MX2012007138A - Uso combinado de proteínas cry1da y cry1fa para el control de la resistencia de los insectos. - Google Patents
Uso combinado de proteínas cry1da y cry1fa para el control de la resistencia de los insectos.Info
- Publication number
- MX2012007138A MX2012007138A MX2012007138A MX2012007138A MX2012007138A MX 2012007138 A MX2012007138 A MX 2012007138A MX 2012007138 A MX2012007138 A MX 2012007138A MX 2012007138 A MX2012007138 A MX 2012007138A MX 2012007138 A MX2012007138 A MX 2012007138A
- Authority
- MX
- Mexico
- Prior art keywords
- plants
- cryi
- plant
- protein
- refuge
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 186
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 131
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 52
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 153
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 153
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 17
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 127
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 44
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 42
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 37
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 34
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 34
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 28
- 101150102464 Cry1 gene Proteins 0.000 claims description 18
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 10
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 8
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 claims description 7
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 claims description 7
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 claims description 6
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 claims description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 3
- 244000038559 crop plants Species 0.000 claims 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 184
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 31
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 27
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 19
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000004531 microgranule Substances 0.000 description 13
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 13
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 13
- 241001147381 Helicoverpa armigera Species 0.000 description 12
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 230000009471 action Effects 0.000 description 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 7
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 7
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 7
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 241000122106 Diatraea saccharalis Species 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000346285 Ostrinia furnacalis Species 0.000 description 4
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 4
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 4
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 2
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000223651 Aureobasidium Species 0.000 description 2
- 241000589151 Azotobacter Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 241000879145 Diatraea grandiosella Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 2
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 241001477931 Mythimna unipuncta Species 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 235000021405 artificial diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 2
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- -1 t Species 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZHVOBYWXERUHMN-KVJKMEBSSA-N 3-[(3s,5r,8r,9s,10s,13s,14s,17s)-10,13-dimethyl-3-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2h-furan-5-one Chemical compound O([C@@H]1C[C@H]2CC[C@@H]3[C@@H]([C@]2(CC1)C)CC[C@]1([C@H]3CC[C@@H]1C=1COC(=O)C=1)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ZHVOBYWXERUHMN-KVJKMEBSSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 1
- 244000235858 Acetobacter xylinum Species 0.000 description 1
- 235000002837 Acetobacter xylinum Nutrition 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 238000008940 Alkaline Phosphatase assay kit Methods 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101100497233 Bacillus thuringiensis subsp. aizawai cry1Da gene Proteins 0.000 description 1
- 101100007609 Bacillus thuringiensis subsp. aizawai cry1Fa gene Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 1
- 239000011547 Bouin solution Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 241000190714 Gymnosporangium clavipes Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 1
- DKNPRRRKHAEUMW-UHFFFAOYSA-N Iodine aqueous Chemical compound [K+].I[I-]I DKNPRRRKHAEUMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 239000012741 Laemmli sample buffer Substances 0.000 description 1
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 1
- 241000215495 Massilia timonae Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000005041 Mylar™ Substances 0.000 description 1
- 241001443590 Naganishia albida Species 0.000 description 1
- 241000033319 Naganishia diffluens Species 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000222051 Papiliotrema laurentii Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 1
- 241000158450 Rhodobacter sp. KYW73 Species 0.000 description 1
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 description 1
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 241000223253 Rhodotorula glutinis Species 0.000 description 1
- 241000223254 Rhodotorula mucilaginosa Species 0.000 description 1
- 239000011542 SDS running buffer Substances 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241001479507 Senecio odorus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000256247 Spodoptera exigua Species 0.000 description 1
- 241000985245 Spodoptera litura Species 0.000 description 1
- 241000222068 Sporobolomyces <Sporidiobolaceae> Species 0.000 description 1
- 241000123675 Sporobolomyces roseus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 244000288561 Torulaspora delbrueckii Species 0.000 description 1
- 235000014681 Torulaspora delbrueckii Nutrition 0.000 description 1
- 241001495125 Torulaspora pretoriensis Species 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960005475 antiinfective agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000005667 attractant Substances 0.000 description 1
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 229960001927 cetylpyridinium chloride Drugs 0.000 description 1
- YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M cetylpyridinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000031902 chemoattractant activity Effects 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 238000001297 coherence probe microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 101150024923 da gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 235000012489 doughnuts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002140 halogenating effect Effects 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 235000014666 liquid concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- STEPQTYSZVCJPV-UHFFFAOYSA-N metazachlor Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1N(C(=O)CCl)CN1N=CC=C1 STEPQTYSZVCJPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052615 phyllosilicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ALZJERAWTOKHNO-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;3-morpholin-4-ylpropane-1-sulfonic acid Chemical compound [Na+].OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O ALZJERAWTOKHNO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
- A01H5/10—Seeds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physiology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Botany (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
Abstract
La invención en cuestión incluye métodos y plantas para controlar insectos lepidópteros, en donde dichas plantas comprenden las toxinas núcleo Cry1Fa y Cry1Da que contiene proteínas en combinación para retardar o prevenir el desarrollo de resistencia en insecto(s).
Description
USO COMBINADO DE PROTEÍNAS CRY1DA Y CRY1FA PARA EL
CONTROL DE LA RESISTENCIA DE LOS INSECTOS
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los seres humanos cultivan maíz para aplicaciones de alimentos y energía. Los seres humanos también hacen crecer muchos otros cultivos que incluyen soja y algodón. Los insectos comen y dañan plantas y por lo tanto debilitan dichos esfuerzos realizados por los seres humanos. Cada año se gastan miles de millones de dólares para controlar plagas de insectos y se pierden al mismo tiempo miles de millones adicionales con el daño que los insectos infligen. Los insecticidas orgánicos, sintéticos y químicos, han sido las principales herramientas que se han utilizado para controlar las plagas de insectos, si bien los insecticidas biológicos, tales como las proteínas insecticidas derivadas de Bacillus thuríngiensis (Bt) han desempeñado un papel importante en algunas zonas. La capacidad para producir plantas resistentes a los insectos a través de la transformación con genes de proteínas insecticidas Bt ha revolucionado la agricultura moderna y ha resaltado también la importancia y el valor de las proteínas insecticidas y sus genes.
Se han utilizado diversas proteínas Bt para crear plantas transgénicas resistentes a los insectos, las cuales se han registrado y comercializado con éxito hasta la fecha. Dichas proteínas incluyen CryIAb, CrylAc, Cryl F y Cry3Bb en el maíz CryIAc, Cry2Ab en el algodón y Cry3A en la papa.
Los productos comerciales que expresan dichas proteínas expresan una única proteina excepto en aquellos casos en los cuales se desea el espectro insecticida combinado de 2 proteínas (por ejemplo, CryIAb y Cry3Bb en el maíz, combinadas para proporcionar resistencia a las plagas de lepidópteros y gusanos de la raíz, respectivamente) o en aquellos casos en los cuales la acción independiente de las proteínas las hace útiles como herramienta para retardar el desarrollo de la resistencia en poblaciones susceptibles a los insectos (por ejemplo, CrylAc y Cry2Ab en el algodón, combinadas para proporcionar el control de resistencia a la oruga del tabaco).
Es decir, algunas de las cualidades de las plantas transgénicas resistentes a los insectos que han llevado a la adopción rápida y generalizada de esta tecnología también han originado la inquietud referida a la posibilidad de que las poblaciones de plagas desarrollen en el futuro resistencia a las proteínas insecticidas producidas por dichas plantas. Se han propuesto diversas estrategias para preservar la utilidad de las características de resistencia de los insectos sobre la base de Bt, las cuales incluyen utilizar proteínas a una dosis alta en combinación con un refugio y, en alternancia con, o con la utilización conjunta de distintas toxinas (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management " Nature Biotechnol. 16:144-146).
Las proteínas seleccionadas para utilizar en un evento apilado de Control de Resistencia a Insectos (IR , según sus siglas en inglés)
necesitan ejercer su efecto insecticida en forma independiente de modo que la resistencia desarrollada hacia una proteína no confiera resistencia hacia la segunda proteína (es decir, no exista una resistencia cruzada entre las proteínas). En el caso de que, por ejemplo, una población de plaga seleccionada por su resistencia a la "Proteína A" sea sensible a la "Proteína B", se podría llegar a la conclusión de que no existe resistencia cruzada y de que una combinación de la Proteina A y la Proteína B sería eficaz para retardar la resistencia a la Proteína A en forma individual.
A falta de poblaciones de insectos resistentes se pueden realizar valoraciones basadas en otras características de las que se presume que están relacionadas con el mecanismo de acción y el potencial de resistencia cruzada. Se ha afirmado que la utilidad de la unión mediada por el receptor para la identificación de las proteínas insecticidas probablemente no presente una resistencia cruzada (van Mellaert et al. 1999). El fundamento clave de ausencia de resistencia cruzada inherente en este enfoque es que las proteínas insecticidas no compiten por los receptores en una especie de insectos sensibles.
En el caso de que dos toxinas Bt compitan por el mismo receptor, entonces si dicho receptor muta en dicho insecto de modo que una de las toxinas ya no se una a dicho receptor y por lo tanto ya no sea insecticida contra el insecto, podría ocurrir que el insecto también sea resistente a la segunda toxina (la cual se une competitivamente al mismo receptor). Es decir, se entiende que el insecto tiene resistencia cruzada a ambas toxinas Bt. Sin embargo, si dos toxinas se unen a dos receptores diferentes, esto podría ser una señal de que el insecto no seria simultáneamente resistente a dichas dos toxinas.
CryI Fa es útil para el control de varias especies de plagas de lepidópteros que incluyen el barrenador de maíz europeo (ECB (según sus siglas en inglés); Ostrinia nubilalis (Hübner)) y el gusano cogollero del maíz
(FAW (según sus siglas en inglés); Spodoptera frugiperda), y es activa contra el barrenador de la caña de azúcar (SCB (según sus siglas en inglés);
Diatraea saccharalis). La proteína CryI Fa, producida en las plantas de maíz que contienen el evento TC1507, es responsable de una característica de resistencia de los insectos destacada en la industria para el control de FAW.
La proteína CryI Fa además se utiliza en los productos Herculex®,
SmartStax™, y WideStrike™.
La capacidad de llevar a cabo estudios de unión al receptor (competitivos u homólogos) que utilizan la proteína CryI Fa está limitada debido a que las técnicas más comunes disponibles para rotular proteínas para la detección en los ensayos de unión al receptor inactiva la actividad insecticida de la proteína Cry Fa.
En el sitio web del comité oficial de la nomenclatura de B.t. se enumeran toxinas Cry adicionales - (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Véase el Apéndice A, adjunto.
Existen actualmente casi 60 grupos principales de toxinas "Cry" (Cry1-Cry59), con toxinas Cyt y toxinas VIP adicionales y similares. Varias toxinas de cada uno de los grupos numéricos tienen subgrupos en letra mayúscula y los subgrupos de letra mayúscula tienen sub-subgrupos en letra minúscula. (Cry1 tiene A-L y CryIA tiene, por ejemplo, a-i).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención en cuestión se refiere en parte al hallazgo sorprendente de que una población de gusano cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda; FAW) seleccionada por su resistencia a la actividad insecticida de la proteína Cryl Fa no es resistente a la actividad insecticida de la proteína CryI Da. Tal como podrá apreciar el experto en la técnica con el beneficio de la presente divulgación, las plantas que expresan dichas dos proteínas insecticidas, o porciones insecticidas de las mismas, serán útiles para retardar o prevenir el desarrollo de resistencia a cualquiera de dichas proteínas insecticidas en forma individual.
La invención en cuestión también está basada en el hallazgo de que Cryl Fa y CryI Da no compiten entre sí para unirse a los receptores del intestino del gusano cogollero del maíz (FAW).
La invención en cuestión también se refiere en parte a eventos apilados triples o "pirámides" de tres (o más) toxinas, en donde las toxinas Cryl Fa y CryI Da son el par base. Una pirámide preferida proporciona por lo menos dos modos de acción contra dos plagas - el gusano cogollero del maíz (FAW) y el barrenador de maíz europeo (ECB; Ostrínia nubilalis): Cry Fa más Cryi Da más una o más toxinas del barrenador de maíz europeo (ECB) tales como CryIAb. En algunas modalidades preferidas de pirámide, las toxinas seleccionadas tienen tres modos de acción por separado contra el gusano cogollero del maíz (FAW). Dichas combinaciones preferidas de pirámides que tienen "tres modos de acción" son Cryl Fa más Cryl D más otra toxina/gen seleccionado entre el grupo integrado por Vip3Ab, Cryi C, CryI Be y CryI E. Las plantas (y la extensión en acres plantados con dichas plantas) que producen dichas tres toxinas están incluidas dentro del alcance de la invención en cuestión. También se pueden agregar toxinas/genes adicionales si bien dichos eventos apilados triples particulares, de acuerdo con la invención en cuestión, podrían proporcionar ventajosamente y sorprendentemente tres modos de acción contra el gusano cogollero del maíz (FAW). Esto podría ayudar a reducir o eliminar la necesidad de extensión en acres para refugio. La invención en cuestión también se refiere generalmente al uso de tres proteínas insecticidas (las proteínas Cry en algunas modalidades preferidas) que no compiten entre sí contra una única plaga blanco.
Por lo tanto, Cryi Da se podría utilizar como en la combinación de 3 genes para el maíz y otras plantas (algodón y soja, por ejemplo). Un gen cryi Da se podría combinar, por ejemplo, en un producto Cryl Fa tal como Herculex®, SmartStax™ y WidesStrike™. Por consiguiente, el uso de Cryi Da podría ser significativo para reducir la presión de selección sobre otras proteínas comercializadas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Daños (% promedio de daños en las hojas + SE ) ocurridos en segmentos de hojas del maíz infestado con gusano cogollero del maíz, FAW (barras azules) o rFAW (barras violetas). Todos los tratamientos precedidos por los números "5163" son segmentos de hojas provenientes de plantas transformadas con una construcción que contiene CryI Da. Las plantas en las cuales no se detectó la expresión CryI Da están agrupadas en la extrema izquierda del gráfico. Las plantas en las cuales se detectó la expresión CryI Da están agrupadas en el centro del gráfico. Los controles no transgénicos (es decir, negativos) están ubicados en la extrema derecha del gráfico y están rotulados "B 04", "HUI", e "Isolina". Una línea endogámica comercial que contiene CryI Fa es el primer tratamiento a la derecha (rotulado "Herculex I") y es el mismo antecedente genético que el control no transgénico rotulado "Isolina".
