MX2014014086A - Metodo de seleccion para agentes terapeuticos. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a métodos para detectar unión fuera de diana de candidatos terapéuticos. Este ensayo puede emplearse, entre otras cosas, durante generación u optimización de anticuerpo que lleva a incrementar la probabilidad de obtener un fármaco conveniente.

Description

MÉTODO DE SELECCIÓN PARA AGENTES TERAPÉUTICOS REFERENCIA CRUZADA A UNA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de patente de los E.U.A. N° . de Serie 61/650,964, presentada el 23 de mayo de 2012, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere a métodos de selección para la identificación de agentes terapéuticos que tienen un mayor riesgo de tener rápida eliminación en los seres humanos o los seres humanos y los monos macacos cangrejeros, y métodos para reducir la eliminación de tal agente terapéutico .

ANTECEDENTES Los anticuerpos monoclonales humanos o humanizados han sido ampliamente exitosos como agentes terapéuticos para la enfermedad humana. Más de 30 anticuerpos han recibido aprobación de la FDA para el tratamiento de una variedad de trastornos con varios cientos más actualmente en desarrollo clínico.1 Además de la exquisita selectividad y alta potencia que se pueden lograr con un anticuerpo terapéutico, el éxito de anticuerpos como fármacos se ha beneficiado mucho de su larga típicamente vida media en circulación. Una depuración lenta de la sangre permite que las concentraciones deseadas de drogas sean realizadas con dosis infrecuentes. Fármacos de anticuerpos se administran generalmente mediante infusión intravenosa o inyección subcutánea y administración menos frecuente mejora el cumplimiento del paciente y por lo tanto beneficio clínico.

Los anticuerpos pueden ser eliminados de la circulación sistémica por varios mecanismos - catabolismo intracelular siguiente endocitosis en fase fluida (depuración no específica) , depuración mediada por antígeno4, y en algunos casos debido a la formación de anticuerpos anti-terapéuticos (ATA) . Depuración de antígeno mediada se observa generalmente cuando los anticuerpos se unen al antígeno unido a la célula, es más prominente a bajas concentraciones de anticuerpo, y por lo general puede ser saturada por el aumento de la dosis de anticuerpo. ATA se ha observado que aparece 4-7 días después de la dosificación, involucra la formación de complejos inmunes que puedan ser eliminados rápidamente, y puede a veces ser fácilmente detectada a partir de la forma atípica del perfil de concentración plasmática-tiempo del anticuerpo.

Eliminación de anticuerpos es más lenta a través de un mecanismo de reciclaje dependiente de FcRn. Como un anticuerpo atraviesa la vía endocítica, puede unir a FcRn a pH <6. La unión a FcRn protege la IgG de catabolismo y promueve volver a la superficie apical de células donde puede ser liberada rápidamente en el pH (> 7) de la sangre. Estas características resultan en vidas medias de 6-32 días para los anticuerpos humanos o humanizados en los seres humanos (Keizer, RJ, Huitema, ADR, Schellens, JH , Beijnen, J.H. Clinical Pharmacokinetics of Therapeutic onoclonal Antibodies. Clinical Pharmacokinetics 49, 493-507 (2010)). Sobre la base de los datos farmacocinéticos con 12 anticuerpos IgGl, un valor medio para depuración en los seres humanos de 3.9 + 1.2 (SD) ml/kg/día con la gama de ~ 2-6 ml/kg/día se determinó (Deng, R. et al. Projecting human pharmacokinetics of therapeutic antibodies from nonclinical data: What have we learned? mAbs 3, 61-66 (2011)). Del mismo modo, los estudios de estos anticuerpos en monos macacos cangrejeros produjeron una depuración media de 6.5 + 2.9 (SD) ml/kg/día. Ingeniería de la región Fe del anticuerpo para aumentar la unión a FcRn a pH 6.0 puede aumentar la vida media de los anticuerpos terapéuticos potenciales en monos macacos cangrejeros y en ratones (Dall'Acqua, WF, Kiener, PA S u, H. Properties of human IgGls engineered for enhanced binding to the neonatal Fe receptor (FcRn) . The Journal of biological chemistry 281, 23514-23524 (2006) ; Hinton, P.R. et al. An Engineered Human IgGl Antibody with Longer Serum Half-Life. J Immunol 176, 346-356 (2006); Yeung, Y. A. et al. Engineering human IgGl affinity to human neonatal Fe receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates. J Immunol 182, 7663-7671 (2009); Zalevsky, J. et al. Enhanced antibody half-life improves in vivo activity. Nature biotechnology 28, 157-159 (2010)).

Pruebas preclínicas de un anticuerpo terapéutico potencial en una especie no humana relevante son necesarias para obtener una comprensión del régimen de dosificación previsto en los seres humanos, y para evaluar las toxicidades potenciales. Dado el alto objetivo de homología de secuencia del antígeno entre primates humanos y no humanos (NHP) , y las afinidades de unión similares para el receptor FcRn reciclaje (DallAcqua, Kiener & Wu, supra) , macaco es la especie preferida para farmacocinética preclínica (PK) y estudios de toxicología. Previamente hemos demostrado que la depuración no específica de anticuerpos terapéuticos IgGl determinados en los seres humanos es comúnmente alrededor de la mitad medida en monos macacos cangrejeros (Deng, R. et al., Supra) 8.

Un mecanismo potencial para la más rápida depuración esperada es enlace fuera del objetivo 13-16. Aunque a veces enlace fuera de objetivo puede en ocasiones ser identificado y eliminado14, más a menudo enlace fuera de objetivo es de origen desconocido y difícil de saturar con un aumento de la dosis. En sistemas in vitro para evaluar y predecir los mecanismos in vivo de la absorción, distribución, metabolismo y eliminación o el comportamiento farmacocinético in vivo de anticuerpos, todavía no se han establecido. Hemos tratado de desarrollar ensayos in vitro de la unión no específica que podrían ser útiles para la identificación de anticuerpos que puedan mostrar una rápida depuración en vivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que muestra la correlación de los valores de depuración de anticuerpos medidos en los seres humanos y monos macacos cangrejeros (p = 0.74, n = 16). Para nuestro análisis, se eligieron las dosis de anticuerpos que se cree saturan cualquier depuración dependiente de la diana. La línea continua es un ajuste de regresión lineal del logaritmo de depuración humana al logaritmo de depuración de monos macacos cangrejeros. Para la mayoría de los anticuerpos que se muestran, la depuración humana es aproximadamente 2 veces más lenta que la correspondiente depuración en macacos cangrejeros. Por el contrario, para el anti-NRPl la depuración en humanos (9.2 ml/kg/día) es de ~ 2 veces más rápida que la depuración en monos macacos cangrejeros (4.3 ml/kg/día).

La Figura 2 es una gráfica que muestra los valores de depuración de los anticuerpos (n = 52) en macacos cangre eros . Valores medios geométricos se muestran de grupos de dosis de los que se asume la contribución de cualquier depuración específica a la depuración notificada como insignificante. Excepto por 4 estudios, los valores medios son de 3 o más animales . Se muestran anticuerpos quiméricos humanizados (círculo) , humano (cuadrado) , derivados de fago sintético humano (triángulo) , y quiméricos (diamante) . Símbolos rellenos indican anticuerpos con una cadena ligera lambda, todos los demás tienen una cadena ligera kappa. Anticuerpos de isotipo IgG4 tienen la bisagra de estabilización mutante S228P están marcados con una "x" , todos los demás son isotipo IgGl. Una línea horizontal dentro de una forma geométrica indica un anticuerpo afucosilado. Anticuerpos aglicosilados obtenidos a través de la sustitución de Asn297 con Ala se indican por un punto dentro de una forma geométrica. Los anticuerpos con sustituciones de aminoácidos de Fe para modular la unión FcgammaR se indican por una línea vertical dentro de una forma geométrica.

La Figura 3 es un diagrama de caja que muestra la comparación de los valores de depuración en monos macacos cangrejeros de anticuerpos humanos humanizados y sintéticos derivados de bibliotecas de presentación de fagos. Los anticuerpos quiméricos (n = 1) y anticuerpos humanos a partir de fuentes no- fago (n = 3) no se muestran por el muy pequeño tamaño de los conjuntos de datos. Gráficos muestran valores de datos individuales superpuestos por diagramas de caja. Diagrama de caja rectangular muestra el rango intercuartil (IQR) entre el primer cuartil (percentil 25) y el tercer cuartil (percentil 75) ; la línea horizontal más gruesa dentro del diagrama de caja rectangular es en la mediana (percentil 50) . El diagrama de cajas y bigotes inferior se extiende al valor de datos más bajo que todavía está dentro de 1.5 IQR del cuartil inferior, y el bigote superior se extiende al valor de datos más alto dentro de 1.5 IQR del cuartil superior .

La Figura 4 ilustra la relación entre la depuración de anticuerpos en monos macacos cangrejeros y afinidad de unión (KD, pH 5.8) para monos macacos cangrejeros FcRn. Se utilizan como símbolos definidos en la Figura 2. Las constantes de disociación (KD) en nM se determinaron a partir del análisis en estado estacionario de los datos de SPR como se describe por Yeung et al., 2010. Los símbolos utilizados son los mismos que para la Figura 2.

La Figura 5A-5B ilustra la asociación de valor de depuración de anticuerpos en Fig.5A) monos macacos cangrejeros y Fig.5B) humanos con la puntuación BV ELISA normalizada. Una puntuación BV ELISA> 5 se asocia con un mayor riesgo de una rápida depuración en macaco (p = 0.53, n = 45) . La puntuación BV se calcula a partir de la media de 6 determinaciones; cada determinación se normalizó dividiendo por la señal observada para los pozos sin recubrimiento en la misma placa de ensayo. De anticuerpos con una puntuación BV <5, el 12% tiene depuración> 10 ml/kg/día en monos macacos cangrejeros, mientras depuración excede 10 ml/kg/día para el 75% de los anticuerpos con puntuación BV> 5. Una estimación de máxima verosimilitud para el cociente de probabilidades es de 19.5 (prueba exacta de Fisher, 95%) Intervalo de confianza (3.3, 165.7)). El intervalo de confianza sugiere un aumento de 3.3 a 166 veces en las probabilidades de una depuración más rápida de BV> 5; que el intervalo no contiene 1 implica significación estadística. B) Puntuación BV ELISA> 5 se asocia con un mayor riesgo de una rápida depuración en humanos (p = 0.83, n = 16) .

Las Figuras 6-8 muestran la relación entre la depuración de anticuerpos en monos macacos cangrejeros y el anticuerpo con respecto a A) pl, B) hidrofobicidad medida por HIC, y C) carga calculada para el dominio Fv, respectivamente .

La Figura 9 muestra que las puntuaciones de depuración de macacos cangrejeros y BV ELISA están correlacionadas .

La Figura 10 muestra que la correlación entre la depuración de macacos cangrejeros y puntuación BV normalizado persiste entre los anticuerpos IgGl probados que tienen HUI y marcos kappal y diferentes CDRs y posiciones de vernier.

La Figura 11 muestra que la correlación entre la depuración humana y calificaciones BV ELISA persisten, incluso para anticuerpos anti-NRP-1.

