BR102013001692A2 - evento de algodão tolerante a herbicida pdab4468.18.07.1 - Google Patents

Abstract

evento de algodão tolerante a herbicida pdab4468.18.07.1. a presente invenção refere-se a um evento de algodão pdab4468.18.07.1 compreende genes codificando aad-12 e pat, produzindo tolerância a herbicida para colheitas de algodão contendo o evento, e possibilitando métodos para proteção de colheita.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para EVENTO DE ALGODÃO TOLERANTE A HERBICIDA pDAB4468.18.07.1.

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

Este pedido reivindica o benefício da data de depósito de Núme5 ro Serial de Pedido de Patente Provisional dos Estados Unidos 61/589,602, depositado em de janeiro de 2012, para EVENTO DE ALGODÃO TOLERANTE A HERBICIDA pDAB4468.18.07.1.

ANTECEDENTE

O gene codificando AAD-12 (ariloxialcanoato dioxigenase-12) é 10 capaz de conferir níveis comerciais de tolerância aos herbicidas de ácido fenoxiacético, 2,4-D e MCPA, e os herbicidas de herbicidas de ácido piridilo, 1 xiacético, triclopir e fluroxipir, quando expressos em plantas transgênicas. O > gene codificando PAT (fosfinotricina acetiltransferase) é capaz de conferir tolerância ao terbicida fosfinotricina (glufosinato) quando expresso em plan15 tas transgênicas. PAT tem sido bem sucedidamente expressa em algodão para uso tanto como um marcador selecionável na produção de colheitas transgênicas, quanto para conferir níveis comerciais de tolerância ao herbicida glufosinato em plantas transgênicas.

A expressão de transgenes em plantas é conhecida ser influen20 ciada por sua localização no genoma da planta, talvez devido à estrutura de cromatina (por exemplo, heterocromatina) ou à proximidade de elementos regulatórios transcricionais (por exemplo, realçadores) próximos ao sítio de integração (Weising e outro, Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Ao mesmo tempo em que a presença do transgene em diferentes localizações no ge25 noma influenciará o fenótipo total da planta de diferentes maneiras. Por esta razão, é frequentemente necessário analisar um grande número de eventos transgênicos a fim de identificar um evento transgênico específico caracterizado por expressão ideal de um gene introduzido de interesse. Por exemplo, observou-se em plantas e em outros organismos que pode existir uma ampla variação em níveis de expressão de um gene introduzido entre os eventos. Pode também existir diferenças em padrões espaciais ou temporais de expressão, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em

2/65 vários tecidos de planta, que podem não corresponder aos padrões esperados de elementos regulatórios transcricionais presentes na construção de gene introduzido. Por esta razão, é comum produzir centenas a milhares de diferentes eventos e analisar aqueles eventos para um único evento que tem níveis de expressão de transgene desejados e padrões para os propósitos comerciais. Um evento que tem níveis ou padrões desejados de expressão de transgene é útil para incorporar o transgene em outras bases genéticas por cruzamento sexual usando métodos de reprodução convencionais. A prole de tais cruzamentos mantem as características de expressão de transgene do transformante original. Esta estratégia é usada para assegurar expressão de gene segura em diversas variedades que são abem adaptadas às condições de crescimento.

É desejável ser capaz de detector a presence de um evento particular a fim de determinar se a prole de um cruzamento sexual contem um transgene ou grupo de transgenes de interesse. Além disso, um Método para detector um evento particular seria útil para aquiescer com regulações que requerem a aprovação pré-comércio e rotulagem de alimento ou fibra derivada de plantas de colheita recombinantes, por exemplo, ou para uso em monitoração ambiental, características de monitoração em colheitas no campo, ou monitoração de produtos derivados de uma colheita de safra, bem como para uso na garantia da aquiescência de reuniões submetidas a termos regulatórios ou contratuais.

É possível detectar a presença de um evento transgênico por qualquer método de detecção de ácido nucleico conhecido na técnica incluindo, porém não limitado a, a reação de cadeia de polimerase (PCR) ou Hibridização de DNA usando sondas de ácido nucleico. Estes métodos de detecção geralmente focalizam em elementos genéticos frequentemente usados, tais como promotores, terminadores, genes marcadores, etc., por que para muitas construções de DNA, a região de codificação é alternável. Como um resultado, tais métodos podem não ser úteis para discriminação entre diferentes eventos, particularmente aqueles produzidos usando a mesma construção de DNA ou construções muito similares a menos que a sequên3/65 cia de DNA do DNA de flanqueamento adjacente ao DNA heterólogo inserido seja conhecida. Por exemplo, um ensaio de PCR específico do evento é descrito em Pedido de Patente dos Estados Unidos 2006/0070139 para o evento de milho DAS-59122-7. Seria desejável ter um método simples e dis5 criminativo para a identificação de evento de algodão pDAB4468.18.07.1.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Modalidades da presente invenção referem-se a um novo evento de transformação de algodão transgênico tolerante a herbicida, designado como evento de algodão pDAB4468.18.07.1, compreendendo aad-12e PAT, 10 como descrito aqui, inserido em um sitio específico dentro do genoma de uma célula de algodão. Semente de algodão representativa foi depositada com American Type Culture Collection (ATCC) com o No. de Acessão identificado no parágrafo [0032], O DNA de plantas de algodão contendo este evento inclui as sequências de junção/flanqueamento descritas aqui que ca15 racterizam a localização do DNA inserido no genoma de algodão. SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 são diagnósticos para evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Mais particularmente, sequências que circundam as junções em bp 2885/2886 de SEQ ID NO:1, e bp 147/148 de SEQ ID NO:2 são diagnósticos para evento de algodão pDAB4468.18.07.1. O parágrafo [0012] 20 abaixo descreve exemplos de sequências compreendendo estas junções que são características de DNA de plantas de algodão contendo evento de algodão pDAB4468.18.07.1.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma planta de algodão, ou parte da mesma, que é tolerante a herbicidas de ácido fenoxiacético tais 25 como 2,4-D e MCPA. Em outra modalidade, a invenção fornece uma planta de algodão, ou parte da mesma, que é tolerante aos herbicidas de ácido piridiloxíacético tais como triclopir e fluroxipir. Em uma modalidade adicional a invenção fornece a planta de algodão que tem um genoma compreendendo uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 286730 2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID ΝΟ.Ί; bp 2787-2986 de

SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ

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ID NO:2, e complementos dos mesmos. Em outra modalidade, a invenção fornece semente de tais plantas.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma planta de algodão, ou parte da mesma, que é tolerante a compostos que são convertidos em herbicidas de auxina de fenoxiacetato tais como 2,4-D e MCPA (por exemplo, 2,4-DB, MCPB, etc.). Em uma outra modalidade, a invenção fornece uma planta de algodão, ou parte da mesma, que é tolerante a compostos que são convertidos em herbicidas de ácido piridiloxiacético tais como triclopir e fluroxipir (por exemplo, triclopirB, fluroxipirB, etc.). A porção de ácido butírico presente nos herbicidas de auxila de fenoxiacetato e ácido piridiloxiacético é convertida por meio de β-oxidação na forma fitotóxica dos herbicidas. As formas de ácido butanoico dos herbicidas são em si não herbicidas. Elas são convertidas em sua respectiva forma de ácido por β-oxidação em plantas suscetíveis (isto é, plantas de algodão), e é a forma de ácido acético do herbicida que é fitotóxico. Plantas incapazes de rápida β-oxidação não são prejudicadas pelos herbicidas de ácido butanoico. Entretanto, plantas que são capazes de rápida β-oxidação e podem converter o herbicida de ácido butanoico na forma acética são subsequentemente protegidas por AAD-12. Consequentemente, a invenção fornece a planta de algodão que tem um genoma compreendendo uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos. Em outra modalidade, a invenção fornece semente de tais plantas.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método de controle de ervas daninhas em uma colheita de algodão que compreende aplicar herbicidas de ácido fenoxiacético tais como 2,4-D e MCPA, à colheita de algodão, onde a colheita de algodão compreende plantas de algodão que têm um genoma contendo uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp

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128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos, que são diagnósticos quanto à presença de evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Em outra modalidade, a invenção fornece um método de controle de ervas daninhas em uma colheita de algodão que compreende aplicar herbicidas de ácido piridiloxiacético, tais como triclopir e fluroxipir, à colheita de algodão, onde a colheita de algodão compreende plantas de algodão que têm um genoma contendo uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos, que são diagnósticos quanto à presença de evento de algodão pDAB4468.18.07.1. A presença do gene aad-12 em evento de algodão pDAB4468.18.07.1 confere tolerância aos herbicidas de ácido fenoxiacético e herbicidas de ácido piridiloxiacético.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método de controle de ervas daninhas em uma colheita de algodão que compreende aplicar herbicida glufosinato à colheita de algodão, a referida colheita de algodão compreendendo plantas de algodão que têm um genoma contendo uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos, que são diagnósticos quanto à presença de evento de algodão pDAB4468.18.07.1. A presença do gene pat em evento de algodão pDAB4468.18.07.1 confere tolerância ao herbicida de glufosinato.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método de detectar evento de algodão pDAB4468.18.07.1 em uma amostra compreendendo DNA de algodão, o referido método compreendendo:

a) contactar a referida amostra com um primeiro iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que seletivamente liga-se a uma sequência

6/65 de flanqueamento dentro de bp 1-2885 de SEQ ID NO:1 ou o complemento da mesma, e um segundo iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que seletivamente liga-se a uma sequência de inserção dentro de bp 28863205 de SEQ ID NO:1 ou o complemento da mesma; e ensaiar quanto a um amplicon gerado entre os referidos iniciadores; ou (b) contactar a referida amostra com um primeiro iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que seletivamente liga-se a uma sequência de inserção dentro de bp 1-147 de SEQ ID NO:2 ou o complemento da mesma, e um segundo iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que seletivamente liga-se a uma sequência de flanqueamento within bp 1481049 de SEQ ID NO:2 ou o complemento da mesma; e (c) ensaiar quanto um amplicon gerado entre os referidos iniciadores.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método de detectar evento de algodão pDAB4468.18.07.1 compreendendo:

(a) contatar a referida amostra com um primeiro iniciador que seletivamente liga-se a uma sequência de flanqueamento selecionadas do grupo que consiste em bp 1-2885 de SEQ ID NO:1 e bp 148-1049 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos; e um segundo iniciador que seletivamente liga-se à SEQ ID NO:3, ou o complemento da mesma;

(b) submeter a referida amostra à reação de cadeia de polimerase; e (c) ensaiar quanto um amplicon gerado entre os referidos iniciadores.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método de reprodução de uma planta de algodão compreendendo: cruzar uma primeira planta com uma segunda planta de algodão para produzir uma terceira planta de algodão, a referida primeira planta compreendendo DNA compreendendo one or more sequence selecionadas do grupo que consiste em bp 28672906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ

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ID NO:2, e complementos dos mesmos; e ensaiar a referida terceira planta de algodão quanto à presença de DNA compreendendo uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma molécula de DNA isolada que é diagnóstico para evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Tais moléculas incluem, além de SEQ ID NOS: 1 e 2, moléculas de pelo menos 40 bp de comprimento que compreendem uma sequência de polinucleotídeo que une a junção de bp 2885/2886 de SEQ ID NO:1, e moléculas de pelo menos 40 bp de comprimento que compreendem uma sequência de polinucleotídeo que une a junção de bp 147/148 de SEQ ID NO:2. Exemplos são bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 27872986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1297 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos.

Em outra modalidade, a invenção fornece fibra de algodão, grão, semente, óleo de semente, ou farinha de semente que compreende evento de algodão pDAB4468.18.07.1 na referida fibra, grão, semente, óleo de semente, ou farinha de semente como demonstrado pela referida fibra, grão, semente, óleo de semente, ou farinha de semente compreendendo DNA compreendendo uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos.

Modalidades da invenção também incluem células de planta de algodão e partes de planta incluindo, porém não limitado a, pólen, óvulos, flores, brotos, raízes, e folhas, e núcleos de células vegetativas, células de pólen, semente, óleo de semente e farinha de semente, e células de ovo,

8/65 que contêm evento de algodão pDAB4468.18.07.1.

Em algumas modalidades, evento de algodão pDAB4468.18.07.1 pode ser combinado com outras características, incluindo, por exemplo, outro(s) gene(s) de tolerância a herbicida e/ou proteínas inibitórias de inseto e sequências regulatórias de transcrição (isto é, interferência de RN A, dsRNA, fatores de transcrição, etc). As características adicionais podem ser empilhadas no genoma de planta por meio de reprodução de planta, retransformação da planta transgênica contendo evento de algodão pDAB4468.18.07.1, ou adição de novas características através da integração alvejada por meio de recombinação homóloga.

Outras modalidades incluem a excisão de sequências de polinucleotídeo que compreendem evento de algodão pDAB4468.18.07.1, incluindo por exemplo, o cassete de expressão de gene pat. Na excisão de uma sequência de polinucleotídeo, o evento modificado pode ser realvejado em um sítio cromossômico específico em que sequências de polinucleotídeo adicionais são empilhadas com evento de algodão pDAB4468.18.07.1.

Em uma modalidade, a presente invenção abrange um sítio de alvo cromossômico de algodão localizado no cromossoma 26 do genoma D entre as sequências de flanqueamento mencionadas nas SEQ ID NOS:1 e 2.

Em uma modalidade, a presente invenção abrange um método de preparar uma planta de algodão transgênica compreendendo inserir um ácido nucleico heterólogo em uma posição sobre o cromossoma 26 do genoma D entre as sequências genômicas mencionadas nas SEQ ID NOS:1 e 2, isto é, entre bp 1-2885 de SEQ ID NO:1 e bp 148-1049 de SEQ ID NO:2.

Adicionalmente, modalidades da invenção também fornecem ensaios para detectar a presença do evento objeto em uma amostra (de fibras de algodão, por exemplo). Os ensaios podem ser com base em uma sequência de DNA da construção recombinante, inserida no genoma de algodão, e nas sequências genômicas flanqueando o sítio de inserção. Kits e condições úteis na condução dos ensaios são também fornecidos.

Modalidades da invenção também se referem em parte à clonagem e análise das sequências de DNA das regiões de bordas resultantes da

9/65 inserção de T-DNA de pDAB4468 em linhagens de algodão transgênicas. Estas sequências são únicas. Com base nas sequências de inserção e junção, iniciadores específicos do evento podem ser e foram gerados. Análise de PCR demonstrou que estes eventos podem ser identificados por análise dos amplicons de PCR gerados com estes grupos de iniciador específico do evento. Desse modo, estes e outros procedimentos relacionados podem ser usados para unicamente identificar linhagens de algodão compreendendo o evento da invenção objeto.

Uma modalidade fornece um método de controle de ervas daninhas em uma colheita de algodão que compreende aplicar herbicida de ácido fenoxiacético à colheita de algodão, a referida colheita de algodão compreendendo plantas de algodão compreendendo DNA que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2. Em outro aspecto deste método, o herbicida de ácido fenoxiacético é 2,4-D. Em outro aspecto deste método, o herbicida de ácido fenoxiacético é MCPA.

Uma modalidade fornece um método de controle de ervas daninhas em uma colheita de algodão que compreende aplicar herbicida de ácido piridiloxiacético à colheita de algodão, a referida colheita de algodão compreendendo plantas de algodão compreendendo DNA que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2. Em outro aspecto deste método, o herbicida de ácido piridiloxiacético é triclopir. Em outro aspecto deste método, o herbicida de ácido piridiloxiacético é fluroxipir.

