KR20020071476A - 단백질 제조 방법 - Google Patents

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KR20020071476A
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니로 이나바
다께야 호리
사또루 이또
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후지레비오 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은 목적 단백질을 변성시키지 않으면서 쉽게 회수할 수 있는 유전자 조작 방법에 의한 목적 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 이 방법에서, 목적 단백질은 바이러스 입자의 구성 단백질과 융합된 형태로 생산되며, 바이러스 입자는 회수된다. 바이러스 입자는 세포내에 존재하는 일반적인 단백질 분자보다 더 크기 때문에, 입자는 원심분리법 등에 의해 쉽게 회수할 수 있다.

Description

단백질 제조 방법 {Method for Producing Proteins}
본 발명은 유전자 재조합 기술에 의한 목적 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
인간 게놈의 서열분석이 거의 완료되었음에도 불구하고, 각 유전자의 기능에 대한 분석은 그리 많이 진척되지 않았다. 유전자 수가 예상된 것보다 훨씬 적었다는 사실로부터 알 수 있듯이, 유전자의 기능이 그의 서열에 기초하여서만 논의될 수는 없다. 클로닝된 유전자의 기능을 분석하기 위해서는 유전자에 의해 코딩되는 재조합 단백질의 기능을 분석해야할 필요가 있다. 그러나, 대장균 (E. coli)에 의해 생산되는 단백질은 일반적으로 불용성이며 이 단백질의 구조는 가용화 단계에서 변한다는 사실이 잘 알려져 있다. 지금까지는, 생산된 단백질이 분비되는 발현계 또는 리폴딩 방법을 이용하여 이러한 문제를 그럭저럭 해결하였다. 다시 말하면, 종래의 연구는 생산된 단백질을 이들의 원래 구조로 회복시키는 것이었다. 자연 발생적인 구조는 동물 세포를 사용하여 달성될 수 있을 것으로 예상된다. 그러나, 동물 세포를 숙주 세포로 사용함으로써, 생산되는 단백질의 양이 흔히 소량이거나 또는 재조합체의 선별에 상당한 시간을 소모할 수 있다. 즉, 항생제에 내성이 있는 세포를 선별하기 위해서는 선별 조건이 복잡하고 선별 과정이 시간 소모적이어서, 이러한 방법은 요즘과 같은 경쟁 시대에 부합되지 못하는 것이다.
바쿨로바이러스 발현계 (Bac-To-Bac (등록상표) Baculovirus Expression System, GibcoBRL, 미국 특허 제5,674,908호 및 동 제4,981,797호)가 현재 주목받고 있는데, 이는 생산된 단백질이 포유동물 세포에서 생산되는 단백질에 부착된 당보다 더 간단한 구조이기는 하지만 당 구조를 가지며, 계를 다양하게 개량하여 유전자 조작을 쉽게 수행할 수 있기 때문이다. 현재까지, 분비계를 달성하는 방법 (Protein Expr. Purif., 14, 8-12 (1998)), 및 삽입될 목적 유전자를, 바이러스의 단백질 (특히, 표면 막 단백질 (J. Immunol. Methods, 234 123-135 (2000); J. Cell Biol., 143, 1155-1166 (1998).; and Biotechnology, 13, 1079-1084 (1995))을 코딩하는 유전자의 상류 영역에 융합시키는 방법과 같은 다양한 개량법이 제안되고 있다. 그러나, 분비 단백질을 원하는 형태로 얻을 수 있을 것으로 예상되기는 하지만, 막 단백질은 정제 과정에 요구되는 가용화 단계 동안에 반드시 변형되게 된다. 또는, 정제를 위한 플래그 (flag)라 불리는 태그 (tag)를 생성물에 연결하고 이 태그를 사용하여 정제를 쉽게 수행하는 방법이 제안되었다. 그러나, 이러한 방법은 단계수를 증가시키게 되어 비용이 많이 들게 된다. 또한, 태그에 의해 제공되는 생성물의 천연 구조에 대한 영향은 아직 밝혀진 바 없다.
유전자 조작 기술에 의해 생산되는 단백질의 정제는 암모늄 술페이트에 의한 침전, 염 침전, 각종 크로마토그래피 및 전기영동 등과 같은 다양한 정제 단계들을 조합하여 수행한다. 그러나, 이러한 단계들은 복잡하며 낮은 수율을 나타낸다.또한, 상기 언급한 바와 같이, 단백질은 정제 과정 동안 변성될 수 있다.
<발명의 개요>
따라서, 본 발명의 목적은 목적 단백질을 변성시키지 않으면서 쉽게 회수할 수 있는, 유전자 재조합 기술에 의한 목적 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 폭넓은 연구를 통해, 바이러스 입자 구성 단백질을 코딩하는 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자 사이의 융합 유전자를 발현시켜 목적 단백질과 바이러스 입자 사이의 융합 단백질의 형태로 목적 단백질을 생산하고, 바이러스 입자를 회수하고, 필요하다면 회수된 바이러스 입자로부터 목적 단백질을 회수함으로써, 목적 단백질을 변성시키지 않고 쉽게 정제할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은,
바이러스 입자 구성 단백질을 코딩하는 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 융합 유전자가 혼입된 재조합 벡터를 숙주 세포내에 도입하는 단계,
상기 융합 유전자를 상기 숙주 세포에서 발현시켜 상기 바이러스 입자와 융합된 상기 목적 단백질을 생산하는 단계, 및
상기 목적 단백질이 융합된 상기 바이러스 입자를 회수하는 단계
로 이루어진, 단백질 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한,
다수개의 막횡단 단편을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 융합 유전자가 혼입된 재조합 벡터를, 바이러스 입자를 생산하는 숙주 세포내에 도입하는 단계,
상기 융합 유전자를 상기 숙주 세포에서 발현시켜 다수개의 막횡단 단편을 갖는 상기 단백질과 융합된 상기 목적 단백질 (생산된 융합 단백질은 상기 바이러스 입자에 결합되어 있음)을 생산하는 단계 , 및
상기 목적 단백질을 포함하는 상기 융합 단백질이 결합된 상기 바이러스 입자를 회수하는 단계
로 이루어진, 단백질 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 의해, 목적 단백질을 변성시키지 않으면서 쉽게 회수할 수 있는, 유전자 재조합 기술에 의한 목적 단백질의 제조 방법이 제공되었다. 본 발명의 방법에 따라, 목적 단백질은 큰 크기의 바이러스 입자와의 융합 단백질 형태로 생산되기 때문에, 단백질은 원심 분리 등에 의해 매우 쉽게 정제될 수 있다.
<본 발명을 수행하기 위한 최적의 실시양태>
본 발명에 따른 제1 방법에서, 바이러스 입자 구성 단백질을 코딩하는 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 융합 유전자를 벡터내에 도입하고, 생성된 재조합 벡터를 숙주 세포내에 도입하고, 융합 유전자를 발현시켜 바이러스 입자와 융합된 목적 단백질을 생산하며, 목적 단백질이 결합된 바이러스 입자를 회수한다.
바이러스 입자 구성 단백질로서, 예를 들어 바이러스의 외피 (envelope)를구성하는 코트 단백질 등을 사용할 수 있다. 이러한 단백질의 바람직한 예는 바쿨로바이러스의 코트 단백질인 gp64이다. 그러나, 바이러스 입자 구성 단백질은 이에 한정되지 않으며, 숙주 세포에서 생산되는 바이러스 입자내 성분으로 혼입되는 임의 단백질을 사용할 수 있다.