La Figura 12 muestra una posible cascada de cribado para mitigar el riesgo de depuración rápida.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Aquí se describe un ensayo basado en la detección de la unión a partículas de baculovirus (BV) que es útil para evaluar la unión de agentes terapéuticos fuera de diana. Este ensayo se puede utilizar, entre otras cosas, durante la generación o la optimización principal de anticuerpo para aumentar la probabilidad de obtener un fármaco adecuado.

Por las pruebas de un gran panel de anticuerpos en un ensayo de esta invención y el análisis de los resultados de la prueba con los datos farmacocinéticos los mismos anticuerpos en monos macacos cangrejeros y, si está disponible, en los seres humanos, se determinó que la una alteración en la interacción con el receptor FcRn de reciclaje no tomó en cuenta la eliminación más rápida de lo esperado observado para estos anticuerpos. No se encontró que la depuración se asocia con el punto isoeléctrico (pl) o la hidrofobicidad del anticuerpo intacto según lo informado por otros. Creemos que, la unión de fuera de diana representa la rápida depuración de muchos anticuerpos aunque en la mayoría de los casos no se han identificado tales objetivos fuera de diana para la depuración rápida. Consume mucho tiempo y dinero llevar a cabo estudios farmacocinéticos en los primates no humanos y humanos . Antes de esta invención, que era difícil de predecir las contribuciones de unión de fuera de diana a un perfil farmacocinético previo a la modalidad de tales estudios farmacocinéticos in vivo. Hemos desarrollado un ensayo in vitro, de bajo costo, con rendimiento más alto, que es fácil de utilizar y se puede utilizar para ayudar a seleccionar a los candidatos terapéuticos con una mayor probabilidad de tener propiedades farmacocinéticas adecuadas y anular la selección de candidatos terapéuticos con una mayor probabilidad de tener insuficiencia en las propiedades farmacocinéticas en los primates no humanos y seres humanos .

La invención se describirá ahora en detalle a modo de referencia utilizando sólo las siguientes definiciones y ejemplos. Todas las patentes y publicaciones, incluyendo todas las secuencias descritas en dichas patentes y publicaciones, se hace referencia en el presente documento como incorporadas expresamente por referencia.

"Agente terapéutico" se refiere a un agente que puede ser útil en el tratamiento de una enfermedad. En una modalidad, un agente terapéutico comprende una o más secuencias de polipéptidos . En otra modalidad, el agente terapéutico comprende la secuencia de un anticuerpo. En otra modalidad, el agente terapéutico es un inmunoconj ugado .

"BV" como se usa aquí, se refiere a una partícula de baculovirus.

"Puntuación BV" tal como se utiliza aquí se refiere a un valor calculado a partir de la media de los valores a partir de múltiples (2 o más) ensayos de enlace que miden el nivel de unión de un agente terapéutico a una partícula de baculovirus de unión.

Una "puntuación BV normalizada" se refiere a una puntuación BV, en el que el valor de cada ensayo de unión se ha normalizado antes de calcular el valor medio. En una modalidad, la normalización se logra dividiendo el valor de cada ensayo de unión con BV por un valor observado en un ensayo no tratado (es decir, sin BV) . En un ejemplo, el valor de DO de cada ensayo de unión con BV se divide por el valor promedio de los valores de DO observados para pozos no recubiertos .

"Aumento del riesgo" o "mayor probabilidad" se refiere a la mayor posibilidad de que un evento ocurra.

"Depuración rápida" se refiere a la tasa de depuración de un agente en un ser humano o macaco cangrejero. En una modalidad, una tasa de depuración rápida es cualquier tasa que es mayor que 10 ml/kg/día. En otra modalidad, una tasa de depuración rápida es cualquier tasa que es mayor que 12 ml/kg/día.

"Depuración deseable" se refiere a una tasa de depuración deseable de un agente en un ser humano o macaco cangrejero. En una modalidad, una tasa de depuración deseable es de 8.5 ml/kg/día o menos. En otra modalidad, una tasa de depuración deseable es de 12 mL/kg/día o menos.

Tal como se utiliza aquí, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de una proteina heteróloga (una "adhesina" ) con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es otra que el reconocimiento de antígenos y sitio de unión de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contiguos que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, igA (incluyendo IgA-1 y IgA-2) , IgE, IgD o IgM.

Una "proteína de fusión" y un "polipéptido de fusión" se refiere a un polipéptido que tiene al menos dos porciones covalentemente unidas entre sí, donde cada una de las partes es un polipéptido que tiene una propiedad diferente. La propiedad puede ser una propiedad biológica, tales como la actividad in vitro o in vivo. La propiedad también puede ser una simple propiedad química o física, tal como la unión a una molécula diana, la catálisis de una reacción, etc. Las porciones pueden estar ligadas directamente por un enlace sencillo o péptido a través de un enlazador peptídico que contiene uno o más residuos de aminoácidos. Generalmente, las porciones y el enlazador estarán en marco de lectura entre sí .

El término "anticuerpo" se utiliza en la presente en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero no limitado a anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) , y fragmentos de anticuerpos siempre que exhiban la deseada antígeno actividad de unión.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula que no sea un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une el antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a Fv, Fab, Fab ', Fab'-SH, F (ab!) 2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) , por ejemplo; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos .

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" como un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50% o más, y por el contrario, los bloques de anticuerpo de referencia de unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50% o más. Un ensayo de competencia ejemplar se proporciona en el presente documento.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de éstas pueden dividirse además en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 , IgG , IgAl , e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente .

El término "agente citotóxico" tal como se utiliza aquí, se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o causa la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radiactivos (por ejemplo, AT211, 1131, 1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53, BÍ212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu) ; agentes quimioterapéuticos o medicamentos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido) , doxorubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes) ; agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos; y los diversos agentes antitumorales o anticancerosos descritos a continuación.

"Funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras del anticuerpo incluyen: unión a Clq y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) ; Unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) ; fagocitosis; regulación a la baja de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B) ; y la activación de células B.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

El término "región Fc" en el presente documento se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene por lo menos una porción de la región constante. El término incluye la secuencia nativa regiones Fe y regiones Fe variantes . En una modalidad, una región de cadena pesada de IgG humana Fe se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al carboxilo-terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fe puede o puede no estar presente. A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, la numeración de residuos de aminoácidos en la región Fe o una región constante es de acuerdo con el sistema de numeración de la UE, también llamado el índice de la ÜE, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Marco" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable diferentes de los residuos región hipervariable (HVR) . El FR de un dominio variable en general consta de cuatro FR dominios: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR generalmente aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL) : FR1-H1 (Ll) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4.

Los términos "anticuerpo de longitud completa" , "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan aquí de forma intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fe como se define aquí .

Los términos "célula huésped", "línea celular huésped", y "cultivo de células huésped" se usan indistintamente y se refieren a células en las que el ácido nucleico exógeno se ha introducido, incluyendo la progenie de tales células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma sin tener en cuenta el número de pasajes. La progenie puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula madre, pero puede contener mutaciones. Progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como filtrado o seleccionada en la célula originalmente transformada en el presente documento.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más molécula heteróloga (s) , incluyendo pero no limitado a un agente citotóxico o un agente de detección..

El término "detectar" se pretende que incluya la determinación de la presencia o ausencia de una sustancia o cuantificar la cantidad de una sustancia. Así pues, el término se refiere a la utilización de los materiales, composiciones, y métodos de la presente invención para determinaciones cualitativas y cuantitativas.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos) , primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos, conejos) , y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) . En ciertas modalidades, el individuo o sujeto es un ser humano.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural . En algunas modalidades, un anticuerpo se purifica hasta más del 95% o 99% de pureza como se determina mediante, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF) , electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC de fase inversa) . Para una revisión de métodos para la evaluación de la pureza de anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007) .

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que ordinariamente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. "Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos cadenas pesadas y ligeras (o fragmentos de los mismos) , incluyendo dicha molécula de ácido nucleico (s) en un único vector o vectores separados, y dicha molécula de ácido nucleico (s) presente en uno o más lugares en una célula huésped.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, a excepción de posibles variantes de anticuerpos, por ejemplo, que contiene de forma natural mutaciones que ocurren o que surja durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, tales variantes siendo generalmente presentes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales , que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como el obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que se requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante una variedad de técnicas, incluyendo, pero no limitado a, el procedimiento del hibridoma, métodos de ADN recombinante , métodos de expresión en fago, y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen la totalidad o parte de los sitios de inmunoglobulina humana, tales métodos y otros métodos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales que se describe en este documento.

Un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.

"Anticuerpos nativos" se refieren a moléculas de inmunoglobulina de origen natural con diferentes estructuras . Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que son de enlace-disulfuro. A partir de N a C-terminal, cada cadena pesada tiene una región variable (VH) , también llamado un dominio pesado variable o un dominio variable de cadena pesada, seguido de tres dominios constantes (CH1, CH2, y CH3) . Del mismo modo, a partir de N a C-terminal, cada cadena ligera tiene una región variable (VL) , también llamado un dominio variable ligero o un dominio variable de cadena ligera, seguido de un dominio ligero constante (CL) . La cadena ligera de un anticuerpo puede ser asignado a uno de dos tipos, denominados kappa (?) y lambda (?) , basado en la secuencia de aminoácidos de sus dominios constantes .

El término "prospecto" se utiliza para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, la terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de este tipo de productos terapéuticos .

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que es en tal forma como para permitir que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en el mismo para ser eficaz, y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que la formulación sería administrada.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico a un sujeto., Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante, conservador.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales de los mismos tales como "tratar" o "tratamiento") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo que está siendo tratado, y se pueden realizar ya sea para la profilaxis o durante el curso de patología clínica. Efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, alivio de síntomas, disminución de las consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, prevención de la metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o paliación de la estado de la enfermedad, y la remisión o mejora el pronóstico. En algunas formas de modalidad, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para retardar la progresión de una enfermedad.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de un anticuerpo de cadena pesada o ligera que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, con cada dominio comprende cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR) . (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, sexta ed. , WH Freeman and Co., página 91 (2007).) Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para escrutar una genoteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al, Nature 352: 624-628 (1991).

El término "vector", como se usa aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está vinculado. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico auto-replicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que están unidos operativamente. Tales vectores se denominan aquí como "vectores de expresión" .

En un aspecto adicional, un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede incorporar cualquiera de las características, individualmente o en combinación, como se describe en las Secciones 1-7 a continuación: 1. Afinidad de Anticuerpos En ciertas modalidades, un anticuerpo proporcionado en este documento tiene una constante de disociación (Kd) de = ?µ?, < 100 ??, 10 ?? =, < 1 ??, 0.1 ?? <, < 0.01 ??, o < 0.001 ?? (por ejemplo, 10-8 ? o menos, por ejemplo 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, 10-9 M a 10-13 M) .

