ES2347325T3 - Metodo de produccion de proteinas. - Google Patents
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Abstract
Un método para la producción transitoria de una o más proteínas extracelulares no procedentes de plantas en un protoplasto de musgo, método que comprende los pasos de transformar transitoriamente el protoplasto con un constructo de ácido nucleico que comprende una o más secuencias nucleotídicas heterólogas codificantes de dicha o dichas proteínas no procedentes de plantas enlazadas operativamente a un promotor, y cultivar el protoplasto transformado a fin de producir dicha o dichas proteínas no procedentes de plantas, en donde dicho cultivo tiene lugar durante al menos 48 horas en un medio de cultivo seleccionado del grupo constituido por W5, 3M y MMS.
Description
Método de producción de proteínas.
La presente invención se refiere en general a
métodos y materiales para uso en la expresión de genes, y en
particular para la producción de proteína extracelular no procedente
de plantas, a partir de protoplastos de musgo.
Los sistemas de producción de proteínas
recombinantes actualmente en uso abarcan desde sistemas procariotas
tales como Escherichia coli y Bacillus, a sistemas
eucariotas tales como levadura, células de mamífero, cultivos de
células de insecto, animales transgénicos y plantas. Proteínas que
tienen modificaciones posteriores a la traducción, v.g.
glicosilación y procesamiento de puentes disulfuro, se producen
típicamente en sistemas eucariotas. Para producción en gran escala
de proteínas recombinantes se han utilizado típicamente líneas de
células u organismos transformados de manera estable (es decir,
sistemas en los cuales el ácido nucleico de interés se ha integrado
en el genoma nuclear), así como sistemas de baculovirus/células de
insecto. Por ejemplo, Schaefer et al. (1991) describen un
método para la transformación estable de Physcomitrella
patens, que comprende cultivar los protoplastos transformados
en medio 3M durante 4 a 7 días antes de regenerar la planta. El
establecimiento de dichas líneas de células u organismos
transformados establemente es un proceso que consume mucho tiempo e
intensivo en mano de obra.
La transfección de células de mamífero o células
de insecto requiere muchas horas-hombre y el uso de
equipo técnico especializado, v.g. cámaras de incubación con
CO_{2}. Ambos factores hacen muy elevado el coste de
producción.
Los sistemas de transformación transitoria
basados en plantas que se utilizan para la expresión y producción
transitoria de proteínas recombinantes están basados en la
inoculación de tejidos de plantas o plantas enteras con
agrobacterias o con partículas de virus (Vaquero et al. 1999;
Fischer et al. 1999; Fischer y Emans 2000; Dirnberger et
al. 2001). La transferencia directa de DNA en tejidos de plantas
por bombardeo con partículas se ha utilizado también como método
para testar la expresión génica antes de la transformación estable
(Fischer et al. 1999).
Los sistemas alternativos de transformación
transitoria, es decir, sistemas en los cuales el ácido nucleico de
interés no está integrado en el genoma nuclear, ofrecen un camino
hacia adelante para la expresión eficiente de proteínas heterólogas
en cantidades comerciales.
Hasta ahora, la expresión transitoria de
proteínas en protoplastos ha sido utilizada únicamente con sistemas
informadores para v.g. análisis de promotores (Zeidler et al.
1999); análisis de transducción de señales; direccionamiento y
circulación de proteínas; e interacción
proteína-proteína (Sheen 2001). Se han utilizado
ensayos de informadores en experimentos de transformación
transitoria con protoplastos para el análisis de péptidos señal para
la secreción de proteínas (v.g. De Loose et al. 1991, Denecke
et al. 1990).
La secreción de proteínas recombinantes en el
espacio extracelular (apoplasto) utilizando plantas transformadas
de manera estable (esporofito) está perfectamente caracterizada
(Magnuson et al. 1996, De Wilde et al. 1998) y a
primera vista parecía ser una herramienta útil para producción de
proteínas en plantas. La secreción de proteínas recombinantes
expresadas en cepas transgénicas de musgo transformadas de manera
estable (gametofito) directamente en el medio ha sido descrita
también (WO 01/25456 A2).
Houba-Herin et al. (1999)
describen la introducción de una citoquinina-oxidasa
(CKO) de planta (maíz) en protoplastos de musgo en un sistema de
ensayo transitorio y el análisis del papel de CKO en el desarrollo
de la planta. La doctrina del documento describe la expresión de
una citoquinina-oxidasa de planta (maíz)
correctamente plegada y glicosilada, y no propone el protoplasto de
musgo como posible sistema de producción de proteínas.
Sin embargo, la expresión y secreción
transitorias de proteínas recombinantes no procedentes de plantas
para producción de proteínas (suficiente para análisis de
proteínas, v.g. modificaciones posteriores a la traducción,
análisis MALDI-TOF) utilizando protoplastos de musgo
transformados directamente por transferencia directa de DNA mediada
por PEG no parece haber sido descrita en la técnica anterior.
Sorprendentemente, los autores de la presente
invención han encontrado que los protoplastos de musgo transformados
transitoriamente (gametofitos) son capaces de expresar niveles
altos de proteínas recombinantes no procedentes de plantas que se
secretan al medio. Los protoplastos de musgo transformados
transitoriamente pueden cultivarse en medios simples, que pueden
comprender o no componentes que son adecuados para la estabilización
de las proteínas. Adicionalmente, los protoplastos de musgo pueden
concentrarse a una alta densidad de células, lo que permite que los
mismos se transformen transitoriamente con relativa facilidad y en
números elevados para uso en sistemas en los cuales pueden
emplearse volúmenes pequeños de medio de cultivo, permitiendo la
producción de soluciones concentradas de proteínas que facilitan
los análisis ulteriores que requieren volúmenes pequeños pero
concentraciones altas de proteína (v.g. modificaciones posteriores a
la traducción).
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un método para la producción transitoria de (una) o más
proteínas extracelulares no procedentes de plantas en un protoplasto
de musgo, método que comprende los pasos de transformar
transitoriamente el protoplasto con un constructo de ácido nucleico
que comprende (a) una o más secuencias heterólogas de nucleótidos
que codifican dicha o dichas proteínas no procedentes de plantas
enlaza-
da(s) operativamente a un promotor, y cultivar el protoplasto transformado a fin de producir dicha o dichas proteínas no procedentes de plantas, en donde dicho cultivo tiene lugar durante al menos 48 horas en un medio de cultivo seleccionado del grupo constituido por W5, 3M y MMS.
da(s) operativamente a un promotor, y cultivar el protoplasto transformado a fin de producir dicha o dichas proteínas no procedentes de plantas, en donde dicho cultivo tiene lugar durante al menos 48 horas en un medio de cultivo seleccionado del grupo constituido por W5, 3M y MMS.
Aspectos particulares de la invención se
describirán a continuación con mayor detalle.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "heterólogo" se utiliza
ampliamente más adelante para indicar que el gen/secuencia de
nucleótidos en cuestión se ha (n) introducido transitoriamente en
protoplastos de musgo utilizando ingeniería genética, v.g. por
intervención humana. Una secuencia heteróloga de nucleótidos puede
comprender la secuencia codificante de una proteína de fusión
constituida por una pareja de fusión que puede estar formada, por
ejemplo, en parte por una proteína de planta que puede estar
fusionada a una proteína no procedente de plantas, lo que puede
denominarse una proteína de fusión híbrida planta : no planta para
los propósitos de la presente invención. Una proteína de fusión
híbrida de este tipo puede considerarse también como una proteína no
procedente de plantas para los propósitos de la presente invención.
Alternativamente, una proteína de fusión puede ser una que está
formada por parejas de fusión que no son de origen vegetal. Un gen
heterólogo puede aumentar la expresión de una proteína de interés a
partir de un gen endógeno equivalente, es decir uno que realiza
normalmente la misma función o una función similar, o la secuencia
insertada puede ser adicional al gen endógeno u otra secuencia. El
ácido nucleico heterólogo a una célula puede ser no existente
naturalmente en protoplastos de musgo de dicho tipo, variedad o
especie. Así, el ácido nucleico heterólogo puede comprender una
secuencia codificante de, o derivada de, un tipo particular de
organismo, tal como una especie de mamífero, v.g. de especie humana,
ovina, bovina, equina, o porcina, puesto en el contexto de un
protoplasto del musgo, tal como un protoplasto derivado de
Physcomitrella patens. Una proximidad adicional corresponde a
una secuencia de ácido nucleico a situar dentro de un protoplasto
de musgo en el cual se encuentra naturalmente la misma o un homólogo
de la misma, pero en el cual la secuencia de ácido nucleico está
enlazada y/o adyacente a un ácido nucleico que no existe
naturalmente en la célula, o células de dicho tipo o especie o
variedad de planta, por ejemplo enlazado operativamente a una o más
secuencias reguladoras, tales como una secuencia promotora, para
control de la expresión.
El término "gen", a no ser que el contexto
requiera otra cosa, se refiere a cualquier información genética que
codifica un ácido nucleico no procedente de plantas para traducción
en un péptido, polipéptido o proteína.
"Vector" se define de modo que incluye,
entre otras cosas, cualquier vector de plásmido, cósmido, fago, o
virus en forma lineal o circular bi- o monocatenaria a partir de la
cual puede ser o no auto-transmisible o
movilizable, y que puede transformar un hospedador procariota o
eucariota y existe extracromosómicamente (v.g. plásmido de
replicación autónoma con un origen de replicación). Se incluyen
específicamente vectores lanzadera por los cuales se entiende un
vehículo de DNA capaz, naturalmente o por diseño, de replicación en
dos organismos hospedadores diferentes, que pueden seleccionarse de
actinomicetos y especies afines, bacterias y células eucariotas
(v.g. plantas superiores, musgos, mamíferos, levaduras u
hongos).
