MX2014000533A - Evento 8264.42.32.1 de tolerancia apilada a los herbicidas, lineas de soya transgenicas relacionadas y su deteccion. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al evento de soja pDAB8264.42.32.1 e incluye nuevos casetes de expresión e insertos transgénicos que comprende múltiples rasgos que confieren resistencia a herbicidas de glífosato, ariloxialcanoato y glufosinato. Esta invención también se refiere en parte a métodos de control de malezas resistentes, cría de plantas y plantas tolerantes a herbicidas. En algunas formas de realización, la secuencia de eventos se puede 'apilar" con otros rasgos, que incluye, por ejemplo, otros genes tolerantes a herbicidas y/o proteínas inhibidoras de insectos. Esta invención también se refiere en parte a los ensayos de PCR TAQMAN de punto final PCR respecto de la detección del evento pDAB8264.42.32.1 en sojas y material vegetal relacionado. Algunas formas de realización pueden realizar análisis de cigosidad de alto rendimiento de material vegetal y otras formas de realización se pueden usar para identificar de forma exclusiva la cigosidad y las líneas de soja de cría que comprenden el evento de la invención objeto. También se proporcionan kits y condiciones de utilidad para realizar estos ensayos.

Description

EVENTO 8264.42.32.1 DE TOLERANCIA APILADA A LOS HERBICIDAS, LÍNEAS DE SOYA TRANSGÉNICAS RELACIONADAS Y SU DETECCIÓN Antecedentes de la Invención El glifosato ((N-fosfonometilglicina), un herbicida de amplio espectro, inhibe la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una enzima en la vía metabólica del ácido shikímico que produce los aminoácidos aromáticos esenciales en las celulas de las plantas. La inhibición del EPSPS destruye de manera efectiva la síntesis de las proteínas y de esta manera mata las células de las plantas afectadas. Dado que el glifosato no es selectivo de células vegetales, mata tanto las malezas como las plantas de cultivo. Por lo tanto, es útil en la producción agrícola cuando es posible modificar las plantas de cultivo para hacerlas resistentes al glifosato, con lo que se permite que las plantas deseables sobrevivan al glifosato.

Se ha utilizado la teenología de ADN recombinante para aislar las EPSP sintasas mutantes que son resistentes al glifosato. Tales EPSP sintasas mutantes resistentes al glifosato pueden ser transformadas en las plantas y conferir una resistencia al glifosato en las plantas transformadas. A título de ejemplo, se aisló un gen de tolerancia al glifosato a partir de la cepa CP4 de Agrobacterium descrita en el documento patente de los Estados Unidos No. 5.633.435. Dicha referencia y la totalidad de las referencias mencionadas en la presente se incorporan en la presente a título de referencia.

Se han creado otros genes de tolerancia al glifosato mediante la introducción de mutaciones. Las mismas incluyen el gen AroA aislado por Comai y descrito en las patentes de los EE. UU. Nros. 5.094.945, 4.769.061 y 4.535.060. Se ha utilizado un mutante único, como se describe en la patente de los EE. UU. NO. 5.310.667, para lo cual se sustituyó un residuo alanina entre las posiciones de aminoácidos 80 y 120. Se han descrito mutantes dobles en las patentes de los EE. UU. 6.225.114 y 5.866.775 en las que, además de la mutación mencionada anteriormente, se introdujo una segunda mutación (un residuo treonina en lugar de un residuo alanina entre las posiciones 170 y 210) en un gen de EPSP de tipo salvaje.

Otros trabajos resultaron en la producción de maíz hecho resistente al glifosato mediante la introducción de un gen de EPSP de maíz modificado portador de mutaciones en el residuo 102 (para lo cual se cambió treonina en isoleucina) y en el residuo 106 (para lo cual se cambió prolina en serina) de la secuencia de aminoácidos codificada por el número de acceso a GenBank X63374. Ver las patentes de los EE. UU. Nros. 6.566.587 y 6.040.497.

Los ejemplos de eventos que proveen una resistencia al glifosato en las soyas incluyen el evento de soya GTS 40-3-2 (Padgette et al. 1995) y el evento de soya MON89788 (patente de los EE. UU. NO. 7.608.761 ).

En años más recientes, la difundida aplicación de los sistemas de cultivo resistente al glifosato y el creciente uso del glifosato ha contribuido al predominio de malezas resistentes al glifosato y difíciles de controlar. En las áreas en las que los cultivadores se enfrentan con malezas resistentes al glifosato y a un desplazamiento hacia especies de malezas más difíciles de controlar, los cultivadores pueden compensar las brechas en el espectro herbicida del glifosato mediante mezclado en tanque o alternando con otros herbicidas que controlarán las malezas faltantes.

