JP2017516840A - コーンイヤーワームを防除するためのCry1D - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年3月21日出願の米国仮出願第61/968,703号の利益を主張する。その開示は、完全に本明細書に明確に組み込まれる。
配列番号1は、DIG−911コード配列(CDS)を有するDNA断片である。
本発明は、Cry1Daがコーンイヤーワーム幼虫(CEW)、アメリカタバコガ(Helicoverpa zea(Boddie))に対し活性であるという驚くべき発見に一部関する。インビトロでの餌バイオアッセイのバイオアッセイ結果から、Cry1Da/Cry1Abプロトキシンキメラが、CEW幼虫に対して有意な成長阻害および死亡率をもたらすことが示された。Cry1Da殺虫性タンパク質または毒素は、配列番号6に示すコア毒素またはその変異体を含む、任意の殺虫性タンパク質である。このような変異体は、配列番号6に対し少なくとも95%の配列同一性、好ましくは配列番号6に対し99%の配列同一性を有する。
「コーン穿孔虫保護性Bt(Cry1AbまたはCry1F)コーン産物についての、特定の構造的必要条件は以下の通りである:
− 構造的緩衝区:
コーン地帯では非鱗翅目Btコーン緩衝区20%;
ワタ地帯では非鱗翅目Bt緩衝区50%
− ブロック
内部(すなわちBt圃場内)
外部(すなわち、任意交配を最大にするための、Bt圃場の1/2マイル(可能であれば1/4マイル)以内の独立した圃場)
− 圃場内ストリップ
ストリップは、幼虫の運動の効果を低下させるため、少なくとも4作条幅(好ましくは6作条)でなければならない」
「コーン穿孔虫IRMの必要条件:
− 緩衝区混在地(refuge hybrids)に対してコーン畑の少なくとも20%に設けること
− ワタ生産領域においては、緩衝区は50%でなければならない
− 緩衝区混在地の1/2マイル以内で設けなければならない
− 緩衝区は、Bt圃場内にストリップとして設けることができる;緩衝区ストリップは少なくとも4作条幅でなければならない
− 緩衝区は、標的昆虫について経済的許容限界に達した場合のみ、従来の殺有害生物剤で処理してよい
− Btベースの散布式殺虫剤を緩衝区のコーンに使用することはできない
− 適切な緩衝区を、Btコーンを有する農場ごとに設けなければならない」
本明細書で論じられる、具体的に例示される遺伝子およびタンパク質に加え、殺虫活性変異体が含まれる。「変異体」という用語により、出願人らは、断片、特定の欠失および挿入突然変異体、ならびに特定の融合タンパク質を含むことを意図する。Cry1Daタンパク質は、古典的な3ドメインCry毒素である。本発明に含まれるCry1Da昆虫毒素の変異体について記載する前置きとして、一般的な3ドメインCry毒素およびCry1Da昆虫毒素の構成を簡潔に見直すことが有用であろう。
例示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸欠失、置換および付加を連続的に容易に行うことができ、殺虫活性に対するこのような変異の効果を、バイオアッセイにより試験することができる。変化の数が数において限られるという条件で、このような試験は不当な実験法を伴わない。本発明は、最大10個、最大15個または最大20個のアミノ酸付加、欠失または置換が行われたコア毒素の殺虫活性変異体を含む。
アミノ酸の分類 アミノ酸の例
非極性側鎖 Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp
非電荷極性側鎖 Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性側鎖 Asp、Glu
塩基性側鎖 Lys、Arg、His
β分岐側鎖 Thr、Val、Ile
芳香族側鎖 Tyr、Phe、Trp、His
Cry1Da昆虫毒素をコードする単離された核酸は、本発明の一態様である。これは、配列番号2、配列番号4および配列番号6、およびそれらの補体をコードする核酸、ならびに殺虫活性変異体をコードするその他の核酸の本新規使用を含む。「単離された」により、出願人らは、核酸分子がそれらの天然の環境から取り出され、人の手で異なる環境に置かれたことを意味する。遺伝暗号の冗長性により、様々な異なるDNA配列が、本明細書で開示されるアミノ酸配列をコードすることができる。同じまたは本質的に同じ毒素をコードするこれらの代替DNA配列を作り出すことは、当業者の技術の十分に範囲内である。