Figura 2: Competición para unión a vesículas de membrana del borde en cepillo (BBMV) de Spodoptera frugiperda mediante la toxina núcleo de CryI Fa, la toxina núcleo de CryI Da, y la proteína de toxina núcleo de CryI Da rotulada 1251.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Tal como se indica en la presente, la toxina CryI Da producida en el maíz transgénico (y otras plantas; algodón y soja, por ejemplo) es muy eficaz para el control del gusano cogollero del maíz (FAW; Spodoptera frugiperda) que ha desarrollado resistencia a la actividad CryI Fa. Por lo tanto, la invención en cuestión se refiere en parte al hallazgo sorprendente de que el gusano cogollero del maíz resistente a CryI Fa es susceptible (es decir, no tiene resistencia cruzada) a CryI Da.
La invención en cuestión también se refiere en parte al hallazgo sorprendente de que la toxina CryI Da es eficaz para la protección de plantas (tales como las plantas de maíz) contra daños causados por el gusano cogollero del maíz resistente a CryI Fa. Para un análisis de esta plaga, véase por ejemplo Tabashnik, PNAS (2008), vol. 105 N° 49, 19029-19030.
La invención en cuestión incluye el uso de la toxina CryI Da para proteger el maíz y otras especies de plantas importantes a nivel económico contra daños y pérdida de rendimiento causados por la alimentación del gusano cogollero del maíz o por poblaciones del gusano cogollero del maíz que han desarrollado resistencia a CryI Fa.
Por lo tanto, la invención en cuestión divulga un evento apilado de Control de Resistencia a Insectos (IRM) para prevenir o mitigar el desarrollo de resistencia del gusano cogollero del maíz a CryI Fa y/o CryI Da.
La presente invención proporciona composiciones para el control
de plagas de lepidópteros que comprenden células que producen una proteína que contiene la toxina núcleo de CryI Fa y una proteína que contiene la toxina núcleo de Cryl Da.
La invención además comprende un huésped transformado para producir tanto una proteína que contiene la toxina núcleo de CryI Fa como una proteína que contiene la toxina núcleo de Cryl Da, en la cual dicho huésped es un microorganismo o una célula de planta. El polinucleótido cryI Fa de la invención y el polinucleótido cryI Da de la invención están preferentemente en una construcción genética bajo el control de (operativamente unido a / que comprende) uno o más promotores no Bacillus-thuringiensis. Los polinucleótidos de la invención pueden comprender el uso de codones para promover la expresión en una planta.
Se prevé adicionalmente que la invención provea un método de control de plagas de lepidópteros que comprende poner en contacto dichas plagas o el entorno de dichas plagas con una cantidad eficaz de una composición que contiene una proteína CryI Fa que contiene la toxina núcleo y que además contiene una proteína Cryl Da que contiene la toxina núcleo.
Una modalidad de la invención comprende una planta de maíz que comprende un gen expresable en una planta que codifica una proteína Cryl Da que contiene la toxina núcleo y un gen expresable en una planta que codifica una proteína CryI Fa que contiene la toxina núcleo, y la semilla de dicha planta.
Una modalidad adicional de la invención comprende una planta
de maíz en la cual un gen expresable en una planta que codifica una proteína CryI Da que contiene la toxina núcleo y un gen expresable en una planta que codifica una proteína CryI Fa que contiene la toxina núcleo han sido introducidos en dicha planta de maíz y en la semilla de dicha planta.
Receptores de insectos
Tal como se describe en los Ejemplos, los estudios de unión a receptores competitivos que utilizan la proteína de toxina núcleo de CryI Da radiorrotulada muestran que la proteína de toxina núcleo de CryIFa no compite por el sitio de unión de alta afinidad presente en los tejidos de insectos tales como el gusano cogollero del maíz (FAW) a los cuales se une CryI Da. Estos resultados indican que la combinación de las proteínas CryI Fa y CryI Da es un medio eficaz para mitigar el desarrollo de resistencia en poblaciones del gusano cogollero del maíz (FAW) a CryIFa (y del mismo modo, el desarrollo de resistencia a CryI Da), y probablemente aumentaría el nivel de resistencia a esta plaga en las plantas de maíz que expresan ambas proteínas.
Por lo tanto, basándose en parte en los datos descriptos anteriormente y en cualquier otra parte de la presente, se cree que la producción conjunta (evento apilado) de las proteínas CryIDa y CryI Fa se puede utilizar para producir una alta dosis de evento apilado de Control de Resistencia en Insectos (IRM) para el gusano cogollero del maíz (FAW). Se pueden agregar otras proteínas a esta combinación para expandir el espectro de control del insecto. Por ejemplo, en el maíz, la adición de CryIAb crearía una pirámide de Control de Resistencia en Insectos (IRM) para el control del barrenador de maíz europeo agregando al mismo tiempo incluso otro mecanismo de acción para el control del barrenador de la caña de azúcar (SCB). La utilidad de la invención en cuestión también se podría extender a otras plagas de insectos sensibles tales como la rosquilla verde {Spodoptera exigua (Hübner)) y el barrenador del maíz del sudoeste (Diatraea grandiosella Dyer).
Otra opción de utilización consistiría en utilizar las proteínas Cryl Fa y Cryl Da en combinación con otra, tercera toxina/gen, y utilizar este evento apilado triple para mitigar el desarrollo de resistencia en el gusano cogollero del maíz (FAW) a cualquiera de estas toxinas. Por lo tanto, otra opción de utilización de la invención en cuestión sería utilizar una, dos o tres (o más) de estas proteínas en regiones de crecimiento de cultivos en donde el gusano cogollero del maíz (FAW) puede desarrollar poblaciones resistentes. Por consiguiente, la invención en cuestión también se refiere en parte a eventos apilados triples o "pirámides" de tres (o más) toxinas, en donde las toxinas Cryl Fa y Cryl Da son el par base. Una pirámide preferida proporciona por lo menos dos modos de acción contra dos plagas - el gusano cogollero del maíz (FAW) y el barrenador de maíz europeo (ECB; Ostrínia nubilalis): Cryl Fa más Cryl Da más una o más toxinas del barrenador de maíz europeo (ECB) tal como CryIAb (véase el documento US 2008 031 1096), ya que CryI F es activa contra ambos insectos. Otras toxinas del barrenador de maíz europeo (ECB) incluyen CryIBe (véase el documento USSN 61/284,290; presentado el 16 de diciembre de 2009), Cryl l (véase el documento USSN 61/284,278; presentado el 16 de diciembre de 2009), Cry2Aa (véase el documento USSN 61/284,278; presentado el 16 de diciembre de 2009) y DIG-3 (véase él documento US 2010 00269223). En algunas modalidades preferidas de pirámide, las toxinas seleccionadas tienen tres modos de acción por separado contra el gusano cogollero del maíz (FAW). Estas combinaciones de pirámide preferidas que tienen "tres modos de acción" incluyen CryIFa más CryI D más otra toxina/gen seleccionado entre el grupo integrado por Vip3Ab, CryIC (véase el documento USSN 61/284,281 ; presentado el 16 de diciembre de 2009), CryI Be, y CryI E (véase el documento USSN 61/284,278; presentado el 16 de diciembre de 2009). Las plantas (y la extensión en acres plantados con dichas plantas) que producen estas tres toxinas están incluidas dentro del alcance de la invención en cuestión. También se pueden agregar toxinas/genes adicionales si bien dichos eventos apilados triples particulares, de acuerdo con la invención en cuestión, podrían proporcionar ventajosamente y sorprendentemente tres modos de acción contra el gusano cogollero del maíz (FAW). Esto podría ayudar a reducir o eliminar la necesidad de extensión en acres para refugio. Por lo tanto, un campo de alrededor de 4,04 ha (10 acres), que está plantado de este modo, está incluido dentro de la invención en cuestión.
Por lo tanto, CryI Da se podría utilizar como en la combinación de 3 genes para el maíz que actualmente (sic) en el Desarrollo I del nuevo proceso de Desarrollo de Características. CryI Fa se encuentra en los productos Herculex®, SmartStax™, y WidesStrike™. Por consiguiente, el uso de CryI Da podría ser significativo para reducir la presión de selección sobre otras proteínas comercializadas.
En el Apéndice A adjunto se enumeran, por ejemplo, otras toxinas Vip3. Dichos números de acceso al GENBANK también se pueden utilizar para obtener las secuencias para cualquiera de los genes y proteínas divulgados o mencionados en la presente.
Las Patente de EE.UU. N° 5,188,960 y la Patente de EE.UU. N° 5,827,514 describen la toxina núcleo de CryI Fa que contiene proteínas adecuadas para llevar a cabo la presente invención. La Patente de EE.UU. N° 6,218,188 describe secuencias de ADN optimizadas con plantas que codifican la proteína CryI Fa que contiene las toxinas básicas que son adecuadas para utilizar en la presente invención.
Las combinaciones de las toxinas descriptas en la invención en cuestión se pueden utilizar para el control de plagas de lepidópteros. Los lepidópteros adultos, por ejemplo, las mariposas y las polillas, se alimentan básicamente del néctar de flores y constituyen un factor significativo de polinización. Casi todas las larvas de lepidópteros, es decir, las orugas, se alimentan de plantas y muchas de ellas constituyen plagas graves. Las orugas se alimentan sobre o dentro del follaje o en las raíces o el tallo de una planta, privando a la planta de nutrientes y a menudo destruyendo la estructura de apoyo físico de la planta. Adicionalmente, las orugas se
alimentan de fruta, tejidos, y granos almacenados y harinas, estropeando estos productos para la venta o disminuyendo drásticamente su valor. Tal como se emplea en la presente, la referencia a plagas de lepidópteros se refiere a diversas etapas de vida de la plaga, incluyendo las etapas de larva.
Algunas toxinas quiméricas de la invención en cuestión comprenden una porción de toxina núcleo N-terminal completa de una toxina Bt y, en algún punto pasando el extremo de la porción de toxina núcleo, la proteína tiene una transición a una secuencia de protoxina heteróloga. La porción de toxina N-terminal, insecticidamente activa de una toxina Bt se denomina toxina "núcleo". La transición desde el segmento de toxina núcleo hacia el segmento de protoxina heteróloga puede ocurrir en aproximadamente la unión de toxina/protoxina o, en forma alternativa, se puede retener una porción de la protoxina nativa (que se extiende pasando la porción de toxina núcleo), en donde la transición hacia la porción heteróloga de protoxina ocurre corriente abajo.
A modo de ejemplo, una toxina quimérica de la invención en cuestión, es una porción completa de toxina núcleo de CryI Fa (aminoácidos 1 a 601) y una protoxina heteróloga (aminoácidos 602 al extremo C-terminal). En una modalidad preferida, la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina proviene de una toxina de proteína CryIAb. A modo de segundo Ejemplo, una segunda toxina quimérica de la invención en cuestión tiene la porción completa de toxina núcleo de CryI Da (aminoácidos 1 a 619) y una protoxina heteróloga (aminoácidos 620 al extremo C-terminal).
En una modalidad preferida, la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina proviene de una toxina de proteína CryIAb.
Un experto en la técnica podrá apreciar que las toxinas Bt, incluso dentro de una cierta clase tal como CryI F, podrán variar hasta cierto punto en longitud y la ubicación precisa de la transición desde la porción de toxina núcleo hacia la porción de protoxina. Típicamente, las toxinas Cryl Da y CryI Fa tienen alrededor de 1 150 a alrededor de 1200 aminoácidos de longitud. La transición desde la porción de toxina núcleo hacia la porción de protoxina ocurrirá típicamente entre alrededor de 50% y alrededor de 60% de la toxina de longitud completa. La toxina quimérica de la invención en cuestión incluirá la extensión total de esta porción de toxina núcleo N-terminal. Por lo tanto, la toxina quimérica comprenderá por lo menos alrededor de 50% de la longitud completa de la proteína de toxina Cry1 Fa Bt o por lo menos alrededor de 50% de la longitud completa de la proteína de toxina Cryl Da Bt. Esta tendrá típicamente por lo menos alrededor de 590 aminoácidos. Con respecto a la porción de protoxina, la extensión total de la porción de protoxína CryIAb se extiende desde el extremo de la porción de toxina núcleo hacia el extremo C-terminal de la molécula.
Genes y toxinas
Los genes y las toxinas útiles de acuerdo con la invención en cuestión incluyen no sólo las secuencias de longitud completa divulgadas sino también los fragmentos de dichas secuencias, variantes, mutantes, y
proteínas de fusión que retienen la actividad pesticida característica de las toxinas específicamente ejemplificadas en la presente. Tal como se emplea en la presente, los términos "variantes" o "variaciones" de los genes se refieren a secuencias de nucleótídos que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas equivalentes que tienen actividad pesticida. Tal como se emplea en la presente, la expresión " toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma o básicamente la misma actividad biológica contra las plagas blanco que las toxinas reivindicadas.
Tal como se emplea en la presente, los límites representan aproximadamente el 95% (Cry1 Fa's y 1 Da's), el 78% (Cry1 F's y Cry1 D's), y el 45% (Cry s) de identidad de secuencia, según "Revisión of the Nomenciature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins," N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, y D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Estos recortes también se pueden aplicar a la toxina núcleo solamente (para las toxinas Cry1 F y Cry1 D).
Debería ser evidente para un experto en la técnica que los genes que codifican toxinas activas se pueden identificar y obtener a través de diversos medios. Los genes específicos o las porciones de genes ejemplificados en la presente se pueden obtener a partir de aislados depositados en un depósito de cultivos. Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, también se pueden construir sintéticamente, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de genes. Las variaciones de genes se
pueden construir fácilmente utilizando técnicas estándares para preparar mutaciones de punto. Asimismo, los fragmentos de estos genes se pueden preparar utilizando exonucleasas o endonucleasas disponibles en el comercio de acuerdo con procedimientos estándares. Por ejemplo, las enzimas tales como Bal31 o la mutagénesis dirigida al sitio se pueden utilizar para recortar sistemáticamente nucleótidos desde los extremos de estos genes. Los genes que codifican fragmentos activos también se pueden obtener utilizando una variedad de enzimas de restricción. Las proteasas se pueden utilizar para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas de proteínas.
Los fragmentos y equivalentes que retienen la actividad pesticida de las toxinas ejemplificadas estarían dentro del alcance de la invención en cuestión. Asimismo, debido a la redundancia del código genético, una variedad de distintas secuencias de ADN pueden codificar las secuencias de aminoácidos divulgadas en la presente. Queda a criterio del experto en la técnica crear estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas, o básicamente las mismas, toxinas. Estas variantes de secuencias de ADN están comprendidas dentro del alcance de la invención en cuestión. Tal como se emplea en la presente, la referencia a "básicamente la misma" secuencia se refiere a secuencias que tienen sustituciones, supresiones, adiciones o inserciones que no afectan materialmente la actividad pesticida. Los fragmentos de genes que codifican proteínas que retienen la actividad pesticida también están incluidos en esta definición.
