或分离完整宿主细胞。
如本文所用的术语“宿主细胞培养匀浆物”意指其中三螺旋蛋白保留在宿主细胞内且通过破裂或提取工艺而释放的宿主细胞培养物。因此，在本发明的上下文中，匀浆物表示细胞已经破坏，以使得宿主细胞培养匀浆物包含破裂宿主细胞和已从所述破裂细胞释放的三螺旋蛋白。
如本文所用的术语“构建体”是指含有用于编码三螺旋形成结构域的DNA序列的表达盒。构建体可还包括V结构域和组氨酸标签。所述术语也延伸至可表达存在于表达盒中的DNA的载体。DNA在功能上与能够影响其表达的其他序列(例如启动子序列)相关。一般而言，通常用于重组DNA技术中的表达载体呈“质粒”形式。
如本文所用的术语“片段”是指天然氨基酸或核苷酸遗传序列，且具体地三螺旋蛋白的功能衍生物的一部分。
如本文所用的术语“变体”是指缺失、插入或取代有不同核苷酸以产生编码相同或功能上等效多肽的多核苷酸的序列。
术语“纯化”意欲表示通过本文所描述的蛋白质纯化工艺而使三螺旋蛋白变得实质上不含其他蛋白质(例如特定宿主细胞蛋白)或污染剂。蛋白质可能变得实质上不含其他蛋白质或污染剂，例如至少约70％或75％或80％或85％或90％或95％或96％或97％或98％或99％不含其他蛋白质或污染剂。
发明详述
本公开的方法可用于纯化来自非哺乳动物宿主细胞中的任何来源的任何重组产生的三螺旋蛋白。
三螺旋序列
适用于本公开的方法的重组三螺旋蛋白序列适用作生物材料、用于制造的材料、化妆品或食物添加剂。编码三螺旋蛋白的序列由一个或多个三螺旋形成或胶原蛋白状(CL)形成结构域构成，其中每个CL结构域任选地由非胶原蛋白状抗蛋白酶性插入区分隔。插入区可适于模拟在许多人类胶原蛋白内发现的三螺旋结构中的天然间断，或可提供所需生物学功能(例如细胞/组织结合(例如肝素或整合素)、蛋白酶分裂位点等)。插入区可出现在重组三螺旋序列的个别CL结构域之间或一个CL结构域内。为确保重组蛋白的三螺旋区的恰当折叠，在翻译之后，球状折叠结构域优选插入在重组构建体的N末端或C末端处。此球状折叠结构域可在后续蛋白酶消化步骤期间移除。
在一个实例中，适用于本公开的方法的三螺旋序列可重组地来源于在病原性或非病原性细菌有机体中发现的天然三螺旋蛋白。例如，已显示来自化脓性链球菌(Scl1或Scl2)的细菌胶原蛋白状蛋白在不需经翻译后修饰以形成羟脯氨酸的情况下形成稳定三螺旋结构。在另一个实例中，肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的基因组序列显示多个具有不存在于常见实验室菌株K-12中的胶原蛋白状序列的开放阅读框(Ghosh N等人(2012)PLoSone e37872)。
可重组产生的天然产生的细菌胶原蛋白状蛋白的替代性来源可在甲基杆菌4-46、Solibacter usitatus、equi ScIC链球菌、炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、沼泽红假单胞菌、嗜肺性退伍军人杆菌和肺炎链球菌A中找到。相应地，本公开延伸至从这类来源获得的序列或其片段。
在另一个实例中，三螺旋蛋白为包含分隔每个三螺旋结构域的插入序列的重组蛋白，其中所述插入序列为对蛋白水解稳定的约1至50个亚氨基或氨基酸的非胶原蛋白肽序列。这些序列提供适用于所得生物材料、化妆品、食物添加剂或其他产品(例如用于生产)的一些生物学功能。
三螺旋蛋白的所需生物学功能可来源于促进三螺旋蛋白与靶向细胞型的结合或以其他方式在身体中提供用于降解的天然分裂位点的序列。结合序列可包括来自I型胶原蛋白的整合素结合序列(GERGFPGERGVE)和/或来自乙酰胆碱酯酶的胶原蛋白尾部的肝素结合序列之一(GRPGKRGKQGQK)。分裂序列可包括(但不限于)基质金属蛋白酶(MMP)结构域的家族内的一个或多个序列，例如分裂I型、II型和III型胶原蛋白的MMP-I、MMP-2、MMP-8、MMP-13和MMP-18、以及分裂变性的胶原蛋白的MMP-2和MMP-9。插入序列也可包括上述结合或分裂序列的部分序列。
本公开还涵盖已知达到所述功能的其他序列。所述序列可以4、5、6或8个三肽重复单元的形式提供，其中最佳分裂可能为(但不限于)5或6个三肽序列。
使用重组技术允许引入赋予更大稳定性(诸如电荷对中的变化)的特定稳定三螺旋基序序列，或影响蛋白质变性温度或π(pI)(其随后影响其可用于药物的程度)的序列。
功能性结构域可插入在一个三螺旋形成结构域内或在连续三螺旋形成结构域之间。另外，可添加多于一个功能性结构域，其可包括一个三螺旋结构域内的多个重复序列或跨越若干重复三螺旋结构域(可包括相同或不同功能)的重复序列。类似地，多个功能性重复序列可包括在三螺旋结构域重复之间，或为可使用序列内和序列之间的插入序列而达到的更复杂的组合。总之，所有这些方法允许设计和操控所表达的三螺旋蛋白以提供可提供增强型生物医学产品的特定生物学功能。
在另一个实例中，在本公开中还涵盖嵌合三螺旋蛋白。例如，在两个或更多个不同细菌序列之间、在两个或更多个动物之间或在动物与非动物(例如细菌)序列之间的嵌合体可容易地通过选择来源于同在载体中的各种同源结构域的特定序列来工程改造，以促成嵌合三螺旋蛋白的表达。
由本发明所涵盖且可重组表达的其他三螺旋蛋白包括C1q、乙酰胆碱酯酶、巨噬细胞清道夫受体、肺表面活性蛋白、甘露糖结合蛋白、冬眠蛋白、足丝贻贝、外异蛋白A和神经胶质蛋白、或其片段。
宿主细胞
根据本公开的宿主细胞为任何便利的非动物细胞，包括细菌、酵母和植物来源的细胞。本发明的宿主细胞可为能够表达三螺旋或胶原蛋白状蛋白质的天然产生的有机体或突变有机体。在一个实例中，宿主有机体为已使用重组DNA技术、用编码产生三螺旋蛋白的异源DNA序列转化的有机体或其后代。
三螺旋序列的表达
用于重组三螺旋蛋白的表达构建体可通过本领域已知的任何便利方法引入宿主细胞中。
