ES2341009T3 - Anticuerpos cd20 con afinidad de union a receptores fc y funcion efectora. - Google Patents
Anticuerpos cd20 con afinidad de union a receptores fc y funcion efectora. Download PDFInfo
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Abstract
Anticuerpo anti-CD20 de tipo II glucomanipulado humanizado que presenta una ADCC incrementada como resultado de dicha glucomanipulación y que presenta una capacidad incrementa de inducir apoptosis de células diana tras dicha humanización, en donde dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del anticuerpo B-Ly1 murino, en el que: a. la CDR1 de la cadena pesada es la secuencia SEC ID nº 16, b. la CDR2 de la cadena pesada es la secuencia SEC ID nº 26, y c. la CDR3 de la cadena pesada es la secuencia SEC ID nº 28, en donde las regiones marco (FRs) de la región variable de cadena pesada, FR1, FR2 y FR3 de dicho anticuerpo son secuencias FR humanas codificadas por la secuencia VH1_10 de la línea germinal humana y la región variable FR4 de cadena pesada de dicho anticuerpo es una secuencia FR humana codificada por la secuencia JH4 de la línea germinal humana, y en donde dicho anticuerpo comprende además una región variable de cadena ligera que comprende las CDRs del anticuerpo B-Ly1 murino, en donde: d. la CDR1 de la cadena ligera es la secuencia SEC ID nº 18, e. la CDR2 de la cadena ligera es la secuencia SEC ID nº 19, y f. la CDR3 de la cadena ligera es la secuencia SEC ID nº 20, en donde las FRs de la región variable de la cadena ligera FR1, FR2 y FR3 de dicho anticuerpo son secuencias FR humanas codificadas por la secuencia VK_2_40 de la línea germinal humana y la región FR4 de la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo es una secuencia FR humana codificada por la secuencia JK4 de la línea germinal humana.
Description
Anticuerpos CD20 con afinidad de unión a
receptores Fc y función efectora incrementadas.
La presente invención se refiere a moléculas de
unión a antígeno (ABMs). En realizaciones particulares, la presente
invención se refiere a anticuerpos monoclonales recombinantes, es
decir anticuerpos humanizados específicos para CD20 humana.
Asimismo, la presente invención se refiere a moléculas de ácidos
nucleicos codificantes de dichas ABMs y a vectores y células
huésped que comprenden dichas moléculas de ácidos nucleicos. La
invención se refiere asimismo a métodos para producir las ABMs de
la invención y a métodos de utilización de dichas ABMs en el
tratamiento de enfermedades. Además, la presente invención se
refiere a ABMs con glucosilación modificada que presentan
propiedades terapéuticas mejoradas, incluyendo anticuerpos con una
capacidad incrementada de unión a receptores Fc y con una función
efectora incrementada.
El sistema inmunológico de los vertebrados,
incluido el ser humano, consiste de varios órganos y tipos
celulares, que han evolucionado para reconocer, unirse y destruir
exacta y específicamente los microorganismos foráneos invasores
("antígenos"). Los linfocitos resultan críticos para la función
correcta del sistema inmunológico. Estas células se producen en el
timo, el bazo y la médula ósea (adulta) y representan
aproximadamente 30% de los glóbulos blancos totales presentes en el
sistema circulatorios del ser humano adulto. Existen dos
subpoblaciones importantes de linfocitos: las células T y las
células B. Las células T son responsables de la inmunidad mediada
por células, mientras que las células B son responsables de la
producción de anticuerpos (inmunidad humoral). Sin embargo, en una
respuesta inmunológica típica, las células T y las células B
funcionan independientemente. Las células T son activadas al unirse
el receptor de células T a fragmentos de un antígeno que se
encuentran unidos a glucoproteínas del complejo de
histocompatibilidad mayor ("MHC") sobre la superficie de una
célula presentadora de antígenos; esta activación provoca la
liberación de mediadores biológicos ("interleuquinas"), que
estimulan a las células B a diferenciarse y producir anticuerpos
("inmunoglobulinas") contra el antígeno.
Cada célula B dentro del huésped expresa un
anticuerpo de un tipo y especificidad particulares, y diferentes
células B expresan anticuerpos específicos para diferentes
antígenos. La proliferación de las células B y la producción de
anticuerpos alcanzan un máximo como reacción a un foráneo antígeno,
y típicamente ambos cesan (o se reducen sustancialmente) tras
neutralizar el antígeno foráneo. Ocasionalmente, sin embargo, la
proliferación de una célula B particular puede continuar sin
control; dicha proliferación puede resultar en un cáncer denominado
"linfoma de células B".
Tanto las células T como las células B
comprenden proteínas de superficie celular que pueden utilizarse
como "marcadores" para la diferenciación e identificación. Una
de estas células B humanas marcadoras es el antígeno Bp35 de
diferenciación restringido a linfocitos D, denominado "CD20".
CD20 se expresa durante el desarrollo temprano de las células
pre-B y permanece hasta la diferenciación de la
célula plasmática. Específicamente, la molécula CD20 podría regular
una etapa en el proceso de activación que resulta necesaria para el
inicio y diferenciación del ciclo celular, y habitualmente se
expresa a niveles muy altos en las células B neoplásicas
("tumorales"). Debido a que CD20 se encuentra presente a
niveles elevados sobre células B "malignas", es decir,
aquellas células B cuya proliferación no controlada puede conducir a
un linfoma de células B, el antígeno de superficie CD20 presenta el
potencial de servir como candidato para el "reconocimiento" de
los linfomas de células B.
En esencia, dicho reconocimiento puede
generalizarse de la manera siguiente: se introducen anticuerpos
específicos del antígeno de superficie CD20 de las células B en un
paciente, mediante inyección, por ejemplo. Estos anticuerpos
anti-CD20 se unen específicamente al antígeno de
superficie celular CD20 de, aparentemente, células normales y
células B malignas; el anticuerpo anti-CD20 unido al
antígeno de superficie CD20 puede conducir a la destrucción y
marcada reducción de las células B neoplásicas. Además, algunos
agentes químicos o marcajes radioactivos que presentan el potencial
de destruir el tumor pueden conjugarse con el anticuerpo
anti-CD20 de manera que el agente se
"administre" específicamente a, por ejemplo, las células B
neoplásicas. Con independencia del enfoque, un objetivo principal
es destruir el tumor: el enfoque específico puede ser determinado
por el anticuerpo anti-CD20 particular que se
utilice y, de esta manera, los enfoques disponibles para el
reconocimiento del antígeno CD20 pueden variar
considerablemente.
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) no
conjugados pueden ser medicinas útiles para el tratamiento del
cáncer, tal como demuestra la autorización de la U.S. Food and Drug
Administration del Rituximab (Rituxan^{TM}; IDEC Pharmaceuticals,
San Diego, CA, y Genentech Inc., San Francisco, CA) para el
tratamiento de células B CD20-positivas, linfoma no
de Hodgkin folicular o de grado bajo, trastuzumab (Herceptin^{TM},
Genentech Inc.), para el tratamiento del cáncer de mama avanzado
(Grillo-Lopez, A.-J. et al., Semin. Oncol.
26:66-73, 1999; Goldenberg M.M., Clin Ther.
21:309-18, 1999), Gemtuzumab (Mylotarg^{TM},
Celltech/Wyeth-Ayerst) para el tratamiento de la
leucemia mieloide aguda en recaída, y Alemtuzumab
(CAM-PATH^{TM}, Millenium Pharmaceuticals/Schering
AG) para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica de
células B. El éxito de estos productos se basa no sólo en su
eficacia, sino también en sus excepcionales perfiles de seguridad
(Grillo-Lopez A.-J. et al., Semin. Oncol.
26:66-73, 1999; Goldenberg M.M., Clin. Ther.
21:309-18, 1999). A pesar de los éxitos obtenidos
con estos fármacos, en la actualidad existe un gran interés en
obtener una actividad específica más alta de anticuerpo que la
proporcionada típicamente por la terapia de mAb no conjugado. El
anticuerpo monoclonal murino B-Ly1 es otro
anticuerpo que es conocido que es específico de el CD20 humano
(Poppema S. y Visser L., Biotest Bulletin
3:131-139, 1987).
La patente WO nº 03/11878 describe la
glucomanipulación de anticuerpos utilizando C2B8 (Rituxan) a título
de ejemplo, Dicho documento no contiene ninguna mención de
B-Ly1.
Polyak et al., 2002, páginas 3256 a 3262,
estudiaron el epítopo o epítopos a los que se unen diversos
anticuerpos anti-CD20. Utilizaron un
B-Ly1 totalmente murino como uno de entre un panel
de 16 anticuerpos en experimentos para analizar la reactividad con
una región particular del bucle extracelular de CD20, y la
capacidad de inducir la agregación homotípica de las células y de
traslocar CD20 a la membrana celular. Sin embargo, no
proporcionaron ninguna secuencia de B-Ly1 ni
construyeron proteínas de fusión que comprendiesen partes de la
secuencia de B-Ly1, tales como anticuerpos
quiméricos, humanizados o glucomanipulados, que conservasen la
capacidad de unirse a CD20.
Cragg et al., Blood, 2003, páginas 1045 a
1052, correlacionaron la lisis mediada por el complemento con
diversos anticuerpos anti-CD20, incluyendo el
Rituximab, con la segregación de CD20 en balsas lipídicas. Cragg
et al. no sometieron a ensayo ni siquiera el anticuerpo
B-Ly1 totalmente murino en su estudio; por el
contrario, meramente hacen referencia al artículo de Polyak y Deans,
que indicaba que B-Ly1 no libera CD20 en balsas
lipídicas.
Davies et al., Biotechnology and
Bioengineering - Combinatorial Chemistry, 2001, páginas 288 a 294,
expresaron GnTIII de rata en células CHO que expresaban Rituximab.
Ni siquiera mencionan el B-Ly1 murino, así como
tampoco construyeron polipéptidos de fusión que comprendiesen
secuencias de B-Ly1 o anticuerpos de tipo II
glucomanipulados.
La patente US nº 2003/67796 se refiere a métodos
para tratar enfermedades autoinmunológicas con antagonistas que se
unen a marcadores de la superficie de las células B (por ejemplo
anticuerpos anti-CD20). Los ejemplos se refieren al
Rituximab. No se da a conocer el anticuerpo de
B-Ly1.
Los resultados de varios estudios sugieren que
los mecanismos dependientes del receptor Fc contribuyen
sustancialmente a la acción de los anticuerpos citotóxicos contra
los tumores, e indican que un anticuerpo óptimo contra los tumores
se uniría preferentemente a receptores Fc de activación y
mínimamente a la pareja inhibidora Fc\gammaRIIB (Clynes R.A.
et al., Nature Medicine 6(4):443-446,
2000; Kalergis A.M. y Ravetch J.V., J. Exp. Med.
19S(12):1653-1659, junio de 2002). Por
ejemplo, los resultados de por lo menos un estudio sugieren que el
receptor Fc\gammaRIIIa en particular se encuentra fuertemente
asociado a la eficacia de la terapia de anticuerpos (Cartron G.
et al., Blood 99(3):754-757, febrero
de 2002). Este estudio demostró que los pacientes homocigóticos para
Fc\gammaRIIIa presentaban una mejor respuesta frente al Rituximab
que los pacientes heterocigóticos. Los autores concluyeron que la
superior respuesta se debía a la mejor unión in vivo del
anticuerpo a Fc\gammaRIIIA, que resultaba en una mejor actividad
de ADCC contra las células de linfoma (Cartron G. et al.,
Blood 99(3):754-757, febrero de 2002).
Se ha informado de diversos intentos de dianizar
el antígeno superficial CD20. Se informa de que se administró el
anticuerpo monoclonal murino (de ratón) 1F5 (un anticuerpo
anti-CD20) mediante infusión intravenosa continua a
pacientes de linfoma de células B. Resultaron necesarios niveles
extremadamente altos (>2 gramos) de 1FS para reducir
marcadamente las células tumorales circulantes, y los resultados se
describieron como "transitorios" (Press et al.,
"Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy
of Human B-Cell Lymphomas", Blood
69(2):584-591, 1987). Un problema potencial
de este enfoque es que los anticuerpos monoclonales no humanos (por
ejemplo anticuerpos monoclonales murinos) típicamente no presentan
la funcionalidad efectora humana, es decir son incapaces, inter
alia, de mediar la lisis dependiente del complemento o de lisar
células diana humanas mediante la toxicidad celular dependiente de
anticuerpos o de la fagocitosis mediada por el receptor Fc. Además,
los anticuerpos monoclonales no humanos pueden ser reconocidos por
el huésped humano como proteína foránea; por lo tanto, las
inyecciones repetidas de dichos anticuerpos foráneos podrían
conducir a la inducción de respuestas inmunológicas que provocasen
reacciones de hipersensibilidad perjudiciales. Para los anticuerpos
monoclonales de tipo murino, lo anterior con frecuencia se denomina
respuesta de anticuerpos humanos antirratón, o respuesta
"HAMA". Además, estos anticuerpos "foráneos" pueden
resultar atacados por el sistema inmunológico del huésped de manera
que resulten, en efecto, neutralizados antes de alcanzar su sitio
diana.
Otro enfoque del que se informa para la mejora
de la capacidad de los anticuerpos monoclonales murinos de resultar
eficaces en el tratamiento de los trastornos de las células B ha
sido conjugar un marcaje radioactivo o una toxina con el
anticuerpo, de manera que el marcaje o la toxina se localice en el
sitio tumoral. Por ejemplo, el anticuerpo 1F5 al que se ha hecho
referencia anteriormente ha sido "marcado" con
yodo-131 ("^{131}I") y se informa de que ha
sido evaluado para su biodistribución en dos pacientes (ver Eary
J.F. et al., "Imaging and Treatment of
B-Cell Lymphoma", J. Nuc. Med.
31(8):1257-1268, 1990; ver también Press O.W.
et al., "Treatment of Refractory
Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled
MB-1 (Anti-CD37) Antibody", J.
Clin. Onc. 7(8):1027-1038, 1989 (indicación
de que en un paciente tratado con IF-5 marcado con
^{131}I se observaba una "respuesta parcial"); Goldenberg
D.M. et al., "Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy
of B-Cell Lymphomas with
Iodine-131-Labeled LL2 Monoclonal
Antibody", J. Clin. Onc. 9(4):548-564,
1991 (se informó de que tres de ocho pacientes que habían recibido
múltiples inyecciones habían desarrollado una respuesta HAMA);
Appelbaum F.R., "Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the
Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma", Hem. Onc.
Clinics of N.A. 5(5):1013-1025, 1991
(artículo de revisión); Press O.W. et al.,
``Radiolabeled-Antibody Therapy of
B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support,
New England J. Med. 329(17):1219-1223, 1993
(anticuerpo IF5 anti-CD20 marcado con
yodo-131 y B1), y Kaminski M.G. et al.,
"Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with
^{131}I Anti-B1 (Anti-CD20)
Antibody", New England J. Med. 329(7), 1993 (anticuerpo B1
anti-CD20 marcado con yodo-131, en
lo sucesivo "Kaminiski"). También se han conjugado toxinas (es
decir, agentes quimioterapéuticos, tales como doxorrubicina o
mitomicina C) con anticuerpos. Ver, por ejemplo, la solicitud de
patente PCT publicada WO nº 92/07466 (publicada el 14 de mayo de
1992).
Se han desarrollado anticuerpos quiméricos que
comprenden partes de anticuerpos de dos o más especies diferentes
(por ejemplo ratón y ser humano) como alternativa a los anticuerpos
"conjugados". Por ejemplo, Liu A.Y. et al., Production
of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to
CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity'',
J. Immun. 139(10):3521-3526, 1987, describen
un anticuerpo quimérico ratón/humano dirigido contra el antígeno
CD20. Ver también la publicación de patente PCT WO nº 88/04936. Por
ejemplo, el rituximab (RITUXAN®), un anticuerpo quimérico
anti-CD20, ha sido autorizado para el tratamiento
del linfoma no de Hodgkin.
Dada la expresión de CD20 por parte de los
linfomas de células B, este antígeno puede servir como candidato
para el "reconocimiento" de dichos linfomas. En esencia, dicho
reconocimiento puede generalizarse de la manera siguiente: se
administran en el paciente anticuerpos específicos para el antígeno
de superficie CD20 sobre las células B. Estos anticuerpos
anti-CD20 se unen específicamente al antígeno CD20
de (aparentemente) tanto células normales como B malignas, y el
anticuerpo unido a CD20 sobre la superficie celular resulta en la
destrucción y reducción marcada de las células B tumorigénicas.
Además, pueden unirse directa o indirectamente agentes químicos,
citotoxinas o agentes radioactivos al anticuerpo
anti-CD20, de manera que el agente sea
selectivamente "enviado" a las células B que expresan antígeno
CD20. En ambos enfoques el objetivo principal es destruir el tumor.
El enfoque específico depende del anticuerpo
anti-CD20 particular que se utilice. De esta manera,
resulta evidente que los diversos enfoques para el reconocimiento
del antígeno CD20 pueden variar considerablemente.
El anticuerpo Rituximab (RITUXAN®) es un
anticuerpo monoclonal genéticamente manipulado quimérico que
contiene el dominio constante gamma 1 humano murino dirigido contra
el antígeno CD20 humano. Este anticuerpo quimérico contiene
dominios constantes gamma 1 humanos y se identifica con el nombre
"C2B8" en la patente US nº 5.736.137 (Andersen et al.),
publicada el 17 de abril de 1998, de IDEC Pharmaceuticals
Corporation. RITUXAN® está autorizado para el tratamiento de
pacientes con linfoma no de Hodgkin de células B
CD20-positivos foliculares o de grado bajo en
recaída o refractarios. El mecanismo in vitro de los estudios
de acción han demostrado que el RITUXAN® muestra citotoxicidad
dependiente del complemento humano (CDC) (Reff et al., Blood
83(2):435-445, 1994). Además, muestra una
actividad significativa en ensayos que miden la citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Se ha demostrado que el
RITUXAN® presenta actividad antiproliferativa en ensayos de
incorporación de timidina y una capacidad limitada de inducir
apoptosis directamente, mientras que los anticuerpos CD28 no la
presentan (Maloney et al., Blood 88(10):637a,
1996).
El componente oligosacárido puede afectar
significativamente a propiedades relevantes para la eficacia de una
glucoproteína terapéutica, incluyendo la estabilidad física, la
resistencia al ataque de proteasas, las interacciones con el
sistema inmunológico, la farmacocinética y la actividad biológica
específica. Estas propiedades pueden depender no sólo de la
presencia o ausencia, sino también de las estructuras específicas de
los oligosacáridos. Pueden realizarse algunas generalizaciones
sobre la relación entre la estructura del oligosacárido y la función
de la glucoproteína. Por ejemplo, determinadas estructuras de
oligosacárido median en la rápida eliminación de la glucoproteína
del flujo sanguíneo mediante interacciones con proteínas específicas
de unión a carbohidratos, mientras que otras pueden unirse a
anticuerpos y desencadenar reacciones inmunológicas no deseadas
(Jenkins et al., Nature Biotechnol.
14:975-81, 1996).
Las células de mamífero son los huéspedes
preferentes para la producción de glucoproteínas terapéuticas,
debido a su capacidad de glucosilar proteínas en la forma más
compatible para la aplicación en el ser humano (Cumming et
al., Glycobiology 1:115-30, 1991; Jenkins et
al., Nature Biotechnol. 14:975-81, 1996). Las
bacterias muy raramente glucosilan las proteínas, y al igual que
otros tipos de huéspedes comunes, tales como levaduras, hongos
filamentosos, células de insecto y células vegetales, proporcionan
patrones de glucosilación asociados a la rápida eliminación del
flujo sanguíneo, a interacciones inmunológicas no deseables y, en
algunos casos específicos, a una actividad biológica reducida.
Entre las células de mamífero, las células de ovario de hámster
chino (CHO) han sido las utilizadas más comúnmente durante las
últimas dos décadas. Además de proporcionar patrones de
glucosilación adecuados, estas células permiten la generación
consistente de líneas celulares clonales altamente productivas y
genéticamente estables. Pueden cultivarse a altas densidades en
biorreactores simples utilizando medio libre de suero, y permiten
el desarrollo de procesos biológicos seguros y reproducibles. Entre
otras células animales utilizadas comúnmente se incluyen las células
de riñón de hámster neonato (BHK), células de mieloma de ratón NS0
y SP2/0. Más recientemente también se ha sometido a ensayo la
producción a partir de animales transgénicos (Jenkins et
al., Nature Biotechnol. 14:975-81, 1996).
Todos los anticuerpos contienen estructuras de
carbohidrato en posiciones conservadas en las regiones constantes
de cadena pesada, presentando cada isotipo una serie diferente de
estructuras de carbohidrato N-ligadas, que afectan
variablemente al ensamblaje de la proteína, a la secreción o a la
actividad funcional (Wright A. y Morrison S.L., Trends Biotech.
15:26-32, 1997). La estructura del carbohidrato
N-ligado unido varía considerablemente, dependiendo
del grado de procesamiento, y puede incluir oligosacáridos ricos en
manosa, de ramificación múltiple, así como complejos biantenarios
(Wright A. y Morrison S.L., Trends Biotech.
15:26-32, 1997). Típicamente se produce un
procesamiento heterogéneo de las estructuras de oligosacárido
nucleares unidas en un sitio de glucosilación particular, de manera
que incluso existen anticuerpos monoclonales en forma de glucoformas
múltiples. De manera similar, se ha demostrado que se producen
diferencias mayores en la glucosilación de los anticuerpos en
diferentes líneas celulares, e incluso se observan diferencias
menores en una línea celular dada cultivada bajo diferentes
condiciones de cultivo (Lifely M.R. et al., Glycobiology
5(8):813-22, 1995).
Una manera de obtener grandes incrementos de
potencia, manteniendo simultáneamente un procedimiento de producción
simple y evitando potencialmente efectos secundarios no deseables
significativos, es incrementar las funciones efectoras naturales
mediadas por células de anticuerpos monoclonales mediante la
manipulación del componente oligosacárido tal como se describe en
Umaña P. et al., Nature Biotechnol.
17:176-180, 1999, y la patente US nº 6.602.684. Los
anticuerpos de tipo IgG1, los anticuerpos más comúnmente utilizados
en la inmunoterapia del cáncer, son glucoproteínas que presentan un
sitio de glucosilación N-ligada conservado en Asn297
en cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos biantenarios complejos
unidos a Asn297 se encuentran enterrados entre los dominios CH2,
formando contactos extensivos con el esqueleto polipeptídico, y su
presencia resulta esencial para que el anticuerpo para mediar en
las funciones efectoras, tal como la citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos (ADCC) (Lifely M.R. et al.,
Glycobiology 5:813-822, 1995; Jefferis R. et
al., Immunol. Rev. 163:59-76, 1998; Wright A. y
Morrison S.L., Trends Biotechnol. 15:26-32,
1997).
Los presentes inventores han demostrado
anteriormente que la sobreexpresión en células de ovario de hámster
chino (CHO) de la
\beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa
III ("GnTIII"), una glucosiltransferasa que cataliza la
formación de oligosacáridos biantenarios, incrementa
significativamente la actividad ADCC in vitro de un
anticuerpo monoclonal quimérico antineuroblastoma (chCE7) producido
por las células CHO manipuladas (ver Umaña P. et al., Nature
Biotechnol. 17:176-180, 1999, y la publicación
internacional WO nº 99/54342). El anticuerpo chCE7 pertenece a una
clase grande de mAbs no conjugados que presentan una afinidad y
especificidad para tumores elevadas, pero presentan una potencia
excesivamente baja para resultar clínicamente útiles cuando se
producen en las líneas celulares industriales estándares que carecen
del enzima GnTIII (Umana P. et al., Nature Biotechnol.
17:176-180, 1999). Este estudio fue el primero que
demostró que podían obtenerse grandes incrementos de la actividad
de ADCC mediante la manipulación de las células productoras de
anticuerpos para que expresasen GnTIII, que también condujo a un
incremento de la proporción de oligosacáridos biantenarios
asociados a región constante (Fc), incluyendo oligosacáridos no
fucosilados biantenarios, por encima de los niveles presentes en
los anticuerpos naturales.
Sigue existiendo una necesidad de enfoques
terapéuticos mejorados centrados en el antígeno CD20 y destinados
al tratamiento de los linfomas de células B en primates, incluyendo,
aunque sin limitación, el ser humano.
Reconociendo el enorme potencial terapéutico de
las moléculas de unión a antígeno (ABMs) que presentan la
especificidad de unión del anticuerpo B-Ly1 murino y
que han sido glucomanipuladas para incrementar la afinidad de unión
a receptores Fc y la función efectora, los presentes inventores
desarrollaron un método para producir dichas ABMs. Este método
implica, inter alia, producir anticuerpos quiméricos
recombinantes o fragmentos quiméricos de los mismos. La eficacia de
estas ABMs se potencia adicionalmente mediante la manipulación del
perfil de glucosilación de la región Fc del anticuerpo.
Se da a conocer un polinucleótido aislado que
comprende: (a) una secuencia seleccionada de entre el grupo que
consiste de: SEC ID nº 5, SEC ID nº 6 y SEC ID nº 7 (CDRs de
V_{H}-1), (b) una secuencia seleccionada de entre
el grupo que consiste de: SEC ID nº 21, SEC ID nº 22 y SEC ID nº 23
(CDRs de V_{H}-2), y SEC ID nº 24. También se da
a conocer un polinucleótido aislado que comprende las secuencias SEC
ID nº 8, SEC ID nº 9 y SEC ID nº 10 (CDRs de V_{L}). En una
realización, cualquiera de dichos polinucleótidos codifica un
polipéptido de fusión.
Se dan a conocer además un polinucleótido
aislado que comprende la secuencia SEC ID nº 3, un polinucleótido
aislado que comprende la secuencia SEC ID nº 4 o un polinucleótido
aislado que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo
que consiste de las secuencias SEC ID nº 29, SEC ID nº 31, SEC ID nº
33, SEC ID nº 35, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID
nº 43, SEC ID nº 45, SEC ID nº 47, SEC ID nº 49, SEC ID nº 51, SEC
ID nº 53, SEC ID nº 55, SEC ID nº 57, SEC ID nº 59, SEC ID nº 61,
SEC ID nº 63, SEC ID nº 65, SEC ID nº 67, SEC ID nº 69 y SEC ID nº
71. También se da a conocer un polinucleótido aislado que comprende
la secuencia SEC ID nº 75. En una realización, dichos
polinucleótidos codifican polipéptidos de fusión.
Se describe un polinucleótido aislado que
comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos
80% con la secuencia SEC ID nº 3, en el que el polinucleótido
aislado codifica un polipéptido fusionado. En un aspecto adicional,
se especifica un polinucleótido aislado que comprende una secuencia
que presenta una identidad de por lo menos 80% con la secuencia SEC
ID nº 4, en el que dicho polinucleótido aislado codifica un
polipéptido de fusión. Se proporciona un polinucleótido aislado que
comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos
80% con una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de
las secuencias SEC ID nº 29, SEC ID nº 31, SEC ID nº 33, SEC ID nº
35, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC ID
nº 45, SEC ID nº 47, SEC ID nº 49, SEC ID nº 51, SEC ID nº 53, SEC
ID nº 55, SEC ID nº 57, SEC ID nº 59, SEC ID nº 61, SEC ID nº 63,
SEC ID nº 65, SEC ID nº 67, SEC ID nº 69 y SEC ID nº 71, en el que
dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. En
un aspecto adicional, se menciona un polinucleótido aislado que
comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos
80% con la secuencia SEC ID nº 75, en el que dicho polinucleótido
aislado codifica un polipéptido de fusión.
Se da a conocer un polinucleótido que comprende
la secuencia SEC ID nº 11 (cadena pesada completa) o polinucleótidos
que presentan una identidad de 80%, 85%, 90%, 95% o 99% con la
secuencia SEC ID nº 11, así como un polinucleótido que comprende la
secuencia SEC ID nº 12 (cadena ligera completa), o polinucleótidos
que presentan una identidad de 80%, 85%, 90%, 95% o 99% con la
secuencia SEC ID nº 12.
Se da a conocer un polinucleótido aislado
codificante de un polipéptido quimérico que presenta la secuencia
SEC ID nº 1. En una realización el polinucleótido comprende una
secuencia codificante de un polipéptido que presenta la secuencia
SEC ID nº 1 y una secuencia codificante de un polipéptido que
presenta la secuencia de una región Fc de anticuerpo, o un
fragmento del mismo, procedente de una especie que no es el ratón.
Se describe un polinucleótido aislado codificante de un polipéptido
quimérico que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo
que consiste de las secuencias SEC ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC ID nº
34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC ID nº 42, SEC ID
nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50, SEC ID nº 52, SEC
ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 60, SEC ID nº 62,
SEC ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC ID nº 68, SEC ID nº 70 y SEC ID nº
72. En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia
codificante de un polipéptido que presenta una secuencia
seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC
ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38,
SEC ID nº 40, SEC ID nº 42, SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº
48, SEC ID nº 50, SEC ID nº 52, SEC ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID
nº 58, SEC ID nº 60, SEC ID nº 62, SEC ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC
ID nº 68, SEC ID nº 70 y SEC ID nº 72, y una secuencia codificante
de un polipéptido que presenta la secuencia de una región Fc de
anticuerpo, o un fragmento de la misma, procedente de una especie
que no es el ratón.
En todavía otro aspecto, se da a conocer un
polinucleótido aislado codificante de un polipéptido quimérico que
presenta la secuencia SEC ID nº 2. En una realización, el
polinucleótido comprende una secuencia codificante de un
polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 2, y una secuencia
codificante de un polipéptido que presenta la secuencia de una
región Fc de anticuerpo, o un fragmento de la misma, procedente de
una especie que no es el ratón. En todavía otro aspecto, se
describe un polinucleótido aislado codificante de un polipéptido
quimérico que presenta la secuencia SEC ID nº 76. En una
realización, el polinucleótido comprende una secuencia codificante
de un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 76, y una
secuencia codificante de un polipéptido que presenta la secuencia
de una región Fc de anticuerpo, o un fragmento de la misma,
procedente de una especie que no es el ratón.
Se menciona un polinucleótido aislado que
comprende una secuencia codificante de un polipéptido que presenta
la región V_{H} del anticuerpo B-Ly1 murino, o
variantes funcionales del mismo, y una secuencia codificante de un
polipéptido que presenta la región V_{H} del anticuerpo
B-Ly1 murino, o variantes funcionales del mismo, y
una secuencia codificante de un polipéptido que presenta la
secuencia de una región Fc de anticuerpo, o un fragmento de la
misma, procedente de una especie que no es el ratón. En otro
aspecto, se especifica un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia codificante de un polipéptido que presenta la región
V_{L} del anticuerpo B-Ly1 murino, o variantes
funcionales del mismo, y una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta la secuencia de una región Fc de anticuerpo, o un
fragmento de la misma, procedente de una especie que no es el
ratón.
La invención se refiere asimismo a un vector de
expresión que comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados
indicados anteriormente, y a una célula huésped según las
reivindicaciones 12 a 17 que comprende dicho vector de expresión.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a una célula
huésped según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17.