本明細書で記載される改良Cryタンパク質をコードする遺伝子を、当技術分野で周知の様々な方法により作製することができる。例えば、合成遺伝子セグメントおよび合成遺伝子を、亜リン酸トリエステルおよびホスホロアミダイト化学反応(Caruthers et al, 1987)により作製することができ、オンデマンドで遺伝子合成を行うために、民間の供給業者を利用することもできる。例えば、制限酵素断片のライゲーション、または重複オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応アセンブリーを含む様々な方法で、全長遺伝子を構築することができる(Stewart and Burgin, 2005)。さらに、末端遺伝子の欠失を、部位特異的な末端オリゴヌクレオチドを使用して、PCR増幅により作製することができる。
2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の同一性パーセントを決定するため、配列を最適に比較するため整列させる。2つの配列間の同一性パーセントは、配列に共有される同一の位置の数の関数である(すなわち、同一性パーセント=同一な位置の数/位置の総数(例えば、重複している位置)×100)。一実施形態において、2つの配列は同じ長さである。2つの配列間の同一性パーセントを、ギャップを入れてまたは入れることなく、下記の技術に類似の技術を使用して決定することができる。同一性パーセントの算出において、典型的には正確な一致を計数する。
本発明の昆虫毒素コード遺伝子を、多様な微生物または植物宿主に導入することができる。昆虫毒素遺伝子を発現させることにより、直接的または間接的に、殺有害生物性タンパク質の細胞内産生および維持がもたらされる。適切な微生物宿主、例えばシュードモナス属(Pseudomonas)を用いて、微生物を、微生物が増殖し摂食される有害生物環境に対し施用することができる。結果は有害生物の防除である。あるいは、昆虫毒素遺伝子を保有する微生物を、毒素の活性を長引かせ、細胞を安定化させる条件下で処理することもできる。毒性活性を維持している処理された細胞を、次いで、標的有害生物の環境に対し施用することができる。本発明の植物由来の非再生/非全能性植物細胞(本発明のCry毒素遺伝子の少なくとも1種を含む)が本発明に含まれる。
トランスジェニック植物での発現、製剤化したタンパク質組成物、散布可能なタンパク質組成物、ベイトマトリックスまたはその他の送達系を介して送達される有効量の毒素に昆虫が接触すると、結果として典型的には昆虫が死亡するか、毒素を昆虫に与える供給源を昆虫が摂食しない。
本発明のタンパク質を、害虫による損傷から任意の種類の植物を実際に防御するために使用することができる。このような植物の例には、数例を挙げれば、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、キャノーラ、イネ、モロコシ、コムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、コショウ(トウガラシ含む)、テンサイ、果実および芝生が含まれる。植物を形質転換させる方法は当技術分野で周知であり、例示的な形質転換方法を実施例に記載する。
DIG−911タンパク質(Cry1Da2/Cry1Abキメラ殺虫性毒素;配列番号2)は、Cry1Da(アミノ酸1〜594、GENBANK受託番号176415.1および米国特許第5,691,308号明細書で開示)のコア毒素セグメント、およびCry1Ab(DIG−911アミノ酸595〜1139)、基本的にGENBANK受託番号AFK79795.1で開示)由来のプロトキシンセグメントからなる。その他のCryまたはVip殺虫性毒素と組み合わせたCry1Daコア毒素セグメントの使用については、米国特許出願公開第20130007923、20120331590、20120331589および20120317681号明細書で以前に開示されているが、コーンイヤーワーム(CEW;Helicoverpa zea(Boddie))を防除するためのCry1Da殺虫性タンパク質の使用については考慮されていない。
特性決定および昆虫バイオアッセイのためのDIG−911およびDIG−180タンパク質産生を、振とうフラスコで増殖させたP.フルオレセンス(P. fluorescens)株DPf150(プラスミドpDOW2848保有)または株Dpf129(プラスミドpDAB1817保有)により行った。1%グルコースおよび微量元素を添加したM9培地で増殖させた種培養物を、5%グリセロール含有合成最少培地(TEKNOVA Cat.#3D7426、Hollister、CA)50mLに播種するために使用した。振とうしながら30℃で24時間、最初にインキュベートした後、Ptacプロモーターを介したDIG−911またはDIG−180遺伝子の発現を、イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加により誘導した。誘導時、および誘導後各時間に培養物を採取した。細胞密度を、600nmでの光学密度(OD600)により測定した。例えば、Huang et al. (2007, Prot)に記載される、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)の増殖に適切なその他の培養培地を利用してもよい。