表达重组三螺旋蛋白的方法包括本领域中一般已知的标准表达方法，诸如描述于Molecular Cloning(Sambrook和Russell(2001))中的那些方法。
用于产生三螺旋蛋白的表达系统描述于例如US 20120116053中。
毕赤酵母的转化、阳性转化体选择和培养方法公开于例如美国专利第4,837,148号；第4,855,231号；第4882,279号；第4929,555号；第5,122,465号；第5,324,639号；第5,593,859号和第6,472,171号中。
产生三螺旋蛋白的方法为本领域中已知的且描述于例如US 20120282817、EP1809751和WO 2012/117406中。
用于产生三螺旋蛋白的表达系统描述于例如US 20120116053中。
所表达的三螺旋蛋白的回收
可通过本领域中已知的技术来采集/收集表达后培养的细胞。在一个实例中，通过离心来采集细胞且重悬于适合的培养基中以获得发酵液/溶液(即细胞培养提取物)或匀浆物。
回收所表达的重组三螺旋蛋白的确切方法将取决于宿主细胞和表达构建体。在微生物宿主细胞中，三螺旋蛋白将在宿主细胞的细胞壁内捕获，即使其已被输送至细胞质外也如此。在此情况下，破坏宿主细胞以回收三螺旋蛋白。或者，可移除或削弱细胞壁以释放位于胞外质中的蛋白质。破坏可通过本领域中已知的任何手段来实现，包括声波处理、微流体化、在弗式压碎器或相似设备中裂解、通过与玻璃珠一起剧烈搅拌/研磨来破坏、使渗透易碎性突变酵母菌株裂解或酶处理。在通过裂解或破坏重组宿主细胞来回收三螺旋蛋白的情况下，裂解或破坏通常在具有足够离子强度的缓冲剂中进行以允许三螺旋蛋白保持可溶形式。这些机械和酶破坏方法将产生亚细胞片段，所述片段可通过离心或通过过滤来移除以获得匀浆物。
如果三螺旋蛋白在细胞外(即以可溶性分泌蛋白形式)产生，则仍需要从细胞上清液移除细胞。澄清一般通过离心来实现，但也可通过沉降和/或过滤来实现。
三螺旋蛋白的纯化
含有可溶性重组三螺旋蛋白的培养液/溶液(例如细胞培养提取物)或匀浆物随后根据本公开的方法经受酸性沉淀步骤。这通过添加调整培养液/溶液或匀浆物的pH值的酸性溶液来达到。酸性溶液可为任何弱酸或强酸或两者的混合物。盐酸、硫酸、乙酸、甲酸和乳酸均为合适的。不同于用于使胶原蛋白膨胀和溶解的含天然胶原蛋白的哺乳动物组织材料的预先酸性处理，已发现在本公开的方法中采用的酸化步骤使污染性宿主细胞蛋白沉淀出来但仍将三螺旋蛋白保持在溶液中。此外，酸化步骤不使三螺旋蛋白变性。因此，所述方法代表用于从可溶性三螺旋蛋白有效分离宿主细胞污染物的便利工艺。
酸性溶液可以浓溶液形式添加。酸化可在4℃的温度下进行，但根据构建体，高达30℃的温度也是可能的。最适当的温度将取决于已由所选择的核苷酸序列形成的三螺旋蛋白的熔点温度。使用比三螺旋蛋白的熔点温度(Tm)低的温度(优选比Tm低至少10℃或更多)将确保三螺旋不变性。例如，在pH值2.2处，构建体长度为234个Gly-Xaa-Yaa基序的化脓性链球菌的Tm为25.7℃，构建体长度为147个氨基酸的甲基杆菌4-46的Tm为28.3℃，构建体长度为189个氨基酸的产气荚膜梭菌的Tm为37.2℃。
酸性条件的pH值将根据所选择的宿主系统的情况和用于产生胶原蛋白状蛋白质的序列的情况而变化。如果使用细菌宿主细胞(诸如大肠杆菌)，则pH值优选介于2与3之间。如果使用酵母宿主细胞，则pH值优选为4至6。如果使用植物宿主细胞，则pH值优选为2至5。
酸性沉淀步骤之后为移除易受蛋白酶消化影响的宿主细胞蛋白的消化步骤。三螺旋蛋白保持对蛋白酶的抗性。在一个实例中，消化步骤使用酸性蛋白酶来进行。适用于根据本公开的方法的酸性蛋白酶的实例包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜蛋白酶状酶(诸如菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶或奇异果蛋白酶)、或佐氏曲霉酸性蛋白酶。根据所采用的蛋白酶，可必需调节pH条件(例如对诸如木瓜蛋白酶的蛋白酶)。本领域技术人员将熟悉所述策略。如果使用诸如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的蛋白酶，则可必需将pH值调节至中性或甚至碱性条件。
蛋白酶将许多污染性蛋白质消化为因分子量比完整可溶性重组三螺旋蛋白小得多而均可通过透滤作用来移除的肽。随后可收集所得重组三螺旋蛋白。借助于透滤作用来收集具有浓缩重组三螺旋蛋白的附加优势。另外，在某些情况下，可通过使三螺旋蛋白沉淀，因而使所述三螺旋蛋白移出溶液来促进收集。通过使重组三螺旋蛋白沉淀而收集可通过添加调节离子强度(使用例如硫酸铵或氯化钠)、通过调节pH值、通过调节温度、或通过添加聚合物(例如聚乙二醇)来达到。
根据在本发明的步骤(i)中所采用的提取方法，在酸性沉淀步骤与蛋白酶消化步骤之间包括中间分离/纯化步骤可为有益的，所述纯化步骤提供三螺旋蛋白从所沉淀的宿主细胞物质的物理分离。宿主细胞物质可包括蛋白质和/或DNA。相应地，可采用任何粗分离工艺以移除这些物质中的一种或两种。所述工艺对本领域技术人员而言将为熟悉的。在一个实例中，所述工艺包括离心、(超)过滤、交叉流过滤和沉降。
精制
如果需要将三螺旋蛋白用于医学用途，则优选通过精制纯化来进一步纯化经酸化和蛋白酶处理的产物，以达到大于90％的纯度。根据本公开，任何精制纯化均为合适的，包括例如凝胶过滤、疏水性、亲和或离子交换层析。尽管也可使用其他沉淀步骤，但它们一般达不到所需高纯度。
稳定化
如果使用经纯化的三螺旋蛋白作为生物医学材料，则它们必须能够制成适当形式。三螺旋构建体可形成为海绵和薄片。为帮助达到这些形式，经纯化的三螺旋蛋白可在用于医学应用中之前稳定化(如动物胶原蛋白的情况)，以在需要时改善其长期稳定性和机械强度。多种多样合适的稳定化策略是可能的。戊二醛是用于交联的合适试剂，且广泛用于改善胶原蛋白物质的体内稳定性。辐射是另一种物理稳定化技术。
