ES2531980T3 - Líneas de algodón transgénico Cry1F y Cry1Ac y su identificación específica de evento - Google Patents

Líneas de algodón transgénico Cry1F y Cry1Ac y su identificación específica de evento Download PDF

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Abstract

Una semilla de algodón que comprende en su genoma el evento cry1Ac del algodón 3006-210-23, en la que el evento del algodón 3006-210-23 es una secuencia polinucleotídica del inserto cry1Ac que consiste en los nucleótidos 528-8900 de SEQ ID NO:2 y al menos 20 nucleótidos flanqueantes contiguos en ambos lados de dicha segunda secuencia del inserto, en la que los nucleótidos flanqueantes-5' proceden de los restos nucleótidos 1-527 de SEQ ID NO:2, y los nucleótidos flanqueantes-3' proceden de los restos nucleótidos 8901-9382 de SEQ ID NO:2.

Description

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nucleótidos, por ejemplo, generalmente no es necesario que uno o dos o unos cuantos nucleótidos se unan a la hebra opuesat si la base desapareada es interna o está en el extremo del cebador opuesto al amplicón. A continuación se proporcionan diversas condiciones de hibridación apropiadas. También pueden utilizarse análogos de nucleótidos sintéticos, tales como inosina, en las sondas. También pueden emplearse sondas de ácidos nucleicos peptídicos (PNA), así como sondas de ADN y ARN. Lo importante es que dichas sondas y cebadores sean diagnósticas (sean capaces de identificar y distinguir de forma exclusiva) de la presencia de un evento de la presente invención.
También debe advertirse que pueden producirse errores en la amplificación con PCR que pueden producir pequeños errores de secuenciación, por ejemplo. Es decir, a menos que se indique lo contrario, las secuencias listadas en la presente se determinaron generando amplicones largos a partir de ADN genómicos de algodón, y después clonando y secuenciando los amplicones. No es raro encontrar ligeras diferencias y pequeñas discrepancias en las secuencias generadas y determinadas de esta manera, debido a las muchas rondas de amplificación que son necesarias para generar los amplicones suficientes para la secuenciación a partir de ADN genómico. Por ejemplo, se indican las siguientes diferencias entre las secuencias determinadas de los ADN flanqueantes del evento y los correspondientes ADN conocidos/de tipo salvaje/genómicos. En el flanco 50 para el presente evento cry1F, se determinó que el resto 2037 de SEQ ID NO: 1 se lista como “G”, mientras que el correspondiente resto del locus de 281-24-236 de la secuenca genómica conocida es “A” (R puede emplearse en una secuencia consenso, según las convenciones de la IUPAC-IUB convencionales). En el flanco 3’ de este evento, el resto 12.781 de SEQ ID NO:1 se lista en la presente como T, mientras que en la secuencia genómica publicada se proporciona C en la correspondiente localización (Y es el código consenso). La posición 12.811 de SEQ ID NO:1 es C, mientras que se proporciona T para el genoma (Y sería el consenso). La posición 12.866 se lista como C en SEQ ID NO:1, mientras que aparece T en el genoma (Y es el consenso). La posición 12.882 se lista como G en SEQ ID NO:1, mientras que aparece A en el genoma (R es el consenso). La posición 12.918 se lista como A en SEQ ID NO:1, mientras que aparece G en el genoma (R es el consenso). El resto 13.129 se lista como G en SEQ ID NO:1, mientras que aparece A en el genoma (R es el consenso). El resto 13.222 se lista como C en SEQ ID NO:1, mientras que aparece T en la secuencia genómica (Y es el consenso). En la posición 13.441 en SEQ ID NO:1 aparece T, mientras que no existe un resto correspondiente en el listado genómico. Así, esta aparente inserción desplazaría cadena abajo la numeración de SEQ ID NO:1 en consecuencia, comparado con la secuencia genómica. Los expertos en la técnica deberían reconocer y advertir que cualquier ajuste necesario debido a este tipo de errores de secuenciación o discrepancias comunes está dentro del alcance de la presente invención.
También aparecen diferencias similares en el flanco 5’ para el presente evento cry1A. En las posiciones 149, 153, 159, 165 y 244 de SEQ ID NO:2 se listan los siguientes restos, respectivamente: C, G, C, C, y C. En la secuencia genómica en el locus de 3006-210-23 aparecen los siguientes restos, respectivamente, en las correspondientes localizaciones: A, A, A, A, y A. Los códigos consenso para estas sustituiciones son, respectivamente: M, R, M, M, y
M. Pueden realizarse ajustes en consecuencia en las sondas y los cebadores, y las correspondientes diferencias pueden notarse en los amplicones que abarcan o incluyen cualquiera de los restos anteriores.
También debe advertirse que no es raro que una parte de la secuencia genómica se delecione cuando una secuencia se inserta durante la creación de un evento. Este es el caso para ambos eventos de la presente invención. Es decir, SEQ ID NO:1 proporciona un segmento de 53 bases de ADN genómico del algodón para el evento de 281-24-236 que se deleciona durante la inserción. Este “segmento interior” aparece entre los restos 2074 y 12.749 de SEQ ID NO:1 en el genoma del algodón no transformado. De modo similar, SEQ ID NO:2 proporciona un segmento de 16 bases del ADN genómico del algodón para el evento de 3006-210-23 que se deleciona durante la inserción. Este “segmento interior” aparece entre los restos 527 y 8.901 de SEQ ID NO:2 en el genoma del algodón no transformado.