各試料採取時に、2mL分量を5分間14000xgで遠心分離し、細胞ペレットを−80℃で保管した。タンパク質抽出については、ペレットを解凍し、pH7.2のリン酸緩衝液0.5mL中に懸濁させた。20ユニットを一定に排出する直径1/8インチのマイクロチップを使用する、BRANSON250 SONIFIER(BRANSON ULTRASONICS、Danbury CT)を使用したソニケーションにより、細胞を溶解させた。45秒のバーストを2回、バースト間に氷上で試料を数分間冷却しながら使用した。14,000rpmで5分間、微量遠心管中で遠心分離することによりライセートを分画した後、上清(可溶性画分)を除去し、ペレットをリン酸緩衝液0.5ml中で懸濁させた(不溶性画分)。
Cryタンパク質封入体(IB)調製を、SDS−PAGEおよびMALDI−MS(マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析)により示される、不溶性B.t.殺虫性タンパク質を産生する、P.フルオレセンス(P. fluorescens)発酵物由来の細胞において行った。P.フルオレセンス(P. fluorescens)発酵ペレットを、37℃のウォーターバスで解凍した。溶解緩衝液(50mMトリス、pH7.5、200mM NaCl、20mM EDTA二ナトリウム塩(エチレンジアミン四酢酸)、1%Triton X−100および5mMジチオスレイトール(DTT)に25%w/vで細胞を再懸濁させ、使用の直前に細菌プロテアーゼ阻害剤カクテル(P8465 SIGMA−ALDRICH、St.Louis、MO)5mL/Lを添加した。最低の設定で手持ち式ホモジナイザー(TISSUE TEAROR(商標)、BIOSPEC PRODUCTS,Inc.、Bartlesville、OK)を使用して、完全な懸濁液を得た。リゾチーム(SIGMA L7651 25mg、ニワトリ卵白由来)を、金属スパチュラで混合することにより細胞懸濁液に添加し、懸濁液を室温で1時間インキュベートした。懸濁液を氷上で15分間冷却し、次いで、BRANSON250 SONIFIER(1分間のセッションが2回、50%デューティサイクル、30%排出)を使用してソニケーションした。顕微鏡で細胞が溶解したことを確認した。さらなるリゾチーム25mgを必要に応じて添加し、インキュベーションおよびソニケーションを繰り返した。顕微鏡で細胞溶解を確認して、ライセートを11,500xgで25分間(4℃)遠心分離してIBペレットを形成させ、上清を捨てた。IBペレットを溶解緩衝液100mLで再懸濁させ、手持ち式のミキサーでホモジナイズし上記のように遠心分離した。上清が無色になり、IBペレットが固くオフホワイト色になるまで、IBペレットを再懸濁(溶解緩衝液50mL中)、ホモジナイズ、ソニケーションおよび遠心分離により繰り返し洗浄した。最後の洗浄については、IBペレットを2mM EDTAを含む無菌濾過した(0.22μm)蒸留水中で再懸濁させ、遠心分離した。最終ペレットを無菌状態で再懸濁させた。
Pf単離菌DPf150またはDpf129(DIG−911またはDIG−180タンパク質約30mg/mLを含む)由来の封入体懸濁液6mLを、微量遠心管の最高の設定(約14,000xg)で遠心分離し、封入体をペレットにした。50mLコニカルチューブ中で、保存緩衝液の上清を除去し、pH11の100mM炭酸ナトリウム緩衝液25mLに交換した。ピペットを使用して封入体を再懸濁させ、ボルテックスして完全に混合した。チューブを、4℃で一晩、穏やかに振動しているプラットフォーム上に配置して標的タンパク質を抽出した。抽出物を4℃で30分間、30,000xgで遠心分離し、生じた上清をAMICON ULTRA−15再生セルロース遠心式フィルターデバイス(分子量カットオフ30,000;MILLIPORE)を使用して5倍に濃縮した。次いで、使い捨てPD−10カラム(GE HEALTHCARE、Piscataway、NJ)を使用して、試料緩衝液を10mM CAPS(3−(シクロヘキサミノ)1−プロパンスルホン酸)pH10に交換した。
試料調製およびバイオアッセイ
