JP2020072666A - 治療薬の選択方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒト又はヒト及びカニクイザルにおいて速いクリアランスを有する危険性が増加した治療剤を同定するための選択方法及びそのような治療剤のクリアランスを減少させる方法を提供する。【解決手段】本発明は、バキュロウイルス粒子(BV)に治療薬を接触させ、BVへの治療薬の結合のレベルを測定し、結合のレベルに基づいて治療薬についてBVスコアを計算する工程を含む、治療候補のオフターゲット結合を検出するための方法で、治療薬が、カニクイザル、ヒト又はカニクイザルにおいて望ましいクリアランス速度を有するかどうかを予測する方法である。このアッセイは、とりわけ、適切な薬剤を得る確率を高めるために、抗体リード・ジェネレーション又は最適化中に使用することができる。【選択図】なし
Description
関連出願への相互参照
本出願は、2012年5月23日に出願された米国仮出願第61/650,964号の利益を主張し、該出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。
本出願は、2012年5月23日に出願された米国仮出願第61/650,964号の利益を主張し、該出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。
本発明は、ヒト又はヒト及びカニクイザルにおいて速いクリアランスを有する危険性が増加した治療剤を同定するための選択方法及びそのような治療剤のクリアランスを減少させる方法に関する。
ヒト又はヒト化モノクローナル抗体は、ヒト疾患のための治療剤として広く成功している。30を超える抗体が、様々な障害の治療用にFDAの承認を受けており、数百以上が現在臨床開発段階にある1。抗体治療薬により達成することができる優れた選択性と高い効力に加えて、薬物としての抗体の成功はそれらの通常の長い循環半減期から非常に恩恵を受けている。血液からの遅いクリアランスは、低頻度の投薬により実現されるべき所望の薬物濃度を可能にする。抗体医薬は通常、静脈内注入又は皮下注射によって投与され、低頻度の投与は、患者の服薬順守、従って臨床的利益を向上させる。
抗体は、複数のメカニズム−流体相エンドサイトーシス後の細胞内異化作用(非特異的クリアランス)、抗原媒介クリアランス4によって、及び場合によっては抗治療抗体(ATA)の形成に起因して全身循環から除去することができる。抗体が細胞に結合した抗原に結合する際に一般に観察される抗原媒介性クリアランスは、抗体の低濃度で最も顕著であり、通常は、抗体の投与量を増加させることにより飽和させることができる。ATAは、投与後4−7日に現れ、迅速に排除することができる免疫複合体の形成を含むことが観察されており、時には抗体の血漿濃度−時間プロファイルの非定型形状から容易に検出することができる。
抗体の除去は、FcRn依存性リサイクル機構を介して遅延される。抗体はエンドサイトーシス経路を通過する時に、pH<6でFcRnに結合することができる。FcRnへの結合は、異化作用からIgGを保護し、頂端細胞表面への回帰を促進し、そこで血液のpH(>7)で急速に放出され得る。これらの特徴は、ヒトにおいて、ヒト又はヒト化抗体の6−32日の半減期をもたらす(Keizer, R.J., Huitema, A.D.R., Schellens, J.H.M., Beijnen, J.H. 治療用モノクローナル抗体の臨床薬物動態(Clinical Pharmacokinetics of Therapeutic Monoclonal Antibodies)Clinical Pharmacokinetics 49, 493-507 (2010))。12のIgG1抗体による薬物動態学的データに基づいて、ヒトにおいて〜2−6mL/kg/日の範囲を持つA3.9±1.2(SD)mL/kg/日のクリアランスの平均値が決定された(Deng, R.ら、非臨床データからの治療用抗体のヒトの薬物動態の投影:私たちは何を学んだ?(Projecting human pharmacokinetics of therapeutic antibodies from nonclinical data: What have we learned?) mAbs 3, 61-66 (2011))。同様に、カニクイザルにおけるこれらの抗体の研究により、6.5±2.9(SD)mL/kg/日の平均クリアランスを得た。pH6.0でFcRnへの結合を増加させるための抗体Fc領域の操作は、カニクイザル及びマウスにおいて潜在的治療抗体の半減期を増加させることができる (Dall'Acqua, W.F., Kiener, P.A. & Wu, H. 新生児Fc受容体(FcRn)への結合の増強ために操作されたヒトIgG1の性質(Properties of human IgG1s engineered for enhanced binding to the neonatal Fc receptor (FcRn))。The Journal of biological chemistry 281, 23514-23524 (2006); Hinton, P.R.ら、長い血清半減期を有する操作されたヒトのIgG1抗体(An Engineered Human IgG1 Antibody with Longer Serum Half-Life). J Immunol 176, 346-356 (2006); Yeung, Y.A.ら、ヒト新生児Fc受容体へのヒトIgG1の親和性を操作する:霊長類における薬物動態に関する親和性改善の影響(Engineering human IgG1 affinity to human neonatal Fc receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates). J Immunol 182, 7663-7671 (2009); Zalevsky, J.ら、拡張された抗体半減期はインビボ活性を改善する(Enhanced antibody half-life improves in vivo activity). Nature biotechnology 28, 157-159 (2010))。
ヒトで予想される投与計画を理解し、潜在的な毒性を評価するために、関連する非ヒト種の潜在的な治療用抗体の前臨床試験が必要である。ヒト及び非ヒト霊長類(NHP)の間の標的抗原の高い配列相同性、及びFcRn受容体をリサイクルするための類似の結合親和性を考慮すると(Dall'Acqua, Kiener & Wu, supra)、カニクイザルは、前臨床薬物動態学(PK)及び毒物学研究のための好適な種である。これまでに、我々は、ヒトにおいて決定された治療用IgG1抗体の非特異的クリアランスは、一般にカニクイザルにおいて測定されたものの約半分であることを示している(Deng, R. et al., supra)8。
予想されるクリアランスより速くするための一つの潜在的なメカニズムは、オフターゲット結合である13−16。高度に特異的なオフターゲット結合が時には同定されそして排除することができるものの14、最も頻繁なオフターゲット結合は未知の起源のものであり、用量の増加により飽和させることは困難である。抗体のインビボにおける吸収、分布、代謝、及び排出メカニズム又はインビボでの薬物動態学的挙動を評価し予測するためのインビトロ系は、まだ確立されていない。我々は、インビボで速いクリアランスを示す可能性が高い抗体を同定するために有用であろう非特異的結合のインビトロアッセイを開発しようとした。
詳細な説明
本明細書では、治療薬の結合のオフターゲット結合を評価するために有用であるバキュロウイルス(BV)粒子への結合の検出に基づくアッセイを記述する。このアッセイは、とりわけ、適切な薬剤を得る確率を高めるために、抗体リード・ジェネレーション又は最適化中に使用することができる。
本明細書では、治療薬の結合のオフターゲット結合を評価するために有用であるバキュロウイルス(BV)粒子への結合の検出に基づくアッセイを記述する。このアッセイは、とりわけ、適切な薬剤を得る確率を高めるために、抗体リード・ジェネレーション又は最適化中に使用することができる。
本発明のアッセイにおける抗体の大きなパネルを試験し、そしてカニクイザルにおいて、かつ可能な場合ヒトにおいて同一抗体の薬物動態データによる試験結果を分析することにより、我々は、再利用FcRn受容体との相互作用の変化は、これらの抗体について観測が期待されるクリアランスよりも速いクリアランスを説明していないと判断した。我々は、他者によって報告されるように、クリアランスは、インタクトな抗体の等電点(pI)又は疎水性と関連していることを見いださなかった。我々は、オフターゲット結合は、ほとんどの場合、そのようなオフターゲットは同定されていない、多くの抗体の高速クリアランスを説明すると信じる。非ヒト霊長類及びヒトでの薬物動態学的研究を実施することは、時間がかかり、かつ高価である。この発明の前に、潜在的なオフターゲット結合の寄与を予測することは困難であって、生体内でそのような薬物動態学的研究を実施する前に薬物動態プロファイルを予測した。我々は、用いるのが簡単であり、かつ適切な薬物動態学的特性を有する可能性が高い治療候補を選択すること及び非ヒト霊長類及びヒトで不十分な薬物動態学的特性を有する可能性が高い治療候補を除外することを支援ために使用することができる、安価で、よりハイスループットなインビトロのアッセイを開発した。
本発明は、以下の定義及び実施例を使用する参照によってのみ詳細に説明される。本明細書で言及されるような特許及び刊行物は、そのような特許及び刊行物に開示すべての配列を含み、参照により明示的に援用される。
「治療薬」は、疾患の治療に有用であり得る薬剤を意味する。一実施態様において、治療薬は、一以上のポリペプチド配列を含む。別の実施態様において、治療薬は、抗体の配列を含む。別の実施態様において、治療薬はイムノコンジュゲートである。
本明細書で使用する「BV」とは、バキュロウイルス粒子を指す。
本明細書で使用する「BVスコア」とは、バキュロウイルス粒子への治療薬の結合のレベルを測定する複数(二以上)の結合アッセイからの値の平均値から算出した値を指す。
「正規化されたBVスコア」とは、BVスコアを指し、ここでは、各結合アッセイからの値は平均値を計算する前に正規化されている。一実施態様において、正規化は、BVとの各結合アッセイからの値を、非処置(即ち、BVなし)のアッセイで観察値により除算することにより達成される。一例において、BVとの各結合アッセイのOD値は、非被覆ウェルについて観察されたOD値の平均値で除算される。
「リスクの増加」又は「可能性の増加」とは、事象が発生する大きな可能性を指す
「高速クリアランス」は、ヒト又はカニクイザルにおける薬剤のクリアランス速度を指す。一実施態様において、速いクリアランス速度とは、10mL/kg/日を超える任意の速度である。別の実施態様において、速いクリアランス速度とは、12mL/kg/日を超える任意の速度である。
「望ましいクリアランス」は、ヒト又はカニクイザルにおける薬剤の望ましいクリアランス速度を指す。一実施態様において、望ましいクリアランス速度は、8.5mL/kg/日又はそれ以下であるものである。別の実施態様において、望ましいクリアランス速度は、12mL/kg/日又はそれ以下であるものである。
本明細書において用いる場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を兼備する抗体様分子を示す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG−1、IgG−2、IgG−3又はIgG−4サブタイプ、IgA(IgA−1及びIgA−2を含む)、IgE、IgD又はIgMなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
「融合タンパク質」及び「融合ポリペプチド」は、部分の各々が異なる特性を有するポリペプチドにおいて、互いに共有結合した2つの部分を有するポリペプチドを意味する。特性は生物学的特性、例えばインビトロ又はインビボでの活性であってよい。また特性は、単に化学的又は物理学的特性、例えば標的分子への結合性、反応の触媒性等であってよい。その部分は単一のペプチド結合によって直接連結され、又は一以上のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを介して連結され得る。一般的に、その部分とリンカーは互いにリーディングフレーム内に存在し得る。
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2;ダイアボディ;直鎖状抗体;単鎖抗体分子(例えばscFv);及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて50%以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に競合アッセイにおいて50%以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び/又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び/又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG,及びIgMがあり、これらのうちの幾つかは、「サブクラス」(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2へとさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び/又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位体):化学療法剤又は薬物(例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤);成長阻害剤;酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など;抗生物質;小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素(それらの断片及び/又はその変異体を含む);及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のFc領域に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、C1q結合及び補体依存性細胞障害(CDC);Fcレセプター結合性;抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC);貪食作用;細胞表面レセプター(例えば、B細胞レセプター)のダウンレギュレーション;及びB細胞活性化が含まれる。
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
