ES2949367T3 - Cry1d para controlar el gusano de la mazorca del maíz - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona en parte con el sorprendente descubrimiento de que Cry1Da es activo contra el gusano elotero del maíz (DEC), Helicoverpa zea (Boddie). Se describen métodos para usar Cry1Da en plantas transgénicas para prevenir daños graves a los cultivos. Los bioensayos de hojas y seda utilizando maíz transgénico que expresa la región de la toxina central de longitud completa o Cry1Da quimérico demostraron una buena protección contra los insectos contra el daño de las larvas de DEC. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Cry1 d para controlar el gusano de la mazorca del maíz

ANTECEDENTES

Cry1 Da es una delta-endotoxina producida por ciertas especies de Bacillus thuringiensis y fue descrita por primera vez en la patente de EE. UU. 5.691.308. Más recientemente, dos artículos con revisión científica externa independiente han informado que es inactiva contra el gusano de la mazorca del maíz (CEW): Karim et al. (2000) y Frankenhuyzen (2009). Por consiguiente, las siguientes sorprendentes e inesperadas observaciones refutan directamente estos resultados publicados y muestran claramente que Cry1 Da tiene buena actividad insecticida contra larvas de CEW cuando el gen se expresa en plantas.

BREVE SUMARIO

La invención objeto se refiere en parte al sorprendente descubrimiento de que Cry1 Da es activa contra larvas del gusano de la mazorca del maíz (CEW), Helicoverpa zea (Boddie). Bioensayos en hojas y seda usando maíz transgénico que expresa una versión de longitud completa, truncada y quimérica de Cry1 Da demostraron la buena protección de los insectos contra el daño por larvas del CEW. Fue además sorprendente que se descubriera que la protección de larvas de CEW que se alimentan de la seda del maíz fue superior en plantas transgénicas que expresan Cry1 Da truncada en comparación con plantas comerciales que producen Cry1 Fa.

CEW es una plaga de insectos difícil de controlar con proteínas de Bacillus thuringiensis (Bt), y esta es la primera observación descrita donde el maíz transgénico que expresa Cry1 Da demostró actividad biológica para proteger la seda del maíz del daño por alimentación provocado por este insecto. Polillas adultas de CEW ovipositan normalmente sus huevos sobre la seda del maíz, y las larvas recién salidas se alimentan de la seda del maíz antes de entrar en la mazorca. Por lo tanto, el tener actividad protectora contra los insectos situados en los tejidos de la seda del maíz proporcionará efectos protectores significativos contra el daño por alimentación provocado por esta plaga significativa y destructiva del maíz.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Porcentaje de actividad de daño foliar de maíz no transformado (B-104), maíz transgénico que expresa YFP (109812), maíz Herculex1™ (HX1) o maíz T-1 transgénico que expresa Cry1 Da de longitud completa (109840) o Cry1 Da truncada (109841) expuesta a larvas de CEW.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO:1 es un fragmento de ADN que tiene la secuencia codificante (CDS) DIG-911

SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácidos para la proteína DIG-911 (toxina insecticida quimérica Cry1Da2/Cry1Ab, que consiste en un segmento de toxina central de Cry1Da (aminoácidos 1 a 594, como se desvela en N.° de acceso de GenBank 176415.1 y la patente de EE. UU. N.° 5.691308) y un segmento de protoxina derivado de Cry1Ab (DIG-911 aminoácidos 595 a 1139), esencialmente como se desvela en N.° de acceso de GenBank AFK79795.1)

SEQ ID NO:3 es un fragmento de ADN que tiene la secuencia codificante (CDS) DIG-180

SEQ ID NO:4 es la proteína DIG-180 (Cry1 Fa2).

SEQ ID NO:5 es un vector de entrada Gateway® (INVITROGEN) pDAB109825 que comprende una secuencia codificante optimizada para el maíz (SEQ ID NO:5) que codifica una proteína insecticida de toxina central Cry1 Da2 (SEQ ID NO:6).

SEQ ID NO:6 es la proteína insecticida de toxina central Cry1 Da2.

SEQ ID NO:7 es un cebador para AAD-1; véase la Tabla 2

SEQ ID NO:8 es un cebador para AAD-1

SEQ ID NO:9 es una sonda para AAD-1

SEQ ID NO:10 es un cebador para el gen de resistencia a espectinomicina

SEQ ID NO:11 es un cebador para el gen de resistencia a espectinomicina

SEQ ID NO:12 es una sonda para el gen de resistencia a espectinomicina

SEQ ID NO:13 es un cebador para el gen de invertasa del maíz

SEQ ID NO:14 es un cebador para el gen de invertasa del maíz

SEQ ID NO:15 es una sonda para el gen de invertasa del maíz

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La invención objeto se refiere en parte al sorprendente descubrimiento de que Cry1 Da es activa contra larvas del gusano de la mazorca del maíz (CEW), Helicoverpa zea (Boddie). Los resultados de bioensayos de los bioensayos de dieta in vitro mostraron que la quimera de protoxina Cry1 Da/Cry1 Ab produce una inhibición significativa del crecimiento y la mortalidad a las larvas de CEW. Una proteína insecticida o toxina Cry1 Da es cualquier proteína insecticida que comprenda la toxina central expuesta en SEQ ID NO:6 o variantes de la misma. Dichas variantes tienen al menos 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:6, preferible 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:6.

Los bioensayos en hojas y seda usando maíz transgénico que expresa una versión truncada de Cry1 Da demostraron la buena protección de insectos contra el daño por larvas de CEW. Se observó protección foliar comparable contra la alimentación de CEW en tanto plantas de maíz transgénico que expresan Cry1 Da truncada como el producto comercial Herculex® I (HX1) que expresa Cry1 Fa.

Sorprendentemente, se descubrió que la protección de la alimentación de larvas de CEW de la seda del maíz era superior en plantas transgénicas que expresan Cry1Da truncada en comparación con plantas HX1. La alimentación de insectos del tejido de la seda del maíz transgénico que expresa Cry1 Da truncada tuvo una mortalidad (-25 %), que fue numéricamente mejor que la observada para insectos que se alimentan de tejido de la seda de plantas HX1 (<10 %).

CEW es una plaga de insectos difícil de controlar con proteínas de Bacillus thuringiensis (Bt), y esta es la primera observación descrita donde el maíz transgénico que expresa Cry1 Da demostró actividad biológica para proteger la seda del maíz del daño por alimentación provocado por este insecto. Polillas adultas de CEW ovipositan normalmente sus huevos sobre la seda del maíz, y las larvas recién saldas se alimentan de la seda del maíz antes de entrar en la mazorca. Por lo tanto, el tener actividad protectora contra los insectos situados en los tejidos de la seda del maíz proporcionará efectos protectores significativos contra el daño por alimentación provocado por esta plaga significativa y destructiva del maíz. Las opciones de utilización de la invención objeto incluyen el uso de proteínas Cry1 Da en regiones geográficas, que incluye regiones de cultivo de soja y maíz, donde CEW está presente y es problemático.

Los datos presentados en el presente documento demuestran que Cry1 Da es una proteína excelente para controlar CEW en tejido de la seda en comparación con Herculex 1®. Como se usa en el presente documento, los términos "control" y "controlar" incluyen inhibición del crecimiento y/o mortalidad.

Se muestra en el presente documento que una quimera de protoxina Cry1Da/Cry1Ab tiene actividad insecticida contra H. zea en bioensayos con insectos en la dieta. Cuando la forma truncada de Cry1 Da se expresó en maíz transgénico, protegió las plantas del daño por alimentación de las hojas y la seda provocado por CEW o el gusano cogollero (FAW), Spodoptera frugiperda. Estos resultados son sorprendentes, ya que se informó previamente Cry1 Da que no era activo contra CEW (Karim, 2000) y solo activo contra FAW (Van Frankenhuyzen, 2009). Se conoce la proteína insecticida Cry1 Da; sin embargo, la presente invención es un uso novedoso e inesperado de Cry1 Da para prevenir el daño grave por CEW a las plantas, especialmente las plantas de cultivo.

Helicoverpa zea tiene un hábito de alimentación de larva polífaga. Se alimenta preferentemente de estructuras reproductoras y tejidos en crecimiento que son ricos en nitrógeno, tales como la seda, la mazorca, el zuro y la panoja del maíz, la cápsula y el capullo del algodón, así como la vaina de la soja. Es un insecto muy significativo (plaga para los cultivos) debido a que el daño a la planta afecta directamente el rendimiento del cultivo. Aparte del maíz, Cry1 Da tiene utilidad para controlar estas especies de insectos en cultivos de gran valor, tales como algodón y sojas, así como verduras, tales como tomates.

El manejo de resistencia de insectos (IRM) describe prácticas agrícolas usadas para reducir las posibilidades de que plagas de insectos se vuelvan resistentes a un pesticida. El IRM es de gran importancia con respecto al uso de toxinas Cry en plantas de cultivo importantes debido a que la resistencia a los insectos plantea numerosas amenazas al uso de toxinas Cry en cultivos transgénicos. Estrategias de IRM específicas, tales como la alta dosis y el refugio estructurado, tienen la capacidad de disminuir la probabilidad de que los insectos desarrollen resistencia a ciertas toxinas Cry. Prácticas de IRM eficaces pueden reducir el riesgo de desarrollo de resistencia.

En su página web, la Agencia de Protección Medioambiental de los Estados Unidos (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) publica los siguientes requisitos para proporcionar refugios constituidos de plantas portadoras de toxinas distintas de Cry para su uso con cultivos transgénicos que producen una única toxina Cry activa contra plagas objetivo.

"Los requisitos estructurados específicos para productos de maíz Bt protegidos del barrenador del maíz (Cry1 Ab o Cry1 F) son los siguientes:

□ Refugios estructurados:

20 % de refugios del maíz Bt no de lepidóptero en el cinturón del maíz;

50 % de refugios Bt no de lepidóptero en el cinturón del algodón

□ Bloques

Internos (es decir, dentro del campo Bt)

Externos (es decir, campos separados / milla (800 m) ( / de milla (400 m) si es posible) del campo Bt para maximizar el emparejamiento aleatorio)

□ Tiras en el campo

Las tiras deben ser al menos 4 hileras de ancho (preferentemente 6 hileras) para reducir los efectos del movimiento de las larvas"

Además, la Asociación Nacional de Productores de Maíz, en su página web: (ncga.com/insect-resistance-managementfact-sheet-bt-corn) también proporciona orientación similar referente a los requisitos de los refugios. Por ejemplo:

"Requisitos del IRM del barrenador del maíz:

□ Sembrar al menos el 20% de sus hectáreas de maíz con híbridos refugio

□ En regiones productoras de algodón, el refugio debe ser del 50 %

□ Se debe sembrar en 1/2 milla (800 m) de los híbridos refugio

□ El refugio se puede sembrar como tiras dentro del campo Bt; las tiras de refugio deben ser de al menos 4 hileras de ancho

□ El refugio se puede tratar con pesticidas convencionales solo si se logran los umbrales económicos para el insecto objetivo

□ Los insecticidas pulverizables basados en Bt no se pueden usar en el maíz refugio

□ Se debe sembrar el refugio apropiado en cada explotación con maíz Bt"

Existen diversas formas de proporcionar los efectos de IRM de un refugio, que incluye diversos patrones de siembra geométricos en los campos (como se ha mencionado anteriormente) y mezclas de semilla en sacos, como se trata adicional por Roush et al. (arriba) y la patente de EE. UU. N.° 6.551.962.