pH10の10mM CAPS中の封入体製剤を、用量3,000、1,000、333.3、111.1、37.0、12.3または4.1ng/cm2の標的Cry1Daタンパク質を送達するように、同じ緩衝液中で希釈した。全てのバイオアッセイは、死亡率または成長阻害についてのバックグラウンドチェックとして機能する、pH10の10mM CAPS緩衝液または水からなるコントロール処理剤を含んでいた。
GI=[1−(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]
ここで、TWITは処理における昆虫の総重量であり、
TNITは処理における昆虫の総数であり、
TWIBCはバックグラウンドチェック(緩衝液コントロール)における昆虫の総重量であり、
TNIBCはバックグラウンドチェック(緩衝液コントロール)における昆虫の総数である。
Gateway(登録商標)(INVITROGEN)エントリーベクターを、標準的な分子クローニング方法により構築した。エントリーベクターpDAB109825は、Cry1Da2コア毒素殺虫性タンパク質(配列番号6)をコードする、トウモロコシ最適化コード配列(配列番号5)を含む。エントリーベクターpDAB109840は、Cry1Da2全長殺虫性タンパク質をコードする、トウモロコシ最適化コード配列を含む。Cry1Da2コア毒素コード配列の植物における発現は、付随するイントロン1を有するトウモロコシユビキチン1プロモーター(米国特許第5,510,474号明細書)のコピーの制御下にある。トウモロコシペルオキシダーゼ5遺伝子由来の3’UTR(ZmPer5 3’UTR;米国特許第6,699,984号明細書)を含む断片を使用して、Cry1Da2 mRNAの転写を終結させた。アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介性のトウモロコシ胚形質転換のための形質転換/発現ベクター(pDAB109841)を、標準的なクローニング方法、ならびに典型的なデスティネーションバイナリーベクター(pDAB109805)および上記のエントリーベクターpDAB109825を使用するGateway(登録商標)組換え反応の使用により構築した。バイナリーデスティネーションベクターpDAB109805は、サトウキビ桿状ウイルスプロモーター(SCBV;基本的に米国特許第6,093,569号明細書に記載)のコピーの発現制御下にある、AAD−1除草剤耐性タンパク質コード領域(米国特許第7,838,733号明細書、およびWright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-20245)を含む。メイズストリークウイルス(MSV)コートタンパク質遺伝子5’UTR由来の配列、およびトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH1)遺伝子由来のイントロン6から構成される合成5’UTR配列は、SCBVプロモーターセグメントの3’末端とAAD−1コード領域の開始コドンとの間に位置している。トウモロコシリパーゼ遺伝子由来の3’UTR(上記)を含む断片を使用して、AAD−1 mRNAの転写を終結させた。
アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介性の形質転換を使用して、Cry1Da2コア毒素コード領域を植物ゲノムに安定に組み込み、それにより、全長または短縮型Cry1Da2殺虫性タンパク質を産生するトランスジェニックトウモロコシ細胞、組織および植物を生成した。スーパーバイナリーまたはバイナリー形質転換ベクターを使用するトウモロコシ形質転換方法は、例えば、国際PCT公開第2010/120452号パンフレットに記載されるように、当技術分野で既知である。形質転換された組織を、R−ハロキシホップ含有培地で生長する能力により選択した。
プロジェクトベクターのグリセロールストックを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)宿主株DAt13192(国際公開第2012/016222号パンフレット)内に用意した。アグロバクテリウム(Agrobacterium)培養物をグリセロールストックから、適切な抗生物質を含むAB最少培地(Watson, et al., (1975) J. Bacteriology 123:255-264)にストリークし、20℃の暗所で3日間インキュベートした。次いで、培養物を、抗生物質を有するYEP培地(mg/L:酵母抽出物、10;ペプトン、10;NaCl、5)のプレートにストリークし、20℃の暗所で1〜3日間インキュベートした。