En una modalidad, Kd se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno tal como se describe por el siguiente ensayo. Afinidad de Fab para la unión al antígeno solución se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de (1251) de antígeno marcado con en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, a continuación, la captura de antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al, J. Mol Biol 293: 865-881 (1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, placas de múltiples pozos MICROTITER® (Thermo Scientific) se recubren durante la noche con 5 g/ml de un anticuerpo anti-Fab captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9.6), y posteriormente se bloquearon con 2% (w/v) de albúmina de suero bovino en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . En una placa no adsorbente (Nunc # 269620) , 100 pM o 26 pM de antígeno

[1251] se mezclan con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, de acuerdo con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en. Presta et al, Cáncer Res 57: 4.593-4.599 (1997)). El Fab de interés se incuba a continuación durante la noche; Sin embargo, la incubación puede continuar por un período más largo (por ejemplo, alrededor de 65 horas) para asegurar que se alcance ese equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora) . Luego se retira la solución y se lava la placa ocho veces con 0.1% de polisorbato 20 (Tween-20 ®) en PBS. Cuando las placas se han secado, 150 1/pozo de líquido de centelleo (Microscint-20 TM; Packard) se añaden, y las placas se contaron en un contador gamma TOPCOUNT TM (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a 20% de la unión máxima se eligen para su uso en ensayos de unión competitiva.

Según otra modalidad, Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmón superficial utilizando un BiaCore®-2000 o una ®-3000 BIACORE (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips de antígeno inmovilizado CM5 a ~ 10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips biosensores carboximetilados de dextrano (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con N-etil-N' - (3 -dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida ( HS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4.8, a 5 mg/ml (~ 0.2 µ?) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, 1 M etanolamina se inyecta para bloquear los grupos no reaccionados . Para mediciones cinéticas, diluciones seriadas dos veces de Fab (0.78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con 0,05% de polisorbato 20 (Tween-20TM) tensioactivo (PBST) a 25 °C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (koff) se calculan utilizando un modelo simple uno-a-uno Langmuir vinculante (programa de evaluación BIACORE ® versión 3.2) ajustando simultáneamente las sensogramas asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999). Si la tasa de constante de afinidad excede de 106 M-l s-1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad en la se puede determinar mediante el uso de una técnica de extinción de la fluorescencia que mide el incremento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm ; emisión = 340 nm, 16 nm de paso de banda) a 25 °C nM de un anticuerpo anti-antígeno 20 (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro de flujo tapón (Aviv Instruments) o un 8000-series SLM-AMINCO TM espectrofotómetro (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. 2. Fragmentos de anticuerpos En ciertas modalidades, un anticuerpo proporcionado en este documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab ', Fab'-SH, F (ab1) 2, Fv, y fragmentos scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpos, véase Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds (Springer-Verlag, Nueva York) , pp 269-315 (1994) ; véase también el documento WO 93/16185; y las patentes de los E.U.A. núms. 5,571,894 y 5,587,458. Para la discusión de Fab y F (ab ' ) 2 fragmentos que comprenden al receptor de rescate vinculante epítopo residuos y de haber aumentado en la semivida in vivo, véase la patente de los E.U.A. No. 5,869,046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos . Véase, por ejemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Science, USA 90: 6444-6448 (1993). Triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

Anticuerpos de un solo dominio son fragmentos de anticuerpos que comprenden todo o una porción del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas modalidades, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humanO (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, Patente de los E.U.A. No. 6,248,516 Bl) .

Los fragmentos de anticuerpos se pueden realizar mediante diversas técnicas, incluyendo, pero no limitado a la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como la producción por las células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o de fagos), como se describe aquí. 3. Anticuerpos quiméricos y humanizados En ciertas modalidades, un anticuerpo proporcionado en este documento es un anticuerpo quimérico. Ciertos anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la Patente de los E.U.A. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc . Nati. Acad. Sci, USA. , 81: 6851 a 6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "clase conmutada" en el que la clase o subclase se ha cambiado de la del anticuerpo parental . Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos .

En ciertas modalidades, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humanizado para reducir la inmunogenicidad para los seres humanos, al tiempo que conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano parental . Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en las que HVRS, por ejemplo, CDRS, (o porciones de los mismos) se derivan de un anticuerpo no humano, y los FRs (o porciones de los mismos) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos . Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante humana. En algunas modalidades, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado están sustituidos con restos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR) , por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad de1 anticuerpo .

Anticuerpos y métodos para fabricarlas humanizados se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008), y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al., Proc. Acad. Sci. USA 86: 10029 a 10033 (1989); Patentes de los E.U.A. números 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, y 7,087,409.; Kashmiri et al, Methods 36: 25-34 (2005) (describiendo SDR (a-CDR) injerto); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) (que describe "recubrimiento");. Dall'Acqua y otros, Methods 36: 43-60 (2005) (que describe "entremezclar FR") ; y Osbourn y otros, Methods 36: 61-68 (2005) y Klimka et al, Br.. J. Cáncer, 83: 252-260 (2000) (que describe el enfoque de la "selección guiada" a entremezclado de FR) .

Regiones marco humanas que pueden usarse para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones marco seleccionadas usando el método de "mejor ajuste" (ver, por ejemplo, Sims et al J. Immunol 151: 2296 (1993)); regiones marco derivadas de la secuencia consenso de los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadena ligera o pesada regiones variables (véase, por ejemplo, Cárter et al Proc Nati Acad Sci USA. , 89: 4285 (1992), y Presta et al, J. Immunol., 151: 2623 (1993)); regiones (somáticamente mutadas) estructurales humanas maduras o regiones marco de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro and Fransson, Front Biosci 13:. 1619-1633 (2008)); y regiones marco derivadas de cribado de bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Baca et al, J. Biol Chem 272: 10678-10684 (1997) y Rosok et al, J. Biol Chem 271: 22.611-22.618 (1996)). 4. Anticuerpos Humanos En ciertas modalidades, un anticuerpo proporcionado en este documento es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando varias técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en Van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol . 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol . 20: 450-459 (2008).

Los anticuerpos humanos se pueden preparar mediante la administración de un inmunógeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una estimulación antigénica. Dichos animales normalmente contienen todo o una porción de los sitios de inmunoglobulina humana, que sustituyen a los sitios de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrado aleatoriamente en los cromosomas del animal. En tales ratones transgénicos, los sitios de inmunoglobulina endógena se han inactivado general . Para una revisión de los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). Véase también, por ejemplo, Patentes de los E.U.A. Nos 6,075,181 y 6,150,584 describe la tecnología XENO OUSETM. ; Patente de los E.U.A. número 5,770,429 describe la tecnología HUMAB®; Patente de los E.U.A. No. 7,041,870 describe la tecnología de KM Mouse®, y la Publicación de Solicitud de Patente de los E.U.A. No. US 2007/0061900, describiendo la tecnología VELOCIMOUSE®) . Regiones variables humanas a partir de anticuerpos intactos generados por estos animales se pueden modificar adicionalmente, por ejemplo, mediante la combinación con una región constante humana diferente .

Los anticuerpos humanos también pueden hacerse por métodos basados en hibridoma. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se han descrito. (Véase, por ejemplo, Kozbor J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp 51-63 ( arcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al, J. Immunol, 147: 86 (1991) los anticuerpos humanos generados a través de la tecnología del hibridoma de células B humanas también se describen en Li et al, Proc) . Nati. Acad. Sci. U.S.A., 103: 3557-3562 (2006). Métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la Patente de los E.U.A. No. 7,189,826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4) : 265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano) . Tecnología de hibridoma humano (tecnología trioma) también se describe en Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3) : 927-937 (2005) y Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (3) : 185 -91 (2005) .

Los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante el aislamiento de Fv clonar secuencias de dominio variable seleccionados a partir de bibliotecas de presentación de fagos derivadas de humanos. Tales secuencias de dominio variable pueden entonces ser combinados con un dominio constante humano deseado. Técnicas para la selección de anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de anticuerpos se describen a continuación. 5. Anticuerpos Biblioteca-Derivado Los anticuerpos de la invención pueden aislarse mediante el cribado de bibliotecas combinatorias de anticuerpos con la actividad o actividades deseadas . Por ejemplo, una variedad de métodos son conocidos en la técnica para generar bibliotecas de presentación de fagos y cribar dichas bibliotecas de anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Tales métodos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en ethods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al, ed, Human Press, Totowa, NJ, 2001..) y se describe adicionalmente, por ejemplo, en el McCafferty et al, Nature 348: 552-554; Clackson et al, Nature 352: 624-628 (1991);. Marks et al., J. Mol. Biol . 222: 581-597 (1992) ; Marcas y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed, Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Nati. Acad. Sci. USA101 (34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Métodos 284 (1-2): 119-132 (2004).

En ciertos métodos de presentación de fagos, los repertorios de genes VH y VL se clonan separadamente por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y recombinan aleatoriamente en las bibliotecas de fagos, que luego pueden ser seleccionados para fago de unión a antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994) . Phage suelen mostrar fragmentos de anticuerpos, ya sea como fragmentos Fv (scFv) de cadena única o como fragmentos Fab. Bibliotecas de fuentes inmunizados proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin el requisito de la construcción de hibridomas . Alternativamente, el repertorio ingenuo puede ser clonado (por ejemplo, de humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de no propio y también se auto antígenos sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al, EMBO J, 12: 725 -734 (1993). Finalmente, las bibliotecas ingenuas también se pueden hacer de manera sintética mediante la clonación no reordenados segmentos de genes V a partir de células madre, y usando cebadores de PCR que contiene la secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variable y para llevar a cabo la reordenación in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter, J. mol. Biol, 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patentes que describen bibliotecas de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: Patente de los E.U.A. No. 5.750.373, y la Patente de los E.U.A. núms publicación 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007 /. 0292936, y 2009/0002360. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aislados a partir de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos en el presente documento. 6. multiespecíficos Los anticuerpos En ciertas modalidades, un anticuerpo proporcionado en este documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos sitios diferentes. En ciertas modalidades, una de las especificidades de unión es para [[PRO]] y la otra es por cualquier otro antígeno. En ciertas modalidades, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de [ [PRO] ] . Los anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos a células que expresan [ [PRO] ] . Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos .

Las técnicas para hacer anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, recombinante co-expresión de dos pares de inmunoglobulina de cadena pesada-cadena ligera que tienen diferentes especificidades (Milstein ver y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), O 93/08829, y. Traunecker et al, EMBO J. 10: 3655 (1991)), y "-mando en hoyos" ingeniería (véase, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. No. 5.731.168). Multi-anticuerpos específicos también pueden ser realizados por técnicas de efectos electrostáticos de dirección para la fabricación de moléculas de anticuerpo heterodimérico-Fc (WO 2009/089004A1) ; entrecruzamiento de dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, Patente US No. 4.676.980, y Brennan et al, Science, 229: 81. (1985)); utilizando cremalleras de leucina para producir anticuerpos bi-específicos (véase, por ejemplo, Kostelny et al, J. Immunol, 148 (5):. 1547-1553 (1992)); utilizando la tecnología de "diacuerpo" para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecífieos (véase, por ejemplo, Hollinger et al, Proc Nati Acad Sci U.S.A., 90: 6.444 a 6.448 (1993)); y el uso de Fv de cadena única (sFv) dímeros (véase, por ejemplo, Gruber et al, J. Immunol, 152:. 5368 (1994)); y la preparación de anticuerpos triespecífieos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Anticuerpos con tres o más sitios funcionales de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos de ingeniería "Octopus", también se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, US 2006/0025576A1) .