Un método adicional para identificar los genes que codifican las toxinas y las porciones de genes útiles de acuerdo con la invención en cuestión es a través del uso de sondas de oligonucleótidos. Estas sondas son secuencias de nucleótidos detectables. Estas secuencias pueden ser detectables en virtud de un rótulo apropiado o pueden ser inherentemente fluorescentes tal como se describe en la Solicitud Internacional N° WO93/16094. Como es bien sabido en la técnica, si la molécula de sonda y la muestra de ácido nucleico se hibridan formando un enlace fuerte entre las dos moléculas se puede asumir razonablemente que la sonda y la muestra tienen una homología sustancial. Preferentemente, la hibridación se lleva a cabo en condiciones de rigurosidad mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tal como se describe, por ejemplo, en Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., páginas 169- 70. Algunos ejemplos de concentraciones de sales y combinaciones de temperatura son los siguientes (a fin de aumentar la rigurosidad): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1X SSPE o SSC a 42° C; 0.1X SSPE o SSC a 42° C; 0.1X SSPE o SSC a 65° C. La detección de la sonda proporciona un medio para determinar en una manera conocida si ocurrió la hibridación. Dicho análisis de sonda proporciona un método rápido para identificar genes que codifican toxinas de la invención en cuestión. Los segmentos de nucleótidos que se utilizan como sondas de acuerdo con la invención se pueden sintetizar utilizando un sintetizador de ADN y procedimientos estándares. Estas secuencias de nucleótidos también se pueden utilizar como iniciadores PCR para amplificar genes de la invención en cuestión.
Variantes de toxinas
Ciertas toxinas de la invención en cuestión han sido específicamente ejemplificadas en la presente. Debido a que estas toxinas son sólo ejemplos de las toxinas de la invención en cuestión, debería advertirse fácilmente que la invención en cuestión comprende variantes de toxinas o toxinas equivalentes (y secuencias de nucleótidos que codifican toxinas equivalentes) que tienen actividad pesticida igual o similar a la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendrán homología de aminoácidos con una toxina ejemplificada. Esta homología de aminoácidos será típicamente mayor al 75%, preferentemente mayor al 90%, y muy preferentemente mayor al 95%. La homología de aminoácidos será más elevada en regiones críticas de la toxina que representan la actividad biológica o que están involucradas en la determinación de una configuración tridimensional, la cual sea finalmente responsable de la actividad biológica. En este aspecto, ciertas sustituciones de aminoácidos son aceptables y pueden esperarse si dichas sustituciones se encuentran en regiones que no son críticas para la actividad o que son sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los aminoácidos se pueden colocar en las clases siguientes: non-polar, polar no cargado, básico y ácido. Las sustituciones conservadoras en las cuales un aminoácido de una clase es reemplazado por otro aminoácido del mismo tipo están comprendidas dentro del alcance de la invención en cuestión siempre que la sustitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. A continuación se proporciona un listado de ejemplos of aminoácidos que pertenecen a cada una de las clases.
En algunos casos también se pueden realizar sustituciones no conservadoras. El factor crítico es que dichas sustituciones no deben significativamente quitarle valor a la actividad biológica de la toxina.
Huéspedes recombinantes
Los genes que codifican las toxinas de la invención en cuestión se pueden introducir en una amplia variedad de huéspedes microbianos o de plantas. La expresión del gen de la toxina tiene como resultado, directamente o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del pesticida. La transferencia conyugal y la transferencia recombinante se pueden utilizar para crear una cepa de Sf que expresa ambas toxinas de la invención en cuestión. Otros organismos huéspedes también se pueden transformar con uno o ambos genes de la toxina luego utilizados para llevar a cabo el efecto sinérgico. En el caso de huéspedes microbianos adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios se pueden aplicar al sitio de la plaga, en donde proliferarán y serán ingeridos. El resultado es el control de la plaga. De forma alternativa, el microbio que hospeda al gen de la toxina se puede tratar en condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La célula tratada que retiene la actividad tóxica luego se puede aplicar al entorno de la plaga blanco.
Cuando la toxina de Bt se introduce mediante un vector adecuado en un huésped microbiano y dicho huésped se aplica al entorno en estado vivo, es fundamental que se utilicen ciertos microbios huéspedes. Se seleccionan huéspedes de microorganismos que se sabe que ocupan la "fitoesfera" (filoplano, filoesfera, rizoesfera, y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de manera que sean capaces de competir con éxito en el entorno particular (cultivo y otros hábitats de los insectos) con los microorganismos de tipo salvaje, proporcionar el mantenimiento y la expresión estables del gen que expresa el pesticida polipéptido, y, convenientemente, proporcionar la protección mejorada del pesticida frente a la degradación del medio ambiente y la inactivación.
Se conoce un gran número de microorganismos que habitan el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas) y/o la rizoesfera (el suelo que rodea las raíces de la plantas) de una amplia variedad de cultivos importantes. Dichos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. De especial interés son los microorganismos tales como las bacterias, por ejemplo, los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arihrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes, hongos, en particular levaduras, por ejemplo, los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. De especial interés son dichas especies bacterianas de la fitoesfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestrís, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, y Azotobacter vinlandii; y las especies de levadura de la fitoesfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoríensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans. De especial interés son los microorganismos pigmentados.
Existe una amplia variedad de métodos para introducir un gen de Bf que codifica una toxina en un microorganismo huésped en condiciones que permiten el mantenimiento y la expresión estables del gen. Dichos métodos son muy conocidos por los expertos en la técnica y están descriptos, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N° 5135867, la cual se incorpora a la presente a modo de referencia.
Tratamiento de células
Bacillus thuríngiensis o las células recombinantes que expresan las toxinas de Bt se pueden tratar para prolongar la actividad de la toxina y estabilizar la célula. La microcápsula pesticida que se forma comprende la toxina o las toxinas de Bt dentro de una estructura celular que se ha
estabilizado y que protegerá la toxina cuando la microcápsula se aplique al entorno de la plaga blanco. Las células huésped adecuadas pueden incluir cualquier célula procariota o eucariota, limitándose normalmente a dichas células que no producen sustancias tóxicas para los organismos superiores tales como los mamíferos. Sin embargo se podrían utilizar organismos que producen sustancias tóxicas para los organismos superiores, en donde las sustancias tóxicas son inestables o el nivel de aplicación es suficientemente bajo para evitar cualquier posibilidad de toxicidad para un mamífero huésped. Como huéspedes, de especial interés serán las células procariotas y las células eucariotas inferiores tales como los hongos.
La célula estará generalmente intacta y estará básicamente en forma proliferativa cuando se trata, en vez de en forma de espora, si bien en algunos casos se pueden emplear esporas.
El tratamiento de la célula microbiana, por ejemplo, un microbio que contiene el gen o los genes de la toxina de B.t., puede ser por medios físicos o químicos, o mediante una combinación de medios físicos y/o químicos, siempre que la técnica no afecte perjudicialmente las propiedades de la toxina, ni disminuya la capacidad celular de protección de la toxina. Algunos ejemplos de reactivos químicos son los agentes halogenantes, particularmente los halógenos de número atómico 17-80. Más particularmente se puede utilizar yodo en condiciones suaves y durante un período de tiempo suficiente para lograr los resultados deseados. Otras técnicas adecuadas incluyen el tratamiento con aldehidos tales como glutaraldehído;
antiinfecciosos tales como cloruro de zefirano y cloruro de cetilpiridinio; alcoholes tales como isopropilo y etanol; varios fijativos histológicos tales como yodo de Lugol, fijativo de Bouin, varios ácidos y el fijativo de Helly (Véase: Humason, Gretchen L, Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman & Company, 1967); o una combinación de agentes físicos (calor) y químicos que conservan y prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se administra al entorno huésped. Algunos ejemplos de medios físicos son la radiación de onda corta tal como la radiación gamma y la radiación X, la congelación, la irradiación UV, la liofilización y similares. Los métodos para el tratamiento de células microbianas están divulgados en las Patentes de EE.UU. N° 4,695,455 y 4;695,462, las cuales se incorporan en la presente a modo de referencia.
Las células tendrán generalmente una estabilidad estructural que mejorará la resistencia a las condiciones del entorno. Cuando el pesticida se encuentra como proforma, el método de tratamiento de la célula debería seleccionarse de manera que no inhiba el procesamiento de la proforma a la forma madura del pesticida por el patógeno de la plaga blanco. Por ejemplo, el formaldehído entrecruzará proteínas y podría inhibir el procesamiento de la proforma de un pesticida polipéptído. El método de tratamiento debería retener por lo menos una porción sustancial de la biodisponibilidad o bíoactivídad de la toxina.
Las características de especial interés al seleccionar una célula huésped con fines de producción incluyen la facilidad de introducir el gen o los genes de B.t. en el huésped, la disponibilidad de sistemas de expresión, la eficacia de la expresión, la estabilidad del pesticida en el huésped , y la presencia de capacidades genéticas auxiliares. Las características de interés para utilizar como microcápsula pesticida incluyen cualidades protectoras para el pesticida tales como paredes celulares gruesas, pigmentación y empaquetamiento intracelular o formación de cuerpos de inclusión; la supervivencia en medios acuosos; la falta de toxicidad para los mamíferos; atracción para que la plaga lo ingiera; facilidad para matar y fijar sin dañar la toxina; y similares. Otras consideraciones incluyen facilidad de formulación y manejo, economía, estabilidad de almacenamiento, y similares.
Crecimiento de células
El huésped celular que contiene el gen o los genes insecticidas de B.t. se puede cultivar en cualquier medio nutritivo conveniente, en donde la construcción de ADN proporciona una ventaja selectiva proporcionando un medio selectivo de manera que sustancialmente casi todas o todas las células retengan el gen de B.t. Dichas células luego se pueden recolectar de acuerdo con métodos convencionales. De forma alternativa, las células se pueden tratar antes de la recolección.
Las células de B.t. que producen las toxinas de la invención se pueden cultivar utilizando medios estándares conocidos en la técnica y técnicas de fermentación. Luego de completarse el ciclo de fermentación, las bacterias se pueden recolectar primero separando las esporas y los cristales de B.t. del caldo de fermentación por métodos conocidos en la técnica. Las esporas y los cristales recuperados de B.t. se pueden formular en un polvo humectable, concentrado líquido, gránulos u otras formulaciones mediante la adición de agentes tensoactivos, dispersantes, portadores inertes y otros componentes para facilitar el manejo y la aplicación para plagas blanco en particular. Dichas formulaciones y procedimientos de aplicación son muy conocidos en la técnica.
Formulaciones
Los gránulos de cebo formulados que contienen un atrayente y esporas, cristales y toxinas de los aislados de B.t., o microbios recombinantes que comprenden los genes que se pueden obtener a partir de los aislados de B.t. divulgados en la presente, se pueden aplicar al suelo. El producto formulado también se puede aplicar como un recubrimiento de semilla o tratamiento de raíces o como tratamiento total de la planta en etapas posteriores del ciclo del cultivo. Los tratamientos de células de B.t. para la planta y el suelo se pueden emplear como polvos humectables, gránulos o polvos espolvoreables, mezclándose con varios materiales inertes tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos y similares) o con materiales botánicos (mazorcas en polvo, cáscaras del grano de arroz, cascara de nuez y similares). Las formulaciones pueden incluir adyuvantes de dispersión-adherencia, agentes estabilizantes, otros aditivos pesticidas o agentes tensoactivos. Las formulaciones líquidas pueden ser de base acuosa
o no acuosa y emplearse como espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsiónateles, o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, agentes tensoactivos, emulsionantes, dispersantes, o polímeros.
Tal como podrá apreciar el experto en la técnica, la concentración pesticida podrá variar ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación en particular, particularmente si es un concentrado o es para utilizar directamente. El pesticida estará presente en por lo menos 1 % en peso y puede estar presente en 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán desde alrededor de 1-95% en peso del pesticida en tanto que las formulaciones líquidas tendrán generalmente desde alrededor de 1-60% en peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones tendrán generalmente desde alrededor de 102 hasta alrededor de 104 células/mg. Dichas formulaciones se administrarán desde alrededor de 50 mg (líquidas o secas) hasta 1 kg o más por hectárea.
Las formulaciones se pueden aplicar al entorno de la plaga de lepidópteros, por ejemplo, al follaje o al suelo, pulverizando, espolvoreando, rociando, o en forma similar.
Transformación de la Planta
Un huésped recombinante preferido para la producción de proteínas insecticidas de la invención en cuestión es una planta transformada. Los genes que codifican las proteínas de toxinas de B.t, divulgados en la presente, se pueden insertar en plantas utilizando una variedad de técnicas que son muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, existe un gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en Escherichia coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas para la preparación de la inserción de genes extraños en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, entre otros. Por consiguiente, el fragmento de ADN que tiene la secuencia que codifica la proteina de la toxina B.t. se puede insertar en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se utiliza para la transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutritivo adecuado, luego se recolectan y se lisan. El plásmido se recupera. Generalmente se llevan a cabo métodos de análisis de secuencias, análisis de restricción, electroforesis y otros métodos biológicos bioquímicos-moleculares como métodos de análisis. Luego de cada manipulación, la secuencia de ADN utilizada se puede clivar y unir a la próxima secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmidos se puede clonar en el mismo o en otros plásmidos. Dependiendo del método de inserción de genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. En caso de que, por ejemplo, se utilice el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula de la planta, entonces por lo menos el límite derecho, si bien a menudo el límite derecho y el límite izquierdo del ADN-T del plásmido Ti o Ri, se tiene que unir como la región flanqueante de los genes a insertar. El uso de ADN-T para la transformación de células de plantas ha sido exhaustivamente investigado y suficientemente descripto en el documento EP 120 516, Lee & Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986), y An et al., (1985), y está bien fundamentado en la técnica.
Una vez que el ADN insertado se ha integrado en el genorna de la planta, éste es relativamente estable. El vector de transformación normalmente contiene un marcador seleccionare que confiere a las células de la planta transformada la resistencia a un biocida o a un antibiótico, tal como Bialafos, Kanamicina, G418, Bleomicina, o Higromicina, entre otros. El marcador empleado individualmente debería permitir, por consiguiente, la selección de células transformadas en vez de células que no contienen el ADN insertado.