"Vector de expresión" se refiere a un
vector en el cual un ácido nucleico se encuentra bajo el control de,
y enlazado operativamente a, un promotor apropiado u otros
elementos reguladores para transcripción en una célula hospedadora
tal como una célula microbiana o un protoplasto de musgo. El vector
puede ser un vector de expresión bifuncional, que funciona en
hospedadores múltiples. En el caso del DNA genómico o subgenómico,
éste puede contener su propio promotor u otros elementos
reguladores, y en el caso del cDNA éste puede encontrarse bajo el
control de un promotor apropiado u otros elementos reguladores para
expresión en la célula hospedadora.
Un "promotor" es una secuencia de
nucleótidos a partir de la cual puede iniciarse la transcripción del
DNA enlazado operativamente aguas abajo (es decir en la dirección
3' o en la cadena de sentido del DNA bicatenario).
"Enlazado operativamente" significa unido
como parte de la misma molécula de ácido nucleico, posicionada y
orientada convenientemente para que se inicie la transcripción por
el promotor.
El término "inducible", como se aplica a un
promotor, está bien entendido por los expertos en la técnica. En
esencia, la expresión bajo el control de un promotor inducible se
pone en funcionamiento o se incrementa en respuesta a un estímulo
aplicado. La naturaleza del estímulo varía entre los promotores.
Algunos promotores inducibles causan niveles escasos o
indetectables de expresión (o no causan expresión alguna) en
ausencia del estímulo apropiado. Otros promotores inducibles causan
expresión constitutiva detectable en ausencia del estímulo.
Cualquiera que sea el nivel de expresión en ausencia del estímulo,
la expresión de cualquier promotor inducible se incrementa en
presencia del estímulo correcto.
La invención abarca también el uso de una
variante de cualquiera de estas secuencias. Una proteína variante
comparte homología con, o es idéntica a, la totalidad o parte de las
secuencias arriba descritas. Hablando en términos generales,
cualquiera que sea el término que se utilice en esta memoria, las
variantes pueden ser:
- (i)
- variantes homólogas existentes naturalmente de la proteína relevante no procedente de plantas,
- (ii)
- variantes homólogas generadas artificialmente (derivados) que pueden ser preparadas por la persona experta a la vista de la presente exposición, por ejemplo por mutagénesis orientada o aleatoria, o por síntesis directa. Preferiblemente, el ácido nucleico variante, que codifica el péptido variante, se genera directa o indirectamente (v.g. por uno o más pasos de amplificación o replicación) a partir de un ácido nucleico original. Los cambios en la secuencia de ácido nucleico pueden producir un derivado por una o más operaciones de adición, inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos en el ácido nucleico, conduciendo a la adición, inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos en el polipéptido codificado. La mutación deseable puede ser mutagénesis aleatoria u orientada a fin de alterar la actividad (v.g. especificidad) o estabilidad del polipéptido codificado. Los cambios pueden tener lugar por variación conservadora, es decir sustitución de un residuo hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, tal como arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina. Se incluyen también variantes que tienen sustituciones no conservadoras. En las regiones que son críticas en la determinación de la conformación o actividad de los péptidos, tales cambios pueden conferir propiedades ventajosas al polipéptido, v.g. estabilidad o especificidad alteradas.
La semejanza u homología en el caso de las
variantes se establece preferiblemente por comparaciones de
secuencia realizadas utilizando FASTA y FASTP (véase Pearson &
Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183: 63-98). Los
parámetros se ajustan preferiblemente, utilizando la matriz por
defecto, como sigue:
- Gapopen (penalidad por el primer residuo en una laguna): -12 para proteínas/-16 para DNA
- Gapext (penalidad por residuos adicionales en una laguna): -2 para proteínas/-4 para DNA
- KTUP longitud de palabra: 2 para proteínas/6 para DNA.
La homología puede estar al nivel de la
secuencia de nucleótidos y/o la secuencia de aminoácidos codificada.
Preferiblemente, la secuencia del ácido nucleico y/o de aminoácidos
comparte al menos aproximadamente 75% u 80% de identidad, muy
preferiblemente al menos aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o
99% de identidad.
La homología puede evaluarse también por el uso
de una metodología de sondas (Sambrook et al., 1989). Una
fórmula común para calcular las condiciones de severidad requeridas
para conseguir la hibridación entre moléculas de ácido nucleico de
una homología de secuencia especificada es: T_{m} = 81,5ºC + 16,6
Log [Na+] + 0,41 (% G+C) - 0,63 (%
formamida)-600/#pb en dúplex. Como ilustración de la
fórmula anterior, utilizando [Na+] = [0,368] y 50% formamida, con
contenido de GC de 42% y un tamaño medio de sonda de 200 bases, el
valor T_{m} es 57ºC. El valor T_{m} de un dúplex de DNA decrece
en 1-1,5ºC por cada 1% de disminución de la
homología. Así, podrían observarse dianas con más de
aproximadamente 75% de identidad de secuencia utilizando una
temperatura de hibridación de 42ºC.
Como se describe más adelante, en sus diversos
aspectos, la invención se empleará generalmente sobre protoplastos
de musgo, utilizando ácidos nucleicos que codifican proteínas de
interés no procedentes de plantas.
Promotores adecuados que operan en protoplastos
de musgo incluyen el 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (35S
de CaMV). Otros ejemplos se describen en pág. 120 de Lindsey &
Jones (1989) Plant Biotechnology in Agriculture@Pub. OU Press,
Milton Keynes, Reino Unido. El promotor puede seleccionarse de modo
que incluya uno o más motivos o elementos de secuencia que
confiere(n) control de la expresión experimental y/o
regulador específico de tejido. Promotores inducibles de plantas
incluyen el promotor inducido por etanol de Caddick et al
(1998) Nature Biotechnology 16:177-180.
En caso deseado, pueden incluirse marcadores
genéticos seleccionables en el constructo, tales como los que
confieren fenotipos seleccionables tales como la resistencia a
antibióticos o herbicidas (v.g. kanamicina, higromicina,
fosfinotricina, clorsulfurón, metotrexato, gentamicina,
espectinomicina, imidazolinonas y glifosato).
La presente invención proporciona también
métodos que comprenden la introducción transitoria de tales
constructos que comprenden secuencias heterólogas apropiadas en una
célula de planta de musgo y/o la introducción de la expresión de un
constructo en una célula de planta de musgo, por aplicación de un
estímulo adecuado, v.g. un inductor exógeno eficaz. Células
adecuadas de plantas de musgo incluyen el protoplasto de musgo,
tales como los derivados de Physcomitrella patens.
El ácido nucleico puede introducirse en
protoplastos de musgo utilizando cualquier tecnología adecuada, tal
como la absorción de DNA mediada por PEG como se describe en esta
memoria, bombardeo con partículas o microproyectiles (US 5100792,
EP-A 444882,
EP-A-434616), microinyección (WO
92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green et al.
(1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press),
electroporación (EP 290395, WO 8706614 Gelvin Debeyser), otras
formas de absorción directa de DNA (DE 4005152, WO 9012096, US
4684611), absorción de DNA mediada por liposomas (v.g. Freeman
et al. Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)), o el método de
agitación vorticial (v.g. Kindle, PNAS EE.UU. 87: 1228 (1990d)
Métodos físicos para la transformación de células de plantas han
sido revisados en Oard, 1991, Biotech. Adv. 9:
1-11.
Se prefieren electroporación, absorción de DNA
mediada por PEG y absorción directa de DNA. Es especialmente
preferido el procedimiento modificado de absorción de DNA mediada
por PEG, como se describe en los ejemplos de esta memoria.
La elección particular de una tecnología de
transformación estará determinada por su eficiencia para transformar
ciertas especies de musgo, así como la experiencia y preferencia de
la persona que practique la invención con una metodología
particular de elección. Será evidente para las personas expertas que
la elección particular de un sistema de transformación transitoria
para introducir ácido nucleico en protoplastos de musgo no es
esencial para la invención. No obstante, se prefiere el uso del
sistema de transformación de DNA mediada por PEG como se describe
en esta memoria.
Así pues, diversos aspectos de la presente
invención proporcionan un método de transformación transitoria de
un protoplasto de musgo que implica la introducción de un constructo
heterólogo basado en ácido nucleico como se describe más adelante
en un protoplasto de musgo y causar o permitir la expresión
transitoria del vector, lo que da a su vez como resultado la
secreción de proteína extracelular en el medio. El cultivo de
protoplastos de una manera muy concentrada da como resultado
concentraciones de proteínas aumenta-das
eficientemente.
En un prefermento (sic) se proporciona un método
de transformación transitoria de un protoplasto de musgo por
absorción de DNA mediada por PEG y cultivo del mismo
caracterizado porque el cultivo se conduce en un volumen de
cultivo de hasta 1000 \mul. Preferiblemente, el cultivo se realiza
en un volumen de cultivo de 50-1000 \mul, más
preferiblemente de 100-600 \mul, más
preferiblemente todavía de 100-300 \mul y de modo
muy preferible en aproximadamente 200 \mul \pm 50 \mul.
Genes de interés incluyen aquéllos que codifican
proteínas de origen no vegetal que son en sí mismas, medicamentos
naturales tales como productos farmacéuticos o veterinarios.