Uma modalidade fornece um método de controle de ervas daninhas em uma colheita de algodão que compreende aplicar herbicida glufosinato à colheita de algodão, a referida colheita de algodão compreendendo

10/65 plantas de algodão compreendendo DNA que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2.

Uma modalidade fornece uma sequência de DNA isolada compreendendo uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2.

Uma modalidade fornece um método de reprodução de uma planta de algodão compreendendo: cruzar uma primeira planta com uma segunda planta de algodão para produzir uma terceira planta de algodão, a referida primeira planta compreendendo DNA compreendendo uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos; e ensaiar a referida terceira planta de algodão quanto à presença de DNA compreendendo uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID ΝΟ.Ί; bp 2787-2986 de SEQ ID ΝΟ.Ί; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos.

Uma modalidade fornece uma molécula de DNA isolada compreendendo uma sequência de junção compreendendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2, e

11/65 complementos dos mesmos.

Uma modalidade fornece uma semente de algodão compreendendo em seu genoma uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em resíduos 2867-2906 de SEQ ID NO:1; resíduos 2837-2936 de SEQ ID NO:1; resíduos 2787-2986 de SEQ ID NO:1; resíduos 2737-3036 de SEQ ID NO:1; resíduos 128-167 de SEQ ID NO:2; resíduos 98-197 de SEQ ID NO:2; resíduos 48-247 de SEQ ID NO:2; e resíduos 1-297 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos. Outra modalidade fornece uma semente de algodão compreendendo em seu genoma AAD-12/PAT evento de algodão pDAB4468.18.07.1 e tendo semente de algodão representativa depositada com American Type Culture Collection sob o No. de Acessão PTA12456. Outra modalidade fornece a planta de algodão produzida cultivando uma semente de algodão de qualquer destas duas modalidades. Outra modalidade fornece uma semente de algodão produzida por esta planta de algodão, em que a referida semente compreende em seu genoma AAD12/PAT evento de algodão pDAB4468.18.07.1 quando presente em uma semente de algodão depositada com American Type Culture Collection sob o No. de Acessão PTA-12456. Outra modalidade fornece uma parte desta planta de algodão, em que a referida parte é selecionada do grupo que consiste em pólen, óvulo, flores, casulos, brotos, raizes, e folhas, e a referida parte compreende AAD-12/PAT evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Outra modalidade fornece uma composição derivada da planta de algodão ou uma parte da mesma, em que a referida composição é um produto de utilidade selecionado do grupo que consiste em farinha de algodão, fibra de algodão, e óleo de algodão.

Em outra modalidade, a planta de algodão compreende uma sequência de DNA tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com os resíduos 2.886 a 9.253 de SEQ ID NO:17. Uma modalidade fornece uma planta de algodão descendente da planta da modalidade acima, em que a referida planta exibe tolerância ao ácido fenoxiacético, ácido piridiloxiacético, e herbicidas de glifosinato, e a referida tolerância é devido à expressão de uma proteína codificada no referido evento ou referido genoma.

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Outra modalidade fornece uma semente de algodão compreendendo um genoma compreendendo uma sequência de DNA tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17. Outra modalidade fornece uma planta produzida cultivando esta semente de algodão.

Uma modalidade fornece uma planta de algodão transgênica ou parte da mesma compreendendo evento de algodão pDAB4468.18.07.1, em que semente de algodão representativa compreendendo evento de algodão pDAB4468.18.07.1 foi depositada com American Type Culture Collection sob o No. de Acessão PTA-12456.

DEPÓSITO DE SEMENTE

Como parte desta descrição, pelo menos 2500 sementes de uma linhagem de algodão compreendendo evento de algodão pDAB4468.18.07.1 foram depositadas e deixadas disponíveis ao público sem restrição (porém submetidas aos direitos de patente), com the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. O depósito, designado como ATCC Deposit No. PTA-12456, foi feito em nome de Dow AgroSciences LLC em 23 de janeiro de 2012. Este depósito foi feito e sera mantido de acordo com e sob os termos do Tratado de Budapest com respeito aos depósitos de semente para os propósitos de procedimento de patente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

SEQ ID NO: 1 é a sequência de borda de flanqueamento de 5' DNA para evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Nucleotídeos 1-2885 são sequências genômicas. Nucleotídeos 2886-3205 são sequências de inserção.

SEQ ID NO: 2 é a sequência de borda de flanqueamento de 3' DNA para evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Nucleotídeos 1-147 são sequências de inserção. Nucleotídeos 148-1049 são sequências genômicas.

SEQ ID NO: 3 é a sequência de DNA de filamento T de pDAB4468, que é mencionada abaixo na Tabela 1.

SEQ ID NO: 4 é iniciador de oligonucleotídeo 3endG1 para confirmação de DNA genômico borda 3'.

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SEQ ID NO: 5 é iniciador de oligonucleotídeo 3endG2 para confirmação de DNA genômico borda 3'.

SEQ ID NO: 6 é iniciador de oligonucleotídeo 3endG3 para confirmação de DNA genômico borda 3’.

SEQ ID NO: 7 é iniciador de oligonucleotídeo 5endG1 para confirmação de DNA genômico borda 5'.

SEQ ID NO:8 é iniciador de oligonucleotídeo 5endG2 para confirmação de DNA genômico borda 5'.

SEQ ID NO:9 é iniciador de oligonucleotídeo 5endG3 para confirmação de DNA genômico borda 5'.

SEQ ID NO:10 é iniciador de oligonucleotídeo 5endG4 para confirmação de DNA genômico borda 5'.

SEQ ID NO:11 é iniciador de oligonucleotídeo 5endT1 para confirmação de DNA genômico borda 5'.

SEQ ID NO: 12 é iniciador de oligonucleotídeo 5endT2 para confirmação de DNA genômico borda 5'.

SEQ ID NO:13 é iniciador de oligonucleotídeo 5endT3 para confirmação de DNA genômico borda 5'.

SEQ ID NO:14 é iniciador de oligonucleotídeo 3endT1 para confirmação de DNA genômico borda 3'.

SEQ ID NO: 15 é iniciador de oligonucleotídeo 3endT2 para confirmação de DNA genômico borda 3’.

SEQ ID NO:16 é iniciador de oligonucleotídeo 3endT3 para confirmação de DNA genômico borda 3'.

SEQ ID NO:17 é a sequência esperada de evento de algodão pDAB4468.18.07.1, incluindo a sequência de flanqueamento genômico 5', inserção de filamento T pDAB4468, e sequência de flanqueamento genômico 3¹.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 é um mapa de plasmídeo de pDAB4468 contendo oscassetes de expressão de gene aad-12 e PAT.

A Figura 2 representa as localizações de iniciador para confirmar

14/65 a sequência de borda 5' e 3' de evento de algodão pDAB4468.18.07.1. MODO(S) PARA REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

Ambas as extremidades da inserção pDAB4468.18.07.1 de evento de algodão foram sequenciadas e caracterizadas. Ensaios específicos de evento foram desenvolvidos. O evento também foi mapeado no genoma de algodão (cromossoma 26 do genoma D). O evento pode ser introgredido em também linhagens de elite.

Tal como aludido acima na seção Antecedentes, a introdução e integração de um transgene em um genoma de planta envolve alguns eventos aleatórios (em consequência, o nome evento para uma determinada inserção que é expressa). Isto é, com muitas técnicas de transformação tais como transformação de Agrobacterium, a transformação biolistica (isto é, pistola de gene), e transformação mediada por carbeto de silício (isto é, WHISKERS), é imprevisível onde no genoma um transgene virá a ser inserido. Desta forma, a identificação do DNA genômico de planta de flanqueamento em ambos os lados da inserção é importante para identificação de uma planta que tem um determinado evento de inserção. Por exemplo, iniciadores de PCR podem ser designados que geram um amplicon de PCR através da região de junção da inserção e do genoma de hospedeiro. Este amplicon de PCR pode ser usado para identificar um tipo único ou distinto de evento de inserção.

Definições e Exemplos são fornecidos aqui para ajudar a descrever modalidades da presente invenção e a guiar aqueles de ordinária versatilidade na técnica a praticar aquelas modalidades. A menos que de outra forma notado, os termos devem ser entendidos de acordo com uso convencional por aqueles de ordinária versatilidade na relevante técnica. A nomenclatura para bases de DNA tal como apresentado em 37 CFR §1.822 é usada.

Tal como usado aqui, o termo progenia denota a descendência de qualquer generação de uma planta origem que compreende evento de algodão pDAB4468.18.07.1.

Um evento transgênico é produzido por transformação de célu15/65

Ias de planta com DNA heterólogo, isto é, uma construção de ácido nucleico que inclui os transgenes de interesse, regeneração de uma população de plantas resultando da inserção do transgene no genoma da planta, e seleção de uma planta particular caracterizada por inserção em uma locação de genoma particular. O termo evento refere-se ao transformante original e progenia do transformante que incluem o DNA heterólogo. O termo evento também refere-se à progenia produzida por um cruzamento exogâmico sexual entre o transformante e outra variedade que inclui o DNA genômico/de transgene. Até depois de cruzamento reversível repetido a uma origem recorrente, o DNA de transgene inserido e DNA genômico de flanqueamento (DNA genômico/de transgene) da origem transformada estão presentes na progenia do cruzamento na mesma locação cromossômica. O termo evento também refere-se um DNA do transformante original e progenia deste compreendendo o DNA inserido e sequência genômica de flanqueamento imediatamente adjacente ao DNA inserido, que seria esperado ser transferido a uma progenia que recebe DNA inserido incluindo o transgene de interesse como o resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e progenia resultando de autofecundação) e uma linhagem parental que não contêm o DNA inserido.

Uma sequência de junção ou sequência de remate transpõe o ponto em que DNA inserido no genoma é ligado ao DNA do genoma nativo de algodão flanqueando o ponto de inserção, a identificação ou detecção de uma ou outras sequências de junção em um material genético de planta sendo suficiente ser diagnóstico para o evento. Incluídos são as sequências de DNA que transpõem as inserções em eventos de algodão descritos aqui e comprimentos similares de DNA de flanqueamento. Exemplos específicos de tais sequências de diagnóstico são fornecidos aqui; entretanto, outras sequências que sobrepõem as junções das inserções, ou as junções das inserções e da sequência genômica, são também diagnósticos e podem ser usados de acordo com modalidades da invenção.

Modalidades da invenção referem-se em parte à identificação de

16/65 evento usando tais flanqueamento, junção, e sequências de inserção. Iniciadores de PCR relacionados e amplicons são incluídos em modalidades da invenção. De acordo com modalidades da invenção tema, métodos de análise de PCR usando amplicons que transpõem através de DNA inserido e seus remates podem ser usados para detectar ou identificar variedades ou linhagens de algodão transgênico comercializado derivadas das linhagens de algodão transgênicas proprietárias tema.

As sequências de flanqueamento/junção são diagnósticos para evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Com base nestas sequências, iniciadores específicos por evento foram gerados. Análise de PCR demonstrou que estas linhagens de algodão podem ser identificadas em diferentes genótipos de algodão por análise dos amplicons de PCR gerados com estes grupos de iniciador específico por evento. Desta forma, estes e outros procedimentos relacionados podem ser usados para unicamente identificar estas linhagens de algodão. As sequências tal como identificadas aqui são únicas.

Técnicas de detecção de modalidades da invenção tema são especialmente úteis em conjunção com reprodução de planta, para determinar que plantas de progenia compreendem um determinado evento, depois que uma planta origem compreendendo um evento de interesse é cruzada com outra linhagem de planta em um esforço para conferir uma ou mais características adicionais de interesse na progenia. Estes métodos de análise de PCR beneficiam programas de reprodução de algodão bem como controle de qualidade, especialmente para sementes de algodão transgênicas comercializadas. Kits de detecção de PCR para estas linhagens de algodão transgênicas podem também agora ser produzidos e usados. Isto é também benéfico para registro de produto e intendência de produto.

Além disso, sequências de algodão/genômicas de flanqueamento podem ser usadas para especificamente identificar a locação genômica de cada inserção. Esta informação pode ser usada para produzir sistemas de marcador molecular específicos para cada evento. Isto pode ser usado para estratégias de reprodução aceleradas e estabelecer dados de ligação.

Ainda além disso, a informação de sequência de flanqueamento

17/65 pode ser usada para estudar e caracterizar processos de integração de transgene, características de sítio de integração genômica, classificação de evento, estabilidade de transgenes e suas sequências de flanqueamento, e expressão de gene (especialmente relacionado a silenciamento de gene, padrões de metilação de transgene, efeitos de posição, e elementos relacionados a expressão potenciais tais como MARS [regiões de ligação de matriz], e outros mais).

Devido a toda a descrição tema, deve ser claro que as modalidades da invenção tema incluem sementes disponíveis sob o No. de Depósito de ATCC identificado no parágrafo [0032], Modalidades da invenção também incluem uma planta de algodão tolerante a herbicida desenvolvida de uma semente depositada com o No. de Depósito de ATCC identificado no parágrafo [0032]. Modalidades da invenção também incluem partes da referida planta, tais como folhas, amostras de tecido, sementes produzidas pela referida planta, pólen, e outros mais (em que estas partes da planta compreendem aad-12 e pat, e SEQ ID NOS: 1 e 2).

Entretanto ainda, modalidades da invenção também incluem plantas descendentes e/ou de progenia de plantas desenvolvidas da semente depositada, de preferência uma planta de algodão resistente a herbicida em que a referida planta possui um genoma compreendendo uma sequência de junção/flanqueamento detectável tal como descrito aqui. Tal como usado aqui, o termo algodão quer dizer Gossypium hirsutum e inclui todas as variedades deste que pode ser reproduzido com uma planta de algodão.

Uma planta de algodão tolerante a herbicida de uma modalidade da invenção pode ser reproduzida primeiro por cruzamento sexualmente de uma planta de algodão parental primária consistindo em uma planta de algodão desenvolvida de semente de qualquer uma das linhagens referidas aqui, e uma planta de algodão parental secundária, desse modo produzindo uma pluralidade de plantas de progenia primárias; em seguida seleção de uma planta de progenia primária que é resistente a glifosinato; autofecundação da planta de progenia primária, desse modo produzindo uma pluralidade de plantas de progenia secundárias; e em seguida seleção das plantas de pro18/65 genia secundárias à planta que é resistente a glifosinato. Estas etapas podem também incluir o cruzamento reversível da planta de progenia primária ou da planta de progenia secundária à planta de algodão parental secundária ou à planta de algodão parental terciária. A colheita de algodão compreendendo sementes de algodão de uma modalidade da invenção, ou progenia deste, pode em seguida ser plantada.

Deve também ser entendido que duas plantas transgênicas diferentes podem também ser combinadas para produzir descendência que contêm dois genes exógenos adicionados independentemente segregantes. Autofecundação de progenia apropriada pode produzir plantas que são homozigóticas para ambos os genes exógenos adicionados. Cruzamento reversível a uma planta parental e cruzamento exogâmico com uma planta não transgênica são também contemplados, quando é propagação vegetativa. Outros métodos de reprodução comumente usados para diferentes características e safras são conhecidos na técnica. A reprodução por cruzamento reversível foi usada para transferir genes para uma característica altamente hereditária simplesmente herdada, em um cultivo homozigótico desejável, que é a origem recorrente. A fonte da característica a ser transferida é chamada a origem do doador. A planta resultante espera-se possuir os atributos da origem recorrente (por exemplo, cultivo) e a característica desejável transferida da origem do doador. Depois do cruzamento inicial, os indivíduos possuindo o fenótipo da origem do doador são selecionados e repetidamente cruzados (cruzamento reversível) à origem recorrente. A planta resultante espera-se possuir os atributos da origem recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejável transferida da origem do doador.