Toxinas de insecto y variantes activas de insecto. Además de los genes y proteínas específicamente ejemplificados como se trata en el presente documento, se incluyen variantes insecticidamente activas. Por el término "variante", los solicitantes pretenden incluir fragmentos, ciertos mutantes de deleción e inserción, y ciertas proteínas de fusión. La proteína Cry1 Da es una toxina Cry de tridominio clásico. Como prefacio para describir variantes de la toxina de insecto Cry1 Da que están incluidas en la invención, será útil revisar brevemente la arquitectura de las toxinas Cry de tridominio en general y de la toxina de insecto Cry1 Da.

La mayoría de las moléculas de proteína cristalina de delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis están compuestas de dos segmentos funcionales. La toxina central resistente a proteasa es el primer segmento y corresponde a aproximadamente la primera mitad de la molécula de proteína. La molécula de protoxina completa de ~130 kDa es rápidamente procesado por proteasas en el intestino del insecto dando el segmento central resistente. El segmento que se deleciona por este procesamiento se denominará en el presente documento el "segmento de protoxina". Se cree que el segmento de protoxina participa en la formación de cristales de toxina (Arvidson et al., (1989). El segmento de protoxina puede así llevar una a especificidad de insecto parcial por la toxina limitando la accesibilidad del núcleo al insecto reduciendo el procesamiento de proteasa de la molécula de toxina (Haider et al., (1986) o reduciendo la solubilidad de la toxina (Aronson et al., (1991). Las toxinas B.t., incluso dentro de una cierta clase, varían de algún modo en la longitud y en la localización precisa de la transición de la porción de toxina central a la porción de protoxina. La transición de la porción de toxina central a la porción de protoxina ocurrirá normalmente en entre aproximadamente el 50 % y aproximadamente el 60 % de la toxina de longitud completa.

Se han determinado estructuras cristalinas tridimensionales para Cry1 Aa1, Cry2Aa1, Cry3Aa1, Cry3Bb1, Cry4Aa, Cry4Ba y Cry8Ea1. Estas estructuras para las toxinas centrales son sorprendentemente similares y comprenden tres dominios distintos (revisado en de Maagd et al., 2003).

Variantes de toxinas de insecto creadas haciendo un número limitado de deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos Las deleciones, sustituciones y adiciones de aminoácidos a las secuencias de aminoácidos ejemplificadas se pueden hacer fácilmente de un modo secuencial y los efectos de dichas variaciones sobre la actividad insecticida se pueden probar por bioensayo. El número de cambios proporcionado está limitado en número, dicha prueba no implica experimentación no razonable. La invención incluye variantes insecticidamente activas de la proteína central en las que se han hecho hasta 10, hasta 15, o hasta 20 adiciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos.

Se incluyen variantes insecticidamente activas de Cry1 Da, es decir, incluyen las que tienen un segmento de toxina central, es decir, al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a una secuencia de aminoácidos ejemplificada como se usa en el presente documento. También se incluyen proteínas activas similares que tienen al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 % o 94 % de identidad con una secuencia ejemplificada.

Según procedimientos de nomenclatura oficiales, la nomenclatura de Cry y B.t. se basa en límites de aproximadamente 95 % (Cry1 Da, por ejemplo), 78 % (Cry1 D) y 45 % (Cry1), por "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum y D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813.

Se pueden preparar variantes haciendo mutaciones aleatorias o se pueden diseñar las variantes. En el caso de mutantes diseñados, existe una alta probabilidad de generación de variantes con actividad similar a la toxina nativa cuando la identidad de aminoácidos se mantiene en regiones críticas de la toxina que explican la actividad biológica o participan en la determinación de la configuración tridimensional que por último lugar es responsable de la actividad biológica. Una alta probabilidad de retención de actividad también ocurrirá si las sustituciones son conservativas. Los aminoácidos se pueden clasificar en las siguientes clases: no polar, polar sin carga, básico y ácido. Es menos probable que las sustituciones conservativas por las cuales un aminoácido de una clase se sustituye por otro aminoácido del mismo tipo alteren materialmente la actividad biológica de la variante. Lo siguiente son lista de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

En algunos casos, también se pueden hacer sustituciones no conservativas. El factor crítico es que estas sustituciones no deben quitar significativamente valor a la actividad biológica de la toxina. Las variantes incluyen polipéptidos que se diferencian en la secuencia de aminoácidos debido a mutagénesis. Las proteínas de variante englobadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, retención de la actividad pesticida.

También se pueden diseñar proteínas de variante que se diferencian al nivel de secuencia, pero que retienen la misma estructura tridimensional esencial global o similar, distribución de carga superficial y similares. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 7058515; Larson et al., (2002); Stemmer (1994a, 1994b, 1995); y Crameri et al., (1996a, 1996b, 1997).

Ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos aislados que codifican las toxinas de insecto Cry1 Da son un aspecto de la presente invención. Esto incluye los novedosos usos objeto de ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6, y complementos de los mismos, así como otros ácidos nucleicos que codifican variantes insecticidamente activas. Por "aislado" los solicitantes indican que las moléculas del ácido nucleico se han retirado de su entorno nativo y han sido puestas en un entorno diferente por la mano del hombre. Debido a la redundancia del código genético, una variedad de diferentes secuencias de ADN puede codificar las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento. Está perfectamente dentro de la experiencia de un experto en la técnica crear estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas toxinas, o esencialmente las mismas.

Las secuencias codificantes de la invención objeto pueden estar unidas operativamente a un promotor heterólogo, que incluye un promotor no B.t. Dichas secuencias se pueden incluir en construcciones de expresión, casetes de transformación y casetes de expresión que incluyen aquellos que se presentan reproduciblemente en, por ejemplo, un genoma de planta.

Síntesis de genes Se pueden preparar genes que codifican las proteínas Cry mejoradas descritas en el presente documento mediante una variedad de métodos muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, los segmentos de genes sintéticos y genes sintéticos se pueden preparar por química de triéster de fosfito y fosforamidito (Caruthers et al, 1987), y están disponibles vendedores comerciales para realizar la síntesis de genes por encargo. Se pueden ensamblar genes de longitud completa en una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, por ligamiento de fragmentos de restricción o ensamblaje por reacción en cadena de la polimerasa de oligonucleótidos solapantes (Stewart y Burgin, 2005). Además, se pueden preparar deleciones de genes terminales por amplificación por PCR usando oligonucleótidos terminales específicos de sitio.

Se pueden preparar ácidos nucleicos que codifican toxinas de insecto Cry1 Da, por ejemplo, por construcción sintética por métodos actualmente puestos en práctica por cualquiera de varios proveedores comerciales (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 7482119 B2). Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, también se pueden construir sintéticamente, por ejemplo, por uso de un sintetizador de genes y los métodos de diseño de, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 53 80831. Alternativamente, variaciones de genes sintéticos o que existen de forma natural pueden ser fácilmente construidas usando técnicas habituales de biología molecular para hacer mutaciones puntuales. También se pueden preparar fragmentos de estos genes usando exonucleasas o endonucleasas comercialmente disponibles, según procedimientos convencionales. Por ejemplo, se pueden usar enzimas tales como Bal31 o mutagénesis dirigida al sitio para cortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. Por tanto, se pueden obtener fragmentos de genes que codifican fragmentos de toxina activa usando una variedad de enzimas de restricción.

Dada la secuencia de aminoácidos para una toxina de insecto Cry1 Da, se puede diseñar una secuencia codificante por traducción inversa de la secuencia de aminoácidos usando codones preferidos por el hospedador previsto, y refinando luego la secuencia usando codones alternativos para retirar secuencias que podrían causar problemas y proporcionar codones de terminación periódicos para eliminar secuencias codificantes abiertas largas en los marcos de lectura no codificantes.

Cuantificación de la identidad de secuencia Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias del ácido nucleico, las secuencias se alinean para fines de comparación óptima. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones solapantes) x 100). En una realización, las dos secuencias son de la misma longitud. El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a las descritas a continuación, con o sin permitir huecos. Al calcular el porcentaje de identidad, normalmente se cuentan las coincidencias exactas.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede conseguirse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de dicho algoritmo es el de Altschul et al. (1990), y Karlin y Altschul (1990), modificado como en Karlin y Altschul (1993), e incorporado en los programas BLASTN y BLASTX. Las búsquedas de BLAST se pueden usar convenientemente para identificar secuencias homólogas (similares) a una secuencia de búsqueda en bases de datos nucléicas o de proteína. Las búsquedas de BLASTN se pueden realizar (puntuación = 100, longitud de palabra = 12) para identificar secuencias de nucleótidos que tienen homología con las moléculas del ácido nucleico reivindicadas de la invención. Las búsquedas de BLASTX se pueden realizar (puntuación = 50, longitud de palabra = 3) para identificar secuencias de aminoácidos que tienen homología con las moléculas de proteínas insecticidas reivindicadas de la invención.

Se puede utilizar Gapped BLAST, Altschul et al., (1997), para obtener alineaciones con huecos para fines de comparación. Alternativamente, se puede usar PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas, Altschul et al., (1997). Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos. Véase www.ncbi.nlm.nih.gov.

Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Thompson et al., (1994). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o de ADN, y así puede proporcionar datos sobre la conservación de secuencias de la secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleótidos entera. El algoritmo ClustalW se usa en varios paquetes de software de análisis de ADN/aminoácidos comercialmente disponibles, tales como el módulo ALIGNX del Vector NTI Program Suite (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Cuando se alinean secuencias de aminoácidos con ALIGNX, se pueden usar convenientemente los parámetros por defecto con una penalización por abertura de hueco de 10, una penalización por extensión de hueco de 0,1 y la matriz de comparación blosum63mt2 para evaluar el porcentaje de similitud de aminoácidos (consenso) o identidad entre las dos secuencias. Cuando se alinean secuencias de ADN con ALIGNX, se pueden usar convenientemente los parámetros por defecto con una penalización por abertura de hueco de 15, una penalización por extensión de hueco de 6,6 y la matriz de comparación swgapdnamt para evaluar el porcentaje de identidad entre las dos secuencias.

Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el de Myers y Miller (1988). Dicho algoritmo se incorpora en el programa wSTRETCHER, que es parte del paquete de software de alineación de secuencias wEMBOSS (disponible en http://emboss.sourceforge.net/). wSTRETCHER calcula una alineación global óptima de dos secuencias usando una modificación del algoritmo de programación dinámico clásico que usa el espacio lineal. La matriz de sustitución, la penalización por inserción de huecos y las penalizaciones por extensión de huecos usadas para calcular la alineación se pueden especificar. Cuando se utiliza el programa wSTRETCHER para comparar secuencias de nucleótidos, se puede usar una penalización por abertura de hueco de 16 y una penalización por extensión de hueco de 4 con el archivo de matriz de puntuación EDNAFULL. Cuando se usa para comparar secuencias de aminoácidos, se puede usar una penalización por abertura de hueco de 12 y una penalización por extensión de hueco de 2 con el archivo de matriz de puntuación EBLOSUM62.