Los ácidos nucleicos heterólogos pueden
codificar, inter alia, genes de origen bacteriano, fúngico, o
no vegetal tales como proteínas de fusión como las citadas
anteriormente en esta memoria, o de origen animal. Los polipéptidos
producidos pueden utilizarse para producir polipéptidos que pueden
purificarse a partir de ellos para uso en otro lugar. Proteínas que
pueden producirse en un proceso de la invención incluyen
heterodímeros, tales como FSH, inmunoglobulinas, anticuerpos de
fusión y anticuerpos monocatenarios.
Tales proteínas incluyen, pero sin carácter
limitante, la proteína del retinoblastoma, p53, angiostatina, y
leptina. Análogamente, los métodos de la invención pueden utilizarse
para producir proteínas reguladoras de mamífero. Otras secuencias
de interés incluyen proteínas, hormonas, tales como hormona
estimulante de los folículos, factores de crecimiento, citoquinas,
seroalbúmina, hemoglobina, colágeno, taumatina, proteínas análogas
a taumatina, factores de crecimiento epidérmico tales como VEGF,
etc.
Hablando en términos generales, los ácidos
nucleicos heterólogos pueden expresarse por cualquier proceso
apropiado utilizado en la técnica o pueden transcribirse o
expresarse como sigue:
- (i)
- expresión transitoria de DNA "desnudo", v.g. que comprende un promotor enlazado operativamente a la secuencia heteróloga de interés,
- (ii)
- expresión a partir de un vector de expresión, tal como un vector de replicación. Hablando en términos generales, los expertos en la técnica son perfectamente capaces de construir vectores y diseñar protocolos para expresión transitoria de genes recombinantes. Pueden seleccionarse o construirse vectores adecuados, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, con inclusión de secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias de poliadenilación, secuencias intensificadoras, genes marcadores y otras secuencias según sea apropiado. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, o Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.
- (iii)
- expresión de un vector no integrador que está presente al menos transitoriamente en el citoplasma.
Se entenderá que estas categorías no son
mutuamente excluyentes, por ejemplo, dado que un vector no
integrador puede ser también un vector de expresión, etc.
Métodos para conseguir dicha expresión se
exponen en otro lugar de esta memoria.
Como se ha expuesto anteriormente, los autores
de la presente invención han descubierto que la expresión
incrementada de constructos introducidos (preferiblemente a niveles
altos) en los protoplastos de un musgo, preferiblemente a densidad
de células alta, tal como Physcomitrella patens, constructos
que no están integrados en el genoma (v.g. ectópicamente) dan lugar
a mRNA transcrito. Los constructos pueden introducirse en número de
copias relativamente alto con promotores fuertes, y sin el efecto
modelador inherente que puede ocurrir cuando se selecciona un
transformante estable en el cual está integrado un constructo en el
genoma. Como resultado, los niveles y concentraciones de proteína
producidos pueden exceder con mucho de los que pueden alcanzarse
por el uso de métodos para producción de proteínas en sistemas
basados en células de plantas de la técnica anterior.
Así pues, en un aspecto de la invención, se
describe el uso de un protoplasto de musgo transformado
transitoriamente, capaz de generar mRNA que codifica una proteína
diana generada por transcripción a partir de un constructo de ácido
nucleico introducido transitoriamente, que incluye la secuencia
nucleotídica diana enlazada operativamente a un promotor,
constructo que se introduce en la célula de un organismo.
El "ácido nucleico introducido" incluirá
así la secuencia de ácido nucleico heteróloga como una secuencia de
DNA proporcionada en la forma de un constructo que es capaz de dar
lugar a la producción de proteína extracelular a un nivel elevado
con relación al nivel de producción de proteínas asociado
normalmente con la expresión de transgenes estables de dicha
secuencia de DNA. En un aspecto de la invención, la secuencia de
ácido nucleico heteróloga puede codificar una proteína que está
constituida por un péptido señal y/o un péptido de tránsito
acoplado a la secuencia de proteína o polipéptido de elección.
Así pues, en un aspecto preferido de la
invención, se describe un método para lograr la expresión
transitoria de una secuencia de nucleótidos heteróloga en una
planta, método que comprende el paso de introducir transitoriamente
en un protoplasto de musgo al menos una primera secuencia de ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga no
procedente de plantas.
En una realización, se proporciona un método de
generar al menos una proteína heteróloga extracelular no procedente
de planta, método que comprende los pasos de:
- (i)
- introducir transitoriamente en un protoplasto de un musgo un primer ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga,
- (ii)
- causar o permitir la expresión por el ácido nucleico, durante cierto periodo de tiempo, de la proteína heteróloga,
- (iii)
- cosechar la proteína heteróloga secretada a partir del medio,
- (iv)
- opcionalmente, aislar del medio los protoplastos de musgo.
Como resultado, los protoplastos de musgo pueden
utilizarse para producir continuamente las proteínas deseadas
después de cada cosecha de la proteína secretada.
El aislamiento puede hacerse por medios
totalmente convencionales, y puede incorporar o no purificación
parcial o completa.
Los protoplastos o tejidos de musgo comprenderán
generalmente células gametofitos, tales como gametofitos del musgo
Physcomitrella patens.
El periodo de tiempo para el cultivo de
protoplastos de musgo puede ser cualquier periodo hasta o incluso
más allá del periodo durante el cual el tejido se mantiene viable, o
hasta que el mismo está saturado con proteína; en general, puede
preferirse que el mismo sea entre aproximadamente 1 y 10 días, de
modo más preferiblemente entre aproximadamente 1 y 5 días.
Naturalmente, el experto en la técnica
reconocerá que puede utilizarse más de un gen en el constructo o en
cada constructo, aunque se prefiere una sola secuencia en cada caso.
Vectores múltiples (cada uno de los cuales incluye una o más
secuencias de nucleótidos que codifican la proteína heteróloga de
elección) pueden introducirse en los protoplastos de musgo por
métodos de absorción de DNA mediada por PEG como se describe en esta
memoria. Esto puede ser útil para producir, v.g. subunidades
múltiples, v.g. de una enzima.
Como se muestra en los ejemplos que siguen, la
expresión transitoria de la secuencia heteróloga cuando se
introduce de este modo puede proporcionar niveles muy altos de
polipéptido diana durante el curso del periodo de expresión
transitoria, que será generalmente de varios días, dependiendo de
los métodos y materiales precisos empleados. Por utilización de los
métodos de la invención como se describe en esta memoria, se
consigue la secreción del polipéptido heterólogo en el medio.
Así pues, la expresión transitoria en el
protoplasto de musgo representa una herramienta útil en muchos
contextos para los cuales aquélla puede haberse considerado
previamente inadecuada, v.g. la expresión fiable de secuencias de
proteínas o polipéptidos heterólogas inestables, es decir expresadas
transitoriamente, que se secretan al medio.
El método puede ser particularmente preferido en
aquellas aplicaciones en las cuales se requieren niveles de
expresión altos, pero en las cuales los constructos virales (con el
requerimiento de "infección" de la planta) o plantas
transgénicas estables son indeseables, v.g. donde es importante un
ensayo rápido, o donde la secuencia en cuestión imparte un fenotipo
letal.
El informador puede ser cualquier proteína
detectable, tal como un gen marcador, utilizado comúnmente en la
técnica tal como GUS, GFP, luciferasa, etc. Preferiblemente, el
informador es un marcador no invasivo tal como GFP o
luciferasa.
La invención se describirá a continuación con
referencia a las figuras y ejemplos no limitantes siguientes. Otras
realizaciones de la invención serán ideadas por los expertos en la
técnica a la vista de éstos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó la cepa de tipo salvaje de
Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. caracterizada
previamente por Reski et al. 1994. Se trata de un subcultivo
de la cepa 16/14 que fue recogida por H.L.K. Whitehouse en Gransden
Wood, Huntingdonshire, Reino Unido fue propagada por Engel
(1968).
\vskip1.000000\baselineskip
Cribado por PCR para secuencias
polinucleotídicas derivadas. Se cribó una biblioteca de cDNA de
Thuja occidentalis con iniciadores degenerados para clones
específicos por PCR. Para hacer esto, se diseñaron iniciadores 5'
de acuerdo con la secuencia N-terminal obtenida por
degradación de Edman (Edman y Begg G, 1967) de la proteína To32
endógena purificada, se derivaron los iniciadores 3' del motivo de
consenso de proteínas semejantes a taumatina: se utilizaron 50 ng
de la biblioteca de cDNA de Thuja occidentalis como molde en
una PCR de lectura de pruebas Pfu (Promega, Alemania; condiciones de
la PCR: 5 min, 94ºC; 30 ciclos: 30 s 94ºC/45 s 50ºC/90 s 72ºC;
extensión: 10 min) utilizando el iniciador 5'
To32N-2-S
(5'-TTYGAYATIMGIAAYCARCAYGGNTAYAC-3')
y el iniciador 3'
Thaum-Mot-2-AS
(5'-TCYTKIGSRTAGCTRTAVGCITSDGGRCA-3').