El anticuerpo o fragmento de la presente invención también incluye un "doble efecto Fab" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a [ [PRO] ] , así como otra, antígeno diferente (véase, E.U.A. 2008/0069820, por ejemplo) . 7. variantes de anticuerpo En ciertas modalidades, variantes de secuencia aminoacídica de los anticuerpos proporcionados en este documento se contemplan. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Variantes de secuencia aminoacídica de un anticuerpo se pueden preparar mediante la introducción de modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo, o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución puede hacerse para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, de unión a antígeno. a) Sustitución, inserción y deleción Variantes En ciertas modalidades, las variantes de anticuerpo que tiene una o más sustituciones de aminoácidos se proporcionan. Sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones conservadoras . " Los cambios más importantes se presentan en la Tabla 1 bajo el título de "ejemplos de sustituciones", y tal como se describe más adelante en referencia a los amino clases de cadena lateral de ácido. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser introducidos en un anticuerpo de interés y los productos seleccionados para una actividad deseada, por ejemplo, retiene la unión/antígeno mejorada, disminución de la inmunogenicidad, o mejorarse ADCC o CDC.

TABLA 1 Los aminoácidos pueden ser agrupados de acuerdo a las propiedades comunes de la cadena lateral : (1) hidrofóbicos : Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, He; (2) hidrofílieos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acidicos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influencian la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase .

Un tipo de variante por sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . Generalmente, la variante resultante (s) seleccionada para el estudio adicional tendrá modificaciones (por ejemplo, mejoras) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo, aumento de la afinidad, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo parental y/o se han conservado sustancialmente ciertas propiedades biológicas de la anticuerpo parental. Una variante de sustitución de ejemplo es un anticuerpo madurado por afinidad, que puede ser convenientemente generado, por ejemplo, utilizando técnicas de maduración de afinidad basada en expresión de fagos tales como los descritos en el presente documento. Brevemente, uno o más residuos de HVR están mutados y las variantes de anticuerpos en fagos y se criban para una actividad biológica en particular (por ejemplo, afinidad de unión) .

Alteraciones (por ejemplo, sustituciones) se pueden hacer en HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden hacer en HVRs "puntos calientes", es decir, los residuos codificados por los codones que se someten a mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol Biol 207: 179-196 (2008)), y/o DEG (a-CDR) , con la variante resultante VH o VL siendo probados para la afinidad de unión. Maduración de la afinidad mediante la construcción y volver a seleccionar a partir de bibliotecas secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al, ed, Human Press, Totowa, NJ, (2001)) En algunas modalidades de maduración de la afinidad, la diversidad se introduce en los genes variables elegidas para la maduración por cualquiera de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR propensa a error, intercambio de cadenas, o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos) . Se crea entonces una biblioteca secundaria. La biblioteca se criba a continuación, para identificar las variantes de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir la diversidad implica enfoques HVR-dirigido, en el que varios residuos HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez) se asignaron al azar. Residuos HVR implicados en la unión al antígeno pueden ser identificados específicamente, por ejemplo, mediante mutagénesis de barrido de alanina o modelado. CDR-H3 y CDR-L3, en particular, a menudo son blanco.

En ciertas modalidades, las sustituciones, inserciones o eliminaciones pueden ocurrir dentro de uno o más HVRs siempre y cuando dichas alteraciones no reducen sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, las alteraciones conservadores (por ejemplo, las sustituciones conservadoras a lo dispuesto en el presente documento) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión se pueden hacer en HVRs. Tales alteraciones pueden estar fuera de HVR "hotspots" o SDRs . En ciertas formas de modalidad de la variante de VH y VL secuencias proporcionadas anteriormente, cada HVR cualquiera es inalterada, o no contiene más de uno, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

Un método útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que puede ser dirigido para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" , como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. En este método, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) se identifican y se sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Otras sustituciones se pueden introducir en los lugares de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Alternativamente, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos pueden dirigirse o eliminados como candidatos a la sustitución. Las variantes pueden ser examinadas para determinar si contienen las propiedades deseadas .

La secuencia de aminoácidos inserciones incluyen fusiones amino y/o carboxilo-terminal que varían en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al N o C- terminal del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo. b) Variantes de glicosilación En ciertas modalidades, un anticuerpo proporcionado en este documento es alterada para aumentar o disminuir el grado en que el anticuerpo está glicosilado. La adición o supresión de sitios de glicosilación a un anticuerpo pueden ser convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que uno o más sitios de glicosilación se crea o se eliminan.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fe, el hidrato de carbono unido al mismo puede alterarse. Los anticuerpos nativos producidos por células de mamífero comprenden típicamente un oligosacárido ramificado, biantenario que está unido generalmente por un N-enlace con Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15: 26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos hidratos de carbono, por ejemplo, mañosa, N-acetil glucosamina (GlcNAc) , galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a un GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunas modalidades, las modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención se pueden fabricar a fin de crear variantes de anticuerpos con ciertas propiedades mejoradas.

En una modalidad, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de fucosa de tal anticuerpo puede ser de 1% a 80%, del 1% al 65%, del 5% al 65% o del 20% al 40%. La cantidad de fucosa se determina mediante el cálculo de la cantidad media de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, relativa a la suma de todas las glicoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo, complejo, híbrido y altas estructuras de mañosa) según lo medido por MALDI-TOF espectrometría de masas, como se describe en el documento O 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo asparagina localizada en aproximadamente la posición 297 en la región Fe (numeración Eu de residuos de la región Fe) ; sin embargo, Asn297 también puede estar situado alrededor de + 3 aminoácidos aguas arriba o aguas abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a las variaciones menores en la secuencia de anticuerpos. Tales variantes fucosilación pueden haber mejorado la función de ADCC. Véase, por ejemplo, las Publicaciones de Patente de los E.U.A. números 2003/0157108 (Presta, L.).; E.U.A. 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) . Ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpos "desfucosiladas" o "deficientes en fucosa " incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; E.U.A. 2003/0115614; E.U.A. 2002/0164328; E.U.A. 2004/0093621; E.U.A. 2004/0132140; E.U.A. 2004/0110704; E.U.A. 2004/0110282; E.U.A. 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742 ; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol . 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lecl3 deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka et al Arch Biochem Biophys 249: 533-545 (1986); la sol. de Patente de los E.U.A. 2003/0157108 Al, Presta, L y WO 2004/056312 Al, Adams et al, especialmente en el Ejemplo 11) , y las líneas celulares de silenciamiento génico, como gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO de silenciamiento génico (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech Bioeng 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al, Biotechnol Bioeng, 94 (4): 680-688 (2006), y WO2003/085107) .

Anticuerpos variantes se proporcionan más a oligosacáridos bisectados, por ejemplo, en la que un oligosacárido biantenario unido a la región Fe del anticuerpo es bisectado por GlcNAc. Tales variantes de anticuerpo pueden haber reducido fucosilación y/o mejora de la función de ADCC. Ejemplos de tales variantes de anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente de los E.U.A. No. 6,602,684 (Umana et al.); y US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fe. Tales variantes de anticuerpo pueden haber mejorado la función CDC. Tales variantes de anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.). c) Variantes de la región Fe En ciertas modalidades, una o más modificaciones de aminoácidos se pueden introducir en la región Fe de un anticuerpo proporcionado en este documento, generando de este modo una variante de la región Fe . La variante de la región Fe puede comprender una secuencia de la región Fe humana (por ejemplo, una región Fe IgGl humana, IgG2, IgG3 o IgG4) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos .

En ciertas modalidades, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas las funciones efectoras, que lo hacen un candidato deseable para aplicaciones en las que la vida media del anticuerpo in vivo es importante aún ciertas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. In vitro y/o en ensayos de citotoxicidad in vivo pueden llevarse a cabo para confirmar la reduceion/agotamiento de CDC y/o actividades de ADCC. Por ejemplo, ensayos de unión del receptor de Fe (FcR) pueden llevarse a cabo para asegurar que el anticuerpo carece de unión FcDR (por lo tanto probable que carece de actividad ADCC) , pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar ADCC células, NK, expresan FcDRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcORI, FcDRII y FcDRIII. La expresión de FcR en las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991) . Ejemplos de ensayos in vitro no limitantes para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describe en la Patente de los E.U.A. No. 5,500,362 (véase, por ejemplo Hellstrom, I. et al Proc Nat ' 1 Acad Sci E.U.A. 83: 7059- 7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Acad.

Sci. USA82: 1499-1502 (1985); (Ver Brüggemann, M. et al, J. Exp Med 166: 1351-1361 (1987)) 5821337. Alternativamente, los métodos de ensayos no radiactivos pueden emplearse (véase, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radiactivo para citometría de flujo ACTI ™ (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA, y ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI) . células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células Destructoras Naturales (NK) las. Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al Proc Nat'l Acad Sci E.U.A. 95: 652-656 (1998) ensayos de unión a Clq también pueden llevarse a cabo para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a Clq y por lo tanto carece de actividad CDC. véase, por ejemplo, Clq y C3c ELISA de unión en el documento WO 2005/100402 y WO 2006/029879. para evaluar la activación del complemento, un ensayo CDC se puede realizar (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996); Cragg, MS et al, Blood 101: 1045-1052 (2003) y Cragg, MS y MJ Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004)). De unión a FcRn y la depuración in vivo/determinaciones de la vida media también se puede realizar utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, SB et al, Int'l Immunol 18 (12): 1759-1769 (2006) ) .

Los anticuerpos con la función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fe 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (Patente de los E.U.A. No. 6,737,056). Tales mutantes incluyen mutantes Fe Fe con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante "DANA" Fe con la sustitución de los residuos 265 y 297 a alanina (Patente US No. 7,332,581).

Se describen algunas variantes de anticuerpos con mejorada o disminuida unión a FcR. (Véase, por ejemplo, Patente de los E.U.A. No. 6,737,056, WO 2004/056312, y Shields et al, J. Biol Chem 9 (2): 6591 a 6604 (2001).) En ciertas modalidades, una variante de anticuerpo comprende una región Fe con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, por ejemplo, las sustituciones en las posiciones 298, 333, y/o 334 de la región Fe (numeración de residuos de la UE) .

En algunas modalidades, las modificaciones se realizan en la región Fe que dan como resultado alterada (es decir, ya sea mejorada o disminuida) de unión a Clq y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) , por ejemplo, como se describe en la Patente US No. 6,194,551, WO 99/5*1642, y Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178 a 4184 (2000).

Los anticuerpos con aumento de la vida media y la mejora de la unión al receptor Fe neonatal (FcRn) , que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al, J. Immunol 117. 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol 24: 249 (1994)), se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et al) .. Esos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones de éstos que mejoran la unión de la región Fe a FcRn. Tales variantes de Fe incluyen aquellos con sustituciones en una o más de residuos de la región Fe: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución de la región Fe del residuo 434 (Patente de los E.U.A. No. 7,371,826).