El herbicida, ácido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D), se puede usar junto con el glifosato para esperar expandir el espectro de malezas de hojas anchas o dicotiledóneas que pueden ser tolerantes o resistentes al glifosato. 2,4-D, que se usó como un herbicida durante más de 60 años, proporciona un amplio espectro, un control posemergencia de un amplio espectro de malezas de hojas anchas anuales, bienales y perennes. En maíz, soya y algodón, el 2,4-D (tasas de 560 - 1 120 g ae/ha) controla las malezas clave que incluyen Ambrosia artemisiifolia, Ambrosia trífida, Xanthium strumarium, Chenopodium álbum, Helianthus annuus, Ipomoea sp., Abutilón theophrasti, Conyza Canadensis, y Senna obtusifolia. El 2,4-D provee un control parcial de varias malezas clave, que incluyen Polygonum pensylvanicum, Polygonum persicaria, Cirsium arvense, Taraxacum officinale y Amaranthus sp. incluyendo Amaranthus rudis y Amaranthus palmeri.

Una limitación para una mayor utilización del 2,4-D es que su selectividad en las plantas de cultivo dicotiledóneas tales como soya o algodón es muy pobre, por lo que típicamente no se utiliza el 2,4-D en las plantas de cultivo sensibles (y por lo general poco sensibles). Además, el uso del 2,4-D en las plantas de cultivo gramíneas está un tanto limitado por la naturaleza del daño que puede presentarse en la planta de cultivo. Se ha utilizado el 2,4-D combinado con glifosato para proveer un tratamiento de destruir por quemazón más robusto antes de plantar soyas y algodón sin labranza; sin embargo, debido a esta sensibilidad de las especies dicotiledóneas al 2,4-D, estos tratamientos de destruir por quemazón han de efectuarse por lo menos 14-30 días antes de efectuar la plantación (Agriliance, 2005).

Un organismo que fue ampliamente investigado por su capacidad de degradar el 2,4-D es Ralstonia eutropha, que contiene un gen, tfdA, que codifica una enzima (TfdA) que cataliza la primera etapa en la vía de la mineralización. (Ver la patente U. S. No. 6.153.401 y acceso a GENBANK No. M16730). TfdA cataliza la conversión de ácido 2,4-D a diclorofenol (DCP) por medio de una reacción de dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (Smejkal et al., 2001 ). DCP tiene poca actividad herbicida en comparación con 2,4-D. tfdA se usó en plantas transgenicas para impartir resistencia a 2,4-D en plantas dicotiledóneas (por ejemplo, algodón y tabaco) normalmente sensible a 2,4-D (Streber et al. (1989), Lyon et al. (1989), Lyon (1993) y patente U. S. No. 5.608.147).

A partir del entorno se ha identificado una cantidad de genes de tipo t fdA que codifican proteínas capaces de degradar el 2,4-D, y se los ha registrado en la base de datos del Genbank. Muchos homólogos son similares al TfdA (>85% de identidad de aminoácido) y tienen similares propiedades enzimáticas al TfdA. Sin embargo, hay una cantidad de homólogos que tienen una identidad significativamente menor con respecto al TfdA (25-50%), pero que sin embargo tienen los residuos característicos asociados con las a-cetoglutarato dioxigenasa Fe (II) dioxigenasas. Por ello, la especificidad del sustrato de proteínas de TfdA divergentes no es obvia.

Un ejemplo de un gen que degrada el 2,4-D con una baja homología (<35%) con respecto al tfdA es el gen aad-12 de Delftia acidovorans (Schleinitz et al. (2004) y Westendorf et al. (2002). El gen aad-12 codifica una dioxigenasa S-enantiómera-específica a-cetoglutarato-dependiente que se ha utilizado en plantas para conferir una tolerancia a determinados herbicidas fenoxi auxina, que incluyen, pero sin limitación: herbicidas de fenoxialcanoato (por ejemplo, herbicidas de ácido fenoxiacetico tales como 2,4-D y MCPA; y herbicidas de ácido fenoxibutanoico, tales como 2,4-DB y MCPB) y herbicidas ácido piridiloxialcanoicos (por ejemplo, herbicidas ácido piridiloxiacético tales como triclopir y fluroxlpir), y que incluyen ácidos, sales o formas de áster del/de los ingredientes activos (ver, por ejemplo, el documento WO 2007/053482).

El glufosinato-amonio (“glufosinato”) es un herbicida no sistemico, no selectivo, de la clase fosfinotricina de los herbicidas. Se utiliza primariamente para el control de posemergencia de una amplia gama de malezas herbáceas de hojas anchas; la L-fosfinotricina, que es el ingrediente activo en el glufosinato, controla las malezas por intermedio de la inhibición irreversible de la glutamina-sintasa, una enzima que es necesaria para la detoxificación de amoníaco en las plantas. Los herbicidas Glufosinato se venden comercialmente, por ejemplo, bajo las designaciones comerciales Ignite® y Liberty®.