El producto PCR amplificado se purificó de acuerdo con
procedimientos estándar (véase Sambrook y Russell, 2001). Se
reamplificó 1 \mul de producto PCR diluido en relación 1/100 en
una PCR de lectura de pruebas Pfu "anidada" (Promega, Alemania;
condiciones de la PCR: 5 min, 94ºC; 30 ciclos: 30 s 94ºC/45 s
50ºC/90 s 72ºC; extensión: 10 min) con iniciador 5'
To32-N-3-S
(5'-GCNGCIGGNYTNCCNGGIGGIGGNCA-3') y
el iniciador 3'
Thaum-Mot-1-AS
(5'-CCRTCRAYIAIM
GAIAYGTCSYAGAAATC-3'). Los productos PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% (p/v) y se escindió y purificó del gel una banda de 263 pb (Quiagen, Hilden, Alemania). La banda se clonó en el vector pCR4-TOPO de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.; libro de protocolo: versión H, 072701; 25-0276) para secuenciación. En detalle: A 4 \mul de producto PCR purificado y adenilado (por extensión Taq-PCR; véase el protocolo) se añadió 1 \mul de solución salina y 1 \mul de vector TOPO. La reacción suavemente mezclada se incubó durante 5 min a la temperatura ambiente y se transformó luego en células Top10 quimiocompetentes (para el método, véase Sambrook y Russell, 2001). Los clones positivos se seleccionaron por extensión en placas LB, que contenían 50 \mug/ml de kanamicina. El vector pCRTo resultante se secuenció y contenía un fragmento de 263 pb (pb 121-384 en CDS) del cDNA de To32. A partir de esta secuencia se derivaron un nuevo iniciador 5' To32-300-1-S (5'-GGCAGGGACAAAGAAGGC-3') y un nuevo iniciador 3' To32-300-2-AS (5'-AGTGTGCAGCTCAGTTGGC-3').
GAIAYGTCSYAGAAATC-3'). Los productos PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% (p/v) y se escindió y purificó del gel una banda de 263 pb (Quiagen, Hilden, Alemania). La banda se clonó en el vector pCR4-TOPO de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.; libro de protocolo: versión H, 072701; 25-0276) para secuenciación. En detalle: A 4 \mul de producto PCR purificado y adenilado (por extensión Taq-PCR; véase el protocolo) se añadió 1 \mul de solución salina y 1 \mul de vector TOPO. La reacción suavemente mezclada se incubó durante 5 min a la temperatura ambiente y se transformó luego en células Top10 quimiocompetentes (para el método, véase Sambrook y Russell, 2001). Los clones positivos se seleccionaron por extensión en placas LB, que contenían 50 \mug/ml de kanamicina. El vector pCRTo resultante se secuenció y contenía un fragmento de 263 pb (pb 121-384 en CDS) del cDNA de To32. A partir de esta secuencia se derivaron un nuevo iniciador 5' To32-300-1-S (5'-GGCAGGGACAAAGAAGGC-3') y un nuevo iniciador 3' To32-300-2-AS (5'-AGTGTGCAGCTCAGTTGGC-3').
Para obtener la secuencia 5' ausente de To32, se
realizó una PCR de lectura de pruebas Pfu (Promega, Alemania;
condiciones de la PCR: 5 min, 94ºC; 30 ciclos: 30 s 94ºC/45 s
50ºC/90 s 72ºC; extensión: 10 min) con 50 ng de la biblioteca de
cDNA de Thuja occidentalis, el iniciador 5' T7term
(5'-CTAGTTATTGCTCAGCGG-3') y el
iniciador 3'
To32-300-2-AS (véase
arriba). El producto PCR purificado se clonó en
PCR4-TOPO de acuerdo con el protocolo del
fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.; libro de protocolo:
versión H, 072701; 25-0276) dando como resultado el
vector pCRToN, y se secuenció. Este vector contiene los primeros 295
pb del To32-CDS (pb 1-295). Para
obtener la secuencia ausente 3' de To32, se realizó una PCR de
lectura de pruebas Pfu (Promega, Alemania; condiciones de la PCR: 5
min, 94ºC; 30 ciclos: 30 s 94ºC/45 s 50ºC/90 s 72ºC; extensión: 10
min) con 50 ng de la biblioteca de cDNA de Thuja
occidentalis, el iniciador 5'
To-32-300-1-S
(véase arriba) y el iniciador 3'
pYES-2-AS
(5'-AACTAATTACATGATGCGGC-3'). El
producto PCR purificado se clonó en PCR4-TOPO de
acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA,
EE.UU.; libro de protocolo: versión H, 072701;
25-0276) dando como resultado el vector pCRToC, y se
secuenció. Este vector contiene la región 3' del
To32-CDS (pb 185-693). Las
secuencias de cDNA para To32 se solaparon en vectores pCRTo, pCRToN
y pCRToC. De este modo, pudo identificarse el CDS total para To32,
que comprendía 693 pb. Éste pudo modificarse por secuenciación de
pETTo32 (véanse los procedimientos de clonación para To32 en
pET24b(+) más adelante), que era 100% idéntico. En este caso, el
CDS que codificaba la proteína nativa se amplificó de nuevo a partir
de la biblioteca de cDNA de Thuja occidentalis.
NB para los iniciadores degenerados arriba
descritos: R = G o A; Y = C o T; W = A o T; M = A o C; K = G o T; I
= inosina; S = C o G; N = G, A, T o C.
Procedimientos de clonación para To32 en
pET24b(+) (Novagen, Madison, WI, EE.UU.). La secuencia
codificante de 615 pb de To32, que no comprendía la secuencia
codificante para el péptido conductor de 26 aminoácidos, se
amplificó a partir de la biblioteca de Thuja occidentalis por
PCR de lectura de pruebas Pfu (Promega, Alemania) utilizando
el iniciador de aguas arriba
To32Nterm-BamH1-S
(5'-CGG GAT CCA GTG AAG TTT AAT ATA CGG AAC
C-3') y el iniciador de aguas abajo
To32Cterm-EcoRI1-AS
(5'-CGG AAT TCG GGC AGA ATA CGA TAC TGT AGT
C-3'). Después de restricción del producto de
amplificación resultante con EcoRI y BamH1, se clonó el mismo
en el vector de expresión procariota pET24b (+), dando como
resultado pETTo32.
Procedimientos de clonación para To32 en
pGEX-4T-1. La secuencia de cDNA
de 615 pb se amplificó a partir de pETTo32. Un producto PCR
restringido con EcoRI/XhoI se clonó en
pGEX-4T-1, utilizando los
iniciadores P33
(5'-ATCGAATTCGTGAAGTTTAATATACGG-3')
and P34
(5'-GTCCTCGAGTTAGGGGCAGAATACGATAC-3'),
dando como resultado pGEXTo32.
Procedimientos de clonación para To32 en
pKSTo32. Una secuencia de cDNA de 150 pb que codificaba el
término N de To32 (con inclusión de la secuencia de 78 pb que
codificaba el péptido de señal To32) se amplificó a partir de
pCRToN utilizando los iniciadores P72 (5'-GTC GAA
TTC ATG GCC ACA GTT TCA GAT C-3') y P74
(5'-AAG CAG CTG GAC CAG GGT CAG
AC-3'). El producto PCR restringido con
EcoRI/PvuII se clonó en pKs (digerido con
EcoRI/NotI), en una ligación de un solo tubo que
incluía un fragmento de 546 pb digerido con
PvuII/NotI derivado de pGEXTo32, dando como
resultado pKSTo32. pKSTo32 contenía la secuencia de
cDNA de la proteína To32 semejante a taumatina con inclusión de la
secuencia codificante del péptido señal.
Procedimientos de clonación para To32 en
pRT101To32. Se amplificó el cDNA de To32 a partir del plásmido
pKsTo32 utilizando los iniciadores MoB254 (5'-ATA
CTC GAG GAA GAT GGC CAC AGT TTC-3') y P73
(5'-GTC GGA TCC TTA CTT GTC GTC GTC ATC CTT GTA GTC
GGG GCA GAA TAC GAT ACT G-3') por PCR de lectura de
pruebas Pfu (Promega, Alemania; condiciones de la PCR: 2 min, 94ºC;
25 ciclos: 30 s 94ºC/30 s 54ºC/2 min 72ºC; extensión: 10 min).
Después de restricción del producto de amplificación resultante con
XhoI y BamHI se clonó el mismo en pRT101 (Töpfer
et al. 1987; digerido con XhoI/BamHI). El
plásmido resultante contenía el cDNA de To32 (con inclusión de
secuencias codificantes del péptido señal de To32 y el epítope FLAG
C-terminal) (posicionado aguas abajo del promotor
35S de CaMV y terminado por el terminador CaMV. Este plásmido se
designó pRT101To32.
El cDNA del factor de crecimiento endotelial
vascular humano 121 (VEGF_{121}) sin la secuencia conductora se
escindió como un fragmento NdeI-SalI a partir de
pCYTEXP-VEGF_{121} (proporcionado amablemente por
el Dr. McCarthy, GBF, Braunschweig, Alemania). Este fragmento se
hizo romo por la reacción de Klenow y se introdujo en pRT101
(Töpfer et al. 1987) en el sitio de restricción SmaI
para formar el plásmido pRT101VEGF C3. En este constructo, se
dispuso el cDNA de VEGF_{121} sin la secuencia conductora aguas
abajo del promotor 35S de CaMV y se terminó por medio del
terminador CaMV (Gorr, 1999).
La secuencia para el péptido señal VEGF (señal
de clasificación para la secreción) se clonó en pRT101VEGF C3. Se
amplificó el cDNA del péptido señal a partir del plásmido pRT101 P21
(Gorr, 1999) utilizando el iniciador 5' MoB323
5'-ATA CTC GAG GAA GAT GAA CTT TTC TGC CTG TCT
TGG-3') que contenía un sitio de restricción
XhoI y el iniciador 3' MoB349 5'-CTG CCA TGG
GTG CAG CCT GGG ACC AC-3' que contenía el sitio de
restricción NcoI. El DNA amplificado se digirió con
XhoI y NcoI y ligó en pRT101VEGF C3 (digerido con
XhoI/NcoI) dando como resultado pRT101TPVEGF C3. El
plásmido resultante contenía las secuencias codificantes para
péptido el señal VEGF y VEGF_{121} en marco bajo control del
promotor 35S de CaMV.