바이러스 입자 구성 단백질 중에서, 바쿨로바이러스의 바이러스 입자를 구성하는 단백질, 및 바쿨로바이러스의 코트 단백질인 gp64가 특히 바람직하다. 단백질 gp64 그 자체는 잘 알려져 있고, 그의 아미노산 서열 및 gp64를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열도 또한 공지되어 있으며, 예를 들어 진뱅크 접근 번호 L22858로 기재되어 있다. 바쿨로바이러스는 곤충 세포에서 발현되는 강력한 프로모터를 가지며, 이러한 프로모터를 이용하는 바쿨로바이러스 벡터뿐 아니라 누에와 같은 곤충의 숙주 세포는 시판되며 널리 이용된다. 따라서, 숙주-벡터계가 확립되었다. 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 바쿨로바이러스 벡터내에 삽입되어 유전자가 숙주 곤충 세포에서 발현되는 경우, 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 먼저 바크미드 (bacmid) DNA 및 헬퍼 플라스미드 DNA를 포함하는 대장균 세포내에 도입되고, 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 상동 재조합에 의해 바크미드내에 삽입되고, 바크미드는 대장균 세포내에서 복제된 다음, 숙주 곤충 세포를 감염시킨다. 이렇게 함으로써, 목적 단백질은 숙주 세포에서 바쿨로바이러스와 함께 생산된다. 바크미드, 헬퍼 플라스미드, 및 이를 포함하는 대장균 세포는 시판되며, 상기 언급된 방법은 시판 제품을 사용하여 쉽게 수행할 수 있다. 즉, gp64 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 바쿨로바이러스 벡터내에 혼입시키고 숙주 곤충 세포에서 이러한 유전자를 발현시킴으로써, 목적 단백질과 융합된 gp64를 함유하는 바쿨로바이러스 입자가 생산된다. 이 경우, 곤충 세포가 진핵세포이기 때문에, 원핵 세포가 숙주로 사용되는 경우와는 달리, 당쇄가 생산되는 목적 단백질에 연결되어 있으며, 이는 목적 단백질이 천연 상태에 보다 가깝기 때문에 이롭다.
목적 단백질은 전혀 한정되지 않으며, 어떠한 단백질도 사용될 수 있다. 목적 단백질의 바람직한 예로는 글루코실트랜스퍼라제, 예를 들어 푸코실트랜스퍼라제 1 내지 9, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 내지 IV, 시알산 트랜스퍼라제 및 갈락토실트랜스퍼라제; 술페이트기를 당지질의 당쇄로 전달하는 술포트랜스퍼라제 (예를 들어, 헤파란 술페이트 N-술포트랜스퍼라제, 및 갈락토실세라미드 술페이트를 합성하는 세레브로시드 술포트랜스퍼라제); 및 LDL 옥사이드 스캐빈저 수용체를 비롯한 스캐빈저 수용체 족 및 콜라겐 구조를 갖는 대식세포 수용체 (MACRO)를 포함하는 전체 타입 II 막 단백질이 포함되지만, 목적 단백질은 이에 한정되지 않는다. 바이러스 입자 구성 단백질을 코딩하는 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 융합 유전자에서, 이들 두 유전자는 직접 라이게이션되거나 또는 삽입 서열 (이 경우, 하류 영역에 위치하는 유전자는 상류 영역에 위치하는 다른 유전자와 함께 프레임내 (즉, 두 유전자의 리딩 프레임은 일치함)에 있어야만 함)을 통해 간접적으로 라이게이션될 수 있다. 따라서, 본 출원 명세서 및 특허청구의 범위에 사용된 "융합 단백질"이라는 용어는, 목적 단백질이 바이러스 입자-구성 단백질에 직접 라이게이션된 경우 및 목적 단백질이 삽입 서열을 통해 바이러스입자-구성 단백질에 간접적으로 라이게이션된 경우를 둘 다 포함한다. 상기 두 유전자를 포함하는 융합 유전자를 먼저 형성하고, 형성된 융합 단백질을 벡터내에 삽입할 수 있다. 또는, 두 유전자 중 하나를 먼저 벡터내에 삽입한 다음, 다른 유전자를 벡터내에 삽입하여 융합 유전자를 벡터내에 형성할 수 있다. 트롬빈에 의해 인식되는 서열 Leu-Val-Gly-Arg-Pro-Ser 또는 인자 Xa에 의해 인식되는 서열 Ile-Glu-Gly-Arg를 코딩하는 삽입 영역을 통해 두 유전자를 라이게이션함으로써, 융합 단백질을 트롬빈 또는 인자 Xa로 처리하여 목적 단백질을 바이러스 입자로부터 쉽게 분리할 수 있다.
바람직하게는, 목적 단백질 중 적어도 활성 부위가 바이러스 입자의 외부에 노출되도록 목적 단백질을 바이러스 입자에 연결시킬 수 있다. 이렇게 함으로써, 목적 단백질을 바이러스 입자로부터 분리시키지 않으면서 면역분석법에 의해 또는 단백질의 활성을 지표로 사용하여 목적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. 또한, 목적 단백질의 활성을 이용하는 것이 바람직할 경우, 목적 단백질을 바이러스 입자로부터 분리하지 않고 융합 단백질 형태로 사용할 수 있다. 바이러스 입자의 구조가 공지되어 있는 경우, 이를 쉽게 얻을 수 있다. 즉, 예를 들어 바쿨로바이러스의 gp64의 경우, 그의 N-말단이 입자의 외부에 노출되어 있고 C-말단은 입자의 내부에 노출되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 목적 단백질을 gp64의 N-말단에 융합시킴으로써, 단백질 전체는 바이러스 입자의 외부에 노출된다. 한편, 목적 단백질이 예를 들어 인간 글리코실트랜스퍼라제의 경우에서와 같이 막횡단 단편을 갖는 경우, 막횡단 단편은 매우 소수성이기 때문에, 막횡단 단편이 바이러스 입자의막 (껍데기)에 고정되도록 목적 단백질이 바이러스 입자의 막에 부분적으로 묻혀 있는 융합 단백질을 생산할 수 있다. 목적 단백질 전체가 바이러스 입자의 외부에 완전히 노출되어 있는 경우, 원심분리와 같은 과정 동안 단백질을 떨어뜨릴 수 있다. 따라서, 목적 단백질이 하나 이상의 막횡단 단편을 갖는 경우, 바이러스 입자의 막내부에 부분적으로 묻혀 있는 형태로 목적 단백질을 생산하는 것이 바람직하다. 이 경우, 목적 단백질의 활성 부위는 바람직하게는 바이러스 입자의 외부에 노출되어 있다. 이는 바이러스 입자 및 목적 단백질의 구조가 알려져 있는 경우 쉽게 달성할 수 있다. 예를 들어, 상기 언급한 바와 같이, 바쿨로바이러스 gp64의 N-말단은 입자 외부에 노출되어 있으며, 그의 C-말단은 입자 내부에 노출되어 있는 것으로 알려져 있다. 한편, 인간 글리코실트랜스퍼라제는 타입 II 막 단백질 족에 속하며, 그의 활성 부위는 막횡단 단편의 C-말단 측면에 위치하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 글리코실트랜스퍼라제 유전자의 5'-말단을 gp64 유전자의 3'-말단에 라이게이션하여 글리코실트랜스퍼라제의 N-말단이 gp64의 C-말단에 라이게이션된 융합 단백질을 형성시킴으로써, 글리코실트랜스퍼라제는 그의 막횡단 단편이 바이러스 입자의 막에 고정되어 있고, 그의 활성 부위는 바이러스 입자의 외부에 노출되어 있는 융합 단백질 형태로 생산된다. 따라서, 목적 단백질이 하나 이상의 막횡단 단편을 갖는 경우, 전체 융합 단백질은 그 자체로서 발현될 수 있으며, 막횡단 단편을 제거하기 위한 조작은 필요치 않다. 목적 단백질을 바이러스 입자에 비교적 단단하게 고정시키는 것이 바람직하기 때문에, 목적 단백질은 바람직하게는 하나 이상의 막횡단 단편을 갖는다. gp64는 그가 바이러스 입자의 막을 통과하도록 바이러스 입자의 내부에 보유되어 있기 때문에, 만약 목적 단백질이 하나의 막횡단 단편을 갖는다면, 바이러스 입자-구성 단백질과 목적 단백질 사이의 융합 단백질은 총 2개의 막횡단 단편상에서 바이러스 입자에 고정된다. 즉, 바이러스 입자-구성 단백질과 목적 단백질 사이의 융합 단백질은 바람직하게는 총 2개 이상의 막횡단 단편을 갖는다.