トウモロコシ(Zea mays)近交系B104(Hallauer, et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406)由来の穂を温室で産生し、受粉後10〜12日で収穫した。収穫した穂の殻を剥き、市販の漂白剤(Ultra Clorox(登録商標)Germicidal Bleach、6.15%次亜塩素酸ナトリウム;TWEEN20 2滴含有)の20%溶液中に20分間浸漬することにより表面を滅菌し、その後、ラミナーフローフード内で無菌の脱イオン水で3度洗い流した。未熟な接合胚(1.8〜2.2mm長)を各穂から無菌的に切除し、アグロバクテリウム(Agrobacterium)懸濁液2.0mLを含む1つまたは複数の微量遠心管に分配し、そこへ10%BREAK−THRU(登録商標)S233界面活性剤(EVONIK INDUSTRIES;Essen、Germany)2μLを添加した。
単離後、胚をロッカープラットフォーム(rocker platform)上に5分間配置した。次いで、チューブの内容物を、4.33mg/L MS塩;改変MSビタミン;30mg/L スクロース;700mg/L L−プロリン;KOH中3.3mg/L ジカンバ(3,6−ジクロロ−o−アニス酸または3,6−ジクロロ−2−メトキシ安息香酸);100mg/L ミオイノシトール;100mg/L カゼイン酵素加水分解物;15mg/L AgNO3;DMSO中200μMアセトシリンゴン;および3mg/L 寒天(SIGMA−ALDRICH、植物細胞培養試験済み)をpH5.8で含む共培養培地のプレートに注いだ。液体アグロバクテリウム(Agrobacterium)懸濁液を無菌の使い捨てトランスファーピペットで除去し、胚を含む共培養プレートをラミナーフローフードの後方に、蓋が半開きの状態で30分間配置し、その後、顕微鏡を用い、無菌の鉗子を使用して、胚盤が上向いた状態に胚を指向させた。プレートを、ラミナーフローフードの後方に蓋が半開きの状態でさらに15分間戻した。次いで、プレートを閉じて3M(商標)Micropore(商標)医療用テープで密封し、光を約60μEm−2sec−1の光強度で持続させた25℃のインキュベーター内に配置した。
共培養期間後、4.33mg/L MS塩;改変MSビタミン;30mg/L スクロース;700mg/L L−プロリン;KOH中3.3mg/L ジカンバ;100mg/Lミオイノシトール;100mg/L カゼイン酵素加水分解物;15mg/L AgNO3;0.5mg/L MES(2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸一水和物;Phytotechnologies labr.;Lenexa、KS);250mg/L セフォタキシム;および7.0mg/L 寒天;pH5.8から構成される休止培地(resting medium)に胚を移した。36個以下の胚を各プレートに移動させた。プレートをMicropore(商標)テープで包み、7〜10日間、光を約50μmol m−2s−1の光強度で持続させた状態で、27℃でインキュベートした。次いで、カルスを有する胚(18未満/プレート)を、寒天は6.5mg/Lのみで、100nM R−ハロキシホップ酸(0.0362mg/L)を有する休止培地(上記)から構成される選択培地Iに移した。プレートをMicropore(商標)テープで包み、7日間、光を約50μEm−2sec−1光強度で持続させた状態で、27℃でインキュベートした。次いで、増殖したカルス(12未満/プレート)を、寒天は6.5mg/Lのみで、500nM R−ハロキシホップ酸(0.181mg/L)を有する休止培地(上記)から構成される選択培地IIに移した。プレートを包み、14日間、光を約50μEm−2sec−1の光強度で持続させた状態で、27℃でインキュベートした。
ハロキシホップを含む培地で生長する能力により選択される、形質転換された植物組織を、Phytatrays(商標)から、生長培地(PROMIX BX;Premier Tech Horticulture)で満たされ、ヒューミドーム(Arco Plastics Ltd.)で覆われた小型の植木鉢(T.O.Plastics、3.5”SVD)に移植し、次いで、生育室(昼28℃/夜24℃、明期16時間、RH50〜70%、200μEm−2sec−1光強度)内で寒さに慣らした。植物がV3〜V4段階に達すると、それらをSunshine Custom Blend 160土壌混合物に移植し、温室(光曝露型:光または同化;高光量限度:1200PAR;日長16時間;昼27℃/夜24℃)内で開花するまで生長させた。トランスジェニックと推定される小植物を、導入遺伝子の相対的コピー数を検出するように設計したプライマーを使用して、定量的リアルタイムPCRアッセイにより導入遺伝子コピー数について分析し、組み込まれたCry1Da2遺伝子のコピーを1つまたは2つのみ有する事象を5ガロンの植木鉢に移植した。何らかの異常な形質を追跡するため、定期的に観察を行った。T0植物から収集した花粉で、T0トランスジェニック植物のシルクに自家受粉し、生じた種子を植え付けすることにより、T1世代の植物を得た。事象109841[3]−106由来のT1種子を植え付けし、植物にキザロホップを噴霧し、繁殖段階まで生き残った植物を維持することにより選択し、コーンイヤーワームのバイオアッセイおよびウェスタンブロット分析用のシルクを得た。