Un ejemplo no limitante adicional de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el de Needleman y Wunsch (1970), que se incorpora en los paquetes de software de alineación de secuencias GAP Versión 10 y wNEEDLE (http://emboss.sourceforge.net/). GAP Versión 10 se puede usar para determinar la identidad o similitud de secuencia usando los siguientes parámetros: para una secuencia de nucleótidos, el % de identidad y el % de similitud se encuentran usando un peso de hueco de 50 y un peso de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna. cmp. Para la comparación de secuencias de aminoácidos, el % de identidad o el % de similitud se determinan usando el peso de hueco de 8 y peso de longitud de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62.

wNEEDLE lee dos secuencias de entrada, encuentra la alineación óptima (incluyendo huecos) a lo largo de su longitud entera, y escribe su alineación de secuencias global óptima en un archivo. El algoritmo explora todas las alineaciones posibles y elige la mejor, usando una matriz de puntuación que contiene valores para cada coincidencia de residuo o nucleótido posible. wNEEDLE encuentra la alineación con la máxima puntuación posible, donde la puntuación de una alineación es igual a la suma de las coincidencias tomadas de la matriz de puntuación, menos las penalizaciones que surgen de la abertura y extensión de huecos en las secuencias alineadas. La matriz de sustitución y las penalizaciones por abertura y de hueco son específicas del usuario. Cuando las secuencias de aminoácidos se comparan, se usan una penalización por abertura de hueco por defecto de 10, una penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de comparación EBLOSUM62. Cuando se comparan secuencias de ADN usando wNEEDLE, se usa una penalización por abertura de hueco de 10, una penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de comparación EDNAFLTLL.

También pueden usarse programas equivalentes. Por "programa equivalente" está previsto cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualesquiera dos secuencias en cuestión, genere una alineación que tenga coincidencias idénticas de nucleótidos o restos de aminoácido y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con la alineación correspondiente generada por ALIGNX, wNEEDLE o wSTRETCHER. El % de identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias con respecto a la región alineada informada (incluyendo cualquier hueco en la longitud) y el % de similitud es el porcentaje de coincidencias entre las dos secuencias a lo largo de la región alineada informada (incluyendo cualquier hueco en la longitud).

La alineación también puede realizarse manualmente por inspección.

Hospedadores recombinantes Los genes que codifican la toxina de insecto de la invención objeto se pueden introducir en una amplia variedad de hospedadores microbianos o de planta. La expresión del gen de toxina de insecto resulta, directa o indirectamente, en la producción intracelular y el mantenimiento de la proteína pesticida. Con hospedadores microbianos adecuados, por ejemplo Pseudomonas, los microbios se pueden aplicar al entorno de la plaga, donde proliferarán y serán ingeridos. El resultado es un control de la plaga. Alternativamente, el microbio que alberga el gen de toxina de insecto se puede tratar en condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La célula tratada, que retiene la actividad tóxica, se puede aplicar entonces al entorno de la plaga diana. Células vegetales no regenerables / no totipotentes de una planta de la invención objeto (que comprende al menos uno de los genes de toxina Cry objeto) están incluidos dentro de la invención objeto.

Donde el gen de la toxina B.t. sea introducido por un vector adecuado en un hospedador microbiano, y dicho hospedador se aplique al entorno en un estado vivo, es esencial que se usen ciertos microbios hospedadores. Se seleccionan microorganismos hospedadores que se sabe que ocupan la ''fitosfera'' (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de manera que sean capaces de competir satisfactoriamente en el entorno particular (cultivo y otros hábitat de insecto) con los microorganismos autóctonos no mutantes, proporcionen mantenimiento y expresión estable del gen que expresa el polipéptido pesticida y, deseablemente, proporcionen protección mejorada del pesticida de la degradación e inactivación medioambiental.

Se conoce un gran número de microorganismos que habitan en el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas) y/o la rizosfera (la tierra que rodea las raíces de la planta) de una amplia variedad de cultivos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Son de interés particular los microorganismos, tales como bacterias, por ejemplo, los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Sinorhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; hongos, particularmente levadura, por ejemplo, los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. Son de interés particular dichas especies bacterianas de la fitosfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Sinorhizobium meliloti (antiguamente Rhizobium meliloti), Alcaligenes eutrophus y Azotobacter vinelandii; y especies de levadura de la fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans. Son de interés particular los microorganismos pigmentados.

Métodos de control de plagas de insectos. Cuando un insecto se pone en contacto con una cantidad eficaz de toxina suministrada por expresión de planta transgénica, composición (composiciones) de proteína formulada, composición (composiciones) de proteína pulverizable, una matriz de cebo u otro sistema de administración, los resultados son normalmente la muerte del insecto, o los insectos no se alimentan de la fuente que hace que las toxinas estén disponibles para los insectos.

Las toxinas de proteína objeto pueden ser "aplicadas" o proporcionadas para ponerse en contacto con los insectos objetivo en una variedad de formas. Por ejemplo, se pueden usar plantas transgénicas (en donde la proteína se produce por y está presente en la planta) y se conocen bien en la técnica. La expresión de los genes de toxina también se puede lograr selectivamente en tejidos específicos de las plantas, tales como las raíces, las hojas, etc. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, por el uso de promotores específicos de tejido. Las aplicaciones de pulverización son otro ejemplo y también se conocen en la técnica. Las proteínas objeto pueden ser formuladas apropiadamente para el uso final deseado, y luego se pulverizan (o aplican de otro modo) sobre la planta y/o alrededor de la planta / a la proximidad de la planta a proteger - antes de que se haya descubierto una infestación, después de que se hayan descubierto insectos objetivo, tanto antes como después, y similares. También se pueden usar, por ejemplo, gránulos de cebo y se conoce en la técnica.

Plantas transgénicas. Las proteínas objeto se pueden usar para proteger prácticamente cualquier tipo de planta del daño por una plaga de insectos. Los ejemplos de dichas plantas incluyen maíz, girasol, soja, algodón, canola, arroz, sorgo, trigo, cebada, vegetables, plantas ornamentales, pimientos (incluyendo chiles picantes), remolachas azucareras, fruta y césped, por nombrar algunos. Los métodos de transformación de las plantas se conocen bien en la técnica, y en los Ejemplos se describen métodos ilustrativos de transformación.

Una realización preferida de la invención objeto es la transformación de plantas con genes que codifican la proteína insecticida objeto o sus variantes. Las plantas transformadas son resistentes al ataque por una plaga de insectos objetivo en virtud de la presencia de cantidades de control de la proteína insecticida objeto o sus variantes en las células de la planta transformada. Incorporando material genético que codifica las propiedades insecticidas de las toxinas insecticidas B.t. en el genoma de una planta comida por una plaga de insectos particular, el adulto o la larva moriría después de consumir la planta alimento. Se han transformado numerosos miembros de clasificaciones de monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los cultivos agronómicos transgénicos, así como las frutas y las verduras, son de interés comercial. Dichos cultivos incluyen, pero no se limitan a, maíz, arroz, soja, canola, girasol, alfalfa, sorgo, trigo, algodón, cacahuetes, tomates, patatas y similares. Existen varias técnicas para introducir material genético exógeno en células vegetales, y para obtener plantas que mantienen y expresan establemente el gen introducido. Dichas técnicas incluyen la aceleración del material genético recubierto sobre micropartículas directamente en células (patente de EE. UU. N.° 4945050 y patente de EE. UU. N.° 5141131). Las plantas se pueden transformar usando tecnología de Agrobacterium, véanse la patente de EE. UU. N.° 5177010, la patente de EE. UU. N.° 5104310, la solicitud de patente europea N.° 0131624B1, la solicitud de patente europea N.° 120516, la solicitud de patente europea N.° 159418B1, la solicitud de patente europea N.° 176112, la patente de EE. UU. N.° 5149645, la patente de EE. UU. N.° 5469976, la patente de EE. UU. N.° 5464763, la patente de Ee . UU. N.° 4940838, la patente de EE. UU. N.° 4693976, la solicitud de patente europea N.° 116718, la solicitud de patente europea N.° 290799, la solicitud de patente europea N.° 320500, la solicitud de patente europea N.° 604662, la solicitud de patente europea N.° 627752, la solicitud de patente europea N.° 0267159, la solicitud de patente europea N.° 0292435, la patente de e E. UU. N.° 5231019, la patente de EE. UU. N.° 5463174, la patente de EE. UU. N.° 4762785, la patente de e E. UU. N.° 5004863 y la patente de EE. UU. N.° 5159135. Otra tecnología de transformación incluye la tecnología WHISKFRS™, véase la patente de EE. UU. N.° 5302523 y la patente de EE. UU. N.° 5464765. La tecnología de electroporación también se ha usado para transformar plantas, véase el documento de patente WO 87/06614, la patente de EE. UU. N.° 5472869, la patente de EE. UU. N.° 5384253, el documento de patente WO 9209696 y el documento de patente WO 9321335. Además de numerosas tecnologías para transformar plantas, el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes exógenos puede variar también. Dicho tejido incluiría, pero no se limitaría a, tejido embrionario, tejido de callo de tipo I y II, hipocótilo, meristemo y similares. Casi todos los tejidos de planta se pueden transformar durante la desdiferenciación usando técnicas apropiadas dentro de la experiencia de un experto.

Los genes que codifican toxinas insecticidas Cry1 Da se pueden insertar en células vegetales usando una variedad de técnicas que se conocen bien en la técnica como se desvela anteriormente. Por ejemplo, está disponible un gran número de vectores de clonación que comprenden un marcador que permite la selección de las células microbianas transformadas y un sistema de replicación funcional en Escherichia coli para la preparación y modificación de genes exógenos para su inserción en plantas superiores. Dichas manipulaciones pueden incluir, por ejemplo, la inserción de mutaciones, truncaciones, adiciones o sustituciones según se desee para el uso previsto. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, etc. Por consiguiente, la secuencia que codifica la proteína Cry o variantes se puede insertar en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se usa para la transformación de E. coli, cuyas células se cultivan en un medio nutritivo adecuado, luego se recogen y se lisan de manera que se recuperen cantidades útiles del plásmido. El análisis de secuencias, análisis de fragmentos de restricción, electroforesis y otros métodos bioquímicos-de biología molecular se llevan a cabo, en general, como métodos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN usada se puede escindir y unir a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de ADN manipulada se puede clonar en el mismo plásmido u otros plásmidos.

El uso de vectores que contienen T-ADN para la transformación de células vegetales se ha investigado ampliamente y descrito suficientemente en la solicitud de patente europea N.° 120516; Lee y Gelvin (2008), Fraley etal., (1986), y An et al., (1985), y está bien establecido en el campo.

Una vez el ADN insertado se ha integrado en el genoma de la planta, es relativamente estable en todas las generaciones posteriores. El vector usado para transformar la célula de planta contiene normalmente un gen marcador de selección que codifica una proteína que confiere a las células vegetales transformadas resistencia a un herbicida o un antibiótico, tal como a bialafos, kanamicina, G418, bleomicina o higromicina, entre otros. El gen marcador de selección individualmente empleado debe permitir, por consiguiente, la selección de células transformadas mientras que el crecimiento de células que no contienen el ADN insertado es suprimido por el compuesto selectivo.