根据本公开的方法而纯化的三螺旋蛋白可用于各种应用和程序，包括恢复、再生和美容程序、血管程序、成骨形成和软骨形成程序、软骨重构、移植骨替代物、止血、伤口处理和管理、组织强化和支撑、失禁等。
可从本发明的重组蛋白聚集产生的生物医学产品的非限制性实例和其可能应用包括(但不限于)以下方面：可溶性重组胶原蛋白，诸如用于真皮植入物、药物载剂、医学装置涂层、植入物涂层(骨和血管)、形状形成物质、粘性手术(viscosurgery)、血管封闭剂、化妆品；海绵状物质，诸如用于三维细胞培养物、组织和器官工程改造、止血剂和伤口治疗(人工皮肤和伤口涂剂)；纤维，诸如用于手术缝合和止血剂；凝胶状物质，诸如用于组织植入物、角膜保护膜、隐形眼镜和用于细胞培养的基质；以及膜状物质，诸如用于抗粘附膜、药物输送系统、人工皮肤和其类似物。
本领域技术人员应了解，可在不背离本发明的广泛一般范围的情况下进行上述实施方案的大量变型和/或修改。因此，本发明的实施方案在所有方面中视为说明性而非限制性的。
实施例
以下实施例1-11描述可根据本文所描述的方法而纯化的不同三螺旋构建体。
实施例
实施例1—来自化脓性链球菌的细菌胶原蛋白Scl2片段的DNA
从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)数据库(National institutes of Health，Bethesda，MD 20894，美国)中提供的数据获得用于编码Scl2.28蛋白的组合球状和胶原蛋白状部分、但缺少C末端附接结构域的scl2.28等位基因的片段(Q8RLX7)的DNA序列，作为记录GenBank:AY069936.1。向此序列中在序列的N末端处引入His6标签，且在N末端球状结构域(V)与之后的(Gly-Xaa-Yaa)n胶原蛋白状结构域(CL)序列之间插入凝血酶/胰蛋白酶分裂序列LVPRGSP(SEQ ID No:1)。在CL结构域的C末端处包括三联体序列GKY，继而包括终止密码子以及NdeI和BamHI克隆位点。商业上在不进行任何密码子优化的情况下合成用于此设计的DNA。SEQ ID No:2为最终构建体。
DNA和蛋白序列：(SEQ ID No:2和3)
Figure BDA0000807470280000321
实施例2：来自化脓性链球菌的胶原蛋白Scl2的CL结构域的细菌胶原蛋白二聚体 的DNA.
来自包含球状和胶原蛋白状部分、但缺少C末端附接结构域的化脓性链球菌的Scl2.28等位基因的片段的DNA序列如实施例1中所描述。其还包括额外的N末端His6标签序列、在N末端球状结构域(V)与之后的(Gly-Xaa-Yaa)n胶原蛋白状结构域(CL)序列之间的凝血酶/胰蛋白酶分裂序列LVPRGSP(SEQ ID NO:1)，在CL结构域的C末端处包括三联体序列GKY，继而包括终止密码子。使用定点突变在CL结构域起点处使用以下寡核苷酸来在Scl2基因中添加含有插入序列GAAGVM(SEQ ID No:4)的第二构建体：
5'ACGCGGTAGTCCCGGGGCAGCGGGTGTTATGGGGCCCAGAGG 3'正向(SEQIDNO:5)
和
3'CCTCTGGGCCCCATAACACCCGCTGCCCCGGGACTACCGCGT 5'反向(SEQIDNO:6)
随后用5'SmaI(平端)和3'SspI(平端)消化含有GAAGVM插入序列的这个第二构建体。此经消化的插入序列随后亚克隆回原基因Scl2在原(实施例1)构建体末端的SmaI位点处。最终序列构建体以SEQ ID NO:7示出。因为插入序列以平端片段形式克隆，所以选择菌落，在1xYT中生长，且进行中量制备以选择包括额外的序列和此第二序列正确定向的克隆。
DNA和蛋白序列：(SEQ ID No:7和8).
Figure BDA0000807470280000341
实施例3：包括用于肝素结合的经取代功能性序列的来自化脓性链球菌的细菌胶 原蛋白Scl2的DNA
如实施例1中所给出，使用限制位点5'NdeI和3'BamHI来将Scl2基因克隆入梭形载体pSL1180中。此克隆随后用于进行定点突变以在序列内引入新结合基序。使用3个依序定点突变的PCR反应来在Scl2基因的碱基对561处添加肝素结合序列(GRPGKRGKQGQK；SEQ IDNo:9)，因为肝素插入序列为12个氨基酸且围绕插入位点的序列重复极多。对第一反应，使用以下寡核苷酸：
5'TGAAGCTGGTGCTCAAGGCAGGCCGGGTCCAATGGGTCCTGCTG 3'正向(SEQ ID No:10)
和
3'CAGCAGGACCCATTGGACCGGCCTGCCTTGAGCACCAGCTTCA 5'反向(SEQ ID No:11)
对第二反应，使用以下寡核苷酸：
5'CAAGGCAGGCCGGGTAAGCGGGGTCCTGCTGGTGAGCG3'正向(SEQ ID No:12)
和
3'CGCTCACCAGCAGGACCCCGCTTACCCGGCCTGCCTTG 5'反向(SEQ ID NO:13)
对第三反应，使用以下寡核苷酸：
5'CCGGGTAAGCGGGGTAAACAGGGCCAGAAGGGTGAAAAAGGAGAACCTGG 3'(SEQDNO:14)
和
3'CCAGGTTCTCCTTTTTCACCCTTCTGGCCCTGTTTACCCCGCTTACCCGG 5'(SEQ ID NO:15)
用酶DpnI处理PCR产物以确保所有亲本DNA被消化，且随后转化至大肠杆菌宿主菌株XLI-BLUE中。最终序列构建体以SEQ ID No 16描述。选择菌落，在抗生素选择性培养基中生长，且进行Qiagen小量制备。鉴别含有所引入的肝素位点的克隆且储存在-20℃下。
DNA和蛋白序列：(SEQ No:16和17).