La secuencia para el péptido señal VEGF (señal
de clasificación para la secreción) sin los tres nucleótidos del
terminal 3' (que causaban una deleción del último aminoácidos
(término C) del péptido de tránsito) se clonó en pRT101VEGF C3. El
cDNA del péptido señal se amplificó a partir del plásmido pRT101 P21
(Gorr, 1999) utilizando el iniciador 5' MoB323
5'-ATA CTC GAG GAA GAT GAA CTT TTC TGC CTG TCT
TGG-3' que contenía un sitio de restricción
XhoI y el iniciador 3' MoB350 5'-CTG CCA TGG
GTG CAG CCT GGG ACC ACT TGG-3' que contenía el
sitio de restricción NcoI y la deleción 3'. El DNA
amplificado se digirió con XhoI y NcoI y se ligó en
pRT101VEGF C3 (digerido con XhoI/NcoI) dando como
resultado pRT101TPVEGF-1 C3. El plásmido resultante
contenía las secuencias codificantes para el péptido señal VEGF con
inclusión de la deleción 3' y VEGF_{121} en marco bajo control
del promotor 35S de CaMV.
La secuencia para el péptido señal To32 de la
proteína semejante a taumatina (señal de clasificación para la
secreción) se clonó en pRT101VEGF C3. El cDNA del péptido señal se
amplificó a partir del plásmido pCRToN (pTo63) utilizando el
iniciador 5' MoB254 5'-ATA CTC GAG GAA GAT GGC CAC
AGT TTC AGA TC-3' que contenía un sitio de
restricción XhoI y el iniciador 3' MoB250
5'-CTG CCA TGG GTG CTG CTC CCG CCT
CT-3' que contenía el sitio de restricción
NcoI. El DNA amplificado se digirió con XhoI y
NcoI y se ligó a pRT101VEGF C3 (digerido con
XhoI/NcoI) dando como resultado pRT101TPTo32 C3. El
plásmido resultante contenía las secuencias codificantes del
péptido señal To32 y VEGF_{121} en marco bajo control del promotor
35S de CaMV.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia para el péptido señal To32 de la
proteína semejante a taumatina (señal de clasificación para la
secreción) sin los tres nucleótidos del terminal 3' (que causaban
una deleción del último aminoácido (término C) del péptido de
tránsito) se clonó en pRT101VEGF C3. El cDNA del péptido señal se
amplificó a partir del plásmido pCRToN (pTo63) utilizando el
iniciador 5' MoB254 5'-ATA CTC GAG GAA GAT GGC CAC
AGT TTC AGA TC-3' que contenía un sitio de
restricción XhoI y el iniciador 3' MoB324
5'-CTG CCA TGG GTG CTC CCG CCT CTT
GG-3' que contenía el sitio de restricción
NcoI. El DNA amplificado se digirió con XhoI y
NcoI y se ligó en pRT101VEGF C3 (digerido con
XhoI/NcoI) dando como resultado
pRT101TPTo32-1 C3. El plásmido resultante contenía
las secuencias codificantes para el péptido señal To32 con inclusión
de la deleción 3' y VEGF_{121} en marco bajo control del promotor
35S de CaMV.
\vskip1.000000\baselineskip
La casete de expresión para GFP que contenía el
fragmento de cDNA de 297 pb ftsZ1 codificante del péptido de
tránsito de cloroplasto FtsZ1 y cDNA para gfp bajo control
del promotor 35S de CaMV y el terminador nos se escindió como un
fragmento HindIII/EcoRI a partir de pFtsZ1
(1-93)-GFP (Kiessling et al.
2000). El fragmento se ligó a pRT99 (digerido con
HindIII/EcoRI) dando como resultado
pRT99TPftszGFP.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron plantas axénicamente en
condiciones estériles en medio Knop ordinario modificado con líquido
inorgánico (1000 mg/l Ca(NO_{3})_{2} x 4H_{2}O,
250 mg/l KCl, 250 mg/l KH_{2}PO_{4}, 250 mg/l MgSO_{4} x
7H_{2}O y 12,5 mg/l FeSO_{4} x 7H_{2}O; pH 5,8 (Reski y Abel
1985)). Las plantas se cultivaron en matraces Erlenmeyer de 500 ml
que contenían 200 ml de medio de cultivo y los matraces se
sacudieron en una máquina de sacudidas Certomat R (B. Braun Biotech
International, Alemania) ajustada a 120 rpm. Las condiciones en la
cámara de cultivo eran 25 \pm 3ºC y un régimen
luz-oscuridad de 16:8 h. Los matraces se iluminaron
desde arriba con dos tubos fluorescentes (Osram L58W/25) que
proporcionaban 35 \mumol^{-1} m^{-2}. Los cultivos se
subcultivaron una vez a la semana por desintegración utilizando un
homogeneizador Ultra-Turrax (IKA, Staufen,
Alemania) e inoculación de dos nuevos matraces Erlenmeyer de 500 ml
que contenían 100 ml de medio Knop nuevo.
\vskip1.000000\baselineskip
Precultivo de tejido de musgo para aislamiento
óptimo de protoplastos. Los musgos (especialmente Physcomitrella
patens) pueden precultivarse en condiciones diferentes a fin de
obtener rendimientos óptimos de protoplastos:
- I.
- Rother et al. 1994, cultivaron tejido de musgo durante 7 días en medio Knop con contenido reducido (10%) de Ca(NO_{3})_{2}. Los cultivos se filtraron 3 ó 4 días después de la desintegración y se transfirieron a medio Knop nuevo con contenido reducido (10%) de Ca(NO_{3})_{2}.
- II.
- En lugar de la reducción del Ca(NO_{3})_{2}, el medio para precultivo puede complementarse con tartrato de amonio 5 mM, o el pH puede cambiarse a 4,5 (en cultivos líquidos con valores de pH incontrolados se alcanza un valor medio de pH de 5,8 para el medio Knop modificado). Los cultivos se filtraron 3 ó 4 días después de la desagregación del tejido y se transfirieron a medio Knop nuevo modificado (complementado con tartrato de amonio 5 mM o cambiado a pH 4,5).
- III.
- Hohe y Reski (2002) optimizaron las condiciones de cultivo en un biorreactor semicontinuo para obtener rendimientos altos de protoplastos. Se obtuvieron protoplastos de rendimientos altos aislados por suplementación del medio Knop modificado (Reski y Abel 1985) con 460 mg/l de tartrato de amonio o a valores de pH controlados con un punto de ajuste de 4,5 (en los cultivos de biorreactor con valores de pH incontrolados se alcanza un pH medio de 5,8 para el medio Knop modificado).
\newpage
Protocolos diferentes para el aislamiento de
protoplastos (Grimsley et al. 1977; Schaefer et al.
1991; Rother et al. 1994; Zeidler et al. 1999; Hohe y
Reski 2002, Protocol Schaefer 2001) y para transformación (Schaefer
et al. 1991; Reutter y Reski 1996, Protocol Schaefer 2001)
han sido descritos para Physcomitrella patens.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el trabajo presentado en esta memoria, se
utilizó una modificación/combinación de los métodos descritos
anteriormente:
- Después de filtración, se preincubaron los protonemas de musgo en manitol 0,5 M. Después de 30 min, se añadió a la suspensión 4% de Driselasa (Sigma, Deisenhofen, Alemania). La Driselasa se disolvió en manitol 0,5 M (pH 5,6-5,8), se centrifugó a 3600 rpm durante 10 min y se esterilizó por paso a través de un filtro de 0,22 \mum (Millex GP, Millipore Corporation, EE.UU.). La suspensión, que contenía 1% de Driselasa (concentración final) se incubó en la oscuridad a TA y se agitó suavemente (los rendimientos óptimos de protoplastos se alcanzaron después de 2 horas de incubación) (Protocolo Schaefer 2001). La suspensión se pasó a través de tamices (Wilson, CLF, Alemania) con tamaños de poro de 100 \mum y 50 \mum. La suspensión se centrifugó en tubos de centrífuga estériles y los protoplastos se sedimentaron a TA durante 10 min a 55 g (aceleración de 3; ralentización a 3; multicentrífuga 3 S-R, Kendro, Alemania) (Protocolo Schaefer 2001). Los protoplastos se resuspendieron suavemente en medio W5 (CaCl_{2} x 2H_{2}O 125 mM; NaCl 137 mM; glucosa 5,5 mM; KCl 10 mM; pH 5,6; 660-680 mOsm; filtrado en condiciones estériles). La suspensión se centrifugó de nuevo a TA durante 10 min a 55 g (aceleración de 3; ralentización a 3; multicentrífuga 3 S-R, Kendro, Alemania) (modificación, observación: Schaefer et al. 1991 mencionaron que el medio W5 daba como resultado una viabilidad reducida). Los protoplastos se resuspendieron suavemente en medio W5 (Rother et al. 1994). Para recuento de los protoplastos se transfirió un pequeño volumen de la suspensión a una cámara Fuchs-Rosenthal.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la transformación, se incubaron los
protoplastos en hielo a la oscuridad durante 30 minutos.
Subsiguientemente, los protoplastos se sedimentaron por
centrifugación a TA durante 10 min a 55 g (aceleración de 3;
ralentización a 3; multicentrífuga 3 S-R, Kendro).