Está disponible un gran número de técnicas para insertar ADN en una célula de planta hospedadora. Los técnicas incluyen transformación con T-ADN suministrado por Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación. Además, se puede emplear fusión de protoplastos de planta con liposomas que contienen el ADN a administrar, inyección directa de ADN, transformación biolística (bombardeo con micropartículas) o electroporación, así como otros posibles métodos.

En una realización preferida de la invención objeto, las plantas se transformarán con genes en donde el uso de codones de la región codificante de proteína se ha optimizado para las plantas. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 5380831. Por tanto, ventajosamente, se usarán plantas que codifican una toxina truncada. La toxina truncada codificará normalmente aproximadamente del 55 % a aproximadamente el 80 % de la toxina de longitud completa. Se conocen en la técnica métodos para crear genes B.t. sintéticos para su uso en plantas (Stewart 2007).

Independientemente de la técnica de transformación, el gen se incorpora preferentemente en un vector de transferencia génica adaptado para expresar los genes de toxinas insecticidas B.t. y variantes en la célula de planta, incluyendo en el vector de un promotor de planta. Además de los promotores de planta, los promotores de una variedad de fuentes se pueden usar eficientemente en células vegetales para expresar genes exógenos. Por ejemplo, se pueden usar los promotores de origen bacteriano, tales como el promotor de la octopina sintasa, el promotor de la nopalina sintasa, el promotor de la manopina sintasa; los promotores de origen vírico, tales como los promotores del virus del mosaico de la coliflor35S y 19S, y similares. Los promotores de planta incluyen, pero no se limitan a, subunidad pequeña (ssu) de la ribulosa-1,6-bisfosfato (RUBP) carboxilasa, promotor de la beta-conglicinina, promotor de la faseolina, promotor de la ADH (alcohol deshidrogenasa), promotores del choque térmico, promotor del ADF (factor de despolimerización de actina) y promotores específicos de tejido. Los promotores también pueden contener ciertos elementos potenciadores de secuencia que pueden mejorar la eficiencia de la transcripción. Potenciadores típicos incluyen, pero no se limitan a, ADH1-intrón 1 y ADH1-intrón 6. Se pueden usar promotores constitutivos. Los promotores constitutivos dirigen la expresión génica continua en casi todos los tipos de células y en casi todo momento (por ejemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S). Los promotores específicos de tejido son responsables de la expresión génica en tipos específicos de célula o tejido, tales como las hojas o las semillas (por ejemplo, zeína, oleosina, napina, ACP (proteína transportadora de acilo)), y estos promotores también se pueden usar. También se pueden usar promotores que son activos durante un cierto estadio del desarrollo de las plantas, así como activos en tejidos y órganos de la planta específicos. Los ejemplos de dichos promotores incluyen, pero no se limitan a, promotores que son específicos de raíz, específicos del polen, específicos de embrión, específicos de la seda del maíz, específicos de la fibra del algodón, específicos del endospermo de la semilla, específicos del floema y similares.

En ciertas circunstancias se puede desear usar un promotor inducible. Un promotor inducible es responsable de la expresión de genes en respuesta a una señal específica, tal como: estímulo físico (por ejemplo, genes de choque térmico); luz (por ejemplo, RUBP carboxilasa); hormona (por ejemplo, glucocorticoide); antibiótico (por ejemplo, tetraciclina); metabolitos; y estrés (por ejemplo, sequía). Se pueden usar otros elementos de transcripción y traducción deseables que funcionan en las plantas, tales como secuencias conductoras sin traducir de 5', secuencias de terminación de la transcripción de ARN y secuencias señalizadoras de la adición de poli-adenilato. Se conocen en la técnica numerosos vectores de transferencia génica específicos de planta.

Los cultivos transgénicos que contienen rasgos de resistencia a insectos (IR) son predominantes en plantas de maíz y algodón en toda América del Norte, y el uso de estos rasgos se está expandiendo globalmente. Los cultivos transgénicos comerciales que combinan rasgos de IR y tolerancia a herbicidas (HT) han sido desarrollados por múltiples empresas de semillas. Estos incluyen combinaciones de rasgos de IR conferidos por proteínas insecticidas B.t. y rasgos de HT, tales como tolerancia a los inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS), tales como sulfonilureas, imidazolinonas, triazolopirimidina, sulfonanilidas y similares, inhibidores de la glutamina sintetasa (GS), tales como bialafos, glufosinato y similares, inhibidores de la 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), tales como mesotriona, isoxaflutol y similares, inhibidores de la 5-enolpiruvilsikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), tales como glifosato y similares, e inhibidores de la acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa), tales como haloxifop, quizalofop, diclofop y similares. Se conocen otros ejemplos en los que las proteínas transgénicamente proporcionadas proporcionan tolerancia por parte de las plantas a clases químicas de herbicidas, tales como herbicidas de ácidos fenoxi y herbicidas de piridiloxiacetato auxina (véase el documento de patente WO 2007/053482 A2), o herbicidas de ácidos fenoxi y herbicidas de ariloxifenoxipropionato (véase el documento de patente WO 2005107437 A2, A3). La capacidad para controlar problemas por múltiples plagas mediante los rasgos de IR es un concepto de producto comercial valioso, y la conveniencia de este concepto de producto se potencia si los rasgos de control de insectos y los rasgos de control de malas hierbas se combinan en la misma planta. Además, se puede obtener un valor mejorado por combinaciones de plantas individuales de rasgos de IR conferidos por una proteína insecticida B.t., tal como la de la invención objeto, con uno o más rasgos de HT adicionales, como los mencionados anteriormente, más uno o más rasgos de entrada adicionales (por ejemplo, resistencia a otros insectos conferida por proteínas insecticidas derivas de B.t. u otras proteínas insecticidas, resistencia a insectos conferida por mecanismos tales como iARN y similares, resistencia a enfermedades, tolerancia al estrés, utilización mejorada del nitrógeno y similares), o rasgos de salida (por ejemplo, alto contenido de aceites, composición de aceites saludables, mejora nutricional y similares). Dichas combinaciones se pueden obtener ya sea mediante cultivo convencional (pila de cultivo) o conjuntamente como un novedoso evento de transformación que implica la introducción simultánea de múltiples genes (pila molecular). Los beneficios incluyen la capacidad de gestionar plagas de insectos y el control mejorado de las malas hierbas en una planta de cultivo que proporciona beneficios secundarios al productor y/o el consumidor. Por lo tanto, la invención objeto se puede usar en combinación con otros rasgos para proporcionar un paquete agronómico completo de calidad mejorada de los cultivos con la capacidad de controlar de forma flexible y rentable cualquier número de problemas agronómicos.

A menos que se indique o implique específicamente, los términos "un", "una", "el" y "la" significan "al menos uno", como se usa en el presente documento.

Lo siguiente son ejemplos que ilustran procedimientos para poner en práctica la invención. Estos ejemplos no se deben interpretar como limitantes. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla de disolventes son en volumen, a menos que se indique lo contrario. Todas las temperaturas son en grados Celsius.

EJEMPLO 1

Construcción de plásmidos que codifican DIG-911 y DIG-180, y expresión en hospedadores bacterianos

La proteína DIG-911 (toxina insecticidas quimérica Cry1Da2/Cry1Ab; SEQ ID NO:2) consiste en un segmento de toxina central de Cry1 Da (aminoácidos 1 a 594, como se desvela en N.° de acceso de GenBank 176415.1 y patente de EE. UU. N.° 5.691.308) y un segmento de protoxina derivado de Cry1Ab (aminoácidos 595 a 1139 de DIG-911), esencialmente como se desvela en N.° de acceso de GenBank AFK79795.1). El uso del segmento de toxina central Cry1Da en combinaciones con otras toxinas insecticidas Cry o Vip se ha desvelado previamente en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N.220130007923, 20120331590, 20120331589 y 20120317681, pero no se ha contemplado el uso de la proteína insecticida Cry1 Da para controlar el gusano de la mazorca del maíz (CEW; Helicoverpa zea (Boddie)).

A menos que se indique lo contrario, las manipulaciones biológicas moleculares y bioquímicas descritas en este y los EJEMPLOS posteriores se realizaron por metodologías habituales como se desvela en, por ejemplo, Sambrook et al., eds. (1989 y actualizaciones, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.), Ausubel et al., eds. (1995 y actualizaciones, Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York) y Harlow & Lane, eds. (1988 y actualizaciones, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY). Se usaron métodos habituales de clonación en la construcción de plásmidos de expresión de Pseudomonas fluorescens (Pf) manipulados para producir proteínas DIG-911 y DIG-180 (es decir, Cry1Fa2; SEQ ID NO:4). Se realizaron preparaciones de plásmido usando NUCLEOSPIN PlASMID K it (MACHEREY-NAGEL Inc, Bethlehem, PA), siguiendo las instrucciones de aislamiento de plásmidos de baja copia del proveedor.

La estrategia básica de clonación conllevó la subclonación de un fragmento de ADN que tenía la secuencia codificante (CDS) de DIG-911 o DIG-180, como se proporciona por SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3, respectivamente, en pDOW1 169 en sitios de restricción Spel o Xbal, y Xhol o Salí, por lo que las CDS de DIG-911 y DIG-180 se pusieron bajo el control de expresión del promotor Ptac y el terminador rrnBT1T2 del plásmido pKK₂23-3 (PL PHARMACIA, Milwaukee, Wl). pDOW1169 es un plásmido de copias del medio con el origen de replicación RSF1010 y un gen pyrF (patente de EE. UU. N.° 7.618.799). Los fragmentos de ADN que comprenden secuencias de la región codificante de proteína se pueden clonar en ADN de pDOW1169 en un sitio de restricción en la dirección 3' de un sitio de unión al ribosoma presente dentro de la secuencia de pDOW1169, o, alternativamente, se puede introducir un sitio de unión al ribosoma separado como una secuencia presente en el fragmento de la región codificante en la dirección 5' de la región codificante de proteína. El ADN del plásmido de expresión pDOW2848 (DIG-911) se transformó por electroporación en células DC454 (una cepa de P. fluorescens casi no mutante que tenía las mutaciones ApirF y lsc::lacIQI), y se transformó ADN de pDAB1817 (DIG-180) en células MB214). Se dejó que las células transformadas se recuperaran en medio de hidrolizado SOC-Soy, y entonces se sembró en medios selectivos (agar de glucosa M9 que carece de uracilo o sobre el medio LB que contiene tetraciclina en concentraciones apropiadas; Sambrook et al., arriba). Están disponibles detalles de las manipulaciones microbiológicas para P. fluorescens en Squires et al. (2004), patente de EE. ^u U. N.° 7.985.564, patente de EE. UU. N.° 7.681.799 y solicitud de patente de EE. UU. N.° 20080058262. Se identificaron colonias recombinantes por digestión con restricción de ADN de plásmido miniprep.