Se da a conocer un polipéptido aislado que
comprende: (a) una secuencia seleccionada de entre un grupo que
consiste de las secuencias SEC ID nº 15, SEC ID nº 16 y SEC ID nº 17
(CDRs de V_{H}-1), (b) una secuencia seleccionada
de entre un grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 25, SEC
ID nº 26 y SEC ID nº 27 (CDRs de V_{H}-2) y la
secuencia SEC ID nº 28, en el que dicho polipéptido es un
polipéptido de fusión. En otro aspecto, se especifica un
polipéptido aislado que comprende las secuencias SEC ID nº 18, SEC
ID nº 19 y SEC ID nº 20 (CDRs de V_{L}), en las que dicho
polipéptido es un polipéptido de fusión.
Se da a conocer un polipéptido quimérico que
comprende la secuencia SEC ID nº 1 o una variante de la misma y un
polipéptido quimérico que comprende la secuencia SEC ID nº 2 o una
variante de la misma. En una realización, cualquiera de dichos
polipéptidos comprende además una región Fc humana. Se describe un
polipéptido quimérico que comprende una secuencia seleccionada de
entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 30, SEC ID
nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC
ID nº 42, SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50,
SEC ID nº 52, SEC ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº
60, SEC ID nº 62, SEC ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC ID nº 68, SEC ID
nº 70 y SEC ID nº 72, o una variante de las mismas, y un
polipéptido quimérico que comprende la secuencia SEC ID nº 76 o una
variante de la misma. En una realización, cualquiera de dichos
polipéptidos comprende además una región Fc humana.
Se da a conocer un polipéptido que comprende una
secuencia derivada del anticuerpo B-Ly1 murino y una
secuencia derivada de un polipéptido heterólogo y a una molécula de
unión a antígeno que comprende dicho polipéptido. La molécula de
unión a antígeno es un anticuerpo. El anticuerpo se encuentra
humanizado.
Se especifica un polipéptido aislado que
comprende la secuencia SEC ID nº 13 o una variante de la misma y un
polipéptido aislado que comprende la secuencia SEC ID nº 14.
Se da a conocer una ABM, que es capaz de
competir con el anticuerpo B-Ly1 murino para la
unión a CD20 y que es quimérica. En una realización, la ABM es un
anticuerpo o un fragmento del mismo. En una realización adicional,
la ABM es un anticuerpo recombinante que comprende una región
V_{H} que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de
entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 1, SEC ID nº
30, SEC ID nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID
nº 40, SEC ID nº 42, SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC
ID nº 50, SEC ID nº 52, SEC ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58,
SEC ID nº 60, SEC ID nº 62, SEC ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC ID nº
68, SEC ID nº 70 y SEC ID nº 72. En otra realización, la ABM es un
anticuerpo recombinante que comprende una región V_{L} que
presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el
grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 2 y SEC ID nº 76. La
ABM es un anticuerpo recombinante que se encuentra humanizado. En
otra realización, la ABM es un anticuerpo recombinante que comprende
una región Fc humana. En una realización adicional, puede
conjugarse cualquiera de las ABMs comentadas anteriormente con un
grupo tal como una toxina o un marcaje radioactivo.
La invención se refiere asimismo a una ABM de la
presente invención, presentando dicha ABM oligosacáridos
modificados. En una realización, los oligosacáridos modificados
presentan una fucosilación reducida en comparación con los
oligosacáridos no modificados. En otras realizaciones, los
oligosacáridos modificados son híbridos o complejos. En una
realización adicional, la ABM presenta una proporción incrementada
de oligosacáridos no fucosilados o de oligosacáridos no fucosilados
biantenarios en la región Fc de dicha molécula. En una realización,
los oligosacáridos no fucosilados biantenarios son híbridos. En una
realización adicional, los oligosacáridos no fucosilados
biantenarios son complejos. En una realización, por lo menos 20% de
los oligosacáridos en la región Fc de dicho polipéptido son no
fucosilados o biantenarios. En realizaciones más preferentes, por lo
menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75% o más de
los oligosacáridos son no fucosilados o no fucosilados
biantenarios.
Se da a conocer un polinucleótido codificante de
cualquiera de las ABMs comentadas anteriormente, y vectores de
expresión y células que comprenden dicha polinucleótido.
Se da a conocer un método para producir una ABM,
que es capaz de competir con el anticuerpo B-Ly1
murino para la unión a CD20 y en el que dicha ABM es quimérica,
comprendiendo dicho método: (a) cultivar una célula huésped que
comprende un polinucleótido que codifica una ABM de la presente
invención en un medio bajo condiciones que permitan la expresión de
dicho polinucleótido codificante de dicha ABM, y (b) recuperar dicha
AMB del cultivo resultante.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
composición farmacéutica según la reivindicación 18, que comprende
la ABM de la invención. Se encuentra contemplado que la composición
farmacéutica pueda comprender además un portador farmacéuticamente
aceptable, un adyuvante o una combinación del os mismos.
En un aspecto adicional, la invención puede
utilizarse en un método para tratar una enfermedad tratable mediante
la reducción marcada de las células B. El método comprende
administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de las ABMs de la
presente invención en un sujeto humano que lo necesita. En una
realización preferente, la enfermedad se trata mediante la
administración de una ABM que es un anticuerpo quimérico o un
fragmento quimérico de un anticuerpo.
Se da a conocer una célula huésped manipulada
para que exprese por lo menos un ácido nucleico codificante de un
polipéptido que presenta actividad de GnTIII en una cantidad
suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fc de los
anticuerpos producidos por la célula huésped, en la que las ABMs son
capaces de competir con el anticuerpo B-Ly1 murino
para la unión a CD20 y en la que las ABMs son quiméricas. En una
realización, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un
polipéptido de fusión. En otra realización, la ABM producida por la
célula huésped es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En una
realización adicional, la ABM comprende una región equivalente a la
región Fc de una IgG humana.
Se describe un polinucleótido aislado que
comprende por lo menos una región determinante de complementariedad
del anticuerpo B-Ly1 murino, o una variante o forma
truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos
determinantes de especificidad para dicha región determinante de
complementariedad, en el que dicho polinucleótido aislado codifica
un polipéptido de fusión. Preferentemente dichos polinucleótidos
aislados codifican un polipéptido de fusión que es una molécula de
unión a antígeno. En una realización el polinucleótido comprende
tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo
B-Ly1 murino, o variantes o formas truncadas del
mismo que contienen por lo menos los residuos determinantes de la
especificidad para cada una de dichas tres regiones determinantes
de complementariedad. En otra realización, el polinucleótido
codifica la región variable entera de la cadena ligera o pesada de
un anticuerpo quimérico (por ejemplo humanizado).
\newpage
Se da a conocer una molécula de unión a antígeno
que comprende por lo menos una región determinante de
complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o
una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos
los residuos determinantes de especificidad para dicha región
determinante de complementariedad, y que comprende una secuencia
derivada de un polipéptido heterólogo. En una realización, la
molécula de unión a antígeno comprende tres regiones determinantes
de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o
variantes o formas truncadas del mismo que contienen por lo menos
los residuos determinantes de especificidad para cada una de dichas
tres regiones determinantes de complementariedad. En otro aspecto,
la molécula de unión a antígeno comprende la región variable de una
cadena ligera o pesada de anticuerpo. En una realización
particularmente útil, la molécula de unión a antígeno es un
anticuerpo quimérico, por ejemplo humanizado. Dichas moléculas de
unión a antígeno pueden utilizarse en el tratamiento de
enfermedades, incluyendo los linfomas de células B.
La presente invención es el primer caso conocido
en el que se ha manipulado un anticuerpo anti-CD20
de tipo II para que presente funciones efectoras incrementadas,
tales como ADCC, conservando simultáneamente una potente capacidad
de apoptosis. Por consiguiente, la presente invención se refiere a
un anticuerpo anti-CD20 de tipo II manipulado que
presenta una ADCC incrementada como resultado de dicha manipulación
y sin pérdida de capacidad sustancial de inducir apoptosis. En una
realización, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II
han sido manipulados para presentar un patrón alterado de
glucosilación en la región Fc. En una realización particular, la
glucosilación alterada comprende un nivel incrementado de residuos
complejos biantenarios en la región Fc. En otra realización
particular, la glucosilación alterada comprende un número reducido
de residuos fucosa en la región Fc. En otra realización, los
anticuerpos anti-CD20 de tipo II han sido sometidos
a manipulación del polipéptido. La invención se refiere asimismo a
métodos de preparación de dichos anticuerpos de tipo II manipulados
y a métodos de utilización de dichos anticuerpos en el tratamiento
de diversos trastornos de las células B, incluyendo los linfomas de
células B.
La célula huésped de la presente invención puede
seleccionarse de entre el grupo que incluye, aunque sin limitación,
una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0,
una célula de mieloma YO, una célula de mieloma de ratón P3X63, una
célula PER, una célula PER.C6 o una célula de hibridoma. En una
realización, la célula huésped de la invención comprende además un
polinucleótido transfectado que comprende un polinucleótido
codificante de la región V_{L} del anticuerpo
B-Ly1 murino o variantes del mismo y una secuencia
codificante de una región equivalente a la región Fc de una
inmunoglobulina humana. En otra realización, la célula huésped de
la invención comprende además un polinucleótido transfectado que
comprende un polinucleótido codificante de la región V_{H} del
anticuerpo B-Ly1 murino o variantes del mismo y una
secuencia codificante de una región equivalente a la región Fc de
una inmunoglobulina humana.
En un aspecto adicional, la invención se refiere
a una célula huésped que produce una ABM que muestra una afinidad
de unión a receptores Fc incrementada y/o una función efectora
incrementada como resultado de la modificación de sus
oligosacáridos. En una realización, la afinidad de unión
incrementada es a un receptor Fc, particularmente al receptor
Fc\gammaRIIIA. La función efectora contemplada en la presente
invención puede seleccionarse de entre el grupo que incluye, aunque
sin limitación, citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada,
unión incrementada a células NK, unión incrementada a macrófagos,
unión incrementada a células polimorfonucleares, unión incrementada
a monocitos, señalización directa incrementada inductora de
apoptosis, maduración de células dendríticas incrementada y cebado
incrementado de las células T.
En una realización adicional, la célula huésped
de la presente invención comprende por lo menos un ácido nucleico
codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII que
se encuentra operablemente ligado a un elemento promotor
constitutivo.
En otro aspecto, se da a conocer un método para
producir una ABM en una célula huésped, que comprende: (a) cultivar
una célula huésped manipulada para expresar por lo menos un
polinucleótido codificante de un polipéptido de fusión que presente
actividad de GnTIII bajo condiciones que permitan la producción de
dicha ABM y que permitan la modificación de los oligosacáridos
presentes en la región Fc de dicha ABM, y (b) aislar dicha ABM, en
donde dicha ABM es capaz d competir con el anticuerpo
B-Ly1 murino para la unión a CD20, y en donde dicha
ABM es quimérica. En una realización, el polipéptido que presenta
actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión, que
preferentemente comprende el dominio catalítico de GnTIII y el
dominio de localización en el Golgi de un polipéptido residente en
el Golgi heterólogo seleccionado de entre el grupo que consiste del
dominio de localización de la manosidasa II, el dominio de
localización de
\beta(1,2)-N-acetiglucosaminiltransferasa
I ("GnTI"), el dominio de localización de manosidasa I, el
dominio de localización de
\beta(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa
II ("GnTII") y el dominio de localización de
\alpha1-6-fucosiltransferasa
nuclear. Preferentemente, el dominio de localización en el Golgi es
de la manosidasa II o de GnTI.
En un aspecto adicional, la invención se refiere
a un método para modificar el perfil de glucosilación de una ABM
anti-CD20 producida por una célula huésped, que
comprende introducir en la célula huésped por lo menos un ácido
nucleico o vector de expresión de la invención. En una realización,
la ABM es un anticuerpo o un fragmento del mismo, comprendiendo
preferentemente la región Fc de una IgG. Alternativamente, el
polipéptido es una proteína de fusión que incluye una región
equivalente a una región Fc de una IgG humana.
En un aspecto, la invención se refiere a un
anticuerpo quimérico recombinante, o a un fragmento del mismo,
capaz de competir con el anticuerpo B-Ly1 murino
para la unión a CD20 y que presenta una fucosilación reducida.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método para modificar la glucosilación del anticuerpo
recombinante o de un fragmento del mismo de la invención mediante la
utilización de un polipéptido de fusión que presenta actividad de
GnTIII y que comprende el dominio de localización de Golgi de un
polipéptido residente en el Golgi heterólogo. En una realización,
los polipéptidos de fusión de la invención comprenden el dominio
catalítico de GnTIII. En otra realización, el dominio de
localización en el Golgi se selecciona de entre el grupo que
consiste del dominio de localización de la manosidasa II, el dominio
de localización de GnTI, el dominio de localización de la
manosidasa I, el dominio de localización de GnTII y el dominio de
localización en el Golgi es de la manosidasa II o de GnTI.
En una realización, el método de la invención se
refiere a producir un anticuerpo quimérico recombinante, o un
fragmento del mismo, con oligosacáridos modificados, en el que
dichos oligosacáridos modificados presentan una fucosilación
reducida en comparación con los oligosacáridos no modificados. Según
la presente invención, estos oligosacáridos modificados pueden ser
híbridos o complejos. En otra realización, el método de la invención
se refiere a la producción de un anticuerpo quimérico recombinante
o un fragmento del mismo que presenta una proporción incrementada
de oligosacáridos no fucosilados biantenarios en la región Fc de
dicho polipéptido. En una realización, los oligosacáridos no
fucosilados biantenarios son híbridos. En otra realización, los
oligosacáridos no fucosilados biantenarios son complejos. En una
realización adicional, el método de la invención se refiere a
producir un anticuerpo quimérico recombinante o un fragmento del
mismo en el que por lo menos 20% de los oligosacáridos de la región
Fc de dicho polipéptido son no fucosilados biantenarios. En otra
realización preferente, por lo menos 35% de los oligosacáridos en
la región Fc de dicho polipéptido son no fucosilados
biantenarios.
En un aspecto adicional, la invención se refiere
a un anticuerpo quimérico recombinante o a un fragmento del mismo,
que muestra una afinidad de unión de receptor Fc incrementada y/o
una función efectora incrementada como resultado de la modificación
de sus oligosacáridos. En una realización, la afinidad de unión
incrementada es a un receptor activador de Fc. En una realización
adicional, el receptor Fc es un receptor activador Fc\gamma,
particularmente el receptor Fc\gammaRIII. La función efectora
contemplada en la presente invención puede seleccionarse de entre
el grupo que incluyen, aunque sin limitación, citotoxicidad celular
mediada por Fc incrementada, un nivel incrementado de unión a
células NK, un nivel incrementado de unión a macrófagos, un nivel
incrementado de unión a células polimorfonucleares, un nivel
incrementado de unión a monocitos, la señalización directa
inductora de apoptosis incrementada, la maduración incrementada de
las células dendríticas y un nivel incrementado de cebado de las
células T.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
fragmento de anticuerpo quimérico recombinante que presenta la
especificidad de unión del anticuerpo B-Ly1 murino y
que contiene la región Fc, que ha sido manipulado para presentar
una función efectora incrementada producido mediante cualquiera de
los métodos de la presente invención.
En otro aspecto, se da a conocer una proteína de
fusión que incluye un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID
nº 1 y una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina
y manipulada para presentar una función efectora incrementada
producida mediante cualquiera de los métodos de la presente
invención.
En otro aspecto, se describe una proteína de
fusión que incluye un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID
nº 2 y una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina
y manipulada para que presenta una función efectora incrementada
producida mediante cualquiera de los métodos de la presente
invención.
En un aspecto, la presente invención se refiere
a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo
quimérico recombinante, producido mediante cualquiera de los métodos
de la presente invención, y un portador farmacéuticamente
aceptable. En otro aspecto, la presente invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende un fragmento de anticuerpo
quimérico recombinante producido mediante cualquiera de los métodos
de la presente invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición
farmacéutica que comprende una proteína de fusión producida mediante
cualquiera de los métodos de la presente invención, y un portador
farmacéuticamente aceptable.
La invención puede utilizarse en un método de
tratamiento de una enfermedad tratable mediante la reducción
marcada de las células B, que comprende administrar una cantidad
terapéuticamente eficaz del anticuerpo quimérico recombinante o de
un fragmento del mismo, producido mediante cualquiera de los métodos
de la presente invención, en un sujeto humano que lo necesita.
Fig. 1. Secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 2) y
de aminoácidos (SEC ID nº 1) de la región V_{H} de
B-Ly1 murino.
Fig. 2. Secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 4) y
de aminoácidos (SEC ID nº 3) de la región V_{L} de
B-Ly1 murino.
Fig. 3. Unión de Rituximab® y de
ch-B_Ly1 (\Delta) a CD20 sobre células B de
linfoma de Raji.
Fig. 4. Reducción marcada de las células B por
Rituximab® (O) y ch-B_Lyl (\Delta) en sangre
completa de tres clases diferentes de genotipo
Fc\gammaRIIIa-158V/F: (A) sangre completa de un
donante F/F, homocigótico para el receptor de menor afinidad, (B)
sangre completa de un donante F/V, heterocigótico para el receptor
de afinidad, y (C) sangre completa de un donante V/V, homocigótico
para el receptor de afinidad más alta.
Fig. 5. Secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 11)
y de aminoácidos (SEC ID nº 13) de la cadena pesada de un anticuerpo
anti-CD20 quimérico.
Fig. 6. Secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 12)
y de aminoácidos (SEC ID nº 14) de la cadena ligera de un anticuerpo
anti-CD20 quimérico.
Fig. 7. Secuencias de nucleótidos y de
aminoácidos de las CDRs del anticuerpo B-Ly1 murino.
(A) CDRs predichas para la región V_{H}. (B) CDRs predichas para
la región V_{L}.
Fig. 8. Perfil de MALDI-TOF de
un anticuerpo B-Ly1 quimérico glucomanipulado. (A)
Tabla que muestra los porcentajes de picos específicos, (B) espectro
de B-Ly1 quimérico glucomanipulado, (C) espectro de
B-Ly1 quimérico glucomanipulado tratado con
Endo-H.
Fig. 9. Unión de diferentes anticuerpos
anti-CD20 humanizados a células B Raji. Las
diferencias entre el constructo B-HH2 y los
constructos B-HL8 y B-HL11 se
localizan en las regiones de marco 1 y 2, siendo las tres CDRs
idénticas. B-HL8 y B-HL11 presentan
secuencias FR1 y FR2, derivadas de la clase VH3 humana, mientras que
el marco completo de B-HH2 se deriva de la clase
VH1 humana. B-HL11 es un derivado de
B-HL8 con la mutación única Glu1Gln, siendo Gln el
residuo aminoácido en el constructo B-HH2. Lo
anterior significa que el intercambio Glu-Gln no
altera la afinidad o la intensión de unión. Las otras diferencias
entre B-HH2 y B-HL8 son: 14 residuos
de FR, de entre los que uno o más influirá sobre el comportamiento
de unión de este anticuerpo con los antígenos.
Fig. 10. Unión del anticuerpo
anti-CD20 humanizado BHL4-KV a
células diana Raji. El constructo B-HL4 se derivada
del anticuerpo B-HH2 mediante la sustitución del FR1
de B-HH2 por el de la secuencia VH1_45 de la línea
germinal humana. Este constructo muestra una capacidad de unión a
antígeno muy reducida, a pesar de presentar aminoácidos diferentes
únicamente en tres posiciones en FR1. Estos residuos se encuentran
situados en las posiciones 2, 14 y 30 según la numeración de Kabat.
De estos, la posición 30 aparentemente es la posición con más
influencia, debido a que es parte de la definición de Chothia de la
CDR1.
Fig. 11. Comparación entre el comportamiento de
unión entre B-HH1, B-HH2,
B-HH3 y el anticuerpo parental
B-ly1. Los datos muestran que todos los Abs
muestran un valor de EC_{50} similar, aunque el constructo
B-HH1 se une con una intensidad/estequiometría
menos que las variantes B-HH2 y
B-HH3. B-HH1 puede distinguirse de
B-HH2 y de B-HH3 por sus regiones
CDR1 y CDR2 parcialmente humanas (definición de Kabat), así como el
polimorfismo Ala/Thr en la posición 28 (numeración de Kabat). Esto
indica que la posición 28, la CDR1 completa y/o la CDR2 completa
resultan importantes para la interacción anticuerpo/antígeno.
Fig. 12. La comparación de
B-HL1, B-HH1 y el anticuerpo
parental B-ly1. Los datos mostraron la ausencia de
cualquier actividad de unión en el constructo B-HL1,
y aproximadamente la mitad de la intensidad/estequiometría de unión
de B-HH1 en comparación con B-ly1.
Tanto B-HL1 como B-HH1 se han
diseñado basándose en marcos aceptores derivados de la clase
V_{H}-1 humana. Entre otras diferencias, la
posición 71 (numeración de Kabat) del constructo
B-HL1 es una diferencia notable, que indica su
importancia putativa para la unión de antígeno.
Fig. 13. Análisis fluorocitométrico de la
capacidad del anticuerpo anti-CD20 de unión a su
antígeno. Los datos mostraron que los constructos
B-HL2 y B-HL3 no presentaban
actividad de unión a CD-20.
Fig. 14. Apoptosis de los anticuerpos
anti-CD20 en células Z-138 MCL.
Fig. 15. Apoptosis de los anticuerpos
anti-CD20. Detalles del ensayo: se sembraron
5x10^{5} células/pocillo en placas de 24 pocillos (5x10^{5}
células/ml) en medio de cultivo. Se añadieron a los pocillos 10 mg
del Ab respectivo, PBS como control negativo o camptotecina (CPT) 5
mM como control positivo. Las muestras se incubaron durante la
noche (16 horas), se tiñeron con AnnV-FITC y se
analizaron mediante FACS. El ensayo se realizó por triplicado. (*):
Se ha restado la señal de PBS solo (PBS solo proporcionó una señal
de 8% y 2%, AnnV^{+}, para las células PR-1 y
Z-138, respectivamente). Los anticuerpos utilizados
fueron: C2B8 (quimérico, no glucomanipulado),
BHH2-KV1 (humanizado, no glucomanipulado). Nota:
este ensayo no implica la adición de células efectoras adicionales,
únicamente dianas más anticuerpo o controles.
Fig. 16. Eliminación de células diana por parte
de anticuerpos anti-CD20 con células inmunológicas
efectoras. Detalles del ensayo: marcada reducción de las células B
en la incubación durante la noche de sangre completa normal, y
análisis para CD 19+/CD3+ mediante FACS. ADCC utilizando PBMCs como
efectores, 4 horas de incubación: proporción de efecto:diana de
25:1, eliminación de la diana medida mediante retención de calceína
respecto a la lisis con detergente (100%) y a la lisis sin Ab (0%).
Anticuerpos utilizados: C2B8 (quimérico, forma no glucomanipulada),
BHH2-KV1-wt (forma humanizada no
glucomanipulada de BHH2-KV1),
BHH2-KV1-GE (forma humanizada no
glucomanipulada de BHH2-KV1).
Fig. 17. Perfil de MALDI/TOF-MS
de Fc-oligosacáridos liberados con PNGasa F de
anticuerpo IgG1 B-ly1 anti-CD20
humano no modificado no glucomanipulado humanizado con
BHH2-KV1.
Fig. 18. Perfil de MALDI/TOF-MS
de Fc-oligosacáridos liberados con PNGasaF de
anticuerpo IgG1 B-ly1 anti-CD20
humano glucomanipulado humanizado con BHH2-KV1g1. La
glucomanipulación se realizó mediante coexpresión en células
huésped de genes de anticuerpo y del gen codificante de enzima con
actividad catalítica de
\beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa
III (Gnt-III).
Fig. 19. Perfil de MALDI/TOF-MS
de Fc-oligosacáridos liberados con PNGasaF de
anticuerpo IgG1 B-ly1 anti-CD20
humano glucomanipulado humanizado con BHH2-KV1g2. La
glucomanipulación se realizó mediante coexpresión en células
huésped de genes de anticuerpo y genes codificantes de enzima con
actividad catalítica de
\beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa
III (GnT-III) y codificante de enzima con actividad
catalítica de \alpha-manosidasa II del Golgi.
Fig. 20. Unión de anticuerpos no
glucomanipulados y glucomanipulados a receptor Fc\gammaRIIIa
expresado sobre la superficie de células CHO-CD16
recombinantes.
Fig. 21. Apoptosis de anticuerpos
anti-CD20 no manipulados con Fc y manipulados con Fc
sobre células Z-138 MCL. Detalles del ensayo: se
sembraron 5x10^{5} células/pocillo en placas de 24 pocillos
(5x10^{5} células/ml) en medio de cultivo. Se añadieron a los
pocillos 10 mg del Ab respectivo, PBS para el control negativo. Las
muestras se incubaron durante la noche (16 horas), se tiñeron con
AnnV-FITC y se analizaron mediante FACS. El ensayo
se realizó por triplicado. Abs utilizados: C2B8=rituximab (forma no
glucomanipulada quimérica, igual a la forma comercial),
BHH2-KV1 (forma no glucomanipulada humanizada, ver
la fig. 6 para el perfil de glucosilación),
BHH2-KV1g1 (forma glucomanipulada humanizada, ver la
figura 7 para el perfil de glucosilación),
BHH2-KV1g2 (forma glucomanipulada humanizada, ver
la fig. 8 para el perfil de glucosilación). Nota: este ensayo no
implica ninguna célula efectora adicional, únicamente dianas más
anticuerpo o controles. (*): se ha restado la señal de PBS
solo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los términos se utilizan en la presente memoria
tal como se utilizan generalmente en la técnica, a menos que se
definan de otra manera a continuación.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "anticuerpo" pretende incluir moléculas de anticuerpo
completo, incluyendo anticuerpos monoclonales, policlonales y
multiespecíficos (por ejemplo biespecíficos), así como fragmentos
de anticuerpo que presentan la región Fc y que conservan la
especificidad de unión, y proteínas de fusión que incluyen una
región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina y que
conservan la especificidad de unión. También se encuentran
comprendidos los anticuerpos humanizados, primatizados y
quiméricos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "región equivalente a la región Fc de una
inmunoglobulina" pretende incluir las variantes alélicas
naturales de la región Fc de una inmunoglobulina, así como las
variantes que presentan alteraciones que producen sustituciones,
adiciones o deleciones pero que no reducen sustancialmente la
capacidad de la inmunoglobulina de mediar en funciones efectoras
(tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos).
Por ejemplo, pueden delecionarse uno o más aminoácidos del extremo
N-terminal o C-terminal de la
región Fc de una inmunoglobulina sin pérdida sustancial de función
biológica. Dichas variantes pueden seleccionarse según reglas
generales conocidas de la técnica, de manera que presente un efecto
mínimo sobre la actividad (ver, por ejemplo, Bowie J.U. et
al., Science 247:1306-10, 1990).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "molécula de unión a antígeno" se refiere, en su
sentido más amplio, a una molécula que se une específicamente a un
determinante antigénico. Más específicamente, una "molécula de
unión a antígeno que se une a CD20" es una molécula que se une
específicamente a una fosfoproteína no glucosilada de superficie
celular de 35.000 daltons, denominada típicamente antígeno Bp35 de
diferenciación restringida de los linfocitos B humanos, denominado
comúnmente CD20. La expresión "se une específicamente" se
refiere a que la unión es selectiva para el antígeno y puede
diferenciarse de interacciones no deseadas o no específicas.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los
términos "fusión" y "quimérico", cuando se utilizan en
referencia a polipéptidos tales como ABMs, se refieren a
polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de
dos o más polipéptidos heterólogos, tales como partes de anticuerpos
de diferentes especies. Para las ABMs quiméricas, por ejemplo, los
componentes no ligantes de antígeno pueden derivarse de una amplia
diversidad de especies, incluyendo primates, tales como los
chimpancés y los seres humanos. La región constante de la ABM
quimérica más preferentemente es sustancialmente idéntica a la
región constante de un anticuerpo humano natural; la región
variable del anticuerpo quimérico más preferentemente es
sustancialmente idéntica a la de un anticuerpo
anti-CD20 recombinante que presenta la secuencia de
aminoácidos de la región variable B-Ly1 murina. Los
anticuerpos humanizados resultan ser una forma particularmente
preferente de anticuerpo de fusión o quimérico.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "polipéptido que presenta actividad de GnTIII" se
refiere a polipéptidos que son capaces de catalizar la adición de un
residuo N-acetilglucosamina (GlcNAc) en enlace
\beta-1-4 con el manósido
\beta-ligado del núcleo trimanosilo de los
oligosacáridos N-ligados. Lo anterior incluye los
polipéptidos de fusión que muestran una actividad enzimática
similar, aunque no necesariamente idéntica, a una actividad de
\beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa
III, también conocida como
\beta-1,4-manosilglucoproteína
4-beta-N-acetilgluocsaminil-transferasa
(EC 2.4.1.144), según el comité de nomenclatura de la International
Union of Biochemistry and Molecular Biology
(NC-IUBMB), según medición en un ensayo biológico
particular, con o sin dependencia de la dosis. En el caso en exista
dependencia de la dosis, no es necesario que sea idéntica a la de
GnTIII, sino sustancialmente similar a la dependencia de dosis para
una actividad dada en comparación con la de GnTIII (es decir, el
polipéptido candidato muestra una actividad mayor o no más de
aproximadamente 25 veces menos y, preferentemente, no más de
aproximadamente diez veces menos actividad, y más preferentemente,
no más de aproximadamente tres veces menos actividad que
GnTIII).
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "variante" (o "análogo") se refiere a un
polipéptido que difiere de un polipéptido específicamente indicado
de la invención por inserciones, deleciones y sustituciones de
aminoácidos, creadas utilizando, por ejemplo, técnicas de ADN
recombinante. Entre las variantes de las ABMs de la presente
invención se incluyen moléculas ligantes de antígeno quiméricas,
primatizadas o humanizadas en las que uno o varios de los residuos
aminoácidos se modifican mediante sustitución, adición y/o deleción
de manera que no afecten sustancialmente a la afinidad de unión a
antígeno (por ejemplo a CD20). Pueden encontrarse una orientación
para determinar qué residuos aminoácidos pueden sustituirse,
añadirse o delecionarse sin eliminar actividades de interés,
comparando la secuencia del polipéptido particular con la de
péptidos homólogos y minimizando el número de cambios de la
secuencia de aminoácidos realizados en regiones de elevada homología
(regiones conservadas) o sustituyendo aminoácidos por una secuencia
de consenso.
Alternativamente, pueden sintetizarse variantes
recombinantes codificantes dichos polipéptidos o polipéptidos
similares o seleccionarse utilizando la "redundancia" del
código genético. Pueden introducirse diversas sustituciones de
codones, tales como cambios silenciosos que producen diversos sitios
de restricción, para optimizar la clonación en un plásmido o vector
vírico o la expresión en un sistema procariótico o eucariótico
particular. Las mutaciones en la secuencia polinucleótida pueden
reflejarse en el polipéptido o en dominios de otros péptidos
añadidos al polipéptido para modificar las propiedades de cualquier
parte del polipéptido, para cambiar características tales como las
afinidades de unión a ligando, las afinidades entre cadenas o la
tasas de degradación/renovación.