Los protoplastos se resuspendieron en medio 3M (CaCl_{2} x
2H_{2}O 15 mM; 0,1% MES; manitol 0,48 M; pH 5,6; 540 mOsm;
filtrado en condiciones estériles, Schaefer et al. 1991) a
una concentración de 1,2 x 10^{6} protoplastos/ml (Reutter y Reski
1996). Se dispensaron 250 \mul de esta suspensión de protoplastos
en un tubo estéril nuevo de centrífuga, 50 \mul de solución de DNA
(DNA purificado en columna en H_{2}O (Qiagen, Hilden, Alemania);
10-100 \mul; cantidad óptima de DNA de 60 \mug)
y se añadieron finalmente 250 \mul de solución de PEG (40% PEG
4000; manitol 0,4 M; Ca(NO_{3})_{2} 0,1 M; pH 6
después de tratamiento en autoclave). La suspensión se mezcló
inmediata pero suavemente y se incubó luego durante 6 min a TA con
mezcladura suave ocasional. La suspensión se diluyó progresivamente
por adición de 1, 2, 3 y 4 ml de medio 3M. La suspensión se
centrifugó a 20ºC durante 10 minutos a 55 g (aceleración de 3;
ralentización a 3; multicentrífuga 3 S-R, Kendro).
El pelet se resuspendió en 300 \mul o 400 \mul de medio (para
ejemplos: medio 3M o medio W5 o medio MMS (que contenía 610 mg
MgCl_{2} x 6H_{2}O; 0,2 g MES; 18,21 g
D-sorbita (Roth, Alemania), pH
5,6-5,8; 191 mOsm). El cultivo de los protoplastos
transformados se realizó en placas de 96 pocillos (300 \mul,
Nunclon, Nunc GmbH, Wiesbaden, Alemania) o placas de 48 pocillos
(400 \mul, Cellstar, Greiner Bio-One,
Frickenhausen, Alemania).
Las muestras de transformación transitoria se
incubaron en luz débil (4,6 \mumols^{-1} m^{-2}) a 25ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se reemplazó cuidadosamente el medio (a fin de
evitar la dispersión de los protoplastos) por medio nuevo cada 24
h. El medio no se reemplazó completamente, dado que los protoplastos
tienen que mantenerse en líquido. El medio retirado (con inclusión
de la proteína recombinante) se guardó a -20ºC.
Se realizaron experimentos de evolución temporal
reemplazando la mitad del medio (se retiraron 200 \mul, y se
añadieron 200 \mul de medio nuevo).
En algunos experimentos, tanto los protoplastos
como el medio se aislaron después de las segundas 24 h.
Las muestras se guardaron a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El VEGF_{121} recombinante expresado por los
protoplastos de musgo transitorios transformados se cuantificó por
ELISA (R&D Systems, Wiesbaden, Alemania). El ELISA se realizó de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se
diluyeron para cuantificación.
Determinación de la actividad biológica de
VEGF_{121} recombinante. La actividad biológica de VEGF_{121}
recombinante expresada por los protoplastos de musgo transformados
transitoriamente se determinó por RELIDA específico de VEGF
(RELIATech, Braunschweig, Alemania). El RELIDA se realizó de acuerdo
con las instrucciones del fabricante. El ensayo reconoce únicamente
formas libres, no complejadas y biológicamente activas de
VEGF-A que no están secuestradas por receptores
solubles. Las moléculas de VEGF-A secuestradas,
monómeras y degradadas no serán detectadas (instrucciones del
fabricante).
La expresión de proteínas se realizó por
análisis mediante transferencia Western. Las muestras se mezclaron
con tampón de muestras reductor o no reductor y se resolvieron en un
gel de SDS-poliacrilamida al 12% o 15% de acuerdo
con Laemmli (1970). Para la Transferencia Western, las proteínas se
sometieron a electrotransferencia desde SDS-PAGE
por transferencia semiseca a una Membrana NC Optitran
BA-S83 Reforzada (Schleicher & Schuell, Dassel,
Alemania) de acuerdo con Towbin (1979) utilizando un dispositivo
Multiphor II (Amersham Pharmacia Biotech, Alemania). El análisis se
llevó a cabo utilizando el sistema de detección ECL (Amersham
Pharmacia Biotech, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
La detección de VEGF_{121} se realizó en
condiciones no reductoras. Las muestras se calentaron durante 10
min a 60ºC antes de la carga. El VEGF recombinante se detectó
utilizando anticuerpo anti-rhVEGF
(AF-293-NA, R&D Systems,
Wiesbaden, Alemania), diluido en relación 1/500 en solución salina
tamponada con Tris, pH 8/0,05% Tween 20 y una IgG
anti-cabra, marcada con peroxidasa (A5420, Sigma,
Taufkirchen, Alemania) diluida en relación 1/8000 en solución
salina tamponada con Tris, pH 8/0,05% Tween 20.
La detección de la proteína To32 semejante a
taumatina se realizó en condiciones reductoras. Las muestras se
calentaron durante 10 min a 95ºC antes de la carga. Se detectó To32
recombinante utilizando conjugado anticuerpo monoclonal
anti-FLAG M2-peroxidasa
(A-8592, Sigma, Deisenhofen, Alemania), diluido en
relación 1/1000 en solución salina tamponada con Tris, pH 8/0,05%
Tween 20.
Se analizaron tejidos de plantas utilizando un
Axiovert 200 (Zeiss, Alemania). La fluorescencia de GFP se
visualizó utilizando la serie de filtros 10 (excitación:
450-490 nm; emisión: 515-565 nm;
Zeiss, Alemania). Las sustancias de la pared celular se tiñeron con
5 \mug/ml de Abrillantador Fluorescente 28 (específico de
celulosa, Sigma, Deisenhofen, Alemania) o Azul de Anilina al 0,01%
(específico de callosa, Merck, Darmstadt, Alemania) y la
regeneración de las paredes celulares se analizó utilizando la serie
de filtros 2 (excitación: G 365 nm, emisión: LP 420 nm, Zeiss,
Alemania).
La viabilidad de los protoplastos de musgo
aislados 48 horas después de la transformación era aproximadamente
50%. La viabilidad se calculó por recuento de los protoplastos
supervivientes microscópicamente en una cámara
Fuchs-Rosenthal. Schaefer (protocolo 2001)
mencionaba una tasa de regeneración de 50%.
Estimada por expresión de GFP de los
protoplastos transformados transitoriamente. Se transformaron 5 a
10% de los protoplastos viables. La transformación se realizó con
60 \mug de DNA. La relación de protoplastos transformados a
protoplastos supervivientes se calculó sometiendo a recuento los
protoplastos supervivientes y que expresaban GFP microscópicamente
en una cámara Fuchs-Rosenthal. Schaefer (protocolo
2001) mencionaba una tasa de transformación de protoplastos
supervivientes de 5 a 25%.
Los protoplastos pudieron cultivarse en medio 3M
o en medio W5 durante 2 a 3 meses. Cultivados en medio 3M o W5, los
protoplastos no eran capaces de regenerar las paredes celulares o de
dividirse. Sin embargo, la transferencia de protoplastos de 3 meses
de vejez en medio de regeneración daba como resultado una
regeneración más lenta pero aparentemente normal. La regeneración
de las paredes celulares se verificó utilizando tintes específicos
contra Callosa (Azul de Anilina) y celulosa (Abrillantador
Fluorescente 28) y se visualizó por microscopía.
Se realizaron experimentos de deleción a fin de
analizar la escisión apropiada de los péptidos señal y la secreción
direccionada. Se delecionaron los aminoácidos terminales de los
péptidos señal que representaban los sitios de escisión.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La secuencia codificante del péptido señal de
VEGF humano se amplificó por PCR utilizando iniciadores específicos
(MoB323/MoB349; molde: pRT101 P21 (Gorr, 1999)) y se introdujo en
marco para vegf121 en pRT101 C3 (Gorr 1999). El plásmido
pRT101TPVEGF C3 resultante se utilizó para experimentos transitorios
de transformación.
La secuencia codificante del péptido señal de
VEGF humano, que no comprendía los tres nucleótidos
(5'-CAG-3') codificantes del
aminoácido C-terminal (Gln) se amplificó por PCR
utilizando iniciadores específicos (MoB323/
MoB350) y se introdujo en marco para vegf121 en pRT101 C3. El plásmido pRT101TPVEGF-1 C3 resultante se utilizó asimismo para experimentos de transformación transitoria.
MoB350) y se introdujo en marco para vegf121 en pRT101 C3. El plásmido pRT101TPVEGF-1 C3 resultante se utilizó asimismo para experimentos de transformación transitoria.
Se utilizaron para la transformación 60 \mug
de DNA (purificado en columnas Qiagen, Alemania) de cada constructo.
Se realizaron 3 experimentos de transformación en paralelo para
cada constructo. Las muestras de transformación se cultivaron en
medio 3M durante 48 h en placas de 48 pocillos en condiciones de luz
débil (16 h luz, 8 h oscuridad). 24 horas después de la
transformación, se reemplazó la mitad del medio por medio nuevo. La
toma de muestras se realizó 48 h después de la transformación por
retirada de 200 \mul. El VEGF_{121} direccionado al medio por
el péptido señal nativo dio como resultado 8,47 ng/ml \pm 1,95 y
se ajustó a 100%. La deleción del último aminoácido del péptido
señal dio como resultado una secreción reducida de 0,21 ng/ml \pm
0,06, o respectivamente 2,48% (Tab. 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La secuencia codificante del péptido señal To32
de la proteína semejante a taumatina de plantas se amplificó por
PCR utilizando iniciadores específicos (MoB254/MoB250; molde pCRToN)
y se introdujo en marco para vegf121 en pRT101 C3 (Gorr,
1999). El plásmido pRT101TPTo32 C3 resultante se utilizó para
experimentos de transformación transitoria.