Figure BDA0000807470280000361
实施例4：包括用于整合素结合的经取代功能性序列的来自化脓性链球菌的细菌 胶原蛋白Scl2的DNA
如实施例1中所给出，使用限制位点5'NdeI和3'BamHI来将Scl2基因克隆入梭形载体pSL1180中。此克隆随后用于进行定点突变以在序列内引入新结合基序。借助于PCR导引的整合使用两个依序步骤来在Scl2基因的碱基对705处添加整合素结合序列(GERGFPGERGVE；SEQ ID No:18)。用于步骤1的寡核苷酸为：
5'GGAAAAGATGGTGAACGTGGTTTCCCGGGTCCAGCTGGTAAGGACG 3'正向(SEQ ID No:19)
和
3'CGTCCTTACCAGCTGGACCCGGGAAACCACGTTCACCATCTTTTCC 5’反向(SEQ ID No:20)
用于步骤2的寡核苷酸为：
5'GAACGTGGTTTCCCGGGTGAGAGGGGCGTCGAGGGCCAAAACGGCCAAGAT 3’正向(SEQ IDNo:21)
和
3'ATCTTGGCCGTTTTGGCCCTCGACGCCCCTCTCACCCGGGAAACCACGTTC 5'反向(SEQ IDNo:22)
用酶DpnI处理PCR产物以确保所有亲本DNA被消化，且随后转化至大肠杆菌宿主菌株XLI-BLUE中。最终序列构建体以SEQ ID No 23描述。选择菌落，在抗生素选择性培养基中生长，且进行Qiagen小量制备。鉴别含有所引入的整合素位点的克隆且储存在-20℃下。
DNA和蛋白序列：(SEQ_ID_No:23和24)
Figure BDA0000807470280000371
Figure BDA0000807470280000381
实施例5：包括用于肝素和整合素结合两者的经取代功能性序列的来自化脓性链 球菌的细菌胶原蛋白Scl2的DNA
使用如实施例3中所描述的含有引入的肝素结合位点的Scl2基因。使用如实施例4中所描述的寡核苷酸使经选择的含有确定引入的肝素位点的克隆经受第二轮定点突变，以在Scl2基因的碱基对705处引入整合素结合域(GERGFPGERGVE；SEQ ID No:18)。用酶DpnI处理PCR产物以确保所有亲本DNA被消化，且随后转化至大肠杆菌宿主菌株XLI-BLUE中。最终序列构建体以SEQ ID No 25描述。选择菌落，在抗生素选择性培养基中生长，且进行Qiagen小量制备。鉴别含有所引入的整合素位点以及肝素结合位点的克隆且储存在-20℃下。
DNA和蛋白序列：(SEQ ID No:25和26)
Figure BDA0000807470280000382
Figure BDA0000807470280000391
实施例6：使用来自沼泽红假单胞菌的V结构域的来自Solibacter usitatus的细 菌胶原蛋白的DNA
从国家生物技术信息中心数据库(National institutes of Health，Bethesda，MD 20894,美国)中提供的数据获得用于来自Candidatus Solibacter usitatusEllin6076的含三螺旋重复序列的胶原蛋白的DNA序列，作为记录ABJ82342。从在国家生物技术信息中心数据库(National institutes of Health，Bethesda，MD 20894，美国)中提供的数据获得用于来自沼泽红假单胞菌V结构域的DNA序列，作为YP_001993084。将蛋白序列翻译成标称DNA序列，且设计维持正确编码构架的复合基因，其中Met启动信号后接着是来自S.usitatus的CL结构域，随后为来自沼泽红假单胞菌的V结构域，最后是C末端His6标签和终止密码子。为5'以NdeI和EcoRI形式添加编码序列外的末端限制位点，而为3’以SalI和HindIII形式添加。用在使所需宿主系统大肠杆菌的表达达到最佳的同时保留原氨基酸序列的DNA序列来合成此构建体(
Figure BDA0000807470280000392
Gene Synthesis,Regensburg,Germany)。最终序列构建体以SEQ ID No:27描述。
DNA和蛋白序列：(SEQ ID No:27和28)
Figure BDA0000807470280000401
实施例7：来自锯蜂寡斑叶蜂基因A的昆虫胶原蛋白的DNA
如先前所述(US 61/615745)，从所报道的A型链序列(A279)获得来自寡斑叶蜂丝腺的三螺旋胶原蛋白状实体的DNA。合成基因构建体(
Figure BDA0000807470280000402
Gene Synthesis,Regensburg,Germany)，所述基因构建体包括NdeI和EcoRI限制位点，且引入有使所需宿主系统大肠杆菌的表达达到最佳的同时保留原氨基酸序列的保守碱基取代。
最终序列构建体以SEQ No:29描述。
DNA和蛋白序列：(SEQ ID No:29和30)
SF21(A279)-锯蜂胶原蛋白A型基因
Figure BDA0000807470280000411
实施例8：用于人类III型胶原蛋白的片段的3个重复的DNA
PCR反应的模板是基于cDNA Clone MGC:39848(图像5405119)(ATCC,Manassas,VA)，其含有人类COL3A1基因且引入有不改变氨基酸序列、但减少次级结构形成的可能性的有限碱基变化。
通过电泳来分离PCR产物，且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)来提取所切除的条带。
用于PCR生成三个用于克隆的单独片段的寡核苷酸为：
Figure BDA0000807470280000412
使PCR片段经受成对限制酶消化(EcoRI和XmaI、XmaI和BamHI、BamHI和SaclI，且通过从琼脂糖凝胶提取来纯化片段。与在载体YepFlag1(Eastman Kodak/IBI,New Haven,CT)中依序接合结合来达到三重复DNA片段的产生。使用适当酶制备载体DNA。经纯化的PCR片段接合至依序载体构建体中，每个载体构建体的比率为3摩尔插入序列与1摩尔载体。接合混合物用于使用标准程序来转化大肠杆菌。大肠杆菌菌株XL1Blue(Stratagene，La Jolla,CA)常规用于质粒的维持、繁殖和转化。若需要则可从此载体分离单独DNA。最终序列构建体以SEQ ID No:37示出。
DNA和蛋白序列：(SEQNo:37和38)
Figure BDA0000807470280000421
实施例9：用于人类I型α1链CB3片段的DNA.