Preferentemente, las "sustituciones" de
aminoácidos son el resultado de sustituir un aminoácido por otro
aminoácido que presenta propiedades estructurales y/o químicas
similares, es decir, sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Pueden realizarse sustituciones "conservadoras" de aminoácidos
basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad,
hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los
residuos implicados. Por ejemplo, entre los aminoácidos no polares
(hidrofóbicos) se incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina,
prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; entre los
aminoácidos neutros polares se incluyen glicina, serina, treonina,
cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; entre los aminoácidos
cargados positivamente (básicos) se incluyen arginina, lisina e
histidina, y entre los aminoácidos cargados negativamente (ácidos)
se incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico. Las
"inserciones" o "deleciones" preferentemente son de entre
aproximadamente 1 y 20 aminoácidos, preferentemente de entre 1 y 10
aminoácidos. La variación permitida puede determinarse
experimentalmente mediante la realización sistemática de
inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en una
molécula de polipéptido utilizando técnicas de ADN recombinante y
sometiendo a ensayo las variantes recombinantes resultantes para la
actividad.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "humanizado" se utiliza para referirse a una molécula
de unión a antígeno derivada de una molécula de unión a antígeno no
humana, por ejemplo un anticuerpo murino, que conserva o que
conserva sustancialmente las propiedades de unión a antígeno de la
molécula parental pero que es menos inmunogénica en el ser humano.
Esto puede conseguirse mediante diversos métodos, incluyendo: (a)
la injertación de los dominios variables no humanos enteros en
regiones constantes humanas para generar anticuerpos quiméricos,
(b) injertar únicamente las CDRs no humanas en las regiones de marco
y constantes humanas con o sin conservación de los residuos de
marco críticos (por ejemplo aquellos que resultan importantes para
conservan una buena afinidad de unión de antígeno o funciones de
anticuerpo), o (c) trasplantar los dominios variables no humanos
enteros aunque "cubriéndolos" con una sección de tipo humano
mediante sustitución de los residuos superficiales. Dichos métodos
se dan a conocer en Jones et al., Morrison et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855, 1984; Morrison
y Oi, Adv. Immunol. 44:65-92, 1988; Verhoeyen et
al., Science 239:1534-1536, 1988; Padlan,
Molec. Immun. 28:489-498, 1991; Padlan, Molec.
Immun. 31(3):169-217, 1994. Existen
generalmente 3 regiones determinantes de complementariedad, o CDRs
(CDR1, CDR2 y CDR3) en cada uno de los dominios variables de cadena
pesada y de cadena ligera de un anticuerpo, que se encuentran
flanqueados por cuatro subregiones de marco (es decir, FR1, FR2,
FR3 y FR4) en cada uno de los dominios variables de cadena pesada y
de cadena ligera de un anticuerpo:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
Puede encontrarse un comentario de anticuerpos humanizados en,
inter alia, la patente US nº 6.632.927 y publicado en la
solicitud de patente US nº 2003/0175269.
De manera similar, tal como se utiliza en la
presente memoria, el término "primatizado" se utiliza para
referirse a una molécula de unión a antígeno derivada de una
molécula de unión a antígeno no de primate, por ejemplo un
anticuerpo murino, que conserva o que conserva sustancialmente las
propiedades de unión a antígeno de la molécula parental pero que es
menos inmunogénica en primates.
En el caso de que existan dos o más definiciones
de un término que se utilice y/o se encuentre aceptado en la
técnica, la definición del término tal como se utiliza en la
presente memoria pretende incluir todos dichos significados, a
menos que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo
específico es la utilización de la expresión "región determinante
de complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de
unión a antígeno no contiguos presentes dentro de la región
variable de los polipéptidos tanto de cadena pesada como de cadena
ligera. Esta región particular ha sido descrita por Kabat et
al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of
Proteins of Immunological Interest", 1983, y por Chothia et
al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987, en donde
las definiciones incluyen residuos aminoácidos solapantes o
subconjuntos de los mismos en la comparación entre ellos. Sin
embargo, la aplicación de cualquiera de las definiciones para
referirse a una CDR de un anticuerpo o a variantes de la misma
pretende encontrarse comprendido dentro del alcance de la expresión
tal como se define y se utiliza en la presente memoria. Los residuos
aminoácidos apropiados comprendidos por las CDRs tal como se
definen en cada una de la referencias anteriormente citadas se
proporcionan a continuación en la Tabla I a título comparativo. Los
números de residuo exactos comprendidos en una CDR particular
variarán dependiendo de la secuencia y del tamaño de la CDR. El
experto en la materia podrá determinar rutinariamente qué residuos
se encuentran comprendidos en una CDR particular dada la secuencia
de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.
Kabat et al. también definieron un
sistema de numeración para las secuencias de dominio variable que
resulta aplicable a cualquier anticuerpo. El experto ordinario en
la materia puede asignar inequívocamente este sistema de
"numeración Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable
sin basarse en ningún dato experimental más allá de la secuencia
misma. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión
"numeración Kabat" se refiere al sistema de numeración
proporcionado en Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human
Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest",
1983. A menos que se indique lo contrario, las referencias a la
numeración de posiciones específicas de residuo aminoácido en una
ABM se realizan según el sistema de numeración Kabat. Las
secuencias del listado de secuencias (es decir, SEC ID nº 1 a SEC ID
nº 78) no han sido numeradas según el sistema de numeración
Kabat.
La mención de un ácido nucleico o polinucleótido
que presenta una secuencia de nucleótidos por lo menos, por
ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de
referencia de la presente invención pretende hacerse referencia a
que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la
secuencia de referencia, excepto en que la secuencia polinucleótida
puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100
nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras
palabras, para obtener un polinucleótido que presente una secuencia
de nucleótidos por lo menos 95% idéntica a la secuencia de
nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la
secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse por otro
nucleótido, o un número de nucleótidos de hasta 5% del número total
de nucleótidos en la secuencia de referencia puede insertarse en la
secuencia de referencia. La secuencia pregunta puede ser la
secuencia entera mostrada en la fig. 24 o en la fig. 25.
En la práctica, puede determinarse
convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos si
cualquier molécula de ácidos nucleicos o polipéptido particular es
idéntica por lo menos al 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a
una secuencia de nucleótidos o a una secuencia polipeptídica de la
presente invención. Un método preferente para determinar la mejor
correspondencia global entre una secuencia pregunta (una secuencia
de la presente invención) y una secuencia de la base de datos
("secuencia sujeto"), también denominado alineación global de
secuencias, puede determinarse utilizando el programa informático
FASTDB, basado en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. App.
Biosci. 6:237-245, 1990. En una alineación de
secuencias, las secuencias pregunta y sujeto son secuencias de ADN.
Puede compararse una secuencia de ARN convirtiendo los Us en Ts. El
resultado de dicha alineación global de secuencias se proporciona en
forma de porcentaje de identidad. Los parámetros preferentes
utilizados en una alineación FASTDB de secuencias de ADN para
calcular el porcentaje de identidad son: Matriz=Unitaria,
k-tuplo=4, Penalización por desapareamiento=1,
Penalización por unión=30, Longitud de grupo de aleatorización=0,
Puntuación de corte=1, Penalización por hueco=5, Penalización según
tamaño del hueco=0,05, Tamaño de ventana=500 o la longitud de la
secuencia de nucleótidos sujeto, la que sea más corta.
En el caso de que la secuencia sujeto sea más
corta que la secuencia pregunta debido a deleciones 5' o 3', y no
debido a deleciones internas, debe realizarse una corrección manual
de los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no
considera los truncados 5' y 3' de la secuencia sujeto al calcular
el porcentaje de identidad. Para las secuencias sujeto truncadas en
los extremos 5' o 3', respecto a la secuencia pregunta, se corrige
el porcentaje de identidad mediante el cálculo del número de bases
de la secuencia pregunta que se encuentran situados 5' y 3'
respecto de la secuencia sujeto, que no se encuentran
apareados/alineados, como porcentaje del número total de bases de
la secuencia pregunta. Se determina si un nucleótido se encuentra
apareado/alineado a partir de los resultados de una alineación de
secuencias de FASTDB. A continuación, se resta este porcentaje del
porcentaje de identidad, calculado con el programa FASTDB anterior
utilizando los parámetros especificados, alcanzando una puntuación
de porcentaje de identidad final. Esta puntuación corregida es la
que se utiliza para los fines de la presente invención. Únicamente
las bases situadas fuera de las bases 5' y 3' respecto de la
secuencia sujeto, según muestra la alineación de FASTDB, que no se
encuentran apareadas/alineadas con la secuencia pregunta, son
calculadas para los fines de ajustar manualmente la puntuación de
porcentaje de identidad.
Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 bases se
alinea con una secuencia pregunta de 100 bases para determinar el
porcentaje de identidad. Las deleciones se producen en el extremo 5'
de la secuencia sujeto y, por lo tanto, la alineación FASTDB no
muestra un apareamiento/alineación de las primeras 10 bases en el
extremo 5'. Las 10 bases desapareadas representan 10% de la
secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' no
apareadas/número total de bases en la secuencia pregunta), de
manera que se resta 10% de la puntuación de porcentaje de identidad
calculada por el programa FASTDB. En el caso de que las 90 bases
restantes se encontrasen perfectamente apareadas, el porcentaje de
identidad final sería de 90%. En otro ejemplo, se compara una
secuencia sujeto de 90 bases con una secuencia pregunta de 100
bases. En esta ocasión las deleciones son deleciones internas, de
manera que no se encuentran bases en el lado 5' o 3' de la
secuencia sujeto que no estén apareadas/alineadas con la secuencia
pregunta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por
FASTDB no se corrige manualmente. Nuevamente, únicamente las bases
situadas en el lado 5' y 3' de la secuencia sujeto que no están
apareadas/alineadas con la secuencia pregunta son corregidas
manualmente. No se realizan otras correcciones manuales para los
fines de la presente invención.
La mención de un polipéptido que presenta una
secuencia de aminoácidos que es por lo menos, por ejemplo, 95%
"idéntica" a una secuencia pregunta de aminoácidos de la
presente invención se refiere a que dicha secuencia de aminoácidos
del polipéptido sujeto es idéntica a la secuencia pregunta excepto
en que la secuencia polipeptídica sujeto puede incluir hasta cinco
alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia
pregunta de aminoácidos. En otras palabras, para obtener un
polipéptido que presente una secuencia de aminoácidos por lo menos
95% idéntica a una secuencia pregunta de aminoácidos, deben
insertarse, delecionarse o sustituirse por otro aminoácido hasta 5%
de los residuos aminoácidos en la secuencia sujeto. Estas
alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las
posiciones aminoterminales o carboxiterminales de la secuencia de
aminoácidos de referencia o en cualquier posición entre aquellas
posiciones terminales, intercalados individualmente entre residuos
en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro
de la secuencia de referencia.
En la práctica, si cualquier polipéptido
particular es idéntico al 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a
un polipéptido de referencia puede determinarse convencionalmente
utilizando programas informáticos conocidos. Un método preferente
para determinar la correspondencia global óptima entre una secuencia
pregunta (una secuencia de la presente invención) y una secuencia
sujeto, también denominado alineación global de secuencias, puede
determinarse utilizando el programa informático FASTDB, basado en el
algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci.
6:237-245, 1990. En una alineación de secuencias,
las secuencias pregunta y sujeto son ambas secuencias de
nucleótidos o ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicha
alineación global de secuencias se proporciona en forma de
porcentaje de identidad. Los parámetros preferentes utilizados en
una alineación FASTDB de aminoácidos son: Matrix=PAM 0,
k-tuplo=2, Penalización por desapareamiento=1,
Penalización por unión=20, Longitud de grupo de aleatorización=0,
Puntuación de corte=1, Tamaño de ventana=longitud de secuencia,
Penalización por hueco=5, Penalización según tamaño de hueco=0,05,
Tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia sujeto de
aminoácidos, la que sea más corta.
En el caso de que la secuencia sujeto sea más
corta que la secuencia pregunta debido a deleciones
N-terminales o C-terminales, no
debido a deleciones internas, debe realizarse una corrección manual
de los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no
considera los truncados N-terminales y
C-terminales de la secuencia sujeto al calcular el
porcentaje de identidad global. Para las secuencias sujeto truncadas
en los extremos N-terminal y
C-terminal, respecto a la secuencia pregunta, se
corrige el porcentaje de identidad calculando el número de residuos
de la secuencia pregunta que son N-terminales y
C-terminales respecto a la secuencia sujeto, que no
se encuentren apareadas/alineadas con un residuo correspondiente de
la secuencia sujeto, en forma de porcentaje del número total de
bases de la secuencia pregunta. Los resultados de alineación de
secuencias de FASTDB permiten determinar si un residuo se encuentra
apareado/alineado. A continuación, este porcentaje se resta del
porcentaje de identidad, calculado con el programa FASTDB
anteriormente indicado utilizando los parámetros especificados,
alcanzando una puntuación final de porcentaje de identidad. Esta
puntuación final de porcentaje de identidad es la que se utiliza
para los fines de la presente invención. Únicamente los residuos
N-terminales y C-terminales respecto
de la secuencia sujeto que no se encuentren apareados/alineados con
la secuencia pregunta se consideran para los fines de ajustar
manualmente la puntuación de porcentaje de identidad. Es decir,
únicamente las posiciones de residuos en la secuencia pregunta en el
exterior de los residuos N-terminales y
C-terminales más alejados de la secuencia
sujeto.
Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 residuos
aminoácidos se alinea con una secuencia pregunta de 100 residuos
para determinar el porcentaje de identidad. La deleción se ha
producido en el extremo N-terminal de la secuencia
sujeto y, por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra un
apareamiento/alineación de los primeros 10 residuos en el extremo
N-terminal. Los 10 residuos no apareados representan
10% de la secuencia (número de residuos en los extremos
N-terminales y C-terminales no apareados/número total de residuos en la secuencia pregunta), de manera que se resta 10% de la puntuación de porcentaje de identidad calculada con el programa FASTDB. Si los 90 residuos restantes se encontrarse perfectamente apareados, el porcentaje final de identidad sería de 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia sujeto de 90 residuos con una secuencia pregunta de 100 residuos. En esta ocasión las deleciones son deleciones internas, de manera que no existen residuos en los extremos N-terminal o C-terminal de la secuencia sujeto que no se encuentren apareados/alineados con la secuencia pregunta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Nuevamente, únicamente las posiciones de residuos situados en el exterior de los extremos N-terminal y C-terminal de la secuencia sujeto, según muestra la alineación de FASTDB, que no se encuentran apareados/alineados con la secuencia pregunta son corregidos manualmente. No resulta necesario realizar ninguna otra corrección manual para los fines de la presente invención.
N-terminales y C-terminales no apareados/número total de residuos en la secuencia pregunta), de manera que se resta 10% de la puntuación de porcentaje de identidad calculada con el programa FASTDB. Si los 90 residuos restantes se encontrarse perfectamente apareados, el porcentaje final de identidad sería de 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia sujeto de 90 residuos con una secuencia pregunta de 100 residuos. En esta ocasión las deleciones son deleciones internas, de manera que no existen residuos en los extremos N-terminal o C-terminal de la secuencia sujeto que no se encuentren apareados/alineados con la secuencia pregunta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Nuevamente, únicamente las posiciones de residuos situados en el exterior de los extremos N-terminal y C-terminal de la secuencia sujeto, según muestra la alineación de FASTDB, que no se encuentran apareados/alineados con la secuencia pregunta son corregidos manualmente. No resulta necesario realizar ninguna otra corrección manual para los fines de la presente invención.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un
ácido nucleico que "se hibrida bajo condiciones astringentes"
a una secuencia de ácidos nucleicos de la invención se refiere a un
polinucleótido que se hibrida en una incubación durante la noche a
42ºC en una solución que comprende formamida al 50%, 5x SSC (NaCl
750 mM, citrato sódico 75 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5x
solución de Denhardt, dextrán sulfato al 10% y 20 \mug/ml de ADN
de esperma de salmón sonicado desnaturalizado, seguido del lavado de
los filtros en 0,1x SSC a aproximadamente 65ºC.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "dominio de localización en el Golgi" se refiere a
la secuencia de aminoácidos de un polipéptido residente en el Golgi
que es responsable del anclaje del polipéptido en una localización
dentro del complejo de Golgi. Generalmente, los dominios de
localización comprenden "colas" aminoterminales de un
enzima.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "función efectora" se refiere a aquellas actividades
biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia
nativa o una región Fc de secuencia de aminoácidos variante) de un
anticuerpo. Entre los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo
se incluyen, aunque sin limitación, afinidad de unión a receptores
Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC),
fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de
citoquinas, incorporación de antígenos mediada por complejo
inmunológico por células presentadoras de antígeno, regulación
negativa de receptores de superficie celular, etc.
Tal como se utiliza en la presente memoria, las
expresiones "manipular", "manipulado", "manipulación"
y "manipulación mediante glucosilación" e considera que
incluyen cualquier manipulación del patrón de glucosilación de un
polipéptido o fragmento de polipéptido natural o recombinante. La
manipulación mediante glucosilación incluye la manipulación
metabólica de la maquinaria de glucosilación de una célula,
incluyendo manipulaciones genéticas de las rutas de síntesis de
oligosacáridos para conseguir la glucosilación alterada de
glucoproteínas expresadas en las células. Además, la manipulación
mediante glucosilación incluye los efectos de mutaciones y del
ambiente celular sobre la glucosilación.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "célula huésped" comprende cualquier tipo de sistema
celular que pueda manipularse para generar los polipéptidos y
moléculas de unión a antígeno de la presente invención. En una
realización, la célula huésped se manipula para producir la
producción de una molécula de unión a antígeno con glucoformas
modificadas. En una realización preferente, la molécula de unión a
antígeno es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de
fusión. En determinadas realizaciones, las células huésped han sido
manipuladas adicionalmente para expresar niveles incrementadas de
uno o más polipéptidos que presentan actividad GnTIII. Entre las
células huésped se incluyen células en cultivo, por ejemplo células
de mamífero en cultivo, tales como células CHO, células BHK, células
NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de
ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma,
células de levadura, células de insecto y células vegetales, entre
otros, aunque también células comprendidas dentro de un animal
transgénico, planta transgénica o tejido vegetal o animal en
cultivo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "citotoxicidad celular mediada por Fc" incluye la
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y la citotoxicidad
celular mediada por una proteína de fusión a Fc soluble que
contiene una región Fc humana: es un mecanismo inmunológico que
conduce a la lisis de "células reconocidas por anticuerpos"
por parte de "células efectoras inmunológicas humanas", en
donde:
las "células efectoras inmunológicas
humanas" son una población de leucocitos que muestran receptores
Fc sobre su superficie, a través de las que se unen a la región Fc
de los anticuerpos o de proteínas de fusión con Fc y llevan a cabo
funciones efectoras. Dicha población puede incluir, aunque sin
limitación, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y/o
células asesinas naturales (NK).
Las "células reconocidas por anticuerpos"
son células a las que se unen anticuerpos o proteínas de fusión con
Fc. Los anticuerpos o proteínas de fusión con Fc se unen a las
células diana mediante la parte de la proteína
N-terminal respecto a la región Fc.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada"
se define como un incremento del número de "células reconocidas
por anticuerpos" que resultan lisadas en un tiempo dado, a una
concentración dada de anticuerpo, o de proteínas de fusión con Fc,
en el medio circundante a las células diana, mediante el mecanismo
de citotoxicidad celular mediada por Fc definido anteriormente, y/o
una reducción de la concentración de anticuerpo o de proteína de
fusión con Fc, en el medio circundante a las células diana,
necesario para conseguir la lisis de un número dado de "células
reconocidas por anticuerpos", en un tiempo dado, mediante el
mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fc. El incremento de
la citotoxicidad celular mediada por Fc es respecto a la
citotoxicidad celular mediada por el mismo anticuerpo, o proteína
de fusión con Fc, producido por el mismo tipo de células huésped,
utilizando los mismos métodos estándares de producción,
purificación, formulación y almacenamiento, que son conocidos por el
experto en la materia, pero que no ha sido producido por células
huésped manipuladas para expresar la glucosiltransferasa GnTIII
mediante los métodos descritos en la presente memoria.
La expresión "anticuerpo que presentan
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)" se
refiere a un anticuerpo, tal como se define dicha expresión en la
presente memoria, que presenta una ADCC incrementada según se
determina mediante cualquier método adecuado conocido por el experto
ordinario en la materia. Un ensayo ADCC in vitro aceptado es
el siguiente:
1) el ensayo utiliza células diana que es
conocido que expresan el antígeno diana reconocido por la región
ligante de antígeno del anticuerpo,
2) el ensayo utiliza células mononucleares de
sangre periférica humana (PBMCs) aisladas de sangre de un donante
sano seleccionado aleatoriamente, como células efectoras,
3) el ensayo se lleva a cabo siguiendo el
protocolo siguiente:
i) las PBMCs se aíslan utilizando procedimientos
estándares de centrifugación en gradiente de densidades y se
suspenden a una densidad de 5 x 10^{6} células/ml en medio de
cultivo celular RPMI,
ii) las células diana se cultivan mediante
métodos de cultivo de tejido estándares, se recolectan de la fase
de crecimiento exponencial con una viabilidad superior a 90%, se
lavan en medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100
microCuries de ^{51}Cr, se lavan dos veces con medio de cultivo
celular y se resuspenden en medio de cultivo celular a una densidad
de 10^{5} células/ml,
iii) se transfieren 100 microlitros de la
suspensión de células diana final a cada pocillo de una placa de
microtitulación de 46 pocillos,
iv) el anticuerpo se diluye en serie de 4.000
ng/ml a 0,04 ng/ml en medio de cultivo celular y se añaden 50
microlitros de las soluciones de anticuerpo resultantes a las
células diana en la placa de microtitulación de 96 pocillos,
llevando a cabo ensayos por triplicado de concentraciones del
anticuerpo que cubren el intervalo completo de concentraciones
anteriormente indicado,
v) para los controles de liberación máxima (MR),
3 pocillos adicionales en la placa que contiene las células diana
marcadas reciben 50 microlitros de una solución acuosa al 2% (v/v)
de detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis) en lugar de la
solución de anticuerpo (punto iv), anteriormente),
vi) para los controles de liberación espontánea
(SR), 3 pocillos adicionales en la placa que contiene las células
diana marcadas reciben 50 microlitros de medio de cultivo celular
RPMI en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv),
anteriormente),
vii) a continuación, la placa de microtitulación
de 96 pocillos se centrifuga a 50 x g durante 1 minuto y se incuba
durante 1 hora a 4ºC,
viii) se añaden 50 microlitros de la suspensión
de PBMCs (punto i), anteriormente) a cada pocillo, dando lugar a
una proporción de efector:célula diana de 25:1 y las placas se
introducen en un incubador bajo una atmósfera con 5% de CO_{2} a
37ºC durante 4 horas,
ix) el sobrenadante libre de células de cada
pocillo se recolecta y la radioactividad liberada experimentalmente
(ER) se cuantifica utilizando un contador gamma,
x) se calcula el porcentaje de lisis específica
para cada concentración de anticuerpo según la fórmula
(ER-MR)/
(MR-SR) x 100, en la que ER es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para dicha concentración de anticuerpo, MR es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para los controles MR (ver el punto v), anteriormente), y SR es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para los controles SR (ver el punto vi), anteriormente).
(MR-SR) x 100, en la que ER es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para dicha concentración de anticuerpo, MR es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para los controles MR (ver el punto v), anteriormente), y SR es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para los controles SR (ver el punto vi), anteriormente).
4) la expresión "ADCC incrementada" se
define como un incremento del porcentaje máximo de lisis específica
observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo
sometido a ensayo anteriormente, y/o una reducción de la
concentración de anticuerpo necesaria para alcanzar la mitad del
porcentaje máximo de lisis específica observado dentro del
intervalo de concentraciones de anticuerpo sometidas a ensayo
anteriormente. El incremento de la ADCC es relativo a la ADCC, que
se ha medido utilizando el ensayo anteriormente indicado, mediada
por el mismo anticuerpo, producido por el mismo tipo de células
huésped, utilizando los mismos métodos estándares de producción,
purificación, formulación y almacenamiento conocidos por el experto
en la materia, pero que no ha sido producido por las células
huésped manipuladas para sobreexpresar GnTIII.
En un aspecto, la presente invención se refiere
a moléculas de unión a antígeno que presentan la especificidad de
unión del anticuerpo B-Ly1 murino, y al
descubrimiento de que sus funciones efectoras pueden potenciarse
mediante glucosilación alterada. En una realización, la molécula de
unión de antígeno es un anticuerpo quimérico. Una realización
preferente se refiere a un anticuerpo quimérico, o a un fragmento
del mismo, que comprende las CDRs mostradas en la figura 7.
Específicamente, en una realización preferente, la invención se
refiere a un polinucleótido aislado que comprende: (a) una
secuencia seleccionada de entre un grupo que consiste de las
secuencias SEC ID nº 5, SEC ID nº 6 y SEC ID nº 7 (CDRs de
V_{H}-1), y (b) una secuencia seleccionada de
entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 21, SEC ID
nº 22 y SEC ID nº 23 (CDRs de V_{H}-2) y de la
secuencia SEC ID nº 24. Otra realización preferente se refiere a un
polinucleótido aislado que comprende las secuencias SEC ID nº 8,
SEC ID nº 9 y SEC ID nº 10 (CDRs de V_{L}). En una realización,
cualquiera de estos polinucleótidos codifica un polipéptido de
fusión.
En otra realización, la molécula de unión a
antígeno comprende el dominio V_{H} del anticuerpo
B-Ly1 murino mostrado en la figura 1, o una
variante del mismo, y un polipéptido no murino. En otra realización
preferente, una molécula de unión a antígeno comprende el dominio
VL del anticuerpo B-Ly1 murino mostrado en la figura
2, o una variante del mismo, y un polipéptido no murino.
En otro aspecto, las moléculas de unión a
antígeno comprenden una o más CDRs truncadas de
Bly-1. Dichas CDRs truncadas contienen, como
mínimo, los residuos aminoácidos determinantes de especificidad para
la CDR dada. La expresión "residuo determinante de
especificidad" se refiere a aquello residuos que se encuentran
directamente implicados en la interacción con el antígeno. En
general, sólo aproximadamente un quinto a un tercio de los residuos
en una CDR dada participa en la unión a un antígeno. Los residuos
determinantes de especificidad en una CDR particular pueden
identificarse, por ejemplo, mediante computación de contactos
interatómicos obtenidos del modelado tridimensional y la
determinación de la variabilidad de secuencia en una posición de
residuo dada de acuerdo con los métodos descritos en Padlan et
al., FASEB J. 9(1):133-139, 1995.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, se da
a conocer un polinucleótido aislado que comprende por lo menos una
región determinante de complementariedad del anticuerpo
B-Ly1 murino, o una variante o forma truncada del
mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de
especificidad de dicha región determinante de complementariedad, en
donde dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de
fusión. Preferentemente, dichos polinucleótidos aislados codifican
un polipéptido de fusión que es una molécula de unión a antígeno.
En una realización, el polinucleótido comprende tres regiones
determinantes de complementariedad del anticuerpo
B-Ly1 murino, o variantes o formas truncadas del
mismo que contienen por lo menos residuos determinantes de
especificidad de cada una de dichas tres regiones determinantes de
complementariedad. En otra realización, el polinucleótido codifica
la región variable entera de la cadena ligera o pesada de un
anticuerpo quimérico (por ejemplo humanizado). La invención se
refiere además a los polipéptidos codificados por dichos
polinucleótidos.
En otra realización, una molécula de unión a
antígeno comprende por lo menos una región determinante de
complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o
una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos
los residuos determinantes de especificidad de dicha región
determinante de complementariedad, y que comprende una secuencia
derivada de un polipéptido heterólogo. En una realización, la
molécula de unión a antígeno comprende tres regiones determinantes
de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o
variantes o formas truncadas del mismo que contienen por lo menos
los residuos determinantes de especificidad de cada una de dichas
tres regiones determinantes de complementariedad. En otro aspecto,
la molécula de unión a antígeno comprende la región variable de una
cadena ligera o pesada de anticuerpo. En una realización
particularmente útil, la molécula de unión a antígeno es un
anticuerpo quimérico, por ejemplo humanizado. Se dan a conocer
métodos para preparar dichas moléculas de unión a antígeno, y la
utilización de las mismas en el tratamiento de enfermedades,
incluyendo los linfomas de células B.
Es conocido que están implicados varios
mecanismos en la eficacia terapéutica de los anticuerpos
anti-CD20, incluyendo la citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos (ADCC), la citotoxicidad dependiente del
complemento (CDC) y la inducción de la detención del crecimiento o
apoptosis. Por ejemplo, la mayor parte de la evidencia experimental
indica que el Rituximab funciona a través de mecanismos efectores
convencionales medidos mediante ensayos CDC y ADCC. De manera
similar, se ha demostrado que la resistencia de las diferentes
células de linfoma frente al Rituximab in vivo es una
función de su sensibilidad a la CDC in vitro. En contraste,
el modo de acción in vivo de otro anticuerpo que ha sido
autorizado para el uso terapéutico, B1, no requiere ni complemento
ni actividad de células asesinas naturales (NK). Por el contrario,
la eficacia de B1 in vivo se debe a su capacidad de inducir
una potente apoptosis.
En general, los anticuerpos monoclonales
anti-CD20 se clasifican en dos categorías diferentes
basándose en su mecanismo de acción en la erradicación de las
células de linfoma. Los anticuerpos anti-CD20 de
tipo I utilizan principalmente el complemento para eliminar las
células diana, mientras que los anticuerpos de TIPO II funcionan
mediante mecanismos diferentes, principalmente la apoptosis. El
Rituximab y 1F5 son ejemplos de anticuerpos
anti-CD20 de tipo I, mientras que B1 es un ejemplo
de un anticuerpo de tipo II. Ver, por ejemplo, Cragg M.S. y Glennie
M.J., Blood 103(7):2738-2743, abril de 2004;
Teeling J.L. et al., Blood
104(6):1793-1800, septiembre de 2004.
La presente invención es el primer caso conocido
en el que se ha manipulado un anticuerpo anti-CD20
de tipo II para que presenta una función efectora incrementada, tal
como ADCC, conservando simultáneamente una potente capacidad de
apoptosis. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un
anticuerpo anti-CD20 de tipo II manipulado que
presenta una ADCC incrementada como resultado de la manipulación, y
sin pérdida de capacidad sustancial de inducir apoptosis. En una
realización, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II
han sido manipulados para que presenten un patrón alterado de
glucosilación en la región Fc. En una realización particular, la
glucosilación alterada comprende un nivel incrementado de residuo de
complejo biantenario en la región F. En otra realización
particular, la glucosilación alterada comprende un número reducido
de residuos de fucosa en la región Fc. Ver la solicitud publicada
de patente US nº 2004/0093621 de Shitara et al. En otra
realización, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II
han sido sometidos a manipulación proteica, tal como enseña la
patente US nº 6.737.056 de Presta, o la solicitud publicada de
patente US nº 2004/0185045 (Macrogenics) o la solicitud publicada
de patente US nº 2004/0132101 (Xencor). Se dan a conocer métodos
para preparar dichos anticuerpos de tipo II manipulados y los
métodos de utilización de dichos anticuerpos en el tratamiento de
diversos trastornos de células B, incluyendo linfomas de células
B.