Tal como se liustra en las figuras 1 y 2, los componentes de cada uno de los “insertos” son los siguientes. Las moléculas de ADN del elemento genético del transgén contenidas en el presente evento Cry1F de 281-24-236 consisten en el promotor 1 de ubiquitina de maíz, conectado operablemente con fosfinotricina N-acetiltransferasa (PAT) de Streptomyces viridochromogenes, conectado operablemente con las secuencias de poliadenilación ORF25 (Baker et al., Plant Molecular Biology, 2:335-350, 1983); el promotor quimérico [(4OCS)MAS] que contiene un promotor de manopinas sintasa parcialmente delecionado con 4 elementos potenciadores del promotor de octopina sintasa, conectado operablemente con el Cry1F(synpro) de Bacillus thuringiensis var. aizawai, conectado operablemente con las secuencias de poliadenilación ORF25 (Baker et al., Plant Molecular Biology, 2:335-350, 1983); y el promotor 1 de ubiquitina de maíz no conectado operablemente con una secuencia pat parcial. Las secuencias polinucleotídicas del ADN, o fragmentos de estos componentes, pueden emplearse como cebadores o sondas de ADN en los métodos de la presente invención.
Las moléculas de ADN del elemento genético del transgén contenidas en el presente evento Cry1Ac de 3006-210-23 consisten en el promotor (4OCS)MAS conectado operablemente con PAT (según se describó anteriormente), conectado operablemente con ORF25; y el promotor 1 de ubiquitina de maíz conectado operablemente con Cry1Ac (synpro) de Bacillus thuringiensis var. kurstaki, conectado operablemente con las secuencias de poliadenilación ORF25. Las secuencias polinucleotídicas del ADN de estos componentes, o sus fragmentos, pueden emplearse como cebadores o sondas de ADN en los métodos de la presente invención.
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de algodón progenitora (que comprende un módulo de expresión de la presente invención, que confiere dicho rasgo de resistencia a insectos a las plantas de dicha línea) y una segunda línea de algodón progenitora (que carece de este rasgo de tolerancia a los insectos), produciendo con ello una pluralidad de plantas de la progenie; y (b) seleccionar una planta de la progenie mediante el uso de marcadores moleculares. Estos métodos pueden comprender opcionalmente otra etapa de retrocruzamiento de la planta de la progenie hasta la segunda línea de algodón progenitora para producir una planta de algodón de cruzamiento verdadero que comprende dicho rasgo de tolerancia a los insectos.
También se describen métodos para determinar la cigosidad de la progenie de un cruzamiento con uno cualquiera (o más) de dichos tres eventos. Dichos métodos pueden comprender poner en contcto una muestra, que comprende ADN de algodón, con un conjunto de cebadores de la presente invención. Dichos cebadores, cuando se emplean en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con el ADN genómico procedente de al menos uno de dichos eventos del algodón, produce un primer amplicón que es diagnóstico para al menos uno de dichos eventos del algodón. Estos métodos comprenden también realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, produciendo con ello el primer amplicón; detectar el primer amplicón; y poner en contacto la muestra que comprende ADN de algodón con dicho conjunto de cebadores (dicho conjunto de cebadores, cuando se emplea en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico procedente de plantas de algodón, produce un segundo amplicón que comprende el ADN genómico del algodón nativo homólogo con la región genómica del algodón de una inserción del transgén identificada como uno de dichos eventos del algodón); y realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, produciendo con ello el segundo amplicón. Los métodos comprenden también detectar el segundo amplicón, y comparar el primer y el segundo amplicón en una muestra, en la que la presencia de ambos amplicones indica que la muestra es heterocigótica para la inserción del transgén.
Pueden desarrollarse kits de detección de ADN empleando las composiciones descritas en la presente y métodos bien conocidos en la técnica de la detección de ADN. Los kits son útiles para la identificación del ADN del presente evento del algodón en una muestra, y pueden aplicarse a métodos para el cruzamiento de plantas de algodón que contienen este ADN. Los kits contienen secuencias de ADN homólogas o complementarias con los amplicones, por ejemplo, los descritos en la presente, o con secuencias de ADN homólogas o complementarias con el ADN contenido en los elementos genéticos del transgén de los presentes eventos. Estas secuencias de ADN pueden utilizarse en reacciones de amplificación de ADN o como sondas en un método de hibridación de ADN. Los kits también pueden contener los reactivos y los materiales necesarios para realizar el método de detección.
Una “sonda” es una molécula de ácido nucleico aislada a la cual está unido un marcador detectable o una molécula indicadora convencional (tal como un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente, o enzima). Esta sonda es complementaria con una hebra de un ácido nucleico diana, en el caso de la presente invención con una hebra del ADN genómico procedente de uno de dichos eventos del algodón, tanto de una planta de algodón como de una muestra que incluye ADN del evento. Las sondas incluyen no solo ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos, sino también poliamidas y otros materiales de sondas que se unen específicamente a una secuencia de ADN diana y que pueden utilizarse para detectar la presencia de esa secuencia de ADN diana.
Los “cebadores” son ácidos nucleicos aislados que se asocian a una hebra del ADN diana complementaria mediante hibridación de ácidos nucleicos para formar un híbrido entre el cebador y la hebra de ADN diana, y después se extienden a lo largo de la hebra del ADN diana por medio de una polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa. Las parejas de cebadores se remiten a su uso para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana, por ejemplo, mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos convencionales.
Las sondas y los cebadores generalmente tienen una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476,
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