본 발명에 따른 제2 방법에서, 융합 단백질은 목적 유전자를 코딩하는 유전자가 세포에서 다수개의 막횡단 단편을 갖는 단백질을 그의 천연 상태로 코딩하는 유전자와 융합되어 있는 유전자로부터 발현된 단백질이다. 이로서, 목적 단백질은 목적 단백질과 다수개의 막횡단 단편을 갖는 단백질 사이의 융합 단백질 형태로 생산된다.
상기 언급한 바와 같이, 단백질의 막횡단 단편은 매우 소수성이기 때문에, 이들은 바이러스 입자의 막을 통과한다. 따라서, 바이러스 입자를 생산하는 숙주 세포에서 다수개의 막횡단 단편을 갖는 단백질을 생산함으로써, 단백질이 여러 부위에서 바이러스 입자의 막을 통과하는 형태로 단백질이 생산된다. 목적 단백질은 목적 단백질과, 바이러스 입자의 막을 통과하는 다수개의 막횡단 단편을 갖는 단백질 사이의 융합 단백질 형태로 얻어진다. 다수개의 막횡단 단편을 갖는 단백질은 바이러스 입자의 막을 여러 부위에서 통과하기 때문에, 단백질은 정제 과정 동안 바이러스 입자로부터 거의 떨어지지 않으며, 즉 목적 단백질도 바이러스 입자로부터 거의 떨어지지 않는다.
본 발명에 따른 제2 방법에서는 또한, 융합될 두 유전자가 직접 라이게이션되거나 또는 삽입 서열을 통해 간접적으로 라이게이션될 수 있다 (이 경우, 하류 영역에 위치하는 유전자는 상류 영역에 위치하는 다른 유전자와 함께 프레임내에 있어야 한다). 두 유전자를 라이게이션하여 융합 유전자를 형성하고 형성된 융합 유전자를 벡터내에 삽입하거나, 또는 두 유전자를 연속하는 순서로 벡터내에 삽입하여 융합 유전자를 벡터내에 형성시킬 수 있다. 다수개의 막횡단 단편을 갖는 단백질이 바이러스 입자의 막을 여러 부위에서 통과할 수 있도록, 융합 유전자는 바람직하게는, 상류로부터 하류 순서로, 다수개의 막횡단 단편을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 트롬빈에 의해 인식되는 서열 Leu-Val-Gly-Arg-Pro-Ser 또는 인자 Xa에 의해 인식되는 서열 Ile-Glu-Gly-Arg을 코딩하는 삽입 영역을 통해 두 유전자를 라이게이션함으로써, 융합 단백질을 트롬빈 또는 인자 Xa로 처리하여 목적 단백질을 다수개의 막횡단 단편을 갖는 단백질로부터 쉽게 분리할 수 있다.
본 발명에서 다수개의 막횡단 영역을 지닌 단백질로는 임의 다양한 공지의 다수개 막횡단 영역 함유 단백질을 사용할 수 있다. 이러한 단백질의 예에는 인간 케모카인 수용체 (CCR3, CCR4, CCR5 또는 7개의 막횡단 영역을 지닌 유사체), Edg 군에 속하는 리소포스포리피드 수용체 (7개의 막횡단 영역을 함유), 체내의 아민 수용체 (노르아드레날린, 도파민, 세로토닌, 히스타민 등) (7개의 막횡단 영역을 함유), 프로스타글라딘의 수용체 (7개의 막횡단 영역을 함유), 다양한 펩티드 호르몬의 수용체 (7개의 막횡단 영역을 함유), 무스카린 수용체 (2개의 막횡단 영역을 함유), 글루탐산 수용체 (7개의 막횡단 영역을 함유), 콜라겐 수용체 CD36 (2개의막횡단 영역을 함유), 스케빈저 수용체 클래스 B (SR-B) (2개의 막횡단 영역을 함유) 및 포스파티드산 포스파타제 (6개의 막횡단 영역을 함유) 등이 포함되며, 다수개의 막횡단 영역을 함유하는 단백질이 상기에 한정되지는 않는다.
본 발명의 제2 방법은 숙주 세포가 바이러스 입자를 생산하는 것이 필수적이다. 상기 기재된 융합 유전자를 바쿨로바이러스 벡터에 삽입하고 이 재조합 벡터를 곤충 세포에서 발현시킴으로써 곤충 세포에서 바이러스 입자를 생산하는 동시에 융합 유전자를 발현함으로써 쉽게 달성할 수 있다. 또는, 바쿨로바이러스 벡터의 도입과는 별도로 바이러스 자체로 또는 바이러스 입자를 생산하는 벡터로 숙주 세포를 감염시킬 수 있다.
본 발명의 제2 방법은 또한, 바람직하게는 목적 단백질 중 적어도 활성 부위가 바이러스 입자의 외부에 노출되도록 목적 단백질을 다수개의 막횡단 영역을 지닌 단백질에 결합시킬 수 있다. 다수개의 막횡단 영역을 지닌 단백질의 구조와 목적 단백질의 구조를 알면 쉽게 달성할 수 있다. 예를 들어, 7개의 막횡단 영역을 지닌 인간 케모카인 수용체 단백질 CCR3을 다수개의 막횡단 영역을 지닌 단백질로 사용하고, 인간 글리코실트랜스퍼라제를 목적 단백질로 사용하는 경우, CCR3의 C-말단에 인간 글리코실트랜스퍼라제 유전자를 라이게이션함으로써 CCR3은 그의 C-말단이 바이러스 입자의 내부에 노출되게끔 바이러스 입자의 막을 관통하기 때문에, CCR3과 인간 당단백질 사이의 융합 단백질은 인간 글리코실트랜스퍼라제의 막횡단 영역이 제8의 막횡단 영역이 되게끔 바이러스 입자의 막에 일부가 묻히게 되어 인간 글리코실트랜스퍼라제의 활성 부위가 바이러스 입자의 외부에 노출되게 된다.
다수개의 막횡단 영역을 지닌 단백질이 짝수개의 막횡단 영역을 갖는 경우, 목적 단백질은 바람직하기로는 타입 II 막 단백질과 같은 1개의 막횡단 영역일 수 있다. 다수개의 막횡단 영역을 지닌 단백질이 홀수개의 막횡단 영역을 갖는 경우(그의 말단은 세포 중에서의 천연 상태에서는 세포질 안에 위치한다), 목적 단백질은 바람직하기로는 막횡단 영역이 없는 단백질일 수 있다.
본 발명의 제1 및 제2 방법에서, 숙주 세포가 융합 단백질을 생산하는 단계까지는 바쿨로바이러스 벡터, 숙주 곤충 세포 및 대장균 세포를 포함하는 시판되는 키트를 이용하여 통상의 방법에 따라 쉽게 수행할 수 있다.
목적 단백질과 융합된 바이러스 입자 또는 다수개의 막횡단 영역을 지닌 단백질과 목적 단백질 사이의 융합 단백질에 결합된 바이러스 입자가 숙주 세포에서 생산된 후에, 그 바이러스 입자를 분리한다. 바이러스 입자는 일반적으로 배지 상청액으로 방출되므로 배지 상청액을 원심분리하여 바이러스 입자를 쉽게 분리할 수 있다. 이 경우에는, 배지 상청액 중의 다른 다양한 성분들로부터 약 9000 내지 100,000 x g의 속도로 약 30 내지 120 분 동안 원심분리하여 바이러스 입자를 쉽게 분리할 수 있다. 바이러스 입자는 배지 상청액에 함유된 다양한 단백질 보다 훨씬 크기 때문에, 원심분리만으로도 바이러스 입자를 쉽게 분리할 수 있다. 따라서, 종래의 방법과는 달리, 복잡한 조작을 수행할 필요가 없으며 단백질이 변성될 가능성도 없다. 바이러스가 배지 상청액으로 그리 많이 방출되지 않는 경우에는 세포를 파괴하여 바이러스 입자를 회수할 수도 있다. 이 또한 2 또는 3회의 상이한 속도를 이용한 원심분리를 수행함으로써 쉽게 수행할 수 있다. 목적 단백질이 바이러스 입자의 외부에 노출되기 때문에 회수된 바이러스 입자를 이용해 생쥐와 같은 동물을 면역조치함으로써 목적 단백질에 대한 항체를 생산할 수 있다.