Los anticuerpos quiméricos de ratón/ser humano
han sido descritos. Ver, por ejemplo, Morrison S.L. et al.,
PNAS 1:6851-6854 (noviembre de 1984), publicación de
patente europea nº 173494; Boulianna G.L. et al., Nature
312:642 (diciembre de 1984); Neubeiger M.S. et al., Nature
314:268 (marzo de 1985); publicación de patente europea nº 125023;
Tan et al., J. Immunol. 135:8564 (noviembre de 1985); Sun
L.K. et al., Hybridoma 5(1):517, 1986; Sahagan et
al., J. Immunol. 137:1066-1074, 1986. Ver
generalmente Muron, Nature 312:597 (diciembre de 1984); Dickson,
Genetic Engineering News 5(3), marzo de 1985; Marx, Science
229:455 (agosto de 1985) y Morrison, Science
229:1202-1207 (septiembre de 1985). Robinson et
al., en la publicación de patente PCT WO nº 88104936 describe
un anticuerpo quimérico con una región constante humana y una región
variable murina, que presenta especificidad para un epítopo de
CD20; la parte murina del anticuerpo quimérico de las referencias
de Robinson se deriva del anticuerpo monoclonal de ratón 2H7 (gamma
2b, kappa). Aunque la referencia indica que el anticuerpo quimérico
descrito es un "candidato ideal" para el tratamiento de los
trastornos de las células B, esta afirmación puede considerarse
simplemente una sugerencia para que el experto en la materia
determine si dicha sugerencia es exacta para este anticuerpo
particular, particularmente debido a que la referencia carece de
ningún dato para apoyar una declaración de eficacia terapéutica.
También es importante el hecho de que no se proporcionan datos
referidos a mamíferos de orden más alto, tales como primates o
seres humanos.
Las metodologías para generar anticuerpos
quiméricos se encuentran disponibles para el experto en la materia.
Por ejemplo, las cadenas ligera y pesada pueden expresarse
separadamente utilizando, por ejemplo, cadenas ligeras de
inmunoglobulina y cadenas pesadas de inmunoglobulina en plásmidos
separados, o en un único vector (por ejemplo policistrónico). Éstas
pueden purificarse y ensamblarse in vitro para formar
anticuerpos completos; se han descrito metodologías para llevar a
cabo dicho ensamblaje. Ver, por ejemplo, Scharff M., Harvey
Lectures 69:125, 1974. Los parámetros de reacción in vitro
para la formación de anticuerpos IgG a partir de cadenas ligera y
pesada aisladas reducidas también han sido descritos. Ver, por
ejemplo, Sears et al., Biochem.
16(9):2016-25, 1977.
En una realización particularmente preferente,
la ABM quimérica de la presente invención es un anticuerpo
humanizado. Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son
conocidos de la técnica. Por ejemplo, las ABMs humanizadas de la
presente invención pueden prepararse según los métodos de la patente
US nº 5.225.539, de Winter, la patente US nº 6.180.370, de Queen
et al.; o la patente US nº 6.632.927, de Adair et al.
Preferentemente, en un anticuerpo humanizado se han introducido uno
o más residuos aminoácidos procedentes de una fuente que no es
humana. Estos residuos aminoácidos no humanos con frecuencia se
denominan residuos "importados", que típicamente se obtienen
de un dominio variable "importado". La humanización
esencialmente puede llevarse a cabo siguiendo el método de Winter y
colaboradores (Jones et al., Nature
321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature
332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science
239:1534-1536, 1988) mediante la sustitución de
secuencias de la región hipervariable por las secuencias
correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos
anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente
US nº 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio
variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia
correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los
anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en los
que algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente
algunos residuos de FR son sustituidos por residuos procedentes de
sitios análogos en anticuerpos de roedor. Los anticuerpos
anti-CD20 humanizados de la invención comprenden
regiones constantes de una inmunoglobulina humana.
La elección de los dominios variables humanos,
tanto ligeros como pesados, que deben utilizarse en la preparación
de anticuerpos humanizados resulta muy importante para reducir la
antigenicidad. Según el método denominado de "ajuste óptimo",
las secuencias del dominio variable de un anticuerpo de roedor se
criba frente a la biblioteca completa de secuencias de dominio
variable humanas conocidas. La secuencia humana que es más similar a
la del roedor seguidamente se acepta como la región marco (FR)
humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J.
Immunol. 151:2296, 1993; Chothia et al., J. Mol. Biol.
196:901, 1987). Otro método para seleccionar la secuencia marco
humana es comparar la secuencia de cada subregión individual del
marco de roedor completo (es decir, FR1, FR2, FR3 y FR4) o alguna
combinación de las subregiones individuales (por ejemplo FR1 y FR2)
con una biblioteca de secuencias de una región variable humana
conocida que corresponden a dicha subregión de marco (por ejemplo
según se determina a partir de la numeración Kabat) y elegir la
secuencia humana para cada subregión o combinación que sea más
similar a la de roedor (Leung, solicitud publicada de patente US nº
2003/0040606A1, publicada el 27 de febrero de 2003). Otro método
utiliza una región marco particular derivada de la secuencia de
consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular
de cadenas ligeras o pesadas. Puede utilizarse el mismo marco para
varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Presta et al., J.
Immunol. 151:2623, 1993).
También es importante que los anticuerpos se
humanicen conservando la elevada afinidad para el antígeno y otras
propiedades biológicas favorables. Para alcanzar este objetivo,
según un método preferente, se preparan anticuerpos humanizados
mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y
diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos
tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los
modelos tridimensionales de inmunoglobulinas se encuentran
disponibles comúnmente y resultarán familiares para el experto en
la materia. Se encuentran disponibles programas informáticos que
ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales
probables de secuencias de inmunoglobulinas candidatas
seleccionadas. La inspección de estos resultados permite el
análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de
la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de
residuos que influyen sobre la capacidad de la inmunoglobulina
candidata de unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de
FR pueden seleccionarse y combinarse con el receptor e importar
secuencias de manera que se consiga la característica de anticuerpo
deseada, tal como una afinidad incrementada para el antígeno o
antígenos diana. En general, los residuos de la región
hipervariable se encuentran directa y más sustancialmente implicados
en la influencia sobre la unión de los antígenos.
En otra realización, las moléculas de unión a
antígeno de la presente invención se manipulan para que presenten
una afinidad de unión incrementada según, por ejemplo, los métodos
dados a conocer en la solicitud publicada de patente US nº
2004/0132066 de Balint et al.
En una realización, la molécula de unión a
antígeno de la presente invención se conjuga con un grupo adicional,
tal como un marcaje radioactivo o una toxina. Dichas ABMs
conjugadas pueden producirse mediante numerosos métodos que son
bien conocidos de la técnica.
Una diversidad de radionucleidos es aplicable a
la presente invención y al experto en la materia se le atribuye la
capacidad de determinar fácilmente qué radionucleido resulta más
apropiado bajo una diversidad de circunstancias. Por ejemplo, el
yodo-131 es un radionucleido bien conocido que se
utiliza para la inmunoterapia dirigida. Sin embargo, la utilidad
clínica del yodo-131 puede encontrarse limitada por
varios factores, entre ellos: una vida media física de ocho días,
el deshalogenado del anticuerpo yodado tanto en la sangre como en
los sitios tumorales, y las características de emisión (por ejemplo
un componente gamma elevado) que pueden resultar subóptimas para
una deposición localizada de la dosis en el tumor. Con la llegada de
agentes quelantes superiores, la oportunidad de unir grupos
quelantes metálicos a proteínas ha incrementado las oportunidades de
utilizar otros radionucleidos, tales como indio-111
e itrio-90. El itrio-90 proporciona
varios beneficios para la utilización en aplicaciones
radioinmunoterapéuticas: la vida media de 64 horas del
itrio-90 es suficientemente larga para permitir la
acumulación del anticuerpo en el tumor y, al contrario que, por
ejemplo, el yodo-131, el itrio-90
es un emisor beta puro de alta energía sin irradiación gamma
acompañante durante su descomposición, con un alcance en el tejido
de entre 100 y 1.000 diámetros celulares. Además, la cantidad mínima
de radiación penetrante permite la administración ambulatoria de
anticuerpos marcados con itrio-90. Además, la
internalización del anticuerpo marcado no resulta necesaria para la
eliminación celular, y la emisión local de radiación ionizante
debería resultar letal para las células tumorales contiguas que no
presentan el antígeno diana.
Las dosis eficaces de tratamiento único (es
decir, las cantidades terapéuticamente eficaces) de anticuerpos
anti-CD20 marcados con itrio-90 se
encuentran comprendidas entre aproximadamente 5 y aproximadamente 75
mCi, más preferentemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente
40 mCi. Las dosis eficaces no ablativas de médula en un tratamiento
único de anticuerpos anti-CD20 marcados con
yodo-131 se encuentran comprendidas entre
aproximadamente 30 y aproximadamente 600 mCi, más preferentemente
entre aproximadamente 50 y menos de aproximadamente 500 mCi.
Conjuntamente con un anticuerpo anti-CD20 quimérico,
debido a la vida media circulante más prolongada en comparación con
los anticuerpos murinos, las dosis eficaces no ablativas de médula
de un tratamiento único de anticuerpos anti-CD20
quimérico marcado con yodo-131 se encuentran
comprendidas entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi, más
preferentemente son inferiores a aproximadamente 30 mCi. Los
criterios de obtención de imágenes para, por ejemplo, el marcaje de
indio-111, típicamente son valores inferiores a
aproximadamente 5 mCi.
Con respecto a los anticuerpos
anti-CD20 marcados radioactivamente, la terapia con
los mismos también puede realizarse en un tratamiento terapéutico
único o en tratamientos múltiples. Debido al componente
radionucleido, resulta preferente que, antes del tratamiento, se
"recolecten" células madre periféricas ("PSC") o de médula
ósea ("BM") para los pacientes que experimenten toxicidad
potencialmente letal de la médula ósea debida a la radiación. La BM
y/o las PSC se recolectan utilizando técnicas estándares, y después
se purgan y se congelan para la posible reinfusión. Además, resulta
más preferente que antes del tratamiento se realice un estudio de
dosimetría diagnóstica utilizando un anticuerpo marcado diagnóstico
(por ejemplo utilizando indio-111), un propósito
del cual es garantizar que el anticuerpo terapéuticamente marcado
(por ejemplo utilizando itrio-90) no resulte
innecesariamente "concentrado" en cualquier órgano o tejido
normal.
Se da a conocer un polinucleótido aislado que
comprende una secuencia que codifica un polipéptido que presenta
una secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 3, posteriormente.
Se da a conocer un ácido nucleico que comprende una secuencia que
codifica un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de
cualquiera de los constructos en la Tabla 3 con sustituciones
conservadoras de aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe un polinucleótido aislado que
comprende una secuencia que codifica un polipéptido que presenta la
secuencia de aminoácidos mostrada en la fig. 1 ó en la fig. 2. Se da
a conocer un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que
codifica un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de
cualquiera de entre las figuras fig. 1, fig. 2, fig. 5 o fig. 6 con
sustituciones conservadoras de aminoácidos.
En otra realización, la presente invención se
refiere a un vector de expresión y/o a una célula huésped según las
reivindicaciones, que comprende uno o más polinucleótidos
aislados.
Generalmente, puede utilizarse cualquier tipo de
línea celular en cultivo para expresar la ABM de la presente
invención. En una realización preferente, se utilizan células CHO,
células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO,
células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o
células de hibridoma, otras células de mamífero, células de
levadura, células de insecto o células vegetales como la línea
celular de fondo para generar las células huésped manipuladas de la
invención.
La eficacia terapéutica de las ABMs de la
presente invención puede potenciarse mediante la producción de las
mismas en una célula huésped que expresa adicionalmente un
polinucleótido codificante de un polipéptido que presenta actividad
de GnTIII. En una realización preferente, el polipéptido que
presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que
comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido
residente en el Golgi. En otra realización preferente, las
expresión de las ABMs de la presente invención en una célula
huésped que expresa un polinucleótido codificante de un polipéptido
que presenta actividad de GnTIII resulta en ABMs con afinidad de
unión a receptores Fc incrementada y una función efectora
incrementada. De acuerdo con lo anterior, en una realización, la
presente invención se refiere a una célula huésped que comprende:
(a) un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia
codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII, y
(b) un polinucleótido aislado codificante de una ABM de la presente
invención, tal como un anticuerpo quimérico o humanizado que se une
a CD20 humano. En una realización preferente, el polipéptido que
presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que
comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de
localización en Golgi es el dominio de localización de la manosidasa
II. Los métodos para generar dichos polipéptidos de fusión y la
utilización de los mismos para producir anticuerpos con funciones
efectoras incrementadas se dan a conocer en la solicitud
provisional de patente US nº 60/495.412. En otra realización
preferente, la ABM quimérica es un anticuerpo quimérico o un
fragmento del mismo, que presenta la especificidad de unión del
anticuerpo B-LY1 murino. En una realización
particularmente preferente, el anticuerpo quimérico comprende un Fc
humano. En otra realización preferente, el anticuerpo ha sido
primatizado o humanizado.
En una realización, puede expresarse uno o
varios polinucleótidos codificantes de una ABM de la presente
invención, bajo el control de un promotor constitutivo o,
alternativamente, un sistema de expresión regulada. Entre los
sistemas de expresión regulada adecuados se incluyen, aunque sin
limitación, un sistema de expresión regulada por tetraciclina, un
sistema de expresión inducible con ecdisona, un sistema de expresión
de interruptor Lac, un sistema de expresión inducible por
glucocorticoides, un sistema de promotor inducible térmicamente, y
un sistema de expresión inducible por metal metalotioneína. En el
caso de que el sistema de la célula huésped comprenda varios ácidos
nucleicos diferentes codificantes de una ABM de la presente
invención, algunos de ellos pueden expresarse bajo el control de un
promotor constitutivo, mientras que otras se expresan bajo el
control de un promotor regulado. El nivel máximo de expresión se
considera que es el nivel más alto posible de expresión estable de
polipéptido que no presenta un efecto adverso significativo sobre la
tasa de crecimiento celular, y se determinará mediante
experimentación rutinaria. Los niveles de expresión se determinan
mediante métodos generalmente conocidos de la técnica, incluyendo
el análisis de transferencia western utilizando un anticuerpo
específico para la AMB o un anticuerpo específico para un
péptido-etiqueta fusionado a la AMB, y el análisis
de transferencia northern. En una alternativa adicional, el
polinucleótido puede ligarse operativamente a un gen informador;
los niveles de expresión de una ABM quimérica que presenta
sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo
B-Ly1 murino se determinan mediante la medición de
una señal correlacionada con el nivel d expresión del gen
informador. El gen informador puede transcribirse conjuntamente con
el ácido o ácido nucleicos codificantes de dicho polipéptido de
fusión en forma de una única molécula de ARNm; sus secuencias
codificantes respectivas pueden unirse mediante un sitio interno de
entrada al ribosoma (IRES) o mediante un intensificador de
traducción independiente de caperuza (CITE). El gen informador puede
traducirse conjuntamente con por lo menos un ácido nucleico
codificante de una AMB quimérica que presenta sustancialmente la
misma especificidad de unión del anticuerpo B-Ly1
murino, de manera que se forma una única cadena polipeptídica. Los
ácidos nucleicos codificantes de las ABMs de la presente invención
pueden ligarse operativamente al gen informador bajo el control de
un único promotor, de manera que el ácido nucleico codificante del
polipéptido de fusión y el gen informador se transcriben en una
molécula de ARN que se procesa alternativamente para formar dos
moléculas separadas de ARN mensajero (ARNm): uno de los ARNm
resultantes se traduce en dicha proteína formadora, y el otro se
traduce en dicho polipéptido de fusión.
Pueden utilizarse métodos que son bien conocidos
por el experto en la materia para construir vectores de expresión
que contienen la secuencia codificante de una ABM que presenta
sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo
B-Ly1 murino conjuntamente con las señales de
control transcripcional/traduccional apropiadas. Entre estos
métodos se incluyen las técnicas in vitro de ADN
recombinante, las técnicas sintéticas y la recombinación in
vivo/recombinación genética. Ver, por ejemplo, las técnicas
descritas en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989, y Ausubel et
al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing
Associates y Wiley Interscience, N.Y., 1989.
Puede utilizarse una diversidad de sistemas de
huésped-vector de expresión para expresar la
secuencia codificante de las ABMs de la presente invención.
Preferentemente se utilizan células de mamífero como sistemas de
célula huésped transfectados con plásmido de ADN recombinante o
vectores de expresión de ADN cósmido que contienen la secuencia
codificante de la proteína de interés y la secuencia codificante del
polipéptido de fusión. Más preferentemente, se utilizan como
sistema de célula huésped células CHO, células BHK, células NS0,
células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón
P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, otras
células de mamífero, células de levadura, células de insecto o
células vegetales. Se describen algunos ejemplos de sistemas de
expresión y métodos de selección en las referencias siguientes, y
referencias contenidas en las mismas: Borth et al.,
Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73,
2000-2001, en: Werner et al.,
Arineimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80,
1998, en: Andersen y Krummen, Curr. Op. Biotechnol.
13:117-123, 2002, en: Chadd y Chamow, Curr. Op.
Biotechnol. 12:188-194, 2001, y en Giddings, Curr.
Op. Biotechnol. 12:450-454, 2001. En realizaciones
alternativas, pueden contemplarse otros sistemas de célula huésped
eucariótica, incluyendo células de levadura transformadas con
vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen la
secuencia codificante de una ABM de la presente invención, sistemas
de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus
recombinante (por ejemplo baculovirus) que contienen la secuencia
codificante de una ABM quimérica que presenta sustancialmente la
misma especificidad de unión que el anticuerpo B-Ly1
murino; sistemas de células vegetales infectados con vectores de
expresión de virus recombinante (por ejemplo el virus del mosaico
de la coliflor, CaMV; el virus del mosaico del tabaco, TMV) o
transformados con vectores de expresión plásmidos recombinantes
(por ejemplo el plásmido Ti) que contienen la secuencia codificante
de la ABM de la invención; o sistemas de células animales
infectados con vectores de expresión virus recombinante (por ejemplo
adenovirus, virus vaccinia), incluyendo líneas celulares
manipuladas para que contengan múltiples copias del AND codificante
de una ABM quimérica que presenta sustancialmente la misma
especificidad de unión que el anticuerpo B-Ly1
murino establemente amplificado (CHO/dhfr) o inestablemente
amplificado en cromosomas dobles diminutos (por ejemplo líneas
celulares murinas). En una realización, el vector que comprende el
polinucleótido o polinucleótidos codificantes de la ABM de la
invención es policistrónico. Además, en una realización la ABM
comentada anteriormente es un anticuerpo o un fragmento del mismo.
En una realización preferente la AMB es un anticuerpo
humanizado.
Para los métodos de la presente invención, se
prefiere generalmente la expresión estable a la expresión
transitoria debido a que típicamente consigue resultados más
reproducibles y que también permite más fácilmente la producción a
gran escala. En lugar de utilizar vectores de expresión que
contienen orígenes víricos de replicación, las células huésped
pueden transformarse con los ácidos nucleicos codificantes
respectivos controlados por los elementos de control de la
expresión apropiados (por ejemplo promotor, intensificador,
secuencias, terminadores de transcripción, sitios de
poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Tras la
introducción del ADN foráneo, las células manipuladas pueden
dejarse en cultivo durante 1 a 2 días en un medio enriquecido, y
después pasarse a un medio selectivo. El marcador seleccionable en
el plásmido recombinante proporciona resistencia a la selección y
permite la selección de células que han integrado establemente el
plásmido en sus cromosomas y que crecen para formar focos que, a su
vez, pueden clonarse y expandirse para formar líneas celulares.
Existen varios sistemas de selección que pueden
utilizarse, incluyendo, aunque sin limitación, los genes de la
timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler et al.,
Cell 11:223, 1977), de la hipoxantina-guanina
fosforibosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 48:2026, 1962), y de la adenina fosforibosiltransferasa
(Lowy et al., Cell 22:817, 1980), que pueden utilizarse en
células tk^{-}, hgprt^{-} o aprt^{-}, respectivamente.
Además, puede utilizarse una resistencia antimetabolito como base de
selección para los genes dhfr, que proporciona resistencia al
metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:3567,
1989; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527,
1981), gpt, que proporciona resistencia al ácido micofenólico
(Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981), neo,
que proporciona resistencia al aminoglucósido G-418
(Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol.
150:1, 1981), e higro, que proporciona resistencia a la higromicina
(Santerre et al., Gene 30:147, 1984). Recientemente, se han
descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo trpB, que
permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano;
hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de
histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047,
1988), el sistema de glutamina sintasa, y la ODC (ornitina
descarboxilasa), que proporciona resistencia al inhibidor de la
ornitina descarboxilasa, la
2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO
(McConlogue, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold
Spring Harbor Laboratory, editor, 1987).
La presente invención se refiere asimismo a un
método para modificar el perfil de glucosilación de las ABMs de la
presente invención que son producidas por una célula huésped, que
comprende expresar en dicha célula huésped un ácido nucleico
codificante de una ABM de la invención y un ácido nucleico
codificante de un polipéptido con actividad de GnTIII, o un vector
que comprende dichos ácidos nucleicos. Preferentemente, el
polipéptido modificado es IgG o un fragmento de la misma que
comprende la región Fc. En una realización particularmente
preferente, la ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del
mismo.
Las ABMs modificadas producidas por las células
huésped de la invención muestran una afinidad de unión de receptor
Fc incrementada y/o una función efectora incrementada como resultado
de la modificación. En una realización particularmente preferente,
la ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo que
contiene la región Fc. Preferentemente la afinidad de unión de
receptor Fc incrementada es unión incrementada a un receptor
activador Fc\gamma, tal como el receptor Fc\gammaRIIIa. La
función efectora incrementada preferentemente es un incremento de
uno o más de los siguientes: citotoxicidad celular dependiente de
anticuerpo incrementada, fagocitosis celular dependiente de
anticuerpo (ADCP) incrementada, secreción de citoquinas
incrementada, incorporación incrementada de antígenos por parte de
células presentadoras de antígeno mediada por complejo inmunológico,
citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada, unión
incrementada a células NK, unión incrementada a macrófagos, unión
incrementada a células polimorfonucleares (PMNs), unión incrementada
a monocitos, entrecruzamiento incrementado de anticuerpos unidos a
diana, señalización directa incrementada inductora de apoptosis,
maduración de células dendríticas incrementada y cebado de células
T incrementado.
La presente invención se refiere asimismo a un
método para producir una ABM de la presente invención, que presenta
oligosacáridos modificados en una célula huésped, que comprende: (a)
cultivar una célula huésped manipulada para que exprese por lo
menos un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta
actividad de GnTIII bajo condiciones que permiten la producción de
una ABM según la presente invención, en la que dicho polipéptido
que presenta actividad de GnTIII se expresa en una cantidad
suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fc de
dicha ABM producida por dicha célula huésped, y (b) aislar dicha
ABM. En una realización preferente, el polipéptido que presenta
actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el
dominio catalítico de GnTIII. En una realización particularmente
preferente, el polipéptido de fusión comprende además el dominio de
localización en Golgi de un polipéptido residente en el Golgi.
Preferentemente, el dominio de localización en
Golgi es el dominio de localización de la manosidasa II o de GnTI.
Alternativamente, el dominio de localización en Golgi se selecciona
de entre el grupo que consiste de: el dominio de localización de la
manosidasa I, el dominio de localización de GnTII, y el dominio de
localización de la \alpha
1-6-fucosiltransferasa nuclear. Las
ABMs producidas mediante los métodos de la presente invención
presentan una afinidad de unión de receptores Fc incrementada y/o
una función efectora incrementada. Preferentemente, la función
efectora incrementada es una o más de las siguientes: citotoxicidad
celular mediada por Fc incrementada (incluyendo la citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpos incrementada), fagocitosis
celular dependiente de anticuerpos (ADCP) incrementada, secreción
incrementada de citoquinas, incorporación de antígeno mediada por
complejo inmunológico incrementada, unión incrementada a células NK,
unión incrementada a macrófagos, unión incrementada a monocitos,
unión incrementada a células polimorfonucleares, señalización
directa incrementada inductora de apoptosis, entrecruzamiento
incrementado de anticuerpos unidos a diana, maduración incrementada
de células dendríticas o cebador de células T incrementada. La
afinidad de unión a receptores Fc incrementada preferentemente es
unión incrementada a receptores activadores de Fc, tales como
Fc\gammaRIIIa. En una realización particularmente preferente, la
ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo.
En otra realización, la presente invención se
refiere a una ABM quimérica que presenta sustancialmente la misma
especificidad de unión del anticuerpo B-Ly1 murino
producido mediante los métodos de la invención, que presenta una
proporción incrementada de oligosacáridos biantenarios en la región
Fc de dicho polipéptido. Se encuentra contemplado que dicho ABM
comprenda anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprendan la
región Fc. En una realización preferente, la ABM es un anticuerpo
humanizado. En una realización, el porcentaje de oligosacáridos
biantenarios en la región Fc de la AMB es de por lo menos 50%, más
preferentemente de por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos
80%, o por lo menos 90%, y más preferentemente de por lo menos 90%
a 95% de los oligosacáridos totales. En todavía otra realización, la
ABM producida mediante los métodos de la invención presenta una
proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la
región Fc como resultado de la modificación de sus oligosacáridos
mediante los métodos de la presente invención. En una realización,
el porcentaje de oligosacáridos no fucosilados es de por lo menos
50%, preferentemente de por lo menos 60% a 70%, más preferentemente
de por lo menos 75%. Los oligosacáridos no fucosilados puede del
tipo híbrido o del tipo complejo. En una realización
particularmente preferente, la ABM producida mediante las células
huésped y métodos de la invención presenta una proporción
incrementada de oligosacáridos no fucosilados biantenarios en la
región Fc. Los oligosacáridos no fucosilados biantenarios pueden ser
híbridos o complejos. Específicamente, los métodos de la presente
invención pueden utilizarse para producir ABMs en las que por lo
menos 15%, más preferentemente por lo menos 20%, más
preferentemente por lo menos 25%, más preferentemente por lo menos
30%, más preferentemente por lo menos 35% de los oligosacáridos en
la región Fc de la ABM son biantenarios, no fucosilados. Los
métodos de la presente invención también pueden utilizarse para
producir polipéptidos en los que por lo menos 15%, más
preferentemente por lo menos 20%, más preferentemente por lo menos
25%, más preferentemente por lo menos 30%, más preferentemente por
lo menos 35% de los oligosacáridos en la región Fc del polipéptido
son biantenarios híbridos no fucosilados.
En otra realización, la presente invención se
refiere a una ABM quimérica que presenta sustancialmente la misma
especificidad de unión del anticuerpo B-Ly1 murino
manipulados para que presenta una función efectora incrementada y/o
una afinidad de unión a receptores Fc incrementada, producida
mediante los métodos de la invención. Preferentemente, la función
efectora incrementada es una o más de las siguientes: citotoxicidad
celular mediada por Fc incrementada (incluyendo la citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpos incrementada), fagocitosis
celular dependiente de anticuerpos (ADCP) incrementada, secreción
incrementada de citoquinas, incorporación de antígenos en células
presentadoras de antígeno mediada por complejo inmunológico
incrementada, unión incrementada a células NK, unión incrementada a
macrófagos, unión incrementada a monocitos, unión incrementada a
células polimorfonucleares, señalización directa inductora de
apoptosis incrementada, entrecruzamiento incrementada de
anticuerpos unidos a diana, maduración de células dendríticas
incrementada, o cebado de células T incrementado. En una
realización preferente, la afinidad de unión de receptores Fc
incrementada es la unión incrementada a un receptor activador de
Fc, más preferentemente Fc\gammaRIIIa. En una realización, la ABM
es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que contiene la región
Fc, o una proteína de fusión que incluye una región equivalente a
la región Fc de una inmunoglobulina. En una realización
particularmente preferente, la ABM es un anticuerpo humanizado.
La presente invención se refiere asimismo a
composiciones farmacéuticas que comprenden las ABMs de la presente
invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere asimismo a la
utilización de dichas composiciones farmacéuticas en el método de
tratamiento del cáncer. Específicamente, la presente invención se
refiere a un método para el tratamiento del cáncer, que comprende
administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición
farmacéutica de la invención.
La presente invención proporciona asimismo
métodos para la generación y utilización de sistemas de células
huésped para la producción de glucoformas de las ABMs de la presente
invención, que presentan una afinidad de unión a receptores Fc
incrementada, preferentemente una unión a receptores activadores de
Fc incrementada, y/o que presentan funciones efectoras
incrementadas, incluyendo citotoxicidad celular dependiente de
anticuerpos. La metodología de glucomanipulación que puede
utilizarse con las ABMs de la presente invención ha sido descrito
en mayor detalle en la patente US nº 6.602.684 y en la solicitud
provisional de patente US nº 60/441.307 y en la patente WO nº
2004/065540. Las ABMs de la presente invención alternativamente
pueden glucomanipularse para que presente un número reducido de
residuos fucosa en la región Fc según las técnicas dadas a conocer
en el documento EP nº 1 176 195 A1.
La presente invención proporciona sistemas de
expresión de células huésped para la generación de las ABMs de la
presente invención que presentan patrones de glucosilación
modificados. En particular, la presente invención proporciona
sistemas de células huésped para la generación de glucoformas de las
ABMs de la presente invención que presentan un valor terapéutico
mejorado. Por lo tanto, la invención proporciona sistemas de
expresión de células huésped seleccionados o manipulados para que
expresen un polipéptido que presenta actividad de GnTIII. En una
realización, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un
polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización en
Golgi de un polipéptido residente en Golgi heterólogo.
Específicamente, dichos sistemas de expresión de células huésped
pueden manipularse para que comprendan una molécula de ácido
nucleico recombinante codiciante de un polipéptido que presenta
GnTIII, operativamente ligado a un sistema promotor constitutivo o
regulado.
En una realización específica, la presente
invención proporciona una célula huésped que ha sido manipulada
para expresar por lo menos un ácido nucleico codificante de un
polipéptido de fusión que presenta actividad de GnTIII y que
comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido
residente en Golgi heterólogo. En un aspecto, la célula huésped se
manipula con una molécula de ácido nucleico que comprende por lo
menos un gen codificante de un polipéptido de fusión que presenta
actividad de GnTIII y que comprende el dominio de localización en
Golgi de un polipéptido residente en Golgi heterólogo.
Generalmente, puede utilizarse cualquier tipo de
línea celular en cultivo, incluyendo las líneas celulares
comentadas anteriormente, como fondo para manipular las líneas de
células huésped de la presente invención. En una realización
preferente, se utilizan células CHO, células BHK, células NS0,
células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón
P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células
de otro mamífero, células de levadura, células de insecto o células
vegetales, como la línea celular de fondo para generar las células
huésped manipuladas de la invención.
Se encuentra contemplado que la invención
comprenda cualquier célula huésped manipulada que expresa un
polipéptido que presenta actividad de GnTIII, incluyendo un
polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización en
Golgi de un polipéptido residente en Golgi heterólogo tal como se
define en la presente memoria.