Crecimiento y análisis de expresión en matraces con agitación. Se llevó a cabo la producción de proteínas DIG-911 y DIG-180 para la caracterización y el bioensayo de insectos por la cepa DPf150 (que aloja el plásmido pDOW2848) o la cepa Dpf129 (que aloja el plásmido pDAB1817) de P. fluorescens cultivada en matraces con agitación. Se usaron cultivos de semillas crecidos en medio M9 complementado con 1 % de glucosa y oligoelementos para inocular 50 ml de medio mínimo definido con 5 % de glicerol (Cat. de TEKNOVA N.° 3D7426, Hollister, CA). La expresión de los genes DIG-911 o DIG-180 por el promotor Ptac se indujo mediante la adición de isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) después de una incubación inicial de 24 horas a 30 °C con agitación. Los cultivos se muestrearon en el momento de la inducción y en diversos momentos después de la inducción. La densidad celular se midió por densidad óptica a 600 nm (DO⁶⁰⁰). También se pueden utilizar otros medios de cultivo adecuados para el crecimiento de Pseudomonas fluorescens.

Fraccionamiento celular y análisis de SDS-PAGE de muestras en matraz oscilante. En cada momento de muestreo, se centrifugaron alícuotas de 2 ml a 14000 x g durante cinco minutos, y los sedimentos de células se almacenaron a -80 °C. Para la extracción de proteína, los sedimentos se descongelaron y se suspendieron en 0,5 ml de tampón fosfato a pH 7,2. Las células se lisaron por sonicación usando un BRANSON 250 SONIFIER (BRANSON ULTRAs On ICS, Danbury CT) usando una micropunta de 1/8 de pulgada (3,2 mm) de diámetro con una salida constante de 20 unidades. Se usaron dos ráfagas de 45 segundos con varios minutos de enfriamiento de la muestra sobre hielo entre ráfagas. Después de que el lisado se fraccionara por centrifugación en una Microfuge durante 5 minutos a 14.000 rpm, el sobrenadante (fracción soluble) se retiró y el sedimento se suspendió en 0,5 ml de tampón fosfato (fracción insoluble).

Las muestras se mezclaron 1:3 con 4X tampón de muestra de Laemmli que contenía p-mercaptoetanol (Sambrook et al., arriba) y se hirvió durante 5 minutos antes de cargar sobre gel de 4-20 % de Tris-glicina SDS poliacrilamida NOVEX® (INVITROGEN, Carlsbad, CA). La electroforesis se realizó en tampón de electroforesis Tris Glicina NOVEX® (INVITROGEN). Los geles se tiñeron con tinción de Coomassie BIO-SAFE según el protocolo del fabricante (BIO-RAD Inc., Hercules, CA).

Preparación de cuerpos de inclusión. Se realizaron preparaciones de cuerpos de inclusión (IB) de proteína Cry en células de fermentaciones de P. fluorescens que produjeron proteína insecticida B.t. insoluble, como se demuestra por SDS-PAGE y MALDI-EM (espectrometría de masas con desorción/ionización de láser asistida por matriz). Se descongelaron sedimentos de fermentación de P. fluorescens en un baño de agua a 37 °C. Las células se resuspendieron al 25 % p/v en tampón de lisis (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, sal de disodio de EDTA 20 mM (ácido etilendiaminatetraacético), 1 % de Triton X-100 y ditiotreitol 5 mM (DTT); se añadieron 5 ml/l de mezcla de inhibidor de la proteasa bacteriano (P8465 SIGMA-ALDRICH, St. Louis, MO) justo antes de uso. Se obtuvo una suspensión completa usando un homogeneizador portátil al ajuste más bajo (TISSu E TEAROR™, BIOSPEC PRODUCTS, OK). Se añadió lisozima (25 mg de SIGMA L7651, de clara de huevo de gallina) a la suspensión de células mezclando con una espátula de metal, y la suspensión se incubó a temperatura ambiente durante una hora. La suspensión se enfrió sobre hielo durante 15 minutos, luego se sonicó usando un b Ra NSON 250 SONIFIER (dos sesiones de 1 minuto, un ciclo de trabajo del 50 %, 30 % de salida). Se comprobó la lisis celular por microscopía. Se añadieron 25 mg adicionales de lisozima si fuera necesario, y se repitieron la incubación y la sonicación. Cuando la lisis celular se confirmó por microscopía, el lisado se centrifugó a 11.500 x g durante 25 minutos (4°) para formar el sedimento IB, y se desechó el sobrenadante. El sedimento IB se resuspendió con 100 ml de tampón de lisis, se homogeneizó con la mezcladora manual y se centrifugó como antes. El sedimento IB se lavó repetidamente por resuspensión (en 50 ml de tampón de lisis), homogenización, sonicación y centrifugación hasta que el sobrenadante se volvió incoloro y el sedimento IB se volvió firme y de color blanquecino. Para el lavado final, el sedimento IB se resuspendió en agua destilada filtrada estéril (0,22 μm) que contenía EDTA 2 mM, y se centrifugó. El sedimento final se resuspendió en estéril

Solubilización de cuerpos de inclusión. Se centrifugaron seis ml de suspensiones de cuerpos de inclusión de cepas aisladas de Pf DPf150 o Dpf129 (que contenían aproximadamente 30 mg/ml de proteína DIG-911 o DIG-180) al máximo ajuste en una Microfuge (aproximadamente 14.000 x g) para sedimentar las inclusiones. Se retiró el sobrenadante de tampón de almacenamiento y se sustituyó con 25 ml de tampón carbonato sódico 100 mM, pH 11, en un tubo cónico de 50 ml. Las inclusiones se resuspendieron usando una pipeta y se mezclaron bien para mezclar minuciosamente. El tubo se dispuso sobre una plataforma de balanceo suave a 4° durante la noche para extraer la proteína diana. El extracto se centrifugó a 30.000 x g durante 30 min a 4°, y el sobrenadante resultante se concentró 5 veces usando un dispositivo de filtro centrífugo de celulosa regenerada AMICON ULTRA-15 (corte de peso molecular 30.000; MILLIPORE). El tampón de muestra se cambió entonces a CAPS 10 mM (ácido 3-(ciclohexamino)-1-propano sulfónico) pH 10, usando columnas desechables PD-10 (GE HEALTHCARE, Piscataway, NJ).

El análisis de SDS-PAGE y la cuantificación de proteína en preparados de IB se hicieron por descongelación de una alícuota de 1 ml de sedimento de IB y dilución 1:20 con agua destilada filtrada estéril. La muestra diluida se hirvió entonces con 4X tampón de muestra reductor (Tris 250 mM, pH 6,8, 40 % de glicerol (v/v), 0,4 % de azul de bromofenol (p/v), 8 % de SDS (p/v) y 8 % de p-mercaptoetanol (v/v)) y se cargó sobre un gel de 12+2 pocillos de 4-20 % de T ris-glicina NOVEX® (INVITROg En ) migrado con ¹X tampón Tris/glicina/SDS (BIO-RAD). El gel migró durante aproximadamente 60 min a 200 voltios, luego se tiñó con azul de Coomassie (50 % de G-250/50 % de R-250 en 45 % de metanol, 10 % de ácido acético), y se destiñó con 7 % de ácido acético, 5 % de metanol en agua destilada. La cuantificación de las bandas objetivo se hizo comparando valores densitométricos para las bandas contra muestras de albúmina de suero bovino (BSA) migradas en el mismo gel para generar una curva patrón. El extracto concentrado se preparó para la electroforesis diluyendo 1:50 en tampón de muestra NuPAGE® LDS (INVITROGEN) que contenía ditiotreitol 5 mM como agente reductor y se calentó a 95 °C durante 4 minutos. La muestra se cargó en carriles duplicados de un gel de 4-12 % de NuPAGE® junto con cinco patrones de BSA que variaron de 0,2 a 2 μg/carril (para la generación de curvas patrón). La tensión se aplicó a 200V usando tampón de electroforesis MOPS SDS (INVITROGEN) hasta que el colorante de seguimiento alcanzó la parte inferior del gel. El gel se tiñó con 0,2 % de azul de Coomassie G-250 en 45 % de metanol, 10 % de ácido acético, y se destiñó, primero brevemente con 45 % de metanol, 10 % de ácido acético, y luego largo y tendido con 7 % de ácido acético, 5 % de metanol hasta que se despejó el fondo. Tras desteñir, el gel se barrió con un BIO-RAD FLUOR-S MULTIIMAGER. Se usó el software del instrumento QUANTITY ONE v.4.5.2 para obtener volúmenes restados del fondo de las bandas de proteína teñidas y para generar la curva patrón de BSA que se usó para calcular la concentración de proteína DIG-911 o DIG-180 en la disolución madre.

EJEMPLO 2

Actividad de toxinas insecticidas DIG-911 y DIG-180 producidas en Pseudomonas fluorescens contra larvas de CEW

Preparación de muestras y bioensayos. Se diluyeron los preparados de cuerpos de inclusión en CAPS 10 mM a pH10 en el mismo tampón para administrar una dosis de 3.000, 1.000, 333,3, 111,1,37,0, 12,3 o 4,1 ng/cm² de la proteína Cry1 Da diana. Todos los bioensayos contuvieron tratamientos de control que consistieron en CAPS 10 mM a pH10, tampón o agua, que sirvieron de comprobaciones de fondo para la mortalidad o inhibición del crecimiento.

Las concentraciones de proteína en tampón de bioensayo se estimaron por electroforesis en gel usando BSA para crear una curva patrón para la densitometría en gel, que se midió usando un sistema de obtención de imágenes BIORAD (FLUOR-S MULTIIMAGER con el software QUANTITY ONE versión 4.5.2). Se tiñeron las proteínas en la matriz de gel con tinción basada en azul de Coomassie y se destiñeron antes de la lectura.

Larvas de CEW eclosionaron de huevos obtenidos de una colonia mantenida por un insectario comercial (BENZON RESEARCH INC., Carlisle, PA). Los bioensayos se realizaron en bandejas de plástico de 128 pocillos diseñadas específicamente para bioensayos de insectos (C-D INTERNATIONAL, Pitman, NJ). Cada pocillo contuvo 1,5 ml de Multispecies Lepidoptera Diet (SOUTHLAND PRODUCTS, Lake Village, AR). Se suministró por pipeta una alícuota de 40 μl de muestra de proteína sobre la superficie de la dieta de 1,5 cm² de cada pocillo (26,7 μl/cm²). Las concentraciones de dieta se calcularon como la cantidad (ng) de proteína de toxina insecticida por centímetro cuadrado (cm²) de área superficial en el pocillo. Las bandejas tratadas se mantuvieron en una campana de laboratorio hasta que el líquido sobre la superficie de la dieta se había evaporado o fue absorbido en la dieta.

A las 24 a 48 horas de la eclosión, se recogieron las larvas individuales con un pincel de pelo de camello humedecido y se depositaron sobre la dieta tratada, una larva por pocillo. Los pocillos infestados se taparon entonces con hojas adhesivas de plástico claro, se ventilaron para permitir el intercambio de gases (C-D INTERNATIONAL). Las bandejas de bioensayo se mantuvieron en condiciones medioambientales controladas (28 °C, -60 % de humedad relativa, 16:8 (luz:oscuridad)) durante 5 días, tiempo después del cual se registró el número total de insectos expuesto a cada muestra de proteína, el número de insectos vivos y muertos y el peso de los insectos supervivientes. Se calcularon el porcentaje de mortalidad y el porcentaje de inhibición del crecimiento para cada tratamiento. La inhibición del crecimiento (GI) se calculó del siguiente modo:

GI= [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]

donde TWIT es el peso total de insectos en el tratamiento,

TNIT es el número total de insectos en el tratamiento

TWIBC es el peso total de insectos en la comprobación de fondo (control de tampón), y

TNIBC es el número total de insectos en la comprobación de fondo (control de tampón).