Também, uma planta de algodão tolerante a herbicida de uma modalidade da invenção pode ser transformada com transgenes adicionais usando métodos conhecidos na técnica. Técnicas de transformação tais como transformação de Agrobacterium, a transformação biolística (isto é, pistola de gene), e transformação mediada por carbeto de silício (isto é, WHISKERS), podem ser usadas para trangene(s) adicional(is) introduzido(s) no genoma de evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Seleção e caracterização

19/65 de plantas transgênicas contendo os transgenes recentemente inseridos podem ser concluídas para identificar plantas que contêm um integrante estável do novo transgene além dos genes aad-12 e pat de modalidades da invenção.

As moléculas de DNA de modalidades da presente invenção podem ser usadas como marcadores moleculares em um método de reprodução assistida por marcador (MAB). As moléculas de DNA de modalidades da presente invenção podem ser usadas em métodos (tais como, marcadores de AFLP, marcadores de RFLP, marcadores de RAPD, SNPs, e SSRs) que identificam características agronomicamente úteis geneticamente ligados, tal como é conhecido na técnica. As características de tolerância a herbicida podem ser rastreadas na progenia de um cruzamento com uma planta de algodão de modalidades da invenção tema (ou progenia deste e qualquer outro cultivo ou variedade de algodão) usando os métodos de MAB. As moléculas de DNA são marcadores para esta característica, e métodos de MAB que são bem conhecidos na técnica podem ser usados para rastrear a(s) característica(s) de tolerância a herbicida em plantas de algodão onde pelo menos uma linhagem de algodão de modalidades da invenção tema, ou progenia deste, era uma origem ou ancestral. Os métodos de modalidades da presente invenção podem ser usados para identificar qualquer variedade de algodão possuindo o evento tema.

Métodos de modalidades da invenção tema incluem um método de produção de uma planta de algodão tolerante a herbicida em que o referido método compreende reprodução com uma planta de uma modalidade da invenção tema. Mais especificamente, os referidos métodos podem compreender cruzamento de duas plantas de modalidades da invenção tema, ou uma planta de uma modalidade da invenção tema e qualquer outra planta. Métodos preferidos também compreendem seleção de progenia do referido cruzamento por análise da referida progenia para um evento detectável de acordo com uma modalidade da invenção tema e desempenho varietal favorável (por exemplo, rendimento). Por exemplo, modalidades da invenção tema podem ser usadas para rastrear o evento tema através de ciclos de

20/65 reprodução com plantas compreendendo outras características desejáveis, tais como características agronômicas, tolerância ou resistência à doença, tolerância ou resistência a nematódeo e dado de maturidade. Plantas compreendendo o evento tema e a característica desejada podem ser detectadas, identificadas, selecionadas, e rapidamente usadas em ciclos adicionais de reprodução, por exemplo. O evento tema / característica pode também ser combinado através de reprodução, e rastreado de acordo com modalidades da invenção tema, com também característíca(s) resistente(s) a inseto e/ou com também características de tolerância a herbicida. Modalidades do último são plantas compreendendo o evento tema combinado com os genes cry1F e crylAc, que conferem resistência a Pseudoplusia incluemns (larva da soja), Anticarsia gemmatalis (lagarta da mucuna), Epinotia aporema, Omoides indicatus, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Spodoptera cosmoides, Spodoptera eridania, Heliothis virescens, Heliocoverpa zea, Spilosoma virginica e Elasmopalpus lignosellus, ou com um gene codificando resistência ao herbicida dicamba.

Desta forma, as modalidades da invenção tema podem ser combinadas com, por exemplo, características codificando resistência a glifosato (por exemplo, planta resistente ou EPSPS, GOX, GAT bactéria no), resistência a glifosinato (por exemplo, dsm-2, bar), resistência a herbicida inibidor de acetolactato sintase (ALS) (por exemplo, imidazolinonas [tais como imazetapir], sulfonilureias, sulfonanilida de triazolopirimidina, pirimidiniltiobenzoatos, e outros produtos químicos [Csr1, SurA, e outros]), resistência a bromoxinila (por exemplo, Bxri), resistência a inibidores de enzima HPPD (4-hidroxilfenilpiruvato-dioxigenase), resistência a inibidores de fitoeno desaturase (PDS), resistência a herbicidas inibidores de fotosistema II (por exemplo, psbA), resistência a herbicidas inibidores de fotosistema I, resistência a herbicidas inibidores de protoporfirinogênio oxidase IX (PPO) (por exemplo, PPO-1), resistência a herbicidas de fenilureia (por exemplo, CYP76B1), enzimas degradantes de dicamba (veja, por exemplo, US 20030135879), e outros podem ser sobrepostos sozinhos ou em múltiplas combinações para fornecer a abilidade de eficazmente controlar ou prevenir desvios de erva daninha e/ou

21/65 resistência a qualquer herbicida das classes acima mencionadas.

Adicionalmente, evento de algodão pDAB4468.18.07.1 pode ser combinado com uma ou mais adicional características de entrada (por exemplo, resistência a inseto, resistência a patógeno, ou tolerância a estresse, e outro) ou saída (por exemplo, rendimento aumentado, perfil de óleo melhorado, qualidade de fibra melhorada, e outro). Desta forma, modalidades da invenção tema podem ser usadas para fornecer uma embalagem agronômica completa de qualidade de safra melhorada com a abilidade para controlar flexivelmente e eficazmente ao custo qualquer número de pestes agronômicas.

Métodos para integrar uma sequência de polinucleotídeo dentro de um sítio cromossômico específico de uma célula de planta por meio de recombinação homóloga foram descritos dentro da técnica. Por exemplo, integração específica por sítio tal como descrito na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2009/0111188 A1, descreve o uso de recombinases ou integrases para mediar a introdução de uma sequência de polinucleotídeo doadora em um alvo cromossômico. Além disso, Pedido de Patente Internacional No. WO 2008/021207, descreve recombinação homóloga mediada por lingueta de zinco para integrar uma ou mais sequências de polinucleotídeo doadoras dentro de locações específicas do genoma. O uso de recombinases tais como FLP/FRT tal como descrito em Patente dos Estados Unidos No. 6.720.475, ou CRE/LOX tal como descrito em Patente dos Estados Unidos No. 5.658.772, pode ser utilizado para integrar uma sequência de polinucleotídeo em um sítio cromossômico específico. Finalmente o uso de meganucleases para alvejamento de polinucleotídeos doadores em uma locação cromossômica específica foi descrito em Puchta e outro, PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060.

Outros métodos para integração específica por sítio dentro de células de planta são geralmente conhecidos e aplicável (Kumar e outro, Trends in Plant Sei. 6(4) (2001) pp. 155-159). Além disso, sistemas de recombinação específica por sítio que foram identificados em diversos organismos procarióticos e eucarióticos inferiores podem ser aplicados para uso

22/65 em plantas. Exemplos de tais sistemas incluem, mas não são limitados a: o sistema R/RS recombinase do plasmídeo pSR1 da levedura Zygosaccharomyces rouxii (Araki e outro, (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203), e o sistema Gin/gix de fago Mu (Maeser e Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170176).

Em algumas modalidades da presente invenção, é desejável integrar ou sobrepor um novo transgene(s) em proximidade a um evento transgênico existente. O evento transgênico pode ser considerado um local genômico preferido que foi selecionado com base em características únicas tais como sítio de inserção único, segregação Mendeliana normal e expressão estável, e uma combinação superior de eficácia, incluindo tolerância a herbicida e desempenho agronômico em e através de múltiplas locações ambientais. Os transgenes recentemente integrados devem manter as características de expressão de transgene dos transformantes existentes. Além disso, o desenvolvimento de ensaios para a detecção e confirmação do evento recentemente integrado seria superar quando as sequências de flanqueamento genômicas e locação cromossômica do evento recentemente integrado são já identificadas. Finalmente, a integração de um novo transgene em uma locação cromossômica específica que é ligada a um transgene existente promovería a introgressão dos transgenes em outros antecedentes genéticos por cruzamento exogâmico sexual usando métodos de reprodução convencionais.

Em algumas modalidades da presente invenção, é desejável para excisar sequências de polinucleotídeo de um evento transgênico. Por exemplo, excisão de transgene tal como descrito em Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2011/0191877, emprega nucleases de lingueta de zinco para remover uma sequência de polinucleotídeo, consistindo em um cassete de expressão de gene, de um evento transgênico cromossomicamente integrado. A sequência de polinucleotídeo que é removida pode ser um marcador selecionável. Na excisão e remoção de uma sequência de polinucleotídeo, o evento transgênico modificado pode ser realvejado pela inserção de uma sequência de polinucleotídeo. A excisão de uma sequên23/65 cia de polinucleotídeo e subsequente realvejamento do evento transgênico modificado fornece vantagens tais como reutilização de um marcador selecionável ou a abilidade de superar mudanças não intencionais a transcriptoma de planta que resulta da expressão de genes específicos.

Um sítio específico no cromossoma 26 do genoma D no genoma de algodão que é excelente para inserção de ácidos nucleicos heterólogos é descrito aqui. Desta forma, modalidades da invenção tema fornecem métodos para introduzir ácidos nucleicos heterólogos de interesse neste sítio alvo pré-estabelecido ou na vizinhança deste sítio alvo. Modalidades da invenção tema também abrangem uma semente de algodão e/ou uma planta de algodão compreendendo qualquer sequência de nucleotídeo heteróloga inserida no sítio alvo descrito ou na vizinhança geral de tal sítio. Uma opção para realizar tal integração alvejada é excisar e/ou substituir uma inserção diferente no lugar do cassete de expressão pat exemplificado aqui. A este respeito, recombinação homóloga alvejada, por exemplo, e sem limitação, pode ser usada de acordo com modalidades da invenção tema.

Tal como usado aqui sobreposição de gene, evento ou característica refere-se à combinação de características desejadas em uma linhagem transgênica. Reprodutores de planta sobrepõem características transgênicas por produção de cruzamentos entre origens em que cada uma possui uma característica desejada e em seguida identificação de descendência que ambas têm destas características desejadas. Outro modo para sobrepor genes é por transferência de dois ou mais genes no núcleo celular de uma planta ao mesmo tempo em que durante a transformação. Outro modo para sobrepor genes é por retransformação de uma planta transgênica com outro gene de interesse. Por exemplo, sobreposição de gene pode ser usada para combinar duas ou mais características diferentes, incluindo, por exemplo, duas ou mais diferentes características de inseto, caracteristica(s) de resistência a inseto e característica(s) de resistência a doença, duas ou mais características de resistência a herbicida, e/ou característica(s) de resistência a inseto e característica(s) resistente a herbicida. O uso de um marcador selecionável além de um gene de interesse pode também ser considerado so24/65 breposição de gene.

Recombinação homóloga refere-se a uma reação entre qualquer par de sequências de nucleotídeo possuindo sítios correspondentes contendo uma sequência de nucleotídeo similar através de que as duas sequências de nucleotídeo podem interagir (recombinar) para formar uma nova sequência de DNA recombinante. Os sítios de sequência de nucleotídeo similar são cada um referidos aqui como uma sequência de homologia. Geralmente, a frequência de recombinação homóloga aumenta quando o comprimento da sequência de homologia aumenta. Desta forma, enquanto recombinação homóloga pode ocorrer entre duas sequências de nucleotídeo que são menos do que idênticas, a frequência de recombinação (ou eficiência) declina quando a divergência entre as duas sequências aumenta. A recombinação pode ser realizada usando uma sequência de homologia em cada uma das moléculas doadoras e alvo, desse modo gerando um produto de recombinação cruzamento único. Alternativamente, duas sequências de homologia podem ser colocadas em cada uma das sequências de nucleotídeo alvo e doadoras. Recombinação entre duas sequências de homologia no doador com duas sequências de homologia no alvo gera um produto de recombinação de cruzamento duplo. Se as sequências de homologia na molécula doadora flanqueiam uma sequência que deve ser manipulada (por exemplo, uma sequência de interesse), a recombinação de cruzamento duplo com a molécula alvo resultará em um produto de recombinação em que a sequência de interesse substitui uma sequência de DNA que estava originalmente entre as sequências de homologia na molécula alvo. A permuta de sequência de DNA entre o alvo e doador através de um evento de recombinação de cruzamento duplo é chamada substituição de sequência.

Uma planta preferida, ou uma semente, de modalidades da invenção tema compreende em suas sequências de nucleotídeo aad-12 e pat operadoras de genoma, tal como identificado aqui, junto com pelo menos 20 a 500 ou mais nucleotídeos de flanqueamento contíguos em ambos os lados da inserção, tal como identificado aqui. A menos que indicado de outra forma, referência a sequências de flanqueamento refere-se àquelas identifica25/65 das com respeito a SEQ ID NOS: 1 e 2. Toda ou parte destas sequências de flanqueamento pode ser esperada ser transferida para progenia que recebe o DNA inserido como um resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o evento.

Modalidades da invenção tema incluem culturas de tecido de células regeneráveis de uma planta de uma modalidade da invenção tema. Também incluída é uma planta regerada de tal cultura de tecido, particularmente onde a referida planta é capaz de expressar todas as propriedades morfológicas e fisiológicas de uma variedade exemplificada. Plantas preferidas de modalidades da invenção tema possuem todas as características fisiológicas e morfológicas de uma planta desenvolvida da semente depositada. Modalidades desta invenção também compreendem progenia de tal semente e semente possuindo as características de qualidade de interesse.

Tal como usado aqui, uma linhagem é um grupo de plantas que exibem pequeno ou nenhuma variação genética entre indivíduos para pelo menos uma característica. Tais linhagens podem ser criadas por diversas gerações de autopolinização e seleção, ou propagação vegetativa de uma origem única usando técnicas de cultura de tecido ou célula.

Tal como usado aqui, os termos cultivo e variedade são sinônimos e referem-se a uma linhagem que é usada para produção comercial.

Estabilidade ou estável quer dizer que com respeito ao determinado componente, o componente é mantido de generação a generação e, de preferência, durante pelo menos três gerações.

Utilidade Comercial é definida como possuindo bom vigor de planta e alta fertilidade, de modo que a safra possa ser produzida por fazendeiros usando equipamento de cultivo convencional, e o óleo com os componentes descritos possa ser extraído da semente usando equipamento de moagem e extração convencional.

Agronomicamente elite quer dizer que a linhagem possui características agronômicas desejáveis tais como rendimento, maturidade, resistência a doença, e outros mais, além da tolerância a herbicida devido ao(s) evento(s) tema(s). Qualquer e todas destas características agronômi26/65 cas e pontos de dado podem ser usados para identificar tais plantas, ou como um ponto ou em qualquer extremidade ou ambas as extremidades de uma faixa de características usadas para definir tais plantas.

Tal como aquele versado na técnica reconhecerá devido a esta descrição, modalidades preferidas de kits de detecção, por exemplo, podem incluir sondas e/ou iniciadores direcionados a e/ou compreendendo sequências de junção ou sequências de transição (onde a sequência de flanqueamento genômica de algodão encontra a sequência de inserção). Por exemplo, isto inclui sondas de polinucleotídeo, iniciadores, e/ou amplicons designados para identificar uma ou ambas as sequências de junção (onde a inserção encontra a sequência de flanqueamento). Um esquema comum é possuir um iniciador que hibridiza na região de flanqueamento, e um iniciador que hibridiza na inserção. Tais iniciadores são frequentemente cada um cerca de pelo menos~15 resíduos em comprimento. Com este arranjo, os iniciadores podem ser usados para gerar/amplificar um amplicon detectável que indica a presença de um evento de uma modalidade da invenção tema. Estes iniciadores podem ser usados para gerar um amplicon que transpõe (e inclui) uma sequência de junção tal como indicado acima.