Puede expresarse uno o varios ácidos nucleicos
codificantes de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII,
bajo el control de un promotor constitutivo o, alternativamente, un
sistema de expresión regulada. Dichos sistemas son bien conocidos
de la técnica, e incluyen los sistemas comentados anteriormente. En
el caso de que varios ácidos nucleicos diferentes codificantes de
polipéptidos de fusión que presentan actividad de GnTIII y que
comprenden el dominio de localización en Golgi de un polipéptido
residente en Golgi heterólogo se encuentren dentro del sistema de
células huésped, algunos de ellos pueden expresarse bajo el control
de un promotor constitutivo, mientras que otros se expresan bajo el
control de un promotor regulado. Los niveles de expresión de los
polipéptidos de fusión que presentan actividad de GnTIII se
determinan mediante métodos generalmente conocidos de la técnica,
incluyendo el análisis de transferencia Western, el análisis de
transferencia Northern, el análisis de expresión de genes
informadores o la medición de la actividad de GnTIII.
Alternativamente, puede utilizarse una lectina que se una a
productos biosintéticos de GnTIII, por ejemplo la lectina
E4-PHA. Alternativamente, puede utilizarse un
ensayo funcional que mide la unión incrementada del receptor Fc o la
función efectora incrementada mediada por anticuerpos producidos
por las células manipuladas con el ácido nucleico codificante de un
polipéptido con actividad de GnTIII.
Las células huésped que contienen la secuencia
codificante de una ABM quimérica que presenta sustancialmente la
misma especificidad de unión que el anticuerpo B-Ly1
murino y que expresan los producto génicos biológicamente activos
pueden identificarse mediante por lo menos cuatro enfoques
generales: (a) hibridación ADN-ADN o
ADN-ARN, (b) presencia o ausencia de funciones
génicas "marcadoras", (c) evaluación del nivel de transcripción
según se mide a partir de la expresión de los transcritos de ARNm
respectivos en la célula huésped, (d) detección del producto génico
según medición mediante inmunoensayo o a partir de su actividad
biológica.
En el primer enfoque, la presente de la
secuencia codificante de una ABM quimérica que presenta
sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo
Bly-1 murino y la secuencia codificante del
polipéptido que presenta actividad de GnTIII pueden detectarse
mediante hibridación ADN-ADN o
ADN-ARN utilizando sondas que comprenden secuencias
de nucleótidos que son homólogas a las secuencias codificantes
respectivas, respectivamente, o partes o derivados de las
mismas.
En el segundo enfoque, el vector de expresión
recombinante/célula huésped puede identificarse y seleccionarse
basándose en la presencia o ausencia de determinadas funciones
génicas "marcadoras" por ejemplo actividad de
timidina-quinasa, resistencia a antibióticos,
resistencia al metotrexato, fenotipo de transformación, formación
de cuerpo de oclusión en baculovirus, etc.). Por ejemplo, en el caso
de que la secuencia codificante de la ABM de la invención, o de un
fragmento de la misma, y la secuencia codificante del polipéptido
que presenta actividad de GnTIII dentro de una secuencia de gen
marcador del vector, puedan identificarse los recombinantes que
contienen las secuencias codificantes respectivas a partir de la
ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, puede
introducirse un gen marcador en tándem con las secuencias
codificantes bajo el control del mismo promotor o de uno diferente
utilizado para controlar la expresión de las secuencias
codificantes. La expresión del marcador en respuesta a la inducción
o la selección indica la expresión de la secuencia codificante de
la ABM de la invención y la secuencia codificante del polipéptido
que presenta actividad de GnTIII.
En el tercer enfoque, puede evaluarse mediante
ensayos de hibridación la actividad transcripcional de la región
codificante de la AB de la invención, o de un fragmento de la misma,
y la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad
de GnTIII. Por ejemplo, puede aislarse ARN y analizarse mediante
transferencia northern utilizando una sonda homóloga a las
secuencias codificantes de la ABM de la invención, o de un fragmento
de la misma, y la secuencia codificante del polipéptido que
presenta actividad de GnTIII o partes particulares de la misma.
Alternativamente, pueden extraerse los ácidos nucleicos totales de
la célula huésped y someterse a ensayo para la hibridación a dichas
sondas.
En el cuarto enfoque, la expresión de los
productos proteicos puede evaluarse inmunológicamente, por ejemplo
mediante transferencias western, inmunoensayos tales como la
radioinmunoprecipitación o inmunoensayos ligados a enzima. El
ensayo definitivo del éxito del sistema de expresión, sin embargo,
implica la detección de los productos génicos biológicamente
activos.
Generación y utilización de ABMs que presentan
una función efectora incrementada, incluyendo la citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpos
En realizaciones preferentes, la presente
invención proporciona glucoformas de ABMs quiméricas que presentan
sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo
B-Ly1 murino y que presentan una función efectora
incrementada, incluyendo citotoxicidad celular dependiente de
anticuerpos. La manipulación mediante glucosilación de anticuerpos
ha sido descrita anteriormente (ver, por ejemplo, la patente US nº
6.602.684).
Algunos ensayos clínicos de anticuerpos
monoclonales no conjugados (mAbs) destinados al tratamiento de
algunos tipos de cáncer recientemente han proporcionado resultados
esperanzadores (Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm.
12:223-25, 1997; Deo et al., Immunology Today
18:127, 1997). Se ha autorizado una IgG1 no conjugada quimérica
para el linfoma no de Hodking de células B foliculares o de grado
bajo (Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm.
12:223-25, 1997), mientras que otro mAb no
conjugado, una IgG1 humanizada que reconoce tumores de mama sólidos,
también ha mostrado resultados prometedores en ensayos clínicos de
fase III (Deo et al., Immunology Today 18:127, 1997). Los
antígenos de estos dos mAbs se expresan a nivel elevado en sus
células tumorales respectivas y los anticuerpos median en la
potente destrucción tumoral por parte de células efectoras in
vitro e in vivo. Por el contrario, muchos otros mAbs no
conjugados con finas especificidades tumorales no pueden
desencadenar funciones efectoras de suficiente potencia para
resultar clínicamente útiles (Frost et al., Cancer
80:317-33, 1997; Surfus et al., J.
Immunother. 19:184-91, 1996). Para algunos de estos
mAbs más débiles, en la actualidad se está sometiendo a ensayo la
terapia complementaria de citoquinas. La adición de citoquinas puede
estimular la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
(ADCC) mediante el incremento de la actividad y número de linfocitos
circulantes (Frost et al., Cancer 80:317-33,
1997; Surfus et al., J. Immunother.
19:184-91, 1996). La ADCC, un ataque lítico sobre
células reconocidas por anticuerpos, resulta desencadenada tras la
unión de los receptores de leucocitos a la región constante (Fc) de
los anticuerpos (Deo et al., Immunology Today 18:127,
1997).
Un enfoque diferente, aunque complementario,
para incrementar la actividad ADCC de las IgGIs no conjugadas es
manipular la región Fc del anticuerpo. Algunos estudios de
manipulación de proteínas han demostrado que los Fc\gammaRs
interaccionan con la región bisagra inferior del dominio CH2 de IgG
(Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69,
1996). Sin embargo, la unión de Fc\gammaR también requiere la
presencia de oligosacáridos unidos covalentemente a la Asn 297
conservada presente en la región CH2 (Lund et al., J.
Immunol. 157:4963-69, 1996; Wright y Morrison,
Trends Biotech. 15:26-31, 1997), sugiriendo que
oligosacárido y polipéptido, ambos, contribuyen directamente al
sitio de interacción o que el oligosacárido resulta necesario para
mantener una conformación activa del polipéptido con CH2. La
modificación de la estructura del oligosacárido, por lo tanto,
podría explorarse como medio para incrementar la afinidad de la
interacción.
Una molécula de IgG porta dos oligosacáridos
N-ligados en su región Fc, uno en cada cadena
pesada. Al igual que cualquier glucoproteína, un anticuerpo se
produce como población de glucoformas que comparten el mismo
esqueleto polipeptídico pero que presentan diferentes oligosacáridos
unidos a los sitios de glucosilación. Los oligosacáridos
normalmente presentes en la región Fc de la IgG sérica son de tipo
biantenario complejo (Wormald et al., Biochemistry
36:130-38, 1997), con un nivel bajo de ácido siálico
terminal y de N-acetilglucosamina (GlcNAc)
biantenaria, y un grado variable de galactosilación terminal y de
fucosilación nuclear. Algunos estudios sugieren que la estructura de
carbohidrato mínima necesaria para la unión de Fc\gammaR se
encuentra dentro del núcleo del oligosacárido (Lund et al.,
J. Immunol. 157:4963-69, 1996).
Las líneas celulares derivadas del ratón y del
hámster utilizadas en la industria y en la universidad para la
producción de mAbs terapéuticos no conjugados normalmente unen los
determinantes oligosacáridos necesarios a los sitios Fc. Las IgGs
expresadas en dichas líneas celulares carecen, sin embargo, del
GlcNAc biantenario presente en cantidades reducidas en las IgGs
séricas (Lifely et al., Glycobiology
318:813-22, 1996). Por el contrario, recientemente
se ha observado que una IgG1 humanizada producida por el mieloma de
rata (CAMPATH-1H) portaba una GlcNAc biantenaria en
algunas de sus glucoformas (Lifely et al., Glycobiology
318:813-22, 1996). El anticuerpo derivado de células
de rata alcanzaba una actividad ADCC in vitro máxima similar
a la de los anticuerpos CAMPATH-1H producidos en
líneas celulares estándares, aunque a concentraciones de anticuerpo
significativamente más bajas.
El antígeno de CAMPATH normalmente se encuentra
presente a niveles elevados sobre las células de linfoma, y este
mAb quimérico presenta una actividad ADCC elevada en ausencia de un
GlcNAc biantenario (Lifely et al., Glycobiology
318:813-22, 1995). En la ruta de glucosilación
N-ligada, un GlcNAc biantenario resulta añadido por
GnTIII (Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81,
1986).
Algunos estudios anteriores utilizaron una única
línea celular CHO productora de anticuerpos, que previamente había
sido manipulada para expresar, de una manera regulada externamente,
diferentes niveles de un enzima de gen GnTIII clonado (Umana P.
et al., Nature Biotechnol. 17:176-180, 1999).
Este enfoque estableció por primera vez una correlación rigurosa
entre la expresión de GnTIII y la actividad ADCC del anticuerpo
modificado. De esta manera, la invención contempla un anticuerpo
quimérico recombinante o un fragmento del mismo con la
especificidad de unión del anticuerpo B-Ly1 murino,
que presenta una glucosilación alterada resultante de la actividad
de GnTIII incrementada. La actividad de GnTIII incrementada resulta
en un incremento del porcentaje de oligosacáridos biantenarios, así
como en una reducción del porcentaje de residuos fucosa en la región
Fc de la ABM. Este anticuerpo, o fragmento del mismo, presenta una
afinidad de unión a receptor Fc incrementada y una función efectora
incrementada. Además, la invención se refiere al fragmento de
anticuerpo y proteínas de fusión que comprenden una región que es
equivalente a la región Fc de las inmunoglobulinas.
Las ABMs de la presente invención pueden
utilizarse por sí solas para reconocer y eliminar las células
tumorales in vivo. Las ABMs también pueden utilizarse
conjuntamente con un agente terapéutico apropiado para tratar el
carcinoma humano. Por ejemplo, las ABMs pueden utilizarse en
combinación con métodos de tratamiento estándares o convencionales,
tales como la quimioterapia o la terapia de radiación, o pueden
conjugarse o unirse a un fármaco terapéutico, o toxina, así como a
un linfocito o a un factor de crecimiento inhibidor tumoral, para
la administración del agente terapéutico en el sitio del carcinoma.
Los conjugados de las ABMs de la presente invención que son de
importancia primordial son: (1) las inmunotoxinas (conjugados de la
ABM y un grupo citotóxico), y (2) ABMs marcadas (por ejemplo
marcadas radioactivamente, marcadas enzimáticamente o marcadas con
fluorocromos) en las que el marcaje proporciona un medio para
identificar los complejos inmunológicos que incluyen la ABM
marcada. Las ABMs también pueden utilizarse para inducir la lisis
mediante el procedimiento natural del complemento, y para
interaccionar con células citotóxicas dependientes de anticuerpos
presentes normalmente.
El grupo citotóxico de la inmunotoxina puede ser
un fármaco citotóxico o una toxina enzimáticamente activa de origen
bacteriano o vegetal, o un fragmento enzimáticamente activo
("cadena A") de dicha toxina. Las toxinas enzimáticamente
activas y fragmentos de las mismas utilizadas son la cadena A
diftérica, los fragmentos activos no ligantes de la toxina
diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas
aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la
abrina, la cadena A de la modeccina, la alfasarcina, las proteínas
de Aleurites fordii, las proteínas diantina, las proteínas
de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y
PAP-S), el inhibidor de Momoordica
charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria
officinalis, gelonina, mitogellina, restrictocina, fenomicina y
enomicina. En otra realización, las ABMs se conjugan con fármacos
anticáncer de molécula pequeña. Los conjugados de la ABM y dichos
grupos citotóxicos se preparan utilizando una diversidad de
proteínas bifuncionales que son agentes de acoplamiento. Son
ejemplos de estos reactivos: SPDP, IT, derivados bifuncionales de
los imidoésteres tales como HCl de adipimidato de dimetilo, ésteres
activos tales como suberato de disuccinimidilo, aldehídos tales
como glutaraldehído, compuestos bis-azido tales como
bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina,
derivados bis-diazonio tales como
bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina,
diisocianatos tales como 2,6-diisocianato de
tolileno y compuestos flúor bis-activos tales como
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno.
La parte lisante de una toxina puede unirse al fragmento Fab de las
ABMs. Son conocidas de la técnica algunas toxinas apropiadas
adicionales, tal como se pone de manifiesto en, por ejemplo, la
solicitud publicada de patente US nº 2002/0128448.
En una realización, una ABM glucomanipulada
quimérica que presenta sustancialmente la misma especificidad de
unión del anticuerpo B-Ly1 murino se conjuga con la
cadena A de la ricina. Más ventajosamente, la cadena A de la ricina
se desglucosila y se produce por medios recombinantes. Un método
ventajoso de preparar la inmunotoxina ricina se describe en Vitetta
et al., Science 238:1098, 1987.
En el caso de que los conjugados se utilicen
para eliminar células cancerosas humanas in vitro con fines
diagnósticos, típicamente se añaden al medio de cultivo celular a
una concentración de por lo menos aproximadamente 10 nM. La
formulación y modo de administración para el uso in vitro no
resultan críticos. Normalmente se utilizan las formulaciones
acuosas que resultan compatibles con medio de cultivo o de
perfusión. La citotoxicidad puede leerse mediante técnicas
convencionales para la determinación de la presencia o grado del
cáncer.
Tal como se ha comentado anteriormente, puede
prepararse un radiofarmacéutico citotóxico para tratar el cáncer
mediante conjugación de un isótopo radioactivo (por ejemplo I, Y,
Pr) con una ABM glucomanipulada quimérica que presenta
sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo
B-Ly1 murino. La expresión "grupo citotóxico"
tal como se utiliza en la presente memoria pretende incluir dichos
isótopos.
En otra realización, se rellena liposomas con un
fármaco citotóxico y los liposomas se recubren con las ABMs de la
presente invención. Debido a que existen muchas moléculas de CD20
sobre la superficie de la célula B maligna, este método permite la
administración de grandes cantidades de fármaco al tipo celular
correcto.
Las técnicas para conjugar dichos agentes
terapéuticos con anticuerpos son bien conocidas (ver, por ejemplo,
Amon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of
Drugs in Cancer Therapy", en: Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, Reisfeld et al. (editores), páginas 243 a 256 (Alan
R. Liss, Inc., 1985), Hellstrom et al., "Antibodies For
Drug Delivery", en: Controlled Drug Delivery (2a edición),
Robinson et al. (editores), páginas 623 a 653 (Marcel
Dekker, Inc., 1987), Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic
Agents In Cancer Therapy: A Review", en: Monoclonal Antibodies
'84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al.
(editores), páginas 475 a 506, 1985, y Thorpe et al., "The
Preparation And Cytotoxic Properties Of
Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev.
62:119-58, 1982).
Entre todavía otras aplicaciones terapéuticas
para las ABMs de la invención se incluyen el conjugado o unión, por
ejemplo mediante técnicas de ADN recombinante, a un enzima capaz de
convertir un profármaco en un fármaco citotóxico, y la utilización
de este conjugado de anticuerpo-enzima en
combinación con el profármaco para convertir el profármaco en un
agente citotóxico en el sitio tumoral (ver, por ejemplo, Senter
et al., "Anti-Tumor Effects of
Antibody-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:4842-46, 1988; "Enhancement of the
in vitro and in vivo Antitumor Activities of
Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives of Monoclonal
Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Cancer
Research 49:5789-5792, 1989, y Senter, "Activation
of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New
Approach to Cancer Therapy", FASEB J. 4:188-193,
1990).
Todavía otro uso terapéutico para las ABMs de la
invención implica la utilización, no conjugado, en presencia del
complemento, o como parte de un conjugado de
anticuerpo-fármaco o de
anticuerpo-toxina, para eliminar células tumorales
de la médula ósea de pacientes de cáncer. Según este enfoque, puede
purgarse médula ósea autóloga ex vivo mediante tratamiento
con el anticuerpo e infusionarse la médula de vuelta en el paciente
(ver, por ejemplo, Ramsay et al., "Bone Marrow Purging
Using Monoclonal Antibodies", J. Clin. Immunol.
8(2):81-88, 1988).
Además, se contempla que la invención comprende
dominios de unión a antígeno que comprenden inmunotoxina de una
cadena, que permiten sustancialmente la misma especificidad de unión
que el anticuerpo B-Ly1 murino (por ejemplo
polipéptidos que comprenden las CDRs del anticuerpo
B-Ly1 murino) y que además comprenden un polipéptido
toxina. Las inmunotoxinas de una cadena de la invención pueden
utilizarse para tratar el carcinoma humano in vivo.
De manera similar, puede utilizarse una proteína
de fusión que comprende por lo menos la región ligante de antígeno
de una ABM de la invención a por lo menos una parte funcionalmente
activa de una segunda proteína que presenta actividad antitumoral,
por ejemplo una linfoquina u oncostatina, para el tratamiento del
carcinoma humano in vivo.
En un aspecto adicional, la invención puede
utilizarse en un método mejorado para tratar los trastornos
proliferativos de las células B, incluyendo el linfoma de células
B, así como una enfermedad autoinmunológica producida en su
totalidad o en parte por autoanticuerpos patogénicos, basándose en
la reducción marcad de las células B, que comprende administrar una
cantidad terapéuticamente eficaz de una ABM de la presente invención
en un sujeto humano que lo necesita. La ABM es un anticuerpo
anti-CD20 glucomanipulado con una especificidad de
unión sustancialmente igual a la del anticuerpo
B-Ly1 murino, en el que el anticuerpo es humanizado.
Entre los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunológicos
se incluyen, aunque sin limitación, trombocitopenias de tipo
inmunológico, tales como la púrpura trombocitopénica idiopática
aguda y la púrpura trombocitopénica idiopática crónica; la
dermatomiositis, la corea de Sydenham, la nefritis lupus, la fiebre
reumatoidea, los síndromes poliglandulares, la púrpura de
Henoch-Schonlein, la nefritis
post-estreptocócica, el eritema nodoso, la arteritis
de Takayasu, la enfermedad de Addison, el eritema multiforme, la
poliarteritis nodosa, la espondilitis anquilosante, el síndrome de
Goodpasture, la tromboangitis obliterante, la cirrosis biliar
primaria, la tiroiditis de Hashimoto, la tirotoxicosis, la
hepatitis activa crónica, la polimiositis/dermatomiositis, la
policondritis, el pénfigo vulgar, la granulomatosis de Wegener, la
nefropatía membranosa, la esclerosis lateral amiotrófica, la tabes
dorsal, la polimialgia, la anemia perniciosa, la glomerulonefritis
de progresión rápida y la alveolitis fibrosante; las respuestas
inflamatorias, tales como las enfermedades inflamatorias de la piel,
incluyendo la soriasis y la dermatitis (por ejemplo la dermatitis
atópica), el escleroderma sistémico y la esclerosis; las respuestas
asociadas a la enfermedad intestinal inflamatoria (tales como la
enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa); el síndrome del distrés
respiratorio (incluyendo el síndrome del distrés respiratorio
adulto, ARDS); la dermatitis, la meningitis, la encefalitis, la
uveitis, la colitis, la glomerulonefritis; las condiciones alérgicas
tales como el eccema y el asma, y otras condiciones que implican la
infiltración de células T y las respuestas inflamatorias crónicas,
la ateroesclerosis, la deficiencia de adhesión leucocitaria, la
artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistémico (SLE), la
diabetes mellitus (por ejemplo la diabetes mellitus de tipo 1 o la
diabetes mellitus insulino-dependiente), la
esclerosis múltiple, el síndrome de Reynaud, la tiroiditis
autoinmunológica, la encefalomielitis alérgica, el síndrome de
Sjörgen, la diabetes de aparición juvenil, y las respuestas
inmunológicas asociadas a la hipersensibilidad aguda y retardada
mediada por citoquinas y linfocitos T típicamente presente en la
tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, granulomatosis y
vasculitis; la anemia perniciosa (enfermedad de Addison),
enfermedades que implican la diapedesis de los leucocitos; el
trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC), el
síndrome del daño orgánico múltiple, la anemia hemolítica
(incluyendo, aunque sin limitación, la crioglobinemia o la anemia
positiva de Coombs), la miastenia grave, las enfermedades mediadas
por un complejo antígeno-anticuerpo, la enfermedad
antiglomerular de la membrana basal, el síndrome antifosfolípidico,
la neuritis alérgica, la enfermedad de Graves, el síndrome
miasténico de Lambert-Eaton, el pemfigoide bulloso,
el pémfigo, las poliendocrinopatías autoinmunológicas, la
enfermedad de Reiter, el síndrome del hombre rígido, la enfermedad
de Behcet, la arteritis de células gigantes, la nefritis de
complejo inmunológico, la nefropatía de IgA, las polineuropatías de
las IgM, la púrpura trombocitopénica inmunológica (ITP) o la
trombocitopenia autoinmunológica, etc. En este aspecto de la
invención, las ABMs de la invención se utilizan para reducir
marcadamente el número de células B normales en la sangre durante
un tiempo prolongado.
Según la práctica de la presente invención, el
sujeto puede ser humano, equino, porcino, bovino, murino, canino,
felino y aviar. Otros animales de sangre caliente también se
encuentran incluidos en la presente invención.
La invención puede utilizarse en métodos para
inhibir el crecimiento de células tumorales humanas, para tratar un
tumor en un sujeto, y para tratar una enfermedad de tipo
proliferativo en un sujeto. Estos métodos comprenden administrar en
el sujeto una cantidad eficaz de la composición de la invención.
Por lo tanto, resulta evidente que la presente
invención comprende composiciones farmacéuticas, combinaciones y
métodos para tratar carcinomas humanos, tales como el linfoma de
células B. Por ejemplo, la invención incluye composiciones
farmacéuticas para la utilización en el tratamiento de carcinomas
humanos, que comprende una cantidad farmacéuticamente activa de un
anticuerpo de la presente invención y un portador farmacéuticamente
aceptable.
Las composiciones de ABMs de la invención pueden
administrarse mediante modos convencionales de administración,
incluyendo, aunque sin limitación, las vías intravenosa,
intraperitoneal, oral, intralinfática o la administración
directamente en el tumor. Resulta preferente la administración
intravenosa.
En un aspecto de la invención, se preparan
formulaciones terapéuticas que contienen las ABMs de la invención
para el almacenamiento mediante la mezcla de un anticuerpo que
presenta el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o
estabilizantes opcionales farmacéuticamente aceptable (Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol A. (editor), 1980) en
forma de formulaciones liofilizadas o de soluciones acuosas. Los
portadores, excipientes o estabilizadores aceptables resultan no
tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones
utilizadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros
ácidos orgánicos, antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y
metionina; conservantes (tales como cloruro de
octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de
benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico o
bencílico; alquilparabenes, tales como metilparabén o
propilparabén; catecol, resorcinol, ciclohexanol,
3-pentanol y m-cresol; polipéptidos
de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos),
proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas;
polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidina;
aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina,
arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos,
incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales
como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o
sorbitol; contraiones formadores de sal, tales como sodio, complejos
metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína) y/o
surfactantes no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o
polietilenglicol (PEG).
Se describen formulaciones de ABMs
anti-CD20 ejemplares en la patente WO nº 98/56418.
Esta publicación describe una formulación multidosis líquida que
comprende 40 mg/ml de Rituximab, acetato 25 mM, trehalosa 150 mM,
alcohol bencílico al 0,9%, polisorbato 20 al 0,02% a pH 5,0, que
presenta una vida de almacenamiento mínima de dos años a una
temperatura de entre 2ºC y 8ºC. Otra formulación
anti-CD20 de interés comprende 10 mg/ml de Rituximab
en 9,0 mg/ml de cloruro sódico, 7,35 mg/ml de citrato sódico
dihidrato, 0,7 mg/ml de polisorbato 80 y agua estéril para
inyección, pH 6,5. En la presente invención, el RITUXAN® se
sustituye por una ABM de la presente invención.
Las formulaciones liofilizadas adaptadas para la
administración subcutánea se describen en la patente WO nº 97/04801.
Dichas formulaciones liofilizadas pueden reconstituirse con un
diluyente adecuado hasta una concentración elevada de proteínas y
la formulación reconstituida puede administrarse subcutáneamente en
el mamífero que debe tratarse en la presente invención.
La formulación de la presente invención también
puede contener más de un compuesto activo, según resulte necesario
para la indicación particular bajo tratamiento, preferentemente
aquéllas con actividades complementarias que no presenten efectos
adversos mutuos. Por ejemplo, puede resultar deseable proporcionar
adicionalmente un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico,
una citoquina o un agente inmunosupresor (por ejemplo uno que actúa
sobre las célula T, tal como la ciclosporina, o un anticuerpo que se
una a células T, por ejemplo uno que se una a
LFA-1). La cantidad eficaz de este otro agente
depende de la cantidad e antagonista presente en la formulación,
del tipo de enfermedad o trastorno o del tratamiento, y de otros
factores comentados anteriormente. Estos generalmente se utilizan a
las mismas dosis y por vías de administración iguales a las
utilizadas anteriormente en la presente memoria, o de entre
aproximadamente 1% y 99% de las dosis utilizadas hasta el
momento.
Los ingredientes activos también pueden
encapsularse en microcápsulas preparadas mediante, por ejemplo,
técnicas de coacervado o mediante polimerización interfacial, por
ejemplo microcápsulas de hdiroximetilcelulosa o de gelatina y
microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en
sistemas de administración coloidales de fármaco (por ejemplo
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas
y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se dan a
conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol
A. (editor), 1980.
Pueden prepararse preparaciones de liberación
sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de
liberación sostenida se incluyen las matrices semipermeables de
polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista, las
cuales se encuentran en la forma de artículos conformados, por
ejemplo películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices
de liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles (por
ejemplo poli(2-hidroxietilmetacrilato) o
poli(alcohol vinílico), poliláctidos (patente US nº
3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato,
acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros degradables de
ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOT^{TM}
(microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido
láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Las formulaciones que deben utilizarse para la
administración in vivo deben ser estériles. Esto puede
conseguirse mediante filtración a través de membranas de filtración
estéril.
Las composiciones de la invención pueden
encontrarse en una diversidad de formas de dosificación, incluyendo,
aunque sin limitación, soluciones líquidas o suspensiones,
tabletas, píldoras, polvos, supositorios, microcápsulas poliméricas
o microvesículas, lisosomas y soluciones inyectables o
infusionables. La forma preferente depende del modo de
administración y de la aplicación terapéutica.
Las composiciones de la invención también
incluyen preferentemente portadores farmacéuticamente aceptables
convencionales y adyuvantes conocidos de la técnica, tales como la
albúmina sérica humana, intercambiadores iónicos, alúmina,
lecitina, sustancias tamponadoras, tales como fosfatos, glicina,
ácido ascórbico, sorbato de potasio y sales o electrolitos, tales
como sulfato de protamina.
El modo administración y régimen de dosificación
más eficaces para las composiciones farmacéuticas de la presente
invención dependen de la severidad y curso de la enfermedad, de la
salud y respuesta al tratamiento del paciente y del criterio del
médico responsable. Por consiguiente, las dosis de las composiciones
deben titularse para el paciente individual. Sin embargo, una dosis
eficaz de las composiciones de la presente invención generalmente
se encontrará comprendida en el intervalo de entre aproximadamente
0,01 y aproximadamente 2.000 mg/kg.
Las moléculas indicadas en la presente memoria
pueden encontrarse en una diversidad de formas de dosificación,
incluyendo, aunque sin limitación, soluciones líquidas o
suspensiones, tabletas, píldoras, polvos, supositorios,
microcápsulas poliméricas o microvesículas, liposomas y soluciones
inyectables o infusionables. La forma preferente depende del modo
de administración y de la aplicación terapéutica.
La composición que comprende una ABM de la
presente invención se formula, se dosifica y se administración de
un modo consistente con la buena praxis médica. Entre los factores a
considerar en el presente contexto se incluyen la enfermedad o
trastorno particular bajo tratamiento, el mamífero particular
tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa de
la enfermedad o trastorno, el sitio de administración del agente,
el método de administración, la programación de la administración y
otros factores conocidos por el médico clínico. La cantidad
terapéuticamente eficaz del antagonista que debe administrarse se
encontrará regulada por dichas consideraciones.
A modo general, la cantidad terapéuticamente
eficaz del anticuerpo administrado parenteralmente por dosis se
encontrar comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y
20 mg/kg de peso corporal del paciente al día, encontrándose
comprendido el intervalo típico inicial de antagonista utilizado en
el intervalo de entre aproximadamente 2 y 10 mg/kg.
En una realización preferente, la ABM es un
anticuerpo, preferentemente un anticuerpo humanizado. Las dosis
adecuadas para dicho anticuerpo no conjugado son, por ejemplo, de
entre aproximadamente 20 mg/m^{2} y aproximadamente 1.000
mg/m^{2}. En una realización, la dosis del anticuerpo difiere de
la recomendada actualmente para el RITUXAN®. Por ejemplo, puede
administrarse en la paciente una o más dosis de sustancialmente
menos de 375 mg/m^{2} del anticuerpo, por ejemplo en el caso de
que la dosis se encuentre comprendida en el intervalo de entre
aproximadamente 20 mg/m^{2} y aproximadamente 250 mg/m^{2}, por
ejemplo entre aproximadamente 50 mg/m^{2} y aproximadamente 200
mg/m^{2}.
Además, puede administrarse una o más dosis
iniciales del anticuerpo, seguido de una o más dosis posteriores,
en donde la dosis en mg/m^{2} del anticuerpo en la dosis o dosis
posteriores excede la dosis en mg/m^{2} del anticuerpo en la
dosis inicial o dosis iniciales del anticuerpo. Por ejemplo, la
dosis inicial puede encontrarse comprendida en el intervalo de
entre aproximadamente 20 mg/m^{2} y aproximadamente 250 mg/m^{2}
(por ejemplo entre aproximadamente 50 mg/m^{2} y aproximadamente
200 mg/m^{2}) y la dosis posterior puede encontrarse comprendida
en el intervalo de entre aproximadamente 250 mg/m^{2} y
aproximadamente 1.000 mg/m^{2}.