用語「Fc領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Fc領域と変異体Fc領域を含む。一実施態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226又はPro230から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Fc領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、EUインデックスとも呼ばれるEU番号付けシステムに従う。
「フレームワーク」又は「FR」は、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般的に4つのFRのドメインで構成される:FR1、FR2、FR3、及びFR4。従って、HVR及びFR配列は一般にVH(又はVL)の以下の配列に現れる:FR1−H1(L1)−FR2−H2(L2)−FR3−H3(L3)−FR4。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるFc領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。
「イムノコンジュゲート」は、一以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬物又は検出薬を含む。
「検出する」という用語は、物質の存在又は非存在を決定すること又は物質の量を定量することを含むことを意図する。従って、その用語は、定性的及び定量的測定のための本発明の材料、組成物、及び方法の使用を指す。
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ)、霊長類(例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類)、ウサギ、げっ歯類(例えば、マウス及びラット)を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動(例えば、SDS−PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動)又はクロマトグラフィー(例えば、イオン交換又は逆相HPLC)により決定されるように、95%以上又は99%の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
「抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖(又はその断片)をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、即ち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び/又は同じエピトープに結合する。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分(例えば、細胞傷害性部分)又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型IgG抗体は、ジスルフィド結合している2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖から成る約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)を有し、3つの定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)が続く。同様に、N末端からC末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)を有し、定常軽鎖(CL)ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)とラムダ(λ)と呼ばれる、2つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び/又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
本明細書で用いられるように、「治療」(及び「治療する(treat)」又は「治療している(treating)」など文法上の変形)は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖(それぞれVH及びVL)は、4つの保存されたフレームワーク領域(FR)と3つの超可変領域(HVR)を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。(例えば、Kindtら、Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照)。単一のVH又はVLドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なVL又はVHドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体由来のVH又はVLドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
更なる態様にて、以下のセクション1−7で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の抗PCSK9抗体は、単独又は組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
1.抗体親和性
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数(Kd)が、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、又は≦0.001nM(例えば、10−8M以下、例えば、10−8Mから10−13M、例えば、10−9Mから10−13M)。
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数(Kd)が、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、又は≦0.001nM(例えば、10−8M以下、例えば、10−8Mから10−13M、例えば、10−9Mから10−13M)。
一実施態様において、以下のアッセイにより説明されるように、Kdは、目的の抗体のFab型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ(RIA)により測定される。非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の(125I)−標識抗原にてFabを均衡化して、抗Fab抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するFabの溶液結合親和性を測定する(例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照)。アッセイの条件を決めるために、MICROTITER(登録商標)マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を、5μg/mlの捕獲抗Fab抗体(Cappel Labs)を含む50mM炭酸ナトリウム(pH9.6)にて一晩コートして、その後2%(w/v)のウシ血清アルブミンを含むPBSにて室温(およそ23℃)で2〜5時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc #269620)に、100pM又は26pMの[125I]抗原を段階希釈した所望のFabと混合する(例えば、Prestaら、(1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗VEGF抗体、Fab−12の評価と一致する)。ついで目的のFabを一晩インキュベートする;しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間(例えばおよそ65時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば1時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを0.1%のポリソルベート20(TWEEN−20(登録商標))を含むPBSにて8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μl/ウェルの閃光物質(MICROSCINT−20 TM;Packard)を加え、プレートをTOPCOUNT TMγ計測器(Packard)にて10分間計測する。最大結合の20%か又はそれ以下濃度のFabを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
他の実施態様に従って、〜10反応単位(RU)の固定した抗原CM5チップを用いて25℃でBIACORE(登録商標)−2000又はBIACORE(登録商標)−3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してKdを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5、BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってN−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN−ヒドロキシスクシニミド(NHS)で活性化した。抗原を10mM酢酸ナトリウム(pH4.8)で5μg/ml(〜0.2μM)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(RU)がおよそ10になるように5μl/分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために1Mのエタノールアミンを注入する。動力学測定のために、Fabの2倍の段階希釈(0.78nMから500nM)を、25℃で、およそ25μl/分の流速で、0.05%ポリソルベート20(TWEEN−20TM)界面活性剤(PBST)を含むPBSに注入した。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIACORE(登録商標)評価ソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(kon)と解離速度(koff)を算出する。平衡解離定数(Kd)をkoff/kon比として算出する。例えば、 Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる結合速度が106M−1s−1を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM−AMINCO TM分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、PBS(pH7.2)、25℃の、20nMの抗抗原抗体(Fab型)の蛍光放出強度(励起=295nm;放出=340nm、帯域通過=16nm)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
2.抗体断片
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、Fv、及びscFv断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudsonら、Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。scFv断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照;また、国際公開第93/16185号;及び米国特許第5,571,894号及び第5,587,458号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたFab及びF(ab’)2断片の議論については、米国特許第5869046号を参照のこと。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、Fv、及びscFv断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudsonら、Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。scFv断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照;また、国際公開第93/16185号;及び米国特許第5,571,894号及び第5,587,458号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたFab及びF(ab’)2断片の議論については、米国特許第5869046号を参照のこと。
ダイアボディは2価又は二重特異性であり得る2つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第404,097号;国際公開第1993/01161号; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である (Domantis, Inc., Waltham, MA; 例えば、米国特許第6,248,516号B1を参照)。
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞(例えば、大腸菌やファージ)による生産を含む。
3.キメラ及びヒト化抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域)及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域)及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、HVR、例えば、CDR(又はその一部)が、非ヒト抗体から由来し、FR(又はその一部)がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのFR残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体(例えば、HVR残基が由来する抗体)由来の対応する残基で置換されている。
ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 米国特許第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号及び第7,087,409号; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (SDR(a−CDR)グラフティングを記述); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (「リサーフェシング」を記述); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (「FRシャッフリング」を記述);及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FRのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述)に記載されている。