コピー数分析のための加水分解プローブqPCR
分子的分析を使用して、低コピーの単一事象をスクリーニングした。土壌への移植前に、トランスジェニックと推定される、根を張った植物から葉組織を収集した。Biosprint96、QIAGEN抽出ロボットおよび供給業者推奨のプロトコルを使用し、QIAGEN MagAttract(商標)kitを用いてDNAを抽出した。AAD−1遺伝子に特異的な加水分解プローブアッセイを使用して、組み込まれた導入遺伝子のコピー数分析を行った。さらに、バイナリーベクターバックボーンが有するスペクチノマイシン(Spec)抵抗性遺伝子に特異的な加水分解プローブアッセイにより、バイナリーベクタープラスミドバックボーンの偶発的な組み込みによるコンタミネーションを検出した。内因性トウモロコシ遺伝子インベルターゼ;(GenBank(商標)受託番号U16123)についての加水分解プローブアッセイを、内部参照標準として開発した。表2は、加水分解プローブアッセイ成分(Integrated DNA Technologies、Coralville、IAおよびApplied Biosystems、Foster City、CAにより合成)のオリゴヌクレオチド配列を示す。バイプレックス加水分解プローブPCR反応を、DNA約10ngを用いて表3に従って設定し、アッセイ条件を表4に提示する。
PBST(0.05%Tween20含有PBS緩衝液)0.6mL中の穂のシルク(未受粉の穂より収集)200〜240mgからタンパク質を抽出した。2mmのスチールビーズを添加し、チューブに蓋をし、GENO/GRINDER(CERTIPREP;Metuchen、NJ)で固定し、1500rpmで5分間振とうした。チューブを4000rpmで7分間、4℃で遠心分離し、可溶性タンパク質を含む上清を使用まで−80℃で保管した。
T1トウモロコシ事象を用いたV5葉のバイオアッセイ
バイオアッセイトレイ(32ウェル/トレイ;C−D International)を、部分的に2%寒天溶液で満たし、寒天を凝固させた。葉の部分2つ(面積約1平方インチ)を各植物から採取し、それぞれを32ウェルトレイの独立したウェルに配置した。新生アメリカタバコガ(Helicoverpa zea)(CEW)幼虫(孵化後約24〜48時間)10匹を各ウェルに配置した。試験中換気できるように穴を開けた粘着性の蓋でトレイを密封し、次いで、28℃、RH40%、明期16時間:暗期8時間下に配置した。3日後、単一の葉面積損傷パーセントスコアを各葉の小片について採点した。各試験における損傷スコアを平均した。
未受粉の穂を収集し、それらの長さを測定し、バイオアッセイに使用するまで穂を4℃で保管した。シルクおよびコーンイヤーワーム幼虫に水分を供給するため、2%素寒天約10mLを、32ウェルバイオアッセイトレイの各アッセイウェル(約1平方インチ)の底に配置した。シルク5本(約10cm長)を各ウェルの新生CEW2匹に摂食させた。各事象を、完全に無作為な様式で、4回反復して(ウェル)試験した。昆虫寄生後、試験中換気できるように穴を開けた粘着性の蓋でトレイを密封した。28℃、RH60%、明期16時間:暗期8時間下にトレイを配置した。寄生3日後、シルク組織上の排泄物量を視覚的に評価することにより、シルク損傷パーセントを記録した。生存、死亡および行方不明の昆虫数を事象ごとに記録し、幼虫の死亡率パーセントを推定した。
イムノブロット分析により、T1pDAB109841トランスジェニック植物の穂のシルク中のCry1Daコア毒素タンパク質を検出し、このシルクが、バイオアッセイにおいてシルク損傷を4.6%しか示さず(表6)、アメリカタバコガ(H. zea)幼虫による食害に対し優れた防御をもたらした。非殺虫性黄色蛍光タンパク質(YFP;構築物pDAB101556)を産生するネガティブコントロールトランスジェニックトウモロコシ植物、または非トランスジェニックB104植物由来のシルクは、アメリカタバコガ(H. zea)幼虫による平均シルク損傷90%〜95%を受けた。さらに、Cry1Daコア毒素タンパク質を産生する植物由来のシルクを摂食した幼虫の死亡率は26.8%であったが、ネガティブコントロール植物試料においては幼虫の死亡率は観測されなかった。pDAB109851トランスジェニック植物では、アメリカタバコガ(H. zea)により引き起こされる葉損傷が12%〜25%であり(表6)、Cry1Da構築物はV5段階の試料に対し優れた葉防御をもたらしたが、ネガティブコントロール植物(B104およびYFP産生)はほぼ100%の葉損傷を受けた。シルクおよび葉のバイオアッセイ両方の結果は、Cry1Daコア毒素タンパク質が、アメリカタバコガ(H. zea)幼虫による損傷からトウモロコシ植物を防御するのに非常に有効であることを示した。
