JP2006345831A

JP2006345831A - Ｄｎａ、ベクター、形質転換体、及びａｐａタンパク質の製造方法

Info

Publication number: JP2006345831A
Application number: JP2005179766A
Authority: JP
Inventors: Eihiko Mizutani; 栄彦水谷
Original assignee: P LAP KK; P-LAP KK
Current assignee: P LAP KK; P-LAP KK
Priority date: 2005-06-20
Filing date: 2005-06-20
Publication date: 2006-12-28
Also published as: WO2006137209A1; EP1916299A1; EP1916299A4; US20080213838A1

Abstract

【課題】従来の方法と比較して効率良く大量にヒトＡＰＡタンパク質を回収可能な製造方法、ならびにヒトＡＰＡタンパク質の製造時に必要とされるヒトＡＰＡ組換タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだベクター、及び該ベクターを保持する形質転換体を提供する。
【解決手段】ヒトＡＰＡタンパク質の活性部位（ヒトＡＰＡタンパク質において、妊娠中毒症の治療等に有効な部分）を大量に且つ容易に回収すべく、Ｎ末端から７１番目までのアミノ酸配列を、ヒトトリプシンIIの特定の配列やヒトＡ−ＬＡＰのシグナルペプチドに置換したヒトＡＰＡ組換タンパク質（以下、分泌型ＡＰＡと称す）を培養する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトＡＰＡタンパク質を効率良く作成するための方法、ならびにヒトＡＰＡタンパク質の作成時に必要とされるヒトＡＰＡ組換タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだベクター、及び該ベクターを保持する形質転換体に関するものである。

従来より、妊娠中毒症の治療に効果的であると予測されている有効成分として、ヒトＡＰＡタンパク質が知られている。該ヒトＡＰＡタンパク質は、ヒト胎盤から回収することができる。しかしながら、そもそもヒト胎盤からの回収といった作業自体が困難である上、ヒト胎盤内においても非常に僅かな量しか含まれていないため、その回収量にしても非常に微量でしかない。すなわち、自然界において極めて回収困難なタンパク質であると言える。そこで、遺伝子組み換え型ヒトＡＰＡタンパク質を培養によって回収しようとする研究が行われており、その一例として非特許文献１に記載されているように、ハムスターの細胞を用いてヒトＡＰＡタンパク質を培養・回収するといった方法が公知となっている。
このようなハムスターの細胞を用いてヒトＡＰＡタンパク質を培養した場合、培養液３００ミリリットルに対して、０．０６ｍｇのヒトＡＰＡタンパク質を回収することができる。

Gilles VAZEUX, Sherwin WILK, Elizabeth WILK, Pierre CORVOL and Catherine LLORENS-CORTES、"Production and properties of a recombinant soluble form of aminopeptidase A"、Eur.J.Biochem.、1998年、254、P.671-678

しかしながら、依然回収率が低く、種々の実験に必要な量さえも容易に得難い状況であり、より効率良く大量に回収することができるヒトＡＰＡタンパク質の製造方法が希求されている。

そこで、本発明は、従来の方法と比較して効率良く大量にヒトＡＰＡタンパク質を回収可能な製造方法、ならびにヒトＡＰＡタンパク質の製造時に必要とされるヒトＡＰＡ組換タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだベクター、及び該ベクターを保持する形質転換体を提供しようとするものである。

請求項１に記載の発明は、配列番号１又は２に示されるヒトＡＰＡ組換タンパク質をコードするＤＮＡである。
請求項２に記載の発明は、配列番号１又は２に示されるヒトＡＰＡ組換タンパク質をコードするＤＮＡを含んだＤＮＡである。
請求項３に記載の発明は、配列番号１又は２に示されるヒトＡＰＡ組換タンパク質をコードするＤＮＡに対しその一部が置換、欠失、挿入されたＤＮＡである。
請求項４に記載の発明は、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡを組み込んだベクターである。
請求項５に記載の発明は、請求項４に記載のベクターを保持する形質転換体である。
請求項６に記載の発明は、昆虫細胞であることを特徴とする請求項５に記載の形質転換体である。
請求項７に記載の発明は、請求項５又は６に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収することを含むヒトＡＰＡタンパク質の作成方法である。