O(s) iniciador(es) de alcance baixo na sequência de flanqueamento é tipicamente não designado hibridizar além de cerca de 1.200 bases ou então além da junção. Desta forma, iniciadores de flanqueamento típico seriam designados para compreender pelo menos 15 resíduos de ou filamento dentro de 1.200 bases nas sequências de flanqueamento do início da inserção. Isto é, iniciadores compreendendo uma sequência de um tamanho apropriado de (ou hibridização a) pares de base 2000 a 3205 de SEQ ID NO:1 e/ou pares de base 1 a 1049 de SEQ ID NO:2 estão dentro do escopo de modalidades da invenção tema. Iniciadores de inserção podem também ser designados em qualquer parte na inserção, mas pares de base 1 a 6368 de SEQ ID NO:3, podem ser usados, por exemplo, não exclusivemente para tal esquema iniciador.

Aquele versado na técnica também reconhecerá que iniciadores e sondas podem ser designados para hibridizar, sob uma faixa de hibridiza27/65 ção padrão e/ou condições de PCR em que o iniciador ou sonda não é perfeitamente complementar à sequência exemplificada. Isto é, algum grau de má combinação ou degeneração pode ser tolerado. Para um iniciador de aproximadamente 20 nucleotídeos, por exemplo, tipicamente um ou dois ou tantos nucleotídeos não necessitam ligar-se com o filamento oposto se a base má combinada é interna ou na extremidade do iniciador que é oposto ao amplicon. Várias condições de hibridização apropriadas são fornecidas abaixo. Análogos de nucleotídeo sintéticos, tais como inosina, podem também ser usados em sondas. Sondas de ácido nucleico de peptídeo (PNA), bem como sondas de DNA e RNA, podem também ser usadas. O que é importante é que tais sondas e iniciadores são diagnósticos para (capazes de unicamente identificar e distinguir) a presença de um evento de uma modalidade da invenção tema.

Deve ser notado que erros em amplificação de PCR podem ocorrer que poderíam resultar em erros de sequenciamento menores, por exemplo. Isto é, a menos que de outra forma indicado, as sequências listadas aqui foram determinadas por geração de longos amplicons de DNAs genômicos de algodão, e em seguida clonagem e sequenciamento dos amplicons. Não é incomum encontrar leves diferenças e discrepâncias menores em sequências geradas e determinadas desta maneira, determinado os muitos ciclos de amplificação que são necessários para gerar amplicon o bastante para sequenciamento de DNAs genômicos. Aquele versado na técnica deve reconhecer e notar que quaisquer ajustes necessários devido a estes tipos de erros de sequenciamento comuns ou discrepâncias estão dentro do escopo de modalidades da invenção tema.

Deve também ser notado que não é incomum para alguma sequência genômica ser deletada, por exemplo, quando uma sequência é inserida durante a criação de um evento. Desta forma, algumas diferenças podem também aparecer entre as sequências de flanqueamento tema e sequências genômicas listadas em GENBANK, por exemplo.

Componentes da inserção de sequência de DNA são ilustrados nas Figuras e são discutidos em mais detalhe abaixo nos Exemplos. As se28/65 quências de polinucleotídeo de DNA destes componentes, ou fragmentos destes, podem ser usados como iniciadores ou sondas de DNA nos métodos de modalidades da presente invenção.

Em algumas modalidades da invenção, composições e métodos são fornecidos para detecção da presença da região de inserção de transgene/genômico, em plantas e sementes e outros mais, de uma planta de algodão. Sequências de DNA são fornecidas que compreendem a sequência de junção de região de inserção de transgene/genômico de tema 5' fornecida aqui (entre pares de base 2885/2886 de SEQ ID NO:1), segmentos desta, e complementos das sequências exemplificadas e quaisquer segmentos destes. Sequências de DNA são fornecidos que compreendem a sequência de junção de região de inserção de transgene/genômico de tema 3' fornecida aqui (entre pares de base 147/148 de SEQ ID NO:2), segmentos desta, e complementos das sequências exemplificadas e quaisquer segmentos destes. A sequência de junção de região de inserção transpõe a junção entre DNA heterólogo inserido no genoma e o DNA da célula de algodão flanqueando o sítio de inserção. Tais sequências podem ser diagnóstico para o determinado evento.

Com base nestas sequências de inserção e remate, iniciadores específicos por evento podem ser gerados. Análise de PCR demonstrou que linhagens de algodão de modalidades da invenção tema podem ser identificada em diferentes genótipos de algodão por análise dos amplicons de PCR gerados com estes grupos de iniciador específico por evento. Estes e outros procedimentos relacionados podem ser usados para unicamente identificar estas linhagens de algodão. Desta forma, amplicons de PCR derivados de tais pares de iniciador são únicos e podem ser usados para identificar estas linhagens de algodão.

Em algumas modalidades, sequências de DNA que compreendem um fragmento contíguo da nova região de inserção de transgene/genômico são um aspecto desta invenção. Incluídas são sequências de DNA que compreendem um comprimento suficiente de polinucleotídeos de sequência de inserção de transgene e um comprimento suficiente de polinu29/65 cleotídeos de sequência genômica de algodão de uma ou mais das plantas de algodão e/ou sequências acima mencionadas que são úteis como sequências de par iniciadora a produção de um diagnóstico de produto de amplicon para uma ou mais destas plantas de algodão.

Modalidades relacionadas pertencem a sequências de DNA que compreendem pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou mais nucleotideos contíguos de uma porção de transgene de uma sequência de DNA identificada aqui (tal como SEQ ID NO:1 e segmentos deste), ou complementos dos mesmos, e um comprimento similar de sequência de DNA de algodão de flanqueamento destas sequências, ou complementos dos mesmos. Tais sequências são úteis como iniciadores de DNA em métodos de amplificação de DNA. Os amplicons produzidos usando estes iniciadores são diagnósticos para qualquer dos eventos de algodão referidos aqui. Por esse motivo, modalidades da invenção também incluem os amplicons produzidos por tais iniciadores de DNA.

Modalidades desta invenção também incluem métodos de detecção da presença de DNA, em uma amostra, que corresponde ao evento de algodão referido aqui. Tais métodos podem compreender: (a) contato da amostra compreendendo DNA com um grupo de iniciador que, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA de pelo menos um deste evento de algodão, produz um amplicon que é diagnóstico para o referido evento(s); (b) desempenho de uma reação de amplificação de ácido nucleico, desse modo produzindo o amplicon; e (c) detecção do amplicon.

Outros métodos de detecção de modalidades da invenção tema incluem um método de detectar a presença de um DNA, em uma amostra, correspondente ao referido evento, em que o referido método compreende: (a) contato da amostra compreendendo DNA com uma sonda que hibridiza sob condições rigorosas de hibridização com DNA do referido evento de algodão e que não hibridiza sob as condições rigorosas de hibridização com uma planta de algodão de controle (não evento de DNA de interesse); (b) submissão da amostra e sonda a condições de hibridização rigorosas; e (c)

30/65 detecção de hibridização da sonda ao DNA.

Entretanto ainda nas modalidades, a invenção tema inclui métodos de produção de uma planta de algodão compreendendo evento de algodão pDAB4468.18.07.1 de uma modalidade da invenção tema, em que o referido método compreende as etapas de: (a) cruzamento sexualmente de uma primeira linhagem de algodão parental (compreendendo um cassete de expressão de uma modalidade da presente invenção, que confere 2,4-D e tolerância de glifosinato a plantas da referida linhagem) e uma segunda linhagem de algodão parental (que é desprovida destas características de tolerância a herbicida) desse modo produzindo uma pluralidade de plantas de progenia; e (b) seleção de uma planta de progenia pelo uso de marcadores moleculares. Tais métodos podem optionalmente compreender a etapa adicional de cruzamento reversível da planta de progenia à segunda linhagem de algodão parental para produção de uma planta de algodão de reprodução verdadeira que compreende as características tolerantes a herbicida.

De acordo com outro aspecto da invenção, métodos de determinação da zigosidade de progenia de um cruzamento com o referido evento são fornecidos. Os referidos métodos podem compreender contato de uma amostra, compreendendo DNA de algodão, com um grupo de iniciador de uma modalidade da invenção tema. Os referidos iniciadores, quando usados em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico dos referidos eventos de algodão, produzem um primeiro amplicon que é diagnóstico para o referido evento de algodão. Tais métodos também compreendem desempenho de uma reação de amplificação de ácido nucleico, desse modo produzindo o primeiro amplicon; detecção do primeiro amplicon; e contato da amostra compreendendo DNA de algodão com um segundo grupo de iniciador (o referido segundo grupo de iniciador, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico de plantas de algodão, produz um segundo amplicon compreendendo uma sequência endógena do DNA genômico de algodão nativo que não contêm a sequência de polinucleotídeo do referido evento); e desempenho de uma reação de amplificação de ácido nucleico, desse modo produzindo o segundo ampli31/65 con. Os métodos também compreendem detecção do segundo amplicon, e comparação do primeiro e segundo amplicons em uma amostra, em que a presença de ambos os amplicons indica a zigosidade da inserção de transgene.

Kits de detecção de DNA podem ser desenvolvidos usando as composições descritas aqui e métodos bem conhecidos na técnica de detecção de DNA. Os kits são úteis para identificação do DNA de evento de algodão tema em uma amostra e podem ser aplicados a métodos para reprodução de plantas de algodão contendo este DNA. Os kits contêm sequências de DNA complementares aos amplicons, por exemplo, descritas aqui, ou às sequências de DNA complementares a DNA contido nos elementos genéticos de transgene dos eventos temas. Estas sequências de DNA podem ser usadas em reações de amplificação de DNA ou como sondas em um método de hibridização de DNA. Os kits podem também conter os reagentes e materiais necessários para o desempenho do método de detecção.

A sonda é uma molécula de ácido nucleico isolada a qual é ligada uma molécula rótulo ou repórter detectável convencional (tal como um isótopo radioativo, ligando, agente quimioluminescente, ou enzima). Uma tal sonda pode hibridizar-se a um filamento de um ácido nucleico alvo, no caso de modalidades da presente invenção, a um filamento de DNA genômico de um dos referidos eventos de algodão, seja de uma planta de algodão ou de uma amostra que inclui DNA do evento. Sondas de acordo com modalidades da presente invenção incluem não apenas ácidos desoxiribonucleicos ou ribonucleicos, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que ligam-se especificamente a uma sequência de DNA alvo e podem ser usados para detectar a presença desta sequência de DNA alvo.

Iniciadores são ácidos nucleicos isolados/sintetizados que são anelados a um filamento de DNA alvo por hibridização de ácido nucleico para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento de DNA alvo, em seguida estendido junto com o filamento de DNA alvo por um polimerase, por exemplo, um DNA polimerase. Pares de iniciador de modalidades da presente invenção referem-se a seu uso para amplificação de uma sequência de áci

32/65 do nucleico alvo, por exemplo, pela reação de cadeia de polimerase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácido nucleico convencionais.

Sondas e iniciadores são geralmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,

14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,33,

34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52,53,

54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73,

74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92,93,

94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110,

	111,	112,	113,	114,	115,	116,	117, 118,	119,	120,	121,	122,	123,	124,	125,
10	126,	127,	128,	129,	130,	131,	132, 133,	134,	135,	136,	137,	138,	139,	140,
	141,	142,	143,	144,	145,	146,	147, 148,	149,	150,	151,	152,	153,	154,	155,
	156,	157,	158,	159,	160,	161,	162, 163,	164,	165,	166,	167,	168,	169,	170,
	171,	172,	173,	174,	175,	176,	177, 178,	179,	180,	181,	182,	183,	184,	185,
	186,	187,	188,	189,	190,	191,	192, 193,	194,	195,	196,	197,	198,	199,	200,
15	201,	202,	203,	204,	205,	206,	207, 208,	209,	210,	211,	212,	213,	214,	215,
	216,	217,	218,	219,	220,	221,	222, 223,	224,	225,	226,	227,	228,	229,	230,
	231,	232,	233,	234,	235,	236,	237, 238,	239,	240,	241,	242,	243,	244,	245,
	246,	247,	248,	249,	250,	251,	252, 253,	254,	255,	256,	257,	258,	259,	260,
	261,	262,	263,	264,	265,	266,	267, 268,	269,	270,	271,	272,	273,	274,	275,
20	276,	277,	278,	279,	280,	281,	282, 283,	284,	285,	286,	287,	288,	289,	290,
	291,	292,	293,	294,	295,	296,	297, 298,	299,	300,	301,	302,	303,	304,	305,
	306,	307,	308,	309,	310,	311,	312, 313,	314,	315,	316,	317,	318,	319,	320,
	321,	322,	323,	324,	325,	326,	327, 328,	329,	330,	331,	332,	333,	334,	335,
	336,	337,	338,	339,	340,	341,	342, 343,	344,	345,	346,	347,	348,	349,	350,
25	351,	352,	353,	354,	355,	356,	357, 358,	359,	360,	361,	362,	363,	364,	365,
	366,	367,	368,	369,	370,	371,	372, 373,	374,	375,	376,	377,	378,	379,	380,
	381,	382,	383,	384,	385,	386,	387, 388,	389,	390,	391,	392,	393,	394,	395,
	396,	397,	398,	399,	400,	401,	402, 403,	404,	405,	406,	407,	408,	409,	410,
	411,	412,	413,	414,	415,	416,	417, 418,	419,	420,	421,	422,	423,	424,	425,
30	426,	427,	428,	429,	430,	431,	432, 433,	434,	435,	436,	437,	438,	439,	440,
	441,	442,	443,	444,	445,	446,	447, 448,	449,	450,	451,	452,	453,	454,	455,
	456,	457,	458,	459,	460,	461,	462, 463,	464,	465,	466,	467,	468,	469,	470,

33/65

471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, ou 1000, ou 2000, ou 5000 polinucleotídeos ou mais em comprimento. Tais sondas e iniciadores hibridizam-se especificamente a uma sequência alvo sob condições de hibridização rigorosas. De preferência, sondas e iniciadores de acordo com modalidades da presente invenção possuem similaridade de sequência completa com a sequência alvo, ainda que sondas diferentes da sequência alvo e que retêm a abilidade de hibridizar-se a sequências alvos possam ser designadas por métodos convencionais.

Métodos para preparo e utilização de sondas e iniciadores são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook e outro, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Pares de iniciador PCR podem ser derivados de a conhecidos sequência, por exemplo, por usando computer programas intended para que propósito.

Iniciadores e sondas com base no DNA de flanqueamento e sequências de inserção descritos aqui podem ser usados para confirmar (e, se necessário, para corrigir) as sequências descritas por métodos convencionais, por exemplo, por reclonagem e sequenciamento de tais sequências.