从国家生物技术信息中心数据库(National institutes of Health，Bethesda,MD 20894,美国)中提供的数据获得用于人类I型胶原蛋白α1链的CB3片段的DNA序列，作为记录#GenBank:Z74615.1。通过添加C末端His6标签和终止密码子来修饰序列，且添加有5'NdeI和3'EcoRI和HindIII限制位点，使构建体适于插入在pCold IV载体中。由此DNA产生的三螺旋蛋白的稳定性表示所有操作必须在4℃下进行。合成构建体(
Figure BDA0000807470280000422
GeneSynthesis,Regensburg，Germany)，所述构建体具有在使所需宿主系统大肠杆菌的表达达到最佳的同时保留原氨基酸序列的保守取代。
最终序列构建体以SEQ DD No:39描述
DNA和蛋白序列：(SEQ ID No:39和40)
Figure BDA0000807470280000431
实施例10：用于由来自人类胶原蛋白I型和III型链的片段制得的嵌合体的DNA
在嵌合DNA的产生中使用具有ATCC寄存编号95498的人类胶原蛋白I型α1c-DNA和具有ATCC寄存编号95502的人类胶原蛋白III型α1c-DNA。
最初，使用热休克方法在42℃下将编码胶原蛋白I和III基因的10ng c-DNA转化至50μl大肠杆菌宿主菌株中。回收对安比西林(ampicillin)具有抗性的菌落且在150ml YT培养基中生长过夜。
进行亲本克隆的限制消化，随后在1％琼脂糖凝胶电泳上分析，并且分离和纯化胶原蛋白条带。使用T4DNA接合酶试剂盒(Invitrogen)来接合载体与经纯化的插入制备物。随后将接合混合物转化至Top10细胞中且接种在安比西林选择性培养基上。使用菌落PCR来检测含有经工程改造的嵌合体的克隆。在1％琼脂糖电泳上分析含有可能工程改造的克隆的PCR产物。4.5kb胶原蛋白I基因插入序列使用限制位点XbaI(5')和SspI(3')亚克隆自其亲本载体pUC19，且使用位点XbaI(5')和SmaI(3')克隆入细菌梭形载体pBluescript II KS+(Stratagene)中。此克隆允许胶原蛋白I中碱基对2929-2934处的内部BamHI位点充当此载体中的独特位点。构造胶原蛋白I(N和C)末端的两个截断。N末端截断含有克隆入pBluescript II KS+中位点XbaI(5')和BamHI(3')处的2.7kb胶原蛋白片段，而大小为1.8kb的C末端截断使用限制位点BamHI(5')和HindIII(3')亚克隆入梭形载体pUC19中。在C末端截断中，使用QuickChange II定点突变试剂盒(Invitrogen)在C尾肽的碱基对3706-3711处引入NaeI限制位点(静默突变)。在胶原蛋白I终止密码子之后直接添加HincII位点(GTCAAC)以易于将全长嵌合体克隆入载体系统中。在N末端截断中，使用PCR来在启动甲硫氨酸残基上游引入kozak序列(kozak序列)。剪接重叠PCR用于使胶原蛋白Iα螺旋区与胶原蛋白IIIα螺旋区互换。跨越CoII Iα螺旋的碱基对3288-3711的重叠与CoII IIIα螺旋的残基3283-3708的重叠互换。5’重叠寡核苷酸含有所引入的BamHI位点，而3’寡核苷酸含有所引入的NaeI位点。PCR产物使用零平端TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)克隆入pTOPO载体中。将重叠从具有BamHI(5')和NaeI(3')的pTOPO消化，且与在pUC19中含有所引入的Nael位点的胶原蛋白I野生型(WT)C末端克隆互换。使用N末端截断的构建体上的缺失突变来进行N-原肽从胶原蛋白I残基193-609的移除。随后将基因克隆入胶原蛋白的C末端亚片段中以产生缺少N-原肽的全长基因。最终序列由SEQ No:41表示。
DNA序列：SEQ ID No:41
Figure BDA0000807470280000441
Figure BDA0000807470280000451
实施例11：用于其中存在来自甲基杆菌种和S.usitatus的两个不同胶原蛋白状成 分的不同细菌胶原蛋白链的嵌合体的DNA
从国家生物技术信息中心数据库(National institutes of Health，Bethesda,MD 20894,美国)中提供的数据获得来自Candidatus Solibacter usitatus Ellin6076和甲基杆菌种的含三螺旋重复序列的胶原蛋白的DNA序列，S.usitatus作为记录ABJ82342而甲基杆菌作为记录ACA18713.1。
将蛋白序列翻译成标称DNA序列，且设计维持正确编码构架的复合基因，其中Met启动信号为接着是来自甲基杆菌的V和CL结构域，继而为来自S.usitatus的CL结构域，最后为终止密码子。为5'以NdeI和EcoRI形式添加编码序列外的末端限制位点，而为3’以SalI和HindIII形式添加。此构建体随后就宿主系统中的表达而进行优化，且与在使所需宿主系统大肠杆菌的表达达到最佳的同时保留原氨基酸序列的DNA序列一起合成(
Figure BDA0000807470280000453
GeneSynthesis,Regensburg,Germany)。
最终序列以SEQ ID No:42描述。
DNA序列：SEQ ID NO 42和43
Figure BDA0000807470280000452
Figure BDA0000807470280000461
实施例12-17描述若干不同构建体的不同表达宿主细胞系统。
实施例12：三螺旋蛋白的DNA构建体的表达.
前述例如SEQ ID No:2、6、14、20、21的DNA构建体中的任一者可克隆入大肠杆菌中且根据以下方法制得为表达三螺旋蛋白。
使用独特位点5'NdeI和3'BamHI来将DNA序列亚克隆入大肠杆菌表达载体系统pColdIII中。随后使用PCR菌落筛选技术来检测阳性克隆。这些克隆在100ml培养体积中生长，且进行Qiagen中量制备以扩展载体数量。对表达而言，将所选择的阳性克隆转化入大肠杆菌宿主BL21-DE3中。在每升含有16g胰化蛋白、10g酵母提取物和5g NaCl的2x YT培养基中生长细胞(也可在一些情况下使用限定培养基，诸如与SEQ ID No 2一起)。所用的限定培养基(DM)每升含有：KH2PO4，10.6g；(NH4)2HPO4，4g；柠檬酸，1.7g；葡萄糖，25g；MgSO4.7H2O，1.23g；安比西林(50μg/ml)，200mg；盐酸硫胺，4.4mg；以及痕量盐溶液5mL。痕量盐溶液每升含有：CuSO4.5H2O，2.0g；NaI，0.08g；MnSO4.H2O，3.0g；Na2MoO4.2H2O，0.2g；硼酸，0..02g；CoCl2.6H2O，0.5g；ZnCl2，7g；FeSO4.7H2O，22g；CaSO4.2H2O，0.5g和H2SO4，1mL。视需要，葡萄糖、镁、痕量盐、硫胺和安比西林在灭菌之后以浓储备溶液的形式无菌地添加至培养基中。