本発明によれば、Ｎ末端から７１個のアミノ酸を、配列番号１又は２に示されるようなＤＮＡから転写・翻訳される配列番号３（配列番号１に対応）又は４（配列番号２に対応）で示されるようなシグナルペプチドに置換することにより、本来の細胞膜結合型から細胞外分泌型へと変化させることになる。したがって、ヒトＡＰＡ組換タンパク質の発現率が極めて高くなる上、従来と比較して、ヒトＡＰＡタンパク質（活性部位）を非常に効率良く且つ大量に回収することができる。
また、上記ヒトＡＰＡ組換タンパク質を、昆虫細胞を利用したバキュロウイルス発現系を利用して培養することにより、培養液３リットルに対して１０ｍｇ〜３０ｍｇ（従来の１０倍以上）のヒトＡＰＡタンパク質の活性部位を回収することができる。

以下、本発明の一実施形態となるヒトＡＰＡタンパク質の製造方法、ならびにヒトＡＰＡタンパク質の製造時に必要とされるヒトＡＰＡ組換タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだベクター、及び該ベクターを保持する形質転換体ついて説明する。

本発明者は、ヒトＡＰＡタンパク質の活性部位（ヒトＡＰＡタンパク質において、妊娠中毒症の治療等に有効な部分）を大量に且つ容易に回収するためには、Ｎ末端から７１番目までのアミノ酸配列を、配列番号３に示すヒトトリプシンIIや配列番号４に示すヒトＡ−ＬＡＰのシグナルペプチドに置換したヒトＡＰＡ組換タンパク質（以下、分泌型ＡＰＡと称す）を培養させればよいことを見出した。

また、該分泌型ＡＰＡの培養にあたって、たとえば蚕細胞といった昆虫細胞を利用することにより、非常に容易に且つ大量に分泌型ＡＰＡを発現することができることも見出した。尚、上記シグナルペプチドはタンパク質合成後、細胞内の分泌経路へと移行した際に速やかに切断されるため活性部位のみを容易に回収することができる。

そこで、このような分泌型ＡＰＡを用い、昆虫細胞を利用して培養するヒトＡＰＡタンパク質（活性部位）の製造方法について以下に詳述する。尚、上記分泌型ＤＮＡのうち、ヒトトリプシンIIのシグナルペプチドに置換するもの（配列番号１で示す）を用いた製造方法について以下に詳述するが、ヒトＡ−ＬＡＰのシグナルペプチドに置換するもの（配列番号２で示す）を用いた製造方法についても略同様の方法となる。

（ａ）分泌型ＡＰＡをコードするｃＤＮＡの増幅、及びトランスファーベクターの構築
分泌型ＡＰＡをコードするｃＤＮＡの構築は、天然に存在するヒトＡＰＡタンパク質をコードするｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法にて行った。ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）とは、DNA Polymeraseの反応を連続的且つ連鎖的に実行することにより、１セットのprimerの間に挟まれるＤＮＡ断片を特異的に増幅する反応である。

ここでは、ロブスターのトロポミオシンの前駆配列（AACTCCTAAAAAACCGCCACC）からヒトトリプシンIIシグナル配列（MNLLLILTFVAAAVAA）へと続き、さらにヒトＡＰＡのAla⁷²-Asp⁷⁶をコードするセンス鎖プライマーからヒトＡＰＡのLeu⁹⁵³-Gly⁹⁵⁷、そして６個のヒスチジン残基、終止コドンとなるようにコードすべく設計したアンチセンス鎖プライマーを用いる。そして、該アンチセンス鎖プライマーを、９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で３分を１サイクルとした過程を３０サイクル繰り返して、目的とするＤＮＡ断片を増幅した。増幅後のＤＮＡ断片は、アガロースゲルを用いた電気泳動にて分離し、目的のＤＮＡ断片を、ゲルから従来の方法により回収・精製する。

その後、インビトロジェン社のpENTR-/D-TOPOクローニングキットにて、精製されたＤＮＡ断片をpENTRプラスミドへと組み込む。さらに、インビトロジェン社Geteway LRクロナーゼによって、分泌型ＡＰＡのｃＤＮＡをバキュロウイルスへのトランスファーベクターであるpDEST8（インビトロジェン社）へと組み込む。
以上のようにして、分泌型ＡＰＡをコードするｃＤＮＡの増幅、及びトランスファーベクターの構築を行う。