Sin embargo, tal como se ha indicado
anteriormente, estas cantidades sugeridas de ABMs se encuentran muy
supeditas al criterio terapéutico. El factor clave en la selección
de una dosis y programación apropiadas es el resultado obtenido,
tal como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, las dosis
relativamente más latas pueden resultar necesarias inicialmente
para el tratamiento de enfermedades continuas y agudas. Para obtener
los resultados más eficaces, dependiendo de la enfermedad o
trastorno, el antagonista se administra tan pronto como se observe
el primer indicio, diagnóstico, aparición o incidencia de la
enfermedad o trastorno, o durante remisiones de la enfermedad o
trastorno.
La ABM de la presente invención se administra
mediante cualquier medio, incluyendo las vías parenteral,
subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, si se
desea para el tratamiento inmunosupresor local, por vía
intralesional. Entre las infusiones parenterales se incluyen las
vías intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o
subcutánea. Además, el antagonista puede administrarse
convenientemente mediante infusión pulsada, por ejemplo con dosis
decrecientes del antagonista. Preferentemente, la dosificación se
proporciona mediante inyecciones, más preferentemente inyecciones
intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la
administración es breve o crónica.
Pueden administrarse otros compuestos, tales
como agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, agentes
inmunosupresores y/o citoquinas con los antagonistas de la presente
invención. La administración combinada incluye la coadministración
utilizando formulaciones separadas o una única formulación
farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden,
en donde preferentemente transcurre un periodo de tiempo durante el
que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus
actividades biológicas.
Resulta evidente que la dosis de la composición
de la invención necesaria para conseguir curas puede reducirse
adicionalmente optimizando la programación.
Según la práctica de la invención, el portador
farmacéutico puede ser un portador lipídico. El portador lipídico
puede ser un fosfolípido. Además, el portador lipídico puede ser un
ácido graso. Además, el portador lipídico puede ser un detergente.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un detergente es
cualquier sustancia que altera la tensión superficial de un
líquido, generalmente reduciéndola.
En un ejemplo de la invención, el detergente
puede ser un detergente no iónico. Entre los ejemplos de detergentes
no iónicos se incluyen, aunque sin limitación, polisorbato 80
(también conocido como Tween 80 o monooleato de
polioxietilensorbitán), Brij y Triton (por ejemplo Triton
WR-1339 y Triton A-20).
Alternativamente, el detergente puede ser un
detergente iónico. Un ejemplo de un detergente iónico puede ser,
aunque sin limitación, bromuro de alquiltrimetilamonio.
Además, según la invención, el portador lipídico
puede ser un liposoma. Tal como se utiliza en la presente
solicitud, un "liposoma" es cualquier vesícula unida a membrana
que contiene cualquier molécula de la invención o combinaciones de
las mismas.
\newpage
En las realizaciones siguientes, se mencionan
aspectos específicos que resultan importantes:
Ítem 1: polinucleótido aislado que
comprende:
a. una secuencia seleccionada de entre el grupo
que consiste de las secuencias SEC ID nº 5, SEC ID nº 6 y SEC ID nº
7, y
b. una secuencia seleccionada de entre el grupo
que consiste de las secuencias SEC ID nº 21, SEC ID nº 22 y SEC ID
nº 23, y
c. la secuencia SEC ID nº 24.
Ítem 2: polinucleótido aislado que comprende las
secuencias SEC ID nº8, SEC ID nº 9 y SEC ID nº 10.
Ítem 3: polinucleótido aislado según el ítem 1 ó
2, que codifica un polipéptido de fusión.
Ítem 4: polinucleótido aislado que comprende la
secuencia SEC ID nº 3.
Ítem 5: polinucleótido aislado que comprende la
secuencia SEC ID nº 4.
Ítem 6: polinucleótido aislado según el ítem 4 ó
5, en el que dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de
fusión.
Ítem 7: polinucleótido aislado que comprende una
secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80% con la
secuencia SEC ID nº 3, en donde dicho polinucleótido aislado
codifica un polipéptido de fusión.
Ítem 8: polinucleótido aislado que comprende una
secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80% con la
secuencia SEC ID nº 4, en donde dicho polinucleótido aislado
codifica un polipéptido de fusión.
Ítem 9: polinucleótido aislado que
comprende:
a. una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta la secuencia SEC ID nº 1, y
b. una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta la secuencia de una región Fc de anticuerpo, o un
fragmento del mismo, de una especie que no es el ratón.
Ítem 10: polinucleótido aislado que
comprende:
a. una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta la secuencia SEC ID nº 2, y
b. una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta la secuencia de una región Fc de anticuerpo, o un
fragmento del mismo, de una especie que no es el ratón.
Ítem 11: polinucleótido aislado codificante de
un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 1.
Ítem 12: polinucleótido aislado codificante de
un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 2.
Ítem 13: polinucleótido aislado que comprende la
secuencia SEC ID nº 11.
Ítem 14: polinucleótido aislado que comprende la
secuencia SEC ID nº 12.
Ítem 15: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80% con la
secuencia SEC ID nº 11 o con la secuencia SEC ID nº 12.
Ítem 16: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 85% con la
secuencia SEC ID nº 11 o con la secuencia SEC ID nº 12.
Ítem 17: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 90% con la
secuencia SEC ID nº 11 o con la secuencia SEC ID nº 12.
Ítem 18: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 95% con la
secuencia SEC ID nº 11 o con la secuencia SEC ID nº 12.
Ítem 19: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 99% con la
secuencia SEC ID nº 11 o con la secuencia SEC ID nº 12.
Ítem 20: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que codifica un polipéptido que presenta la secuencia
SEC ID nº 13 (aminoácidos de cadena pesada).
Ítem 21: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que codifica un polipéptido que presenta la secuencia
SEC ID nº 14 (aminoácidos de cadena ligera).
Ítem 22: polinucleótido aislado que
comprende:
a. una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta la región VH del anticuerpo B-Ly1
murino, o variantes del mismo, y
b. una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta la secuencia de una región Fc de anticuerpo, o un
fragmento del mismo, de una especie que no es el ratón.
Ítem 23: polinucleótido aislado que
comprende:
a. una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta la región VL del anticuerpo B-Ly1
murino, o variantes del mismo, y
b. una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta la secuencia de una región Fc de anticuerpo, o un
fragmento del mismo, de una especie que no es el ratón.
Ítem 24: vector de expresión que comprende un
polinucleótido aislado según cualquiera de los ítems 1 a 23.
Ítem 25: vector según el ítem 24, en el que
dicho vector es policistrónico.
Ítem 26: célula huésped que comprende el vector
de vector según el ítem 24.
Ítem 27: célula huésped que comprende un
polinucleótido aislado según cualquiera de los ítems 1 a 23.
Ítem 28: polipéptido que comprende una secuencia
derivada del anticuerpo B-Ly1 murino y una secuencia
derivada de un polipéptido heterólogo.
Ítem 29: molécula ligante de antígeno que
comprende el polipéptido según el ítem 28.
Ítem 30: molécula ligante de antígeno según el
ítem 29, que se une a CD20 humano.
Ítem 31: molécula ligante de antígeno según el
ítem 29, que es un anticuerpo.
Ítem 32: molécula ligante de antígeno según el
ítem 31, que es un anticuerpo quimérico.
Ítem 33: molécula ligante de antígeno según el
ítem 32, que es un anticuerpo humanizado.
Ítem 34: molécula ligante de antígeno según el
ítem 31, que es un anticuerpo primatizado.
Ítem 35: polipéptido quimérico que comprende la
secuencia SEC ID nº 1 o una variante de la misma.
Ítem 36: polipéptido quimérico que comprende la
secuencia SEC ID nº 2 o una variante de la misma.
Ítem 37: polipéptido quimérico que
comprende:
a. un polipéptido que presenta una secuencia
seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC
ID nº 15, SEC ID nº 16 y SEC ID nº 17, y
b. un polipéptido que presenta una secuencia
seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC
ID nº 25, SEC ID nº 26 y SEC ID nº 27, y
c. la secuencia SEC ID nº 28.
Ítem 38: polipéptido quimérico según el ítem 37,
que comprende además un esqueleto de región variable de cadena
pesada, en el que dicho esqueleto comprende un residuo alanina en la
posición 71, según la numeración Kabat.
Ítem 39: polipéptido quimérico según el ítem 37,
que comprende además un esqueleto de región variable de cadena
pesada, en el que dicho esqueleto comprende un residuo arginina en
la posición 94, según la numeración Kabat.
Ítem 40: polipéptido quimérico que comprende las
secuencias SEC ID nº 18, SEC ID nº 19 y SEC ID nº 20.
Ítem 41: polipéptido aislado que comprende la
secuencia SEC ID nº 13 o una variante de la misma.
Ítem 42: polipéptido aislado que comprende la
secuencia SEC ID nº 14 o una variante de la misma.
Ítem 43: polipéptido aislado según cualquiera de
los ítems 35 a 40, en donde dicho polipéptido es un polipéptido de
fusión.
Ítem 44: molécula ligante de antígeno que
comprende el polipéptido aislado según el ítem 43.
Ítem 45: molécula ligante de antígeno según el
ítem 44, en donde dicha molécula ligante de antígeno es un
anticuerpo.
Ítem 46: anticuerpo según el ítem 45, en donde
dicho anticuerpo es un anticuerpo primatizado.
Ítem 47: anticuerpo según el ítem 45, en donde
dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
Ítem 48: molécula ligante de antígeno según el
ítem 44, en donde dicha molécula ligante de antígeno es un
fragmento de anticuerpo.
Ítem 49: fragmento de anticuerpo según el ítem
48, en donde dicho fragmento de anticuerpo se ha primatizado.
Ítem 50: molécula ligante de anticuerpo según el
ítem 48, en donde dicho fragmento de anticuerpo se ha
humanizado.
Ítem 51: molécula ligante de antígeno, que es
capaz de competir con el anticuerpo B-Ly1 murino
para la unión de CD20, en donde dicha molécula ligante de
anticuerpo es quimérica.
Ítem 52: molécula ligante de antígeno según el
ítem 51, en donde dicha molécula ligante de antígeno es un
anticuerpo.
Ítem 53: molécula ligante de antígeno según el
ítem 52, en donde dicho anticuerpo se ha primatizado.
Ítem 54: molécula ligante de antígeno según el
ítem 51, en donde dicho anticuerpo recombinante se ha
humanizado.
Ítem 55: molécula ligante de antígeno según el
ítem 51, en donde dicho anticuerpo recombinante comprende una
región Fc humana.
Ítem 56: molécula ligante de antígeno según el
ítem 55, en donde dicha región Fc humana es una región Fc de IgG
humana.
Ítem 57: molécula ligante de antígeno según
cualquiera de los ítems 29 a 34 ó 44 a 56, presentando dicha
molécula ligante de antígeno una región Fc con oligosacáridos
modificados.
Ítem 58: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde dicha región Fc ha sido modificada para presentar
un número reducido de residuos de fucosa en comparación con la
molécula ligante de antígeno no modificada.
Ítem 59: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde dicha región Fc ha sido modificada para presentar
un número reducido de residuos de fucosa en comparación con la
molécula ligante de antígeno no modificada.
Ítem 60: molécula ligante de antígeno según el
ítem 59, en donde dichos oligosacáridos modificados son biantenarios
complejos.
\newpage
Ítem 61: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde dichos oligosacáridos modificados presentan una
proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados
biantenarios en la región Fc de dicha molécula ligante de
antígeno.
Ítem 62: molécula ligante de antígeno según el
ítem 61, en donde dichos oligosacáridos no fucosilados biantenarios
son híbridos.
Ítem 63: molécula ligante de antígeno según el
ítem 61, en donde dichos oligosacáridos no fucosilados biantenarios
son complejos.
Ítem 64: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde por lo menos 20% de los oligosacáridos en la
región Fc de dicho polipéptido son no fucosilados biantenarios.
Ítem 65: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde por lo menos 30% de los oligosacáridos en la
región Fc de dicho polipéptido son no fucosilados biantenarios.
Ítem 66: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde por lo menos 35% de los oligosacáridos en la
región Fc de dicho polipéptido son no fucosilados biantenarios.
Ítem 67: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde por lo menos 70% de los oligosacáridos en la
región Fc de dicho polipéptido son no fucosilados biantenarios.
Ítem 68: método para producir una molécula
ligante de antígeno, que es capaz de competir con el anticuerpo
B-Ly1 murino para la unión a CD20 humano, y en el
que dicha molécula ligante de antígeno es quimérica, comprendiendo
dicho método:
a. cultivar la célula huésped según el ítem 26 ó
27 en un medio bajo condiciones que permitan la expresión de dicho
polinucleótido codificante de dicha molécula ligante de antígeno,
y
b. recuperar dicha molécula ligante de antígeno
a partir del cultivo resultante.
Ítem 69: método según el ítem 68, en el que
dicha molécula ligante de antígeno es un anticuerpo.
Ítem 70: composición farmacéutica que comprende
la molécula ligante de antígeno según cualquiera de los ítems 29 a
34 ó 46 a 67 y un portador farmacéuticamente aceptable.
Ítem 71: composición farmacéutica según el ítem
70, en donde dicha composición comprende además un portador
farmacéuticamente aceptable.
Ítem 72: composición farmacéutica según el ítem
70, en donde dicha composición comprende además un adyuvante.
Ítem 73: método de tratamiento de un trastorno
tratable mediante la reducción marcada de las células B, que
comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de
composición farmacéutica según cualquiera de los ítems 70 a 72 en
un sujeto humano que lo necesita.
Ítem 74 célula huésped manipulada para expresar
por lo menos un ácido nucleico codificante de un polipéptido que
presenta actividad de
\beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa
III en un nivel suficiente para modificar los oligosacáridos en la
región Fc de un polipéptido producido por dicha célula huésped, en
donde dicho polipéptido es una molécula ligante de antígeno según
cualquiera de los ítems 44 a 67.
Ítem 75: célula huésped según el ítem 74, en
donde dicho polipéptido que presenta actividad de
\beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa
es un polipéptido de fusión.
Ítem 76: célula huésped según el ítem 74, en
donde dicha molécula ligante de antígeno es un anticuerpo.
Ítem 77: célula huésped según el ítem 74, en
donde dicha molécula ligante de antígeno comprende una región
equivalente a la región Fc de una IgG humana.
Ítem 78: célula huésped según el ítem 74k, en
donde dicha molécula ligante de antígeno comprende una región
equivalente a la región Fc de una IgG humana.
Ítem 79: célula huésped según el ítem 74, en
donde dicha molécula ligante de antígeno producida por dicha célula
huésped muestra una afinidad de unión a receptores Fc incrementada
como resultado de dicha modifica-
ción.
ción.
Ítem 80: célula huésped según el ítem 74, en
donde dicha molécula ligante de antígeno producida por dicha célula
huésped muestra una función efectora incrementada como resultado de
dicha modificación.
Ítem 81: célula huésped según el ítem 75, en
donde dicho polipéptido de fusión comprende el dominio catalítico
de la
\beta(1,4-)-N-acetiglucosaminiltransferasa
III.
Ítem 82: célula huésped según el ítem 75, en
donde dicho polipéptido de fusión comprende además el dominio de
localización en Golgi de un polipéptido residente en Golgi
heterólogo.
Ítem 83: célula huésped según el ítem 82, en
donde dicho dominio de localización en Golgi es el dominio de
localización de la manosidasa II.
Ítem 84: célula huésped según el ítem 82, en
donde dicho dominio de localización en Golgi es el dominio de
localización de la
\beta(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa
I.
Ítem 85: célula huésped según el ítem 82, en
donde dicho dominio de localización en Golgi es el dominio de
localización de la
\beta(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa
II.
Ítem 86: célula huésped según el ítem 82, en
donde dicho dominio de localización en Golgi es el dominio de
localización de la manosidasa I.
Ítem 87: célula huésped según el ítem 82, en
donde dicho dominio de localización en Golgi es el dominio de
localización de la
\alpha(1-6)fucosiltransferasa
nuclear.
Ítem 88: célula huésped según el ítem 80, en
donde dicha función efectora incrementada es la citotoxicidad
celular mediada por Fc incrementada.
Ítem 89: célula huésped según el ítem 80, en
donde dicha función efectora incrementada es la unión incrementada
a las células NK.
Ítem 90: célula huésped según el ítem 80, en
donde dicha función efectora incrementada es la unión incrementada
a macrófagos.
Ítem 91: célula huésped según el ítem 80, en
donde dicha función efectora incrementada es la unión incrementada
a células polimorfonucleares.
Ítem 92: célula huésped según el ítem 80, en
donde dicha función efectora incrementada es la unión incrementada
a monocitos.
Ítem 93: célula huésped según el ítem 80, en
donde dicha función efectora incrementada es la señalización
directa inductora de apoptosis incrementada.
Ítem 94: célula huésped según el ítem 80, en
donde dicha función efectora incrementada es la maduración de
células dendríticas incrementada.
Ítem 95: célula huésped según el ítem 80, en
donde dicha función efectora incrementada es el cebador de células
T incrementado.
Ítem 96: célula huésped según el ítem 79, en
donde dicho receptor Fc es el receptor activador Fc\gamma.
Ítem 97: célula huésped según el ítem 79, en
donde dicho receptor Fc es el receptor Fc\gammaRIIIA.
Ítem 98: célula huésped según el ítem 74, en
donde dicha célula huésped es una célula CHO, una célula BHK, una
célula NS0, una célula SP2/0, una célula de mieloma YO, una célula
de mieloma de ratón P3X63, una célula PER, una célula PER.C6 o una
célula de hibridoma
\newpage
Ítem 99: célula huésped según el ítem 74, que
comprende además por lo menso un polinucleótido transfectado
codificante de un polipéptido según cualquiera de los ítems 28 y 35
a 41, y en donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia
codificante de una región equivalente a la región Fc de una
inmunoglobulina humana.
Ítem 100: célula huésped según el ítem 74, en
donde dicho ácido nucleico o ácidos nucleicos, codificantes de un
polipéptido que presenta actividad de
\beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa
III es un polipéptido de fusión.
Ítem 101: célula huésped según el ítem 100, en
donde dicho polipéptido que presenta actividad de
\beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa
III es un polipéptido de fusión.
Ítem 102: método para producir una molécula
ligante de antígeno que presenta oligosacáridos modificados en una
célula huésped, comprendiendo dicho método:
a. cultivar una célula huésped para expresar por
lo menos un ácido nucleico codificante de un polipéptido que
presenta actividad de
\beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa
III bajo condiciones que permiten la producción de dicha molécula
ligante de antígeno, y que permiten la modificación de los
oligosacáridos presentes en la región Fc de dicha molécula ligante
de antígeno, y
b. aislar dicha molécula ligante de antígeno, en
donde dicha molécula ligante de antígeno es capaz de competir con
el anticuerpo B-Ly1 murino para la unión a CD20 y en
donde dicha molécula ligante de antígeno o fragmento de la misma es
quimérica.
Ítem 103: método según el ítem 102, en donde
dichos oligosacáridos modificados presentan un nivel reducido de
fucosilación en comparación con los oligosacáridos no
modificados.
Ítem 104: método según el ítem 102, en donde
dichos oligosacáridos modificados son híbridos.
Ítem 105: método según el ítem 102, en donde
dichos oligosacáridos modificados son complejos.
Ítem 106: método según el ítem 102, en donde
dicho anticuerpo recombinante o fragmento del mismo producido por
dicha célula huésped presenta una proporción incrementada de
oligosacáridos no fucosilados biantenarios en la región Fc de dicho
polipéptido.
Ítem 107: método según el ítem 106, en donde
dichos oligosacáridos no fucosilados biantenarios son híbridos.
Ítem 108: método según el ítem 106, en donde
dichos oligosacáridos no fucosilados biantenarios son complejos.
Ítem 109: método según el ítem 106, en donde por
lo menos 20% de los oligosacáridos en la región Fc de dicho
polipéptido son no fucosilados biantenarios.
Ítem 110: método según el ítem 106, en donde por
lo menos 30% de los oligosacáridos en la región Fc de dicho
polipéptido son no fucosilados biantenarios.
Ítem 111: método según el ítem 106, en donde por
lo menos 35% de los oligosacáridos en la región Fc de dicho
polipéptido son no fucosilados biantenarios.
Ítem 112: molécula ligante de antígeno
manipulada para que presenta una función efectora incrementada,
producida mediante el método según cualquiera de los ítems 102 a
111.
Ítem 113: molécula ligante de antígeno según el
ítem 112, en donde dicha molécula ligante de antígeno es un
anticuerpo.
Ítem 114: anticuerpo manipulada para que
presenta una afinidad ligante de receptores Fc incrementada,
producido mediante el método según cualquiera de los ítems 102 a
111.
Ítem 115: molécula ligante de antígeno según el
ítem 114, en donde dicha molécula ligante de antígeno es un
anticuerpo.
Ítem 116: molécula ligante de antígeno según el
ítem 112, en donde dicha función efectora incrementada es
citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada.
\newpage
Ítem 117: molécula ligante de antígeno según el
ítem 112, en donde dicha función efectora incrementada es unión a
célula NK incrementada.
Ítem 118: molécula ligante de antígeno según el
ítem 112, en donde dicha función efectora incrementada es unión a
macrófagos incrementada.
Ítem 119: molécula ligante de antígeno según el
ítem 112, en donde dicha función efectora incrementada es unión a
monocitos incrementada.
Ítem 120: molécula ligante de antígeno según el
ítem 112, en donde dicha función efectora incrementada es unión a
células polimorfonucleares incrementada.
Ítem 121: molécula ligante de antígeno según el
ítem 112, en donde dicha función efectora incrementada es la
señalización directa inductora de apoptosis.
Ítem 122: molécula ligante de antígeno según el
ítem 112, en donde dicha función efectora incrementada es la
maduración incrementada de las células dendríticas.
Ítem 123: molécula ligante de antígeno según el
ítem 112, en donde dicha función efectora incrementada es el cebado
de células T incrementado.
Ítem 124: molécula ligante de antígeno según el
ítem 114, en donde dicho receptor Fc es receptor activador Fc.
Ítem 125: molécula ligante de antígeno según el
ítem 114, en donde dicho receptor Fc es receptor activador
Fc\gammaRIIIa.
Ítem 126: molécula ligante de antígeno producida
mediante el método según cualquiera de los ítems 102 a 111, en
donde dicha molécula ligante de antígeno es un fragmento de
anticuerpo que contiene la región Fc y manipulado para que presente
una función efectora incrementada.
Ítem 127: molécula ligante de antígeno producida
mediante el método según cualquiera de los ítems 102 a 111, en
donde dicha molécula ligante de antígeno es una proteína de fusión
que incluye un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 1 y
una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina y
manipulada para que presente una función efectora incrementada.
Ítem 128: molécula ligante de anticuerpo
producida mediante el método según cualquiera de los ítems 102 a
111, en donde dicha molécula ligante de antígeno es una proteína de
fusión que incluye un polipéptido que presenta una secuencia
seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID
nº 30, SEC ID nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC
ID nº 40, SEC ID nº 42, SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48,
SEC ID nº 50, SEC ID nº 52, SEC ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº
58, SEC ID nº 60, SEC ID nº 62, SEC ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC ID
nº 68, SEC ID nº 70 y SEC ID nº 72, y una región equivalente a la
región Fc de una inmunoglobulina y manipulada para que presenta una
función efectora incrementada.
Ítem 129: molécula ligante de antígeno producida
mediante el método según cualquiera de los ítems 102 a 111, en
donde dicha molécula ligante de anticuerpo es una proteína de fusión
que incluye un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 3 y
una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina y
manipulada para que presenta una función efectora incrementada.
Ítem 130: molécula ligante de antígeno producida
mediante el método según cualquiera de los ítems 102 a 111, en
donde dicha molécula ligante de antígeno es una proteína de fusión
que incluye un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 76 y
una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina y
manipulada para presenta una función efectora incrementada.
Ítem 131: composición farmacéutica que comprende
la molécula ligante de antígeno según cualquiera de los ítems 112 a
130 y un portador farmacéuticamente aceptable.
Ítem 132: composición farmacéutica que comprende
la molécula ligante de antígeno según el ítem 126 y un portador
farmacéuticamente aceptable.
Ítem 133: composición farmacéutica que comprende
la proteína de fusión según cualquiera de los ítems 127 a 130 y un
portador farmacéuticamente aceptable.
Ítem 134: método para tratar una enfermedad
tratable mediante reducción marcada de las células B, que comprende
administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula
ligante de antígeno según cualquiera de los ítems 112 a 130 en un
sujeto humano que lo necesita.
Ítem 135: polinucleótido aislado según el ítem 4
ó 5, que comprende además una secuencia codificante de una región
constante de cadena ligera o pesada de anticuerpo humano.
Ítem 136: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80%
respecto a la secuencia SEC ID nº 24, en donde dicho polinucleótido
aislado codifica un polipéptido de fusión.
Ítem 137: célula huésped que coexpresa un
polinucleótido aislado según el ítem 136 y un polinucleótido que
comprende una secuencia codificante de la región variable de una
cadena ligera de anticuerpo.
Ítem 138: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde por lo menos 50% de los oligosacáridos en la
región Fc son biantenarios.
Ítem 139: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde por lo menos 60% de los oligosacáridos en la
región Fc son biantenarios.
Ítem 140: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde por lo menos 70% de los oligosacáridos en la
región Fc son biantenarios.
Ítem 141: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde por lo menos 80% de los oligosacáridos en la
región Fc son biantenarios.
Ítem 142: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde por lo menos 90% de los oligosacáridos en la
región Fc son biantenarios.
Ítem 143: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde por lo menos 50% de los oligosacáridos en la
región Fc son no fucosilados.
Ítem 144: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde por lo menos 60% de los oligosacáridos en la
región Fc son no fucosilados.
Ítem 145: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde por lo menos 70% de los oligosacáridos en la
región Fc son no fucosilados.
Ítem 146: molécula ligante de antígeno según el
ítem 57, en donde por lo menos 75% de los oligosacáridos en la
región Fc son no fucosilados.
Ítem 147: método según el ítem 73, en donde
dicho trastorno es un linfoma de células B.
Ítem 148: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las
secuencias SEC ID nº 29, SEC ID nº 31, SEC ID nº 33, SEC ID nº 35,
SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC ID nº
45, SEC ID nº 47, SEC ID nº 49, SEC ID nº 51, SEC ID nº 53, SEC ID
nº 55, SEC ID nº 57, SEC ID nº 59, SEC ID nº 61, SEC ID nº 63, SEC
ID nº 65, SEC ID nº 67, SEC ID nº 69 y SEC ID nº 71.
Ítem 149: polinucleótido aislado según el ítem
148, en donde dicho polinucleótido aislado comprende la secuencia
nº 31.
Ítem 150: polinucleótido aislado según el ítem
148, en donde dicho polinucleótido aislado comprende la secuencia
nº 55.
Ítem 151: polinucleótido aislado según el ítem
148, en donde dicho polinucleótido aislado comprende la secuencia
nº 59.
Ítem 152: polinucleótido aislado que comprende
la secuencia SEC ID nº 75.
Ítem 153: polinucleótido aislado según el ítem
148 ó 149, en donde dicho polinucleótido aislado codifica un
polipéptido de fusión.
Ítem 154: polinucleótido aislado que
comprende:
a) una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que
consiste de las secuencias SEC ID nº 32, SEC ID nº 56 y SEC ID nº
60, y
b) una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta la secuencia SEC ID nº 76.
Ítem 155: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80%
respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste
de las secuencias SEC ID nº 29, SEC ID nº 31, SEC ID nº 33, SEC ID
nº 35, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC
ID nº 45, SEC ID nº 47, SEC ID nº 49, SEC ID nº 51, SEC ID nº 53,
SEC ID nº 55, SEC ID nº 57, SEC ID nº 59, SEC ID nº 61, SEC ID nº
63, SEC ID nº 65, SEC ID nº 67, SEC ID nº 69 y SEC ID nº 71, en
donde dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de
fusión.
Ítem 156: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80%
respecto a la secuencia SEC ID nº 75, en donde dicho polinucleótido
aislado codifica un polipéptido de fusión.
Ítem 157: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 85%
respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste
de las secuencias SEC ID nº 29, SEC ID nº 31, SEC ID nº 33, SEC ID
nº 35, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC
ID nº 45, SEC ID nº 47, SEC ID nº 49, SEC ID nº 51, SEC ID nº 53,
SEC ID nº 55, SEC ID nº 57, SEC ID nº 59, SEC ID nº 61, SEC ID nº
63, SEC ID nº 65, SEC ID nº 67, SEC ID nº 69 y SEC ID nº 71.
Ítem 158: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 85%
respecto a la secuencia SEC ID nº 75.
Ítem 159: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 90%
respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste
de las secuencias SEC ID nº 29, SEC ID nº 31, SEC ID nº 33, SEC ID
nº 35, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC
ID nº 45, SEC ID nº 47, SEC ID nº 49, SEC ID nº 51, SEC ID nº 53,
SEC ID nº 55, SEC ID nº 57, SEC ID nº 59, SEC ID nº 61, SEC ID nº
63, SEC ID nº 65, SEC ID nº 67, SEC ID nº 69 y SEC ID nº 71.
Ítem 160: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 90%
respecto a la secuencia SEC ID nº 75.
Ítem 161: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 95%
respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste
de las secuencias SEC ID nº 29, SEC ID nº 31, SEC ID nº 33, SEC ID
nº 35, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC
ID nº 45, SEC ID nº 47, SEC ID nº 49, SEC ID nº 51, SEC ID nº 53,
SEC ID nº 55, SEC ID nº 57, SEC ID nº 59, SEC ID nº 61, SEC ID nº
63, SEC ID nº 65, SEC ID nº 67, SEC ID nº 69 y SEC ID nº 71.
Ítem 162: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 95%
respecto a la secuencia SEC ID nº 75.
Ítem 163: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 99%
respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste
de las secuencias SEC ID nº 29, SEC ID nº 31, SEC ID nº 33, SEC ID
nº 35, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC
ID nº 45, SEC ID nº 47, SEC ID nº 49, SEC ID nº 51, SEC ID nº 53,
SEC ID nº 55, SEC ID nº 57, SEC ID nº 59, SEC ID nº 61, SEC ID nº
63, SEC ID nº 65, SEC ID nº 67, SEC ID nº 69 y SEC ID nº 71.
Ítem 164: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 99%
respecto a la secuencia SEC ID nº 75.
Ítem 165: polinucleótido aislado que
comprende:
a) una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que
consiste de las secuencias SEC ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC ID nº 34,
SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC ID nº 42, SEC ID nº
44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50, SEC ID nº 52, SEC ID
nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 60, SEC ID nº 62, SEC
ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC ID nº 68, SEC ID nº 70 y SEC ID nº 72,
y
b) una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta la secuencia de una región Fc de anticuerpo, o un
fragmento del mismo, de una especie que no es el ratón.
Ítem 166: polinucleótido aislado que
comprende:
a) una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta la secuencia SEC ID nº 76, y
b) una secuencia codificante de un polipéptido
que presenta la secuencia de una región Fc de anticuerpo, o un
fragmento de la misma, de una especie que no es el ratón.
Ítem 167: polinucleótido aislado codificante de
un polipéptido que presenta una secuencia seleccionada de entre el
grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC
ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC ID nº 42,
SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50, SEC ID nº
52, SEC ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 60, SEC ID
nº 62, SEC ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC ID nº 68, SEC ID nº 70 y SEC
ID nº 72.
Ítem 168: polinucleótido aislado codificante de
un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 76.