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域(例えば、Simsら、J. Immunol. 151:2296 (1993));軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域(例えば、Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);及びPrestaら、J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照);ヒト成熟(体細胞変異)フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域(例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照);及びFRライブラリースクリーニング由来のフレームワーク領域(例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及びRosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照)を含む。
4.ヒト抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で周知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で周知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、XENOMOUSETM技術を記載している、米国特許第6,075,181号及び6,150,584号;HuMab(登録商標)技術を記載している米国特許第5,770,429号;K−M MOUSE(登録商標)技術を記載している米国特許第7,041,870号及び、VelociMouse(登録商標)技術を記載している米国特許出願公開第2007/0061900号)も参照のこと。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。(例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照)。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第7,189,826号(ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の産生を記載している)及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している)に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)はまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたFvクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
5.ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性又は活性(複数)を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboomら、in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
本発明の抗体は、所望の活性又は活性(複数)を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboomら、in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
所定のファージディスプレイ法において、VH及びVL遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Fv(scFv)断片、又はFab断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、(例えば、ヒトから)クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリーはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なCDR3領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位V遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むPCRプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第5,750,373号、及び米国特許出願公開第2005/0079574号、2005/0119455号、2005/0266000号、2007/0117126号、2007/0160598号、2007/0237764号、2007/0292936号及び2009/0002360を含む。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
6.多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つは[[PRO]]に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、[[PRO]]の2つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまた[[PRO]]を発現する細胞に対して細胞傷害性薬物を局在化させるために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つは[[PRO]]に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、[[PRO]]の2つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまた[[PRO]]を発現する細胞に対して細胞傷害性薬物を局在化させるために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))、国際公開第93/08829号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照)及び「ノブ・イン・ホール(knob-in-hole)」工学(例えば、米国特許第5,731,168号を参照)を含む。多重特異抗体はまた、抗体のFc−ヘテロ2量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること(国際公開第2009/089004A1号)、2つ以上の抗体又は断片を架橋すること(例えば米国特許第4,676,980号;及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照);2重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること(例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照);二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること(例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照);単鎖Fv(sFv)ダイマーを使用すること(例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照);及び、例えばTuttら、J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
「オクトパス抗体」を含む、3つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる(例えば、米国特許出願公開第2006/0025576A1号を参照)。
本明細書中の抗体又は断片はまた、[[PRO]]並びにその他の異なる抗原(例えば米国特許出願公開第2008/0069820号参照)に結合する抗原結合部位を含む、「2重作用(Dual Acting) FAb」又は「DAF」を含む。
7.抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び/又は挿入及び/又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び/又は挿入及び/又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
a)置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、HVRとFRを含む。保存的置換は、表1の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表1の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の減少、又はADCC又はCDCの改善についてスクリーニングされる。
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、HVRとFRを含む。保存的置換は、表1の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表1の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の減少、又はADCC又はCDCの改善についてスクリーニングされる。
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
置換変異体の一つのタイプは、親抗体(例えば、ヒト化又はヒト抗体など)の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変(例えば、改善)(例えば、親和性の増加、免疫原性を減少)を有し、及び/又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のHVR残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。
改変(例えば、置換)は、例えば抗体の親和性を向上させるために、HVRで行うことができる。このような改変は、HVRの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で(例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照)、及び/又はSDR(a−CDR)で行うことができ、得られた変異体VH又はVLが結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboomら、in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法(例えば、変異性PCR、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発)の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのHVR残基(例えば、一度に4から6残基)がランダム化されたHVR指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するHVR残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定され得る。CDR−H3及びCDR−L3がしばしば標的にされる。
所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のHVR内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変(例えば本明細書で与えられる保存的置換)をHVR内で行うことができる。このような改変は、HVR「ホットスポット」又はSDRの外側であってもよい。上記に与えられた変異体VH又はVL配列の所定の実施態様において、各HVRは不変であるか、又はわずか1個、2個又は3個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ(例えば、arg、asp、his、lys及びgluなどの荷電残基)が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸(例えば、アラニン又はポリアラニン)に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び/又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、N末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のN末端又はC末端への融合(例えばADEPTの場合)、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
b)グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
抗体がFc領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWrightら、TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のGlcNAcに結合した、マンノース、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。
一実施態様において、抗体変異体は、Fc領域に(直接又は間接的に)付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、1%から80%、1%から65%、5%から65%、又は20%から40%であり得る。