在37℃下生长细胞24小时，且A600处的细胞培养光学密度达到约3-6。培养物随后在25℃下孵育，且添加1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以诱导蛋白表达。在25℃下孵育10小时之后，将温度降低至15℃，再孵育14小时。在孵育24小时之后，通过离心采集细胞。
对于CB3片段的SEQ ID No:31构建体，表达后，将细胞在4℃下保持14小时，且也在4℃(而非15℃)下进行所有后续加工。
实施例13：使用大肠杆菌中的pET载体、来自S.usitatus的细菌胶原蛋白片段与来 自沼泽红假单胞菌的V结构域的三螺旋蛋白的DNA构建体的表达
如实施例6中所描述取得DNA。复合基因使用5'EcoRI和3’HindIII位点克隆入pET21a载体中。在转化入有效大肠杆菌宿主细胞系BL21DE3之前进行克隆的定序。转化的细胞接种在YT外加安比西林培养板上且在37℃下生长过夜。从这个培养板选取单一菌落，且在YT外加安比西林培养基中于37℃下生长过夜。
在连接至Biostat B(Sartorius Stedim Germany)控制系统的2L搅伴槽生物反应器中产生重组细菌胶原蛋白。发酵槽中的培养基的初始体积为1.6L，且使用葡萄糖作为碳来源。向生物反应器中添加一定体积的第二接种培养物以获得初始光学密度0.25(在600nm处测量)。借助于自动添加10％(v/v)聚丙二醇2025来控制发泡；在接种之前添加3mL消泡剂溶液。pH值设定点为7.0，通过自动添加10％(v/v)H3PO4或10％(v/v)NH3溶液来控制。溶解氧设定点为饱和的20％，且使用两步级联控制来将溶解氧维持在指定设定点以上。搅拌器速度介于500rpm至1200rpm的范围内，而气流(补充有5％纯O2)介于0.3L/min至1.5L/min的范围内。对高细胞密度补料分批工艺而言，进料溶液由其中添加有40mL 1M MgSO47H2O的400mL660g/L葡萄糖溶液组成。进料流速为15mL/小时，且在接种8.5小时之后开始进料。个别实验的孵育时间和温度根据构建体、宿主细胞系统以及其他情况而变化。在接种24小时之后，将培养物冷却(经20分钟时间段)至必需温度以活化载体的冷休克成分和通过添加1mM IPTG(培养物中的最终浓度)来诱导的蛋白质表达。随后通过离心采集细胞。
实施例14：使用大肠杆菌中的pCold载体、锯蜂丝胶原蛋白的三螺旋蛋白的DNA构 建体的表达
在SEQ ID No:23的锯蜂DNA分离物中引入限制酶消化位点允许分离锯蜂丝基因的DNA和将其插入表达载体中。锯蜂胶原蛋白状丝A型基因经由NdeI和EcoRI位点插入在pColdl载体中。使用PCR菌落筛选技术来检测阳性克隆。这些克隆在100ml培养体积中生长，且进行Qiagen中量制备以扩展载体数量。对表达而言，将所选择的阳性克隆转化至有效大肠杆菌BL21细胞中。对锯蜂丝蛋白基因的表达而言，向100ml启动培养基(2x YT-Amp)中添加一个细胞菌落，且在37℃下在200rpm振动的情况下孵育过夜。此培养随后添加有100ml新制2x YT-2％Glucose-Amp，且用1mM IPTG在25℃下诱导10小时，随后在20℃再持续16小时。通过离心(3000x g持续30分钟)采集细胞浆。蛋白质与细胞小球缔合。
实施例15：来自啤酒酵母中III型胶原蛋白的片段重复的三螺旋蛋白的DNA构建体 的表达
使用诸如实施例8中的DNA/载体(YepFlagl)，通过在啤酒酵母菌株BJ5462(αura3-52trpl leu2_l his3_200pep4::HIS3prb_1.6R)(Yeast Genetic Stock Center,Berkeley,CA)中电穿孔来进行酵母转化，其中DNA构建体包含α因子信号α前导序列/FLAG标签/三个重复胶原蛋白III片段的框架内融合体。将转化体在充气的情况下于28℃下在SDahl加Ura培养基上生长48小时。在选择之后，将部分在非选择性YPHSM培养基(1％右旋糖、1％酵母提取物、8％蛋白胨、3％甘油、20mM CaCl2)中稀释且在28℃下在剧烈振荡下继续生长96小时。通过在12,000x g下离心20分钟来移除细胞小球。FLAG的存在提供用于蛋白质鉴别的选项。
人类胶原蛋白I型和III型链的DNA构建体的表达可按照相同方法。
实施例16：使用毕赤酵母、来自S.usitatus的细菌胶原蛋白片段与来自沼泽红假 单胞菌的V结构域的三螺旋蛋白的DNA构建体的表达
如实施例6中所描述制备细菌胶原蛋白基因。任选地，基因可进一步就毕赤酵母表达而优化。基因构建体在大肠杆菌中组装。
在适当载体系统pA0815HIS4中结合胶原蛋白基因构建体，以允许使基因构建体染色体整合至酵母宿主细胞巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中。任选地可使用其他载体系统，诸如pA0815-SX HIS4、pPIC9HIS4、pPICZ ZeoR、pPICZa ZeoR、pBLADE-IX ADEI、pBLARG-IXARG4、pBLARG-SX ARG4或pBLURA URA3。系统的特征在于其中存在强构成性启动子(GAP)和强诱导性启动子(优选AOXI-醇氧化酶)的甲基营养型表达。添加可用作单独碳来源的甲醇允许简单完全诱导。此系统使用插入基因的染色体整合，消除在发酵期间连续选择(例如抗生素)的需要。将包括胶原蛋白基因的载体pA0815与BamHI一起线性化。线性化质粒通过电穿孔转化至巴斯德毕赤酵母中。各种毕赤酵母菌株(包括GSI15his4)为合适的。转化体选择为用于表达胶原蛋白构建体的His+细胞。在摇瓶中在pH值为5.0的具有甘油的基底盐培养基中生长所选择的细胞。当获得适当的湿细胞密度时，添加甲醇且再继续发酵72小时。
实施例17：使用烟草(Nicotinia)种中的短暂表达、来自S.usitatus的细菌胶原蛋 白片段与来自沼泽红假单胞菌的V结构域的三螺旋蛋白的DNA构建体的表达
使用如实施例4中所描述的编码来自S.usitatus的细菌胶原蛋白C L结构域和来自沼泽红假单胞菌的V结构域的合成基因，除了序列经优化以用于在烟草种中表达和引入用于5'AgeI和3'XhoI的限制位点之外。基因经PCR扩增并克隆入pENTR DTOPO中。随后确认序列的完整性。pENTR DTOPO构建体经BspHI消化且经纯化以移除卡那霉素抗性基因，因此允许在基因经LR clonase重组入二元pEA Q-HT-DEST GATEWAY目标载体中之后进行卡那霉素的适当选择(S ainsbury等人(2009)Plant Biotechnol J 7(7):682-93)。二元质粒转化至根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)菌株LBA4404中且维持在其中。构建体在含有适当抗生素的LB培养基中生长，直至达到生长停滞期。离心培养物，且将小球重悬于包含10mM MES、10mM MgCl2、20mM乙酰丁香酮的渗透培养基中直至OD 600为0.5。在黑暗中于室温下孵育培养物4小时，随后用注射器渗透至生长至五叶阶段的本生烟草(Nicotiana b enthamiana)中(Sainsbury等人(2009)Plant Biotechnol J 7(7):682-93)。在渗透5天后采集叶片。