As sondas de ácido nucleicoo e iniciadores de modalidades da presente invenção hibridizam-se sob condições rigorosas a uma sequência de DNA alvo. Qualquer método de hibridização ou amplificação de ácido convencional nucleico pode ser usado para identificar a presença de DNA de um evento transgênico em uma amostra. Moléculas de ácido nucleico ou fragmentos destas são capazes de hibridização especificamente a outras moléculas de ácido nucleico sob certas circunstâncias. Tal como usado aqui, duas moléculas de ácido nucleico são referidas serem capazes de especificamente hibridizarem para uma outra se as duas moléculas forem capazes de formação de uma estrutura de ácido nucleico de filamento duplo antiparalelo. Uma molécula de ácido nucleico é referida ser o complemento de outra molécula de ácido nucleico se elas exibem complementaridade completa. Tal como usado aqui, moléculas são referidas exibirem complementaridade

34/65 completa quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo do outro. Moléculas que exibem complementaridade completa geralmente hibridizarão uma a outra com suficiente estabilidade para permití-los permanecer anelados um ao outro sob condições de alto rigor convencionais. Condições de alto rigor convencionais são descritas por Sambrook e outro, 1989.

Duas moléculas são referidas exibirem complementaridade mínima se elas podem hibridizar uma a outra com suficiente estabilidade para permiti-las permanecerem aneladas uma a outra sob pelo menos condições de baixo rigor convencionais. Condições rigor baixo de convencionais são descritas por Sambrook e outro, 1989. A fim de uma molécula de ácido nucleico servir como um iniciador ou sonda ela necessita apenas exibir complementaridade mínima de sequência para ser capaz de formar uma estrutura de filamento duplo estável sob o solvente particular e concentrações de sal empregados.

O termo condição rigorosa ou condições de rigor é funcionalmente definido com respeito para à hibridização de uma sonda de ácido nucleico a um ácido nucleico alvo (isto é, a uma sequência de ácido nucleico particular de interesse) pelo procedimento de hibridização especifico discutido em Sambrook e outro, 1989, em 9.52-9.55. Veja também, Sambrook e outro, 1989 em 9.47-9.52 e 9.56-9.58.

Dependendo do pedido considerado, alguém pode usar condições variantes de condições rigorosas ou degeneração de sequência de polinucleotídeo de uma sonda ou par iniciador obter graus variantes de seletividade de hibridização para a sequência alvo. Para pedidos requerendo alta seletividade, alguém tipicamente empregará condições relativomente rigorosas para hibridização de uma sequência de polinucleotídeo com uma segunda sequência de polinucleotídeo, por exemplo, alguém selecionará sal relativomente baixo e/ou condições de temperatura elevada, tal como fornecido por cerca de 0,02 M a cerca de 0,15 M de NaCI em temperaturas de cerca de 50°C a cerca de 70°C. Condições rigorosas, por exemplo, podem envolver lavagem do filtro de hibridização pelo menos duas vezes com tampão de

35/65 lavagem de alto rigor (0.2X SSC, 0,1% SDS, 65°C). Condições de rigor apropriadas que promovem hibridização de DNA, por exemplo, 6.0X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em cerca de 45 C, seguido por uma lavagem de 2.0X SSC em 50°C são conhecidos àqueles versados na técnica. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de um rigor baixo de cerca de 2.0X SSC em 50°C a um alto rigor de cerca de 0.2X SSC em 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de rigor baixas em temperatura ambiente, cerca de 22°C, a condições de alto rigor em cerca de 65°C. Tanto temperatura quanto sal podem ser variados, ou qualquer um, a temperatura ou a concentração de sal pode ser mantido constante enquanto a outra variável é mudada. Tais condições seletivas toleram pequena, se existir, má combinação entre a sonda e o padrão ou filamento alvo. Detecção de sequências de DNA por meio de hibridização é bem conhecida àqueles de versatilidade na técnica, e os ensinamentos de Patente dos Estados Unidos Nos. 4.965.188 e 5.176.995 são exemplares dos métodos de análises de hibridização.

Em uma modalidade particularmente preferida, um ácido nucleico de uma modalidade da presente invenção especificamente hibridizará a um ou mais dos iniciadores (ou amplicons ou outras sequências) exemplificados ou sugeridos aqui, incluindo complementos e fragmentos deste, sob condições de alto rigor. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora de uma modalidade da presente invenção possui a sequência de ácido nucleico tal como apresentado aqui em uma das sequências exemplificadas, ou complementos e/ou fragmentos deste.

Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora de uma modalidade da presente invenção compartilha entre 80% e 100% ou 90% e 100% de identidade de sequência com tais sequências de ácido nucleico. Em um aspecto adicional da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora de uma modalidade da presente invenção compartilha entre 95% e 100% de identidade de sequência com tais sequências. Tais sequências podem ser usadas como marcadores em métodos de reprodução de planta para identificar a progenia de cruzamentos

36/65 genéticos. A hibridização da sonda à molécula de DNA alvo pode ser detectada por qualquer número de métodos conhecidos àqueles versados na técnica; estes podem incluir, mas não são limitados a, rótulos fluorescentes, rótulos radioativos, rótulos com base em anticorpo, e rótulos quimioluminescentes.

Com relação à amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, por PCR) usando um par iniciador de amplificação particular, condições rigorosas são condições que permitem o par iniciador hibridizar apenas à sequência de ácido nucleico alvo a que um iniciador possuindo a sequência do tipo silvestre correspondente (ou seu complemento) se ligaria e de preferência produzir um produto de amplificação único, o amplicon.

O termo específico para (uma sequência alvo)” indica que uma sonda ou iniciador hibridiza sob condições de hibridização rigorosas apenas à sequência alvo em uma amostra compreendendo a sequência alvo.

Tal como usado aqui, DNA amplificado ou amplicon refere-se ao produto de amplificação de ácido nucleico de uma sequência de ácido nucleico alvo que é parte de um padrão de ácido nucleico. Por exemplo, para determinar se a planta de algodão resultando de um cruzamento sexual contém DNA genômico de evento transgênico da planta de algodão de uma modalidade da presente invenção, DNA extraído de uma amostra de tecido de planta de algodão pode ser submetido a método de amplificação de ácido nucleico usando um par iniciador que inclui um iniciador derivado de sequência de flanqueamento no genoma da planta adjacente ao sítio de inserção de DNA heterólogo inserido, e um segundo iniciador derivado do DNA heterólogo inserido para produzir um amplicon que é diagnóstico quanto à presença do evento DNA. O amplicon é de um comprimento e possui a sequência que é também diagnóstico para o evento. O amplicon pode variar de comprimento do comprimento combinado dos pares de iniciador mais um par de base de nucleotídeo, e/ou o comprimento combinado dos pares de iniciador mais cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,

37/65

40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,59,

60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,79,

80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,99,

	100,	101,	102,	103,	104,	105,	106,	107,	108,	109,	110,	111,	112,	113,	114,
5	115,	116,	117,	118,	119,	120,	121,	122,	123,	124,	125,	126,	127,	128,	129,
	130,	131,	132,	133,	134,	135,	136,	137,	138,	139,	140,	141,	142,	143,	144,
	145,	146,	147,	148,	149,	150,	151,	152,	153,	154,	155,	156,	157,	158,	159,
	160,	161,	162,	163,	164,	165,	166,	167,	168,	169,	170,	171,	172,	173,	174,
	175,	176,	177,	178,	179,	180,	181,	182,	183,	184,	185,	186,	187,	188,	189,
10	190,	191,	192,	193,	194,	195,	196,	197,	198,	199,	200,	201,	202,	203,	204,
	205,	206,	207,	208,	209,	210,	211,	212,	213,	214,	215,	216,	217,	218,	219,
	220,	221,	222,	223,	224,	225,	226,	227,	228,	229,	230,	231,	232,	233,	234,
	235,	236,	237,	238,	239,	240,	241,	242,	243,	244,	245,	246,	247,	248,	249,
	250,	251,	252,	253,	254,	255,	256,	257,	258,	259,	260,	261,	262,	263,	264,
15	265,	266,	267,	268,	269,	270,	271,	272,	273,	274,	275,	276,	277,	278,	279,
	280,	281,	282,	283,	284,	285,	286,	287,	288,	289,	290,	291,	292,	293,	294,
	295,	296,	297,	298,	299,	300,	301,	302,	303,	304,	305,	306,	307,	308,	309,
	310,	311,	312,	313,	314,	315,	316,	317,	318,	319,	320,	321,	322,	323,	324,
	325,	326,	327,	328,	329,	330,	331,	332,	333,	334,	335,	336,	337,	338,	339,
20	340,	341,	342,	343,	344,	345,	346,	347,	348,	349,	350,	351,	352,	353,	354,
	355,	356,	357,	358,	359,	360,	361,	362,	363,	364,	365,	366,	367,	368,	369,
	370,	371,	372,	373,	374,	375,	376,	377,	378,	379,	380,	381,	382,	383,	384,
	385,	386,	387,	388,	389,	390,	391,	392,	393,	394,	395,	396,	397,	398,	399,
	400,	401,	402,	403,	404,	405,	406,	407,	408,	409,	410,	411,	412,	413,	414,
25	415,	416,	417,	418,	419,	420,	421,	422,	423,	424,	425,	426,	427,	428,	429,
	430,	431,	432,	433,	434,	435,	436,	437,	438,	439,	440,	441,	442,	443,	444,
	445,	446,	447,	448,	449,	450,	451,	452,	453,	454,	455,	456,	457,	458,	459,
	460,	461,	462,	463,	464,	465,	466,	467,	468,	469,	470,	471,	472,	473,	474,
	475,	476,	477,	478,	479,	480,	481,	482,	483,	484,	485,	486,	487,	488,	489,
30	490,	491,	492,	493,	494,	495,	496,	497,	498,	499,	ou 500, 750, 1C	>00, 1	250,

1500, 1750, 2000, ou mais pares de base de nucleotídeo (mais ou menos qualquer dos incrementos listados acima). Alternativamente, um par iniciador

38/65 pode ser derivado de sequência de flanqueamento em ambos os lados do DNA inserido a fim de produzir um amplicon que inclui a sequência de nucleotídeo de inserção inteira. Um membro de um par iniciador derivado da sequência genômica de planta pode ser localizado em uma distância da sequência de DNA inserido. Esta distância pode variar de um par de base de nucleotídeo até cerca de vinte mil pares de base de nucleotídeo. O uso do termo amplicon especificamente exclui dímeros iniciadores que podem ser formados na reação de amplificação térmica de DNA.

Amplificação de ácido nucleico pode ser realizada por qualquer dos vários métodos de amplificação de ácido nucleico conhecidos na técnica, incluindo a reação de cadeia de polimerase (PCR). Uma variedade de métodos de amplificação são conhecidos na técnica e são descritos, entre outros, em Patente dos Estados Unidos No. 4.683.195 e Patente dos Estados Unidos No. 4.683.202. Métodos de amplificação de PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 kb de DNA genômico. Estes métodos bem como outros métodos conhecidos na técnica de amplificação de DNA podem ser usados na prática de modalidades da presente invenção. A sequência da inserção de DNA de transgene heterólogo ou sequência genômica de flanqueamento de um evento de algodão tema pode ser verificada (e corrigida se necessário) por amplificação de tais sequências do evento usando iniciadores derivados das sequências fornecidas aqui seguido por sequenciamento de DNA padrão do amplicon de PCR ou do DNA clonado.

O amplicon produzido por estes métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas. Eletroforese de gel de agarose e manchamento com brometo de etídio é um método bem conhecido comum de detecção de amplicons de DNA. Outro tal método é Análise de Pedaço Genético, onde um oligonucleotideo de DNA é designado que sobrepõe tanto a sequência de DNA genômico de flanqueamento adjacente quanto a sequência de DNA inserido. O oligonucleotideo é imobilizado em cavidades de uma placa de microcavidade. Seguinte a PCR da região de interesse (usando um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica de flanqueamento adjacente), um produto de PCR de filamento único pode ser hibridizado ao oligo39/65 nucleotídeo imobilizado e servir como um padrão para uma reação de extensão de base única usando um DNA polimerase e ddNTPs rotulados específico para a próxima base esperada. Análise de um produto ligado pode ser concluída por meio de quantificação da quantidade de sinal fluorescente. Um sinal fluorescente indica presença da sequência de inserção/flanqueamento devido à amplificação bem sucedida, hibridização, e extensão de base única.

Outro método é a técnica de Pirosequenciamento tal como descrito por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Neste método um oligonucleotídeo é designado que sobrepõe o DNA genômico adjacente e junção de DNA de inserção. O oligonucleotídeo é designado hibridizar um produto de PCR de filamento único da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica de flanqueamento) e incubado na presença de um DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, fosfosulfato de adenosina 5' e luciferina. DNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal de luz que é Medido. Um sinal de luz indica a presença da sequência de inserção/flanqueamento de transgene devido à amplificação bem sucedida, hibridização, e extensão base única ou múltiplas.

Polarização de fluorescência é outro método que pode ser usado para detectar um amplicon de uma modalidade da presente invenção. Seguinte a este método, um oligonucleotídeo é designado que sobrepõe o flanqueamento genômico e junção de DNA inserido. O oligonucleotídeo é hibridizado ao produto de PCR de filamento único da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na sequência de DNA genômico de flanqueamento) e incubado na presença de um DNA polimerase e um ddNTP rotulado por fluorescente. Extensão de base única resulta em incorporação do ddNTP. Incorporação do ddNTP fluorescentemente rotulado pode ser medido como uma mudança em polarização usando um fluorômetro. Uma mudança em polarização indica a presença da sequência de inserção/flanqueamento de transgene devido à amplificação bem sucedida, hibridização, e extensão de base única.

TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) é um

40/65 método de detectação e quantificação da presença de uma sequência de DNA. Resumidamente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é designada que sobrepõe o flanqueamento genômico e junção de DNA de inserção. A sonda de FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de inserção de DNA e um na sequência genômica de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Durante a amplificação específica, o mecanismo de revisão de DNA polimerase de Taq libera ao porção fluorescente longe da porção de extinção na sonda de FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserção de flanqueamento/transgene devido à amplificação bem sucedida e hibridização.

Molecular Beacons foi descrito para uso em detecção de sequência de polinucleotídeo. Resumidamente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é designada que sobrepõe a junção genômica de flanqueamento e de DNA de inserção. A estrutura única da sonda de FRET resulta em conter estrutura secundária que mantém as porções fluorescentes e de extinção em estreita proximidade. A sonda de FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência genômica de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Seguinte a amplificação de PCR bem sucedida, hibridização da sonda de FRET à sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária de sonda e separação espacial das porções fluorescentes e de extinção. Um sinaí fluorescente resulta. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserção genômico/de transgene de flanqueamento devido à amplificação e hibridização bem sucedida.

Tendo descrito uma locação no genoma de algodão que é excelente para uma inserção, modalidades da invenção tema também compreendem uma semente de algodão e/ou uma planta de algodão compreendendo pelo menos uma inserção de evento de não algodão pDAB4468.18.07.1 na vizinhança geral deste locação genômica. Uma opção é substituir uma inserção diferente no lugar daquela de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 exemplificado aqui. Em geral, recombinação homóloga alvejada, por exemplo, é empregada em modalidades particulares. Este tipo

41/65 de tecnologia é o tema de, por exemplo, WO 03/080809 A2 e o correspondente Pedido dos Estados Unidos publicado (US 20030232410). Desta forma, modalidades da invenção tema incluem plantas e células de planta compreendendo uma inserção heteróloga (em vez de ou com multi-cópias do genes aad-12 ou pat), flanqueada por toda ou uma parte reconhecível das sequências de flanqueamento identificadas aqui (bp 1-2885 de SEQ ID NO:1 e bp 148-1049 de SEQ ID NO:2). Uma cópia adicional (ou cópias adicionais) de um gene aad-12 ou pat pode também ser alvejado para inserção nesta / destas maneira(s).