Ver también Duncan & Winter, Nature 322: 738-40 (1988); Patente de los E.U.A. N° 5,648,260; Patente de los E.U.A. N° 5.624.821; y WO 94/29351 sobre otros ejemplos de variantes de la región Fe. d) Variantes de anticuerpos con ingeniería de cisteína En ciertas modalidades, puede ser deseable para crear anticuerpos de ingeniería de cisteína, por ejemplo, " thioMAbs" , en el que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En modalidades particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Mediante la sustitución de aquellos residuos con cisteína, grupos tiol reactivos se colocan de este modo en los sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de enlace con las drogas, para crear un inmunoconjugado, tal como se describe adicionalmente en la presente. En ciertas modalidades, uno o más de los siguientes restos puede estar sustituido con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración de la UE) de la cadena pesada; y S400 (Numeración EU) de la cadena pesada región Fe . Anticuerpos de cisteína de ingeniería se pueden generar como se describe, por ejemplo, en la Patente de los E.U.A. No. 7,521,541. e) Derivados de anticuerpos En ciertas modalidades, un anticuerpo proporcionado en este documento puede modificarse adicionalmente para contener restos no proteicos adicionales que se conocen en la técnica y fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a polímeros solubles en agua. Ejemplos de polímeros solubles en agua no limitantes incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicol (PEG) , copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli 1, 3 , 6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (bien homopolímeros o copolímeros aleatorios) , y dextrano o poli (n-vinil pirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propropilen glicol, co-polímeros óxido de polipropilen/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) , alcohol de polivinilo, y mezclas de los mismos. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si más de un polímero están unidos, pueden ser las mismas o diferentes moléculas. En general, el número y/o tipo de polímeros utilizados para la derivatización puede determinarse basándose en consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones del anticuerpo particular a mejorar, si el derivado de anticuerpo se utilizará en una terapia bajo condiciones definidas, etc En otra modalidad, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y resto proteico que se puede calentar de forma selectiva por exposición a la radiación. En una modalidad, el resto no proteico es un nanotubo de carbono (Kam et al, Proc Nati Acad Sci E.U.A. 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no está limitado a, las longitudes de onda que no dañan las células normales, pero que calientan el resto no proteico a una temperatura a la que se matan las células próximas a la fracción-anticuerpo no proteico.

Métodos recombinantes y composiciones Los anticuerpos pueden ser producidos utilizando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la Patente de los E.U.A. No. 4,816,567. En una modalidad, se proporciona ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento. Tal ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo) . En una modalidad adicional, (por ejemplo, vectores de expresión) se proporcionan uno o más vectores que comprenden tales ácidos nucleicos. En una modalidad adicional, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En una modalidad, una célula huésped comprende (por ejemplo, ha sido transformada con) : (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo , o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una modalidad, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, un ovario de hámster chino (CHO) o células linfoides (por ejemplo, YO, NSO, célula Sp20) . En una modalidad, se proporciona un método de fabricación de un anticuerpo, en el que el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, según lo dispuesto anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo desde la célula huésped (o medio de cultivo de la célula huésped) .

Para la producción recombinante de un anticuerpo, ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aisla y se inserta en uno o más vectores para su posterior clonación y/o expresión en una célula huésped. Tal ácido nucleico se puede aislar fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo) .

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo se incluyen células procariotas o eucariotas descritas en este documento. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir en bacterias, en particular cuando no son necesarias la glicosilación y la función efectora de Fe. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véase, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. núms . 5,648,237, 5,789,199, y 5,840,523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (BKC Lo, ed. , Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpos en E. coli.) Después de la expresión, el anticuerpo puede ser aislado de la pasta celular bacteriana en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras son anfitriones de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican el anticuerpo, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas vías de glicosilación han sido "humanizadas", que resulta en la producción de un anticuerpo con una o parcialmente patrón de glicosilación completamente humano. Ver Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004), y Li et al, Nat.. Biotech. 24: 210-215 (2006).

Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpo glicosilado también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados) . Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Numerosas cepas de baculovirus se han identificado que se pueden usar en conjunción con células de insectos, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Cultivos de células vegetales también se pueden utilizar como huéspedes. Ver, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. núms. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, y 6,417,429 (que describe la tecnología PLA TIBODIESTM para producir anticuerpos en plantas transgénicas) .

Las células de vertebrados también pueden utilizarse como huéspedes. Por ejemplo, líneas celulares de mamíferos que están adaptadas para crecer en suspensión pueden ser útiles. Otros ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7) ; la línea renal embrionaria humana (células 293 ó 293 como se describe, por ejemplo, en Graham et al, J. Gen Virol 36:59 (1977)); células de riñon de cría de hámster (BHK) ; células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol Reprod 23: 243-251 (1980) ) ; células de riñon de mono (CV1) ; Células de riñon de mono verde africano (VERO-76) ; células humanas de carcinoma de cuello uterino (HeLa) ; células de riñon canino ( DCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A) , células de pulmón humano (W138) ; células de hígado humano (Hep G2) ; de tumor mamario de ratón (MMT 060562) ; células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Armáis NY Acad Sci 383: 44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4 Otras líneas celulares huésped de mamíferos útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) , incluyendo las células CHO DHFR (Urlaub et al., Proc Nati Acad Sci E.U.A. 77: 4216 (1980)), y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0 y SP2/0 para una revisión de ciertas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (BKC Lo, ed. , Humana Press, Totowa, NJ) , pp. 255-268 (2003) .

En la descripción experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); M (molar) ; M (micromolar) ; N (Normal) ; mol (moles) ; mmol (milimoles) ; mol (micromoles) ; nmol (nanomoles) ,- g (gramos) ; mg (miligramos) ; kg (kilogramos) ; g (microgramos) ; L (litros) ; mi (mililitros) ; 1 (microlitros) ; cm (centímetros) ; mm (milímetros); m (micrómetros) ; nm (nanómetros) ; °C (grados centígrados) ; h (horas) ; min (minutos) ; sec (segundos) ; ms (milisegundos) ; Ci (Curies) mCi (milicuries) ; Ci (microCuries) ; TLC (cromatografía en capa fina) ; Ts (tosilo) ; Bn (bencilo) ; Ph (fenilo) ; Ms (mesilo) ; Et (acetato) , Me (metilo) .

EJEMPLOS La presente invención se describe con mayor detalle adicionalmente en los siguientes ejemplos que no están de ninguna manera destinados a limitar el alcance de la invención como se reivindica. Las figuras adjuntas se han de considerar como parte integral de la especificación y descripción de la invención. Todas las referencias citadas se incorporan aquí expresamente por referencia para todos lo que se describe en la misma. Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar la invención reivindicada.

Esta aplicación incorpora por referencia las solicitudes de patentes y las patentes y publicaciones citadas en este documento, en su totalidad, incluyendo específicamente Hotzel et al, (2012), " la célula huésped ", mAbs 4: 6, 1-8.

Ejemplo 1 Determinación de depuración en macacos Este ejemplo ilustra el método estándar utilizado para determinar depuración de un anticuerpo en un primate no humano .

Farmacocinéticas de anticuerpos se determinaron después de la administración intravenosa de una dosis única o dosis múltiples de anticuerpo terapéutico en monos macacos cangrejeros. Las muestras de suero se prepararon a partir de sangre recogida en varios puntos de tiempo y concentración de anticuerpos se determinó mediante ELISA. En la mayoría de los casos, el ELISA consistió de captura con el antígeno recubierto seguido por la detección con anticuerpo anti-Fc humano. Ensayo ELISA de anticuerpo 26 emplea un anticuerpo anti-idiotipo para la captura. Anticuerpos 14, 17, 24, 33, y 44 utilizaron un ELISA sándwich de Fe anti-humano de para la determinación de la concentración de suero. La concentración sérica frente a perfiles de tiempo se analizaron utilizando el análisis no compartimental para calcular la depuración total (Deng, R. et al. Pharmacokinetics of humanized monoclonal anti-tumor necrosis factor- {alpha} antibody and its neonatal Fe receptor variants in mice and cynomolgus monkeys. Drug metabolism and disposition: the biological fate of Chemicals 38, 600-605 (2010)). La depuración a la dosis más alta probada para cada anticuerpo se informó como la depuración no específica, y se supuso que la contribución de la depuración específica a la depuración total era insignificante .

Usando un conjunto de datos ligeramente más grande que los disponibles anteriormente (Deng, R. et al Projecting human pharmacokinetics of therapeutic antibodies from nonclinical data: hat ha e we learned? mAbs 3, 61-66 (2011) ) , confirmamos una fuerte correlación entre los valores de depuración medidos en macacos y seres humanos (Fig. 1, el coeficiente de correlación de Spearman (?) = 0,74). Se obtiene una directriz de escala simple en la que la depuración en los seres humanos es de aproximadamente 2 veces más lenta que la depuración medida en monos macacos cangrejeros, con el anticuerpo anti-NRPl como un valor atípico .

Ejemplo 2 Determinación de la afinidad de FcRn El siguiente ejemplo detalla cómo se pueden determinar las constantes de disociación en equilibrio (KD) .

Constantes de disociación en equilibrio (KD) para la unión de mono macacos cangrejeros FcRn al anticuerpo inmovilizado se determinaron a partir de resonancia de plasmón de superficie (SPR) mediciones en un instrumento Biacore® 4000 (GE Healthcare) . Mono Macacos cangrejeros FcRn se prepararon como se ha descrito previamente (Yeung, YA et al Ingeniería afinidad de IgGl humano al receptor Fe neonatal humano Engineering human IgGl affinity to human neonatal Fe receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates J Immunol 182, 7663-7671 (2009)). Un chip sensor serie S se acopló, normalizó y preparó para abordar hidrodinámico utilizando un protocolo suministrado por el fabricante. Todos los 5 puntos de cada una de 4 celdas de flujo se activaron para el acoplamiento de amina a través de 10 minutos de exposición a la solución de EDC/NHS (0.2 M de N-etil-N '- (3-dietilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida 0,05 M (NHS) .. el anticuerpo se acopla a los puntos 1, 2, 4, y 5 a través de 7 minutos de exposición a una solución que contiene 2 mg de anticuerpo/ml y NaOAc 10 mM, pH 5. sitios sin reaccionar se bloquearon luego a través de 7 minutos de exposición de todos los 5 puntos a 1 M de etanolamina. en este formato, el punto 3 es la célula de referencia, 4 anticuerpos diferentes se acoplan por la celda de flujo, con un total de 16 por chip sensor, densidades de acoplamiento estuvieron en el rango de 200-1000 RU de anticuerpo, experimentos separados indican que KD calculada no varió con la densidad de acoplamiento en este rango (datos no presentados) . una serie de soluciones de FcRn de mono macacos cangrejeros variaban en concentración de 10 M a 0,04 M en incrementos de 2 veces se prepararon en un tampón de desarrollo que contiene 25 mM MES, HEPES 25 mM, NaCl 150 mM, 0005% de polisorbato-20, sensogramas se recogieron pH 5,8. para la inyección de 60 1 de estas soluciones, y un tampón único control, sobre el chip sensor a una velocidad de flujo de 30 µ?/min. La temperatura de medición fue de 25 °C, la disociación se controló durante 180 segundos y entonces cualquier FcRn permaneciendo unido se eluyó mediante la inyección de 30 1 de una solución que contiene 50 mM Tris-HC1, NaCl 150 mM, 0.05% de polisorbato-20, pH 8. Constantes de disociación se calcularon a partir Análisis de Afinidad de Estado Estacionario usando el programa Biacore 4000 de evaluación 1.0.