목적 단백질 중 적어도 활성 부위가 바이러스 입자의 외부에 노출된 경우에, 회수된 바이러스 입자 자체는 목적 단백질의 활성을 갖는다. 따라서, 목적 단백질의 활성 조사가 목적인 경우에는 회수된 바이러스 입자 자체를 목적 단백질로 사용할 수 있다.
목적 단백질을 코딩하는 유전자를 세포 내에서 발현시키는 종래의 방법은 생산된 목적 단백질을 세포내의 다른 단백질과 분리하기가 쉽지 않았다. 생산된 단백질이 배지로 분비되는 경우에도 목적 단백질을 배지 중의 다른 단백질과 분리하는 것이 필수적이다. 본 발명에서는 다른 단백질보다 훨씬 큰 바이러스 입자를 회수하는 것이기 때문에 바이러스 입자를 세포 또는 배지 상청액 중의 단백질들로부터 분리하는 것이 휠씬 쉽다. 이렇게 바이러스 입자를 수득함으로써, 발현된 단백질을 종래의 발현계의 경우보다 고순도로 회수할 수 있다. 또한, 목적 단백질이 막횡단 단백질인 경우에, 그 단백질이 바이러스 외피 단백질에 고정되어 있는 상태에서는 아마도 이 천연 단백질이 막을 관통하고 있는 3차원 구조를 가질 것이다.
목적 단백질을 바이러스 입자로부터 정제하기 위해, 바이러스 외피를 약한 계면활성제에 용해시켜 융합 단백질과 뉴클레오캡시드 (바쿨로바이러스의 핵)를 분리할 수 있다.
예를 들어, 외피는 계면활성제 함유 완충액 (예를 들여 트리톤 X-100 (상표명), 트윈 (상표명) 계면활성제, 노디덱 (상표명), 데옥시콜산, 리소PC (리소포스파티딜콜린) 등)을 약 0.05 내지 1.0 중량%의 최종 농도로 첨가하여 혼합물을 교반하거나 초음파 처리함으로써 용해시킬 수 있다. 그 후에, 얻어진 용액을 약 9000 내지 100,000 x g의 속도로 약 30 내지 120 분 동안 원심분리할 수 있다. 이 원심분리에 의해 원심분리 후 뉴클레오캡시드 침전물과 외피에 결합된 목적 단백질이 상청액에 존재하게 된다.
수득된 상청액은 주로 목적 단백질과 외피에 존재하는 외피 단백질 (gp64)를 포함한다. 더 정제해야하는 경우에는, 겔 투과 컬럼, 이온-교환 컬럼, 렉틴 컬럼 및 항체 컬럼과 같은 다양한 컬럼을 1개 이상 사용하여 목적 단백질을 정제할 수 있다.
또한, 융합 단백질을 분할하여 목적 단백질만을 회수하고자 하는 경우에는, 프로테아제가 인식하는 서열을 노출 영역에 삽입함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 트롬빈을 프로테아제로 사용할 경우, 트롬빈이 인식하는 아미노산 서열 Leu-Val-Gly-Arg-Pro-Ser을 삽입한다. 유사하게 Xa 인자를 프로테아제로 사용하는 경우, Xa 인자가 인식하는 Ile-Glu-Gly-Arg를 삽입한다. 그러나, 프로테아제와 그 프로테아제가 인식하는 서열이 이에 제한되는 것이 아님은 물론이다. 바이러스 입자를 프로테아제로 처리한 다음 결과의 용액을 약 9000 내지 100,000 x g의 속도에서 약 30 내지 120 분 동안 원심분리할 수 있다. 이 원심분리에 의해 바이러스 입자가 침전되고 융합 단백질로부터 분할된 목적 단백질이 상청액 분획에 존재하게 된다.
이러한 조작은 종래의 불용성 단백질에 대한 조작보다 훨씬 간단하고 온화하기 때문에, 목적 단백질이 변성될 가능성은 거의 없다.
이제 본 발명을 실시예에 의해 설명할 것이다. 그러나, 본 실시예는 단지 설명하기 위한 목적이지 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.
<실시예>
<참고예 1> 푸코실트랜스퍼라제인 FUT3 유전자의 직접 발현
α(1,3/1,4)푸코실트랜스퍼라제 유전자 (진뱅크 접근 번호 X53578, 이하 본원에서 "FUT3"라 불리움)를 하기와 같이 바쿨로바이러스에 도입하여 FUT3 단백질을 생산하였다. 통상적인 방법에 따라 FUT3 유전자를 인간 유전자 (cDNA)로부터 클로닝하였다. 이 유전자를 증폭하기 위해 PCR에 사용된 프라이머는 NdeI 부위가 첨가된 FUT3F1:tcg cat atg gat ccc ctg ggt gca gcc aag 및 XhoI 부위가 첨가된 FUT3R3: atg ctc gag tca ggt gaa cca agc cgc tat였다. FUT3 유전자의 PCR 산물 및 제작된 pFB6A/CCR3 (하기 참고예 2 참조)를 제한효소인 NdeI 및 XhoI으로 처리하였다. 이들을 라이게이션시켜 대장균 세포 (DH5α 수용성 세포)에 도입하였다. 결과의 세포를 앰피실린 함유 LB 아가 플레이트에 플레이팅하여 37℃에서 약 16시간 동안 배양하였다. 이 플레이트로부터 단일 대장균 콜로니를 선별하고, 선별된 대장균 세포를 앰피실린 함유 배지에서 약 16시간 동안 진탕하에 배양하였다. 배양된 대장균 세포로부터 플라스미드를 회수하여, 삽입된 FUT3 유전자를 서열 분석하였다. 그 결과, 결정된 서열이 보고된 FUT3 유전자 (진뱅크 접근 번호 X53578)의 서열과 동일하였다. FUT3 유전자가 삽입된 이 플라스미드를 pFB6A/FUT3이라 명명하였다.
통상적인 방법으로, FUT3 유전자가 혼입된 공여 플라스미드 (pFB6A/FUT3)를 바크미드 DNA 및 헬퍼 DNA가 미리 도입된 대장균 DH10Bac 세포 (GibcoBRL에서 상업적으로 시판)에 도입하여, FUT3 유전자를 상동성 재조합에 의해 바크미드 DNA로 삽입하였다. 이는 다음과 같이 수행하였다. 플라스미드 pFB6A/FUT3를 수용성 대장균 DH10Bac 세포에 도입하고, 결과의 세포를 카나마이신, 테트라싸이클린, 겐타마이신, IPTG 및 블루오-갈 (Bluo-gal)을 함유하는 LB 아가 플레이트에 플레이팅한 후, 37℃에서 약 16시간 동안 배양하였다. 상동성 재조합이 발생한 대장균 세포의 콜로니는 흰색이었다. 따라서, 흰색 콜로니를 선별하여 카나마이신, 테트라싸이클린 및 겐타마이신을 함유하는 LB 배지에서 37℃로 약 16시간 동안 배양하였다. 이 대장균 현탁액 1.5 ml로부터, 통상적인 방법으로 바크미드 DNA를 정제하여 TE 완충액 40 ㎕에 용해시켰다.