フコースの量は、例えば、国際公開第2008/077546号に記載されているように、MALDI−TOF質量分析法によって測定されるAsn297に付着しているすべての糖構造の合計(例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造)に対して、Asn297の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297は、Fc領域(Fc領域残基のEU番号付け)でおよそ297の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Asn297もまた位置297の上流又は下流のおよそ±3アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置294と300の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はADCC機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第2003/0157108号(Presta, L.);米国特許出願公開第2004/0093621号(協和発酵工業株式会社)を参照。「非フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第2003/0157108号、国際公開第2000/61739号、国際公開第2001/29246号、米国特許出願公開第2003/0115614号、米国特許出願公開第2002/0164328号、米国特許出願公開第2004/0093621号、米国特許出願公開第2004/0132140号、米国特許出願公開第2004/0110704号、米国特許出願公開第2004/0110282号、米国特許出願公開第2004/0109865号、国際公開第2003/085119号、国際公開第2003/084570号、国際公開第2005/035586号、国際公開第2005/035778号、国際公開第2005/053742号、国際公開第2002/031140号、Okazakiら、J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnukiら、Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。フコース非修飾抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているLec13 CHO細胞(Ripkaら、Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986);米国特許出願公開第2003/0157108号A1、Presta, L;及び国際公開第2004/056312号A1、Adamsら、具体的には実施例11)、及びノックアウト細胞株、アルファ−1、6−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8、ノックアウトCHO細胞(例えば、Yamane-Ohnukiら、Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006);及び国際公開第2003/085107号を参照)を含む。
抗体変異体は、例えば、抗体のFc領域に結合した二分岐オリゴ糖がGlcNAcによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び/又はADCC機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第2003/011878号(Jean-Mairettら);米国特許第6,602,684号(Umanaら);及び米国特許出願公開第2005/0123546号(Umanaら)に記載されている。Fc領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも1つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はCDC機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第1997/30087号(Patelら);国際公開第1998/58964号(Raju, S.);及び国際公開第1999/22764号(Raju, S.)に記載されている。
c)Fc領域変異体
ある実施態様において、1つ又は複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のFc領域に導入することができ、それによってFc領域変異体を生成する。Fc領域の変異体は、1つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトFc領域の配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域)を含んでもよい。
ある実施態様において、1つ又は複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のFc領域に導入することができ、それによってFc領域変異体を生成する。Fc領域の変異体は、1つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトFc領域の配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域)を含んでもよい。
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能(例えば補体及びADCCなど)が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び/又はインビボでの細胞毒性アッセイを、CDC活性及び/又はADCC活性の減少/枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイは、抗体がFcγR結合を欠くが(それゆえ、おそらくADCC活性を欠く)、FcRn結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ADCCを媒介する初代細胞、NK細胞は、FcγRIIIのみを発現するのに対し、単球はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現する造血細胞におけるFcRの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の464ページの表3に要約されている。目的の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第5,500,362号(例えば、Hellstrom, I.ら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照)及びHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985);第5,821,337号(例えば、Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる(例えば、フローサイトメトリー用のACTITM非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA;及びCytoTox 96(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(Promega, Madison, WI)を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。代わりとして、又は更に、目的の分子のADCC活性は、Clynesら、PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。C1q結合アッセイはまた、抗体が体C1qを結合することができないこと、したがって、CDC活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第2006/029879号及び国際公開第2005/100402号のC1q及びC3c結合ELISAを参照。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを行うことができる(例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003);及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照)。また、FcRn結合、及びインビボでのクリアランス/半減期の測定は、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる(例えば、Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照)。
エフェクター機能が減少した抗体は、Fc領域の残基238、265、269、270、297、327、329の一つ以上の置換を有するものが含まれる(米国特許第6737056号)。そのようなFc変異体は、残基265及び297のアラニンへの置換を有する、いわゆる「DANA」 Fc変異体を含む、アミノ酸位置265、269、270、297及び327の2以上での置換を有するFc変異体を含む(米国特許第7,332,581号)。
FcRへの結合を改善又は減少させた特定の抗体変異体が記載されている。(例えば、米国特許第6,737,056号;国際公開第2004/056312号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001))。
所定の実施態様において、抗体変異体はADCCを改善する1つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Fc領域の位置298、333、及び/又は334における置換(EUの残基番号付け)を含む。
幾つかの実施態様において、改変された(即ち、改善され又は減少した)C1q結合及び/又は補体依存性細胞傷害(CDC)を生じる、Fc領域における改変がなされ、例えば、米国特許第6,194,551号、国際公開第99/51642号、及びIdusogieら、J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明される。
増加した半減期を持ち、胎仔への母性IgGの移送を担う、新生児Fc受容体(FcRn)への結合が改善された抗体 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))が、米国特許出願公開第2005/0014934A1号 (Hinton et al.)に記載されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を改善する一つ又は複数の置換を有するFc領域を含む。このようなFc変異体は、Fc領域の残基:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424又は434の一以上の置換、例えば、Fc領域の残基434の置換を有するものが含まれる(米国特許第7,371,826号)。
Fc領域の変異体の他の例に関しては、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988);米国特許第5,648,260号;米国特許第5,624,821号;及び国際公開第94/29351号も参照のこと。
d)システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「thioMAbs」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る:軽鎖のV205(Kabatの番号付け);重鎖のA118(EU番号付け);及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第7521541号に記載のように生成され得る。
ある実施態様において、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「thioMAbs」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る:軽鎖のV205(Kabatの番号付け);重鎖のA118(EU番号付け);及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第7521541号に記載のように生成され得る。
e)抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(単独重合体又はランダム共重合体の何れか)及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び/又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む考慮に基づいて決定することができる。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(単独重合体又はランダム共重合体の何れか)及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び/又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む考慮に基づいて決定することができる。
別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第4,816,567号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列、及び/又は抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む一以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む(例えば、以下で形質転換される):(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施態様において、抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から抗体を回収することを含む。
抗体は、例えば米国特許第4,816,567号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列、及び/又は抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む一以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む(例えば、以下で形質転換される):(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施態様において、抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から抗体を回収することを含む。
抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び/又は発現のために1つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて(例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)配列決定することができる。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びFcエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号及び第5,840,523号を参照。(また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照。)発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物(無脊椎動物と脊椎動物)から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5959177号、第6040498号、第6420548号、第7125978号及び第6417429号(トランスジェニック植物における抗体産生に関するPLANTIBODIESTM技術を記載)を参照。