实施例18-32描述如图1的流程图中所示的本发明的纯化步骤。
实施例18：使用声波处理从细菌细胞大肠杆菌提取三螺旋蛋白
对提取而言，将来源于例如上文的实施例12-17的各1克细胞浆重悬于20ml 50mM乙酸/HCl缓冲剂(pH2)中，并且使用Misonix S4000仪器，用增强型辅助(EnhanceBooster)#1探针，在30A(仪器标度)处，通过声波处理持续5分钟来使细胞破裂。任选地，通过离心(12,000x g持续60分钟)来使细胞裂解混合物澄清，并且保留含有三螺旋蛋白的透明上清液。
实施例19：使用弗式压碎器从细菌细胞大肠杆菌提取三螺旋蛋白
将来源于例如实施例12-17的冷冻细胞浆解冻且以1:10w/w与50mM乙酸混合(pH2)。使此混合物在700巴压力下穿过Apv2000弗氏压碎匀浆器3次，在轮次之间另外冷却1小时时间段。在加工之后，任选地通过在12,000x g下离心60分钟来澄清浆液，并且保留含有经提取的三螺旋蛋白的透明上清液。
实施例20：从酵母细胞酿酒酵母提取三螺旋蛋白
将从酵母表达系统中的任一个获得的细胞浆以每20ml断裂缓冲剂1g细胞浆的比率重悬于所述缓冲剂(50mM磷酸钠缓冲剂pH7.4、0.5mM EDTA、2mM PMSF、5％甘油、0.1％Triton X-100)中，并且添加相等体积的玻璃珠(Sigma Glass beads#G8772)。随后将混合物涡旋(1400rpm)混合物30秒，再静置30秒。再重复涡旋10x次。整个提取过程均保持在5℃下。随后在10,000x g下离心混合物1分钟以收集可溶性提取物。
实施例21：从烟草种的植物叶片提取三螺旋蛋白
将诸如来自实施例17(优选已在-20℃下冷冻)的叶片材料以叶片与缓冲剂1:10w/w的比放入20mM乙酸钠缓冲剂(pH4.5)中，且全速在瓦林掺混器(Waring Blender)中提取。
实施例22：在表达和分泌或提取之后验证可溶性三螺旋蛋白
通过离心细胞物质、接着进行SDS-PAGE来确立在诸如实施例12-17中的表达和诸如实施例18-21中的提取后的可溶性三螺旋蛋白或如在实施例16中表达为可溶性产物的三螺旋蛋白的存在。如果在用于表达的构建体上存在任何标签(诸如His6标签或Flag标签)，则蛋白印迹法可与适当抗体(诸如与辣根过氧化酶结合的单克隆抗聚组氨酸抗体)一起使用来检测可溶性蛋白质。
实施例23：选择用于沉淀细胞提取物的pH值
如在实施例18-19中那样，以机械方式提取表达宿主细胞，且在所选择的介于pH2与pH8之间的pH值下孵育提取物。随后任选地移除细胞碎片物质。随后将经提取的细胞裂解液的样品调节至沉淀pH值(其中以1pH单位间隔或优选地以0.5pH单位间隔选择各种pH值)，且将样品在4℃下保持16小时。随后通过离心移除沉淀，且通过在280nm处的吸光度估计上清液的蛋白质含量。如在实施例22中那样，再次确认三螺旋构建体的可溶性的保持。
实施例24：在保留可溶性三螺旋蛋白的同时沉淀来自大肠杆菌的表达细胞宿主蛋 白
如实施例1中那样，含有来自化脓性链球菌的可溶性胶原蛋白状蛋白的来自大肠杆菌的提取蛋白在通过离心提取之后澄清，调节至pH2.2，在4℃下放置16小时以允许沉淀。随后以15,000x g离心样品30分钟，且保留含有三螺旋蛋白的上清液。
实施例25：在保留来自人类III型胶原蛋白重复片段的可溶性三螺旋蛋白的同时 沉淀来自酿酒酵母的表达细胞宿主蛋白
使用乙酸或NaOH溶液将含有可溶性三螺旋蛋白的澄清上清液调节至pH5.0，且在4℃下放置16小时。通过离心(10,000x g持续30分钟)移除所得沉淀，且保留上清液。
实施例26：在保留来自S.usitatus的可溶性三螺旋蛋白的同时沉淀来自烟草种的 表达细胞宿主蛋白
使用乙酸或NaOH溶液将含有可溶性三螺旋蛋白的澄清上清液调节至pH4.5，且在4℃下放置16小时。通过离心(10,000x g持续30分钟)移除所得沉淀。随后用乙酸和HCl调节上清液至pH2.5，且再放置20小时。通过离心(10,000x g持续30分钟)来澄清溶液，且保留上清液。
实施例27：消化沉淀后残余的可溶性宿主细胞污染物
根据以下条件中的任一个调节诸如上述实验中的在移除酸性沉淀的蛋白质之后所获得的上清液。
·pH2.5，且用胃蛋白酶(0.01mg/ml)在4℃下持续16小时，随后任选地通过将消化液的pH值调节至pH7来终止。
·pH6.5和Na EDTA(50mM)和半胱氨酸(50mM)，用木瓜蛋白酶(0.01mg/ml)在4℃和pH3.0下持续16小时，且用真菌酸性蛋白酶XIII型(0.01mg/ml)在4℃下持续16小时，且随后任选地通过将消化液的pH值调节至pH7来终止。pH8.0，且添加胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶都为0.01mg/ml，在4℃持续16小时，且随后任选地通过将消化液的pH值调节至pH4来终止。
以下实施例按照本发明的纯化步骤且涉及蛋白质的收集、浓缩和可能的最终精制和纯化。
实施例28：通过硫酸铵沉淀来分离三螺旋蛋白产物
将如先前实施例中所论述通过酸性沉淀移除杂质、接着进行蛋白酶处理之后的含有重组三螺旋蛋白的级分合并，并且将溶液的pH值调节至pH4.0至7.0，并经由添加固体硫酸铵来沉淀三螺旋蛋白。所有步骤均在小于三螺旋的熔化温度的温度下，优选在4℃下进行。在沉淀必需的固体硫酸铵量之后离心样品，视觉检查沉淀情况，并通过SDS-PAGE分析。对较小非动物胶原蛋白(诸如来自化脓性链球菌)，需要35％饱和硫酸铵。
实施例29：通过聚合物沉淀来分离三螺旋蛋白产物
将如先前实验中所论述通过酸性沉淀移除杂质、接着进行蛋白酶处理之后的含有重组三螺旋蛋白的级分合并，并且将溶液的pH值调节至pH7.0±1.0，并经由添加来自40％水性储备溶液的聚乙二醇-4000来沉淀三螺旋蛋白。所有步骤均在小于三螺旋的熔化温度的温度下，优选在4℃下进行。在沉淀必需的聚乙二醇量之后离心样品，视觉检查沉淀情况，并通过SDS-PAGE分析。对较小非动物胶原蛋白(诸如来自化脓性链球菌)，需要10％w/v聚乙二醇-4000。
所获得的蛋白质的纯度显示在图3中。
实施例30：通过超过滤来分离三螺旋蛋白产物
将如先前实施例中所论述通过酸性沉淀移除杂质、接着进行蛋白酶处理之后的含有重组三螺旋蛋白的级分合并，随后浓缩并使用10kDa交叉流过滤膜设备(Pall LifeSciences)交换至20mM磷酸钠缓冲剂(pH8.0)中。所有步骤均在小于三螺旋的熔化温度的温度下，优选在4℃下进行。
实施例31：通过吸收来分离三螺旋蛋白产物