이와 같이 얻어진 바크미드 DNA 용액 5 ㎕와 Sf900 Ⅱ 배지 (GibcoBRL에서 상업적으로 시판) 100 ㎕의 혼합물, 및 셀펙틴 시약 (상표명 CellFECTIN Reagent; 곤충 세포에 유전자를 도입하기 위한 양이온성 지질; GibcoBRL에서 상업적으로 시판) 6 ㎕와 Sf900 Ⅱ 배지 100 ㎕의 혼합물을 혼합하고, 결과로 얻어진 혼합물을 실온에서 45분 동안 정치하였다. 이 바크미드 DNA/셀펙틴 혼합물에 Sf900 Ⅱ 배지 800 ㎕를 가하고, 결과로 생성된 혼합물을 9×105개의 Sf21 곤충 세포가 결합된 6-웰 플레이트 (GibcoBRL에서 상업적으로 시판)에 가한 후, 27℃에서 5시간 동안 플레이트를 배양하였다. 그 후, 바크미드 DNA/셀펙틴 혼합물을 제거하고, 항생제를 함유하는 Sf900 Ⅱ 배지에서 27℃로 72시간 동안 세포를 배양하였다.
그 후, 배지를 회수하였다. 이 배지는 FUT3을 생산하는 재조합 바쿨로바이러스를 함유하고 있다. 회수된 배지 800 ㎕를 따로 배양 (항생제를 함유하는 Sf900 Ⅱ 배지 20 ml이 들어있는 T75 플라스크에서 서브콘플루언시 (subconfluency)로 배양)된 Sf21 세포에 가하고, 결과의 세포를 27℃에서 72시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 플라스크로부터 박리시켜 배지와 함께 회수하였다. 회수된 세포 현탁액을 3000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 침전물을 세포 분획이라 정의하고, 상청액을 바쿨로바이러스 분획이라 정의하였다.
통상적인 방법으로, 항-FUT3 모노클로날 항체 (일본 특허 출원 공개 (Kokai) 제8-119999호)를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 그 결과, FUT3 단백질이 Sf21 세포에서 발현됨을 관찰하였고, 분자량이 다른 3가지 유형의 단백질이 관찰되었다. 그러나, 바쿨로바이러스 분획에서는 단백질이 관찰되지 않았다.
<참고예 2> pFB6A/CCR3의 제작
통상적인 방법으로, 인간 백혈구로부터 mRNA를 추출하고, 그로부터 cDNA를 제조한 후, 케모카인 수용체 CCR3 유전자 (cDNA)를 클로닝하였다. 이 조작에서, 종결 코돈을 포함하는 유전자를 PCR에 의해 증폭하였다. PCR에 사용된 프라이머들에는 제한효소 인식 부위가 첨가되어 있었다. 즉, 사용된 프라이머는 CCR3F: tcgcatatgacaacctcactagatacagtt 및 CCR3R: tgcgaattcaaacacaatagagagttccggctctg였다. CCR3 유전자의 PCR 산물을 제한효소인 NdeI 및 EcoRI으로 처리하였다. 클로닝에 사용된 이 플라스미드 (이하 "pFB6A"라 불리움)는, 다중클로닝 부위가 NdeI 및 EcoRI 제한 부위를 포함하도록 변형된 것을 제외하고는 pFastBac 공여 플라스미드와 동일하였다. 플라스미드 pFB6A도 NdeI 및 EcoRI으로 처리하고, 결과의 DNA를 제한효소로 처리된 CCR3 유전자의 PCR 산물과 라이게이션시켰다.
CCR3 유전자의 PCR 산물이 삽입된 상태로 얻은 플라스미드를 통상적인 방법에 의해 대장균 세포 (DH5α 수용성 세포)에 도입하고, 결과의 세포를 앰피실린 함유 LB 아가 플레이트에 플레이팅한 후, 37℃에서 약 16시간 동안 배양하였다. 이 플레이트로부터 단일 대장균 콜로니를 선별하여 앰피실린 함유 배지에서 약 16시간 동안 진탕하에 배양하였다. 배양된 대장균 세포로부터 플라스미드를 추출하여, 삽입된 CCR3 유전자를 서열 분석하였다. 그 결과, 서열은 보고된 CCR3 유전자 (진뱅크 접근 번호 AF026535)의 서열과 동일하였다. CCR3 유전자가 삽입된 상태로 얻은 이 플라스미드를 pFB6A/CCR3이라 명명하였다.
<실시예 1> CCR3 유전자의 하류에 융합된 FUT3 유전자의 발현
제작된 플라스미드 pFB6A/CCR3 중의 CCR3 유전자에 글리코실트랜스퍼라제인 α(1,3/1,4)푸코실트랜스퍼라제의 유전자를 하기와 같이 라이게이션시켜 CCR3-FUT3 융합 단백질을 얻었다. FUT3 유전자로서, 참고예 1에서 클로닝된 클론 1개를 사용하였다. EcoRI 부위가 첨가된 프라이머 FUT3F: tgcgaattcatggatcccctgggtgcagcc 및 XhoI 부위가 첨가된 프라이머 FUT3R: tgtctcgagtcaggtgaaccaagccgctat를 사용하여 PCR을 수행하였다. FUT3 유전자의 PCR 산물 및 제작된 pFB6A/CCR3 플라스미드를 제한효소인 EcoRI 및 XhoI으로 절단하였다. 얻어진 절단물을 통상적인 방법에의해 라이게이션시키고, 결과의 DNA를 대장균 세포 (DH5α 수용성 세포)에 도입하였다. 세포를 앰피실린 함유 LB 아가 플레이트에 플레이팅하여, 37℃에서 약 16시간 동안 배양하였다. 이 플레이트로부터 단일 대장균 콜로니를 선별하고, 선별된 대장균 세포를 앰피실린 함유 배지에서 약 16시간 동안 진탕하에 배양하였다. 배양된 대장균으로부터 플라스미드를 추출하여, 삽입된 FUT3 유전자를 서열 분석하였다. 그 결과, 서열은 보고된 FUT3 유전자 (진뱅크 접근 번호 X53578)의 서열과 동일하였다. FUT3 유전자가 삽입된 상태로 얻은 이 플라스미드를 pFB6A/CCR3-FUT3이라 명명하였다.
통상적인 방법으로, 상기와 같이 CCR3 유전자 및 FUT3 유전자의 라이게이션에 의해 얻은 공여 플라스미드 (pFB6A/CCR3-FUT3)를 바크미드 DNA 및 헬퍼 DNA가 미리 도입된 대장균 DH10Bac 세포 (GibcoBRL에서 상업적으로 시판)에 도입하여, CCR3-FUT3 융합 유전자를 상동성 재조합에 의해 바크미드 DNA로 삽입하였다. 이는 다음과 같이 수행하였다. 플라스미드 pFB6A/CCR3-FUT3를 수용성 대장균 DH10Bac 세포에 도입하였다. 결과의 세포를 카나마이신, 테트라싸이클린, 겐타마이신, IPTG 및 블루오-갈을 함유하는 LB 아가 플레이트에 플레이팅하여, 37℃에서 약 16시간 동안 배양하였다. 상동성 재조합이 발생한 대장균 세포의 콜로니는 흰색이었다. 따라서, 흰색 콜로니를 선별하여 카나마이신, 테트라싸이클린 및 겐타마이신을 함유하는 LB 배지에서 37℃로 약 16시간 동안 배양하였다. 이 대장균 현탁액 1.5 ml로부터, 통상적인 방법으로 바크미드 DNA를 정제하여 TE 완충액 40 ㎕에 용해시켰다.
이와 같이 얻어진 바크미드 DNA 용액 5 ㎕와 Sf900 Ⅱ 배지 (GibcoBRL에서 상업적으로 시판) 100 ㎕의 혼합물, 및 셀펙틴 시약 (GibcoBRL) 6 ㎕와 Sf900 Ⅱ 배지 100 ㎕의 혼합물을 혼합하고, 결과로 얻어진 혼합물을 실온에서 45분 동안 정치하였다. 이 바크미드 DNA/셀펙틴 혼합물에 Sf900 Ⅱ 배지 800 ㎕를 가하고, 결과로 생성된 혼합물을 9×105개의 Sf21 곤충 세포가 결합된 6-웰 플레이트 (GibcoBRL에서 상업적으로 시판)에 가한 후, 27℃에서 5시간 동안 플레이트를 배양하였다. 그 후, 바크미드 DNA/셀펙틴 혼합물을 제거하고, 항생제를 함유하는 Sf900 Ⅱ 배지에서 27℃로 72시간 동안 세포를 배양하였다.