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40(COS−7)で形質転換されたサル腎臓CV1株;ヒト胚腎臓株(Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された293細胞又は293細胞;ベビーハムスター腎臓細胞(BHK);マウスのセルトリ細胞(Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるTM4細胞);サル腎細胞(CV1);アフリカミドリザル腎細胞(VERO−76);ヒト子宮頚癌細胞(HeLa);イヌ腎臓細胞(MDCK;バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝細胞(HepG2);マウス乳腺腫瘍(MMT060562);例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるTRI細胞;MRC5細胞;及びFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、DHFR−CHO細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞;及びY0、NS0及びSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。
以下の実験の開示において、以下の略語が適用される;eq(当量);M(モル);μM(マイクロモル);N(ノーマル);mol(モル);mmol(ミリモル);μmol(マイクロモル);nmol(ナノモル);g(グラム);mg(ミリグラム);kg(キログラム);μg(マイクロモル);L(リットル);ml(ミリリットル);μl(マイクロリットル);cm(センチメートル);mm(ミリメートル);μm(マイクロメートル);nm(ナノメートル);℃(摂氏);h(時間);min(分);sec(秒);msec(ミリ秒);Ci(キュリー)mCi(ミリキュリー);μCi(マイクロキュリー);TLC(薄層クロマトグラフィー);Ts(トシル);Bn(ベンジル);Ph(フェニル);Ms(メシル);Et(エチル),Me(メチル)。
本発明は以下の実施例に更に詳細に記載されるが、これらは特許請求される本発明の範囲を限定することを意図のものではない。添付図面は、本発明の明細書と説明の不可欠な部分と見なされることが意図される。全ての参考文献は、本明細書に記載されている全てにおいて、参照により援用される。以下の実施例は、説明するために提供されるが、請求項に記載の発明を限定するものではない。
この出願は、具体的にはHotzelら、(2012), “A Strategy for Risk Mitigation of Antibodies with Fast Clearance", mAbs 4:6, 1-8を含む本明細書で引用した特許出願及び特許及び刊行物を参照によりその全体を援用する。
実施例1:
カニクイザルにおけるクリアランスの決定
この実施例では、非ヒト霊長類における抗体のクリアランスを決定するために使用される標準的な方法を示す。
カニクイザルにおけるクリアランスの決定
この実施例では、非ヒト霊長類における抗体のクリアランスを決定するために使用される標準的な方法を示す。
抗体の薬物動態は、カニクイザルにおいて、治療用抗体の単回用量又は複数回用量を静脈内投与した後に決定した。血清試料を種々の時点で採取した血液から調製し、抗体濃度をELISAによって決定した。ほとんどの場合、ELISAは、コーティングされた抗原を用いた捕獲と続く抗ヒトFc抗体による検出からなる。抗体26のELISAアッセイは、捕獲のために抗イディオタイプ抗体を使用した。抗体14、17、24、33及び44は、血清濃度の測定のために抗ヒトFcサンドイッチELISAを使用した。時間プロファイルに対する血清濃度は、総クリアランスを算出するために、非コンパートメント分析を用いて分析した(Deng, R.ら、Pharmacokinetics of humanized monoclonal anti-tumor necrosis factor-{alpha} antibody and its neonatal Fc receptor variants in mice and cynomolgus monkeys. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 38, 600-605 (2010))。各抗体について試験した最高用量でのクリアランスは、非特異的クリアランスとして報告され、総クリアランスに対する特異的クリアランスの寄与は無視できると仮定した。
以前に利用可能なものよりもわずかに大きなデータセットを使用して(Deng, R.ら、Projecting human pharmacokinetics of therapeutic antibodies from nonclinical data: What have we learned? mAbs 3, 61-66 (2011))、我々は、カニクイザル及びヒトにおいて測定されたクリアランス値の間に強い相関関係を確認している(図1、スピアマンの相関係数(ρ)=0.74)。ヒトで測定されたクリアランスはカニクイザルにおいて測定されたクリアランスより約2倍遅いとする単純なスケーリングガイドラインが得られ、異常値として抗NRP1抗体を含む。
実施例2:
FcRnの親和性の決定
次の例では、平衡解離定数(KD)をどのように決定することができるかを詳述する。 固定化抗体へのカニクイザルFcRnの結合についての平衡解離定数(KD)は、ビアコア(登録商標)4000装置(GE Healthcare)による表面プラズモン共鳴(SPR)測定から決定した。前述のようにカニクイザルFcRnのを調製した(Yeung, Y.A.ら、Engineering human IgG1 affinity to human neonatal Fc receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates. J Immunol 182, 7663-7671 (2009))。シリーズSセンサーチップがドッキングされ、標準化され、製造業者によって供給されたプロトコルを使用して、水力学的アドレッシングのために調製された。4つのフローセルの各々の全5スポットはアミンカップリングのために、EDC/NHS溶液(0.2MのN−エチル−N’−(3−ジエチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDC)及び0.05MのN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)に10分間の曝露により活性化された。抗体は、2μg/mlの抗体及び10mMのNaOAc(pH5)を含む溶液への7分間の曝露により、スポット1、2、4及び5に結合された。未反応部位はその後、1Mのエタノールアミンへの全ての5スポットの7分間の曝露を通じてブロックした。この形式では、スポット3は基準セルであり、4つの異なる抗体がフローセルごとに結合され、センサーチップあたり合計16となる。カップリング密度は、抗体の200〜1000RUの範囲であった。別々の実験では、計算されたKDは、この範囲のカップリング密度では変化しなかったことが示された(データ非表示)。10μMから0.04μMの濃度で2倍刻みで変化させたカニクイザルFcRnの一連の溶液は、25mMのMES、25mMのHEPES、150mMのNaCl、0.05%ポリソルベート20、pH5.8を含むランニングバッファー中で調製した。センサーグラムは、30μL/分の流速でのセンサーチップ上で、これらの溶液及びバッファーのみのコントロールの60μLの注入について収集した。測定温度は25℃で、解離は180秒間モニターされ、次いで結合したままの任意FcRnは、50mMのトリス−HCl、150mMのNaCl、0.05%ポリソルベート20、pH8を含む溶液30μLを注入することにより溶出された。解離定数は、ビアコア4000評価ソフトウェア1.0を使用して定常状態の親和性解析から計算した。
FcRnの親和性の決定
次の例では、平衡解離定数(KD)をどのように決定することができるかを詳述する。 固定化抗体へのカニクイザルFcRnの結合についての平衡解離定数(KD)は、ビアコア(登録商標)4000装置(GE Healthcare)による表面プラズモン共鳴(SPR)測定から決定した。前述のようにカニクイザルFcRnのを調製した(Yeung, Y.A.ら、Engineering human IgG1 affinity to human neonatal Fc receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates. J Immunol 182, 7663-7671 (2009))。シリーズSセンサーチップがドッキングされ、標準化され、製造業者によって供給されたプロトコルを使用して、水力学的アドレッシングのために調製された。4つのフローセルの各々の全5スポットはアミンカップリングのために、EDC/NHS溶液(0.2MのN−エチル−N’−(3−ジエチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDC)及び0.05MのN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)に10分間の曝露により活性化された。抗体は、2μg/mlの抗体及び10mMのNaOAc(pH5)を含む溶液への7分間の曝露により、スポット1、2、4及び5に結合された。未反応部位はその後、1Mのエタノールアミンへの全ての5スポットの7分間の曝露を通じてブロックした。この形式では、スポット3は基準セルであり、4つの異なる抗体がフローセルごとに結合され、センサーチップあたり合計16となる。カップリング密度は、抗体の200〜1000RUの範囲であった。別々の実験では、計算されたKDは、この範囲のカップリング密度では変化しなかったことが示された(データ非表示)。10μMから0.04μMの濃度で2倍刻みで変化させたカニクイザルFcRnの一連の溶液は、25mMのMES、25mMのHEPES、150mMのNaCl、0.05%ポリソルベート20、pH5.8を含むランニングバッファー中で調製した。センサーグラムは、30μL/分の流速でのセンサーチップ上で、これらの溶液及びバッファーのみのコントロールの60μLの注入について収集した。測定温度は25℃で、解離は180秒間モニターされ、次いで結合したままの任意FcRnは、50mMのトリス−HCl、150mMのNaCl、0.05%ポリソルベート20、pH8を含む溶液30μLを注入することにより溶出された。解離定数は、ビアコア4000評価ソフトウェア1.0を使用して定常状態の親和性解析から計算した。
実施例3:
ELISA用抗原の作製
この例では、本明細書に記載のアッセイで使用するためのマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される基質の作製が記載されている。
ELISA用抗原の作製
この例では、本明細書に記載のアッセイで使用するためのマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される基質の作製が記載されている。
バキュロウイルス粒子は、無血清ESF921培地の600ml中で1.8×109のSf9昆虫細胞に、緑色蛍光タンパク質を発現する組換えAutographa californica nucleopolyhedrovirus(Bac-to-Bac, Invitrogen)を約1の感染の多重度で感染させることにより得た(Expression systems, Davis, CA)。感染した培養物は、撹拌(200rpm)の下、27℃で40時間インキュベートし回収し、そして細胞を10分間、5000×gでの遠心分離によって除去した。上清中のウイルスを、4℃で4時間、25000×gの遠心分離によりペレット化し、PBS緩衝液(150mMのNaCl、10mMのリン酸ナトリウム、pH7.4)中に再懸濁し、PBS中35%(w/v)のスクロースクッションの4mlの上に積層され、4℃で1時間、30,000rpmでSW40Tiローター(Beckman)中で遠心分離した。破片を含む上清を捨て、ウイルスペレットを穏やかにPBSで1回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を含むPBS1.2ml中に再懸濁し、4℃で最大4ヶ月間保存した。
粗製のSf9細胞膜画分を、非感染細胞から得た。無血清ESF培地中で増殖させた総数2×108の非感染Sf9細胞をPBSで1回洗浄し、氷冷溶解緩衝液(1mMのEDTA、50mMのHEPES緩衝液(pH7.4)、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル)4ml中に再懸濁した。細胞はダウンスホモジナイザーに移して、ゆるくフィットした乳棒の8ストロークで砕いた。0.5Mのスクロースを含む溶解緩衝液を更に4ml溶解細胞に添加し、細胞をぴったりフィットした乳棒の8ストロークで砕いた。溶解物を4℃で500×gで10分間遠心分離し、ミトコンドリア、核及び粗い破片を除去した。上清を新しいチューブに移し、4℃で20分間25000×gで遠心分離した。ペレットを溶解緩衝液で1回洗浄し、ぴったりフィットした乳棒でダウンスホモジナイザーを使用して、同じ緩衝液5ml中に再懸濁した。大きな破片を4℃で500×gの遠心分離によって除去した。
実施例4:
ELISAアッセイ
抗原(例えば、バキュロウイルス粒子)を384ウェルのELISAプレート(Nunc Maxisorp)に、各ウェルに、50mMの炭酸ナトリウム緩衝液pH9.6中の1%バキュロウイルス懸濁液25μlを添加することにより、固定化し、粒子を4℃で一晩、プレートに吸着させた。ウェルをブロッキング緩衝液(0.5%BSAを含有するPBS)50μlで室温で1時間ブロックした。PBSでプレートを3回洗浄した後、精製した抗体はブロッキング緩衝液で段階希釈し。25μlをELISAウェルに二連で添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBSで6回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Jackson)にコンジュゲートした10ng/mlのヤギ抗ヒトIgG(Fcガンマ断片特異的)25μlを各ウェルに加えた。プレートは、室温で1時間インキュベートし、PBS中で6回洗浄し、TMB基質25μlを各ウェルに加えた。反応は、15分後に各ウェルに1Mリン酸を25μl添加することによって停止され、吸光度を450nmで読み取り、620nmで参照された。BVスコアは、非被覆ウェルについて観察された平均シグナルで除算することにより各々が正規化されていた6つの光学密度測定の平均から計算した。Sf9細胞膜によるアッセイにおいて、バキュロウイルス粒子の代わりにELISAプレートを被覆するため粗製膜の2%懸濁液を使用した。界面活性剤は、任意の段階でバッファーに添加されなかった。