（ｂ）分泌型ＡＰＡ発現バキュロウイルスの作製
大腸菌は原核生物であるため、動物等の真核生物由来の発現系を用いてタンパク質（たとえば、ヒトＡＰＡタンパク質）を発現させると、正しいフォールディングを取れないといった事態が多々発生する。そこで、真核細胞を用いた大量発現系として、バキュロウイルス−昆虫細胞系に注目した。バキュロウイルス発現系は、哺乳動物細胞系と比べると非常に安価である上、培養に係る作業等も煩わしくなく、使い勝手が非常に良い。また、目的とするタンパク質を大量に且つ本来の生物学的性質を保持した状態で発現させることができるといった特性を備えている。

該バキュロウイルス発現系において、たとえば、リコンビナントタンパク質の分野でバキュロウイルと言えば、核多角体病ウイルス（Nuclear Polyhedorosis Virus : NPV）と呼ばれる昆虫の二本鎖ＤＮＡウイルスのことである。そして、このグループのウイルスは、感染細胞の核内にポリヘドリンと呼ばれるタンパク質からなる多角体と呼ばれる封入体を大量に作るという特徴を備えている。そこで、このポリヘドン遺伝子の非常に強力なプロモーターを利用して昆虫細胞内でリコンビナントタンパク質の合成を行わせるのが、バキュロウイルス発現系である。

このようなバキュロウイルス発現系として、現在一般的に用いられているものは、ベクターとして夜蛾科のバキュロウイルスAutographa californica NPV（AcNPV）を、感染細胞として同じく夜蛾科のSpodoptera Frugiperdaの幼虫由来のSf9を用いたシステムである。他にも、カイコ(Bombix mori）の核多角体病ウイルスBmNPVを用いたシステムも日本で開発されている。後者のカイコを利用したシステムは、高価な血清を含む培地を使用した大容量の培養を行わなくても、組換え体ウイルスをカイコの幼虫に直接接種することによって大量に産物を得ることができるという利点がある。尚、半眼発明にあたっては、どちらのシステムであっても適用可能であり、特に限定することはない。

さらに、組換え型ウイルスの作製について説明する。バキュロウイルスの遺伝子は１３０ｋｂもあるため、発現させたい遺伝子をポリヘドリンプロモーターの下流に直接挿入することは、一般的な試験管内で行うＤＮＡ操作では不可能である。しかしながら、インビトロジェン社のBac-to-Bacシステムを利用することで簡便かつ迅速に組換えウィルスを作製することが可能である。すなわち、上述の如く、目的のＤＮＡ断片を一旦トランスファーベクターと称されるプラスミドに組み込んだ後、大腸菌DH10Bac（インビトロジェン社）へと導入し、分泌型ＡＰＡのｃＤＮＡを含むバクミドＤＮＡを作製した。

Bac-to-Bacシステムでは、まず発現させたい遺伝子を大腸菌のトランスポゾン Tn7の両末端の配列を持つドナープラスミドに組み込み、これをTn7のターゲットサイトと大腸菌での複製起点を組み込んだバキュロウイルスＤＮＡ(バキュロウイルスシャトルベクター=バクミド)を持つ大腸菌DH10Bacに導入する。この菌にはトランスポザーゼを発現するヘルパープラスミドも導入してあり、菌体内でドナープラスミドの目的遺伝子を含む領域がトランスポザーゼの働きによってバクミドへと転移し、組換え型バクミドを得ることができる。バクミドは、大腸菌から精製して昆虫細胞にトランスフェクションすれば、昆虫細胞内でウイルスが作製される。この方法では、ウイルスＤＮＡへの外来遺伝子の挿入を大腸菌内で行なうため、時間が短縮できることと、この段階でウイルスのクローン化されていることになり非組換え型ウイルスを除き目的のウイルスのみにする操作（純化）が必要ない、といった利点を有している。

このようにして得られたヒト分泌型ＡＰＡのバクミドＤＮＡを、Cellfection試薬試薬（インビトロジェン社）にてSf9細胞へと導入した後、同細胞を２７℃、３日間培養を行ってウイルスの作製を行った。その後、培養上清中に分泌されたウイルスの回収を行い、２度の増幅を行って、高力価のウイルス液を作製した。
以上のようにして、分泌型ＡＰＡ発現バキュロウイルスの作製を行う。