Ejemplo 3 Producción de antigeno para ELISA Este ejemplo describe la producción del sustrato utilizado para revestir placas de microtitulación para su uso en el ensayo descrito en el presente documento.

Partículas de baculovirus se obtuvieron mediante la infección de 1.8 x 109 células Sf9 de insectos en 600 mi de suero libre de medios de comunicación (ESF921 sistemas de expresión, Davis, CA) con un nucleopoliedrovirus Autographa californica recombinante que expresa la proteína verde fluorescente (Bac-to-Bac, Invitrogen) a una multiplicidad de infección de aproximadamente 1. cultivos infectados se incubaron durante 40 horas a 27 °C con agitación (200 rpm) , se recogieron y las células se eliminan por centrifugación a 5000 xg durante 10 minutos. El virus en el sobrenadante se sedimentaron por centrifugación a 25.000 xg durante 4 horas a 4°C, se resuspendieron en tampón PBS (NaCl 150 mM, 10 mM de fosfato de sodio, pH 7.4), en capas en un 4 mi 35% (w/v) colchón de sacarosa en PBS y se centrifugaron en un rotor SW40TÍ (Beckman) a 30.000 rpm durante 1 hora a 4°C. El sobrenadante se descartó con los desechos, el sedimento de virus se enjuagó suavemente una vez con PBS, se resuspendió en 1.2 mi de PBS con un cóctel inhibidor de proteasa (Roche) y se almacenó a 4°C durante hasta 4 meses.

Fracciones de membranas celulares Sf9 crudas se obtienen a partir de células no infectadas. Un total de 2 x 108 células Sf9 no infectadas cultivadas en medios libres de suero FSE se lavaron una vez en PBS y se resuspendió en 4 mi de tampón de lisis enfriado con hielo (EDTA 1 mM, tampón HEPES 50 mM, pH 7.4, cóctel inhibidor proteasa completo). Las células fueron transferidas a un homogeneizador Dounce y rompen con 8 golpes de una mano de mortero holgada. Se añadieron otros 4 mi de tampón de lisis que contiene 0.5 M de sacarosa a las células lisadas y las células se dividen más arriba con 8 golpes de una mano de mortero de ajuste firme. El lisado se centrifugó durante 10 minutos a 500 xg a 4°C para eliminar las mitocondrias, núcleos y los desecho más gruesos. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo y se centrifugó a 25,000 xg durante 20 minutos a 4°C. El sedimento se lavó una vez con tampón de lisis y se resuspendió en 5 mi del mismo tampón utilizando un homogeneizador Dounce con una mano de mortero ajustada. Residuos de gran tamaño se eliminaron por centrifugación a 500 xg a 4°C.

Ejemplo 4 Ensayo ELISA Antígeno (por ejemplo, partículas de baculovirus) se inmovilizó en placas ELISA de 384 pozos (Nunc Maxisorp) mediante la adición de 25 µ? de una suspensión de baculovirus 1% en tampón carbonato de sodio 50 mM pH 9.6 a cada pozo, lo que permite que las partículas se adsorben a las placas durante la noche a 4°C. Los pozos se bloquearon con 50 µ? de tampón de bloqueo (PBS que contiene 0.5% de BSA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de enjuagar las placas tres veces con PBS, los anticuerpos purificados se diluyeron en serie en tampón de bloqueo, se añadieron 25 µ? por duplicado a los pozos de ELISA y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente . Las placas se lavaron 6 veces con PBS y 25 µ? de 10 ng/ml de cabra anti-IgG humana, (Fcgamma fragmento específico) conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson) se añadieron a cada pozo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron 6 veces en PBS y 25 µ? de sustrato TMB a cada pozo. Las reacciones se detuvieron después de 15 minutos mediante la adición de 25 µ? de ácido fosfórico 1 M a cada pozo y las absorbancias se leyeron a 450 nm, con referencia a 620 nm. Puntuación BV se calcula a partir de la media de 6 determinaciones de densidad óptica cada uno de los cuales había sido normalizado dividiendo por la señal promedio observada para los pozos no recubiertos . Para los ensayos con membranas de las células Sf9, una suspensión al 2% de las membranas en bruto se utiliza para recubrir placas de ELISA en lugar de partículas de baculovirus . Los detergentes no se han añadido a los tampones en cualquier paso.

Ejemplo 5 Análisis FACS Células HEK293 se resuspendieron en suero bovino fetal al 10%-DMEM a 5 x 106 células/ml y se dispensaron en placas de 96 pozos de fondo en U en 100 µ?/????. Se añadió un volumen igual de IgG (30 a 50 nM concentración final) diluido en PBS (NaCl 150 mM, fosfato de sodio 10 mM, pH 7.4) a las células y se incubó durante 1 h a 4°C. Las células fueron lavadas 3 veces con PBS enfriado con hielo, se incubaron con un conjugado de IgG Fc-R-ficoeritrina anti-humano (Jackson Immunoresearch) o un conjugado anti-humano IgG-Alexa488 (Molecular Probes) durante 30 min a 4°C, se lavaron dos veces en PBS enfriado con hielo y se fijaron en PBS con 0.1% de paraformaldehído . Las células se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences) con un muestreador de alto rendimiento .

Ejemplo 6 Análisis Estadístico Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando R (R Development Core Team (2011) R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria ISBN 3-900051-07-0, disponible en línea en R-project [dot] org) . La evaluación del desempeño de la marca BV en la correcta identificación de los anticuerpos de rápida o de lenta depuración utilizando la proporción de probabilidades como se describe en la leyenda de la Figura 5A-5B es optimista porque se realizó utilizando el mismo conjunto de datos utilizados para determinar el umbral de depuración de seccionamiento de BV = 5. Se obtuvo una evaluación más conservadora de la utilidad del ensayo in vitro para el umbral de depuración de 10 ml/kg/día usando la validación cruzada y el modelo de regresión de 5 veces para determinar el umbral de puntuación de BV; este enfoque dio una estimación de proporción de probabilidades más modesta de 14.1 (95% Intervalo de confianza (2.4,113.3)).

Ejemplo 7 Escala predictiva día depuración humana de depuración en monos Usando un conjunto de datos un poco más grandes que el disponible anteriormente 8, confirmamos una fuerte correlación entre los valores de depuración de medidas en macacos y humanos (Fig. 1, el coeficiente de correlación de Spearman (p) = 0.74). Se obtiene una directriz de escala simple en que la depuración de los seres humanos es de aproximadamente 2 veces más lenta que la depuración de monos macacos cangrejeros, con el anticuerpo anti-NRPl como un valor atipico.

Ejemplo 8 Caracterización de variantes estructurales y depuración en monos macacos cangrejeros para un panel de anticuerpos terapéuticos En el curso normal de desarrollo preclínico, los datos farmacocinéticos en monos macacos cangrejeros se han recogido para 52 anticuerpos humanizados y humanos . El isotipo predominante de estos anticuerpos, es IgGl, kappa (n = 46) . Este panel de anticuerpos incluye también 4 IgGl, lambda, y 2 IgG4, los anticuerpos kappa. Los anticuerpos IgG4 incorporan la sustitución de la bisagra de estabilización de S228P 17. Cinco de los 52 anticuerpos son aglicosilado para reducir la función efectora, 1 se afucosila para aumentar la actividad ADCC, y 3 Fe tener sustituciones de aminoácidos para eliminar o aumentar FcgammaR de unión. Los dominios variables de estos anticuerpos son o bien humanizados (n = 32) , derivado de bibliotecas 18 fago de anticuerpo humano sintético (n = 16), humana (n = 3), o el ratón (n = 1; Rituximab) . Estos anticuerpos muestran una amplia gama de valores de depuración (Fig. 2) con 15 (29%) anticuerpos que tienen una eliminación más rápida de 10 ml/kg/día.

La hipótesis de que la depuración rápida está asociado con los anticuerpos de bibliotecas sintéticas que se investigó. Los anticuerpos derivados de bibliotecas sintéticas de fagos de anticuerpos humanos fueron seleccionados y optimizados a través selectionl8 in vitro. La mayoría de estos maduración de la afinidad requerida a través de cambios de aminoácidos en sus regiones determinantes de complementariedad (CDRs) a fin de lograr la afinidad y la potencia requeridas . Aunque muchos de los anticuerpos humanizados también tienen sustituciones de CDR relativos a la secuencia de roedor, bien para mejorar la afinidad o la estabilidad química, en general, los anticuerpos humanizados han sido sometidos a menos en la optimización vitro. Una preocupación con la selección in vitro es que puede resultar en interacciones inadvertidamente fuera de objetivo ya que la selección negativa que se puede realizar in vitro es menos extensa que puede ocurrir en vivol3. Sin embargo, una comparación de los anticuerpos humanizados derivados de la biblioteca y sintéticos indica un intervalo de superposición de los valores de depuración (Fig 3) . El valor de depuración media es de 6.5 ml/kg/día para los anticuerpos humanizados y 9.0 ml/kg/día para los anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de fagos sintéticos . Estos datos no proporcionan evidencia de una asociación entre la biblioteca de anticuerpos sintéticos y depuración rápida (P = 0.28, prueba de Wilcoxon) .

Ejemplo 9 La afinidad de unión a los monos macacos cangrejeros Con el fin de probar si las variaciones en la unión FcRn podrían ser responsables de la gama de valores de depuración observada, hemos utilizado métodos de resonancia de plasmón superficial (SPR) para determinar valores de Kd para la unión de estos anticuerpos a FcRn mono macacos cangrejeros purificado a pH 5.8. Ya que IgG-FcRn vinculante es una interacción relativamente débil, se utilizó un enfoque de estado estacionario descrito previamente 11 para determinar las constantes de unión. Efectos de avidez derivados de 2: 1 FcRn: interacción IgG se evitaron mediante la inmovilización de cada uno de los anticuerpos (n = 44) que estaban disponibles para el análisis. Valores de Kd determinados de esta manera variaron de aproximadamente 250 nM a 1500 nM. Dado que cada anticuerpo se inmoviliza por separado usando un acoplamiento aleatorio a través de grupos amino, con una incertidumbre concomitante en la orientación en la superficie del chip sensor, un rango en valores de Kd no fue inesperado. Múltiples (n = 7) determinaciones de la KD para Pertuzumab indica una media de 940 ± 140 (SD) nM. El método de medición puede detectar cambios en la afinidad de FcRn, ya que podíamos reproducir efectos de unión (datos no mostrados) para los mutantes de Fe conocidos para aumentar la afinidad para FcRn 19. La depuración más rápido observado para algunos anticuerpos no es debido a un pH bajo alterada afinidad por la unión macacos cangrejeros mono FcRn (Fig 4) . De hecho, una comparación de varios anticuerpos con afinidades de unión a FcRn aproximadamente idénticas dio un rango de casi 30 veces en los valores de depuración. Experimentos separados (datos no mostrados) indicaron que la tasa de disociación de mono macacos cangrejeros FcRn de estos anticuerpos a pH 7,4 fue rápida y equivalentes entre el panel de prueba. Aunque estos experimentos son insuficientes para descartar un cambio en la vía de reciclado de algunos anticuerpos como una explicación para la rápida depuración observada, parece poco probable que un cambio significativo en la afinidad de unión a pH 5.8 o en la cinética de depuración a pH neutro juega un papel importante en la depuración rápida.