ELISAアッセイ
抗原(例えば、バキュロウイルス粒子)を384ウェルのELISAプレート(Nunc Maxisorp)に、各ウェルに、50mMの炭酸ナトリウム緩衝液pH9.6中の1%バキュロウイルス懸濁液25μlを添加することにより、固定化し、粒子を4℃で一晩、プレートに吸着させた。ウェルをブロッキング緩衝液(0.5%BSAを含有するPBS)50μlで室温で1時間ブロックした。PBSでプレートを3回洗浄した後、精製した抗体はブロッキング緩衝液で段階希釈し。25μlをELISAウェルに二連で添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBSで6回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Jackson)にコンジュゲートした10ng/mlのヤギ抗ヒトIgG(Fcガンマ断片特異的)25μlを各ウェルに加えた。プレートは、室温で1時間インキュベートし、PBS中で6回洗浄し、TMB基質25μlを各ウェルに加えた。反応は、15分後に各ウェルに1Mリン酸を25μl添加することによって停止され、吸光度を450nmで読み取り、620nmで参照された。BVスコアは、非被覆ウェルについて観察された平均シグナルで除算することにより各々が正規化されていた6つの光学密度測定の平均から計算した。Sf9細胞膜によるアッセイにおいて、バキュロウイルス粒子の代わりにELISAプレートを被覆するため粗製膜の2%懸濁液を使用した。界面活性剤は、任意の段階でバッファーに添加されなかった。
実施例5:
FACS分析
HEK293細胞を、DMEM−10%ウシ胎児血清中に5×106細胞/mlで再懸濁し、100μl/ウェルでU底96ウェルプレートに分注した。PBS(150mMのNaCl、10mMリン酸ナトリウム、pH7.4)で希釈したIgGの等量(30〜50nMの最終濃度)を細胞に添加し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を、氷冷PBSで3回洗浄し、抗ヒトIgG Fc−R−フィコエリトリンコンジュゲート(Jackson Immunoresearch)又は抗ヒトIgG−Alexa488(Molecular Probes)コンジュゲートと共に4℃で30分間インキュベートし、氷冷したPBSで2回洗浄し、0.1%パラホルムアルデヒドを含むPBS中で固定した。細胞は、ハイスループットサンプラーを装備したFACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)で分析した。
FACS分析
HEK293細胞を、DMEM−10%ウシ胎児血清中に5×106細胞/mlで再懸濁し、100μl/ウェルでU底96ウェルプレートに分注した。PBS(150mMのNaCl、10mMリン酸ナトリウム、pH7.4)で希釈したIgGの等量(30〜50nMの最終濃度)を細胞に添加し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を、氷冷PBSで3回洗浄し、抗ヒトIgG Fc−R−フィコエリトリンコンジュゲート(Jackson Immunoresearch)又は抗ヒトIgG−Alexa488(Molecular Probes)コンジュゲートと共に4℃で30分間インキュベートし、氷冷したPBSで2回洗浄し、0.1%パラホルムアルデヒドを含むPBS中で固定した。細胞は、ハイスループットサンプラーを装備したFACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)で分析した。
実施例6:
統計的分析
全ての統計分析は、Rを用いて行った(R Development Core Team (2011)。R:統計計算のための言語と環境。統計コンピューティングのためのR財団、ウィーン、オーストリア。ISBN 3-900051-07-0,R-project[dot]org)で、オンラインで入手可能。.図5の説明に記載のようにオッズ比を使用して急速及び低速でクリアする抗体を正しく同定することにおけるBVスコアの性能の評価は、BVのビニング閾値=5を決定するために使用される同じデータセットを用いて行ったので楽観的である。5分割交差検定及びBVスコア閾値を決定する回帰モデリングを使用する10mL/kg/日のクリアランス閾値に対してインビトロアッセイの有用性のより保守的な評価が得られた;このアプローチは、14.1のより控えめなオッズ比推定値を与えた(95%信頼区間(2.4,113.3))。
統計的分析
全ての統計分析は、Rを用いて行った(R Development Core Team (2011)。R:統計計算のための言語と環境。統計コンピューティングのためのR財団、ウィーン、オーストリア。ISBN 3-900051-07-0,R-project[dot]org)で、オンラインで入手可能。.図5の説明に記載のようにオッズ比を使用して急速及び低速でクリアする抗体を正しく同定することにおけるBVスコアの性能の評価は、BVのビニング閾値=5を決定するために使用される同じデータセットを用いて行ったので楽観的である。5分割交差検定及びBVスコア閾値を決定する回帰モデリングを使用する10mL/kg/日のクリアランス閾値に対してインビトロアッセイの有用性のより保守的な評価が得られた;このアプローチは、14.1のより控えめなオッズ比推定値を与えた(95%信頼区間(2.4,113.3))。
実施例7:
サルのクリアランスからのヒトのクリアランスの予測的スケーリング
以前に利用可能な8つよりもわずかに大きいデータセットを使用して、我々は、カニクイザル及びヒトにおいて測定されたクリアランス値の間に強い相関関係を確認している(図1、スピアマンの相関係数(ρ)=0.74)。ヒトで測定されたクリアランスはカニクイザルにおいて測定されたクリアランスより約2倍遅いとする単純なスケーリングガイドラインが得られ、異常値として抗NRP1抗体を含む。
サルのクリアランスからのヒトのクリアランスの予測的スケーリング
以前に利用可能な8つよりもわずかに大きいデータセットを使用して、我々は、カニクイザル及びヒトにおいて測定されたクリアランス値の間に強い相関関係を確認している(図1、スピアマンの相関係数(ρ)=0.74)。ヒトで測定されたクリアランスはカニクイザルにおいて測定されたクリアランスより約2倍遅いとする単純なスケーリングガイドラインが得られ、異常値として抗NRP1抗体を含む。
実施例8:
治療用抗体のパネルのためのカニクイザルにおける構造変異体とクリアランスの特徴付け
前臨床開発の通常の過程において、カニクイザルにおける薬物動態データが、52のヒト化及びヒト抗体用に収集された。これらの抗体の優勢なアイソタイプは、IgG1、カッパ(n=46)である。この抗体パネルはまた4つのIgG1、ラムダ、及び2つのIgG4、カッパ抗体を含む。IgG4抗体は、S228Pヒンジ安定化置換を組み込んでいる17。52抗体のうち5つは、エフェクター機能を低減するためにアグリコシル化(aglycosylated)され、1つはADCC活性を増加させるためにアフコシル化され、及び3つはFcガンマR結合を切断又は増加させるFcのアミノ酸置換を有する。これらの抗体の可変ドメインは、ヒト化(n=32)、合成ヒト抗体ファージライブラリー18由来(n=16)、ヒト(n=3)、又はマウス(n=1;リツキシマブ)の何れかである。これらの抗体は、広範囲のクリアランス値を示し(図2)、15(29%)の抗体が10mL/kg/日より速いクリアランスを有する。
治療用抗体のパネルのためのカニクイザルにおける構造変異体とクリアランスの特徴付け
前臨床開発の通常の過程において、カニクイザルにおける薬物動態データが、52のヒト化及びヒト抗体用に収集された。これらの抗体の優勢なアイソタイプは、IgG1、カッパ(n=46)である。この抗体パネルはまた4つのIgG1、ラムダ、及び2つのIgG4、カッパ抗体を含む。IgG4抗体は、S228Pヒンジ安定化置換を組み込んでいる17。52抗体のうち5つは、エフェクター機能を低減するためにアグリコシル化(aglycosylated)され、1つはADCC活性を増加させるためにアフコシル化され、及び3つはFcガンマR結合を切断又は増加させるFcのアミノ酸置換を有する。これらの抗体の可変ドメインは、ヒト化(n=32)、合成ヒト抗体ファージライブラリー18由来(n=16)、ヒト(n=3)、又はマウス(n=1;リツキシマブ)の何れかである。これらの抗体は、広範囲のクリアランス値を示し(図2)、15(29%)の抗体が10mL/kg/日より速いクリアランスを有する。
速いクリアランスは合成ライブラリーの抗体と関連しているという仮説を検討した。合成ヒト抗体ファージライブラリーに由来する抗体を選択し、インビトロ選択を介して最適化された18。これらの大半は、必要な親和性及び効力を達成するためにそれらの相補性決定領域(CDR)におけるアミノ酸の変化を介する親和性成熟を必要とした。ヒト化抗体の多くは、親和性又は化学的安定性を改善の何れかのために、げっ歯類配列に対してCDR置換を有するが、一般に、ヒト化抗体は、インビトロでの最適化にはほとんど供されていない。インビトロ選択に対する懸念は、インビトロで行うことができる負の選択がインビボで生じ得るよりも広範囲ではないので、それが誤ってオフターゲット相互作用を生じ得ることである。それにもかかわらず、ヒト化抗体と合成ライブラリーに由来する抗体との比較は、クリアランス値の重複範囲を示している(図3)。クリアランス値の中央値は、ヒト化抗体では6.5mL/kg/日であり、合成ファージライブラリー由来のヒト抗体では9.0mL/kg/日である。これらのデータは、合成ライブラリー抗体と速いクリアランスとの関連性についての証拠を提供していない(P=0.28、ウィルコクソン検定)。
実施例9:
カニクイザルへの結合親和性
FcRn結合における変化が観察されたクリアランス値の範囲を説明することができるかどうかを試験するために、我々は、pH5.8で精製したカニクイザルのFcRnに対するこれらの抗体の結合についてのKD値を決定するために、表面プラズモン共鳴(SPR)法を用いた。IgG−FcRn結合は比較的弱い相互作用であることから、我々は、結合定数を決定するために、以前に説明した定常状態のアプローチ11を使用した。2:1のFcRn:IgG相互作用から生じる結合活性効果は、分析用に利用可能である各々の抗体(n=44)を固定することによって回避された。この方法で決定されたKD値は、約250nMから1500nMの範囲であった。各抗体は、アミノ基を介するランダムなカップリングを用いて別々に固定化し、センサーチップ表面上の配向に付随する不確実性を有するため、KD値の範囲は予想外ではなかった。ペルツズマブのKDの複数回(n=7)の測定では、940±140(S.D.)nMの平均値を示した。我々は、FcRnの親和性を増加させることが知られたFc変異体の結合作用(データ非表示)を再現できたので、本測定方法は、FcRnの親和性の変化を検出することができる19。幾つかの抗体について観察された速いクリアランスは、カニクイザルFcRnに対する低pH結合親和性の改変に起因するものではない(図4)。実際に、ほぼ同一のFcRn結合親和性を持つ複数の抗体の比較では、クリアランスの値に約30倍の値域を与えた。別々の実験(データ非表示)では、pH7.4でこれらの抗体からのカニクイザルのFcRnの解離速度は高速であり、試験されたパネル全体で同等であることを示した。これらの実験は、観察された高速クリアランスについての説明として、幾つかの抗体のリサイクル経路の変化を除外することは不十分であるが、pH5.8での結合親和性又は中性pHでの解離動態における有意な変化が高速クリアランスに大きな役割を果たしているという可能性は低いように見える。
カニクイザルへの結合親和性
FcRn結合における変化が観察されたクリアランス値の範囲を説明することができるかどうかを試験するために、我々は、pH5.8で精製したカニクイザルのFcRnに対するこれらの抗体の結合についてのKD値を決定するために、表面プラズモン共鳴(SPR)法を用いた。IgG−FcRn結合は比較的弱い相互作用であることから、我々は、結合定数を決定するために、以前に説明した定常状態のアプローチ11を使用した。2:1のFcRn:IgG相互作用から生じる結合活性効果は、分析用に利用可能である各々の抗体(n=44)を固定することによって回避された。この方法で決定されたKD値は、約250nMから1500nMの範囲であった。各抗体は、アミノ基を介するランダムなカップリングを用いて別々に固定化し、センサーチップ表面上の配向に付随する不確実性を有するため、KD値の範囲は予想外ではなかった。ペルツズマブのKDの複数回(n=7)の測定では、940±140(S.D.)nMの平均値を示した。我々は、FcRnの親和性を増加させることが知られたFc変異体の結合作用(データ非表示)を再現できたので、本測定方法は、FcRnの親和性の変化を検出することができる19。幾つかの抗体について観察された速いクリアランスは、カニクイザルFcRnに対する低pH結合親和性の改変に起因するものではない(図4)。実際に、ほぼ同一のFcRn結合親和性を持つ複数の抗体の比較では、クリアランスの値に約30倍の値域を与えた。別々の実験(データ非表示)では、pH7.4でこれらの抗体からのカニクイザルのFcRnの解離速度は高速であり、試験されたパネル全体で同等であることを示した。これらの実験は、観察された高速クリアランスについての説明として、幾つかの抗体のリサイクル経路の変化を除外することは不十分であるが、pH5.8での結合親和性又は中性pHでの解離動態における有意な変化が高速クリアランスに大きな役割を果たしているという可能性は低いように見える。
実施例10:
高速のクリアランスのリスク軽減のためのインビトロアッセイの開発
少数の抗体について観察された高速クリアランスは、特異的14,15又は非特異的13、16オフターゲット結合に関連している。抗体の産生及び最適化の最中に、我々のパネル中の抗体のほとんどを、密接に関連する抗原ホモログへの結合の欠如についてスクリーニングした。加えて、ファージディスプレイを介して由来する抗体の多くは、非特異的結合の濃縮を防ぐために添加剤の存在下で選択した20。Wuら13によって示されるように、限られた種の抗原によるELISAによるスクリーニングは、インビボでの挙動に影響し得る特異的又は非特異的オフターゲット結合の種類を検出できない場合がある。従って、我々は、高速クリアランスを示す可能性が高い候補抗体を同定するために有用なインビトロアッセイを開発しようとした。ELISAアッセイにおいて抗原として特異的膜結合型標的を有するインタクトなBV粒子を用いる実験の過程で21、我々は、幾つかの抗体は、標的を発現しないバキュロウイルス粒子に結合することを述べた。これらの抗体の多くはまた、FACSにより、非発現性ヒト293細胞に非特異的に結合することが示された(データ非表示)。しかし、293細胞上の幾つかの同族抗原の発現は、非特異的結合から特異的結合を区別することを困難にした。