Los datos de mortalidad y de inhibición del crecimiento se analizaron por una regresión logística nominal (P<0,05). Se determinó que GI⁵⁰ era la concentración de proteína insecticida de toxina en la dieta a la que el valor de GI era del 50 %, y la CL⁵⁰ (concentración letal al 50 %) se registró como la concentración de proteína insecticida de toxina en la dieta a la que se destruyó el 50 % de los insectos de prueba. El análisis estadístico (ANOVA unifactorial) se hizo usando el software JMP^® Pro (versión 9.0.3; SAS, Cary, NC). La Tabla 1 muestra las actividades de las proteínas DIG-911 y DIG-180 como se mide en bioensayos de dieta.

Tabla 1

Los datos de la Tabla 1 documentan el sorprendente descubrimiento de que la proteína DIG-911, que comprende el segmento de toxina central de Cry1 Da, presenta tanto mortalidad como actividad de inhibición del crecimiento contra larvas del gusano de la mazorca del maíz (CEW). Este resultado es a diferencia de los resultados informados por otros de que la proteína Cry1 Da es inactiva contra el gusano de la mazorca del maíz (véase Karim et al. (2000) Pesticide Biochemistry and Physiology 67(3): 198-216; y Frankenhuyzen (2009) Journal of Invertebrate Pathology. 101:1-16).

EJEMPLO 3

Construcción de vectores de transformación en planta

Se construyeron vectores de entrada Gateway® (INVITROGEN) por métodos habituales de clonación molecular. El vector de entrada pDAB109825 comprende una secuencia codificante optimizada para el maíz (SEQ ID NO:5) que codifica una proteína insecticida de toxina central Cry1Da2 (SEQ ID NO:6). El vector de entrada pDAB109840 comprende una secuencia codificante optimizada para el maíz que codifica una proteína insecticida Cry1 Da2 de longitud completa. La expresión en planta de la secuencia codificante de la toxina central Cry1 Da2 está bajo el control de una copia de un promotor de la ubiquitina 1 de maíz con intrón 1 asociado (patente de e E. UU. N.° 5.510.474). Se usó un fragmento que comprende una 3'UTR de un gen de peroxidasa 5 de maíz (ZmPer5 3'UTR; patente de e E. UU. N.° 6.699.984) para terminar la transcripción del ARNm de Cry1 Da2. Se construyó un vector de transformación/ expresión (pDAB109841) para la transformación de embrión de maíz mediada por Agrobacterium mediante el uso de métodos habituales de clonación y reacciones de recombinación Gateway® empleando un vector binario de destino típico (pDAB109805) y vector de entrada pDAB109825 descrito anteriormente. El vector binario de destino pDAB109805 comprende una región codificante de proteína de tolerancia al herbicida AAD-1 (patente de EE. UU. N.° 7.838.733, y Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-20245) bajo el control de expresión de una copia de un promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar (SCBV; esencialmente como se describe en la patente de EE. UU. N.° 6.093.569). Una secuencia de 5'UTR sintética comprendió secuencias de un gen 5'UTR de la proteína de la cubierta del virus del rayado del maíz (MSV) y el intrón 6 de un gen de la alcohol deshidrogenasa 1 (ADH1) de maíz está situado entre el extremo 3' del segmento del promotor de SCBV y el codón de iniciación de la región codificante de AAD-1. Se usó un fragmento que comprende una 3'UTR de un gen de lipasa de maíz (como antes) para terminar la transcripción del ARNm de AAD-1.

Un vector binario de control negativo (pDAB101556) comprendió una región codificante del gen marcador de proteína fluorescente amarilla (YFP) (Shagin et al. (2004) Molecular Biology and Evolution 21:841 -850) bajo el control de expresión de una copia de un promotor de la ubiquitina 1 de maíz con el intrón 1 (como antes) y un fragmento que comprende una 3'UTR de un gen de peroxidasa 5 de maíz (ZmPer53'UTR; patente de Ee . UU. N.° 6.699.984). pDAB101556 comprende además una región codificante de proteína de tolerancia a herbicida AAD-1 (como antes) bajo el control de expresión de una segunda copia de un promotor de ubiquitina 1 de maíz con el intrón 1 (como antes), y una 3'UTR de un gen de lipasa del maíz (como antes).

EJEMPLO 4

Transformación de maíz mediada por Agrobacterium

Se usó transformación mediada por Agrobacterium para integrar establemente una región codificante de la toxina central Cry1 Da2 en el genoma de la planta y así generar células, tejidos y plantas transgénicas de maíz que producen una proteína insecticida de longitud completa o Cry1 Da2 truncada. Se conocen en la técnica los métodos de transformación del maíz que emplean vectores de transformación superbinarios o binarios, como se describe, por ejemplo, en la publicación PCT internacional N.° WO2010/120452. Se seleccionaron tejidos transformados por su capacidad para crecer sobre un medio que contenía R-haloxifop.

Inicio del cultivo de Agrobacterium Se proporcionaron reservas en glicerol de los vectores de proyecto en la cepa hospedadora de Agrobacterium tumefaciens DAt13192 (documento de patente WO 2012/016222A2). Los cultivos de Agrobacterium se sembraron en estrías de las reservas de glicerol sobre medio mínimo AB (Watson, et al., (1975) J. Bacteriology 123:255-264) y se incubaron a 20 °C en la oscuridad durante 3 días conteniendo antibióticos apropiados. Los cultivos se sembraron entonces en estrías sobre una placa de medio YEP (g/l: extracto de levadura, 10; peptona, 10; NaCl, 5) con antibióticos y se incubaron a 20 °C en la oscuridad durante 1-3 días.

El día de un experimento, se preparó una mezcla de medio de inoculación y acetosiringona (Frame et al. (2011) Methods in Molecular Biology 710:327-341) en un volumen apropiado para el número de construcciones en el experimento y se pipeteó en un matraz desechable estéril de 250 ml. El medio de inoculación contiene: 2,2 g/l de sales MS; vitaminas modificadas con MS (Frame et al., arriba) 68,4 g/l de sacarosa; 36 g/l de glucosa; 115 mg/l de L-prolina; y 100 mg/l de mio-inositol; a pH 5,4.) La acetosiringona se añadió al matraz que contenía medio de inoculación hasta una concentración final de 200 μM de una disolución madre 1 M en 100 % de sulfóxido de dimetilo.

Para cada construcción, se suspendió 1 asa de inoculación de Agrobacterium de la placa de YEP en 15 ml de la mezcla de medio de inoculación/acetosiringona en el interior de un tubo de centrifugadora estéril desechable de 50 ml, y se midió la densidad óptica de la disolución a 550 nm (DO⁵⁵⁰) en un espectrofotómetro. La suspensión se diluyó entonces hasta DO⁵⁵⁰ de 0,3 a 0,4 usando mezcla de medio de inoculación/acetosiringona adicional. El tubo de suspensión de Agrobacterium se puso entonces horizontalmente en un agitador de plataforma establecido a aproximadamente 75 rpm a temperatura ambiente y se agitó durante 1 a 4 horas antes de uso.

Esterilización de mazorcas y aislamiento de embriones. Se produjeron mazorcas de la línea endogámica de Zea mays B104 (Hallauer, et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406) en un invernadero y se recogieron 10 a 12 días después de la polinización. Las mazorcas recogidas se descascarillaron y se esterilizaron superficialmente por inmersión en una disolución al 20 % de blanqueante comercial (Ultra Clorox^® Germicidal Bleach, 6,15 % de hipoclorito sódico; con dos gotas de TWEEN 20) durante 20 minutos, seguido de tres aclarados en agua desionizada estéril en el interior de una campana de flujo laminar. Se cortaron asépticamente embriones cigóticos inmaduros (1,8 a 2,2 mm de largo) de cada mazorca y se distribuyeron en uno o más tubos de microcentrifugadora que contenían 2,0 ml de suspensión de Agrobacterium en la que se habían añadido 2 μl de 10 % de tensioactivo BREAK-Th RU® S233 (EVONIK INDUSTRIES; Essen, Alemania).

Cocultivo de Agrobacterium. Tras el aislamiento, los embriones se dispusieron en una plataforma basculante durante 5 minutos. El contenido del tubo se vertió entonces sobre una placa de medio de cocultivo, que contenía 4,33 g/l de sales MS; vitaminas modificadas con MS; 30 g/l de sacarosa; 700 mg/l de L-prolina; 3,3 mg/l de Dicamba en KOH (ácido 3,6-dicloro-o-anísico o ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico); 100 mg/l de mio-inositol; 100 mg/l de hidrolizado enzimático de caseína; 15 mg/l de AgNO³ ; acetosiringona 200 μM en DMSO; y 3 g/l de agar (SIGMA-ALDRICH, se probó cultivo de células vegetales) a pH 5,8. Se retiró la suspensión líquida de Agrobacterium con una pipeta de transferencia desechable estéril y la placa de cocultivo que contenía los embriones se dispuso en la parte trasera de la campana de flujo laminar con la tapa entreabierta durante 30 minutos, tiempo después del cual los embriones se orientaron con el escutelo hacia arriba usando pinzas estériles con la ayuda de un microscopio. La placa se devolvió a la parte trasera de la campana de flujo laminar con la tapa entreabierta durante 15 min adicionales. Entonces se cerró la placa, se selló con cinta médica 3M^™ Micropore^™ y se puso en una estufa de incubación a 25 °C con luz continua a aproximadamente 60 pEm^-2 s^-1 de intensidad de la luz

Selección de callos y regeneración de acontecimientos transgénicos. Tras el periodo de cocultivo, los embriones se transfirieron a medio de reposo, que está compuesto por 4,33 g/l de sales MS; vitaminas modificadas con MS; 30 g/l de sacarosa; 700 mg/l de L-prolina; 3,3 mg/l de Dicamba en KOH; 100 mg/l de mio-inositol; 100 mg/l de hidrolizado enzimático de caseína; 15 mg/l de AgNO³ ; 0,5 g/l de MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico monohidratado; Phytotechnologies labr.; Lenexa, KS); 250 mg/l de cefotaxima; y 7,0 g/l de agar; a pH 5,8. Se movieron no más de 36 embriones a cada placa. Las placas se envolvieron con cinta Micropore^™ y se incubaron a 27 °C con luz continua a aproximadamente 50 pmol m-2 s-1 de intensidad de la luz durante 7 a 10 días. Los embriones con callo (<18/placa) se transfirieron entonces sobre medio de selección I, que comprende medio de reposo (antes), pero con solo 6,5 g/l de agar, y con R-haloxifop ácido 100 nM (0,0362 mg/l). Las placas se envolvieron con cinta Micropore^™ y se incubaron a 27 °C con luz continua a aproximadamente 50 pEm^-2 s^-1 de intensidad de la luz durante 7 días. El callo proliferado (<12/placa) se transfirió entonces a medio de selección II, que comprende medio de reposo (antes), pero con solo 6,5 g/l de agar, y con R-haloxifop ácido 500 nM (0,181 mg/l). Las placas se envolvieron y se incubaron a 27 °C con luz continua a aproximadamente 50 pEm^-2 s^-1 de intensidad de la luz durante 14 días.