Ejemplo 10 Desarrollo del ensayo in vitro para la mitigación del riesgo de depuración rápida Depuración rápida observada por unos anticuerpos se ha asociado con enlace fuera de diana especifico 14 , 15 o no específica 13, 16. Durante la generación de anticuerpos y la optimización, la mayoría de los anticuerpos en nuestro panel fueron seleccionados por falta de unión a antígenos homólogos estrechamente relacionados. Además, muchos de los anticuerpos derivados a través de la presentación en fagos se seleccionaron en presencia de aditivos para evitar el enriquecimiento de la unión no específica 20. Como se ha señalado por Wu et al. 13, la detección por ELISA con una variedad limitada de antígenos no puede detectar el tipo de enlace fuera de diana específico o no específico que puede influir en el comportamiento in vivo. Por lo tanto, hemos tratado de desarrollar un ensayo in vitro útil para identificar anticuerpos que puedan mostrar una rápida depuración. En el curso de los experimentos con partículas BV intactas teniendo objetivos unidos a la membrana específicos como antígeno en ensayos ELISA 21, observamos que algunos anticuerpos unidos a partículas de baculovirus que no expresan el objetivo. Muchos de estos anticuerpos también se demostró que se unen no específicamente a las células que no expresan humanos 293 por FACS (datos no mostrados) . Sin embargo, la expresión de algunos antígenos afines en células 293 hizo difícil distinguir específica de la unión no específica.

Una pantalla inicial contra un equipo de prueba de 15 anticuerpos seleccionados desde el panel de la Figura 2 sugiere que los anticuerpos de depuración rápidos unidos no específicamente en los baculovirus (BV) ELISA. Posteriormente, un grupo mayor de 45 anticuerpos se ensayó en el ensayo. Si bien existe una considerable variabilidad, una puntuación más alta en el ensayo in vitro se asocia con una eliminación más rápida de macaco (Fig. 5A) . Umbrales de> 10 ml/kg/día para la depuración de "rápida" y> 5 para la puntuación BV normalizado son útiles para la cuantificación de estos datos . Un valor de depuración de 10 ml/kg/día es más que 1 desviación estándar del valor medio (6.5 ± 2.9) determinado para 12 anticuerpos IgGl humanos en monos8. Con estos umbrales, 9 anticuerpos se identifican correctamente ("verdaderos positivos") por tener una rápida depuración en monos, con sólo 3 "falsos positivos" - anticuerpos con valores de depuración <10 ml/kg/día que muestran una puntuación normalizada BV> 5. Cuatro anticuerpos son "falsos negativos", que tiene depuración superior a 10 ml/kg/día y una puntuación BV <5. Los 29 restantes anticuerpos se identifican correctamente como "verdaderos negativos" .

Aunque el conjunto de datos (n = 16) es menor, un mayor riesgo de depuración rápida en los seres humanos también se asocia con la puntuación más alta BV (Fig 5B; Spearman de pho = 0.83). Cinco anticuerpos con una depuración más rápida de 5 ml/kg/día en los seres humanos se identifican correctamente en el ensayo. En particular, el anticuerpo anti-NRPl que tenía depuración <10 ml/kg/día en monos macacos cangrejeros se detecta como un verdadero positivo para la depuración de BV de humano en ELISA. Un anticuerpo que tiene depuración > 5 ml/kg/día en los seres humanos, y> 10 ml/kg/día en macacos, no se identifica en el ensayo. Los 10 anticuerpos restantes fueron clasificados correctamente como que tienen depuración lenta en los seres humanos .

Hemos probado si la BV ELISA podría ser utilizada de forma prospectiva para ayudar a la selección de candidatos a través de la ayuda adicional de ingeniería de anticuerpos 47. Este es un anticuerpo humanizado con cambios de aminoácidos en las CDRs, tanto para la mejora de la afinidad y para eliminar las posibles responsabilidades de secuencia. Mono macacos cangrejeros es una especie no-diana se determinó para el anticuerpo 47. Tinción de tejidos no reproducible se observó en monos con el anticuerpo 47, pero una depuración de 20.2 ml/kg/día en monos macacos cangrejeros se determinó para este anticuerpo. Una variante de anticuerpo 47 que retiene 2 de los cambios de maduración de afinidad, y un cambio de aminoácido para eliminar un potencial sitio de glicosilación ligada a N en una de las CDRs de cadena pesada (anticuerpo 47b) , demostraron una reducción de la unión en el BV ELISA (Tabla 2) . Anticuerpo 47c retiene sólo el cambio de aminoácidos para eliminar el sitio potencial de glicosilación ligada a N y también había reducido BV unión. Experimentos separados indicaron que una gran contribución a la unión del anticuerpo 47 BV se hizo por el cambio VL-D27cS para eliminar un sitio potencial de isomerización Asp-Gly. Anticuerpos 47b y 47c tenido más lenta depuración en relación con anticuerpo 47 en monos macacos cangrejeros (Tabla 2) .

Ejemplo 11 La amplia distribución de los valores de depuración en monos macacos cangrejeros medido para este panel de anticuerpos, así como la eliminación más rápida (> 10 ml/kg/día) observada para 15 de los anticuerpos, era inesperado. Ya que 40 de los 52 anticuerpos tienen idénticas secuencias IgGl Fe humanos, se esperaba que una eliminación más rápida no se asocia con cambios en la interacción FcRn. De hecho, aunque la KD medida para unión a FcRn a pH 5.8 varía en un rango de 7 veces, esto no se asoció con una tendencia en los valores de depuración. Teniendo en cuenta que los aumentos relativamente importantes en el pH 5.8 FcRn de afinidad lleva a una modesta me oría en la depuración 19, no es de extrañar que las pequeñas diferencias en la afinidad FcRn determinadas aquí no tienen un impacto en la depuración. Todos los anticuerpos ensayados mostraron una liberación equivalente y rápida de FcRn a pH neutro. En contraste con los resultados reportados por Wang et al. 22 , no se detecta una asociación entre la depuración y un impacto de la porción Fab del anticuerpo sobre la cinética de liberación FcRn a pH neutro. Nuestro estudio utilizó un panel más grande de anticuerpos y una orientación diferente de los experimentos de SPR para minimizar los efectos de avidez en la unión.

Dado que la mayor diferencia entre los anticuerpos en nuestro panel se encuentra en los dominios variables, y en particular en las CDRs, es probable que las diferencias en la composición de estos dominios contribuyen a la variabilidad en el comportamiento de depuración. Otros grupos han observado efectos sobre la depuración asociados con cambios en la secuencia de CDR que no estaban relacionadas con las diferencias en la afinidad de unión al antígeno diana 13, 16 no encontramos que la depuración está asociado con el punto isoeléctrico (pl) o la hidrofobicidad del anticuerpo intacto ( Fig. , Supl 1A,B) . Igawa et al. 23 han demostrado previamente que la remoción de un anticuerpo IgGl humano en macacos se puede reducir mediante cambios en el dominio variable que se traducen en un pl inferior. Este efecto se observó a una dosis si la depuración significativa dependiente de antígeno estaba operando . El mecanismo se presume que no FcRn dependiente. Para una comparación de un gran panel de anticuerpos, con los datos farmacocinéticos recogidos en dosis donde la vida media es FcRn dependientes, las tasas de depuración no dependen de pl . Una salvedad a esta conclusión es que la mayoría de los anticuerpos en este análisis se agrupan en un rango relativamente estrecho de valores de PI (7.5 a 9.5) por lo que quizás se observó una tendencia si se probó una gama más amplia de pl. Además, encontramos que la depuración no está correlacionada con la carga total calculada para el anticuerpo Fv (Suppl. Fig 1C) . Por lo tanto, las propiedades fisicoquímicas del anticuerpo que resultan en la remoción rápida no se reconocen fácilmente a partir de comparaciones de secuencias solas y pueden requerir más detallado análisis de la estructura-función.

Mostramos aquí que un sencillo ensayo de unión no específica se puede utilizar para identificar anticuerpos con mayor riesgo de tener rápido depuración en los seres humanos y monos macacos cangrejeros. Este ensayo, basado en la unión del anticuerpo a partículas de virus preparadas a partir de células de insecto infectadas con baculovirus, emplea un formato de ELISA simple y se puede aplicar en la modalidad de alto rendimiento. Dado que los datos farmacocinéticos son determinados en especies de mamíferos, se podría haber esperado un ensayo basado en la unión no específica a las células de mamíferos para mostrar una correlación más fuerte con la depuración rápida. Los resultados preliminares indican una correlación entre la depuración rápida y la unión no específica a las células 293 humanas detectadas por FACS, pero amplia aplicación de este ensayo se excluye porque muchos de los antígenos afines para esta colección de anticuerpos se expresan en células 293. El ensayo ELISA BV que hemos desarrollado no sufre de esta limitación objetivo-expresión. Para los anticuerpos que pueden ser evaluados con ambos ensayos, se observa una tendencia similar en la unión no específica (datos no mostrados) . Viriones de baculovirus injertados son nanopartículas estables que imitan las superficies de células infectadas, presentando una mezcla compleja de fosfolípidos, carbohidratos, glucoproteínas , matriz extracelular y ácidos nucleicos, así como la cápside viral. 24' 25. El antígeno presumiblemente también contiene algunos restos de células de insecto incluyendo la proteína, las membranas y los ácidos nucleicos . Tal mezcla que carece de los objetivos específicos de anticuerpos terapéuticos al tiempo que conserva la misma complejidad bioquímica general como células y tejidos humanos tiene ventajas en un ensayo de unión no específica, ya que puede detectar diferentes tipos de interacciones electrostáticas en comparación con hidrófobas por ejemplo, en diferentes anticuerpos.

Una advertencia importante para la asociación entre la depuración de anticuerpos en macacos y unión a partículas BV es que, aparte de para el anticuerpo 47, es una observación basada en los datos recogidos a través del desarrollo preclínico normal, en lugar de un experimento diseñado en el que la unión BV-partícula era sistemáticamente variadas . Los valores de depuración se obtuvieron de estudios separados con muy variable en niveles de dosis y el uso de diferentes tipos de ensayo PK. Sin embargo, cuando se disponía de datos suficientes para hacer una evaluación, la asociación entre la depuración rápida en macacos y BV vinculante se encontró que persisten a través de niveles de dosis, tipos de ensayos y fuentes de anticuerpos y los tipos de destino.

El riesgo de depuración rápida puede ser reducido usando el ensayo para minimizar la introducción de la unión no específica durante la ingeniería de un anticuerpo. En anticuerpo 47, tanto la reducción de la carga y el aumento de la hidrofobicidad se asociaron con la unión no específica aumentada a BV partículas . Variantes con disminución de la unión no específica tuvieron una eliminación más lenta. No se espera que el BV ELISA ser un ensayo fiable de los efectos específicos fuera de objetivo. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado demostrado previamente tener rápido depuración en ratones debido a la la unión específica no intencionada a una proteína complemento 1 no tiene unión a las partículas BV detectable (no mostrado) . En nuestra experiencia, fuera de objetivo efectos específicos son menos frecuentes que los anticuerpos con más amplio enlace fuera de objetivo. Por otra parte, efectos específicos fuera de objetivo por lo general se pueden identificar a través de estudios sobre el mecanismo de depuración rápida.