高速のクリアランスのリスク軽減のためのインビトロアッセイの開発
少数の抗体について観察された高速クリアランスは、特異的14,15又は非特異的13、16オフターゲット結合に関連している。抗体の産生及び最適化の最中に、我々のパネル中の抗体のほとんどを、密接に関連する抗原ホモログへの結合の欠如についてスクリーニングした。加えて、ファージディスプレイを介して由来する抗体の多くは、非特異的結合の濃縮を防ぐために添加剤の存在下で選択した20。Wuら13によって示されるように、限られた種の抗原によるELISAによるスクリーニングは、インビボでの挙動に影響し得る特異的又は非特異的オフターゲット結合の種類を検出できない場合がある。従って、我々は、高速クリアランスを示す可能性が高い候補抗体を同定するために有用なインビトロアッセイを開発しようとした。ELISAアッセイにおいて抗原として特異的膜結合型標的を有するインタクトなBV粒子を用いる実験の過程で21、我々は、幾つかの抗体は、標的を発現しないバキュロウイルス粒子に結合することを述べた。これらの抗体の多くはまた、FACSにより、非発現性ヒト293細胞に非特異的に結合することが示された(データ非表示)。しかし、293細胞上の幾つかの同族抗原の発現は、非特異的結合から特異的結合を区別することを困難にした。
図2のパネルから選択された15の抗体の試験セットに対する初回スクリーニングは、高速にクリアする抗体は、バキュロウイルス(BV)ELISAに非特異的に結合したことを示唆した。その後、45抗体の大きな群をアッセイで試験した。かなりのばらつきがあるものの、インビトロアッセイにおいて、より高いスコアは、カニクイザルにおける高速クリアランスと関連している(図5)。「高速」クリアランスの閾値>10mL/kg/日及び正規化されたBVスコア>5は、これらのデータを定量化するために有用である。10mL/kg/日のクリアランス値は、サルにおいて12のヒトIgG1抗体について決定された平均値からの1標準偏差(6.5±2.9)以上である。これらの閾値により、9つの抗体が、サルで高速クリアランスを有するものとして正しく同定され(「真の陽性」)、3つだけが「偽陽性」−正規化されたBVのスコア>5を示すクリアランススコア<10mL/kg/日を有する抗体−であった。4つの抗体は、10mL/kg/日よりも大きなクリアランス及びBVスコア<5を有する、「偽陰性」である。残りの29の抗体は、「真の陰性」として正しく同定される。
データセット(n=16)は小さいが、ヒトにおける高速クリアランスのリスクの増加はまた、高いBVスコアと関連している(図5(b)、スピアマンのρ=0.83)。5mL/kg/日よりも高速なクリアランスを有する5つの抗体がアッセイで正しく同定されている。注目すべきは、カニクイザルにおいてクリアランス<10mL/kg/日を有する抗NRP1抗体は、BVのELISAにおけるヒトクリアランスについて真の陽性として検出される。ヒトでクリアランス>5mL/kg/日、カニクイザルでクリアランス>10mL/kg/日を有する一抗体は、本アッセイで同定されていない。残りの10の抗体は、ヒトにおいて遅いクリアランスを有するとして正しく分類された。
我々は、抗体47の更なる操作を通じて、候補選択の補助を支援するために、BV ELISAが将来を見越して使用することができるかどうかを試験した。これは、親和性改善のため、及び潜在的な配列のライアビリィティ(sequence liabilities)を除去するための両方のために、CDR中にアミノ酸の変化を有するヒト化抗体である。カニクイザルは、抗体47の非標的結合性種である。再現可能な組織染色は、サルでは抗体47によって観察されなかったが、カニクイザルにおいては20.2mL/kg/日のクリアランスが、この抗体について決定された。2つの親和性成熟の変化及び重鎖CDRの一方の潜在的なN結合型グリコシル化部位を除去するアミノ酸変化を保持した抗体47の変異体(抗体47b)は、BV ELISAにおいて結合の低下を示した(表2)。抗体47cは潜在的なN結合型グリコシル化部位を除去するアミノ酸変化のみを保持し、また、BV結合を減少させていた。別の実験では、抗体47のBV結合に対する大きな寄与は、潜在的なAsp−Gly異性化部位を除去するためのVL−D27cS改変によって行われることが示された。抗体47bと47cは、カニクイザルにおける抗体47と比較してより遅いクリアランスを持っていた(表2)。
実施例11:
抗体のこのパネルについて測定されたカニクイザルにおけるクリアランス値の広範な分布、並びに15の抗体で観察された高速クリアランス(>10mL/kg/日)は予想外であった。52の抗体のうち40が同一のヒトIgG1のFc配列を有しているため、より高速なクリアランスはFcRnとの相互作用の変化とは関連されないことが予想された。実際、pH5.8でのFcRn結合について測定されたKDは7倍の値域にわたって変化するが、これはクリアランス値の傾向とは関連していない。pH5.8でのFcRnの親和性の比較的大きな増加がクリアランスの緩やかな改善へと導くとすれば19、ここで測定されるFcRnの親和性の僅かな相違がクリアランスに影響を与えないことは驚くべきことではない。試験した抗体の全ては、中性pHで、FcRnから同等の迅速な放出を示した。Wangらによって報告された結果とは対照的に22、我々は、中性pHでのFcRnの解離動態において抗体のFab部分への影響とクリアランスとの間の関連を検出していない。我々の研究は、結合に対する結合活性効果を最小にするために、より大きな抗体のパネルとSPR実験の異なる配向を使用した。
抗体のこのパネルについて測定されたカニクイザルにおけるクリアランス値の広範な分布、並びに15の抗体で観察された高速クリアランス(>10mL/kg/日)は予想外であった。52の抗体のうち40が同一のヒトIgG1のFc配列を有しているため、より高速なクリアランスはFcRnとの相互作用の変化とは関連されないことが予想された。実際、pH5.8でのFcRn結合について測定されたKDは7倍の値域にわたって変化するが、これはクリアランス値の傾向とは関連していない。pH5.8でのFcRnの親和性の比較的大きな増加がクリアランスの緩やかな改善へと導くとすれば19、ここで測定されるFcRnの親和性の僅かな相違がクリアランスに影響を与えないことは驚くべきことではない。試験した抗体の全ては、中性pHで、FcRnから同等の迅速な放出を示した。Wangらによって報告された結果とは対照的に22、我々は、中性pHでのFcRnの解離動態において抗体のFab部分への影響とクリアランスとの間の関連を検出していない。我々の研究は、結合に対する結合活性効果を最小にするために、より大きな抗体のパネルとSPR実験の異なる配向を使用した。
我々のパネル中で抗体間の最大の差異は、可変ドメイン、とりわけCDRであることを考えると、これらのドメインの組成物の違いは、クリアランスの挙動のばらつきに寄与する可能性がある。他のグループは、標的抗原に対する結合親和性の差異に関連していないCDR配列の変化に関連付けられるクリアランスの影響を観察した13、16。我々は、クリアランスは、インタクトな抗体の等電点(pI)又は疎水性と関連していることを見いださなかった(付録の図1A、B)。Igawaらは23、以前に、カニクイザルにおけるヒトIgG1抗体のクリアランスは、より低いpIをもたらす可変領域の変化によって低減することができることを示した。この効果は、有意な抗原依存性クリアランスが作動している用量で観察された。そのメカニズムは、非FcRn依存性であると推定された。抗体の大きなパネルの比較のために、半減期がFcRn依存性で、クリアランス速度がpIに依存しない用量で収集された薬物動態データを用いた。この結論への注意点は、この分析において抗体の大部分はpI値が比較的狭い範囲に集中しており(7.5〜9.5)、よってより広範囲のpIを試験した場合に、ある傾向が恐らく観察されるであろうということである。加えて、我々は、クリアランスは抗体のFvに対して計算される全電荷と相関していないことを見いだしている(付録の図1C)。従って、高速クリアランスをもたらす抗体の物理化学的性質は、配列比較のみからは容易には認識されず、より詳細な構造−機能解析を必要とする場合がある。
本明細書において、我々は、非特異的結合の単純なアッセイを、ヒトとカニクイザルの両方で高速なクリアランスを有するというリスクが増加した抗体を同定するために使用することができることを示す。このアッセイは、バキュロウイルス感染昆虫細胞から調製されたウイルス粒子への抗体の結合に基づいて、単純なELISA形式を用い、ハイスループット様式で適用することができる。薬物動態データは、哺乳動物種で決定されるため、哺乳類細胞への非特異的結合に基づくアッセイは、高速クリアランスとの強い相関を示すことが期待されている可能性がある。予備的結果は、FACSにより検出されるヒト293細胞への非特異的結合と高速クリアランスとの間の相関を示したが、抗体のこのコレクションの同族抗原の多くが293細胞に発現しているので、このアッセイの広範な適用は除外された。我々が開発したBV ELISAアッセイは、この標的−発現の制限を受けない。両方のアッセイを用いて評価することができる抗体について、非特異的結合における同様の傾向が観察される(データ非表示)。出芽バキュロウイルスビリオンは、感染した細胞表面を模倣する安定なナノ粒子であり、リン脂質、炭水化物、糖タンパク質、細胞外マトリックス及び核酸の複合混合物並びにウイルスキャプシドを提示する24、25。抗原は、恐らく、タンパク質、膜及び核酸を含む一部の昆虫細胞の破片をも含んでいる。治療用抗体の特異的標的を欠く一方でヒト細胞及び組織と同じ全体的な生化学的複雑さを維持するその混合物は、異なる種の相互作用、例えば異なる抗体における疎水性対静電相互作用を検出することができるため、非特異的結合アッセイにおいて利点を有している。カニクイザルにおける抗体クリアランスとBV粒子への結合との関連への重要な注意点は、抗体47以外で、BV−粒子の結合を系統的に変化させた設計実験よりもむしろ通常の前臨床開発を通して収集されたデータに基づいた観察である。クリアランス値は、可変PKアッセイタイプを使用して、広範に可変させる用量レベルによる別々の研究から得られた。しかし、評価を行うために十分なデータが利用可能であった場合、カニクイザルにおける高速クリアランス及びBV結合との間の関連性は、用量レベル、アッセイのタイプ及び抗体源及び標的タイプにわたって持続することが見いだされた。
高速クリアランスのリスクは、抗体を操作するの間の非特異的結合の導入を最小限に抑えるためのアッセイを用いることによって低減することができる。抗体47において、電荷の減少及び疎水性の増加の両方が、BV粒子への非特異的結合の増加と関連していた。非特異的結合が減少した変異体は、より遅いクリアランスを持っていた。BVのELISAは、特定のオフターゲット効果の信頼性のあるアッセイであるとは期待されていない。例えば、以前マウスにおいて、補体タンパク質14への意図せぬ特異的に結合に起因する高速クリアランスを有することが示されたヒト化抗体は、BV粒子への検出可能な結合を有しない(図示せず)。我々の経験では、特異的なオフターゲット効果は、より広範なオフターゲット結合を有する抗体よりも一般的ではない。更に、特異的オフターゲット効果は、通常、高速クリアランスのメカニズムの研究を介して同定することができる。
BV粒子のELISAは、カニクイザルにおいて急速なクリアランスを有し、偽陽性は少数である、全てではないがほとんどの抗体を検出する。従って、そのアッセイは、NHP PK実験で試験する必要がある治療用抗体の数を減らすためのスクリーニングツールとして、及びカニクイザルにおいてクリアランスを一貫して予測するアッセイとして考慮されるべきである。小さいがゼロでない偽陽性の割合が許容可能であるように、ターゲットに対して同様の効力を持つ複数の候補が利用可能な場合、このアッセイは、高速クリアランスのリスクを最小限にするための費用効率が高いツールである。偽陰性結果の根拠を同定することができた場合、BVのELISAアッセイを高めることができる。哺乳動物細胞からの膜に比べて、昆虫細胞膜のリン脂質組成物は、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、及びホスファチジルエタノールアミンに富み、酸性リン脂質ホスファチジルセリン、コレステロール、グリコ−及びスフィンゴ脂質の量が少ない24。これらの抗体のより高速なクリアランスが、哺乳動物の膜上の酸性リン脂質への結合に関連している場合、中性リン脂質の量が多いことは、アッセイでの偽陰性を説明し得る。4つの偽陰性抗体のうち2つは、Fvのドメインに対して計算される高い正味の正電荷を持っている。BV粒子のリン脂質組成物は、増殖条件又は細胞株の違いを通じて操作することができるかどうかを、非特異的結合アッセイの正確さの改善を同時に伴って、探求することは興味深いであろう。これらの研究は、許容可能な薬物動態学的挙動を維持するために、抗体操作の間に回避されるべき特徴を更に明らかにすることができる。
実施例12:
抗体クリアランスの最適化
この実施例において、我々は、更なる操作を通じて、候補選択の補助を支援するために、BV ELISAが将来を見越して使用することができるかどうかを試験した。
抗体クリアランスの最適化
この実施例において、我々は、更なる操作を通じて、候補選択の補助を支援するために、BV ELISAが将来を見越して使用することができるかどうかを試験した。
抗体47は、親和性改善のため、及び潜在的な配列のライアビリィティ(sequence liabilities)を除去するための両方のために、CDR中にアミノ酸の変化を有するヒト化抗体である。カニクイザルは、抗体47の非標的結合性種である。再現可能な組織染色は、サルでは抗体47によって観察されなかったが、カニクイザルにおいては20.2mL/kg/日のクリアランスが、この抗体について決定された。2つの親和性成熟の変化及び重鎖CDRの一方の潜在的なN結合型グリコシル化部位を除去するアミノ酸変化を保持した抗体47の変異体(抗体47b)は、BV ELISAにおいて結合の低下を示した(表1)。抗体47cは潜在的なN結合型グリコシル化部位を除去するアミノ酸変化のみを保持し、また、BV結合を減少させていた。別の実験では、抗体47のBV結合に対する大きな寄与は、潜在的なAsp−Gly異性化部位を除去するための改変によって行われることが示された。抗体47bと47cは、カニクイザルにおける抗体47と比較してより遅いクリアランスを持っていた(表1)。
従って、このアッセイは、クリアランスの迅速な評価として使用することができ、親抗体に比べてクリアランスが低下した臨床的に関連する抗体の開発に役立つ。
引用の一覧
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28. Geisser, S. The predictive sample reuse method with applications I. Amer.Stat.Assoc.70, 320-328 (1975).