En esta etapa, los callos resistentes (<9/placa) se movieron a medio de pre-regeneración. El medio de pre-regeneración contenía 4,33 g/l de sales MS; vitaminas modificadas con MS; 45 g/l de sacarosa; 350 mg/l de L-prolina; 100 mg/l de mioinositol; 50 mg/l de hidrolizado enzimático de caseína; 1,0 mg/l de AgNO³ ; 0,5 g/l de MES; 0,5 mg/l de ácido naftalenoacético en NaOH; 2,5 mg/l de ácido abscísico en etanol; 1 mg/l de 6-bencilaminopurina; 250 mg/l de cefotaxima; 5,5 g/l de agar; y R-haloxifop ácido 500 nM (0,181 mg/l), a pH 5,8. Las placas se envolvieron y se incubaron a 27 °C con luz continua a aproximadamente 50 pEm^-2 s^-1 de intensidad de la luz durante 7 días. Entonces se transfirieron los callos en regeneración (<6/placa) a medio de regeneración en Phytatrays^™ (Sigma-Aldrich) y se incubaron a 28 °C con 16 horas de luz/8 horas de oscuridad al día a aproximadamente 150 μmol m^-2 s^-1 de intensidad de la luz durante 14 días o hasta que se desarrollaron brotes. El medio de regeneración contenía 4,33 g/l de sales MS; vitaminas modificadas con MS; 60 g/l de sacarosa; 0,50 g/l de MES; 125 mg/l de cefotaxima; 5,5 g/l de agar; y R-haloxifop ácido 500 nM (0,181 mg/l), a pH 5,8. Entonces se aislaron pequeños brotes con raíces primarias y se transfirieron a medio de elongación sin selección (es decir, medio de regeneración sin ácido de R-haloxifop y con 30 g/l de sacarosa en lugar de 60 g/l de sacarosa) para el crecimiento adicional. Las plántulas enraizadas de aproximadamente 6 cm o más altas se trasplantaron en la tierra y se movieron a una cámara de crecimiento para la rustificación.

Transferencia y establecimiento de plantas Tp en el invernadero para ensayo y producción de semilla. Tejidos de plantas transformadas seleccionadas por su capacidad para crecer en medio que contiene haloxifop se trasplantaron de Phytatrays™ a macetas pequeñas (T. O. Plastics, 3,5" SVD) llenas de medio de crecimiento (PROMIX BX; Premier Tech Horticulture), se cubrieron con domos de control de la humedad (Arco Plastics Ltd.) y luego se rustificaron en una sala de crecimiento (28 °C día/24 °C noche, fotoperiodo de 16 horas, 50-70 % de HR, 200 gEm-2 s-1 de intensidad de la luz). Cuando las plantas alcanzaron el estadio V3-V4, se trasplantaron a mezcla de tierra Sunshine Custom Blend 160 y crecieron hasta el florecimiento en el invernadero (tipo de exposición lumínica: foto o asimilación; límite luminoso superior: 1200 PAR; duración del día de 16 horas; 27 °C día/24 °C noche). Se analizaron posibles plántulas transgénicas para el número de copias de transgenes por ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real usando cebadores diseñados para detectar números relativos de copias de los transgenes, y eventos que tenían solo una o dos copias del gen Cry1 Da2 integrado se trasplantaron a macetas de 5 galones (19 litros). Se hicieron observaciones periódicamente para seguir cualquier fenotipo anormal. Las plantas de la generación T¹ se obtuvieron por autopolinización de las sedas de plantas transgénicas T⁰ con polen recogido de las plantas T⁰ y sembrando las semillas resultantes. Las semillas T¹ del evento 109841 [3]-106 se plantaron y seleccionaron pulverizando las plantas con quizalofop, y manteniendo las plantas supervivientes hasta el estadio de reproducción para obtener sedas para bioensayos de gusanos de la mazorca del maíz y análisis de transferencia Western.

Se produjeron similarmente plantas de maíz transgénico tras la transformación con el vector binario pDAB101556 que alojaba un casete de expresión del gen de la proteína fluorescente amarilla.

EJEMPLO 5

Análisis moleculares y bioquímicos de tejidos transgénicos de maíz

Sonda de hidrólisis de qPCR para el análisis del número de copias. Se emplearon análisis moleculares para cribar eventos simples de bajas copias. Se recogió tejido de hoja de supuestas plantas transgénicas enraizadas antes de trasplantarlas a la tierra. Se extrajo ADN con un kit QIAGEN MagAttract™ usando el robot de extracción Biosprint96, QIAGEN, y los protocolos recomendados por el proveedor. El análisis del número de copias de transgenes integradas se realizó usando ensayos de sonda de hidrólisis específica para el gen AAD-1. Además, la contaminación por integración involuntaria del esqueleto del plásmido de vector binario se detectó por un ensayo específico de sonda de hidrólisis para el gen de resistencia de espectinomicina (Spec) transmitido en el esqueleto de vector binario. En ensayo de sonda de hidrólisis para los genes de maíz endógenos invertasa (N.° de acceso de GenBank™ U16123) se desarrolló como patrón de referencia interno. La Tabla 2 enumera las secuencias de oligonucleótidos de los componentes del ensayo de sonda de hidrólisis (sintetizados por Integrated DNA Technologies, Coralville, IA & Applied Biosystems, Foster City, CA). Se establecieron reacciones de PCR de sonda de hidrólisis doble según la Tabla 3 con aproximadamente 10 ng de ADN, y las condiciones de ensayo se presentan en la Tabla 4.

Tabla 2

Tabla 3

Tabla 4

Para la amplificación, se preparó una mezcla madre de sondas LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) a concentración final 1X en una reacción múltiple de 10 μl de volumen, 0,4 μM de cada cebador, y 0,2 μM de cada sonda. Se excitó el resto fluorescente FAM (6-carboxi fluoresceína amidita) a 465 nm y la fluorescencia se midió a 510 nm; el valor correspondiente para el resto fluorescente de HEX (hexaclorofluoresceína) fue 533 nm y 580 nm. El nivel de fluorescencia generado para cada reacción se analizó usando el sistema de PCR en tiempo real Lightcycler®480 de Roche según las recomendaciones del fabricante. El número de copias del transgén se determinó por comparación de salidas de Lightcycler®480 de valores de genes diana/referencia para muestras desconocidas con valores de genes diana/referencia de patrones de número de copias conocido (1-Copia representa plantas hemicigóticas, 2-Copias representa plantas homocigóticas).

Se usaron las puntuaciones Cp, es decir, el momento en el que la señal de fluorescencia atraviesa el umbral de fondo usando el algoritmo de puntos de ajuste (software Lightcycler® versión 1.5), y el módulo Relative Quant para realizar el análisis de datos de PCR en tiempo real.

En el software Lightcycler® Fit Points Algorithm, se hace un gráfico de los datos representando el logaritmo de la concentración del molde de ADN de entrada frente a los valores de Cp medidos. La pendiente de la curva es un parámetro de comparación deseado; por lo tanto, el número de entrada logarítmico inicial puede ser un punto inicial arbitrario en la curva, con la advertencia de que los valores de concentración arbitrarios usados para el molde de ADN de entrada son representativos de la dilución sucesiva real usada. Por ejemplo, para una serie de dilución sucesiva al 10 %, las concentraciones de entrada reales pueden ser 1000, 100, 10, etc., para cuyos puntos el software del algoritmo de puntos de ajuste LC480 representa 3, 2, 1, etc., como los logaritmos de las entradas. Usando una regresión lineal, el mejor ajuste resultante de esta línea (log de entrada frente a Cp) se usa entonces para estimar una pendiente (m) a partir de una ecuación de la forma y = mx+b. Existe una relación inversa entre la cantidad de molde inicial y el valor Cp y, por lo tanto, la pendiente (m) es siempre negativa.

Una reacción de PCR perfecta (es decir, 100 % eficiente) duplica el molde total cada ciclo. La eficiencia (Ef) de PCR se calcula como: Ef = 10e(-1/m). Por lo tanto, la pendiente (m) del gráfico del log de entrada frente a Cp será -3,3219 para una reacción perfectamente eficiente (cuya eficiencia se define como 2,00).

En otras palabras, una reacción de PCR 100 % eficiente se define por: 2,0 = 10e(-1/-3,3219). El software del algoritmo de puntos de ajuste LC480 informa del valor de eficiencia por la primera fórmula. Por lo tanto, una reacción 99 % eficiente tiene un valor de Ef de 1,99 en vez de 0,99. Para expresar esto como un porcentaje de eficiencia, se resta 1 de este valor y se multiplica por 100. O, % de Ef = [(10e(-1/m)-1)] x 100

Detección de la proteína Cry1 Da2 truncada producida por planta. Se extrajeron proteínas de 200 a 240 mg de sedas de mazorca (recogidas de mazorcas no polinizadas) en 0,6 ml de PBST (tampón PBS que contiene 0,05 % de Tween 20).

Se añadió una perla de acero de 2 mm, los tubos se taparon y se aseguraron en un GENO/GRINDER (CERTIPREP; Metuchen, NJ), y se agitaron durante 5 min a 1500 rpm. Los tubos se centrifugaron a 4000 rpm durante 7 min a 4 °C, y los sobrenadantes que contenían las proteínas solubles se almacenaron a -80 °C hasta que se usaron.

Las concentraciones de proteína total se determinaron usando un kit PIERCE 660 nm PROTEIN ASSAY (THERMO SCIENTIFIC; Rockford, IL) siguiendo las instrucciones del proveedor. Se realizaron análisis de inmunotransferencia de proteína usando un anticuerpo policlonal generado en conejos usando procedimientos convencionales (véase, por ejemplo, Harlow, E., y Lane, D.P. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, y actualizaciones del mismo). Se prepararon muestras y las proteínas se separaron por electroforesis a través de geles de 4-12 % de Bis-Tris NUPAGE en tampón de electroforesis MES según el protocolo sugerido por el fabricante para la electroforesis desnaturalizante (INVITROGEN). Las proteínas se transfirieron a membrana de nitrocelulosa durante 80 min a 30 V en tampón de transferencia NUPAGE. Las transferencias se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en 5 % de leche/PBST (PBS con 0,05 % de Tween-20) y luego se sondaron con anticuerpo primario (específico para la proteína de la toxina central Cry1 Da) y luego anticuerpos secundarios durante una hora cada uno a temperatura ambiente en disolución de bloqueo, con aclarado entre cada anticuerpo durante 15 minutos en PBST. El desarrollo de las transferencias se hizo usando sustrato de transferencia Western PIERCE ECL según el protocolo del fabricante (THERMO FISHER SCIENTIFIC, Rockford, IL). La presencia de proteínas Cry1Da truncadas se confirmó en extractos de muestras duplicadas de los tejidos de seda de plantas de maíz generadas del evento 109841[3]-106 (plantas 109841[3]-106.AJ001.008, 109841 [3]-106.AJ001.013, 109841[3]-106.AJ001.020, 109841[3]-106.AJ001.027 y 109841 [3]-106.AJ001.028). Normalmente se detectaron dos bandas, una a la movilidad correspondiente a aproximadamente 65 kDa, que corresponde al tamaño molecular de la proteína Cry1 Da2 codificada por la construcción pDAB109841, y una segunda banda que tiene una movilidad correspondiente a proteínas algo más pequeñas de 65 kDa. Las proteínas más pequeñas pueden corresponder a los productos que quedan después de la escisión de los aminoácidos 1 -28 desde el extremo N de la proteína de toxina central Cry1Da (frecuentemente se detecta el procesamiento de algunos aminoácidos aminoterminales de proteínas Cry1). No se observaron dichas bandas en extractos de seda de las plantas B104 no transgénicas.