8つのT1pDAB109841トランスジェニックB104事象由来の種子を、DOW AGROSCIENCES Field Station、Fowler、Indianaの圃場試験区画で試験した。上記の分子的技術によりこれらの事象を分析したところ、検出可能なバイナリーベクターバックボーン配列を有しない単一のコピー事象であることが判明した。事象の全てを、Cry1Da/AAD1組み込み事象について1:1で分離している(ヘミ接合性:ヌル)T1植物として試験した。ネガティブコントロールは、非トランスジェニックB104(ヌル)植物であった。
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Claims (16)
- 植物に対するコーンイヤーワームによる損傷を防除する方法であって、摂食させるために、前記コーンイヤーワームに対しCry1Da殺虫性タンパク質または変異体を与えるステップを含む、方法。
- 前記Cry1Da殺虫性タンパク質または変異体が、植物細胞によって産生され、植物細胞に存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記Cry1Da殺虫性タンパク質または変異体が、稔性の植物体全体によって産生され、稔性の植物体全体に存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記Cry1Da殺虫性タンパク質が、配列番号6と少なくとも95%同一であるコア毒素領域を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記Cry1Da殺虫性タンパク質が、配列番号6と少なくとも99%同一であるコア毒素領域を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記植物が、コーン、ダイズおよびワタからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 非Bt緩衝区植物、およびCry1Daコア毒素を含む殺虫性タンパク質を発現する複数の植物を含む、圃場内の複数の植物であって、前記緩衝区植物が、前記圃場における全ての作物植物のうち40%未満、30%未満、20%未満、10%未満または5%未満を占める、複数の植物。
- 前記植物が10エーカー超を占有する、請求項7に記載の複数の植物。
- 緩衝区植物が存在しない、請求項7に記載の複数の植物。
- 前記緩衝区植物がブロックまたはストリップ内にある、請求項7に記載の複数の植物。
- 非Bt緩衝区植物由来の緩衝区種子、およびCry1Daを発現することができる複数の種子を含む種子混合物であって、前記緩衝区種子が前記混合物における全ての種子のうち40%未満、30%未満、20%未満、10%未満または5%未満を占める、種子混合物。
- コーンイヤーワーム昆虫に、請求項7から10に記載の植物のいずれかを摂食させることにより、前記昆虫を防除する方法。
- 植物に対するコーンイヤーワームによる損傷を防除する方法であって、配列番号6を含むコード領域を発現するDNA配列により植物細胞を形質転換させるステップ、前記形質転換された植物細胞由来の稔性のトランスジェニック植物を再生させるステップ、前記形質転換された植物由来の前記DNA配列を有する種子を収集するステップ、前記形質転換された植物の前記種子を生長させるステップ、および前記コーンイヤーワームに、前記DNA配列により発現されたタンパク質を摂食させるステップを含む、方法。
- 前記DNA配列が、配列番号6と少なくとも99%同一である、請求項13に記載の方法。
- 植物に対するコーンイヤーワームによる損傷を防除する方法であって、配列番号6を含むコード領域を発現する前記形質転換された植物により産生された種子を生長させるステップ、および前記コーンイヤーワームに、前記DNA配列により発現されたタンパク質を摂食させるステップを含む、方法。
- 前記DNA配列が、配列番号6と少なくとも99%同一である、請求項15に記載の方法。
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