Os seguintes Exemplos são incluídos para ilustrar procedimentos para praticar modalidades da invenção e para demonstrar certas modalidades preferidas da invenção. Estes exemplos não devem ser considerados como limitantes. Deve ser apreciado por aqueles de versatilidade na técnica que as técnicas descritas nos seguintes exemplos representam metodologias específicas usadas para ilustrar modos preferidos para sua prática. Entretanto, aqueles de versatilidade na técnica devem, à luz da presente descrição, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nestas modalidades específicas enquanto ainda obtendo resultados iguais ou similares sem afastamento do espírito e escopo da invenção. A menos que de outra forma indicado, todas as porcentagens são em peso e todas as proporções de mistura de solvente são em volume a menos que de outra forma notado.

As seguintes abreviações são usadas a menos que de outra forma indicado.

bp	par de base
°C	graus Celsius
DNA	ácido desoxiribonucleico
EDTA	ácido etilenodiaminatetraacético
kb	quilobase
P9	micrograma
pL	microlitro
mL	mililitro
M	massa molar

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PCR reação de cadeia de polimerase

PTU unidade de transcrição de planta ou cassete de expressão

SDS dodecilsulfato de sódio

SSC uma solução de tampão contendo uma mistura de cloreto de sódio e citrato de sódio, pH 7,0

TBE uma solução de tampão contendo uma mistura de Tris base, ácido bórico e EDTA, pH 8,3

EXEMPLOS

Exemplo 1: Transformação e Seleção do Evento de Algodão aad-12 e pat PDAB4468.18.07.1

Algodão transgênico (Gossypium hirsutum) contendo o evento de algodão pDAB4468.18.07.1 foi gerado através de transformação mediada por Agrobacterium e selecionado usando meio contendo glifosinato. Uma cepa de Agrobacterium desarmada EHA101 (Hood e outro, 1993), portando o vector binário pDAB4468 (Figura 1) contendo o marcador selecionável, pat, e o gene de interesse, aad-12, dentro da região de DNA de filamento T, foi usada para iniciar transformação de planta de variedade de algodão, Coker 310. A sequência de filamento T de DNA para pDAB4468 é determinada em SEQ ID NO:3, e é mencionada abaixo na Tabela 1.

Tabela 1: Elementos de gene localizados no pDAB4468.

bp (SEQ ID NO:3)	Elemento de construção	Referência
139 - 1,304 bp	RB7 MAR v3	Thompson e outro, 1997, WO9727207
1,400-2,721 bp	AtUbilO Promove	Callis, e outro, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493
2,730-3,611 bp	AAD-12	WO 2007/053482
3,714-4,170 bp	ORF23 3’UTR	U.S. Pat. No. 5,428,147
4,285-4,801 bp	CsVMV Promove	Verdaguer e outro, (1996) Planta Mol. Biol., 31: 1129-1139
4,809 - 5,360 bp	PAT	Wohlleben e outro, (1988) Gene 70: 25-37
5,463-6,166 bp	ORF1 3'UTR	Huang e outro, (1990) J. Bacteriol. 172:1814-1822

43/65

Exemplo 2: Caracterização de Proteína AAD-12 de Evento de algodão PÜAB4468.18.07.1

As propriedades bioquímicas da proteína AAD-12 recombinante derivada do evento transgênico de algodão pDAB4468.18.07.1 foram caracterizadas. Ensaio imunossorvente ligado a enzima quantitativo (ELISA) foi usado para caracterizar as propriedades bioquímicas da proteína e confirmar expressão de proteína AAD-12.

Níveis de proteína AAD-12 foram determinados em evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Amostras de tecido de folha de algodão foram isoladas das plantas de teste e preparadas para análise de expressão. A proteína AAD-12 foi extraída de tecidos de planta de algodão com uma solução de Tris-HCI contendo o detergente Brij-56™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). O tecido de planta foi centrifugado; o sobrenadante aquoso foi coletado, diluído com tampão apropriado quando necessário, e analisado usando um kit de ELISA AAD-12 (Beacon Diagnostics, East Falmouth, MA) em um formato de sanduíche. O kit foi usado seguinte ao protocolo sugerido do fabricante.

Análise de detecção foi desempenhada para investigar a estabilidade de expressão e herdabilidade tanto verticalmente (entre gerações) quanto horizontalmente (entre linhagens da mesma geração) em evento de algodão pDAB4468.18.07.1. A expressão de proteína AAD-12 de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 era estável (não segregante) e consistente através de todas as linhagens.

Níveis de expressão de proteína AAD-12 quando comparado verticalmente (entre gerações) foram determinados para plantas de evento de algodão desenvolvido em estufa pDAB4468.18.07.1. Níveis de expressão foram consistentes e estáveis através das gerações T₃-T₄ com níveis de expressão médios de aproximadamente 125 a 140 ng/cm² de proteína AAD-12 isolada.

Níveis de expressão de proteína AAD-12 quando comparado horizontalmente (entre linhagens da mesma geração) foram determinados para plantas de evento de algodão desenvolvido em campo pDAB4468.18.07.1.

44/65 estudos de nível de expressão em campo foram desempenhados em diversas plantas de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 que compreendiam a geração T₄. Os níveis médios de expressão de proteína foram consistentes e estáveis em aproximadamente 50-150 ng/cm² de proteína AAD-12 isolada.

Exemplo 3: Clonagem e Caracterização de Regiões de Remate de Flanqueamento Genômico de Evento de Algodão pDAB4468.18.07.1

Regiões de remate de flanqueamento genômico que são adjacentes à inserção de filamento T de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 foram isoladas, clonadas, e caracterizadas. Para caracterizar as regiões de remate e descrever o sítio de inserção genômica, as regiões de flanqueamento genômico de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 foram isoladas, compreendendo 2,885 bp da sequência de remate de flanqueamento genômica 5' (SEQ ID NO:1) e 902 bp da sequência de remate de flanqueamento genômica 3' (SEQ ID NO:2). As sequências de remate de flanqueamento genômica de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 foram BLASTada contra a base de dados de nucleotídeo de NCBI para confirmar que estas regiões eram de origem de algodão. Um BLAST do remate de flanqueamento 3' indicou que esta sequência parcialmente alinhou-se a dois diferentes Clones de BAC (Gossypium hirsutum MX146F18 e Gossypium arboretum GM006001). Além disso, a pesquisa de BLAST indicou que o evento de algodão pDAB4468.18.07.1 foi localizado no genoma de algodão no cromossoma 26 do genoma D. Em geral, a caracterização da sequência de remate de flanqueamento genômica de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 indicou que a cópia do filamento T de pDAB4468 estava presente no genoma de algodão.

Exemplo 3.1: Confirmação de Seguências Genômicas de Algodão

Para confirmar a sequência do sítio de inserção genômica de evento de algodão pDAB4468.18.07.1, uma Reação de Cadeia de Polimerase (PCR) foi realizada com diferentes pares de iniciadores (Figura 2 e Tabela 2 e Tabela 3). DNA genômico de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 e outras linhagens de controle de algodão transgênico ou não transgênico foram usados como um padrão. O kit LA Taq PCR® foi usado para as reações (TaKaRa, Japan).

45/65

Tabela 2: iniciadores de PCR e sequências usadas para analisar Evento de algodão pDAB4468.18.07.1

	Ό
	r>
	_o	CO
	o	1—
	o	Φ
	E
r>	'O c: Φ	t— u c:
	o	Φ
cn Ό	<	CO
CL		E
p	Q	O
CL	0)	ω
	o	o
	o «O O m	u ra ω ZJ
	E	CO
	c
	o
	o

46/65

Tabela 3: Condiçoes de PCR e mistura de reação para amplificação de regiões de remate e sequências específicas por evento em evento de algodão PDAB4468.18.07.1.

Reagente	Quantidade (pL) de Reagente	Parâmetros de Ciclização de PCR
LA Tampão + MgCI2	5.0
dNTP's em 2.5mM	8.0	95°C 5 min
Genoma Iniciador (10pM)	1.0	98°C 10s Ί
Transgene Iniciador (10μΜ)	1.0	60°C 30s 35 X
10% PVP	0.5	72°C 4 min J
La Taq Polimerase	0.5	72°C 10 min
h2o	31.5	4°C hold
DNA (20 ng/pL)	2.5
Volume Total	50,0

As sequências de remate de flanqueamento genômicas 5' foram

PCR amplificadas e sequenciadas. Estas reações usaram iniciadores específicos por cassete de expressão aad-12, (por exemplo, 5endT1, 5endT2 e 5endT3) e iniciadores designados de acordo com a sequência de remate de extremidade 5' clonada obtida do genoma de algodão (por exemplo, 5endG1 e 5end G2 e 5endG3) para amplificação de um segmento de DNA genômico que transpõe o gene aad-12 e sequência de remate de extremidade de flanqueamento genômica 5'. Similarmente, para confirmação da sequência de remate de flanqueamento genômica 3' clonada, iniciadores específico por cassete de expressão pat, (por exemplo, 3endT1, 3endT2 e 3endT3) e iniciadores designados de acordo com a sequência de remate de extremidade 3' clonada (por exemplo, 3endG1, 3endG2 e 3endG3) foram usados para amplificar um segmento de DNA genômico que transpõe o gene pat e a sequência de remate de extremidade de flanqueamento genômica 3'. Fragmentos de DNA de tamanho esperado foram amplificados do DNA genômico de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 com cada par iniciador (um iniciador localizado no remate de flanqueamento de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 e um iniciador específico por transgene). As amostras de controle (outras linhagens de algodão transgênicas ou linhagem de controle

47/65 não transgênico, Coker 310) não produzem amplicons de PCR usando estes iniciadores. Os amplicons de PCR foram subclonados em plasmídeos e sequenciados. Este dado foi usado para determinar as sequências de remate de flanqueamento genômicas 5' e 3' localizadas adjacentes à inserção de filamento T de evento de algodão pDAB4468.18.07.1.

Exemplo 4: Evento de Algodão pDAB4468.18.07.1 Caracterização por Manchamento do Sul

Análise de manchamento do Sul foi usada para estabelecer o padrão de integração de evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Estes experimentos geraram dados que demonstraram a integração e integridade dos transgenes aad-12, e pat no genoma de algodão. Evento de algodão pDAB4468.18.07.1 foi caracterizado como um evento de integração simples de tamanho natural contendo uma cópia única do cassete de expressão aad12 e pat de plasmídeo pDAB4468.

Dado de manchamento do Sul dado sugeriu que um fragmento de filamento T inseriu-se no genoma de evento de algodão pDAB4468. Análise de manchamento do Sul detalhada foi conduzida usando uma sonda específica aos genes aad-12 e pat, contida na região de integração de filamento T de pDAB4468, e enzimas de restrição descritivas que têm sítios de divagem localizados dentro do plasmídeo e produzem fragmentos de hibridização internos ao plasmídeo ou fragmentos que transpõem a junção do plasmídeo e DNA genômico de algodão (fragmentos de remate). Os pesos moleculares indicados da hibridização do Sul para a combinação das enzimas de restrição e as sondas foram únicos para o evento, e estabeleceram seu padrão de identificação. Estas análises também mostraram que o fragmento de filamento T pDAB4468 foi inserido no DNA genômico de algodão sem rearranjos dos cassetes de expressão aad-12 ou pat.

Exemplo 4.1: Coleta de Amostra de Folha de Algodão e Isolamento de DNA Genômico

DNA genômico foi extraído de tecido de folha coletada de plantas de algodão individuais contendo evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Além disso, gDNA foi isolado de uma planta de algodão convencional, Coker

48/65

310, que contém os antecedentes genéticos que é representativo da linhagem de algodão usada para transformação e não contém os genes aad-12 e pat. DNA genômico individual foi extraído de tecido de folha liofilizado seguinte ao protocolo do fabricante padrão usando o Kit® de Extração de DNA Qiagen Dneasy Mini Prep (Qiagen, CA). Seguinte a extração, o DNA foi quantificado espectrofluorometricamente usando reagente Pico Green® (Invitrogen, Carlsbad, CA) e utilizando a instrumentação Nanodrop® (Invitrogen). O DNA foi em seguida visualizado em um gel de agarose para confirmar valores da análise de Pico Green® e para determinar a qualidade de DNA.

Exemplo 4.2: Digestão e Separação de qDNA

Para caracterização de manchamento do Sul de evento de algodão pDAB4468.18.07.1, dez microgramas (10 pg) de DNA genômico foram digeridos. DNA genômico de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 e a linhagem de algodão não transgênica, Coker 310, foram digeridos por adição de aproximadamente 10 unidades de enzima de restrição selecionada por pg de DNA e o correspondente tampão de reação para cada amostra de DNA. Cada amostra foi incubada em aproximadamente 37°C durante a noite. As enzimas de restrição Nsil, Ncol, Sbfll, Swal, e Ndel foram usadas individualmente para as reações de digestão (New England Biolabs, Ipswich, MA). Além disso, uma amostra de controle de hibridização positiva foi preparada por combinação de DNA de plasmideo, pDAB4468, com DNA genômico da variedade de algodão não transgênico, Coker310. O coquetel de DNA de plasmideo / DNA genômico foi digerido usando os mesmos procedimentos e enzima de restrição como as amostras de teste. Depois que as digestões foram incubadas durante a noite, NaCI foi adicionado a uma concentração final de 0,1 M para parar a reação de restrição de enzima de digestão. As amostras de DNA digeridas foram precipitadas com isopropanol. A pélete de DNA precipitada foi resuspensa em 15 pl de 3X tampão de carga (0,01% azul de bromofenol, 10,0 mM EDTA, 5.0% glicerol, 1.0 mM Tris pH 7,5). As amostras de DNA e marcador de tamanho molecular foram em seguida eletroforesados através de 0,85% géis de agarose com 0,4X tampão de TAE

49/65 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) em 45 volts durante aproximadamente 18 a 22 horas para obter separação de fragmento. Os géis foram manchados com brometo de etídio (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o DNA foi visualizado sob luz de ultravioleta (UV).

Exemplo 4.3: Tratamento de Membrana e Transferência do Sul

Análise de manchamento do Sul foi desempenhada essencialmente tal como descrito por Memelink, J., Swords, K., Harry J., Hoge, C., (1994) Southern, Northern, e Western Blot Analysis. PlantaMol. Biol. Manual F1:1-23. Resumidamente, seguinte a separação eletroforética e visualização 10 dos fragmentos de DNA, os géis foram desnaturados com 1X Solução de Desnaturação (1.5 M NaOH, 20 mM EDTA) durante exatamente 20 minutos, e em seguida lavados com 1X Solução de Neutralização (1.5 M NaPO₄, pH 7,8) durante pelo menos 20 minutos. Transferência do Sul foi desempenhada durante a noite em membranas de náilon usando um sistema de pavio 15 com 1X solução de Transferência (0.25 M Pirofosfato de Sódio, pH 10). Depois de transferência, o DNA foi ligado à membrana por aquecimento em 65°C durante 1 hora ou por reticulação por UV seguido por lavagem brevemente de membrana com 1X solução de Transferência. Este processo produziu membranas de Manchamento do Sul prontas para hibridização.

Exemplo 4.4: Rotulação e Hibridização de Sonda de DNA

Os fragmentos de DNA ligados à membrana de náilon foram detectados usando uma sonda rotulada por P³² rádio. Sondas foram geradas por um método com base em PCR usando iniciadores específicos por elementos de gene, e seguinte a procedimento de fabricante padrão com a po25 limerase HotStar® Taq (Qiagen, CA). 50 ng de DNA de sonda específico para cada elemento de gene e 25 ng de 1Kb mais progressor (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram rotulados com P³² usando Rotulação Pronta para o Uso Beads® (Amersham, Piscatamodo, NJ) seguindo as instruções do fabricante. As sondas foram purificadas usando uma coluna giratória de Nucleotídeo 30 G-50® de Amersham seguindo o protocolo do fabricante.