Existe un gran número de técnicas para insertar ADN en una célula huésped de planta. Dichas técnicas incluyen la transformación con ADN-T que utilizan Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biolística (bombardeo de micropartículas), o electroporación así como también otros métodos posibles. En caso de utilizar Agrobacteria para la transformación, el ADN a insertar tiene que clonarse en plásmidos especiales, es decir en un vector intermediario o en un vector binario. Los vectores intermediarios se pueden integrar en el plásmido Ti o Ri mediante recombinacíón homologa debido a secuencias que son homologas a secuencias en el ADN-T. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermediarios no pueden replicarse por sí mismos en la Agrobacteria. El vector intermediario se puede transferir en Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios se pueden replicar por sí mismos tanto en E. coli como en Agrobacteria. Ellos comprenden un gen marcador de selección y un ligador o poliligador que están enmarcados por las regiones límite de ADN-T Derecha e Izquierda. Ellos se pueden transformar directamente en Agrobacteria (Holsters et al., 1978). La Agrobacterium utilizada como célula huésped debe comprender un plásmido que porta una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T en la célula de planta. Puede contener ADN-T adicional. La bacteria así transformada se utiliza para la transformación de células de plantas. Las explantas de plantas se pueden cultivar convenientemente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula de planta. Luego se pueden regenerar plantas completas a partir del material infectado de la planta (por ejemplo, pedazos de hoja, segmentos del tallo, raíces, así como también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, el cual puede contener antibióticos o biocidas para selección. Las plantas así obtenidas luego se pueden evaluar para determinar la presencia del ADN insertado. No se precisan requerimientos especiales de los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible utilizar plásmidos ordinarios tales como, por ejemplo, derivados de pUC.
Las células transformadas crecen en el interior de las plantas de la manera habitual. Dichas células transformadas pueden formar células germinales y transmitir la(s) característica(s) transformadas a las plantas progenie. Dichas plantas se pueden cultivar de manera habitual y cruzar con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.
En una modalidad preferida de la invención en cuestión, las plantas se transformarán con genes en los cuales se ha optimizado el uso del codón para las plantas. Véase, por ejemplo, La Patente de EE.UU. N° 5380831 , la cual se incorpora a la presente a modo de referencia. Si bien en la presente se ejemplifican algunas toxinas truncadas, es bien sabido en la técnica de Bt que las toxinas (de longitud completa) de tipo 130 kDa tienen una mitad N-terminal que es la toxina núcleo y una mitad C-terminal que es la "cola" de la protoxina. Por lo tanto se pueden utilizar "colas" adecuadas con toxinas truncadas/núcleo de la invención en cuestión. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 6218188 y la Patente de EE.UU. N° 6673990. Asimismo, los métodos para crear genes sintéticos de Bt para utilizar en plantas son conocidos en la técnica (Stewart and Burgin, 2007). Un ejemplo no restrictivo de una planta transformada preferida es una planta de maíz fértil que comprende un gen expresable en una planta que codifica una proteína Cryl Fa, y que además comprende un segundo gen expresable en una planta que codifica una proteína Cryl Da.
La transferencia (o introgresión) de la(s) característica(s) determinada(s) Cryl Fa y Cryl Da en líneas endogámicas de maíz se puede lograr mediante el mejoramiento genético de selección recurrente, por ejemplo por retrocruzamiento. En este caso se cruza primero una planta progenitora recurrente deseada con una línea endogámica donante (la planta progenitora no recurrente) que porta el(los) gen(es) adecuado(s) para las características determinadas CryI F y CryI D. La progenie de este cruzamiento luego se acopla nuevamente a la planta progenitora recurrente, seguido por la selección en la progente resultante para que la(s) característica(s) deseada(s) se transfieran desde la planta progenitora no recurrente. Luego de tres, preferentemente cuatro, más preferentemente cinco o más generaciones de retrocruzamientos con la planta progenitora recurrente con la selección de la(s) característica(s) deseada(s), la progenie será heterocigosa para el locus que controla la(s) característica(s) a transferir, si bien será similar a la planta progenitora recurrente para la mayoría o casi todos los otros genes (véase, por ejemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principies of Cultivar Development, Vol. 1 : Theory and Technique, 360-376).
Estrategias de control de resistencia de los insectos (IRM)
Roush et al., por ejemplo, explica en general estrategias de dos toxinas, también denominadas "piramidización" o "evento apilado," para el control de cultivos transgénicos insecticidas. (The Royal Society. Phil. Trans.
R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).
El Organismo de Protección del Medio Ambiente de los Estados
Unidos (United States Environmental Protection Agency) en su sitio web
(epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) publica los siguientes requisitos para proporcionar refugios no transgénicos (es decir, no B.t.) (una sección de cultivos no Bt / maíz) para utilizar con cultivos transgénicos que producen una única proteína activa de Bt contra plagas blanco.
"Los requisitos específicos de estructura para los productos de maíz Bt (CryIAb o Cryl F) protegidos contra el barrenador del maíz son los siguientes:
Refugios estructurados:
20% de refugio de maíz Bt no-Lepidóptero en el Cinturón del Maíz;
50% de refugio Bt no-Lepidóptero en el Cinturón del Algodón Bloques
Internos (es decir, dentro del campo de Bt)
Externos (es decir, campos separados dentro de 0.80 km (½ milla) (0.40 km {? de milla), si es posible) del campo de Bt para maximizar la conjugación aleatoria)
Franjas en el campo
Las franjas deben ser de por lo menos 4 hileras de ancho (preferentemente 6 hileras) para reducir los efectos del movimiento larval"
Asimismo, la Asociación Nacional de Cultivadores de Maíz (National Corn Growers Association), en su sitio web:
(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)
también provee una orientación similar con respecto a los requisitos del refugio. Por ejemplo:
"Requisitos del Control de Resistencia en Insectos (IRM) del
Barrenador del Maíz:
-Plantar por lo menos el 20% de sus acres (1 acre: 0.404 ha) de maíz para refugiar híbridos
-En las regiones productoras de algodón, el refugio debe ser del 50% -Debe plantarse dentro de 0.80 km (?? milla) de los híbridos del refugio -El refugio se puede plantar en forma de franjas dentro del campo de Bt; las franjas del refugio deben ser de por lo menos 4 hileras de ancho
-El refugio se puede tratar con pesticídas convencionales sólo si se alcanzan umbrales económicos para el insecto blanco
-Los insecticidas pulverizables basados en Bt no se pueden utilizar en el maíz del refugio
-Se debe plantar un refugio adecuado en cada granja con maíz Bt"
Según lo expuesto por Roush et al. (por ejemplo, en las páginas 1780 y 1784 en la columna derecha), el evento apilado o la piramidización de dos proteínas diferentes, en donde cada una de ellas es eficaz contra las plagas blanco y con poca o ninguna resistencia cruzada, puede permitir el uso de un refugio más pequeño. Roush sugiere que para un evento apilado exitoso, un tamaño de refugio de menos del 10% del refugio puede proporcionar un control de resistencia comparable de hasta alrededor del 50% del refugio para una única característica (no piridamizada). Para los
productos de maíz Bt p'iridamizados actualmente disponibles, el Organismo de Protección del Medio Ambiente de los Estados Unidos (U.S. Environrnental Protection Agency) requiere un refugio significativamente menos estructurado (generalmente del 5%) de maíz no Bt plantado que para productos con una característica en particular (generalmente del 20%).
Existen diversas maneras de proporcionar los efectos de Control de Resistencia en Insectos (IRM) de un refugio, incluyendo diversos modelos geométricos de plantación en los campos (tal como se mencionó anteriormente) y mezclas de semillas en bolsa, según lo expuesto por Roush er a/, {supra), y en la Patente de EE.UU. NT 6,551 ,962.
Los porcentajes anteriores, o las proporciones similares de los refugios, se pueden utilizar para los eventos apilados o pirámides dobles o triples de la invención. Para los eventos apilados triples que tienen tres modos de acción contra una única plaga blanco, un objetivo sería refugio cero (o, por ejemplo, menos del 5% de refugio). Esto es particularmente cierto para la extensión de acres comerciales - por ejemplo, de alrededor de 4,04 ha (10 acres).
Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes provisionales y publicaciones a las que se hace referencia o se mencionan en la presente memoria se incorporan en su totalidad a modo de referencia en la medida en que concuerden con las enseñanzas explícitas de la presente memoria descriptiva.
A continuación se incluyen ejemplos que ilustran procedimientos para ¡mplementar la invención. Dichos ejemplos no debería interpretarse como restrictivos. Todos los porcentajes están expresados en peso y todas las proporciones de mezclas de solventes están expresadas en volumen a menos que se indique lo contrario. Todas las temperaturas están expresadas en grados Celsio.
A menos que se indique o implique específicamente, los términos "un", "una", y "el/la" significan "por lo menos uno" según se emplea en el presente contexto.
EJEMPL0 1
Datos del bioensavo
CryI Da expresada en maíz transgénico (pDAS5163) proporciona protección contra la alimentación del gusano cogollero del maíz (FAW), Spodoptera frugiperda (J E. Smith). Los mismos eventos son más eficaces para el control del gusano cogollero del maíz (FAW) que ha desarrollado resistencia a Cryl Fa y son claramente superiores a las plantas de maíz que contienen el evento TC1507, por lo que podría decirse que es la característica líder en la industria en cuanto a la resistencia en insectos para el control del gusano cogollero del maíz (FAW).
Los inventores también han demostrado que Cryl Fa (proteína proveniente de la cepa recombinante de Pseudomonas fluorescens DR1649; plásmido pDAB1817) y CryI Da (proteína proveniente de la cepa recombinante de Pseudomonas fluorescens DC782) son ambas eficaces en el control del gusano cogollero del maíz (FAW) en los bioensayos de dieta artificial y que la potencia de la combinación es mayor a la esperada de sus potencias individuales.
Basándose en los datos descriptos anteriormente, la expresión conjunto de CryI Da y CryI Fa puede producir una alta dosis de evento apilado de Control de Resistencia en Insectos para el gusano cogollero del maíz (FAW), otra especie Spodoptera importante, y tal vez otras plagas de lepidópteros. Se pueden agregar otras proteínas a esta combinación para ampliar el espectro. Por ejemplo, en el maíz la adición de CryIAb generaría un evento apilado de Control de Resistencia a Insectos (IRM) para el barrenador de maíz europeo (ECB), Ostrínia nubilalis (Hübner).
Tal como se ilustra en la Figura 1 , daños (% promedio de daños en las hojas + SEM) en segmentos de hojas de maíz infestado con el gusano cogollero del maíz (FAW) (barras azules) o rFAW (barras violetas). Todos los tratamientos precedidos por los números "5163" son segmentos de hojas provenientes de plantas transformadas con una construcción que contiene CryI Da. Las plantas en las cuales no se detectó la expresión CryI Da están agrupadas en el extremo izquierdo del gráfico. Las plantas en las cuales se detectó la expresión CryI Da están agrupadas en el centro del gráfico. Los controles no transgénicos (es decir, negativos) están ubicados en el extremo derecho del gráfico y están rotulados "B104", "Hill", e "Isolina". Una línea endogámica comercial que contiene CryI Fa es el primer tratamiento a la
derecha (rotulado "Herculex I") y es el mismo antecedente genético que el control no transgénico rotulado "Isolina".
Se creó una quimera de protoxina compuesta de la secuencia codificadora para la toxina límite olivada por tripsina de CryI Da y la secuencia codificadora para la región C-terminal de protoxina de CryIAb y se modificó por ingeniería genética en un cásete de expresión capaz de dirigir la expresión en el maíz (pDAS5163). El maíz se transformó utilizando Agrobacterium tumefacians y se identificaron los eventos que contenían la quimera Cry1 Da/1Ab. Secciones de hojas provenientes de plantas regeneradas se sometieron a bioensayo con el gusano cogollero del maíz de tipo salvaje (FAW) o con larvas provenientes de una población del gusano cogollero del maíz que era resistente a CryI Fa (rFAW). Las plantas transformadas con Cry1 Da/1Ab redujeron la alimentación del gusano cogollero del maíz (FAW) pero no fueron tan eficaces como la línea endogámica que contenía 2 copias de CryI Fa (Figura 1 ). (Los eventos CryI Da sometidos a la prueba fueron hemicigosos para el transgén en tanto que la línea endogámica convertida fue homocigosa para el evento TC1507.) En comparación, los mismos eventos que contenían Cry1 Da/1Ab fueron generalmente mucho más eficaces en la reducción de la alimentación del gusano cogollero del maíz resistente (rFAW) que la línea endogámica que contenía CryI Fa (Figura 1).
La actividad insecticida de CryI Fa (proteina proveniente de la cepa recombinante de Pseudomonas fluorescens DR1649; plásmido pDAB1817), CryI Da (proteina proveniente de la cepa recombinante de P.
fluorescens DC782), y una combinación 1 :1 (p:p) de las 2 se sometió a prueba en bioensayos estándares de dieta artificial utilizados para evaluar la potencia. Se realizaron cálculos estimados de potencia utilizando el análisis LOGIT (JMP®8.0, SAS Inc. 2008) el cual produjo cálculos estimados de LC50 (concentración letal) y límites superiores e inferiores (95%) para la LC50. Se llevó a cabo una prueba para determinar el sinergismo utilizando el método descripto por Tabashnik (1992) por el cual se calculó un valor previsto para la potencia de una combinación utilizando las potencias de cada uno de los componentes en forma individual. Se considera que una combinación es sinérgica cuando el límite de confianza superior estimado de la combinación es inferior a la potencia prevista calculada. En el caso del gusano cogollero del maíz (FAW) y una población del gusano cogollero del maíz que era resistente a CryI Fa (rFAW), los límites superiores de confianza para la LC50 de la combinación fueron inferiores a las potencias estimadas (Cuadros 1 y 2) llegando así a la conclusión de que la combinación de CryI Fa y CryI Da en estas 2 poblaciones es sinérgica.
CUADRO 1
Cálculos estimados de potencia, límites superiores e inferiores del 95% del intervalo de confianza (LCL y UCL, respectivamente), para Cryl Fa. CryI Da, y la combinación 1 :1 (p;p) de las 2 en el gusano cogollero del maíz de tipo salvaje (FAW), Spodoptera fruqiperda
La última columna contiene el valor de LC50 previsto basado en la potencia de cada una de las proteínas en forma individual utilizando la fórmula descripta por Tabashnik (1992). Tabashnik BE. Evaluation of synergism among Bacillus thuringiensis toxines. Applied and Environmental Microbiology 58[10], 3343-3346. 1992. Se considera que una combinación es sinérgica cuando el valor previsto es superior al límite superior de confianza para la combinación.