그 후, 배지를 회수하였다. 이 배지는 CCR3-FUT3을 생산하는 재조합 바쿨로바이러스를 함유하고 있다. 회수된 배지 800 ㎕를 따로 배양 (항생제를 함유하는 Sf900 Ⅱ 배지 20 ml이 들어있는 T75 플라스크에서 서브콘플루언시로 배양)된 Sf21 세포에 가하고, 결과의 세포를 27℃에서 72시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 플라스크로부터 박리시켜 배지와 함께 회수하였다. 회수된 세포 현탁액을 3000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 침전물을 세포 분획이라 정의하고, 상청액을 바쿨로바이러스 분획이라 정의하였다.
<실시예 2>: pFB6A/gp64의 제작
통상적인 방법으로, 게놈 DNA를 바쿨로바이러스로부터 추출하여 gp64 유전자를 클로닝했다. 이러한 조작에서, 종결 코돈을 제외한 유전자를 PCR로 증폭시켰다. 이 PCR에 사용된 프라이머는 제한 효소 인식 부위를 갖는다. 즉, 사용된 프라이머는 gp64F (tcgcatatggtaagcgctattgttttatat, 첨가된 Nde I 부위 함유) 및 gp64R (tgcgaattcatattgtctattacggtttct, 첨가된 Eco RI 부위 함유)였다. gp64 유전자의 PCT 생성물에 제한 효소 Nde I 및 Eco RI를 처리했다. 클로닝에 사용된 플라스미드는 pFB6A이었다. 또한, 플라스미드 pFB6A를 Nde I 및 Eco RI로 처리했으며, 상기 생성물을 제한 효소로 처리한 gp64 유전자의 PCR 생성물과 라이게이션시켰다.
gp64 유전자의 PCR 생성물이 삽입되어 있는 수득된 플라스미드를 통상적인 방법으로 대장균 세포 (DH5α 감응성 세포)에 도입하고, 생성된 세포를 암피실린-함유 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하여, 37℃에서 약 16시간 동안 배양했다. 이 플레이트에서 단일 대장균 콜로니를 선택하고, 상기 대장균을 암피실린-함유 LB 배지에서 약 16시간 동안 진탕 배양했다. 성장한 대장균에서 플라스미드를 추출하고, 삽입된 gp64 유전자를 서열분석했다. 그 결과, 상기 서열은 보고된 gp64 유전자 (진뱅크 접근 번호 L22858)와 동일했다. gp64 유전자가 삽입되어 있는 수득된 플라스미드를 pFB6A/gp64로 명명했다.
<실시예 3>: gp64 유전자의 하류에 융합된 FUT3 유전자의 발현
글리코실트랜스퍼라제인 α(1,3/1,4)푸코실트랜스퍼라제 유전자에 gp64 유전자를 라이게이션시켜 gp64-FUT3 융합 단백질을 수득하기 위해, FUT3 유전자를 클로닝했다. FUT3 유전자의 증폭은 참고예 1에서와 같이 수행했다. FUT3 유전자의 PCR 생성물 및 플라스미드 pFB6A를 제한효소 Eco RI 및 Xho I로 절단했다. 수득된 절단물을 통상적인 방법으로 라이게이션시켰으며, FUT3 유전자가 삽입되어 있는 생성된 플라스미드를 대장균 세포 (DH5α 감응성 세포)에 도입했다. 상기 세포를 암피실린-함유 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하여, 37℃에서 약 16시간 동안 인큐베이션했다. 이 플레이트에서 단일 대장균 콜로니를 선택하고, 선택된 대장균을 암피실린-함유 LB 배지에서 약 16시간 동안 진탕 배양했다. 성장한 대장균에서 플라스미드를 추출하고, 삽입된 FUT3 유전자를 서열분석했다. 그 결과, 상기 서열은 보고된 FUT3 유전자 (진뱅크 접근 번호 X53578)와 동일했다. FUT3 유전자가 삽입되어 있는 수득된 플라스미드를 pFB6A/FUT3로 명명했다.
상기 제작된 pFB6A/FUT3 플라스미드를 제한효소 Nde I 및 Eco RI로 절단하고, 반응 용액을 저융점 아가로스 겔 상에서 분리하여 gp64 유전자를 수득했다. gp64 유전자를 pFB6A/FUT3 플라스미드에 삽입하기 위해서, 상기 플라스미드를 제한효소 Nde I 및 Eco RI로 절단했다. 생성된 플라스미드 및 상기 언급한 정제된 gp64 유전자를 통상적인 방법으로 라이게이션시켰다. gp64 유전자가 삽입되어 있는 수득된 플라스미드를 대장균 세포 (DH5α 감응성 세포)에 도입했다. 상기 세포를 암피실린-함유 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하여, 37℃에서 약 16시간 동안 인큐베이션했다. 이 플레이트에서 단일 대장균 콜로니를 선택하고, 선택된 대장균을 암피실린-함유 LB 배지에서 약 16시간 동안 진탕 배양했다. 성장한 대장균에서 플라스미드를 추출하고, 삽입된 gp64 유전자를 서열분석했다. 그 결과, 적절히 삽입되었음이 확인되었다. gp64 유전자가 삽입되어 있는 수득된 플라스미드를 pFB6A/gp64-FUT3로 명명했다.
통상적인 방법으로, 상기 언급한 바와 같이 gp64 유전자와 FUT3 유전자를 라이게이션시켜 수득된 공여 플라스미드 (pFB6A/gp64-FUT3)를 바크미드 (bacmid) DNA 및 헬퍼 DNA를 미리 도입해둔 대장균 DH10Bac 세포 (GibcoBRL 제품)에 도입하고, 상동성 재조합을 통해 gp64-FUT3 융합 유전자를 바크미드 DNA에 삽입했다. 이는 하기와 같이 수행했다. 플라스미드 pFB6A/gp64-FUT3를 감응성 대장균 DH10Bac 세포에 도입했다. 생성된 세포를 카나마이신, 테트라사이클린, 겐타마이신, IPTG 및 Bluo-gal을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하여, 37℃에서 약 16시간 동안 배양했다. 대장균 세포의 콜로니 중 상동성 재조합이 일어난 세포는 백색이다. 그러므로, 백색 콜로니를 선별하여 카나마이신, 테트라사이클린 및 겐타마이신을 함유하는 LB 배양 배지에서 37℃에서 약 16시간 동안 배양했다. 이 대장균 현탁액 중 1.5 ml로부터 바크미드 DNA를 통상의 방법으로 정제하고, 이를 TE 40 ㎕에 용해했다.
이렇게 수득된 바크미드 DNA 용액 5 ㎕과 Sf900 II 배양 배지 (GibcoBRL 제품) 100 ㎕의 혼합물, 및 CellFECTIN 시약 (GibcoBRL 제품) 6 ㎕와 Sf900 II 배양 배지 100 ㎕의 혼합물을 혼합하고, 생성된 혼합물을 실온에서 45분 동안 정치했다. 이 바크미드 DNA/CellFECTIN 혼합물에, Sf900 II 배양 배지 800 ㎕를 첨가하고, 생성된 혼합물을 9 ×105Sf21 곤충 세포가 결합되어 있는 6-웰 플레이트 (GibcoBRL 제품)에 첨가한 후, 상기 플레이트를 27℃에서 5시간 동안 인큐베이션했다. 그 다음, 상기 바크미드 DNA/CellFECTIN 혼합물을 제거하고, 상기 세포를 항생제를 함유하는 Sf900 II 배양 배지 중에서 27℃에서 72시간 동안 배양했다.