La secuencia codificante del péptido señal To32
de la proteína semejante a taumatina de plantas, que no incluía los
tres nucleótidos (CTG) codificantes del aminoácido
C-terminal (Leu) se amplificó por PCR utilizando
iniciadores específicos (MoB254/MoB324) y se introdujo en marco
para vegf121 en pRT101 C3. El plásmido
pRT101TPTo32-1 C3 resultante se utilizó para
experimentos de transformación transitoria.
Se utilizaron para la transformación 60 \mug
de DNA (purificado en columnas, Qiagen, Alemania) de cada
constructo. Se realizaron en paralelo 3 experimentos de
transformación para cada constructo. Las muestras de transformación
se cultivaron en medio 3M durante 48 h en placas de 48 pocillos en
condiciones de luz débil (16 h luz : 8 h oscuridad). 24 h después
de la transformación, la mitad del medio se reemplazó por medio
nuevo. La toma de muestras se realizó 48 h después de la
transformación retirando 200 \mul. El VEGF121 direccionado al
medio por el péptido señal nativo producía 26,83 ng/ml \pm 6,25 y
se fijó como 100%. La deleción del último aminoácido del péptido
señal dio como resultado una secreción reducida de 2,18 ng/ml \pm
0,67 o respectivamente 8,13% (Tab. 1).
Se investigó si el uso de los péptidos señal
distintos del péptido señal nativo da o no como resultado una
secreción mejorada de proteínas recombinantes. Se comparó el péptido
señal nativo de VEGF con el péptido señal To32 de la proteína
semejante a taumatina.
La secuencia codificante del péptido señal de
VEGF humano se amplificó por PCR utilizando iniciadores específicos
(MoB/MoB; molde: pRT101 P21 (Gorr, 1999)) y se introdujo en marco
para vegf121 en pRT101 C3 (Gorr 1999). Se utilizó el
plásmido pRT101TPVEGF C3 resultante para los experimentos de
transformación transitoria. La secuencia codificante del péptido
señal To32 de la proteína semejante a taumatina se amplificó por PCR
utilizando iniciadores específicos (MoB/MoB; molde: pCRToN) y se
introdujo en marco para vegf121 en pRT101 C3 (Gorr 1999). El
plásmido pRT101TPTo32 C3 resultante se utilizó para experimentos de
transformación transitoria.
Se utilizaron para la transformación 60 \mug
de DNA (purificado en columnas, Qiagen, Alemania) en cada
constructo. Se realizaron 3 experimentos de transformación en
paralelo para cada constructo. Las muestras de transformación se
cultivaron en medio 3M durante 48 h en placas de 48 pocillos en
condiciones de luz débil (16 h luz : 8 h oscuridad). 24 h después
de la transformación, se reemplazó la mitad del medio por medio
nuevo. La toma de muestras se realizó 48 h después de la
transformación por retirada de 200 \mul. El VEGF121 direccionado
al medio por el péptido señal To32 de la proteína semejante a
taumatina de plantas dio como resultado rendimientos 3 veces
mayores (123,3 ng/ml \pm 11,1) comparado con el direccionamiento
por el péptido señal de VEGF (41,7 ng/ml \pm 6,9).
La secreción de la proteína recombinante se
incrementó utilizando el péptido señal no nativo (Tab. 2).
La secuencia codificante del péptido señal VEGF
humano se amplificó por PCR utilizando iniciadores específicos
(MoB/MoB; molde: pRT101 P21 (Gorr 1999)) y se introdujo en marco
para vegf121 en pRT101 C3 (Gorr 1999). El plásmido
pRT101TPVEGF C3 resultante se utilizó para los experimentos de
transformación transitoria.
Se utilizaron para la transformación 60 \mug
de DNA (purificado por Qiagen Midiprep) de pRT101TPVEGF C3. Se
realizaron tres experimentos de transformación en paralelo para cada
condición de cultivo. Las muestras de transformación se cultivaron
en medio 3M o medio W5 o medio MMS durante 96 h en placas de 48
pocillos utilizando condiciones de luz débil (16 h luz : 8 h
oscuridad). La toma de muestras se realizó reemplazando la mitad
del medio (200 \mul) por medio nuevo cada 24 h. Las tasas de
secreción se calcularon como sigue:
- rendimiento de proteína después de 24 h = tasa de secreción 0-24 h (24 h);
- rendimiento de proteína después de 48 h - (rendimiento de proteína después de 24 h/2) = tasa de secreción 24-48 h (48 h);
- rendimiento de proteína después de 72 h - (rendimiento de proteína después de 48 h/2) = tasa de secreción 48-72 h (72 h);
- rendimiento de proteína después de 96 h - (rendimiento de proteína después de 72 h/2) = tasa de secreción 72-96 h (96 h);
- tasas de secreción 0-24 h + 24-48 h + 48-72 h + 72-96 h = tasa de secreción 0-96 h (0-96 h).
Las evoluciones temporales para la secreción
eran ligeramente diferentes en los medios testados. La expresión
transitoria realizada en medio W5 (24 h:6,25 ng/ml) y medio MMS (24
h = 5,12 ng/ml) comenzaron más pronto comparadas con la tasa de
secreción durante 0-24 h en medio 3M (24 h = 1,72
ng/ml). Sin embargo, pudieron observarse más o menos las mismas
tasas de secreción en medio 3M entre 24 y 96 h (48 h = 5,85 ng/ml;
72 h = 4,48 ng/ml; 96 h 4,3 ng/ml). En contraste, se midieron tasas
de secreción menores entre 72 y 96 h en las muestras de
transformación transitoria realizadas en medio W5 (48 h = 7,05
ng/ml; 72 h: 5,05 ng/ml; 96 h: 2,43 ng/ml) y medio MMS (48 h = 4,54
ng/ml; 72 h = 4,68 ng/ml; 96 h = 0,86 ng/ml (Tab. 3).
El cálculo de las tasas de secreción a lo largo
del periodo total de 96 h (0-96 h) dio como
resultado rendimientos máximos para medio W5 (20,77 ng/ml, seguido
por medio 3M (16,35 ng/ml) y medio MMS (15,2 ng/ml) (Tab. 3). El
uso de medios diferentes para la transformación transitoria de
protoplastos daba como resultado evoluciones temporales diferentes
de secreción a lo largo de 96 h. En contraste, los rendimientos
totales de proteína recombinante excretada después de 96 h eran
sólo ligeramente diferentes.
Se utilizaron para cada transformación 60 \mug
de DNA del constructo (pRT101TPTo32 C3 purificado por Qiagen
Midiprep). Las muestras de transformación se cultivaron en medio 3M
durante 72 h en placas de 96 pocillos en condiciones de luz débil
(16 h luz : 8 h oscuridad). El medio se reemplazó por medio nuevo 24
h después de la transformación. Los sobrenadantes (150
\mul/muestra de transformación) se recogieron 48 h después de la
transformación, se añadió medio 3M nuevo y 72 h después de la
transformación se recogieron nuevamente los sobrenadantes. La
incubación de los protoplastos en un volumen tan pequeño dio como
resultado 130 ng/ml (valor medio: 2 pg/célula) de VEGF_{121}
recombinante excretado durante 24 h.
En las células de mamífero, VEGF_{121} se
sintetiza como una proteína precursora y después de la eliminación
del péptido señal se procesa el mismo en un homodímero enlazado con
disulfuro de 34-36 kDa. En este caso, se utilizó el
péptido conductor de VEGF y el péptido conductor To32 de la proteína
semejante a taumatina para evaluar adecuadamente la dimerización
enlazada por disulfuro y secreción de VEGF_{121} expresada en los
protoplastos de musgo transformados transitoriamente. La proteína
excretada se realizó en ensayos de transferencia Western en
condiciones no reductoras. Se utilizaron 60 \mug de DNA de los
constructos (pRT101TPVEGF C3 y pRT101TPTo32 C3).
Las muestras de transformación se cultivaron en
medio 3M durante 72 h en placas de 96 pocillos y condiciones de luz
débil (16 h luz : 8 h oscuridad). 24 h después de la transformación
se reemplazó el medio por medio nuevo. Los sobrenadantes se
recogieron 48 h después de la transformación, se añadió medio 3M
nuevo y 72 h después de la transformación se recogieron de nuevo
los sobrenadantes.
En condiciones no reductoras, el anticuerpo
detectaba una banda de 35 kDa. Esto sugiere que los monómeros se
dimerizaban adecuadamente y se secretaban eficientemente. Se utilizó
como control VEGF_{121} recombinante derivado de E. coli
(replegado a la estructura nativa, R&D Systems, Alemania).
La actividad biológica se determinó por
tecnología RELIDA (RELIATech, Braunschweig, Alemania). El kit RELIDA
está basado en receptores solubles de VEGF-A como
moléculas de captura de ligandos activos. El receptor reconoce
únicamente las formas libres, no complejadas y biológicamente
activas de VEGF-A (que incluyen VEGF_{121}).
Comparado con los resultados de ELISA, se midieron las mismas
cantidades de VEGF_{121} con RELIDA. Basándose en este resultado,
el VEGF_{121} recombinante excretado parece tener actividad
biológica completa.