Ítem 169: polinucleótido aislado codificante de
un polipéptido que presenta una secuencia seleccionada de entre el
grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC
ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC ID nº 42,
SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50, SEC ID nº
52, SEC ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 60, SEC ID
nº 62, SEC ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC ID nº 68, SEC ID nº 70 y SEC
ID nº 72.
Ítem 170: polinucleótido aislado que comprende
una secuencia que codifica un polipéptido que presenta la secuencia
SEC ID nº 76.
Ítem 171: vector de expresión que comprende un
polinucleótido aislado según cualquiera de los ítems 148 a 170.
Ítem 172: vector según el ítem 171, en donde
dicho vector es policistrónico.
Ítem 173: célula huésped que comprende el vector
de expresión según el ítem 171.
Ítem 174: célula huésped que comprende un
polinucleótido aislado según cualquiera de los ítems 148 a 170.
Ítem 175: polipéptido humanizado que comprende
una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las
secuencias SEC ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36,
SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC ID nº 42, SEC ID nº 44, SEC ID nº
46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50, SEC ID nº 52, SEC ID nº 54, SEC ID
nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 60, SEC ID nº 62, SEC ID nº 64, SEC
ID nº 66, SEC ID nº 68, SEC ID nº 70 y SEC ID nº 72, o una variante
de las mismas.
Ítem 176: polipéptido humanizado que comprende
la secuencia SEC ID nº 76 o una variante de la misma.
Ítem 177: polinucleótido aislado codificante de
un polipéptido que presenta una secuencia seleccionada de entre el
grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC
ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC ID nº 42,
SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50, SEC ID nº
52, SEC ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 60, SEC ID
nº 62, SEC ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC ID nº 68, SEC ID nº 70 y SEC
ID nº 72, o una variante de las mismas.
Ítem 178: polipéptido aislado que comprende la
secuencia SEC ID nº 76, o una variante de la misma.
Ítem 179: polipéptido aislado según cualquiera
de los ítems 177 a 178, en donde dicho polipéptido es un polipéptido
de fusión.
Ítem 180: molécula ligante de antígeno que
comprende el polipéptido aislado según el ítem 179.
Ítem 181: molécula ligante de antígeno según el
ítem 180, en donde dicha molécula ligante de antígeno es un
anticuerpo.
Ítem 182: anticuerpo según el ítem 181, en donde
dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
Ítem 183: molécula ligante de antígeno según el
ítem 180, en donde dicha molécula ligante de antígeno es un
fragmento de anticuerpo.
\newpage
Ítem 184: molécula ligante de antígeno según el
ítem 183, en donde dicho fragmento de anticuerpo ha sido
humanizado.
Ítem 185: molécula ligante de antígeno según el
ítem 180, en donde dicha molécula ligante de antígeno es un
anticuerpo recombinante.
Ítem 186: molécula ligante de antígeno según el
ítem 185, en donde dicho anticuerpo recombinante ha sido
humanizado.
Ítem 187: molécula ligante de antígeno según el
ítem 180, en donde dicho anticuerpo recombinante comprende una
región Fc humana.
Ítem 188: molécula ligante de antígeno según el
ítem 187, en donde dicha región Fc humana es una región Fc de una
IgG humana.
Ítem 189: molécula ligante de antígeno según
cualquiera de los ítems 180 a 188, presentando dicha molécula
ligante de antígeno una región Fc con oligosacáridos
modificados.
Ítem 190: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde dicha región Fc ha sido modificada para que
presente un número reducido de residuos fucosa en comparación con
una molécula ligante de antígeno no modificada.
Ítem 191: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde dicha región Fc presenta una proporción
incrementada de oligosacáridos biantenarios.
Ítem 192: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde dichos oligosacáridos modificados son
biantenarios complejos.
Ítem 193: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde dichos oligosacáridos modificados presentan una
proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados
biantenarios en la región Fc de dicha molécula ligante de
antígeno.
Ítem 194: molécula ligante de antígeno según el
ítem 193, en donde dichos oligosacáridos no fucosilados biantenarios
son híbridos.
Ítem 195: molécula ligante de antígeno según el
ítem 193, en donde dichos oligosacáridos no fucosilados biantenarios
son complejos.
Ítem 196: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde por lo menos 20% de los oligosacáridos en la
región Fc de dichos polipéptidos son no fucosilados
biantenarios.
Ítem 197: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde por lo menos 30% de los oligosacáridos en la
región Fc de dichos polipéptidos son no fucosilados
biantenarios.
Ítem 198: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde por lo menos 35% de los oligosacáridos en la
región Fc de dichos polipéptidos son no fucosilados
biantenarios.
Ítem 199: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde por lo menos 70% de los oligosacáridos en la
región Fc de dichos polipéptidos son no fucosilados
biantenarios.
Ítem 200: método para producir una molécula
ligante de antígeno, que es capaz de competir con el anticuerpo
B-Ly1 murino para la unión a CD20 humano, y en donde
dicha molécula ligante de antígeno es quimérica, comprendiendo
dicho método:
a) cultivar la célula huésped según el ítem 173
ó 174 en un medio bajo condiciones que permiten la expresión de
dicho polinucleótido codificante de dicha molécula ligante de
antígeno, y
b) recuperar dicha molécula ligante de
antígeno.
Ítem 201: método según la reivindicación 200, en
donde dicha molécula ligante de antígeno es un anticuerpo.
Ítem 202: método según el ítem 200, en donde
dicha molécula ligante de antígeno quimérico se ha humanizado.
Ítem 203: composición farmacéutica que comprende
la molécula ligante de antígeno según cualquiera de los ítems 189 a
199 y un portador farmacéuticamente aceptable.
Ítem 204: composición farmacéutica según el ítem
203, en donde dicha composición comprende además un portador
farmacéuticamente aceptable.
Ítem 205: composición farmacéutica según el ítem
203, en donde dicha composición comprende además un adyuvante.
Ítem 206: método para tratar un trastorno
tratable mediante la reducción marcada de las células B, que
comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una
composición farmacéutica según cualquiera de los ítems 203 a 205 en
un sujeto humano que lo necesita.
Ítem 207: célula huésped manipulada para
expresar por lo menos un ácido nucleico codificante de un
polipéptido que presenta actividad de
\beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa
III en un nivel suficiente para modificar los oligosacáridos en la
región Fc de un polipéptido producido por dicha célula huésped, en
donde dicho polipéptido es una molécula ligante de antígeno según
cualquiera de los ítems 180 a 197.
Ítem 208: célula huésped según el ítem 207, en
donde dicha molécula ligante de antígeno es un anticuerpo.
Ítem 209: célula huésped según el ítem 207: en
donde dicha molécula ligante de antígeno es un anticuerpo.
Ítem 210: célula huésped según el ítem 207, en
donde dicha molécula ligante de antígeno es un fragmento de
anticuerpo.
Ítem 211: célula huésped según el ítem 207, en
donde dicha molécula ligante de antígeno comprende una región
equivalente a la región Fc de una IgG humana.
Ítem 212: célula huésped según el ítem 207, en
donde dicha molécula ligante de antígeno producida por dicha célula
huésped muestra afinidad de unión a receptores Fc incrementada como
resultado de dicha modificación.
Ítem 213: célula huésped según el ítem 207, en
donde dicha molécula ligante de antígeno producida por dicha célula
huésped muestra una función efectora incrementada como resultado de
dicha modificación.
Ítem 214: célula huésped según el ítem 208, en
donde dicho polipéptido de fusión comprende el dominio catalítico
de la
\beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa
III.
Ítem 215: célula huésped según el ítem 208, en
donde dicho polipéptido de fusión comprende además el dominio de
localización en Golgi de un polipéptido residente en Golgi
heterólogo.
Ítem 216: célula huésped según el ítem 215, en
donde dicho dominio de localización en Golgi es el dominio de
localización de la manosidasa II.
Ítem 217: célula huésped según el ítem 215, en
donde dicho dominio de localización en Golgi es el dominio de
localización de la
\beta(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa
I.
Ítem 218: célula huésped según el ítem 215, en
donde dicho dominio de localización en Golgi es el dominio de
localización de la
\beta(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa
II.
Ítem 219: célula huésped según el ítem 215, en
donde dicho dominio de localización en Golgi es el dominio de
localización de la manosidasa I.
Ítem 220: célula huésped según el ítem 215, en
donde dicho dominio de localización en Golgi es el dominio de
localización de la \alpha1,6-fucosiltransferasa
nuclear.
Ítem 221: célula huésped según el ítem 213, en
donde dicha función efectora incrementada es la citotoxicidad
celular mediada por Fc incrementada.
Ítem 222: célula huésped según el ítem 213, en
donde dicha función efectora incrementada es la unión a célula NK
incrementada.
Ítem 223: célula huésped según el ítem 213, en
donde dicha función efectora incrementada es la unión a macrófagos
incrementada.
Ítem 224: célula huésped según el ítem 213, en
donde dicha función efectora incrementada es la unión a células
polimorfonucleares incrementada.
Ítem 225: célula huésped según el ítem 213, en
donde dicha función efectora incrementada es la unión incrementada
a monocitos.
Ítem 226: célula huésped según el ítem 213, en
donde dicha función efectora incrementada es la señalización
directa inductora de apoptosis incrementada.
Ítem 227: célula huésped según el ítem 213, en
donde dicha función efectora incrementada es la maduración
incrementada de las células dendríticas.
Ítem 228: célula huésped según el ítem 213, en
donde dicha función efectora incrementada es el cebado de células T
incrementado.
Ítem 229: célula huésped según el ítem 212, en
donde dicho receptor Fc es el receptor activador Fc\gamma.
Ítem 230: célula huésped según el ítem 213, en
donde dicho receptor Fc es el receptor Fc\gammaRIIIA.
Ítem 231: célula huésped según el ítem 207, en
donde dicha célula huésped es una célula CHO, una célula BHK, una
célula NS0, una célula SP2/0, una célula de mieloma YO, una célula
de mieloma de ratón P3X63, una célula PER, una célula PER.C6 o una
célula de hibridoma.
Ítem 232: célula huésped según el ítem 207, que
comprende además por lo menos un polinucleótido transfectado
codificante de un polipéptido según cualquiera de los ítems 28 y 35
a 41, y en donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia
codificante de una región equivalente a la región Fc de una
inmunoglobulina humana.
Ítem 233: célula huésped según el ítem 207, en
donde dicho ácido o ácidos nucleicos codificantes de un polipéptido
que presenta actividad de
\beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa
III se encuentra operablemente ligado a un elemento promotor
constitutivo.
Ítem 234: célula huésped según el ítem 233, en
donde dicho polipéptido que presenta actividad de
\beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa
III es un polipéptido de fusión.
Ítem 235: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde por lo menos 50% de los oligosacáridos en la
región Fc son biantenarios.
Ítem 236: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde por lo menos 60% de los oligosacáridos en la
región Fc son biantenarios.
Ítem 237: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde por lo menos 70% de los oligosacáridos en la
región Fc son biantenarios.
Ítem 238: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde por lo menos 80% de los oligosacáridos en la
región Fc son biantenarios.
Ítem 239: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde por lo menos 90% de los oligosacáridos en la
región Fc son biantenarios.
Ítem 240: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde por lo menos 50% de los oligosacáridos en la
región Fc son no fucosilados.
Ítem 241: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde por lo menos 60% de los oligosacáridos en la
región Fc son no fucosilados.
Ítem 242: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde por lo menos 70% de los oligosacáridos en la
región Fc son no fucosilados.
Ítem 243: molécula ligante de antígeno según el
ítem 189, en donde por lo menos 75% de los oligosacáridos en la
región Fc son no fucosilados.
Ítem 244: método según el ítem 206, en donde
dicho trastorno es un linfoma de células B.
Ítem 245: polinucleótido aislado que comprende
por lo menos una región determinante de complementariedad del
anticuerpo B-Ly1 murino, o una variante o forma
truncada de la misma que contiene por lo menos los residuos
determinantes de especificidad de dicha región determinante de
complementariedad, en donde dicho polinucleótido aislado codifica
un polipéptido de fusión.
Ítem 246: polinucleótido aislado según el ítem
245, en donde dicha región determinante de complementariedad se
selecciona de entre el grupo que consiste de: [LISTA DDE TODAS LAS
SECUENCIAS DE CDR DE B-Ly1].
Ítem 247: polinucleótido aislado según el ítem
245: en donde dicho polinucleótido aislado codifica una molécula
ligante de antígeno.
Ítem 248: polinucleótido aislado que comprende
por lo menos tres regiones determinantes de complementariedad del
anticuerpo B-Ly1 murino, o variantes o formas
truncadas del mismo que contienen por lo menos los residuos
determinantes de especificidad para cada una de dichas tres regiones
determinantes de complementariedad, en donde dicho polinucleótido
aislado codifica un polipéptido de fusión.
Ítem 249: polinucleótido aislado según el ítem
248, en donde dichas regiones determinantes de complementariedad
comprenden por lo menos una secuencia seleccionada de entre el grupo
que consiste de las secuencias SEC ID nº 5, SEC ID nº 6 y SEC ID nº
7, y por lo menos una secuencia seleccionada de entre el grupo que
consiste de las secuencias SEC ID nº 21, SEC ID nº 22, SEC ID nº 23
y SEC ID nº 24, o variantes o formas truncadas de dichas secuencias
que contienen por lo menos los residuos determinantes de
especificidad para cada una de dichas regiones determinantes de
complementariedad.
Ítem 250: polipéptido aislado codificada por los
polinucleótidos aislados según cualquiera de los ítems 245 a
249.
Ítem 251: molécula ligante de antígeno que
comprende por lo menos una región determinante de complementariedad
del anticuerpo B-Ly1 murino, o una variante o forma
truncada de la misma que contiene por lo menos los residuos
determinantes de especificidad de dicha región determinante de
complementariedad, y que además comprende una secuencia derivada de
un polipéptido heterólogo.
Ítem 252: molécula ligante de antígeno según el
ítem 251, en donde dicha molécula ligante de antígeno comprende por
lo menos tres regiones determinantes de complementariedad del
anticuerpo B-Ly1 murino, o variantes o formas
truncadas de la misma que contienen por lo menos los residuos
determinantes de especificidad de cada una de dichas regiones
determinantes de complementariedad.
Ítem 253: molécula ligante de antígeno según el
ítem 252, en donde dicha molécula ligante de antígeno comprende la
región variable de una cadena ligera o pesada de anticuerpo.
Ítem 254: molécula ligante de anticuerpo según
el ítem 252, en donde dicha molécula ligante de antígeno es un
anticuerpo quimérico o humanizado.
Ítem 255: anticuerpo anti-CD20
de tipo II manipulado que presenta una ADCC incrementada como
resultado de dicha manipulación, sin pérdida sustancial de
capacidad de inducir la apoptosis de células diana.
Ítem 256: anticuerpo anti-CD20
de tipo II manipulado, según el ítem 255, en donde dicho anticuerpo
ha sido manipulado para que presente un patrón alterado de
glucosilación en la región Fc.
Ítem 257: anticuerpo anti-CD20
de tipo II manipulado según el ítem 256, en donde dicha
glucosilación alterada es un incremento de la cantidad de
oligosacáridos complejos biantenarios.
Ítem 258: anticuerpo anti-CD20
de tipo II manipulado, según el ítem 256, en donde dicha
glucosilación alterada es una reducción del número de residuos de
fucosa.
Ítem 259: anticuerpo anti-CD20
de tipo II manipulado, según el ítem 255, en donde dicho anticuerpo
ha sido manipulado para que presenta una secuencia de aminoácidos
alterada en la región Fc.
Los ejemplos a continuación explican la
invención en mayor detalle. Las preparaciones y ejemplos siguientes
se proporcionan para permitir que el experto en la materia entienda
más claramente y para la práctica de la presente invención. En
efecto, resultarán evidentes para el experto en la materia diversas
modificaciones de la invención además de las descritas en la
presente memoria, a partir de la descripción anterior y los dibujos
adjuntos.
[Nota: a menos que se indique lo contrario, las
referencias a la numeración de posiciones específicas de residuos
aminoácidos en los Ejemplos siguientes siguen el sistema de
numeración Kabat]
Se cultivaron células de hibridoma que
expresaban B-Ly1, en RPMI que contenía FBS al 10% y
L-glutamina 4 mM. Se recolectaron 6x10^{6}
células con una viabilidad >90% y se aisló el ARN total
utilizando un kit Qiagen RNeasy midi. Los ADNcs codificantes de las
cadenas ligera y pesada variables de B-Ly1 se
amplificaron mediante RT-PCR. La reacción de
RT-PCR se llevó a cabo utilizando las condiciones
siguientes: 30 minutos a 50ºC para la síntesis de la primera cadena
de ADNc, 15 minutos a 95ºC para la desnaturalización inicial, 30
ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 45ºC, 1,5 minutos a 72ºC, y
una etapa de elongación final de 10 minutos a 72ºC. El tamaño
esperado de los productos de PCR se confirmó mediante electroforesis
en gel. Los productos de PCR se clonaron en vectores de E.
coli adecuados y la secuenciación del ADN confirmó que se habían
aislado los genes codificantes de las cadenas ligera y pesada
variables.
Para la construcción de los vectores de
expresión de B-Ly1 quiméricos, se fusionaron
secuencias de señal sintéticas y sitios de restricción apropiados a
las cadenas variables mediante reacciones de PCR adicionales. Tras
una confirmación final de la secuencia de ADN correcta de las
cadenas variables, se combinaron con las regiones constantes de la
IgG1 humana correspondiente. Tras construir los genes, se clonaron
bajo el control del promotor MPSV y cadena arriba de un sitio poliA
sintético, utilizando dos vectores separados, uno para cada cadena,
resultando en los plásmidos pETR1808 (vector de expresión de cadena
pesada) y pETR1813 (vector de expresión de cadena ligera). Cada
vector portaba una secuencia OriP del EBV.
Se produjo B-Ly1 quimérico
mediante contransfección de células HEK293-EBNA con
los vectores pETR1808 y pETR1813 utilizando un enfoque de
transfección con fosfato de calcio. Se transfectaron células
HEK293-EBNA en crecimiento exponencial mediante el
método del fosfato de calcio. Las células se cultivaron como
cultivos monocapa adherentes en matraces T utilizando medio de
cultivo DMEM suplementado con FCS al 10%, y se transfectaron una vez
habían alcanzado una confluencia de entre 50% y 80%. Para la
transfección de un matraz T75, se sembraron 8 millones de células
24 horas antes de la transfección en 14 ml de medio de cultivo DMEM
suplementado con FCS (al 10% v/v final), 250 \mug/ml de neomicina
y las células se introdujeron a 37ºC en un incubador con un
atmósfera de 5% de CO_{2} durante la noche. Para la transfección
de cada matraz T75, se preparó una solución de ADN, CaCl_{2} y
agua mediante la mezcla de 47 \mug de ADN total de vector plásmido
dividido igualmente entre los vectores de expresión de cadena
ligera y de cadena pesada, 235 \mul de una solución de CaCl_{2}
1 M, y adición de agua hasta un volumen final de 469 \mul. A esta
solución se añadieron 469 \mul de HEPES 50 mM, NaCl 280 mM,
solución de Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM a pH 7,05, se mezcló
inmediatamente durante 10 segundos y se dejó reposar a temperatura
ambiente durante 20 segundos. La suspensión se diluyó con 12 ml de
DMEM suplementado con FCS al 2%, y se añadió a T75 en lugar del
medio existente. Las células se incubaron a 37ºC, 5% de CO_{2},
durante aproximadamente 17 a 20 horas, después el medio se sustituyó
con 12 ml de DMEM, FCS al 10%. Para la producción de anticuerpo no
modificado "chB-Ly1", las células se
transfectaron únicamente con vectores de expresión de los
anticuerpo pETR1808 y pETR1813 en una proporción 1:1. Para la
producción del anticuerpo glucomanipulado
"chB-LY1-ge", las células se
cotransfectaron con cuatro plásmidos, dos para la expresión de
anticuerpos (pETR1808 y pETR1813), uno para la expresión de
polipéptido GnTIII de fusión (pETR1519) y uno para la expresión de
manosidasa II (pCLF9) a una proporción de 4:4:1:1, respectivamente.
El día 5 después de la transfección, se recolectó el sobrenadante,
se centrifugó durante 5 minutos a 1.200 rpm, seguido de una segunda
centrifugación durante 10 minutos a 4.000 rpm y se almacenó a
4ºC.
Se purificaron chB-Ly1 y
chB-Ly1-ge a partir del sobrenadante
de cultivo utilizando tres etapas cromatográficas secuenciales,
cromatografía de proteína A, cromatografía de intercambio catiónico
y una etapa de cromatografía por exclusión de tamaños en una
columna Superdex 200 (Amersham Pharmacia) intercambiando el tampón
por solución salina tamponada con fosfato y recogiendo el pico de
anticuerpo monomérico de esta última etapa. Se estimó la
concentración de anticuerpo utilizando un espectrofotómetro a partir
de la absorbancia a 280 nm.
Se liberaron enzimáticamente los oligosacáridos
de los anticuerpos mediante digestión con PNGasaF, encontrándose
los anticuerpos inmovilizados sobre una membrana de PVDF o en
solución.
La solución digerida resultante que contenía los
oligosacáridos liberados se preparó directamente para el análisis
de MALDI/TOF-MS o se digirió adicionalmente con
glucosilada EndoH previamente a la preparación de muestras para el
análisis de MALDI/TOF-MS.
Se humectaron pocillos de una placa de 96
pocillos preparada con una membrana de PVDF (Immobilon P, Millipore,
Bedford, Massachusetts) con 100 \mul de metanol y el líquido se
pasó a través de la membrana de PVDF utilizando vacío aplicado al
colector de vacío Multiscreen (Millipore, Bedford, Massachusetts).
Las membranas de PVDF se lavaron tres veces con 300 \mul de agua.
A continuación, los pocillos se lavaron con 50 \mul de tampón RCM
(urea 8 M, Tris 360 mM, EDTA 3,2 mM, pH 8,6). Se cargaron entre 30 y
40 \mug de anticuerpo en un pocillo que contenía 10 \mul de
tampón RCM. El líquido en el pocillo se pasó a través de la membrana
mediante la aplicación de un vacío, y la membrana posteriormente se
lavó dos veces con 50 \mul de tampón RCM. La reducción de los
puentes disulfuro se llevó a cabo mediante la adición de 50 \mul
de ditiotreitol 0,1 M en RCM e incubación a 37ºC durante 1
hora.
Tras la reducción, se aplicó un vacío para
eliminar la solución de ditiotreitol del pocillo. Los pocillos se
lavaron tres veces con 300 \mul de agua antes de llevar a cabo la
carboximetilación de los residuos de cisteína mediante la adición
de 50 \mul de ácido yodoacético 0,1 M en tampón RCM y la
incubación a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30
minutos.
Tras la carboximetilación, los pocillos se
aspiraron al vacío y se lavaron seguidamente tres veces con 300
\mul de agua. A continuación, la membrana de PVDF se bloqueó para
evitar la adsorción de la endoglucosidasa, mediante la incubación
de 100 \mul de una solución acuosa al 1% de polivinilpirrolidona
360 a temperatura ambiente durante 1 hora. Seguidamente, el
reactivo de bloqueo se eliminó mediante vacío suave seguido de tres
lavados con 300 \mul de agua.
Los oligosacáridos N-ligados se
liberaron mediante la adición de 2,5 mU de
péptido-N-glucosidasa F
(N-glicanasa recombinante, GLYKO, Novato, CA) y 0,1
mU de sialidasa (GLYKO, Novato, CA) para eliminar cualquier residuo
monosacárido cargado potencial, en un volumen final de 25 \mul en
NaHCO_{3} 20 mM, pH 7,0). Se llevó a cabo la digestión durante 3
horas a 37ºC.
Se mezclaron entre 40 y 50 \mug de anticuerpo
con 2,5 mU de PNGasaF (Glyko, U.S.A.) en Tris 2 mM, pH 7,0, en un
volumen final de 25 microlitros, y la mezcla se incubó durante 3
horas a 37ºC.
Los oligosacáridos liberados con PNGasaF se
digirió posteriormente con endoglucosidasa H (EC 3.2.1.96). Para la
digestión con EndoH, se añadieron 15 mU de EndoH (Roche, Suiza) al
digerido con PNGasaF (método de anticuerpo en solución,
anteriormente), proporcionando un volumen final de 30 microlitros, y
la mezcla se incubó durante 3 horas a 37ºC. La EndoH corta entre los
residuos de N-acetilglucosamina del núcleo
quitobiosa de los oligosacáridos N-ligados. El
enzima únicamente puede digerir oligomanosa y la mayoría de glicanos
de tipo híbrido, mientras que nos oligosacáridos de tipo complejo no
resultan hidrolizados.
Se incubaron los digeridos enzimáticos que
contenían los oligosacáridos liberados durante 3 horas adicionales
a temperatura ambiente tras la adición de ácido acético hasta una
concentración final de 150 mM, y posteriormente se pasaron a través
de 0,6 ml de resina de intercambio catiónico (resina
AG50W-X8, forma hidrógeno, malla 100 a 200, BioRad,
Suiza) empaquetada en una columna de cromatografía
micro-bio-spin (BioRad, Suiza) para
eliminar los cationes y las proteínas. Se aplicó un microlitro de la
muestra resultante a una placa diana de acero inoxidable y se
mezcló en la placa con 1 \mul de matriz sDHB. La matriz sDHB se
preparó mediante la disolución de 2 mg de ácido
2,5-dihidroxibenzoico más 0,1 mg de ácido
5-metoxisalicílico en 1 ml de etanol/cloruro sódico
acuoso 10 mM 1:1 (v/v). Las muestras se secaron al aire, se
aplicaron 0,2 \mul de etanol y las muestras finalmente se dejaron
recristalizar al
aire.
aire.
El espectrómetro de masas
MALDI-TOF utilizado para obtener los espectros de
masas fue un Voyager Elite (Perspective Biosystems). El instrumento
se operó en la configuración lineal, con una aceleración de 20 kV y
un retardo de 80 ns. Se utilizó la calibración eterna utilizando
estándares oligosacáridos para la asignación de masas de los iones.
Los espectros de 200 pulsos de láser se sumaron para obtener el
espectro final.
Se distribuyeron alícuotas de 495 \mul de
sangre heparinizada de un donante sano en tubos de poliestireno de
5 ml; se añadieron 5 \mul de muestras de anticuerpo concentradas
100 veces (concentración final: 1 a 1.000 ng/ml) o de PBS, y los
tubos se incubaron a 37ºC. Tras 24 horas, se transfirieron 50 \mul
de sangre a un tubo nuevo y se tiñeron con
anti-CD3-FITC,
anti-CD19-PE y
anti-CD45-CyChrome
(Becton-Dickinson) durante 15 minutos a temperatura
ambiente en la oscuridad. Antes del análisis, se añadieron 500
\mul de tampón FACS (PBS que contenía FCS al 2% y EDTA 5 mM) a
los tubos. La fluorescencia de CD3-FITC y de
CD19-PE de las muestras de sangre se analizó
mediante citometría de flujo fijando un umbral en
CD45-CyChrome. Se determinó la reducción marcada de
las células B dibujando un gráfico de la proporción entre células B
CD19^{+} y células T CD3^{+}.
Se transfirieron 500.000 en 180 \mul de tampón
FACS (PBS que contenía FCS al 2% y EDTA 5 mM) a 5 ml de tubos de
poliestireno y se añadieron 20 \mul de muestra de anticuerpo
anti-CD20 concentrado 10 veces (concentración
final: 1 a 5.000 ng/ml) o PBS solo, y los tubos se incubaron a 4ºC
durante 30 minutos. Posteriormente, se lavaron las muestras dos
veces con tampón FACS y se peletizaron a 300xg durante 3 minutos. Se
separó el sobrenadante mediante aspiración y se introdujeron las
células en 100 \mul de tampón FACS y 1 \mul de fragmentos
F(ab')_{2}-FITC específicos
anti-Fc (Jackson Immuno Research Laboratories, USA)
y los tubos se incubaron a 4ºC durante 30 minutos. Las muestras se
lavaron dos veces con tampón FACS y se introdujeron en 500 \mul de
tampón FACS que contenía 0,5 \mug/ml de PI para el análisis
mediante citometría de flujo. La unión se determinó dibujando un
gráfico de la media geométrica de la fluorescencia frente a las
concentraciones de anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una búsqueda del marco de
anticuerpo aceptor de homología elevada mediante el alineamiento de
la secuencia de la proteína B-Ly1 de ratón con una
colección de secuencias de línea germinal humana y seleccionando la
secuencia humana que mostraba la identidad de secuencia más elevada.
En este análisis se seleccionó la secuencia VH1_10 de la base de
datos VBase como la secuencia de marco aceptor de cadena pesada, y
se seleccionó la secuencia VK_2_40 como el marco aceptor para la
cadena ligera. En estos dos marcos aceptores se injertaron las tres
regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de los dominios
variables de cadenas pesada y ligera de ratón. Debido a que la
región del marco 4 no es parte de la región variable del gen V de la
línea germinal, el alineamiento para esta posición se realizó
individualmente. Se seleccionó la región JH4 para la cadena pesada,
y se seleccionó la región JK4 para la cadena ligera. El modelado
molecular del dominio de inmunoglobulina diseñado reveló un punto
que potencialmente requería los residuos aminoácidos murinos en
lugar de los humanos en el exterior de la CDR. La reintroducción de
residuos aminoácidos murinos en el marco humano generaría las
denominadas retromutaciones. Por ejemplo, el residuo aminoácido
aceptor humano en la posición Kabat 27 se retromutó a un residuo
tirosina. Se diseñaron variantes de anticuerpo humanizado que
incluían u omitían las retromutaciones. La cadena ligera de
anticuerpo humanizado no requirió ninguna retromutación. Tras
diseñar las secuencias de las proteínas, se sintetizaron las
secuencias de ADN codificantes de estas proteínas, tal como se
detalle posteriormente.
Con el fin de evitar la introducción de
retromutaciones en posiciones de residuos aminoácidos críticos
(críticos para conservar una buena afinidad de unión a antígeno o
funciones del anticuerpo) del marco aceptor humano, se investigó si
podían sustituirse la región marco 1 completa (FR1) o las regiones
marco 1 (FR1) y 2 (FR2) por secuencias de anticuerpo humano que ya
presentaban los residuos donantes, o residuos funcionalmente
equivalentes, en aquellas posiciones importantes en la secuencia de
la línea germinal humana natural. Con este fin, se alinearon
individualmente los marcos 1 y 2 de VH de la secuencia de
B-Ly1 de ratón con las secuencias de la línea
germinal humana. No resultaba importante la identidad de secuencia
más elevada y no se utilizó para seleccionar los marcos aceptores,
sino que, por el contrario, se supuso que resultaba más importante
hacer corresponder varios residuos críticos. Aquellos residuos
críticos comprendían los residuos 24, 71 y 94 (numeración Kabat) y
también aquellos residuos en las posiciones 27, 28 y 30 (numeración
Kabat), que se encuentran fuera de la definición de CDR1 según
Kabat, sino que con frecuencia se encuentran implicados en la unión
de antígenos. La secuencia IMGT de VH3_3_15 se seleccionó como una
adecuada. Tras diseñar las secuencias de las proteínas, se
sintetizaron las secuencias de ADN codificantes de las mismas, tal
como se detalla posteriormente. Utilizando este enfoque, no
resultaron necesarias retromutaciones ni para la cadena ligera ni
para la cadena pesada para conservar buenos niveles de unión a
antígenos.