그 다음, 상기 배양 배지를 회수했다. 이 배양 배지는 gp64-FUT3를 생산하는 재조합 바쿨로바이러스를 함유했다. 회수된 배양 배지 중 800 ㎕를 별도로 배양한 Sf21 세포 (항생제를 함유하는 Sf900 II 배양 배지 20 ml를 함유하는 T75 플라스크에서 서브콘플루언시로 배양)에 첨가하고, 이를 27℃에서 72시간 동안 배양했다. 그 다음, 상기 플라스크에서 세포를 떼어내어 배양 배지와 함께 회수했다. 회수된 세포 현탁액을 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리했다. 침전물을 세포 분획으로 규정하고, 상청액을 바쿨로바이러스 분획으로 규정했다.
통상적인 방법으로, 항-FUT3 모노클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행했다 (일본 특허 공개 (Kokai) 제8-119999호). 그 결과, gp64-FUT3를 생산하는 재조합 바쿨로바이러스로 감염된 Sf21 세포에 대한 양성 밴드는 관찰되었지만, 비감염된 Sf21 세포에 대한 양성 밴드는 관찰되지 않았다.
<참고예 3>: pFB1/CCR3의 제작
CCR3를 함유하는 융합 단백질을 제조하기 위해서, 다중클로닝 부위의 서열을 하기와 같이 변화시킨 후에, CCR3 유전자를 pFastBac 공여 플라스미드 1 (이후, "pFB1"로 지칭함, GibcoBRL 제품)에 클로닝했다. 종결 코돈을 제외한 CCR3 유전자를 PCR로 증폭시켰다. PCR에 사용된 프라이머는 첨가된 제한효소 부위를 함유했다. 즉, 사용된 프라이머는 CCR3FE (tcggaattcatgacaacctcactagataca, 첨가된 Eco RI 부위 함유), 및 CCR3RS (tgcgtcgaccaaacacaatagagagttcc, 첨가된 Sal I 부위 함유)였다. CCR3 유전자의 PCR 생성물 및 pFB1 플라스미드를 제한효소 Eco RI 및 Sal I로 절단하고, 절단물을 통상적인 방법으로 라이게이션시켰다.
CCR3 유전자가 삽입되도록 제작된 플라스미드를 대장균 세포 (DH5α 감응성 세포)에 도입했다. 상기 세포를 암피실린-함유 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하여, 37℃에서 약 16시간 동안 인큐베이션했다. 이 플레이트에서 단일 대장균 콜로니를 선택하고, 선택된 대장균을 암피실린-함유 LB 배지에서 약 16시간 동안 진탕 배양했다. 성장한 대장균에서 플라스미드를 추출하고, 삽입된 CCR3 유전자를 서열분석했다. 그 결과, 상기 서열은 보고된 CCR3 유전자 (진뱅크 접근 번호 AF026535)와 동일했다. CCR3 유전자가 삽입되어 있는 수득된 플라스미드를 pFB1/CCR3로 명명했다.
<실시예 4>: CCR3 유전자의 하류에 융합된 GnTV 유전자의 발현
글리코실트랜스퍼라제인 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 V 유전자 (진뱅크 접근 번호 NM002410, 이후에는 "GnTV"로 지칭함)를 제작된 플라스미드 pFB1/CCR3 내의 CCR3 유전자에 라이게이션시키기 위해, GnTV 유전자를 클로닝했다. 하기와 같이, GnTV를 인간 유전자 (cDNA)로부터 클로닝했다. PCR 증폭에 사용된 프라이머는 GnTVF (agagt cgaca tggct ctctt cactc cgtgg, 첨가된 Sal I 부위 함유), 및 GnTVRXho (tgact cgagc tatag gcagt ctttg c, 첨가된 Xho I 부위 함유)였다. GnTV 유전자의 PCR 생성물 및 pFB1/CCR3 플라스미드를 제한효소 Sal I 및 Xho I로 절단하고, 절단물을 통상적인 방법으로 라이게이션시켰으며, 생성된 플라스미드를 대장균 세포 (DH5α 감응성 세포)에 도입했다. 상기 세포를 암피실린-함유 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하여, 37℃에서 약 16시간 동안 인큐베이션했다. 이 플레이트에서 단일 대장균 콜로니를 선택하고, 선택된 대장균을 암피실린-함유LB 배지에서 약 16시간 동안 진탕 배양했다. 성장한 대장균에서 플라스미드를 추출하고, 삽입된 GnTV 유전자를 서열분석했다. 그 결과, 상기 서열은 보고된 GnTV 유전자 (진뱅크 접근 번호 NM002410)와 동일했다. GnTV 유전자가 삽입되어 있는 수득된 플라스미드를 pFB1/CCR3-GnTV로 명명했다.
통상적인 방법으로, 상기 언급한 바와 같이 CCR3 유전자와 GnTV 유전자를 라이게이션시켜 수득된 공여 플라스미드 (pFB1/CCR3-GnTV)를, 바크미드 DNA 및 헬퍼 DNA를 미리 도입해둔 대장균 DH10Bac 세포 (GibcoBRL 제품)에 도입하고, 상동성 재조합을 통해 CCR3-GnTV 융합 유전자를 바크미드 DNA에 삽입했다. 이는 하기와 같이 수행했다. 플라스미드 pFB1/CCR3-GnTV를 감응성 대장균 DH10Bac 세포에 도입했다. 생성된 세포를 카나마이신, 테트라사이클린, 겐타마이신, IPTG 및 Bluo-gal을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하여, 37℃에서 약 16시간 동안 배양했다. 대장균 세포의 콜로니 중 상동성 재조합이 일어난 세포는 백색이다. 그러므로, 백색 콜로니를 선별하여 카나마이신, 테트라사이클린 및 겐타마이신을 함유하는 LB 배양 배지에서 37℃에서 약 16시간 동안 배양했다. 이 대장균 현탁액 중 1.5 ml로부터 바크미드 DNA를 통상의 방법으로 정제하고, 이를 TE 40 ㎕에 용해했다.
이렇게 수득된 바크미드 DNA 용액 5 ㎕과 Sf900 II 배양 배지 (GibcoBRL 제품) 100 ㎕의 혼합물, 및 CellFECTIN 시약 (GibcoBRL 제품) 6 ㎕와 Sf900 II 배양 배지 100 ㎕의 혼합물을 혼합하고, 생성된 혼합물을 실온에서 45분 동안 정치했다. 이 바크미드 DNA/CellFECTIN 혼합물에, Sf900 II 배양 배지 800 ㎕를 첨가하고, 생성된 혼합물을 9 ×105Sf21 곤충 세포가 결합되어 있는 6-웰 플레이트 (GibcoBRL 제품)에 첨가한 후, 상기 플레이트를 27℃에서 5시간 동안 인큐베이션했다. 그 다음, 상기 바크미드 DNA/CellFECTIN 혼합물을 제거하고, 상기 세포를 항생제를 함유하는 Sf900 II 배양 배지 중에서 27℃에서 72시간 동안 배양했다.
그 다음, 상기 배양 배지를 회수했다. 이 배양 배지는 CCR3-GnTV를 생산하는 재조합 바쿨로바이러스를 함유했다. 회수된 배양 배지 중 800 ㎕를 별도로 배양한 Sf21 세포 (항생제를 함유하는 Sf900 II 배양 배지 20 ml를 함유하는 T75 플라스크에서 서브콘플루언시로 배양)에 첨가하고, 이를 27℃에서 72시간 동안 배양했다. 그 다음, 상기 플라스크에서 세포를 떼어내어 배양 배지와 함께 회수했다. 회수된 세포 현탁액을 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리했다. 침전물을 세포 분획으로 규정하고, 상청액을 바쿨로바이러스 분획으로 규정했다.
<실시예 5>: gp64 유전자의 하류에 융합된 GnTV 유전자의 발현
gp64-GnTV 융합 단백질을 수득하기 위한, gp64 유전자와 글리코실트랜스퍼라제인 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 V 유전자의 라이게이션을 위해, GnTV 유전자를 클로닝했다. 하기와 같이, GnTV를 인간 유전자 (cDNA)로부터 클로닝했다. PCR 증폭에 사용된 프라이머는 GnTVF (agagt cgaca tggct ctctt cactc cgtgg, 첨가된 Sal I 부위 함유), 및 GnTVR17 (tgagg taccc tatag gcagt ctttg c, 첨가된 Kpn I 부위 함유)였다.