La proteína To32 semejante a taumatina exhibía
capacidad de fijación de CD4. Para propósitos analíticos, eran
necesarias cantidades de microgramos. Se utilizó la transformación
transitoria arriba descrita de protoplastos de musgo para la
producción de To32 recombinante excretada.
La expresión transitoria de la proteína To32
semejante a taumatina se realizó en medio 3M. Los protoplastos se
aislaron de cultivos en biorreactor (pH 4,5). Se utilizaron para
cada transformación 60 \mug de DNA (pRT101To32). Las muestras de
transformación se cultivaron en medio 3M durante 96 h en placas de
96 pocillos en condiciones de luz débil (16 h luz : 8 h oscuridad).
Se recogieron los sobrenadantes (150 \mul) 24 h, 48 h, 72 h y 96
h después de la transformación. Los sobrenadantes recogidos se
reemplazaron siempre por volúmenes idénticos de medio nuevo.
Durante las primeras 24 h, no se excretó al medio cantidad alguna de
To32 recombinante. Después de las primeras 24 h, se excretaron
continuamente al medio rendimientos altos de To32 recombinante
(24-48 h = 2,5 \mug (valor medio: 37,5
pg/célula); 48-72 h = 5 \mug (valor medio: 75
pg/célula); 72-96 h = 3,75 \mug (valor medio:
56,2 pg/célula; valor medio). Se utilizó To32 derivada de E.
coli para cuantificación de los análisis de transferencia
Western.
Con la transformación transitoria en
protoplastos de musgo, se alcanzaron rendimientos de proteína
recombinante excretada hasta 5 \mug/ml durante 24 h para una
proteína semejante a taumatina (To32) que tenía capacidad de
fijación de CD4.
Fiebich et al. (1993) describieron la
expresión recombinante y secreción de VEGF en células de insecto
infectadas con baculovirus. Dichos autores alcanzaron niveles de
3-5 \mug VEGF/ml por 2-4 x
10^{6} células (valor medio por célula: 1,33 pg). En protoplastos
de musgo transformados transitoriamente se alcanzaron niveles de
secreción de 130 ng VEGF/ml por 6,6 x 10^{4} células (valor medio
por célula = 1,95 pg).
La transformación transitoria de protoplastos de
musgo con la secuencia codificante de la proteína To32 semejante a
taumatina dio como resultado 5 \mug/ml por 6,6 x 10^{4} células
(valor medio por célula = 75 pg) durante 24 h.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se generan vectores de expresión por clonación
roma de productos PCR de lectura de pruebas Pfu de cadena
pesada (HC; 1410 pb) o ligera (LC; 711 pb), respectivamente, en el
sitio de restricción con SmaI de pRT101 (Töpfer et al.
(1987), NAR, 15, p5890). Como molde sirve el homólogo humano de LC
kappa (número de acceso GENBACK BC005332, contenido en el clon
IMAGE 3934658; véase la secuencia más adelante) y, en el caso de la
HC, o constructo de DNA sintético (véase la secuencia más adelante),
que es una fusión de un precursor HC de IgG humana (número de
acceso GENBANK AF135164) y la región constante de HC de IgG4 humana
(número de acceso GENBANK K01316). Condiciones de la PCR: 2 min
94ºC; 30 ciclos: 20 s 94ºC/10 s 50ºC/1 min/kb 72ºC; extensión: 10
min, utilizando iniciadores con 22 nucleótidos de longitud,
partiendo del codón correspondiente de inicio o de parada,
respectivamente. En tales constructos de expresión están localizados
el promotor 35S de CaMV, las secuencias codificantes de HC o LC con
inclusión de sus péptidos señal endógenos correspondientes (señales
de clasificación para la secreción), y como terminador de la
transcripción se utiliza la señal de terminación de 35S de
CaMV.
Número de acceso a GENBANK BC005332 (pb
21-731:
Constructo HC sintético:
pb1-437: número de acceso a
GENBANK AF135164
pb438-1410: número de acceso a
GENBANK K01316 (con eliminación de los intrones)
El protocolo es el mismo que se ha descrito
arriba.
En cada transformación, los vectores de
expresión para ambas cadenas, HC y LC, se
co-transforman utilizando 20 microgramos de DNA
plasmídico sin cortar superenrollado por constructo.
Las muestras se toman al cabo de 48 horas.
Recubrimiento: LC Kappa
anti-humana (Sigma, Cat #K4377; 1/300 en el tampón
de recubrimiento (véase más adelante).
Conjugado: conjugado de peroxidasa IgG4
anti-humana (Sigma, Cat #A2290; 1:1000 en PBS (véase
más adelante) + 0,1% de BSA).
Estándar: Kappa IgG4 Humana (40 ng/ml de TBS 20
mM (pH 8,0) Sigma, Cat #14639), diluido serialmente 8 veces (en PBS
+ 0,1% BSA) 1:2 para el ensayo (dilución hasta 256 veces).
Protocolo: se recubre una placa ELISA de 96
pocillos con 50 \mul/pocillo de solución de recubrimiento. Se
deja en reposo durante una noche a 4ºC. Se sacude brevemente la
solución y se lava 3 veces a 100 \mul/pocillo con
PBS-T (véase más adelante). Se extiende en placas y
se bloquea luego utilizando 200 \mul/pocillo PBS + 1% BSA. Se
deja en reposo 90 minutos a 37ºC. La solución de bloqueo se sacude
brevemente, se lava 3 veces a 100 \mul/pocillo con
PBS-T y se aplican 50 \mul/pocillo de
estándares/muestras. Se deja en reposo 90 minutos a 37ºC. Se lava 3
veces la placa a 100 \mul/pocillo con PBS-T. Se
aplica el conjugado a 100 \mul/pocillo. Se deja durante 40
minutos a la temperatura ambiente. La placa se lava 3 veces a 100
\mul/pocillo con PBS-T. Se añaden 100
\mul/pocillo de TMB (trimetilbencidina; Dunn Labortechnik; cat
#TMBE-500), y se para la reacción al cabo de 10
minutos por adición de 50 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 2M. Se
mide la absorción a 450 nm (longitud de onda de referencia: 610 nm;
lector ELISA; Labsystems Multiskan RC).
Tampón de recubrimiento: titulación de 70 ml de
Na_{2}CO_{3} 0,1 M (10,6 g/l, anhidro) con 175 ml de NaHCO_{3}
0,2M (16,8 g/l, anhidro).
10 x PBS: 20 ml de KH_{2}PO_{4} 1M/80 ml de
K_{2}HPO_{4} 1M/87,66 g NaCl y 1000 ml de PBS-T:
PBS/0,05% (v/v) Tween 20.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensamblajes de cadena ligera y pesada se
detectan en varios experimentos independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
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La construcción de vectores se describe en
Métodos y Materiales. Las cantidades de VEGF_{121} secretado se
midieron por ELISA. Los valores medios y la desviación estándar se
calcularon a partir de tres experimentos de transformación
realizados en paralelo.
La construcción de vectores se describe en
Métodos y Materiales. Las cantidades de VEGF_{121} secretado se
midieron por ELISA. Los valores medios y la desviación estándar se
calcularon a partir de tres experimentos de transformación
realizados en paralelo.
Las tasas de secreción se calculan como se
describe en Métodos y Materiales. Los valores medios se calcularon
a partir de tres experimentos de transformación realizados en
paralelo. Se utilizó para la transformación el constructo
pRT101TPVEGF.
Claims (15)
1. Un método para la producción transitoria de
una o más proteínas extracelulares no procedentes de plantas en un
protoplasto de musgo, método que comprende los pasos de transformar
transitoriamente el protoplasto con un constructo de ácido nucleico
que comprende una o más secuencias nucleotídicas heterólogas
codificantes de dicha o dichas proteínas no procedentes de plantas
enlazadas operativamente a un promotor, y cultivar el protoplasto
transformado a fin de producir dicha o dichas proteínas no
procedentes de plantas, en donde dicho cultivo tiene lugar durante
al menos 48 horas en un medio de cultivo seleccionado del grupo
constituido por W5, 3M y MMS.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
que comprende adicionalmente el paso de obtener dicha o dichas
proteínas no procedentes de plantas del medio de cultivo.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en donde el protoplasto es de Physcomitrella patens.
4. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde el volumen del medio de cultivo
está comprendido en el intervalo de 50 \mul - 1000 \mul.
5. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde el volumen del medio de cultivo
está comprendido en el intervalo de 100 \mul - 600 \mul.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde el volumen del medio de cultivo
está comprendido en el intervalo de 100 \mul - 300 \mul.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde el volumen del medio de cultivo
es 200 \mul \pm 50 \mul.
8. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde el ácido nucleico
heterólogo comprende dos o más secuencias nucleotídicas
heterólogas.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8,
en donde los ácidos nucleicos están presentes en un solo constructo
vector.
10. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde el promotor es un
promotor inducible.
11. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia nucleotídica
heteróloga codifica una proteína o polipéptido que es una proteína
animal.
12. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia nucleotídica
heteróloga codifica una proteína o polipéptido que es una proteína
de mamífero.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación
11 ó 12, en donde la secuencia nucleotídica heteróloga codifica una
proteína seleccionada del grupo constituido por un heterodímero, un
anticuerpo de fusión, una inmunoglobulina, y un anticuerpo
monocatenario.
14. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, en donde la secuencia nucleotídica
heteróloga codifica una proteína o polipéptido que es una proteína
fúngica.
15. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, en donde la secuencia nucleotídica
heteróloga codifica una proteína o polipéptido que es una proteína
bacteriana.
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