（ｃ）ヒトＡＰＡタンパク質の発現
上述の悟得して得られた組換え型ウイルスをスケールアップして増大させ、高タイターのウイルスストックを得る。該スケールアップの際、あまり継代数を多くすると変異株が出現して発現効率が低下するため、６代以上は継代しない方がよい。また、得たウイルスストックは−８０℃で半永久的に保存可能であるが、凍結融解によりタイターが下がる。したがって、４℃でも２年程度であれば保存可能であるため、使用分にあたっては凍結しない方がよい。

効率の良くタンパク質を発現させるためには、１細胞あたりに出来るだけ多くのウイルスを感染させることが必要である。そこで、ＭＯＩ（Multiphcity of Infection）を５〜１０程度とする。また、細胞の密度が非常に高くなってから感染させるよりも、対数増殖機にある状態で感染させるようにする。分泌ＡＰＡの発現は、感染後４８〜７２時間でピークになるのが一般的であるが、一応タイムコースをとって観察する。

本実施の形態では、Sf9細胞を、酵素濃度８ｐｐｍとなるように制御可能な３リットルのスピナーフラスコを用いて無血清培地SFM900II（インビトロジェン社）中、２７℃の条件のもとで培養する。そして、細胞濃度が１．５×１０⁶細胞／ｍＬまで達した後、上述の如く作製した高力価ウイルス液をウイルスと細胞との比が略１０：１（ＭＯＩ＝１０）となるように添加してウイルス感染を行う。さらに、ウイルス感染後３日間培養を続け、タンパク質の発現を行う。
以上のようにして、ヒトＡＰＡタンパク質の発現を行う。

（ｄ）ヒトＡＰＡタンパク質の精製
上記３リットルの培養液を回収し、遠心分離機によって細胞と培養上清とを分離する。また、分離されたヒトＡＰＡタンパク質を含む細胞培養上清を、４℃、３６時間、５０ｍＭの条件のもとTris-HCL溶液（pH8.0）にて透析する。尚、透析後の試料としては、一般的にaffinity chromatographyが用いられている。

そして、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥトーヨーパール：東ソー社）により精製した後、コバルトイオンを用いた金属キレートカラムクロマトグラフィー（キレーティングセファロース：アマシャムバイオサイエンス社）によって精製して、ヒトＡＰＡタンパク質を得た。さらに必要な場合はゲルろ過カラムクロマトグラフィーや疎水性クロマトグラフィーなど一般的なカラムクロマトグラフィーを用いて精製可能である。
以上のようにして、ヒトＡＰＡタンパク質の精製を行う。

このようなヒトＡＰＡタンパク質の製造方法によれば、真核生物である昆虫細胞を用いたバキュロウイルス発現系を利用しているため、真核生物由来のタンパク質の場合でも、多くの場合正しいフォールディングをとっていると考えられる産物が得られ、ジスルフィド結合も天然型と同じ様に形成される。また、大腸菌では無理な翻訳後の修飾も期待でき、発現産物のリン酸化、脂肪酸の付加が起こる。さらに、シグナルペプチドは正しく認識切断され分泌も起こる。尚、糖鎖の付加については、Asn結合型糖鎖は、複合型までプロセッシングは進まず、高マンノース型の糖鎖となり、Tkm/Ser結合型糖鎖は付加されないと言われている。そのため、バキュロウイルスの系で発現されたタンパク質は、天然型に比べて若干(糖鎖部分の)分子量が小さくなる傾向があり、天然型よりも結晶化に向く。

さらに、培養液３リットルに対して１０ｍｇ〜３０ｍｇ（従来の１０倍以上）のヒトＡＰＡタンパク質（活性部位）を回収することができる。

Claims

配列番号１又は２に示されるヒトＡＰＡ組換タンパク質をコードするＤＮＡ。
配列番号１又は２に示されるヒトＡＰＡ組換タンパク質をコードするＤＮＡを含んだＤＮＡ。
配列番号１又は２に示されるヒトＡＰＡ組換タンパク質をコードするＤＮＡに対しその一部が置換、欠失、挿入されたＤＮＡ。
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
請求項４に記載のベクターを保持する形質転換体。
昆虫細胞であることを特徴とする請求項５に記載の形質転換体。
請求項５又は６に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収することを含むヒトＡＰＡタンパク質の作成方法。