将如先前实施例中所论述通过酸性沉淀移除杂质、接着进行蛋白酶处理之后的含有重组三螺旋蛋白的级分合并，并且用Tris将溶液的pH值调节至pH8.0±0.5。对来自化脓性链球菌的三螺旋蛋白而言，随后将合并的样品吸收到在50mM Tris/HCl缓冲剂(pH8.0)中预平衡的Mono-Q管柱(GE HealthCare)上，所述管柱具有作为带电基团的-CH2-N+(CH3)3。在加料之后，用5管柱体积的平衡缓冲剂洗涤管柱，且随后通过相同缓冲剂中从0至1M的线性NaCl梯度洗脱。通过214nm处的吸收来检测蛋白质，且通过SDS-PAGE确认。
以下实施例说明经纯化的三螺旋蛋白可如何用于临床应用中。
实施例32：制造—制备用于体内应用的细菌胶原蛋白状样品
如果经纯化的胶原蛋白要用作生物医学材料，那么它们最有可能需要使用本领域技术人员已知的方法进一步“精制”。蛋白质还可能需要在用于医学应用中之前稳定化，如动物胶原蛋白的情况。
在此实施例中，通过冷冻干燥化脓性链球菌胶原蛋白(由戊二醛蒸气在封闭式容器中于20℃下稳定化18小时)来制备海绵。此方法得到在>37℃下稳定的蛋白质海绵。收缩温度的增加取决于稳定化的程度，但可获得至多～25C的额外稳定性。通过差示扫描量热法(DSC)，使用PBS中的样品检测稳定化样品的热稳定性。
为评估细胞附接，用MEM中的120μg/ml青霉素和200μg/ml链霉素处理经PBS洗涤的稳定化CL样品2小时，且随后与每样品1x 104L929细胞一起接种于96孔培养板中补充有1％NEAA和10％FCS的MEM中。在用PBS冲洗样品两次之后3小时和16小时时评估附接。在37℃下16小时之后用
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活力/细胞毒性试剂盒(Molecular Probes)分析来测试细胞活力。
这些数据显示胶原蛋白海绵材料为较小纤维与更大聚集体的混合物。在3小时时可见L929细胞与较小纤维和聚集体两者的良好附接。在16小时之后，L929细胞在Live/DeadTM分析中显示极佳活力。此时铺展程度非常有限，符合“空白石板”观察结果。GA稳定化的基质具有少量自体荧光(图4)。
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Claims (23)

1.一种用于纯化其中三螺旋蛋白分泌至培养基中的在非哺乳动物宿主细胞培养提取物或通过宿主细胞破裂以释放宿主细胞保留的蛋白而制备的宿主细胞培养匀浆物内含有的重组表达三螺旋蛋白的方法，所述方法包括：
(i)在pH小于7的酸性条件下和在低于所述三螺旋蛋白的熔化温度的温度下从三螺旋蛋白中沉淀出存在于所述宿主细胞培养提取物或匀浆物中的宿主细胞物质；接着
(ii)通过添加在所述酸性条件下有功能的蛋白酶来消化沉淀后的宿主细胞培养提取物或匀浆物中的残余的可溶性宿主细胞物质，其中所述三螺旋蛋白对消化具有抗性；以及
(iii)收集所述经纯化的三螺旋蛋白；
其中所述三螺旋蛋白是胶原蛋白或胶原蛋白状蛋白；其中所述三螺旋蛋白在至少步骤(i)和(ii)中均保持可溶；并且其中所述三螺旋蛋白包含重复(Gly-X-Y)n基序，其中n在5与600之间，并且X和Y独立地为任何天然或非天然亚氨基或氨基酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述三螺旋蛋白在步骤(i)至(iii)中均保持可溶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述消化使用酸性蛋白酶来进行。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白酶选自由以下组成的组：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、奇异果蛋白酶、佐氏曲霉酸性蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸性条件是指pH值小于7。
6.根据权利要求1所述的方法，还包括通过将培养提取物或匀浆物的pH值调节至中性pH值来终止消化。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞为细菌、酵母或植物宿主细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其在所述沉淀步骤与所述消化步骤之间还包括额外的中间分离步骤，所述分离步骤以物理方式从经沉淀的宿主细胞物质分离所述三螺旋蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述额外的中间分离步骤选自离心、过滤、交叉流过滤或沉降中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达的三螺旋蛋白在所述宿主细胞内以细胞内方式产生。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达的三螺旋蛋白是从所述宿主细胞分泌的。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在低于所述三螺旋蛋白的熔化温度(Tm)的温度下进行。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述温度比所述三螺旋蛋白的Tm低至少10℃。
14.根据权利要求5所述的方法，其中所述pH值在2与4之间并且所述宿主细胞为细菌宿主细胞。
15.根据权利要求5所述的方法，其中所述pH值在4与6之间并且所述宿主细胞为酵母宿主细胞。
16.根据权利要求5所述的方法，其中所述pH值在2与4.5之间并且所述宿主细胞为植物宿主细胞。
17.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法相比于对蛋白水解不稳定的蛋白质，选择性地纯化对蛋白水解稳定的三螺旋蛋白质。
18.根据权利要求1所述的方法，其中从所述收集的三螺旋蛋白移除宿主细胞核酸。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述收集还包括通过渗滤或沉淀浓缩所述三螺旋蛋白。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述三螺旋蛋白的沉淀通过添加硫酸铵、通过调节pH值或调节温度和/或通过使用聚合物来达到。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述聚合物为聚乙二醇。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述收集的三螺旋蛋白通过用于交联所述三螺旋蛋白的稳定剂而稳定化。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述三螺旋蛋白序列来源于细菌、酵母、植物或昆虫。
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