Antes de adição da sonda radiorotulada por P³², as manchas de membrana de náilon contendo DNA fixado foram bloqueadas com tampão

50/65 de bloqueio: (2% SDS, 0.5% BSA, 1mM EDTA, 1mM ortofenantrolina) durante pelo menos 2 horas em temperatura ambiente em um agitador, e foram em seguida pré-hibridizados com 10 ml de HYB Perfeito Mais Tampão® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em 65°C durante pelo menos 1 hora em um forno de hibridização. Sondas rotuladas purificadas foram desnaturadas em uma batelada de água fervente durante 5 minutos e colocadas em gelo durante 5 minutos e em seguida adicionadas às membranas bloqueadas e préhibridizadas e colocadas durante a noite em 65 C em um forno de hibridização.

Depois de hibridização de sonda, a solução de sonda foi descartada em lixo radioativo. As manchas de membrana foram lavadas duas vezes em seu tubo de hibridização original com 1 X Ribolavagem™ (200 mM Fosfato de Sódio, 50 mM Pirofosfato de Sódio, 10 mM EDTA, 2% SDS, pH a 7,8). Tampão de lavagem durante 15 minutos cada lavagem em um forno de hibridização a 65°C. Cada lavagem foi descartada no lixo líquido radioativo seguinte a procedimentos de operação padrão. Membranas foram removida do tubo e colocadas em uma bandeja de enxágue limpa e lavadas uma vez mais em uma incubadora agitadora em 65°C durante um adicional de 15 minutos. Membranas foram embaladas em embalagam de plástico, colocadas em um cassette de película e expostas a uma análise de fosfor imageador durante 1 a 3 dias. Imagens foram obtidas usando o BioRad Personal FX Fosfor Imageador® seguindo as normas de equipamento e software.

As sondas usadas para a hibridização são descritas na Tabela 4. O 1 Kb Mais Progressor de DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi usado para determinar tamanho de fragmento de hibridização nos Manchamentos do Sul.

51/65

Tabela 4: Comprimento de sondas usadas em Análise do Sul de evento de algodão pDAB4468.18.07.1_____________________

Nome da Sonda	Elemento Genético	Comprimento (bp)
aad-12	aad-12	671
Pat	Pat	525
specR	gene de resistência Espectinomicina	750
OríRep	Ori Rep	852
trfA	Proteína de iniciação de replicação trfA	1119

Exemplo 4.5: Resultado de Manchamento do Sul

Tamanhos de fragmento esperados e observados com um di5 gesto e sonda particular, com base nos sítios de enzima de restrição conhecidos do cassete de expressão de gene aad-12 e PAT, são determinados na Tabela 5. Tamanhos de fragmento esperados são com base no mapa de plasmídeo de pDAB4468 e tamanhos de fragmento observados são resultados aproximados destas análises e são com base na correspondência da 10 banda com os tamanhos indicados do 1 Kb Mais Progressor de DNA.

Dois tipos de fragmentos foram identificados destes digestos e hibridizações: fragmentos internos onde sítios de enzima conhecidos flanqueiam a região de sonda e são completamente contidas dentro da região de inserção do cassete de expressão aad-12, e fragmentos de remate onde 15 um sítio de enzima conhecido é localizado em uma extremidade da região de sonda e um segundo sítio é esperado no genoma de algodão. Tamanhos de fragmento de remate variam por evento porque, na maioria dos casos, sítios de integração de fragmento de DNA são únicos para cada evento. Os fragmentos de remate fornecem mecanismos para localizar o sitio de enzima 20 de restrição relativo ao DNA integrado e para avaliar o número de inserções de DNA. Análise de Manchamentos do Sul concluída em múltiplas gerações de linhagens de algodão contendo evento de algodão pDAB4468.18.07.1 produziu dado que sugeriu que um cassete de expressão de plasmídeo intacto de cópia baixa aad-12 pDAB4468 foi inserido no genoma de algodão 25 desse modo resultando em evento de algodão pDAB4468.18.07.1.

52/65

As enzimas de restrição Nsil e Swal ligam-se e clivam sítios de restrição únicos dentro de plasmídeo pDAB4468. Subsequentemente, estas enzimas foram selecionadas para caracterizar a inserção de gene aad-12 em evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Fragmentos de remate de mais do que 6.3 Kb ou mais do que 4.3 Kb foram previstos hibridizar com a sonda seguinte a digestos, respectivamente (Tabela 5). Bandas de hibridização aad-12 únicas de aproximadamente 8.0 Kb e aproximadamente 5.0 Kb foram observadas quando Nsil, e Swal foram usados, respectivamente. Além disso, enzima de restrição Ncol foi selecionada para caracterizar uma inserção de gene aad-12. O plasmídeo usado para produzir evento de algodão pDAB4468.18.07.1, pDAB4468, continha um sítio de restrição único Ncol no cassete de expressão de plasmídeo pDAB4468, e dois sítios adicionais na área de esqueleto de plasmídeo pDAB4468. Um fragmento de remate de mais do que 3.7 Kb foi previsto para hibridizar com a sonda seguinte a digestos (Tabela 5). Uma banda de hibridização aad-12 única de aproximadamente 10.5 Kb foi observada. A hibridização da sonda para bandas deste tamanho sugere uma presença de um sítio de inserção único para o gene aad-12 no genoma de algodão de evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Três combinações de enzimas de restrição, Nde, Nsil+Ncol e Nsil+Sbfl, foram selecionadas para liberar um fragmento que contém várias regiões do cassete de expressão aad-12 e o cassete de expressão pat (Tabela 5). A enzima de restrição Ndel inclui os elementos de cassete de expressão aad-12 do Ubi10 para promover ao terminador de AtuORF23 UTR. Um fragmento previsto de 3.5 Kb foi observado em manchas sondadas com a sonda aad-12 seguinte ao digesto Ndel. A digestão dupla com Nsil e Ncol inclui os elementos de cassete de expressão aad-12 e pat. Um fragmento previsto de 3.5 Kb foi observado em manchas sondadas com a sonda aad-12 seguinte à digestão de enzima dupla. (Tabela 5). A digestão dupla com Nsil e Sbfl contém tanto Elementos de cassete de expressão aad-12 e pat. Um fragmento previsto de 4.8 Kb foi observado em manchas sondadas com aad-12 seguinte à digestão de enzima dupla. (Tabela 5).

Além disso, bandas de hibridização foram observadas em man53/65 chas que foram sondadas com uma sonda de pat e digeridas com as digestões de enzima de restrição descritas acima (Nsil, Ncol, Swal, Ndel, Nsil+Ncol e Nsil+Sbfl). As manchas resultantes produziram fragmentos que indicam que o cassete de expressão pat está presente em evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Tabela 5 lista os tamanhos de fragmento esperados que são com base no mapa de plasmideo de pDAB4468, além dos tamanhos de fragmento observados que resultaram dos Manchamentos do Sul sondados com pat. Estes resultados obtida para evento de algodão pDAB4468.18.07.1 indicam que um cassete de expressão aad-12 intacto e Cassete de expressão pat de plasmideo pDAB4468 foi inserido no genoma de algodão do evento de algodão pDAB4468.18.07.1.

Exemplo 4.6: Ausência de Esqueleto em Sequência

Análise de manchamento do Sul foi também conduzida para verificar a ausência do gene de resistência espectinomicina (specR), elemento Ori Rep e proteína de iniciação de replicação trfA (trf A elemento) em evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Seguinte a digestão e hibridização de Nsil com uma sonda específica specR, uma banda de tamanho esperado de aproximadamente 12 Kb foi observada na amostra de controle positivo (pDAB4468 mais Coker 310) mas ausente de amostras do controle negativo e evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Similarmente, uma banda de tamanho esperado de aproximadamente 7.25 Kb foi detectada na amostra de controle positivo (pDAB4468 mais Coker 310) mas ausente das amostras do controle negativo e evento de algodão pDAB4468.18.07.1 depois de digestão e hibridização de Ncol com a mistura de sonda específica de OriRep e sonda específica de trfA. Este dado indica a ausência do gene de resistência de espectinomicina, elemento Ori Rep e proteína de iniciação de replicação trfA em evento de algodão pDAB4468.18.07.1.

54/65

Tabela 5: Fragmentos de hibridização Previstos e Observados em Análise de manchamento do Sul. 1. Tamanhos de fragmento esperados são com base no mapa de plasmídeo de pDAB4468. 2. Tamanhos de fragmento observados são considerados aproximadamente destas análises e são com base nos tamanhos indicado dos fragmentos de Peso Molecular de DNA rotulado por P^a2.

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Exemplo 5: Tolerância para 2,4-D em Testes de Campo

A tolerância de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 para aplicações pós-emergência do herbicida de ácido fenoxiacético, 2,4-D, foi estudada em testes de campo durante a estação de crescimento de 2010. Tolerância a herbicida foi avaliada seguinte a aplicação pós-emergência única de 2,4-D aplicado a evento de algodão de 2 a 4 folhas pDAB4468.18.07.1 . A aplicação de 2,4-D em plantas de algodão neste estágio de desenvolvimento representa um período de aplicação de herbicida tipicamente utilizado para obter controle de erva daninha satisfatório por desenvolvedores de algodão.

A tolerância a 2,4-D foi medida por avaliação de plantas de algodão quanto lesão no 0 a 1 dia depois da aplicação (DAA) , 7-8 DAA, 12-16 DAA, e 24-32 DAA. Medições para o incremento de tempo de 0 a 1 dia foram tiradas de 6 a 24 horas depois da aplicação. Lesão foi avaliada por determinação de uma faixa de lesão visual em por cento usando uma escala de porcentagem linear (1-100%) onde 0% representa nenhuma lesão de herbicida visível e 100% representa morte da planta. As faixas eram uma classificação de compósito para qualquer sintomologia de herbicida incluindo epinastia, clorose, necrose de folha e morte da planta. Sintomologia de herbicida presente em 0-1 DAA foi primariamente epinastia e sintomas em avaliações posteriores foram primariamente clorose e necrose.

Testes de campo foram conduzidos em onze locações através dos Estados Unidos em áreas de produção de algodão típicas de Alabama, Arkansas, Califórnia, Geórgia, Louisiana, Mississippi, North Carolina, South Carolina, e Tennessee. Testes foram designados com quatro replicações por tratamento. Cada replicação foi separada por uma viela de terra desprotegida de 10 a15 pés de largura. Tamanho de plotagem para tratamentos individuais foi 2 filas por 20 pés de comprimento com filas tipicamente espaçadas 36 a 40 polegadas de distância. Tratamentos experimentais consistiam de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 pulverizado com 2,4-D amina (Weedar 64™, NuFarm, Burr Ridge, IL) em ou 0, 1120, 2240, ou 4480 gramas de equivalente de ácido por hectare (g ae/ha) aplicados em 15 galões por acre de solução de spray final. Um tratamento comparador de algodão não trans57/65 formado não foi incluído nestes experimentos uma vez que tratamento com 2,4-D em taxas muito inferiores do que a taxa mais baixa testada (1.120 g ae/ha) é conhecido resultar em morte da planta.

Tabela 6 apresenta o mecanismo de tratamento para lesão visual resultando de aplicação pós-emergência de 2,4-D. Com a exceção de epinastia transitória 0-1 DAA, nenhuma lesão de herbicida agronomicamente significante foi notada nestes experimentos. Tratamento com 2,4-D em 4480 g ae/ha (que representa a taxa antecipada ser >4X que requerida para controle de erva daninha de amplo espectro) resultou em pequena lesão de safra além do intervalo de avaliação 7-8 DAA e demonstra a robusta tolerância de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 para 2,4-D.

Tabela 6: Lesão visual em por cento para evento de algodão

JDAB4468.18.07.1 seguinte a aplicação pós-emergência de 2,4-D.

2,4-D Taxa (g ae/ha)	0-1 DAA	7-8 DAA	12-16 DAA	24-32 DAA
0	0,0	0,0	0,0	0,0
1120	5.0	2.3	1.1	0,0
2240	11.7	4.9	2.7	0.4
4480	21.0	15.1	8.0	2.2

Exemplo 6: Tolerância para Glifosinato em Testes de campo

A tolerância de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 para aplicações pós-emergência de glifosinato foi estudada em testes de campo durante a estação de crescimento de 2010. Tolerância a herbicida foi avaliada seguinte a aplicação pós-emergência única de glifosinato aplicado a evento de algodão de 6 a 8 folhas pDAB4468.18.07.1, que representa um período de aplicação de herbicida tipicamente utilizado com glifosinato para obter controle de erva daninha satisfatório.

Tolerância de glifosinato foi medida por avaliação de plantas de algodão para lesão em 2 a 4 dias depois da aplicação (DAA), 7-9 DAA, 1319 DAA e 22-29 DAA. Lesão foi avaliada por determinação de uma lesão visual em faixa em por cento usando uma escala de porcentagem linear (1100) onde 0% representa nenhuma lesão de herbicida visível e 100% representa morte da planta. As faixas foram uma classificação de compósito para

58/65 qualquer sintomologia de herbicida incluindo clorose, necrose de folha, nanismo e morte da planta. Sintomologia de herbicida (onde presente) foi primariamente clorose e necrose.

Testes de campo foram conduzidos em onze locações através dos Estados Unidos em algodão típico produzindo áreas de Alabama, Arkansas, Califórnia, Geórgia, Louisiana, Mississippi, North Carolina, South Carolina, e Tennessee. Testes foram designados com quatro replicações por tratamento. Cada replicação foi separada por uma viela de terra desprotegida de 10 a15 pés de largura. Tamanho de plotagem para tratamentos individuais era 2 filas por 20 pés de comprimento com filas tipicamente espaçadas de 36 a 40 polegadas de distância. Tratamentos experimentais consistiam de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 pulverizado com glifosinato de amônio (Ignite 280 SL™, Bayer, Researcj Triangle, NC) em ou 0, 542, 1084, ou 2168 gramas de equivalente de ácido por hectare (g ae/ha) aplicado em 15 galões por acre de solução de spray final. Um tratamento comparador de algodão nâo transformado não foi incluído nestes experimentos uma vez que tratamento com glifosinato em taxas muito menores do que a taxa mais baixa testada (542 g ae/ha) seria esperado para resultado em morte da planta.

Tabela 7 apresenta o mecanismo de tratamento para lesão visual resultando de aplicação pós-emergência de glifosinato. Com a exceção de clorose transitória nas plotagens tratadas com 2168 g ae/ha (>4X a taxa de uso típica) em 2-4 & 7-9 DAA, na lesão de herbicida agronomicamente significante foi notado nestes experimentos. Tratamento com glifosinato 2168 g ae/ha (que representa a taxa antecipada ser >4X que requeria controle de erva daninha de amplo espectro) resultou em pequena lesão de safra além do intervalo de avaliação 7-9 DAA e demonstra a tolerância robusta de evento de algodão pDAB4468.18.07.1.

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Tabela 7: Lesão visual em por cento para evento de algodão

pDADB4468.18.07.1 seguinte a aplicacão pós-emergência de qlifosinato.
Taxa de Glifosinato (g ae/ha)	2-4 DAA	7-9 DAA	13-19 DAA	22-29 DAA
0	0,0	0,0	0,1	0,0
542	3.1	2.3	0,1	0,1
1084	7.6	4.8	0,1	0,0
2168	14.8	10,8	2.2	0.3

Exemplo 7: Tolerância para Triclopir e Fluroxipir em Testes de Estufa

A tolerância de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 para aplicações pós-emergência dos herbicidas de ácido piridiloxiacético, triclopir e fluroxipir, foi estudada em testes de estufa. Tolerância a herbicida foi avaliada seguinte a aplicação pós-emergência única de triclopir ou fluroxipir.