CUADRO 2
Cálculos estimados de potencia, límites superiores e inferiores del 95% del intervalo de confianza (LCL y UCL, respectivamente), para Cryl Fa. Cryl Da, y la combinación 1 :1 (p;p) de las 2 en el gusano cogollero del maíz resistente a Crv Fa (rFAW). Spodoptera fruqiperda
La última columna contiene el valor de LC50 previsto basado en la potencia de cada una de las proteínas en forma individual utilizando la fórmula descripta por Tabashnik (1992). Se considera que una combinación es sinérgica cuando el valor previsto es superior al límite superior de confianza para la combinación.
EJEMPLO 2
Síntesis de los datos de unión
A continuación se describen experimentos de unión competitiva con Cryl Da rotulada 1251 que se llevaron a cabo utilizando vesículas de membrana del borde en cepillo (BBMV, según sus siglas en inglés) aisladas del gusano cogollero del maíz (FAW). Los resultados obtenidos de estos experimentos demuestran que Cry Da se une fuertemente a su receptor y que CryI Fa no compite con CryI Da por sitios de unión. Si la resistencia a CryI Da pudiera basarse en una mutación en el receptor observado en estos estudios, estos datos sugieren que CryI Fa sería una buena herramienta de Control de Resistencia en Insectos (IRM) para controlar dichas poblaciones resistentes o para mitigar el desarrollo de dicha resistencia. Los resultados obtenidos de los bioensayos con el gusano cogollero del maíz (FAW) resistente a CryI Fa (rFAW) demuestran que CryI Da es activo en esta población. En conjunto, estos datos sugieren que CryI Fa y CryIDa podrían ser un evento apilado de Control de Resistencia en Insectos (IRM) que mitiga eficazmente el desarrollo de resistencia a cualquier proteína insecticida.
Los ensayos de unión al receptor muestran que CryI Da 1251 se une fuertemente a su(s) receptor(es), y que puede ser competido eficazmente por CryI Da no rotulado. Ni Cry Ab, CryI Fa o CryI Be pueden competir con CryI Da 1251 desde su(s) sitios del receptor en vesículas de membrana del borde en cepillo (BBMV) del gusano cogollero del maíz (FAW), indicando que CryI Da tiene un único sitio de unión en el intestino medio del gusano cogollero del maíz (FAW) con el cual CryIAb, CryI F y CryIBe no compiten. Debido a que el gusano cogollero del maíz resistente a CryI Fa (rFAW) es tan sensible a CryIDa como el gusano cogollero del maíz de tipo salvaje (FAW), esto indica que el sitio del receptor putativo que se altera en los insectos tales como el gusano cogollero del maíz resistente a CryI Fa (rFAW) no es el sitio del receptor al que se une CryI Da. Por lo tanto, CryI Da constituye una excelente pareja de evento apilado para CryI Fa debido a que ésta interactúa en un sitio blanco diferente que es responsable de su actividad biológica.
Cuando CryI Da 1251 se agregó a vesículas de membrana del borde en cepillo (BBMV) del gusano cogollero del maíz (FAW), sólo CryI Da no radiorrotulada fue capaz de desplazar a CryI Da 1251 unida. La incapacidad de CryI Fa, CryIAb, y CryI Be para desplazar a CryI Da 1251 unida de las vesículas de membrana del borde en cepillo (BBMV) indicó que en el intestino medio del gusano cogollero del maíz (FAW), CryI Da se unió a un único sitio del receptor con el que CryI Fa, CryIAb, y CryI Be no interactúan, aún cuando todas las cuatro toxinas Cry diferentes son activas contra las larvas del gusano cogollero del maíz (FAW).
EJEMPLO 3
Diseño de toxinas quiméricas que comprenden toxinas núcleo Crv1 y protoxinas heteróloqas
Toxinas quiméricas
Las proteínas quiméricas que utilizan el dominio de toxina núcleo de una toxina Cry fusionada al segmento de protoxina de otra toxina Cry han sido previamente divulgadas, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N° 5593881 y en la Patente de EE.UU. N° 5932209.
Las variantes de la proteína quimérica CryI Da de la presente invención incluyen toxinas quiméricas que comprenden un segmento N-terminal de la toxina núcleo proveniente de una toxina CryI Da insecticida, fusionada a un segmento de protoxina endotoxina delta heteróloga en algún punto pasando el extremo del segmento de la toxina núcleo. La transición desde la toxina núcleo hacia el segmento de protoxina heteróloga puede ocurrir en aproximadamente la unión de la toxina núcleo nativa/protoxina o, de manera alternativa, se puede retener una porción de la protoxina nativa (que se extiende pasando el segmento de la toxina núcleo), en donde la transición hacia la protoxina heteróloga ocurre corriente abajo. De otro modo, la toxina núcleo y los segmentos de protoxina pueden comprender exactamente la secuencia de aminoácidos de las toxinas nativas de las cuales provienen, o pueden incluir adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos que no disminuyen, y que pueden promover, la función biológica de los segmentos cuando se fusionan entre sí.
Por ejemplo, una toxina quimérica de la invención en cuestión comprende un segmento de toxina núcleo proveniente de CryI Da y una protoxina heteróloga. En una modalidad preferida de la invención, el segmento de la toxina núcleo proveniente de Cry1 Da2 (594 aminoácidos) está fusionado a un segmento heterólogo que comprende un segmento de protoxina proveniente de una endotoxina delta CryIAb (545 aminoácidos). La secuencia de 1139 aminoácidos de la proteína quimérica, denominada en la presente como CryI Da. Cabe entender que otras fusiones quiméricas que comprenden las variantes de toxina núcleo de Cry1 Da2 y las protoxinas provenientes de CryIAb están comprendidas dentro del alcance de la presente invención.
Una segunda proteína quimérica de la invención comprende un segmento de toxina núcleo proveniente de CryI Fa (603 aminoácidos) fusionado a un segmento heterólogo que comprende un segmento de protoxina proveniente de una endotoxina delta CryIAb (545 aminoácidos). La secuencia de 1148 aminoácidos de la proteína quimérica, denominada en la presente como CryI Fa.
EJEMPLO 4
Construcción de plásmidos de expresión que codifican proteínas
Se utilizaron métodos estándares de clonación [tal como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., (1989) y Ausubel et al., (1995), y sus actualizaciones] en la construcción de la expresión de Pseudomonas fluorescens (Pf), construcción pDOW2848, modificada genéticamente para producir una proteína quimérica CryI Da de longitud completa. La producción de la proteína se llevó a cabo en la cepa MB214 de Pseudomonas fluorescens (un derivado de la cepa MB101 ; P. fluorescens biovar I), que tiene una inserción de un operón lac modificado divulgado en la Patente de EE.UU. N° 5169760. La estrategia básica de clonación implicó subclonar un fragmento de ADN que codifica la proteína CryI Da en vectores del plásmido, por lo cual se coloca bajo el control de la expresión del promotor Ptac y del terminador rrnBT1T2 provenientes del plásmido pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee,
Wl). Un plásmido de dichas características se denominó pDOW2848 y el aislado MB214 que alberga dicho plásmido se denomina Dpf150.
Análisis del crecimiento y la expresión en frascos agitados
La producción de la proteína CryI Da para la caracterización y el bioensayo en insectos se llevó a cabo mediante la cepa Dpf150 de P. fluorescens cultivada en un frasco agitado. La producción de la proteína CryI Da conducida por el promotor Ptac se llevó a cabo tal como se describió previamente en la Patente de EE.UU. N° 5527883. La información sobre las manipulaciones microbiológicas está disponible en Squires et al., (2004), Solicitud de Patente de EE.UU. 20060008877, Solicitud de Patente de EE.UU. 20080193974, y Solicitud de Patente de EE.UU. 20080058262, incorporadas a la presente a modo de referencia. Se indujo la expresión mediante la adición de isopropil-(3-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) luego de una incubación inicial de 24 horas a 30° con agitación. Se recolectaron muestras de los cultivos en el momento de la inducción y en diversos momentos posteriores a la inducción. La densidad de las células se midió por densidad óptica a 600 nm (OD600).
Fraccionamiento de células y análisis de electroforesis en gel de poliacrílamida del sulfato dodecil de sodio (SDS-PAGE, según sus siglas en inglés) de las muestras en frascos agitados
En cada tiempo de muestreo se ajustó la densidad de células de las muestras hasta ??ß?? = 20 y se centrifugaron alícuotas de 1 ml_ a 14000 x g durante cinco minutos. Los microgránulos de las células se congelaron a -80°. Se generaron fracciones solubles e insolubles de las muestras de microgránulos de células provenientes de los frascos agitados utilizando la Solución de Extracción de Proteína Bacteriana EasyLyse™ (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, Wl). Cada microgránulo de célula se resuspendió en 1 mL de solución EasyLyse™ y luego se diluyó 1 :4 en solución reguladora de lisis y se incubó con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. El lisado se centrifugó a 14,000 rpm durante 20 minutos a 4o y el sobrenadante se recuperó en forma de fracción soluble. El microgránulo (fracción insoluble) luego se resuspendió en igual volumen de solución salina regulada con fosfato (PBS; 1 1.9 mM de Na2HP04, 137 mM de NaCI, 2.7 mM de KCI, pH 7.4).
Las muestras se mezclaron 1 :1 con solución reguladora de muestras de Laemmli (2X) que contenía ß-mercaptoetanol (Sambrook et al., supra.) y se llevaron a ebullición durante 5 minutos antes de cargarse sobre geles al 12% de Criterion XT Bis-Tris (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Se llevó a cabo la electroforesis en la solución reguladora XT OPS recomendada. Los geles se tiñeron con solución Bio-Safe Coomassie de acuerdo el protocolo del fabricante (Bio-Rad) y se representaron en imágenes utilizando el sistema de imágenes Alpha Innotech (San Leandro, CA).
Preparación de cuerpos de inclusión
Se realizaron preparaciones de cuerpos de inclusión (IB, según sus siglas en inglés) de la proteína Cry Da en células provenientes de fermentaciones de P.fluorescens que produjeron la proteína insecticida insoluble de Bt, según lo demostrado por SDS-PAGE y Espectrometría de Masa de Ionización/Desorción por Láser asistida por Matrix ( ALDI-MS, según sus siglas en inglés). Los microgránulos de fermentación de P.fluorescens se descongelaron en un baño de agua a 37°. Las células luego se resuspendieron hasta 25% p/v en solución reguladora de lisis [50 mM de Tris, pH 7.5, 200 mM de NaCI, 20 mM de EDTA sal disódica (ácido etilendiaminatetraacético), Tritón X-100 al 1 %, y 5 mM de Ditiotreitol (DTT); se agregaron 5 mL/L de un cóctel de inhibidores de proteasas bacterianas (Catálogo # P8465; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en el momento previo al uso]. Las células se suspendieron utilizando un homogenizador manual en configuración mínima (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). Se agregó Lisozima (25 mg de Sigma L7651 , proveniente de clara de huevo de gallina) a la suspensión de células mezclando con una espátula de metal y la suspensión se incubó a temperatura ambiente durante una hora. La suspensión se enfrió en hielo durante 15 minutos, luego se sometió a ultrasonido utilizando un Sonicador Branson 250 (dos sesiones de 1 minuto, a un ciclo de servicio al 50%, 30% de rendimiento). La lisis de células se controló por microscopio. Se agregó una cantidad adicional de 25 mg de lisozima, en caso de ser necesario, y la incubación y el ultrasonido se
repitieron. Con posterioridad a la confirmación de la lisis de células mediante microscopio, el lisado se centrifugó a 11 ,500 x g durante 25 minutos (4o) para formar el microgránulo de cuerpos de inclusión (IB) y se descartó el sobrenadante. El microgránulo de cuerpos de inclusión (IB) se resuspendió con 100 mL de solución reguladora de lisis, se homogenizó con la mezcladora manual y se centrifugó según lo indicado anteriormente. El microgránulo de cuerpos de inclusión (IB) se lavó repetidamente por resuspensión (en 50 mL de solución reguladora de lisis), homogenización, ultrasonido y centrifugación hasta que el sobrenadante se volvió incoloro y el microgránulo del cuerpo de inclusión (IB) se volvió firme y de color blancuzco. Para el lavado final, el microgránulo de cuerpos de inclusión (IB) se resuspendió en agua destilada filtrada estéril (0.22 pm) que contenía 2 mM de EDTA y se centrifugó. El microgránulo final se resuspendió en agua destilada filtrada estéril que contenía 2 mM de EDTA y se almacenó en alícuotas de 1 mL a -80°.
El análisis por SDS-PAGE y la cuantificación de la proteína en preparaciones de cuerpos de inclusión (IB) se realizaron descongelando una alícuota de 1 mL de microgránulo de cuerpo de inclusión (IB) y diluyendo 1 :20 con agua destilada filtrada estéril. La muestra diluida luego se llevó a ebullición con solución reguladora reductora de muestras 4X [250 mM de Tris, pH 6.8, glicerol al 40% (v/v), Azul de Bromofenol 0.4% (p/v), SDS 8% (p/v) y ß-mercaptoetanol 8% (v/v)] y se cargó en un gel de corrida Novex® 4-20% de Tris-Glicina, 12+2 pocilios (Invitrogen) con solución reguladora 1 X de Tris/Glicina/SDS (BíoRad). El gel se corrió durante 60 minutos a 200 voltios, luego se tino con Azul Coomassie (50% G-250/50% R-250 en metanol 45%, ácido acético 10%) y se decoloró con ácido acético 7%, metanol 5% en agua destilada. La cuantificación de las bandas blanco se realizó comparando los valores densitométricos para las bandas contra las muestras estándares de Albúmina de Suero Bovino (BSA) corridas en el mismo gel para generar una curva estándar.