Tras diseñar la secuencia de aminoácidos de la
región V del anticuerpo humanizado, debía generarse la secuencia de
ADN. Se encontraron los datos de secuencias de ADN de las regiones
marco individuales en las bases de datos de secuencias de línea
germinal humanas. Se obtuvo la secuencia de ADN de las regiones CDR
de los datos de ADNc murino correspondiente. Con estas secuencias,
se ensambló virtualmente la secuencia completa de ADN. Con estos
datos de secuencia de ADN, se introdujeron sitios de restricción
diagnósticos en la secuencia virtual, mediante la introducción de
mutaciones silenciosas, creando sitios de reconocimiento para las
endonucleasas de restricción. Para obtener la cadena de ADN física,
se llevó a cabo la síntesis génica (por ejemplo Wheeler et
al., 1995). En este método, se diseñaron oligonucleótidos a
partir de genes de interés, de manera que, se derivó una serie de
oligonucleótidos a partir de la cadena codificante y otra serie a
partir de la cadena no codificante. Los extremos 3' y 5' de cada
oligonucleótido (excepto el primero y el último en la fila) siempre
muestran secuencias complementarias a dos cebadores derivados de la
cadena opuesta. Al introducir estos oligonucleótidos en un tampón de
reacción adecuado para cualquier polimerasa termoestable, y añadir
Mg^{2+}, dNTPs y una ADN polimerasa, se extendió cada
oligonucleótido desde su extremo 3'. El extremo 3' recién formado de
un cebador seguidamente se hibridó con el siguiente cebador de la
cadena opuesta, y extiende su secuencia adicionalmente bajo
condiciones adecuadas para la elongación de la cadena de ADN
dependiente de molde. El producto final se clonó en un vector
convencional para la propagación en
E. coli.
E. coli.
Se añadieron secuencias líder de cadenas pesada
y ligera humanas (para la secreción) cadena arriba de las
secuencias de región variable anteriormente indicadas y éstas
seguidamente se unieron cadena arriba de las secuencias de cadenas
pesada y ligera constantes kappa de IgG1 humana, respectivamente,
utilizando técnicas estándares de biología molecular. Las
secuencias de ADN de cadenas pesada y ligera de anticuerpo completo
se subclonaron en vectores de expresión de mamífero (uno para la
cadena ligera y uno para la cadena pesada) bajo el control del
promotor MPSV y cadena arriba del sitio poliA sintético, conteniendo
cada vector una secuencia OriP del EBV, tal como se describe en el
Ejemplo 1, anteriormente. Se produjeron anticuerpos tal como se ha
descrito en el Ejemplo 1, anteriormente, es decir, mediante
cotransfección de HEK293-EBNA con los vectores de
expresión de cadenas pesada y ligera de anticuerpo de mamífero,
recolectando el medio de cultivo condicionado 5 a 7 días después de
la transfección y purificando los anticuerpos secretados mediante
cromatografía de afinidad de proteína A, seguido de cromatografía
de intercambio catiónico y una etapa cromatográfica final de
exclusión por tamaño para aislar los anticuerpos IgG1 monoméricos
puros. Los anticuerpos se formularon en fosfato sódico 25 mM,
cloruro sódico 125 mM, solución de glicina 100 mM de pH 6,7. Las
variantes glucomanipuladas de las variantes de anticuerpo
humanizado se produjeron mediante cotransfección de los vectores de
expresión de anticuerpo conjuntamente con un vector de expresión de
glucosiltransferasa GnT-III, o conjuntamente con un
vector de expresión GnT-III más un vector de
expresión de manosidasa II del Golgi, tal como se describe para el
anticuerpo quimérico en el Ejemplo 1, anteriormente. Se purificaron
los anticuerpos glucomanipulados y se formularon tal como se ha
descrito anteriormente para los anticuerpos no glucomanipulados. Los
oligosacáridos unidos a la región Fc de los anticuerpos se
analizaron mediante MALDI/TOF-MS tal como se indica
posteriormente.
Se mezclaron entre 40 y 50 \mug de anticuerpo
con 2,5 mU de PNGasaF (Glyko, U.S.A.) en Tris 2 mM, pH 7,0, en un
volumen final de 25 microlitros, y la mezcla se incubó durante 3
horas a 37ºC.
Los digeridos enzimáticos que contenían los
oligosacáridos liberados se incubaron durante 3 horas adicionales a
temperatura ambiente tras la adición de ácido acético hasta una
concentración final de 150 mM, y posteriormente se pasaron a través
de 0,6 ml de resina de intercambio catiónico (resina
AG50W-X8, forma hidrógeno, malla 100 a 200, BioRad,
Suiza) empaquetada en una columna de cromatografía
micro-bio-spin (BioRad, Suiza) para
eliminar los cationes y las proteínas. Se aplicó un microlitro de la
muestra resultante en una placa diana de acero inoxidable, y se
mezcló en la placa con 1 \mul de matriz sDHB. La matriz sDHB se
preparó mediante disolución de 2 mg de ácido
2,5-dihidroxibenzoico más 0,1 mg de ácido
5-metoxisalicílico en 1 ml de etanol/solución
acuosa de cloruro sódico 10 mM 1:1 (v/v). Las muestras se secaron al
aire, se aplicaron 0,2 \mul de etanol y las muestras se dejaron
finalmente recristalizar al aire.
El espectrómetro de masas
MALDI-TOF utilizado para obtener los espectros de
masas era un Voyager Elite (Perspective Biosystems). El instrumento
se operó en la configuración lineal, con una aceleración de 20 kV y
un retardo de 80 ns. Se utilizó la calibración externa utilizando
estándares oligosacáridos para la asignación de masas de los iones.
Los espectros de 200 pulsos de láser se sumaron para obtener el
espectro final.
Las variantes de anticuerpo humanizado
monomérico purificado se sometieron a ensayo para la unión a CD20
humano en células diana de linfoma de células B Raji utilizando un
ensayo de tipo citometría de flujo, tal como se ha descrito para el
anticuerpo B-Ly1 quimérico en el Ejemplo 1,
anteriormente.
Se aislaron células NK humanas a partir de
células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién aisladas
aplicando una selección negativa enriqueciendo para las células
positivas para CD16 y para CD56 (MACS System, Miltenyi Biotec GmbH,
Bergisch Gladbach/Alemania). La pureza determinada a partir de la
expresión de CD56 se encontraba comprendida entre 88% y 95%. Se
incubaron en PBS sin iones de calcio ni de magnesio (3x10^{5}
células/ml) células NK recién aisladas durante 20 minutos a 37ºC
para eliminar las IgGs asociadas a células NK. Las células se
incubaron a una densidad de 10^{6} células/ml a diferentes
concentraciones de anticuerpo anti-CD20 (0, 0,1,
0,3, 1, 3, 10 \mug/ml) en PBS, BSA al 0,1%). Tras varios lavados,
se detectó la unión de anticuerpos mediante incubación con
F(ab')_{2} conjugado con FITC-IgG
específica de F(ab')_{2} antihumano de cabra 1:200
(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA/USA) y CD56
antihumano-PE (BD Biosciences, Allschwil/Suiza). Se
añadieron fragmentos F(ab')_{2} 3G8
anti-Fc\gammaRIIIA (Ancell, Bayport, MN/USA) a una
concentración de 10 \mug/ml para competir con la unión de las
glucovariantes de anticuerpo (3 \mug/ml). La intensidad de
fluorescencia referente a las variantes de anticuerpo unidas se
determinó para las células positivas para CD56 en un FACSCalibur (BD
Biosciences, Allschwil/Suiza). Se transfectaron células CHO mediante
electroporación (280 V, 950 \muF, 0,4 cm) con un vector de
expresión codificante de las cadenas \alpha y \gamma de
Fc\gammaRIIIA-Va1158. Se seleccionaron los
transfectantes mediante la adición de 6 \mug/ml de puromicina y
los clones estables se analizaron mediante FACS utilizando 10
\mul de anticuerpo monoclonal 3G8
anti-Fc\gammaRIII conjugado con FITC (BD
Biosciences, Allschwil/Suiza) para 10^{6} células. La unión de
IgG1 a células CHO expresantes de
Fc\gammaRIIIA-Val158 se llevó a cabo análogamente
a la unión de células NK tal como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron células mononucleares de sangre
periférica humana (PBMC) como células efectoras y se prepararon
utilizando Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc.,
St. Louis, MO63178, USA) y siguiendo esencialmente las
instrucciones del fabricante. En breve, se obtuvo sangre venosa de
voluntarios utilizando jeringas heparinizadas. Se diluyó la sangre
1:0,75-1,3 con PBS (que no contenía Ca^{++} ni
Mg^{++}), se añadió en una capa sobre
Histopaque-1077. Se centrifugó el gradiente a 400xg
durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) sin interrupciones.
Se recogió la interfase que contenía las PBMCs y se lavó con PBS (50
ml para las células de dos gradientes) y se recolectó mediante
centrifugación a 300xg durante 10 minutos a RT. Tras la suspensión
del pellet con PBS, se contaron las PBMCs y se lavaron una segunda
vez mediante centrifugación a 200xg durante 10 minutos a RT. A
continuación, se resuspendieron las células en el medio apropiado
para los procedimientos posteriores.
La proporción de efector a diana utilizada para
los ensayos de ADCC era de 25:1 y de 10:1 para las células PBMC y
NK, respectivamente. Las células efectoras se prepararon en medio
AIM-V a la densidad apropiada con el fin de añadir
50 \mul por pocillo de placas de 96 pocillos de fondo redondo. Las
células diana eran células de linfoma B humanas (por ejemplo
células Raji) cultivadas en DMEM que contenía FCS al 10%. Las
células diana se lavaron en PBS, se contaron y se resuspendieron en
AIM-V a una densidad de 0,3 millones por ml con el
fin de añadir 30.000 células en 10 \mul por micropocillo. Los
anticuerpos se diluyeron en AIM-V, se añadieron en
50 \mul a las células diana presembradas y se dejó que se uniesen
a las dianas durante 10 minutos a RT. A continuación, se añadieron
las células efectoras y la placa se incubó durante 4 horas a 37ºC en
una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO_{2}. Se evaluó
la eliminación de las células diana mediante medición de la
liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) de células dañadas
utilizando el kit de detección de citotoxicidad (Roche Diagnostics,
Rotkreuz, Suiza). Tras la incubación de 4 horas, las placas se
centrifugaron a 800xg. Se transfirieron 100 \mul del sobrenadante
de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano
transparente. Se añadieron 100 \mul de tampón sustrato de color
del kit a cada pocillo. Se determinaron los valores de V_{max} en
un lector de ELISA a 490 nm durante por lo menos 10 minutos
utilizando software SOFTmax PRO (Molecular Devices, Sunnyvale,
CA94089, USA). Se determinó la liberación máxima de pocillos que
contenían únicamente células diana y Triton X-100 al
1%. Se calculó el porcentaje de eliminación mediada por anticuerpos
específicos, de la manera siguiente:
((x-SR)/(MR-SR)*100, en donde x es
la media de V_{max} a una concentración de anticuerpo específica,
SR es la media de la V_{max} de la liberación espontánea y MR es
la media de la V_{max} de la liberación máxima.
\vskip1.000000\baselineskip
Se contaron las células diana, se lavaron con
PBS, se resuspendieron en AIM-V (Invitrogen) a una
densidad de 1 millón de células por ml. Se sembraron 50 \mul de
células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano. Se
prepararon diluciones de los anticuerpos en AIM-V y
se añadieron en alícuotas de 50 \mul a las células. Se dejó que
los anticuerpos se uniesen a las células durante 10 minutos a
temperatura ambiente. Se descongeló inmediatamente complemento
sérico humano (Quidel), se diluyó 3 veces con AIM-V
y se añadió en alícuotas de 50 \mul a los pocillos. Se preparó
complemento de conejo (Cedarlane Laboratories) tal como describe el
fabricante, se diluyó 3 veces con AIM-V y se añadió
en alícuotas de 50 \mul a los pocillos. Como control, se
calentaron fuentes de complemento durante 30 minutos a 56ºC antes de
la adición al ensayo.
Se incubaron placas de ensayo durante 2 horas a
37ºC. Se determinó la eliminación de las células mediante la
medición de la liberación de LDH. Brevemente, las placas se
centrifugaron a 300xg durante 3 minutos. Se transfirieron 50 \mul
de sobrenadante por pocillo a una nueva placa de 96 pocillos y se
añadieron 50 \mul del reactivo de ensayo del kit de citotoxicidad
(Roche). Una medición cinética con el lector ELISA determinó la
V_{max} correspondiente a la concentración de LDH en el
sobrenadante. Se determinó la liberación máxima mediante incubación
de las células en presencia de Triton X-100 al
1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la reducción marcada de las
células B normales de sangre completa con los anticuerpos
anti-CD20 tal como se ha descrito en el Ejemplo 1,
anteriormente.
Se sometió a ensayo la potencia apoptótica de
los anticuerpos mediante la incubación del anticuerpo a una
concentración de 10 \mug/ml (condiciones saturantes respecto a la
unión de antígeno) con las células diana (a una concentración de
células diana de 5x10^{5} células/ml) durante la noche (16 a 24
horas). Las muestras se tiñeron con AnnV-FITC y se
analizaron mediante FACS. El ensayo se realizó por triplicado.
La detección se llevó a cabo mediante citometría
de flujo mediante el seguimiento de la apariencia de marcadores
apoptóticos tales como la anexina V y fosfatidilserina. El control
negativo (sin inducción de apoptosis) no contenía anticuerpos, sino
únicamente solución salina tamponada con fosfato. El control
positivo (apoptosis máxima) contenía 5 micromolar del inductor
fuerte de apoptosis camptotecina (CPT).
La comparación entre la unión al antígeno CD20
humano de las variantes de anticuerpo B-HH1,
B-HH2, B-HH3, acomplejadas con la
cadena ligera de B-Ly1 quimérico (mVL, tal como se
ha descrito en el Ejemplo 1, anteriormente) o con la cadena ligera
de B-Ly1 humanizado (KV1), y el anticuerpo
chB-ly1 quimérico parental (descrito en el Ejemplo
1, anteriormente) muestra que todos los anticuerpos presentan un
valor de EC_{50} similar, pero que el constructo
B-HH1 se une con una intensidad/estequiometría más
baja que las variantes B-HH2 y B-HH3
(figura 11). B-HH1 puede distinguirse de
B-HH2 y de B-HH3 por sus regiones
CDR1 y CDR2 parcialmente humanas (definición de Kabat), así como
por el polimorfismo Ala/Thr en la posición 28 (numeración Kabat).
Esto indica que la posición 28, la CDR1 completa y/o la CDR2
completa resultan importantes para la interacción
anticuerpo/antígeno.
La comparación entre B-HL1,
B-HH1 y el anticuerpo parental
chB-ly1 quimérico mostró la ausencia de actividad
de unión en el constructo B-HL1, y aproximadamente
la mitad de intensidad/estequiometría de unión en comparación con
B-ly1 (figura 12). Tanto B-HL1 como
B-HH1 están diseñados basándose en los marcos
aceptores derivados de la clase VH1 humana. Entre otras
diferencias, la posición 71 (numeración Kabat: la posición 71 de
Kabat corresponde a la posición 72 de la secuencia SEC ID nº 48)
del constructo B-HL1 es una diferencia notable,
indicando su importancia putativa para la unión de antígenos.
Al comparar los datos de unión de antígeno de
las figuras 9 a 13, las variantes BHH2-KV1,
BHLB-KV1 y BHL11-KV1 muestran la
mejor afinidad de unión, entre las diferentes variantes de
anticuerpo humanizado sometidas a ensayo, para la CD20 humana sobre
la superficie de las células humanas. Las diferentes entre
B-HH2, por una parte, y B-HL8 y
B-HL1, por la otra, se localizan en las regiones FR1
y FR2 únicamente, siendo idénticas las tres CDRs (comparar, por
ejemplo, las secuencias SEC ID nº 32, 56 y 60, que no se encuentran
numeradas según Kabat, pero cuya numeración Kabat puede ser
fácilmente determinada por el experto ordinario en la materia).
B-HL8 y B-HL11 derivan sus
secuencias FR1 y FR2 de la clase VH3 humana, mientras que el marco
completo de B-HH2 se deriva de VH1 humano.
B-HL11 es un derivado de B-HL8 con
la única mutación Glu1Gln (la posición 1 es la misma tanto en la
numeración Kabat como en el sistema convencional de numeración
utilizado en el listado de secuencias), mientras que Gln es el
residuo aminoácido en el constructo B-HH2. Esto
significa que el intercambio Glu1Gln no altera ni la afinidad ni la
intensidad de unión. Las otras diferencias entre
B-HH2 y B-HL8 son 14 residuos del
marco, de entre los que uno o más presentará una influencia sobre el
comportamiento de unión a antígeno de este anticuerpo.
El constructo B-HL4 se deriva
del anticuerpo B-HH2 mediante la sustitución del FR1
del B-HH2 por el FR1 de la secuencia VH1_45 de la
línea germinal humana. Este constructo muestra una capacidad de
unión a antígeno que se ha reducido mucho, a pesar de presentar
diferentes aminoácidos en sólo tres posiciones dentro del FR1.
Estos residuos se encuentran localizados en las posiciones 2, 14 y
30 (numeración Kabat). De éstas, la posición 30 podría ser una
posición influyente, debido a que es parte de la definición de
Chothia de la CDR1. El análisis global de todas las curvas de unión
de las figura 9 a 13 indica que los residuos siguientes de la cadena
pesada de B-ly1 humanizado (numeración Kabat)
resultan importantes para la unión a CD20: N35 (extremo de CDR1 de
Kabat), CDR1 de Kabat completo, CDR2 de Kabat completo y CDR3 de
Kabat completo, residuos A71 y R94 (en este caso, R94 no puede
sustituirse por una treonina) e Y27. A28 y S30 también contribuyen
en menor grado. Además, la CDR3 de Kabat y todos los residuos
canónicos resultan importantes para la unión a antígeno. No se
introdujeron retromutaciones en la cadena ligera humanizada, que
presentaba las CDR1, CDR2 y CDR3 de Kabat injertadas. Para la
inducción de apoptosis (figuras 14, 15 y 21), la variante más
potente era la variante de B-ly1 humana
BHH2-KV1 (todavía más potente que
chB-ly1 original y mucho más potente que un
anticuerpo con una secuencia idéntica al Rituximab, C2B8). Otras
variantes humanizadas (derivados de BHL8) que pueden recuperar la
apoptosis incrementada son: B-HL12 a
B-HL17 (ver la Tabla) y BHHI (marcos mixtos) y BHH9
("marcos mixtos" con una retromutación, S30T). Las posiciones
9 y 48 (numeración Kabat) pueden entrar en contacto con el antígeno.
Las variantes BHH4 a BHH7 son otras variantes humanizadas de
B-ly1 que no introducen secuencias no humanas
adicionales.
Son propiedades importantes del anticuerpo
B-ly1 humanizado son que es un anticuerpo
anti-CD20 de tipo II según se define en Cragg M.S.
y Glennie M.J., Blood 103(7):2738-2743 (abril
de 2004). Por lo tanto, no indujo, tras la unión a CD20, ninguna
resistencia significativa a la extracción con detergentes no iónicos
de CD20 de la superficie de células humanas CD20^{+}, utilizando
el ensayo descrito para este fin en Polyak M.J. y Deans J.P., Blood
99(9):3256-3262, 2002. Definitivamente indujo
significativamente menos resistencia a la extracción con detergente
no iónico de CD20 que el anticuerpo C2B8 (otro anticuerpo
anti-CD20 con una secuencia idéntica al Rituximab,
ver la publicación de patente US nº 2003/0003097, de Reff). Tal como
se esperaba de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II,
el B-ly1 humanizado no presentaba ninguna actividad
significativa de lisis mediada por el complemento y claramente una
actividad de lisis mediada por el complemento más alta que la del
anticuerpo anti-CD20 C2B8 (IgG1 quimérica con
secuencia idéntica al Rituximab). Otra propiedad importante del
anticuerpo B-ly1 humanizado era que resultaba muy
potente en el ensayo de agregación homotípica. En este ensayo, se
incubaron células humanas CD20-positivas, células
Daudi, en medio de cultivo celular durante hasta 24 horas a 37ºC en
una atmósfera con 5% de CO_{2} en un incubador de células de
mamífero, tal como se describe en detalle en (referencia de Deans),
con el anticuerpo a una concentración de 1 microgramo por ml y en
paralelo a una concentración de 5 microgramos por ml. A título de
comparación, se realizó una incubación paralela, de control, de las
células bajo condiciones idénticas, aunque utilizando el anticuerpo
anti-CD20 C2B8. En diferentes puntos del tiempo,
incluyendo las 8 horas y las 24 horas de incubación, las células se
inspeccionaron visualmente utilizando un microscopio. Se encontró
que el anticuerpo B-ly1 humanizado conducía a una
fuerte agregación homotípica, con agregados significativamente más
grandes que los inducidos por la adición del anticuerpo de control
C2B8. Además, y consistentemente con que el anticuerpo fuese
anti-CD20 de tipo II, indujo niveles más altos de
apoptosis al incubar células humanas CD20-positivas
con el anticuerpo B-ly1 humanizado en comparación
con un control bajo condiciones idénticas utilizando el anticuerpo
IgG1 quimérico C2B8 con secuencia idéntica al Rituximab.
Se produjeron variantes glucomanipuladas de los
anticuerpos humanizados mediante coexpresión de la
glucosiltransferasa GnTIII, conjuntamente con los genes de
anticuerpo, en células de mamífero. Esto condujo a un incremento de
la fracción de oligosacáridos no fucosilados unidos a la región Fc
de los anticuerpos, incluyendo oligosacáridos no fucosilados
biantenarios, tal como se ha descrito en la patente WO nº
2004/065540 (figuras 17 a 19). Los anticuerpos glucomanipulados
presentaban niveles significativamente más altos de unión a
receptores Fc\gammaRIII humano (figura 20) y también de actividad
de ADCC (figura 16) en comparación con el anticuerpo no
glucomanipulado y con el anticuerpo C2B8. El anticuerpo
B-ly1 humanizado también era más potente en la
inducción de la reducción marcada de las células B humanas en un
ensayo de sangre completa (figura 16) que el anticuerpo de control
C2B8. Esto era verdad tanto para el anticuerpo B-ly1
no glucompanipulado como para la versión glucomanipulada del mismo.
El anticuerpo glucomanipulado era aproximadamente 1.000 veces más
potente que el anticuerpo anti-CD20 de control C2B8
en la reducción marcada de las células B en el ensayo de sangre
completa. Esta comparación resulta importante tanto para las formas
humanizadas no glucomanipuladas como para las glucomanipuladas del
anticuerpo B-lyl, debido a que mostró que, en
ensayos que combinaban actividades dependientes del receptor Fc,
tales como la ADCC, más la lisis mediada por el complemento, más la
inducción de apoptosis, ambas formas de B-ly1 eran
significativamente más potentes que C2B8, aunque ambas formas de
B-ly1 reducían drásticamente la actividad de lisis
mediada por el complemento. La ADCC, las actividades de eliminación
celular dependientes del receptor Fc y la inducción de apoptosis se
encontraban presentes en esta actividad superior de las variantes
humanizadas del anticuerpo B-ly1. Además, en el
ensayo de apoptosis, las formas tanto glucomanipuladas como no
glucomanipuladas de este anticuerpo anti-CD20 de
tipo II eran potentes, y las variantes de Fc manipuladas de
afinidad de unión incrementada a los receptores Fc\gamma
resultaban todavía más potentes en la inducción de la apoptosis que
la variante sin manipulación de Fc, y siendo todas las variantes
significativamente más potentes que el anticuerpo de control. El
mecanismo exacto para la agregación homotípica incrementada y la
inducción de apoptosis mediada por anticuerpos
anti-CD20 de tipo II no se conoce y la unión
concomitante a otras moléculas sobre la superficie de las células
CD20-positivas, tales como los receptores
Fc\gamma, podría influir sobre esta importante propiedad. Por lo
tanto, resultaba importante demostrar que los anticuerpos
anti-CD20 de tipo II que habían sido manipulados en
su región Fc para la afinidad de unión incrementad a los receptores
Fc gamma, incluyendo Fc\gammaRIII y con un incremento asociado de
la actividad de ADCC, todavía eran capaces de inducir una apoptosis
fuerte, incluso más alta que la variante sin manipulación de Fc, y
agregación homotípica. La inducción de apoptosis es importante
debido a que in vivo existen localizaciones en el cuerpo en
las que pueden encontrarse células CD20-positivas
diana, pero en las que el acceso a las células
Fc\gammaRIII-positivas resulta más difícil que en
la sangre. Dichas localizaciones son, por ejemplo, los nódulos
linfáticos. En estas localizaciones, la inducción de la apoptosis
por el anticuerpo anti-CD20 mismo puede ser crucial
para la buena eficacia de la terapia de anticuerpo
anti-CD20 en el ser humano, tanto para el
tratamiento de malignidades hematológicas, tales como los linfomas
no de Hodgkin y la leucemia linfocítica crónica de células B, y
para el tratamiento de las enfermedades autoinmunológicas tales como
la artritis reumatoide y el lupus mediante un enfoque de reducción
marcada de las células B. La afinidad de unión incrementada a
Fc\gammaRIII y la ADCC más alta del anticuerpo humanizado
anti-CD20 de tipo II de Fc manipulada también puede
resultar un atributo muy importante para dichas terapias.
Finalmente, la actividad e lisis mediada por el complemento
reducida o negligible de este tipo de anticuerpos
anti-CD20 de tipo II, incluyendo las variantes
humanizadas y de Fc manipulada, también puede resultar importante;
una activación más alta del complemento por los anticuerpos
anti-CD20 se ha correlacionado con un incremento de
los efectos secundarios no deseables.
<110> GlycArt Biotechnology AG
\hskip1cm Umana, Pablo
\hskip1cm Bruenker, Peter
\hskip1cm Suter, Tobias
\hskip1cm Puentener, Ursula
\hskip1cm Moessner, Ekkehard
\hskip1cm Ferrara, Claudia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Molécula ligante de antígeno con
afinidad de unión a receptores Fc y función efectora incrementadas
Affinity
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1975.029PC01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 336
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 309
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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<210> 5
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<211> 15
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptactcttgga tgaac
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Mus sp.
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipggctacgcat tcagttac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
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ratón-humano
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<211> 22
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
Claims (20)
1. Anticuerpo anti-CD20 de tipo
II glucomanipulado humanizado que presenta una ADCC incrementada
como resultado de dicha glucomanipulación y que presenta una
capacidad incrementa de inducir apoptosis de células diana tras
dicha humanización, en donde dicho anticuerpo comprende una región
variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de
complementariedad (CDRs) del anticuerpo B-Ly1
murino, en el que:
a. la CDR1 de la cadena pesada es la secuencia
SEC ID nº 16,
b. la CDR2 de la cadena pesada es la secuencia
SEC ID nº 26, y
c. la CDR3 de la cadena pesada es la secuencia
SEC ID nº 28,
en donde las regiones marco (FRs) de la región
variable de cadena pesada, FR1, FR2 y FR3 de dicho anticuerpo son
secuencias FR humanas codificadas por la secuencia VH1_10 de la
línea germinal humana y la región variable FR4 de cadena pesada de
dicho anticuerpo es una secuencia FR humana codificada por la
secuencia JH4 de la línea germinal humana, y
en donde dicho anticuerpo comprende además una
región variable de cadena ligera que comprende las CDRs del
anticuerpo B-Ly1 murino, en donde:
d. la CDR1 de la cadena ligera es la secuencia
SEC ID nº 18,
e. la CDR2 de la cadena ligera es la secuencia
SEC ID nº 19, y
f. la CDR3 de la cadena ligera es la secuencia
SEC ID nº 20,
en donde las FRs de la región variable de la
cadena ligera FR1, FR2 y FR3 de dicho anticuerpo son secuencias FR
humanas codificadas por la secuencia VK_2_40 de la línea germinal
humana y la región FR4 de la región variable de la cadena ligera de
dicho anticuerpo es una secuencia FR humana codificada por la
secuencia JK4 de la línea germinal humana.
2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en
donde dicho anticuerpo comprende un polipéptido aislado que
comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de
secuencia SEC ID nº 32 o SEC ID nº 40.
3. Anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, en
donde dicho anticuerpo comprende un polipéptido aislado que
comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de
secuencia SEC ID nº 40.
4. Anticuerpo según las reivindicaciones 1 a 3,
en donde dicho anticuerpo comprende un polipéptido aislado que
comprende una secuencia de región variable de cadena ligera de
secuencia SEC ID nº 76.
5. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho anticuerpo comprende un
primer polipéptido aislado que comprende una secuencia de región
variable de cadena pesada de secuencia SEC ID nº 32 o SEC ID nº 40,
y un segundo polipéptido aislado que comprende una secuencia de
región variable de cadena ligera de secuencia SEC ID nº 76.
6. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho anticuerpo comprende un
primer polipéptido aislado que comprende una secuencia de región
variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID nº 40, y un
segundo polipéptido aislado que comprende una secuencia de región
variable de cadena ligera de secuencia SEC ID nº 76.
7. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho anticuerpo ha sido
glucomanipulado para que presente un incremento del número de
residuos de fucosa.
8. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo ha sido
glucomanipulado para presentar una reducción del número de residuos
de fucosa.
9. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, presentando dicho anticuerpo una región Fc
con oligosacáridos modificados.
10. Anticuerpo según la reivindicación 9, en
donde por lo menos 20% de los oligosacáridos en la región Fc de
dicho polipéptido son biantenarios no fucosilados.
11. Anticuerpo según la reivindicación 9, en
donde por lo menos 50% de los oligosacáridos en la región Fc son no
fucosilados.
\newpage
12. Célula huésped que expresa por lo menos un
ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad
de
\beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa
III en una cantidad suficiente para glucomanipular la región Fc de
un polipéptido producido por dicha célula huésped, en donde dicho
polipéptido es un anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11.
13. Célula huésped según la reivindicación 12,
en donde dicho anticuerpo producido por dicha célula huésped muestra
una afinidad de unión a receptores Fc incrementada como resultado de
dicha glucomanipulación.
14. Célula huésped según la reivindicación 13,
en donde dicho receptor Fc es el receptor Fc\gammaRIIIA.
15. Célula huésped según la reivindicación 12,
en donde dicho anticuerpo producido por dicha célula huésped muestra
una función efectora incrementada como resultado de dicha
glucomanipulación.
16. Célula huésped según la reivindicación 15,
en donde dicha función efectora incrementada es la señalización
directa inductora de apoptosis incrementada.
17. Célula huésped según la reivindicación 12,
que comprende además por lo menos un polinucleótido transfectado
codificante de un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 2, 3, 5 ó 6, y en donde dicho ácido nucleico
comprende una secuencia codificante de una región equivalente a la
región Fc de una inmunoglobulina humana.
18. Composición farmacéutica que comprende el
anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un
portador farmacéuticamente aceptable.
19. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 para la utilización como medicamento
destinado al tratamiento del linfoma de células B.
20. Utilización del anticuerpo según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de un medicamento
destinado al tratamiento del linfoma de células B.
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