従って、このアッセイは、クリアランスの迅速な評価として使用することができ、親抗体に比べてクリアランスが低下した臨床的に関連する抗体の開発に役立つ。
<本発明の更なる実施態様>
[実施態様1]
バキュロウイルス粒子(BV)に治療薬を接触させ、BVへの治療薬の結合のレベルを測定し、結合のレベルに基づいて治療薬についてBVスコアを計算する工程を含む、治療薬が、カニクイザル、ヒト又はカニクイザルにおいて望ましいクリアランス速度を有するかどうかを予測する方法であって、所定の閾値を超えるBVスコアが高速なクリアランス速度の可能性の増加の指標であり、所定の閾値未満のBVスコアが望ましいクリアランス速度の可能性の増加の指標である、方法。
[実施態様2]
治療薬への結合の前にBVがマイクロタイタープレートに結合される、実施態様1に記載の方法。
[実施態様3]
治療薬が検出薬で標識される、実施態様1又は2の何れか一に記載の方法。
[実施態様4]
検出薬を含む第二の薬剤を治療薬に結合させる工程を更に含む、実施態様1から3の何れか一に記載の方法。
[実施態様5]
検出薬からのシグナルが測定される、実施態様3又は4の何れか一に記載の方法。
[実施態様6]
ヒトにおいて、10mL/Kg/日を超えるクリアランスに相関するBVスコアは高速なクリアランス速度と見なされる、実施態様1から5の何れか一に記載の方法。
[実施態様7]
BVスコアの所定の閾値が5である、実施態様6に記載の方法。
[実施態様8]
治療薬がポリペプチドを含む、実施態様1に記載の方法。
[実施態様9]
治療薬が抗体又はイムノアドヘシンを含む、実施態様1に記載の方法。
[実施態様10]
最初の二工程がELISAアッセイに組み込まれる、実施態様1に記載の方法。
[実施態様11]
治療薬が望ましいクリアランス速度を有するかどうかを決定するためのキットであって、該キットが、バキュロウイルス粒子及びヒト抗体に結合する抗体を含む、キット。
[実施態様12]
キットがマイクロタイタープレートを更に含む、実施態様11に記載のキット。
[実施態様13]
ヒト抗体に結合する抗体は、ヒト抗体のFc領域に結合する、実施態様11に記載のキット。
[実施態様14]
BVが、固体支持体に結合される、実施態様1に記載の方法。
[実施態様15]
個体支持体がマイクロタイタープレートである、実施態様14に記載の方法。
[実施態様16]
バキュロウイルス粒子の非存在下での治療薬の結合が、正規化に使用するための値を導出するために測定される、実施態様15に記載の方法。
[実施態様17]
界面活性剤が任意の工程で存在する、実施態様1に記載の方法。
[実施態様18]
治療薬が望ましいクリアランス速度を有するかどうかを決定するためのキットであって、該キットが、バキュロウイルス粒子及びELISAアッセイにおけるインストラクションを含む、キット。
[実施態様19]
ヒトにおける望ましいクリアランス速度を有する治療薬を選択すること及び宿主細胞中で治療薬を発現する工程を含む、治療薬を作製する方法。
[実施態様20]
宿主細胞により発現される治療薬を回収する工程を更に含む方法。
[実施態様21]
治療薬の選択は、実施態様1に記載の方法により達成される、実施態様19又は実施態様20に記載の方法。
<本発明の更なる実施態様>
[実施態様1]
バキュロウイルス粒子(BV)に治療薬を接触させ、BVへの治療薬の結合のレベルを測定し、結合のレベルに基づいて治療薬についてBVスコアを計算する工程を含む、治療薬が、カニクイザル、ヒト又はカニクイザルにおいて望ましいクリアランス速度を有するかどうかを予測する方法であって、所定の閾値を超えるBVスコアが高速なクリアランス速度の可能性の増加の指標であり、所定の閾値未満のBVスコアが望ましいクリアランス速度の可能性の増加の指標である、方法。
[実施態様2]
治療薬への結合の前にBVがマイクロタイタープレートに結合される、実施態様1に記載の方法。
[実施態様3]
治療薬が検出薬で標識される、実施態様1又は2の何れか一に記載の方法。
[実施態様4]
検出薬を含む第二の薬剤を治療薬に結合させる工程を更に含む、実施態様1から3の何れか一に記載の方法。
[実施態様5]
検出薬からのシグナルが測定される、実施態様3又は4の何れか一に記載の方法。
[実施態様6]
ヒトにおいて、10mL/Kg/日を超えるクリアランスに相関するBVスコアは高速なクリアランス速度と見なされる、実施態様1から5の何れか一に記載の方法。
[実施態様7]
BVスコアの所定の閾値が5である、実施態様6に記載の方法。
[実施態様8]
治療薬がポリペプチドを含む、実施態様1に記載の方法。
[実施態様9]
治療薬が抗体又はイムノアドヘシンを含む、実施態様1に記載の方法。
[実施態様10]
最初の二工程がELISAアッセイに組み込まれる、実施態様1に記載の方法。
[実施態様11]
治療薬が望ましいクリアランス速度を有するかどうかを決定するためのキットであって、該キットが、バキュロウイルス粒子及びヒト抗体に結合する抗体を含む、キット。
[実施態様12]
キットがマイクロタイタープレートを更に含む、実施態様11に記載のキット。
[実施態様13]
ヒト抗体に結合する抗体は、ヒト抗体のFc領域に結合する、実施態様11に記載のキット。
[実施態様14]
BVが、固体支持体に結合される、実施態様1に記載の方法。
[実施態様15]
個体支持体がマイクロタイタープレートである、実施態様14に記載の方法。
[実施態様16]
バキュロウイルス粒子の非存在下での治療薬の結合が、正規化に使用するための値を導出するために測定される、実施態様15に記載の方法。
[実施態様17]
界面活性剤が任意の工程で存在する、実施態様1に記載の方法。
[実施態様18]
治療薬が望ましいクリアランス速度を有するかどうかを決定するためのキットであって、該キットが、バキュロウイルス粒子及びELISAアッセイにおけるインストラクションを含む、キット。
[実施態様19]
ヒトにおける望ましいクリアランス速度を有する治療薬を選択すること及び宿主細胞中で治療薬を発現する工程を含む、治療薬を作製する方法。
[実施態様20]
宿主細胞により発現される治療薬を回収する工程を更に含む方法。
[実施態様21]
治療薬の選択は、実施態様1に記載の方法により達成される、実施態様19又は実施態様20に記載の方法。
Claims (21)
- バキュロウイルス粒子(BV)に治療薬を接触させ、BVへの治療薬の結合のレベルを測定し、結合のレベルに基づいて治療薬についてBVスコアを計算する工程を含む、治療薬が、カニクイザル、ヒト又はカニクイザルにおいて望ましいクリアランス速度を有するかどうかを予測する方法であって、所定の閾値を超えるBVスコアが高速なクリアランス速度の可能性の増加の指標であり、所定の閾値未満のBVスコアが望ましいクリアランス速度の可能性の増加の指標である、方法。
- 治療薬への結合の前にBVがマイクロタイタープレートに結合される、請求項1に記載の方法。
- 治療薬が検出薬で標識される、請求項1又は2の何れか一項に記載の方法。
- 検出薬を含む第二の薬剤を治療薬に結合させる工程を更に含む、請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- 検出薬からのシグナルが測定される、請求項3又は4の何れか一項に記載の方法。
- ヒトにおいて、10mL/Kg/日を超えるクリアランスに相関するBVスコアは高速なクリアランス速度と見なされる、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- BVスコアの所定の閾値が5である、請求項6に記載の方法。
- 治療薬がポリペプチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 治療薬が抗体又はイムノアドヘシンを含む、請求項1に記載の方法。
- 最初の二工程がELISAアッセイに組み込まれる、請求項1に記載の方法。
- 治療薬が望ましいクリアランス速度を有するかどうかを決定するためのキットであって、該キットが、バキュロウイルス粒子及びヒト抗体に結合する抗体を含む、キット。
- キットがマイクロタイタープレートを更に含む、請求項11に記載のキット。
- ヒト抗体に結合する抗体は、ヒト抗体のFc領域に結合する、請求項11に記載のキット。
- BVが、固体支持体に結合される、請求項1に記載の方法。
- 個体支持体がマイクロタイタープレートである、請求項14に記載の方法。
- バキュロウイルス粒子の非存在下での治療薬の結合が、正規化に使用するための値を導出するために測定される、請求項15に記載の方法。
- 界面活性剤が任意の工程で存在する、請求項1に記載の方法。
- 治療薬が望ましいクリアランス速度を有するかどうかを決定するためのキットであって、該キットが、バキュロウイルス粒子及びELISAアッセイにおけるインストラクションを含む、キット。
- ヒトにおける望ましいクリアランス速度を有する治療薬を選択すること及び宿主細胞中で治療薬を発現する工程を含む、治療薬を作製する方法。
- 宿主細胞により発現される治療薬を回収する工程を更に含む方法。
- 治療薬の選択は、請求項1に記載の方法により達成される、請求項19又は請求項20に記載の方法。
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