Solubilización de cuerpos de inclusión
Se centrifugaron seis ml_ de suspensión de cuerpos de inclusión Cry Da provenientes del clon Pf DPf150 en la configuración más alta de un micrófugo Eppendorf, modelo 5415C, (aproximadamente 14,000 x g) para reducir a microgránulos los cuerpos de inclusión. El sobrenadante de solución reguladora de almacenamiento se extrajo y reemplazó con 25 ml_ de 100 mM de solución reguladora de carbonato de sodio, pH 1 1 , en un tubo cónico de 50 mL. Los cuerpos de inclusión se resuspendieron utilizando una pipeta y se agitaron vorticialmente para mezclarse bien. El tubo se colocó sobre una plataforma de oscilación suave a 4o hasta la mañana siguiente para extraer la proteína blanco. El extracto se centrifugó a 30,000 x g durante 30 minutos a 4° y el sobrenadante resultante se concentró 5 veces utilizando un dispositivo de filtro centrífugo de celulosa regenerada Amicon Ultra-15 (30,000 de Corte de Peso Molecular; Millipore). La solución reguladora de muestras luego se cambió a 10 mM de CAPS [ácido 3-(ciclohexamino)1-propanosulfónico] pH 10 utilizando columnas PD-10 descartables (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
Solubilización y activación de tripsina de la proteína de cuerpos de inclusión
En algunos casos, la suspensión de los cuerpos de inclusión Cry Da provenientes del clon Pf DPf 50 se centrifugó en la configuración más alta de un micrófugo Eppendorf, modelo 5415C, (aproximadamente 14,000 x g) para reducir a microgránulos los cuerpos de inclusión. El sobrenadante de la solución reguladora de almacenamiento se extrajo y reemplazó con 100 mM de CAPS, pH 1 1 para proporcionar una concentración de proteína de aproximadamente 50 mg/mL El tubo se hizo oscilar a temperatura ambiente durante tres horas para solubilizar completamente la proteína. Se agregó tripsina en una cantidad equivalente a 5% a 10% (p:p, basado en el peso inicial del polvo de cuerpos de inclusión (IB) y la absorción se logró por incubación mientras se mantuvo oscilando hasta la mañana siguiente a 4o u oscilando durante 90-120 minutos a temperatura ambiente. El material insoluble se extrajo por centrifugación a 10,000 x g durante 15 minutos y el sobrenadante se aplicó a una columna de intercambio aniónico MonoQ (10 mm por 10 cm). La proteína CryI Da activada se eluyó (de acuerdo con lo determinado por el análisis de SDS-PAGE, véase a continuación) en 0% a 100% de gradiente de NaCI 1 M en 25 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían la proteína activada se agruparon y, según lo necesario, se concentraron hasta menos de 10 mL utilizando un dispositivo de filtro centrífugo de celulosa regenerada Amicon Ultra-15 tal como se mencionó anteriormente. El material luego se hizo pasar a través de una columna Superdex 200 (16 mm por 60 cm) en solución reguladora que contenía 100 mM de NaCI, glicerol 10%, Tween-20 0.5% y 1 mM de EDTA. Se determinó por el análisis de SDS-PAGE que la proteína activada (enzimáticamente truncada) se eluye a 65 a 70 ml_. Las fracciones que contenían la proteína activada se agruparon y concentraron utilizando el concentrador centrífugo tal como se describió anteriormente.
Electroforesis en gel
Se prepararon preparaciones concentradas de proteina para electroforesis diluyendo 1 :50 en solución reguladora de muestras NuPAGE® LDS (Invitrogen) que contenía 5 mM de DTT como agente reductor y se calentaron a 95° durante 4 minutos. La muestra se cargó en carriles por duplicado de un gel 4-12% NuPAGE® a lo largo de cinco estándares de Albúmina de Suero Bobino (BSA) que tenían un rango de 0.2 g a 2 g/carril (para generación de curva estándar). El voltaje se aplicó a 200 V utilizando solución reguladora de corrida MOPS SDS (Invitrogen) hasta que la tintura de seguimiento alcanzó la parte inferior del gel. El gel se tiñó con Azul Coomassie G-250 0.2% en metanol 45%, ácido acético 10% y se decoloró primero brevemente con metanol 45%, ácido acético 10% y luego a longitud con ácido acético 7%, metanol 5% hasta que el fondo se aclaró. Luego de la decoloración, el gel se examinó con un dispositivo Multi-lmagen BioRad Fluor-S. Se utilizó el software Quantity One del instrumento, versión 4.5.2 para obtener volúmenes sustraídos del fondo de las bandas de proteína
teñidas y para generar la curva estándar de Albúmina de Suero Bobino (BSA) que se utilizó para calcular la concentración de la proteína quimérica CryI Da en la solución base.
EJEMPLO 5
Preparación de proteínas de toxinas núcleo CryIFa y CryI Da y aislamiento de vesículas de membrana del borde en cepillo de Spodoptera frugiperda para experimentos de unión competitiva
Los siguientes Ejemplos evalúan la unión competitiva de proteínas de toxinas núcleo Cry1 a receptores putativos en tejidos de intestino de insectos. Se muestra que la proteína de toxina CryI Da rotulada 1251 se une con alta afinidad a Vesículas de Membrana del Borde en Cepillo (BBMV) preparadas a partir de Spodoptera frugiperda (gusano cogollero del maíz) y que la proteína de toxina núcleo de CryI Fa no compite con esta unión.
Purificación de proteínas Cry
Un gen que codifica una proteína quimérica CryI Da se expresó en la cepa de expresión de Pseudomonas fluorescens tal como se describe en el Ejemplo 4. De manera similar, un gen que codifica una proteína quimérica que comprende la toxina núcleo de CryI Fa (603 aminoácidos) y la protoxina CryIAb (545 aminoácidos) se expresó en el sistema Pf. En el caso de CryI Fa, el plásmido de expresión se denominó pDAB1817, y la cepa de P.
fluorescens que hospeda a pDAB1817 se denominó DPÍ129. Las proteínas se purificaron por los métodos descriptos en el Ejemplo 4 y luego se llegó a cabo la absorción de tripsina para producir toxinas núcleo activadas a partir de las proteínas de longitud completa y los productos se purificaron por los métodos descriptos en el Ejemplo 4. Las preparaciones de las proteínas procesadas de tripsina (toxina núcleo activada) fueron >95% puras y tuvieron un peso molecular de aproximadamente 65 kDa tal como se determinó experimentalmente por el análisis de SDS-PAGE. Según se emplea en la presente memoria, la toxina núcleo activada preparada a partir de la proteína CryI Da se denomina proteína de toxina núcleo de CryI Da y la toxina núcleo activada preparada a partir de la proteína CryI Fa se denomina proteína de toxina núcleo de CryI Fa.
Preparación y fraccionamiento de vesículas de membrana del borde en cepillo (BBMV) solubilizadas
Se emplearon los métodos estándares de cuantificación de proteínas y electroforesis en gel de poliacrilamida del sulfato dodecil de sodio (SDS) divulgados, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) y Ausubel ef al. (1995) y en las actualizaciones de los mismos.
Las larvas del último estadio de S. frugiperda se sometieron a ayuno hasta la mañana siguiente y luego se sometieron a disección luego de enfriarlas sobre hielo durante 15 minutos. El tejido del intestino medio se extrajo de la cavidad corporal, dejando detrás el intestino posterior unido al integumento. El intestino medio se colocó en un volumen 9X de solución reguladora de homogenización enfriada con hielo (300 mM de manitol, 5 mM de EGTA, 17 mM de base Tris, pH 7.5), enriquecida con el Cóctel de Inhibidores de Proteasas (Sigma-Aldrich P-2714) diluido según las recomendaciones del proveedor. El tejido se homogenizó con 15 golpes de un homogenizador de tejido de vidrio. Las vesículas de membrana del borde en cepillo (BBMV) se prepararon por el método de precipitación de MgCI2 de Wolfersberger (1993). En síntesis, un volumen equivalente a 24 mM de una solución de MgCI2 en 300 mM de manitol se mezcló con el homogenado del intestino medio, se agitó durante 5 minutos y se dejó reposar en hielo durante 15 min. La solución se centrifugó a 2,500 x g durante 15 minutos a 4o. El sobrenadante se conservó y el microgránulo se suspendió en el volumen original de solución reguladora de homogenización diluida 0.5X y se centrifugó nuevamente. Los dos sobrenadantes se combinaron y centrifugaron a 27,000 x g durante 30 minutos a 4o para formar la fracción de vesículas de membrana del borde en cepillo (BBMV). El microgránulo se suspendió en Solución Reguladora de Almacenamiento de BBMV (10 mM de HEPES, 130 mM de KCI, glicerol 10%, pH 7.4) hasta una concentración de proteína de alrededor de 3 mg/mL. La concentración de la proteína se determinó utilizando albúmina de suero bobino (BSA) como estándar. La determinación de fosfatasa alcalina (una enzima marcadora para la fracción de vesículas de membrana del borde en cepillo (BBMV) se llevó a cabo antes de congelar las muestras utilizando el Kit de Ensayo de Fosfatasa Alcalina DALP-250
QuantiChrom™ (Gentaur Molecular Products, Kampenhout, BE) siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad específica de esta enzima aumentó típicamente 7 veces en comparación con la actividad inicial encontrada en la fracción de homogenado del intestino medio. Las vesículas de membrana del borde en cepillo (BBMV) se distribuyeron en alícuotas de muestras de 250 µ?, se congelaron en forma instantánea en nitrógeno liquido y se almacenaron a -80°.
Electroforesis
El análisis de proteínas por SDS-PAGE se llevó a cabo en condiciones de reducción (es decir, en ß-mercaptoetanol 5%, BME) y de desnaturalización (es decir, se calentaron durante 5 minutos a 90° en presencia de SDS 2%). Las proteínas se cargaron en pocilios de gel de poliacrilamida Tris-Glicina 4% a 20% (BioRad; Hercules, CA) y se separaron a 200 voltios durante 60 minutos. Se detectaron bandas de proteínas tiñendo con Azul Brillante Coomassie R-250 (BioRad) durante una hora y decoloraron con una solución de metanol 5% en ácido acético 7%. Los geles se representaron en imágenes y analizaron utilizando un dispositivo de Imágenes BioRad Fluro-S Multi Imager™. Se determinaron los pesos moleculares relativos de las bandas de proteínas mediante la comparación de las movilidades de las proteínas de peso molecular conocido que se observan en una muestra de BenchMark™ Protein Ladder (Life Technologies, Rockville, D) cargada en un pocilio del gel.
Yodación de la proteina de toxina núcleo de Cry1 Da
La proteína de toxina núcleo de CryIDa purificada se yodó utilizando Perlas de Yodación Pierce (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). En síntesis se lavaron dos perlas de yodación dos veces con 500 pL de PBS (20 mM de fosfato de sodio, 0.15 M de NaCI, pH 7.5) y se colocaron en un tubo centrífugo de 1.5 ml_ con 100 pL de PBS. Se agregó 0.5 mCi de yoduro de sodio rotulado 1251, los componentes de permitieron reaccionar durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego se agregó 1 pg de proteína de toxina núcleo de CryIDa a la solución y se permitió reaccionar durante un período adicional de 3 a 5 minutos. La reacción se terminó transfiriendo con pipeta la solución de las Perlas de Yodación y aplicando dicha solución a una columna centrífuga Zeba™ (Invitrogen) equilibrada en 50 mM de CAPS, pH 10,0, 1 mM de DTT (ditiotreitol), 1 mM de EDTA, y glicerol 5%. Las Perlas de Yodación se lavaron dos veces con 10 pL de PBS y la solución de lavado también se aplicó a la columna de desalación Zeba™. La solución radioactiva se eluyó a través de la columna centrifuga centrifugando a 1 ,000 x g durante 2 minutos. La proteína de toxina núcleo de CryI Da radiorrotulada 1251 luego se dializó contra 50 mM de CAPS, pH 10,0, 1 mM de DTT, 1 mM de EDTA, y glicerol 5%.
Formación de imágenes
La radio-pureza de la proteína de toxina núcleo de CryI Da yodada se determinó por análisis de SDS-PAGE y formación de imágenes en
placas de fósforo. En síntesis, los geles para el análisis de SDS-PAGE se secaron utilizando un aparato secante de gel BioRad siguiendo las instrucciones del fabricante. Los geles secos se representaron en imágenes envolviéndolos en película Mylar (12 µ?? de espesor) y exponiéndolos bajo una pantalla de fósforo de almacenamiento Molecular Dynamics (35 cm x 43 cm) durante 1 hora. Las placas se revelaron utilizando un representador de imágenes en placas de fósforo Molecular Dynamics Storm 820 y la imagen se analizó utilizando el software ImageQuant™.
EJEMPLO 6
Unión de la proteína de toxina núcleo de Crv1 rotulada 1251 a las vesículas de membrana del borde en cepillo (BBMV) provenientes de
Spodoptera fruqiperda
Se generó una curva de saturación para determinar la cantidad óptima de proteína de BBMV para utilizar en los ensayos de unión con las proteínas de toxina núcleo de CryI Da y CryI Fa. Se incubó 0.5 nM de proteína de toxina núcleo radiorrotulada 1251 durante 1 hora a 28° en solución reguladora de unión (8 mM de NaHP04, 2 mM de KH2P04, 150 mM de NaCI, BSA 0.1 %, pH 7.4) con cantidades de proteina de BBMV que tenía un rango de 0 pg/mL a 500 pg/mL (volumen total de 0.5 mL). La proteína de toxina núcleo de Cry1 rotulada 1251 unida a las proteínas de BBMV se separó de la fracción no unida realizando un muestreo de 150 pL de la mezcla de reacción por triplicado en distintos tubos centrífugos de 1.5 mL y centrifugando las muestras a 14,000 x g durante 8 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se extrajo suavemente y el microgranulo se lavó tres veces con solución reguladora de unión enfriada con hielo. La parte inferior del tubo centrífugo que contenía el microgránulo se separó, se colocó en un tubo de cultivo de vidrio de 13 x 75 mm y las muestras se contaron durante 5 minutos cada una en el contador gamma. Las cuentas por minuto (CPM, según sus siglas en inglés) obtenidas menos las CPM de fondo (reacción sin proteína de BBMV) se graficaron contra la concentración de proteína de BBMV. De acuerdo con los resultados informados por otros (Luo et al., 1999) se determinó que la concentración óptima de proteína de BBMV para utilizar en los ensayos de unión era de 150 pg/mL.
EJEMPLO 7
Ensayos de unión competitiva a vesículas de membrana del borde en cepillo (BBMV) provenientes de S. frugiperda con proteínas de toxina núcleo de CrylDa y CryI Fa
Se llevaron a cabo ensayos de unión competitiva, homólogos y heterólogos, utilizando 150 pg/mL de proteína de BBMV de S. frugiperda y 0.5 nM de la proteína de toxina núcleo de Cryl Da radiorrotulada 1251. Las concentraciones de la proteína de toxina núcleo de CryI Fa competitiva no radiorrotulada agregada a la mezcla de reacción tuvieron un rango de 0,045 nM a 1000 nM y se agregaron al mismo tiempo que la proteína de toxina núcleo de CryI Da radioactiva, para asegurar una competencia de unión genuina. Las incubaciones se llevaron a cabo durante 1 hora a 28° y la cantidad de proteína de toxina núcleo de CryI Da rotulada 1251 unida a BBMV (unión específica) se midió tal como se describió anteriormente. La unión no específica se representó por las cuentas obtenidas en presencia de 1 ,000 nM de proteína de toxina núcleo de CryI Da no radiorrotulada. Se consideró que un total de ciento por ciento de unión era la cantidad de unión a falta de cualquier proteína de toxina núcleo de CryI Fa competidora.