Tabla 5

Análisis de plantas TI para el nivel de transcritos relativos de ARN (RTL) y la expresión de proteínas

*Las mediciones se realizaron por análisis Western y se cuantificaron por CL/EM/EM como se conoce en la técnica.

EJEMPLO 6

Bioensayo de tejidos de maíz transgénico

Bioensayos de hoja V5 con eventos de maíz T¹ Se llenaron parcialmente bandejas de ensayo (32 pocillos/bandeja; C-D International) con una disolución al 2 % de agar y se dejó que el agar solidificara. Se cogieron dos secciones de hoja (aproximadamente una pulgada cuadrada (6,5 cm2) de área) de cada planta y cada una se puso en un pocillo separado de las bandejas de 32 pocillos. Se pusieron diez larvas recién nacidas de Helicoverpa zea (CEW) (aproximadamente 24 a 48 h después de la eclosión) en cada pocilio. Las bandejas se taparon con tapas adhesivas perforadas para permitir la ventilación durante la prueba y luego se pusieron a 28 °C, 40 % de HR, 16 horas de luz-8 horas de oscuridad. Después de tres días, para cada trozo de hoja se tomó una puntuación simple del porcentaje de daño del área de la hoja. Se promediaron las puntuaciones de daño para cada prueba.

Bioensayos en seda del gusano de la mazorca el maíz. Se recogieron mazorcas sin polinizar, se midió su longitud y se almacenaron las mazorcas a 4 °C hasta que se usaron para el bioensayo. Se dispusieron aproximadamente 10 ml de 2 % de agar en agua en el fondo de cada pocillo de ensayo (aproximadamente 1 pulgada cuadrada (6,5 cm2)) de una bandeja de bioensayo de 32 pocillos para suministrar humedad a las sedas y larvas del gusano de la mazorca del maíz. Se alimentaron cinco hebras de sedas (aproximadamente 10 cm de longitud) a dos CEW recién nacidas en cada pocillo. Cada evento se probó en cuatro duplicados (pocillos) en un formato completamente aleatorizado. Después de la infestación por los insectos, las bandejas se taparon con tapas adhesivas perforadas para permitir la ventilación durante la prueba. Las bandejas se pusieron a 28 °C, 60 % de HR, 16 horas de luz:8 horas de oscuridad. 3 días después de la infestación, se registró el porcentaje de daño a la seda por evaluación visual de la cantidad de heces sobre los tejidos de seda. Se registraron los números de insectos vivos, muertos y ausentes por evento y se estimó el porcentaje de mortalidad de las larvas.

Actividad de Cry1 Da producida por planta en larvas de CEW. Los análisis de inmunotransferencia detectaron proteína de la toxina central Cry1 Da en sedas de mazorcas de plantas transgénicas T¹ pDAB109841, y las sedas proporcionaron excelente protección contra el daño por alimentación por larvas de H. zea, que tienen solo 4,6 % de daño a las sedas en los bioensayos (Tabla 6). Las sedas de las plantas de maíz transgénico de control negativo que producen la proteína fluorescente amarilla no insecticida (YFP; construcción pDAB101556), o plantas B104 no transgénicas, sufrieron del 90 % al 95 % de daño medio en las sedas por larvas de H. zea. Además, la mortalidad de las larvas que se alimentan de seda de plantas que producen la proteína de la toxina central Cry1 Da fue del 26,8 %, mientras que no se observó mortalidad de las larvas en las muestras de plantas de control negativo. La construcción de Cry1 Da dio excelente protección de la hoja de las muestras de estadio V5, teniendo las plantas transgénicas pDAB109851 12 % al 25 % de daño tisular provocado por H. zea (Tabla 6), mientras que las plantas de control negativo (productoras de B104 y YFP) sufrieron casi el 100 % de daño tisular. Los resultados de los bioensayos de tanto seda como hoja demostraron que la proteína de la toxina central Cry1 Da es altamente eficaz en proteger las plantas de maíz del daño por larvas de H. zea.

Tabla 6

La Tabla 7 muestra el porcentaje de mortalidad, porcentaje de daño tisular y porcentaje de daño en sedas de H. zea. La cantidad de daño en sedas se puntuó según la cantidad de excrementos visuales de los insectos sobre los tejidos. Se puntuó el porcentaje de daño tisular según la evaluación visual del área de alimentación de larvas sobre un recorte de hoja de 1 pulgada cuadrada (6,5 cm2). La variedad de maíz B104 y la construcción 101556 (o construcción 109812 para el daño tisular) fueron controles negativos del control de cultivar híbrido y proteína fluorescente amarilla (YFP), respectivamente, mientras que HX1 fue un híbrido comercial Herculex® I, que expresa la proteína Cry1 Fa. La construcción 109841 fue el maíz T1 que expresaba la versión truncada de Cry1 Da. Los datos se analizaron por ANOVA y la prueba de separación de medias de Tukey-Kramer.

Tabla 7

EJEMPLO 7

Eficacia de campo de la proteína de la toxina central Cry1 Da contra CEW

Se probaron semillas de ocho eventos B104 transgénicos T¹ pDAB109841 en parcelas de ensayo de campo en la estación de campo de DOW AGROSCIENCES, Fowler, Indiana. Estos eventos habían sido analizados por técnicas moleculares, como se ha descrito anteriormente, y se encontró que eran los eventos de copia única que no tenían secuencias de esqueleto de vector binario detectable. Todos los acontecimientos se probaron como plantas T¹ que segregaban 1:1 (hemicigóticas:nulas) para el evento de integración Cry1 Da/AAD1. Los controles negativos fueron plantas no transgénicas B104 (nulas).

Las parcelas de ensayo contuvieron un hilera de 20 pies (6,1 m) para cada especie de insecto probada. Los tratamientos se sembraron en un diseño de bloques completo aleatorizado con cuatro duplicados. Las entradas experimentales se trataron en el estadio V2 con ASSURE^® II (DUPONT^™ CROP PROTECTION, Wilmington, DE) a 184 g de equivalentes de ácido por hectárea (ea/ha) 1 % de COC para eliminar las plantas nulas. ASSURE^® II contiene el principio activo (pa) quizalofop-p-etilo (R)-2-4-[4-6-cloroquinoxalin-2-il oxi)-fenoxi]propionato de etilo. El producto comercial contiene 0,88 lb (0,4 kg) de pa por galón y 1,0 % (v/v) de concentrado de aceite de cultivo (COC). El COC es un aceite parafínico refinado emulsionable que contiene aproximadamente 85 % de aceite parafínico y aproximadamente 15 % de emulsionantes. Se realizaron recuentos de rodales 2 semanas después del tratamiento. Se evaluaron cinco plantas por parcela para el daño por insectos.

Los huevos de gusano de la mazorca del maíz (CEW; Helicoverpa zea Boddie) fueron suministrados por BENZON RESEARCH. Para evaluar la eficacia contra CEW, cada planta recibió 5 larvas de CEW de segundo estadio sobre las sedas de mazorcas el 21/08/2012 durante la floración (estadio de crecimiento principal N.° 6). El 04/09/2012 se examinaron las mazorcas para larvas vivas y daño por alimentación, se determinó según los criterios listados en la Tabla 87.

Tabla 8

Se usaron ensayos de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) usando protocolos convencionales para evaluar los niveles de proteína foliar Cry1 Da en cada evento. Los ELISA se realizaron usando múltiples diluciones de extractos vegetales y usando reactivos e instrucciones esencialmente como se proporcionaron por los proveedores del kit de ELISA. Se usó el anticuerpo Cry1 Da como se ha descrito anteriormente.

Tabla 9

Hubo un amplio intervalo de niveles de acumulación de Cry1Da, de 67 ng/cm2 a 135 ng/cm2. Todos los eventos de pDAB109841 probados proporcionaron un nivel de protección estadísticamente similar contra CEW, en tanto los niveles de consumo de granos como de infestación de las mazorcas, independientemente del nivel de producción de Cry1 Da.

Referencias

Frankenhuyzen, K. 2009. Minireview: Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal proteins. Journal of Invertebrate Pathology. 101:1-16.

Karim S., Ridzuddin, S., Gould, F., Dean, D.H. 2000. Determination of Receptor Binding Properties of Bacillus thuringiensis 5-Endotoxins to Cotton Bollworm (Helicoverpa zea) and Pink Bollworm (Pectinophora gossypiella) Midgut Brush Border Membrane Vesicles. Pesticide Biochemistry and Physiology 67(3): 198-216.

Hofte, H., P. Soetaert, S. Jansens, and M. Peferoen. 1990. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of a new Lepidoptera-specific crystal protein gene from Bacillus thuringiensis. Nucl. Acids Res. 18:5545.

Payne, J., and A. J. Sick. 1997. Patente de EE. UU. 5.691.308.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método de control del daño por gusanos de la mazorca del maíz a las plantas, comprendiendo dicho método proporcionar una o más plantas que expresan una proteína insecticida Cry1 Da a dicho gusano de la mazorca del maíz para la ingestión, en donde la proteína insecticida Cry1 Da comprende SEQ ID NO: 6 y en donde cada una de las plantas comprende además al menos un rasgo de tolerancia a herbicidas y al menos un rasgo de entrada.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el al menos un rasgo de entrada comprende un rasgo de resistencia a los insectos.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el rasgo de resistencia a los insectos es conferido por una proteína insecticida.

4. El método de la reivindicación 2, en donde el rasgo de resistencia a los insectos es conferido por una proteína insecticida derivada de B.t. distinta de una proteína insecticida Cry1 Da.

5. El método de la reivindicación 2, en donde el rasgo de resistencia a los insectos es conferido por iARN.

6. El método de la reivindicación 1, en donde el rasgo de tolerancia a los herbicidas proporciona tolerancia a uno o más herbicidas seleccionados del grupo de (i) inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS); (ii) inhibidores de la glutamina sintetasa (GS); (iii) inhibidores de la 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD); (iv) inhibidores de la 5-enolpiruvilsikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) e (v) inhibidores de la acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa).

7. El método de la reivindicación 1, en donde el rasgo de tolerancia a los herbicidas proporciona tolerancia a uno o más herbicidas seleccionados del grupo de herbicidas de ácidos fenoxi, herbicidas de piridiloxiacetato auxina y herbicidas de ariloxifenoxipropionato.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el rasgo de tolerancia a los herbicidas proporciona tolerancia al glifosato.

9. El método de la reivindicación 1, en donde el rasgo de tolerancia a los herbicidas proporciona tolerancia a ariloxifenoxipropionato.

10. El método de la reivindicación 1, en donde el rasgo de tolerancia a los herbicidas es conferido por la proteína de tolerancia al herbicida AAD-1.

11. El método de la reivindicación 1, en donde la expresión de Cry1 Da está controlada por un promotor de la ubiquitina de maíz e intrón 1 de maíz.