Sementes de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 foram tratadas por calor em uma batelada de água em 82.5 °C durante 1 minuto e em seguida plantadas em 360 meios de mistura de metro e desenvolvida em uma estufa. As temperaturas na estufa mediram 27 °C e o fotoperíodo era o grupo em 16 horas de luz e oito horas de escuro, com intensidade de luz máxima. Plantas foram deixadas desenvolver até o 3 estágio de folha de desenvolvimento e um estudo não aleatorizado foi conduzido com três replicações e três tratamentos para cada herbicida. Plantas foram pulverizadas em um pulverizador de trilha calibrado para liberar 187 L/ha das formulações comerciais de triclopir (Garlon 4™, Dow AgroSciences, Indianapolis, EM) e fluroxipir (Starane™, Dow AgroSciences, Indianapolis, EM). Uma variedade de algodão não transformada Coker 310 foi usada como um controle negativo. Avaliação de lesão visual foi tirada 3 DAA (dias depois da aplicação) e comparação de 11 DAA de cada taxa de herbicida. Lesão foi avaliada visualmente como porcentagem de folhagem de planta de algodão epinástica usando uma escala de porcentagem linear (1 a 100%) onde 0% não representa nenhuma lesão de herbicida visível e 100% representa morte da planta.

Evento de algodão pDAB4468.18.07.1 fornece tolerância para níveis de fluroxipir até 280 g ae/ha por 3 DAA (Tabela 8). Além disso, evento

60/65 de algodão pDAB4468.18.07.1 fornece tolerância para triclopir (Tabela 8). No evento de algodão 3 DAA pDAB4468.18.07.1, plantas demonstraram níveis moderados de tolerância para triclopir, mas por 11 DAA, as plantas tinham se recuperado da resposta epinástica inicial e fornecido tolerância ro5 busta comparadas ao controle não transformado. O estudo resultante demonstra que evento de algodão pDAB4468.18.07.1 fornece tolerância aos herbicidas de ácido piridiloxiacético, triclopir e fluroxipir.

Tabela 8: Lesão visual em por cento após a aplicação pós-emerqência dos herbicidas triclopir e fluroxipir.

	% Lesão
3 DAA	11 DAA
Herbicida	Taxa (g ae/ha)	Evento de algodão pDAB4468. 18.07.1	Controle de Coker	Evento de algodão pDAB4468. 18.07.1	Controle de Coker
Triclopir	140	11,8 b	33,8 a	3,0 a	36.3 b
Triclopir	280	17,0 a	33,8 a	6,3 a	40,0 ab
Triclopir	560	19,3 a	36,3 a	3,5 a	48.8 a
Fluroxipir	70	1,8 c	11,3c	4,8 a	43.8 ab
Fluroxipir	140	1,0 c	27,3 b	4,3 a	36.3 b
Fluroxipir	280	5,5 c	33,3 a	8,0 a	43.8 ab
Diferença Significante Mínima (p =.05)	3.98	4,78	4,07	6,95
Desvio Padrão	2.68	3,22	2,74	4,68

Significados seguidos pela mesma letra não significantemente diferem-se (P=.O5, Student-Newman-Keuls).

Exemplo 8: Caracterização Agronômica de Evento de Algodão PDAB4468.18.07.1

As características agronômicas de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 foram quantificadas em testes de campo conduzidos através de locações geograficamente diferentes ao longo do cinto de algodão em 2010. Estes estudos compararam o desempenho agronômico de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 (com e sem aplicações dos herbicidas 2,4-D e glifosinato) ao controle de quase isolina não transgênico, Coker 310. Ne

61/65 nhuma diferença não intencional agronomicamente significativa foi observada entre evento de algodão pDAB4468.18.07.1 e as plantas de controle Coker 310. Os resultados destes testes de campo demonstraram que evento de algodão pDAB4468.18.07.1 foi agronomicamente equivalente às plantas de 5 controle de Coker 310 e que a presença da inserção de filamento T de pDAB4468 não altera o desempenho agronômico esperado de evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Adicionalmente, o desempenho agronômico de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 não foi alterado como um resultado da aplicação dos herbicidas, 2,4-D e glifosinato, quando comparado as plan10 tas de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 que não foram pulverizadas com os tratamentos de herbicida.

Avaliações de características agronômicas foram feitas para vigor de semeadura, emergência de planta em %, início de florescimento, nódulos depois da flor branca (NAWF), e determinação de rendimento usando 15 os critérios indicados na Tabela 9. Fibra coletada foi mandada ao Fier and

Biopolymer Research Institute em Lubbock, Texas para avaliação de fibra usando o Instrumento de Volume Alto (HVI).

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Sementes de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 e sementes da linhagem de controle de quase isolina, Coker 310, foram plantadas em uma taxa de 80 sementes por 20 ft de fila com um espaçamento de fila de 34 a 38 polegadas (86,36 cm -96,52 cm). Este esquema de plantio foi replicado quatro vezes em cada sítio. Cada sítio foi disposto em um esquema em bloco aleatorizado completo (CRBD) consistindo em 3 blocos não pulverizados e 4 blocos pulverizados para cada replicação. Plantas foram pulverizadas com os herbicidas 2,4-D e glifosinato usando taxas de aplicação de campo padrão e métodos tal como descrito acima. As duas filas do centro (filas 2 e 3) foram usadas para medir as características agronômicas e avaliar as plantas. As características agronômicas medidas foram equivalentes para evento de algodão pDAB4468.18.07.1 quando comparado às plantas de controle de quase isolina Coker 310 para a totalidade das características agronômicas medidas e estatisticamente analisadas. Uma exceção foi identificada para os resultados de emergência de planta em % dentro das plotagens pulverizadas de herbicida de evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Entretanto, os pontos de dado de emergência de planta em % foram tirados antes da aplicação de qualquer herbicida e a variabilidade nesta medição é atribuída a fatores ambientais. Nenhuma diferença não intencional agronomicamente significativa foi observada entre evento de algodão pDAB4468.18.07.1 e a plantas de controle de Coker 310. Estes testes de campo demonstraram que evento de algodão pDAB4468.18.07.1 foi agronomicamente equivalente às plantas de controle de Coker 310 e que a presença da inserção de filamento T de pDAB4468 não altera o desempenho agronômico esperado de evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Adicionalmente, o desempenho agronômico de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 não foi alterado como um resultado da aplicação dos herbicidas, 2,4-D e glifosinato, quando comparado às plantas de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 que não foram pulverizadas com os tratamentos de herbicida.

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Tabela 10: Dado estatístico para eventos tratados (pulverizados com herbicida) e não tratados (não pulverizados com herbicida) quando comparado a uma planta de algodão de controle de quase isolina. ___

Parâmetro	Coker 310 (controle de quase isolina)	Evento de algodão pDAB4468.1 8.07.1 não pulverizado (P-valor)	Evento de algodão pDAB4468.18.0 7.1 pulverizado com herbicida (P-valor)	Efeito de tratamento geral (PR >F)
Emergência de planta (7DAP)	70.3	65.8 (0.29)	64.2 (0,045)	0.553
Faixas de Vigor	1.96	2.3 (0,1362)	2.14 (0.22)	0.303
Dias até a primeira flor branca (~60 DAP)	56.9	57.79 (0.3883)	57.79 (0.364)	0.645
NAWF (no.)	4.92	4.95 (0,8919)	5.15 (0.2539)	0.4348
Rendimento de algodão (Ibs)	1825.43	2173.15 (0.4726)	1678.6 (0.6544)	0,8986
Rendimento de fiapo (Ibs)	831.63	782.81 (0.2359)	792.43 (0.2887)	0.5627

Exemplo 9: Sequência Esperada de Evento de algodão pDAB4468.18.07.1

SEQ ID ΝΟΊ7 fornece a sequência esperada de evento de algodão pDAB4468.18.07.1. Esta sequência contém a sequência de flanqueamento genômica 5', a inserção de filamento T esperada de pDAB4468 e a sequência de flanqueamento genômica 3'. Com respeito a SEQ ID NO:17, resíduos 1-2,885 são sequência de flanqueamento genômica 5', resíduos

2,886-9,253 são resíduos da inserção de filamento T de pDAB4468, e resíduos 9,254-10,156 são sequência de flanqueamento 3'. A sequência de junção ou transição com respeito extremidade à 5' da inserção desta forma ocorre em resíduos 2,885/2,886 de SEQ ID NO:17. A sequência de junção ou transição com respeito à extremidade 3' da inserção desta forma ocorre em resíduos 9,253/9,254 de SEQ ID NO:17.

Deve ser notado que SEQ ID NO: 17 é a representação esperada de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 e foi montada de um alinhamento de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, e do filamento T de pDAB4468, SEQ ID

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NO:3. A sequência atual da inserção de filamento T de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 pode levemente deviar-se de SEQ ID NO: 17. Durante o processo de transformação de introdução de uma inserção de filamento T no genoma de células de planta, não é incomum para algumas deleções ou outras alterações da inserção ocorrer. Além disso, erros em amplificação de PCR podem ocorrer que podería resultar em menores erros de sequenciamento. Por exemplo, sequências de flanqueamento listadas aqui foram determinadas por geração de amplicons de DNAs genômicos de algodão, e em seguida clonagem e sequenciamento dos amplicons. Não é incomum encontrar leves diferenças e discrepâncias menores em sequências geradas e determinadas desta maneira, determinado os muitos ciclos de amplificação que são necessários para gerar amplicon o bastante para sequenciamento de DNAs genômicos. Aquele versado na técnica deve reconhecer e notar que quaisquer ajustes necessários devido a estes tipos de erros de sequenciamento ou discrepâncias comuns estão dentro do escopo de modalidades da invenção tema. Desta forma, o segmento relevante da sequência de plasmídeo fornecida aqui podería compreendem algumas variações menores. Desta forma, a planta compreendendo um polinucleotídeo possuindo alguma faixa de identidade com uma sequência de inserção tema é dentro do escopo de modalidades da invenção tema. Especificamente, uma sequência de polinucleotídeo tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para a sequência de SEQ ID NO:17 é dentro do escopo de modalidades da invenção tema. A sequência das sequências de flanqueamento mais sequência de inserção pode ser confirmada com referência à semente depositada. Desta forma, algumas diferenças entre SEQ ID NO:17 e a inserção de filamento T atual de evento de algodão pDAB4468.18.07.1 podem ser identificadas e estão dentro do escopo de modalidades da presente invenção.

Claims (21)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Sequência de DNA isolada compreendendo uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID ΝΟ.Ί; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2.
2. 2. Método de reprodução de uma planta de algodão compreendendo:

   cruzar uma primeira planta com uma segunda planta de algodão para produzir uma terceira planta de algodão, a referida primeira planta compreendendo DNA compreendendo uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos; e ensaiar a referida terceira planta de algodão quanto à presença de DNA compreendendo uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos.
3. 3. Molécula de DNA isolada compreendendo uma sequência de junção compreendendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID ΝΟ.Ί; bp 2837-2936 de SEQ ID ΝΟΊ; bp 2787-2986 de SEQ ID ΝΟΊ; bp 2737-3036 de SEQ ID ΝΟΊ; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos.
4. 4. Semente de algodão compreendendo em seu genoma uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em resíduos 28672906 de SEQ ID ΝΟΊ; resíduos 2837-2936 de SEQ ID ΝΟΊ; resíduos 27872986 de SEQ ID NO:1; resíduos 2737-3036 de SEQ ID NO:1; resíduos 128167 de SEQ ID NO:2; resíduos 98-197 de SEQ ID NO:2; resíduos 48-247 de

   2/4

   SEQ ID NO:2; e resíduos 1-297 de SEQ ID NO:2, e complementos dos mesmos.
5. 5. Semente de algodão compreendendo em seu genoma AAD12/PAT evento de algodão pDAB4468.18.07.1 e tendo semente de algodão representativa depositada com Amerícan Type Culture Collection sob o No. de Acessão PTA-12456.
6. 6. Planta de algodão produzida por cultivo da semente comon definido na reivindicação 4 ou 5.
7. 7. Semente de algodão produzida por uma planta como definido na reivindicação 6, em que a referida semente compreende em seu genoma AAD-12/PAT evento de algodão pDAB4468.18.07.1 quando presente em uma semente de algodão depositada com Amerícan Type Culture Collection sob o No. de Acessão PTA-12456.
8. 8. Parte da planta de algodão como definido na reivindicação 6, em que a referida parte é selecionada do grupo que consiste em pólen, óvulo, flores, casulos, brotos, raízes, e folhas, e a referida parte compreende o referido evento.
9. 9. Composição derivada da planta de algodão como definido na reivindicação 6 ou a parte como definido na reivindicação 8, em que a referida composição é um produto de utilidade selecionado do grupo que consiste em farinha de algodão, fibra de algodão, e óleo de algodão.
10. 10. Planta de algodão descendente da planta de acordo com a reivindicação 6, em que a referida planta exibe tolerância ao ácido fenoxiacético, ácido piridiloxiacético, e herbicidas de glifosinato, e a referida tolerância é devido à expressão de uma proteína codificada no referido evento ou referido genoma.
11. 11. Planta de algodão de acordo com a reivindicação 6, em que a referida planta de algodão compreende uma sequência de DNA tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com os resíduos 2,886-9,253 de SEQ ID NO:17.
12. 12. Semente de algodão compreendendo um genoma compreendendo uma sequência de DNA tendo pelo menos 95% de identidade de

    3/4 sequência com a SEQ ID NO:17.
13. 13. Planta produzida cultivando uma semente como definido na reivindicação 12.
14. 14. Planta de algodão transgênica ou parte da mesma compreendendo evento de algodão pDAB4468.18.07.1, em que semente de algodão representativa compreendendo evento de algodão pDAB4468.18.07.1 foi depositada com American Type Culture Collection sob o No. de Acessão PTA-12456 .
15. 15. Método de controle de ervas daninhas em uma colheita de algodão que compreende aplicar herbicida de ácido fenoxiacético à colheita de algodão, a referida colheita de algodão compreendendo plantas de algodão compreendendo DNA que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1, bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737 3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o referido herbicida de ácido fenoxiacético é 2,4-D.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o referido herbicida de ácido fenoxiacético é MCPA.
18. 18. Método de controle de ervas daninhas em uma colheita de algodão que compreende aplicar ácido piridiloxiacético herbicide à colheita de algodão, a referida colheita de algodão compreendendo plantas de algodão compreendendo DNA que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o referido herbicida de ácido piridiloxiacético é triclopir.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o referido herbicida de ácido piridiloxiacético é fluroxipir.

    4/4
21. 21. Método de controle de ervas daninhas em uma colheita de algodão que compreende aplicar o herbicida glufosinato à colheita de algodão, a referida colheita de algodão compreendendo plantas de algodão compreendendo DNA que compreende uma sequência selecionada do gru5 po que consiste em bp 2867-2906 de SEQ ID NO:1; bp 2837-2936 de SEQ ID NO:1; bp 2787-2986 de SEQ ID NO:1; bp 2737-3036 de SEQ ID NO:1; bp 128-167 de SEQ ID NO:2; bp 98-197 de SEQ ID NO:2; bp 48-247 de SEQ ID NO:2; e bp 1-297 de SEQ ID NO:2.