Los ensayos de unión al receptor utilizando proteína de toxina núcleo de CryI Da rotulada 1251 determinaron la capacidad de la proteína de toxina núcleo de CryI Fa para desplazar este ligando radiorrotulado de su sitio de unión en BBMV provenientes de S. frugiperda. Los resultados muestran que la proteína de toxina núcleo de CryI Fa no desplazó la proteina de toxina núcleo de CryI Da rotulada 1251 unida de su(s) proteína(s) receptora(s) en concentraciones tan altas como 1000 nM (2000 veces la concentración del ligando radioactivo de unión). Según lo esperado, la proteína de toxina núcleo de CryI Da no rotulada fue capaz de desplazar la proteína de toxina núcleo de CryI Da radiorrotulada de su(s) proteína(s) de unión, exhibiendo una curva de dosis-respuesta sigmoidal con 50% de desplazamiento que ocurre en 5 nM.
Por lo tanto, indicó que la proteína de toxina núcleo de CryI Da interactúa con un sitio de unión en BBMV de S. frugiperda que no se une a la proteína de toxina núcleo de CryI Fa.
REFERENCIAS
Finney, D.J. 1971. Probit analysis. Cambridge University Press,
England.
Hua, G., L. asson, J. L. Jurat-Fuentes, G. Schwab, and M. J.
Adang. Binding analyses of Bacillus thuringiensis Cry d-endotoxines using brush border membrane vesicles of Ostrinia nubilalis. Applied and Environmental Microbiology 67[2], 872-879. 2001.
LeOra Software. 1987. POLO-PC. A user's guide to probit and logit analysis. Berkeley, CA.
McGaughey, W. H., F. Gould, and W. Gelernter. Bt resistance management. Nature Biotechnology 16[2], 144-146. 1998
Marcon, P.R.G.C., L.J. Young, K. Steffey, and B.D. Siegfried. 1999. Baseline susceptibility of the European corn borer, Ostrinia nubilalis (Hübner) (Lepidoptera: Pyralidae) to Bacillus thuringiensis toxines. J. Econ. Entomol. 92 (2): 280-285.
Robertson, L.J. and H.K. Preisler. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC Press, Boca Ranton, FL.
SAS Institute Inc. 1988. SAS procedures guide, Reléase 6.03 edition. SAS Institute Inc, Cary, NC.
Stone, B.F. 1968. A formula for determining degree of dominance in cases of monofactorial inheritance of resistance to chemicals. Bull. WHO 38:325-329.
Van Mellaert, H., J. Botterman, J. Van Rie, and H. Jóos. Transgenic plants for the prevention of development of insects resistant to Bacillus thuringiensis toxines. (Plant Genetic Systems N.V., Belg. 89-401499(400246], 57-19901205. EP. 5-31-1989
APÉNDICE A
Lista completa de delta-endotoxinas - del sitio web de Crickmore et al.
(mencionado en la solicitud)
El número de Acceso es para el registro de NCBI (si está disponible)
Vip3Aa1 Vip3Aa C3Z036 «™*« 1996 |¾ AB88
Vip3Aa2 Vip3Ab AAC3703Z rUChe' 1996
EUA
Estruc et
Vip3Aa3 Vip3Ac 2000 6137033
al Oct 2000
W098 89 32(A2,A3) w. ? . PS36A
V.p3Aa4 Sup AAR81079 Feltflson 1998 6656908 Bt PS36A 7 de Mayo etal Dic2003 ¡1998
:WÓ98 89 '32(?2,?3)
Vip3Aa5 ¡Sup AAR81080 !Fe,tflson ¡1998 6656908 BtPSSIF ,7 de Mayo etal Dic2003 ; 1998
'W098189
EUA 32(A2,A3)
AAR81081 ^ lS°n 6656908 Bt 7 de Mayo
Dic 2003 1998 sin Bt YBT- Vip3Aa7 Vip83 AAK95326 Ca¡ et al 2001 publicar 833
sin
81 ^ 2001 Bt HD125
Vip3Aa8 Vip3A AAK974 publicar
sin
6665 » di 2Q01 Bt A13
Vip3Aa9 VipS CAA7
publicar
Protein
Vip3Aa1 Vjp3V
Vip3Aa1 sin
Vip3A AAR36859 Liu et al Bt C9
publicar
1
Vip3Aa1 Vip3A- Wu and sin
AAM22456 2003 Bt 2 WB5 Guan publicar
Sheng Wu
Gong
Cheng
Vip3Aa1 Vip3A AAL69542 Chenetal 2002 Xue Bao
18,687- 692
EUA W099572
V¡p3Ab1 Vip3B AAR4Q284 ^ et a!! 1999 6603
l ISOn 063 ?
. __ K ¦ \DBi c5n9AA4,-6 e ? 1?1 (i N2ov,A3)
Ago 2003
V¡p3Ab2 V¡p3D AAY88247 gjjjjjj and 20Q6 Bt
Solicitud
EUA
Vip3Ac1 PS49C Narva et al
20040128
716
Solicitud
... , A .„ PS158C .. . . EUA
V.p3Ad1 2 Narva et al 200A0UQ
716
Vip3Ad2 ISP3B CAI43276 V.an Rie et 2005 Sin l.
al publicar
Vip3Ae1 ISP3C CAI43277 Van Rie et 2005 's"! ..
r al publicar
V¡p3Af1 ISP3A CAI43275 V.an Rie et 2005 -s,n. ..
al publicar
Vip3Af2 Vip3C ADN08753 Syngenta . ÜÍL—cc
WO
Vip3Ag1 Vip3B ADN08758 Syngenta
02/078437
Vip3Ag2 FJ556803 ^udtho et 2Q08
Vip3Ah1 Vip3S DQ832323 ^' and 2006 Sin. .. Bt
r v Shen publicar
Vip3Ba1 AAV70653 Rang et al ;2004 Sin. ..
3 publicar
WO
Vip3Bb1 Vip3Z ADN08760 Syngenta
03/075655
Vip3Bb2 EF439819 Akhurst et 2007
Claims (36)
1.- Una planta transgénica que comprende ADN que codifica una proteína insecticida CryI D y ADN que codifica una proteina insecticida CryI F.
2. - Una semilla de una planta como la que se reclama en la reivindicación 1.
3. - La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el ADN que codifica una proteína insecticida CryI D y el ADN que codifica una proteína insecticida CryI F han sido introducidos en dicha planta.
4. - Una semilla de una planta como la que se reclama en la reivindicación 3.
5.- Un campo de plantas que comprende plantas de refugio no Bt y una pluralidad de plantas como la que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dichas plantas de refugio comprenden menos del 40% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
6. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos del 30% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
7. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos del 20% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
8.- El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos del 10% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
9 - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos del 5% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
10. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio están en bloques o en franjas.
11. - Una mezcla de semillas que comprende semillas de refugio provenientes de plantas de refugio no Bt, y una pluralidad de semillas como la que se reclama en la reivindicación 4, en donde dichas semillas de refugio comprenden menos del 40% de todas las semillas en la mezcla.
12 - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos del 30% de todas las semillas en la mezcla.
13. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos del 20% de todas las semillas en la mezcla.
14. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos del 10% de todas las semillas en la mezcla.
15. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos del 5% de todas las semillas en la mezcla.
16. - Un método de control del desarrollo de resistencia a una toxina Cry por un insecto, método que comprende plantar semillas para producir un campo de plantas como el que se reclama en la reivindicación 5.
17. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha planta comprende adicionalmente ADN que codifica una proteína Cry Ab que contiene la toxina núcleo.
18.- Un campo de plantas que comprende plantas de refugio no Bt y una pluralidad de plantas transgénicas como la que se reclama en la reivindicación 17, en donde dichas plantas de refugio comprenden menos de alrededor del 20% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
19. - Un campo de plantas que comprende una pluralidad de plantas como la que se reclama en la reivindicación 17, en donde dicho campo comprende menos de alrededor del 10% de plantas de refugio.
20. - Un método de control del desarrollo de resistencia a una toxina Cry por un insecto, método que comprende plantar semillas para producir un campo de plantas como el que se reclama en la reivindicación 19.
21.- Una composición para controlar plagas de lepidópteros que comprende células que expresan cantidades eficaces de una proteina que contiene la toxina núcleo de Cryl F y una proteína que contiene la toxina núcleo de CryI D.
22 - La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque comprende un huésped transformado para expresar tanto una proteína Cry F que contiene la toxina núcleo como una toxina núcleo de CryI D que contiene proteína, en donde dicho huésped es un microorganismo o una célula de planta.
23. - Un método de control de plagas de lepidópteros que comprende presentar a dichas plagas o al entorno de dichas plagas una cantidad eficaz de una composición como la que se reclama en la reivindicación 21 .
24. - Una planta transgénica que produce tres proteínas Cry insecticidas que son insecticidas al mismo insecto blanco, en donde dicho insecto tiene potencial para desarrollar resistencia a cualquiera de dichas proteínas Cry, y en donde cada una de dichas proteínas Cry se une a un distinto receptor de intestino en dicho insecto blanco.
25 - La planta de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque dicho insecto es el gusano cogollero del maíz.
26. - Una planta transgénica que produce una proteína CryI Fa más una proteína CryI Da más una tercera proteína seleccionada entre el grupo integrado por las proteínas Vip3A, Cry1 C, Cry1 Be y Cry1 E.
27. - Un método de control del desarrollo de resistencia a una toxina Cry por un insecto, método que comprende plantar semillas para producir un campo de plantas como la que se reclama en la reivindicación 26.
28. - Un campo de plantas que comprende plantas de refugio no Bt y una pluralidad de plantas como la que se reclama en la reivindicación 26, en donde dichas plantas de refugio comprenden menos de alrededor del 10% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
29. - El campo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicho campo comprende menos de alrededor del 5% de plantas de refugio.
30. - Un método de control del desarrollo de la resistencia a una toxina Cry por un insecto, método que comprende plantar semillas para producir un campo de plantas como el que se reclama en la reivindicación 28 o 29.
31. - Una mezcla de semillas que comprende semillas de refugio provenientes de plantas de refugio no Bt, y una pluralidad de semillas provenientes de una planta como la que se reclama en la reivindicación 26, en donde dichas semillas de refugio comprenden menos del 10% de todas las semillas en la mezcla.
32. - El campo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5, 18, y 28, caracterizado además porque dichas plantas ocupan más de 4.04 ha (10 acres).
33. - La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 17, 24, y 26, caracterizada además porque dicha planta está seleccionada entre el grupo integrado por maíz, soja y algodón.
34. - La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 17, 24, y 26, caracterizada además porque dicha planta es una planta de maíz.
35. - Una célula de planta de una planta como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 17, 24, 26, 33 y 34, en donde dicha dicha célula de planta comprende dicho ADN que codifica dicha proteina insecticida CryI D y dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida CryI F, en donde dicha proteína insecticida CryI D es por lo menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 1 , y dicha proteína insecticida CryI F es por lo menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 2.