GnTV 유전자의 PCR 생성물 및 플라스미드 pFB6A/gp64를 제한효소 Sal I 및Kpn I로 절단했다. 절단물을 통상적인 방법으로 라이게이션시켰으며, 생성된 플라스미드를 대장균 세포 (DH5α 감응성 세포)에 도입했다. 상기 세포를 암피실린-함유 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하여, 37℃에서 약 16시간 동안 인큐베이션했다. 이 플레이트에서 단일 대장균 콜로니를 선택하고, 선택된 대장균을 암피실린-함유 LB 배지에서 약 16시간 동안 진탕 배양했다. 성장한 대장균에서 플라스미드를 추출하고, 삽입된 GnTV 유전자를 서열분석했다. 그 결과, 상기 서열은 보고된 GnTV 유전자 (진뱅크 접근 번호 NM002410)와 동일했다. GnTV 유전자가 삽입되어 있는 수득된 플라스미드를 pFB6A/gp64-GnTV로 명명했다.
통상적인 방법으로, 상기 언급한 바와 같이 gp64 유전자와 GnTV 유전자를 라이게이션시켜 수득된 공여 플라스미드 (pFB6A/gp64-GnTV)를, 바크미드 DNA 및 헬퍼 DNA를 미리 도입해둔 대장균 DH10Bac 세포 (GibcoBRL 제품)에 도입하고, 상동성 재조합을 통해 gp64-GnTV 융합 유전자를 바크미드 DNA에 삽입했다. 이는 하기와 같이 수행했다. 플라스미드 pFB6A/gp64-GnTV를 감응성 대장균 DH10Bac 세포에 도입했다. 생성된 세포를 카나마이신, 테트라사이클린, 겐타마이신, IPTG 및 Bluo-gal을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅한 다음, 37℃에서 약 16시간 동안 배양했다. 대장균 세포의 콜로니 중 상동성 재조합이 일어난 세포는 백색이다. 그러므로, 백색 콜로니를 선별하여 카나마이신, 테트라사이클린 및 겐타마이신을 함유하는 LB 배양 배지에서 37℃에서 약 16시간 동안 배양했다. 이 대장균 현탁액 중 1.5 ml로부터 바크미드 DNA를 통상의 방법으로 정제하고, 이를 TE 40 ㎕에 용해했다.
이렇게 수득된 바크미드 DNA 용액 5 ㎕과 Sf900 II 배양 배지 (GibcoBRL 제품) 100 ㎕의 혼합물, 및 CellFECTIN 시약 (GibcoBRL 제품) 6 ㎕와 Sf900 II 배양 배지 100 ㎕의 혼합물을 혼합하고, 생성된 혼합물을 실온에서 45분 동안 정치했다. 이 바크미드 DNA/CellFECTIN 혼합물에, Sf900 II 배양 배지 800 ㎕를 첨가하고, 생성된 혼합물을 9 ×105Sf21 곤충 세포가 결합되어 있는 6-웰 플레이트 (GibcoBRL 제품)에 첨가한 후, 상기 플레이트를 27℃에서 5시간 동안 인큐베이션했다. 그 다음, 상기 바크미드 DNA/CellFECTIN 혼합물을 제거하고, 상기 세포를 항생제를 함유하는 Sf900 II 배양 배지 중에서 27℃에서 72시간 동안 배양했다.
그 다음, 상기 배양 배지를 회수했다. 이 배양 배지는 gp64-GnTV를 생산하는 재조합 바쿨로바이러스를 함유했다. 회수된 배양 배지 중 800 ㎕를 별도로 배양한 Sf21 세포 (항생제를 함유하는 Sf900 II 배양 배지 20 ml를 함유하는 T75 플라스크에서 서브콘플루언시로 배양)에 첨가하고, 이를 27℃에서 72시간 동안 배양했다. 그 다음, 상기 플라스크에서 세포를 떼어내어 배양 배지와 함께 회수했다. 회수된 세포 현탁액을 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리했다. 침전물을 세포 분획으로 규정하고, 상청액을 바쿨로바이러스 분획으로 규정했다.
통상적인 방법으로, 항-GnTV 모노클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행했다 (일본 특허 공개 (Kokai) 제11-240900호). 그 결과, gp64-GnTV를 생산하는 재조합 바쿨로바이러스로 감염된 Sf21 세포에 대한 양성 밴드는 관찰되었지만, 비감염된 Sf21 세포에 대한 양성 밴드는 관찰되지 않았다.
본 발명에 의해, 바이러스 입자 구성 단백질을 코딩하는 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자 사이의 융합 유전자를 발현시켜 목적 단백질과 바이러스 입자 사이의 융합 단백질의 형태로 목적 단백질을 생산하고, 바이러스 입자를 회수하고, 필요에 따라 회수된 바이러스 입자로부터 목적 단백질을 회수함으로써, 목적 단백질을 변성시키지 않으면서 쉽게 회수할 수 있는, 유전자 재조합 기술에 의한 목적 단백질의 제조 방법을 제공할 수 있게 되었다.

Claims (15)

  1. 바이러스 입자 구성 단백질을 코딩하는 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 융합 유전자가 혼입된 재조합 벡터를 숙주 세포내에 도입하는 단계,
    상기 융합 유전자를 상기 숙주 세포에서 발현시켜 상기 바이러스 입자와 융합된 상기 목적 단백질을 생산하는 단계, 및
    상기 목적 단백질이 융합된 상기 바이러스 입자를 회수하는 단계
    로 이루어진, 단백질 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 입자 구성 단백질이 상기 바이러스의 코트 단백질인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 바이러스가 바쿨로바이러스이고 상기 숙주 세포가 곤충 세포인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 바이러스 입자 구성 단백질이 바쿨로바이러스의 코트 단백질 gp64인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적 단백질 중 적어도 활성 부위가 상기 바이러스 입자의 외부에 노출되도록 상기 목적 단백질이 상기 바이러스 입자와 융합되어 있는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 융합 유전자가 gp64 유전자, 및 gp64 유전자의 하류에 위치하는 상기 목적 단백질 코딩 유전자로 이루어져 있는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적 단백질이 글리코실트랜스퍼라제인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 융합 단백질을 절단하여 상기 목적 단백질을 상기 바이러스 입자로부터 분리하는 단계, 및 분리된 목적 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 다수개의 막횡단 단편을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 융합 유전자가 혼입된 재조합 벡터를 바이러스 입자를 생산하는 숙주 세포에 도입하는 단계,
    상기 융합 유전자를 상기 숙주 세포에서 발현시켜 다수개의 막횡단 단편을 갖는 상기 단백질과 융합된 상기 목적 단백질 (생산된 융합 단백질은 상기 바이러스 입자에 결합되어 있음)을 생산하는 단계, 및
    상기 목적 단백질을 포함하는 상기 융합 단백질이 결합된 상기 바이러스 입자를 회수하는 단계
    로 이루어진, 단백질 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 융합 유전자가, 상류로부터 순서대로, 다수개의 막횡단 단편을 갖는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 바이러스가 바쿨로바이러스이고 상기 숙주 세포가 곤충 세포인 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적 단백질 중 적어도 활성 부위가 상기 바이러스 입자의 외부에 노출되도록 상기 융합 단백질이 상기 바이러스 입자에 결합되어 있는 것인 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 다수개의 막횡단 단편을 갖는 상기 단백질이 홀수의 막횡단 단편을 갖는 단백질이고, 상기 목적 단백질은 막횡단 단편을 가지고 있지 않는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 다수개의 막횡단 단편을 갖는 상기 단백질이 케모카인 수용체 CCR3인 방법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 융합 단백질을 절단하여 다수개의 막횡단 단편을 갖는 상기 단백질로부터 상기 목적 단백질을 분리함으로써, 상기 바이러스 입자로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 단계, 및 분리된 목적 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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