La partícula BV ELISA detecta la mayoría pero no todos los anticuerpos con una depuración rápida en macacos, con pocos falsos positivos. Por lo tanto, el ensayo debe ser considerado como una herramienta de detección para reducir el número de anticuerpos terapéuticos que necesitan ser probado en NHP experimentos de PK y no como un ensayo que predice consistentemente depuración en macacos. Cuando hay varios candidatos con potencias similares contra un blanco están disponibles, de manera que una pequeña, pero no nula tasa de falsos positivos es aceptable, este ensayo es una herramienta rentable para minimizar el riesgo de una rápida depuración. El ensayo ELISA BV podría mejorarse si la base de los resultados falsos negativos se puede identificar. Relativa a las membranas de células de mamífero, la composición de fosfolípidos de las membranas celulares de insectos se enriquece en fosfatidil inositol, fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina y, con niveles más bajos de fosfolípidos ácidos fosfatidil serina, colesterol, glicoproteínas y esfingolípidos 24. Las cantidades más altas de fosfolípidos neutros pueden ser responsables de los falsos negativos en el ensayo si la depuración más rápido de estos anticuerpos está relacionada con la unión a fosfolípidos ácidos en las membranas de mamíferos. Dos de los cuatro anticuerpos negativos falsos tienen una alta carga positiva neta calculada para el dominio Fv. Será interesante para explorar si la composición de fosfolípidos de las partículas BV puede ser manipulado a través de las condiciones de crecimiento o las diferencias de líneas celulares con una mejora concomitante de la veracidad del ensayo de unión no específica. Estos estudios podrían iluminar aún más características que deben evitarse durante la ingeniería de anticuerpos para mantener el comportamiento farmacocinético aceptable .

Ejemplo 12 Optimización de depuración de anticuerpos En este ejemplo hemos probado si la BV ELISA podría ser utilizada de forma prospectiva para ayudar a la selección de candidatos a través de la ayuda adicional de la ingeniería.

Anticuerpo 47 es un anticuerpo humanizado con cambios de aminoácidos en las CDRs tanto para la mejora de afinidad como para eliminar las posibles responsabilidades de secuencia. Mono macacos cangrejeros es una especie no-diana para el anticuerpo 47. Tinción de tejidos no reproducible se observó en monos con el anticuerpo 47, pero una depuración de 20.2 ml/kg/día en monos macacos cangrejeros se determina para este anticuerpo. Una variante de anticuerpo 47 que retiene 2 de los cambios de maduración de afinidad, y un cambio de aminoácido para eliminar un potencial sitio de glicosilación ligada a N en una de las CDRs de cadena pesada (anticuerpo 47b) , demostraron una reducción de la unión en el BV ELISA (Tabla 1) . Anticuerpo 47c retiene sólo el cambio de aminoácidos para eliminar el sitio potencial de glicosilación ligada a N y también había reducido BV unión. Experimentos separados indicaron que una gran contribución a la unión del anticuerpo 47 BV se hizo por el cambio para eliminar un sitio potencial de isomerización Asp-Gly. Anticuerpos 47b y 47c tenido más lento depuración en relación con anticuerpo 47 en monos macacos cangrejeros (Tabla 1) .

Por lo tanto, este ensayo puede ser utilizado como una evaluación rápida de depuración y la ayuda en el desarrollo de anticuerpos clínicamente relevantes con una depuración inferior en relación con un anticuerpo parental .

LISTA DE CITAS 1. Reichert, J. . Marketed therapeutic antibodies compendium. mAbs 4 (2012) . 2. Wang, W., Wang, E.Q. & Balthasar, J.P. Monoclonal antibody pharmacokinetics and pharmacodynamics . Clinical pharmacology and therapeutics 84, 548-558 (2008) . 3. Tabrizi, M.A. , Tseng, C.M. & Roskos, L.K. Elimination mechanisms of therapeutic monoclonal antibodies . Drug discovery today 11, 81-88 (2006) . 4. Mager, D.E. Target-mediated drug disposition and dynamics. Biochemical pharmacology 72, 1-10 (2006) . 5. Mould, D.R. & Green, B. Pharmacokinetics and Pharmacodynaraics of Monoclonal Antibodies : Concepts and Lessons for Drug Development . Biodrugs 24, 23-39 (2010) . 6. Kuo, T.T. & Aveson, V.G. Neonatal Fe receptor and IgG-based therapeutics . mAbs 3, 422-430 (2011) . 7. Keizer, R.J., Huitema, A.D.R., Schellens, J.H.M., Beijnen, J.H. Clinical Pharmacokinetics of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Clinical Pharmacokinetics 49, 493-507 (2010) . 8. Deng, R. et al. Projecting human pharmacokinetics of therapeutic antibodies from nonclinical data: What have we learned? mAbs 3, 61-66 (2011) . 9. Dall'Acqua, W.F., Kiener, P.A. & Wu, H. Properties of human IgGls engineered for enhanced binding to the neonatal Fe receptor (FcRn) . The Journal of biological chemistry 281, 23514-23524 (2006) . 10. Hinton, P.R. et al. An Engineered Human IgGl Antibody with Longer Serum Half-Life. J Immunol 176, 346-356 (2006) . 11. Yeung, Y.A. et al. Engineering human IgGl affinity to human neonatal Fe receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates. J Immunol 182, 7663-7671 (2009) . 12. Zalevsky, J. et al. Enhanced antibody half-life improves in vivo activity. Nature biotechnology 28, 157-159 (2010) . 13. Wu, H. et al. Development of motavizumab, an ultra-potent antibody for the prevention of respiratory syncytial virus infection in the upper and lower respiratory tract. Journal of molecular biology 368, 652-665 (2007) . 14. Bumbaca, D. et al. Highly specific off-target binding identified and eliminated during the humanization of an antibody against FGF receptor 4. mAbs 3, 376-386 (2011). 15. Vugmeyster, Y. et al. Complex pharmacokinetics of a humanized antibody against human amyloid beta peptide, anti-abeta Ab2, in nonclinical species. Pharmaceutical research 28, 1696-1706 (2011) . 16. Vugmeyster, Y. et al. In vitro potency, pharmacokinetic profiles and phamacological activity of optimized anti-IL-21R antibodies in a mouse model of lupus. mAbs 2, 335-346 (2010) . 17. Angal, S. et al. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Molecular immunology 30, 105-108 (1993) . 18. Lee, C.V. et al. High-affinity human antibodies from phage-displayed synthetic Fab librarles with a single framework scaffold. Journal of molecular biology 340, 1073-1093 (2004) . 19. Yeung, Y.A. et al . A therapeutic anti-VEGF antibody with increased potency independent of pharmacokinetic half-life. Cáncer research 70, 3269-3277 (2010) . 20. Dennis, M.S. & Lowman, H.B. in Phage Display, Vol . 266. (eds. T. Clackson & H.B. Lowman) 61-94 (Oxford University Press, Oxford, UK; 2004) . 21. Hotzel, I. et al. Efficient production of antibodies against a mammalian integral membrane protein by phage display. Protein engineering, design & selection : PEDS 24, 679-689 (2011) . 22. Wang, W. et al. Monoclonal antibodies with identical Fc sequences can bind to FcRn differentially with pharmacokinetic consequences . Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 39, 1469-1477 (2011) . 23. Igawa, T. et al . Reduced elimination of IgG antibodies by engineering the variable región. Protein engineering, design & selection : PEDS 23, 385-392 (2010) . 24. Marheineke, K. Lipid Composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters 441, 4 (1998) . 25. Wang, R. et al. Proteomics of the Autographa californica nucleopolyhedrovirus budded virions. Journal of virology 84, 7233-7242 (2010) . 26. Deng, R. et al. Pharmacokinetics of humanized monoclonal anti-tumor necrosis factor- {alpha} antibody and its neonatal Fc receptor variante in mice and cynomolgus monkeys . Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 38, 600-605 (2010) . 27. Stone, M. Cross-validatory choice and assessment of statistical predictions . Journal of the Royal Statistical Society Ser. B 36, 111-147 (1974) . 28. Geisser, S. The predictive sample reuse method with applications I. Amer. Stat. Assoc. 70, 320-328 (197

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Un método para predecir si un agente terapéutico tendrá una tasa de depuración deseable en un mono macaco cangrejero, un ser humano o un mono macaco cangrejero y humano, que comprende la etapa de poner en contacto el agente terapéutico con una partícula de baculovirus (BV) , midiendo el nivel de unión de agente terapéutico a la BV y calcular una puntuación de BV para el agente terapéutico basado en el nivel de unión, en el que una puntuación BV por encima de un umbral predeterminado es indicativa de una mayor probabilidad de tasa de depuración rápida, en donde una puntuación BV por debajo de un umbral predeterminado es indicativo de una mayor probabilidad de una tasa de depuración deseable.

2. El método según la reivindicación 1, en el que el BV está unido a una placa de microtitulación antes de la unión del agente terapéutico.

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el agente terapéutico se marca con un agente de detección.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, que comprende además la etapa de unión de un segundo agente que comprende un agente de detección para el agente terapéutico.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en el que una señal procedente del reactivo de detección se mide.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en el que la puntuación BV se correlaciona con mayor que 10 mL/Kg/día tasa de depuración en un ser humano, se considera una tasa de depuración rápido.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6, en el que el umbral predeterminado para la puntuación BV es 5.

8. El método según la reivindicación 1, donde el agente terapéutico comprende un polipéptido.

9. El método según la reivindicación 1, donde el agente terapéutico comprende un anticuerpo o una inmunoadhesina .

10. El método según la reivindicación 1, en el que los dos primeros pasos se incorporan en un ensayo ELISA.

11. Un equipo para determinar si un agente terapéutico tendrá una tasa de depuración deseable, en el que el equipo comprende partículas de baculovirus y un anticuerpo que se une a los anticuerpos humanos .

12. El equipo según la reivindicación 11, en el que el equipo comprende además una placa de microtitulación.

13. El equipo de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el anticuerpo que se une a los anticuerpos humanos se une a la región Fe de anticuerpos humanos .

14. El método según la reivindicación 1, en el que el BV está unido a un soporte sólido.

15. El método según la reivindicación 14, en el que el soporte sólido es una placa de microtitulación.

16. El método según la reivindicación 15, en el que la unión del agente terapéutico en ausencia de una partícula de baculovirus se mide para derivar un valor para su uso en la normalización.

17. El método según la reivindicación 1, en el que no hay detergentes presentes en ningún paso.

18. Un equipo para determinar si un agente terapéutico tendrá una tasa de depuración deseable, en el que el equipo comprende una partícula de baculovirus y la instrucción en un ensayo ELISA.

19. Un método de fabricación de un agente terapéutico que comprende la etapa de seleccionar un agente terapéutico que tiene una tasa de depuración deseable en los seres humanos y la expresión del agente terapéutico en una célula huésped.

20. El método comprende además el paso de recuperar el agente terapéutico expresado por la célula huésped.

21. El método de la reivindicación 19 o la reivindicación 20, en el que la selección de un agente terapéutico se logra por el método de la reivindicación 1.