36. - La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 17, 24, 26, 33 y 34, caracterizada además porque dicha proteína insecticida CryI D comprende la SEQ ID NO: 1 , y dicha proteína insecticida Cry F comprende la SEQ ID NO: 2.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28425209P | 2009-12-16 | 2009-12-16 | |
| PCT/US2010/060815 WO2011075587A1 (en) | 2009-12-16 | 2010-12-16 | Combined use of cry1da and cry1fa proteins for insect resistance management |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MX2012007138A true MX2012007138A (es) | 2012-10-09 |
| MX358710B MX358710B (es) | 2018-08-31 |
Family
ID=44167703
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| MX2012007138A MX358710B (es) | 2009-12-16 | 2010-12-16 | Uso combinado de proteínas cry1da y cry1fa para el control de la resistencia de los insectos. |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20120331589A1 (es) |
| EP (1) | EP2512221B1 (es) |
| JP (1) | JP5908409B2 (es) |
| KR (1) | KR101841298B1 (es) |
| CN (1) | CN102843903B (es) |
| AR (1) | AR079499A1 (es) |
| AU (1) | AU2010330916B2 (es) |
| BR (2) | BR122019001711B8 (es) |
| CA (1) | CA2782546C (es) |
| CL (1) | CL2012001622A1 (es) |
| CO (1) | CO6602146A2 (es) |
| ES (1) | ES2704652T3 (es) |
| IL (1) | IL220333A (es) |
| MX (1) | MX358710B (es) |
| NZ (1) | NZ601096A (es) |
| RU (1) | RU2603257C2 (es) |
| UA (3) | UA111710C2 (es) |
| WO (1) | WO2011075587A1 (es) |
| ZA (1) | ZA201204914B (es) |
Families Citing this family (59)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9567602B2 (en) | 2009-12-16 | 2017-02-14 | Dow Agrosciences Llc | Combined use of CRY1Ca and CRY1Fa proteins for insect resistance management |
| CN102762733B (zh) | 2009-12-16 | 2016-05-04 | 陶氏益农公司 | 与Cry1Ca组合的Cry1Da用于管理抗性昆虫的用途 |
| EP2903413A4 (en) * | 2012-10-05 | 2016-07-20 | Dow Agrosciences Llc | USE OF CRY1EA IN COMBINATIONS FOR MANAGING FALLING AUTUMN LEGION INSECTS |
| WO2014071182A1 (en) | 2012-11-01 | 2014-05-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Directed evolution of synthetic gene cluster |
| US10023877B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-07-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | PHI-4 polypeptides and methods for their use |
| MX359026B (es) | 2013-08-16 | 2018-09-12 | Pioneer Hi Bred Int | Proteinas insecticidas y metodos de uso. |
| MX359027B (es) | 2013-09-13 | 2018-09-12 | Pioneer Hi Bred Int | Proteinas insecticidas y metodos para su uso. |
| CN103719137B (zh) * | 2013-11-15 | 2015-05-13 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 控制害虫的方法 |
| CN103718895B (zh) * | 2013-11-18 | 2016-05-18 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 控制害虫的方法 |
| MX2016010187A (es) | 2014-02-07 | 2017-07-11 | Pioneer Hi Bred Int | Proteinas insecticidas y metodos para su uso. |
| CN106232620B (zh) | 2014-02-07 | 2022-05-13 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| TW201542093A (zh) * | 2014-03-21 | 2015-11-16 | 艾格里遺傳學股份有限公司 | 用於控制玉米穗蟲之Ｃｒｙ１Ｄ |
| WO2016000237A1 (en) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | Pioneer Overseas Corporation | Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes |
| CN113372421A (zh) | 2014-10-16 | 2021-09-10 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| US10231460B2 (en) * | 2015-01-15 | 2019-03-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| EA038923B1 (ru) | 2015-03-11 | 2021-11-10 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидная днк-конструкция и способы её применения |
| RU2017144238A (ru) | 2015-05-19 | 2019-06-19 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
| EP3310803A1 (en) | 2015-06-16 | 2018-04-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| WO2017011602A1 (en) | 2015-07-13 | 2017-01-19 | Pivot Bio, Inc. | Methods and compositions for improving plant traits |
| EP3943602A1 (en) | 2015-08-06 | 2022-01-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant derived insecticidal proteins and methods for their use |
| BR112018004108A2 (pt) | 2015-08-28 | 2018-12-11 | Du Pont | ochrobactrum haywardense h1 isolada, ochrobactrum haywardense h1, método para produzir uma célula vegetal transformada, kit e vetor |
| WO2017062412A1 (en) | 2015-10-05 | 2017-04-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Nitrogen fixation using refactored nif clusters |
| EP3390431A1 (en) | 2015-12-18 | 2018-10-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| US11781151B2 (en) | 2016-04-14 | 2023-10-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal CRY1B variants having improved activity spectrum and uses thereof |
| WO2017184673A1 (en) | 2016-04-19 | 2017-10-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof |
| CA3018384A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| EP3472323A1 (en) | 2016-06-16 | 2019-04-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| CN109642237B (zh) | 2016-06-24 | 2022-09-30 | 先锋国际良种公司 | 植物调节元件及其使用方法 |
| CA3026113A1 (en) | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
| WO2018013333A1 (en) | 2016-07-12 | 2018-01-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| EP4050021A1 (en) | 2016-11-01 | 2022-08-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| CA3044408A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Syngenta Participations Ag | Engineered pesticidal proteins and methods of controlling plant pests |
| CA3044404A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| CA3046226A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| UY37566A (es) | 2017-01-12 | 2018-07-31 | Pivot Bio Inc | Métodos y composiciones para mejorar características en plantas |
| WO2018140214A1 (en) | 2017-01-24 | 2018-08-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nematicidal protein from pseudomonas |
| WO2018148001A1 (en) | 2017-02-08 | 2018-08-16 | Pioneer Hi-Bred International Inc | Insecticidal combinations of plant derived insecticidal proteins and methods for their use |
| WO2018208882A1 (en) | 2017-05-11 | 2018-11-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| EA201992824A1 (ru) | 2017-05-26 | 2020-05-06 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные полипептиды, обладающие улучшенным спектром активности, и пути их применения |
| US20200165626A1 (en) | 2017-10-13 | 2020-05-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Virus-induced gene silencing technology for insect control in maize |
| KR20200088342A (ko) | 2017-10-25 | 2020-07-22 | 피벗 바이오, 인크. | 질소를 고정하는 유전자조작 미생물을 개선하는 방법 및 조성물 |
| WO2019165245A1 (en) | 2018-02-22 | 2019-08-29 | Zymergen Inc. | Method for creating a genomic library enriched for bacillus and identification of novel cry toxins |
| US20210002657A1 (en) | 2018-03-02 | 2021-01-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant health assay |
| CA3088011A1 (en) | 2018-03-02 | 2019-09-06 | Zymergen Inc. | Insecticidal protein discovery platform and insecticidal proteins discovered therefrom |
| BR102018009263A8 (pt) * | 2018-05-07 | 2023-01-31 | Embrapa Pesquisa Agropecuaria | Molécula de ácido nucleico cry1da códon-otimizada, construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, célula vegetal, planta transgênica, método para transformar uma célula, método para produzir uma planta transgênica, método de controle de pragas invertebradas de plantas de cultivo e usos da molécula de ácido nucleico |
| WO2019226508A1 (en) | 2018-05-22 | 2019-11-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
| MX2020013875A (es) | 2018-06-27 | 2021-08-11 | Pivot Bio Inc | Composiciones agricolas que comprenden microbios remodelados de fijacion de nitrogeno. |
| MX2021002290A (es) | 2018-08-29 | 2021-04-28 | Pioneer Hi Bred Int | Proteinas insecticidas y metodos para su uso. |
| WO2021076346A1 (en) | 2019-10-18 | 2021-04-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize event dp-202216-6 and dp-023211-2 stack |
| BR102019023319A2 (pt) * | 2019-11-06 | 2021-05-18 | Embrapa-Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuaria | molécula de ácido nucléico do evento transgênico de milho me240913 expressando a proteína cry1da, célula, planta e semente transgênica, usos das mesmas, produto de planta, método, kit e amplicon para detecção do evento, e métodos para produzir uma planta transgênica e de controle de insetos-pragas lepidópteros |
| WO2021221690A1 (en) | 2020-05-01 | 2021-11-04 | Pivot Bio, Inc. | Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen |
| TW202142114A (zh) | 2020-02-04 | 2021-11-16 | 美商陶氏農業科學公司 | 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關之方法 |
| WO2021222567A2 (en) | 2020-05-01 | 2021-11-04 | Pivot Bio, Inc. | Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen |
| CA3186978A1 (en) | 2020-07-14 | 2022-01-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| CN112390893B (zh) * | 2020-07-16 | 2022-06-28 | 杭州瑞丰生物科技有限公司 | 一种高效抗草地贪夜蛾的融合蛋白及其应用 |
| CA3189603A1 (en) | 2020-08-10 | 2022-01-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
| AU2022301301A1 (en) | 2021-07-02 | 2023-12-14 | Pivot Bio, Inc. | Genetically-engineered bacterial strains for improved fixation of nitrogen |
| TW202345696A (zh) | 2022-05-18 | 2023-12-01 | 美商科迪華農業科技有限責任公司 | 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關的方法 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0400246A1 (en) * | 1989-05-31 | 1990-12-05 | Plant Genetic Systems, N.V. | Prevention of Bt resistance development |
| GB9318207D0 (en) * | 1993-09-02 | 1993-10-20 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
| US5942664A (en) * | 1996-11-27 | 1999-08-24 | Ecogen, Inc. | Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants |
| JP2001524817A (ja) * | 1997-04-03 | 2001-12-04 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 植物病原体抑制 |
| US6218188B1 (en) * | 1997-11-12 | 2001-04-17 | Mycogen Corporation | Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins |
| US6500617B1 (en) * | 1998-05-01 | 2002-12-31 | Maxygen, Inc. | Optimization of pest resistance genes using DNA shuffling |
| WO2001014562A1 (en) * | 1999-08-19 | 2001-03-01 | Syngenta Participations Ag | Hybrid insecticidal toxins and nucleic acid sequences coding therefor |
| AR035799A1 (es) * | 2001-03-30 | 2004-07-14 | Syngenta Participations Ag | Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos. |
| US6868634B2 (en) * | 2001-10-04 | 2005-03-22 | Mississippi State University | Insect resistance management in agricultural applications |
| HUE028375T2 (en) * | 2003-05-02 | 2016-12-28 | Dow Agrosciences Llc | TC 1507 corn and a method for detecting it |
| US20070006340A1 (en) * | 2004-03-05 | 2007-01-04 | Lang Bruce A | Combinations of Cry1Ab and Cry1Fa as an insect resistance management tool |
| ES2531980T3 (es) * | 2004-03-26 | 2015-03-23 | Dow Agrosciences Llc | Líneas de algodón transgénico Cry1F y Cry1Ac y su identificación específica de evento |
| AU2007228981B2 (en) * | 2006-03-21 | 2012-10-04 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Novel genes encoding insecticidal proteins |
| TWI349526B (en) * | 2007-12-31 | 2011-10-01 | Taiwan Agricultural Chemicals And Toxic Substances Res Inst Council Of Agricult | Novel bacillus thuringiensis strain for inhibiting insect pests |
| CA2723188A1 (en) * | 2008-05-01 | 2009-11-05 | Bayer Bioscience N.V. | Armyworm insect resistance management in transgenic plants |
| HUE025156T2 (en) * | 2009-04-17 | 2016-03-29 | Dow Agrosciences Llc | Insecticide DIG-3 CRY toxins |
| US9567602B2 (en) * | 2009-12-16 | 2017-02-14 | Dow Agrosciences Llc | Combined use of CRY1Ca and CRY1Fa proteins for insect resistance management |
| AR084293A1 (es) * | 2010-12-16 | 2013-05-08 | Dow Agrosciences Llc | Cry1FA RADIOMARCADA, BIOLOGICAMENTE ACTIVA Y METODOS DE ENSAYOS DE UNION AL RECEPTOR |
-
2010
- 2010-12-16 UA UAA201208657A patent/UA111710C2/uk unknown
- 2010-12-16 AR ARP100104672A patent/AR079499A1/es not_active Application Discontinuation
- 2010-12-16 RU RU2012129906/10A patent/RU2603257C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-12-16 EP EP10838259.9A patent/EP2512221B1/en active Active
- 2010-12-16 NZ NZ601096A patent/NZ601096A/en not_active IP Right Cessation
- 2010-12-16 ES ES10838259T patent/ES2704652T3/es active Active
- 2010-12-16 CN CN201080064010.1A patent/CN102843903B/zh active Active
- 2010-12-16 UA UAA201208557A patent/UA113273C2/uk unknown
- 2010-12-16 JP JP2012544839A patent/JP5908409B2/ja active Active
- 2010-12-16 KR KR1020127018424A patent/KR101841298B1/ko active IP Right Grant
- 2010-12-16 UA UAA201208628A patent/UA112409C2/uk unknown
- 2010-12-16 WO PCT/US2010/060815 patent/WO2011075587A1/en active Application Filing
- 2010-12-16 CA CA2782546A patent/CA2782546C/en active Active
- 2010-12-16 BR BR122019001711A patent/BR122019001711B8/pt active IP Right Grant
- 2010-12-16 AU AU2010330916A patent/AU2010330916B2/en not_active Ceased
- 2010-12-16 BR BR112012014575A patent/BR112012014575A2/pt active IP Right Grant
- 2010-12-16 US US13/516,604 patent/US20120331589A1/en not_active Abandoned
- 2010-12-16 MX MX2012007138A patent/MX358710B/es active IP Right Grant
-
2012
- 2012-06-12 IL IL220333A patent/IL220333A/en not_active IP Right Cessation
- 2012-06-15 CL CL2012001622A patent/CL2012001622A1/es unknown
- 2012-07-02 ZA ZA2012/04914A patent/ZA201204914B/en unknown
- 2012-07-16 CO CO12119367A patent/CO6602146A2/es not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| UA113273C2 (xx) | 2017-01-10 |
| CA2782546C (en) | 2023-03-21 |
| ZA201204914B (en) | 2013-02-27 |
| EP2512221A4 (en) | 2013-10-09 |
| RU2603257C2 (ru) | 2016-11-27 |
| AU2010330916A1 (en) | 2012-07-12 |
| NZ601096A (en) | 2014-10-31 |
| WO2011075587A1 (en) | 2011-06-23 |
| CA2782546A1 (en) | 2011-06-23 |
| MX358710B (es) | 2018-08-31 |
| ES2704652T3 (es) | 2019-03-19 |
| KR101841298B1 (ko) | 2018-03-22 |
| BR122019001711B1 (pt) | 2020-03-31 |
| JP2013514768A (ja) | 2013-05-02 |
| CN102843903A (zh) | 2012-12-26 |
| EP2512221B1 (en) | 2018-11-07 |
| IL220333A (en) | 2016-07-31 |
| JP5908409B2 (ja) | 2016-04-26 |
| AU2010330916B2 (en) | 2015-07-16 |
| CL2012001622A1 (es) | 2013-01-25 |
| BR112012014575A2 (pt) | 2017-06-20 |
| US20120331589A1 (en) | 2012-12-27 |
| KR20120096574A (ko) | 2012-08-30 |
| EP2512221A1 (en) | 2012-10-24 |
| UA112409C2 (uk) | 2016-09-12 |
| BR122019001711B8 (pt) | 2022-10-11 |
| RU2012129906A (ru) | 2014-01-27 |
| UA111710C2 (uk) | 2016-06-10 |
| CO6602146A2 (es) | 2013-01-18 |
| CN102843903B (zh) | 2016-02-10 |
| AR079499A1 (es) | 2012-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2603257C2 (ru) | КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ Cry1Da И Cry1Fa ДЛЯ ВЫРАБАТЫВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К НАСЕКОМЫМ | |
| RU2596406C2 (ru) | КОМБИНИРОВАННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВ CRY1Ca И CRY1Ab ДЛЯ КОНТРОЛЯ УСТОЙЧИВОСТИ НАСЕКОМЫХ | |
| RU2593961C2 (ru) | КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ CRY1Ca И CRY1Fa ДЛЯ БОРЬБЫ С РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ У НАСЕКОМЫХ | |
| JP5969921B2 (ja) | 抵抗性昆虫の対応のためのＣｒｙ１Ｂｅと組み合わせたＣｒｙ１Ｄａの使用 | |
| RU2583288C2 (ru) | Применение cry1ab в комбинации с cry1be для управления резистентностью насекомых | |
| KR20120096570A (ko) | 곤충 내성 관리를 위한 ｖｉｐ３ａｂ 및 ｃｒｙ１ｆａ의 병용 용도 | |
| KR101841292B1 (ko) | 곤충 내성 관리를 위한 ｃｒｙ１ｄａ 및 ｃｒｙ１ｃａ의 병용 용도 | |
| JP2016501511A (ja) | 抵抗性のフォールアーミーワーム昆虫の管理のための組み合わせたＣｒｙ１Ｅａの使用 | |
| KR20120115979A (ko) | 곤충 내성 관리를 위한 ｖｉｐ３ａｂ 및 ｃｒｙ１ｃａ의 병용 용도 | |
| RU2624031C2 (ru) | Применение инсектицидного кристаллического белка dig3 в комбинации с cry1ab для регулирования устойчивости к кукурузному мотыльку | |
| RU2608500C2 (ru) | Комбинированное применение vip3ab и cry1ab для регулирования устойчивых насекомых | |
| JP5913124B2 (ja) | サトウキビでのＣｒｙ抵抗性のシュガーケーンボーラーの防除および昆虫抵抗性管理のためのＣＲＹ１ＦａおよびＣＲＹ１Ａｂタンパク質の併用 | |
| RU2575084C2 (ru) | ПРИМЕНЕНИЕ Vip3Ab В СОЧЕТАНИИ С Cry1Ca ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Grant or registration |