La enzima fosfinotricina N-acetil transferasa (PAT), aislada de la bacteria del suelo Streptomyces viridochromogenes, cataliza la conversión de la L-fosfinotricina en su forma inactiva por acetilación. Se ha utilizado una forma de gen planta optimizada que expresa PAT en la soya, a efectos de conferir una tolerancia al herbicida glufosinato. Uno de tales ejemplos de soyas resistentes al glufosinato es el evento A5547-127. Más recientemente se ha propuesto el uso del herbicida glufosinato en combinación con el rasgo de tolerancia al glufosinato como un medio no selectivo para controlar de manera selectiva las malezas resistentes al ALS- y al glifosato.

La expresión de genes heteróiogos o extraños en las plantas es influida según dónde se inserta el gen extraño en el cromosoma. Esto podría deberse a la estructura de la cromatina (por ejemplo, la heterocromatina) o a la proximidad de los elementos reguladores transcripcionales (por ejemplo, de los reforzadores) cercanos al sitio de integración (Weising et al. , Ann. Rev. Genet 22:421 -477, 1988), por ejemplo. El mismo gen en el mismo tipo de planta transgenica (o en otro organismo) puede presentar una amplia variación en el nivel de expresión entre diferentes eventos. También puede haber diferencias en los patrones de expresión espaciales o temporales. Por ejemplo, las diferencias en la expresión relativos de un transgén en diversos tejidos de plantas puede no corresponder a los patrones expresados a partir de los elementos reguladores transcripcionales presentes en el constructo gen introducido.

Por lo tanto, frecuentemente se crean grandes cantidades de eventos, y se los selecciona sistemáticamente a efectos de identificar un evento que exprese un gen introducido de interés en un nivel satisfactorio para una dada finalidad. Para fines comerciales es común producir de centenares a miles de diferentes eventos y seleccionar sistemáticamente aquellos eventos para un único evento que tenga los niveles de expresión transgénica y patrones deseados. Un evento que tenga niveles y/o patrones deseados de expresión de transgenes, es útil para la introgresión del transgén en otros segundos planos mediante cruzamiento sexual basado en métodos de cultivo convencionales. La descendencia de tales cruces mantiene las características de expresión de los transgenes del transformante original. Se utiliza esta estrategia para asegurar la expresión fiable de genes en una cantidad de variedades que están bien adaptadas a las condiciones de cultivo locales.

Breve Descripción de la Invención La presente invención puede proveer, en parte, medios efectivos para controlar la resistencia de las malezas, lo que ayuda a preservar la utilidad de las teenologías tolerantes a los herbicidas. La presente invención tambien puede proveer a los cultivadores una gran flexibilidad y conveniencia en las opciones para el control de las malezas.

Más específicamente, la presente invención se refiere en parte al evento de soya ( Glycine max) designado como pDAB8264.42.32.1 (“evento pDAB8264.42.32.1”) que tiene una semilla representativa registrada ante la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-11993 y la descendencia derivada de la misma. La presente invención incluye plantas de soya que comprenden el evento pDAB8264.42.32.1 (y que incluye plantas de soya que comprenden un inserto transgénico entre SEC ID NO: 1 y SEC ID NO:2).

El inserto transgénico presente en el evento de la presente invención y en la semilla registrada comprende tres genes resistentes a los herbicidas: el gen aad-12, el gen 2mepsps, y un gen pat. El gen aad-12, derivado de Delftia acidovorans, codifica la proteína ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-12), que confiere una resistencia a, por ejemplo, el ácido 2,4-diclorofenoxiacético y a los herbicidas piridiloxiacetato. El gen 2mepsp, una secuencia EPSP modificada a partir del maíz, produce una proteína que confiere una tolerancia a los herbicidas glifosato. El gen pat, de la bacteria del suelo Streptomyces viridochromogenes, confiere una tolerancia al herbicida glufosinato.

Otros aspectos de la invención comprenden la descendencia de las plantas, soyas, semillas, y/o partes regenerables de las plantas y semillas y descendencia que comprenden el evento de soya pDAB8264.42.32.1 , así como tambien productos alimenticios para consumo humano o animal derivados hechos a partir de cualesquiera de los mismos. La invención también incluye partes de plantas del evento pDAB8264.42.32.1 que incluyen, pero sin limitación, polen, óvulos, flores, brotes, raíces, hojas, núcleos de células vegetativas, células de polen, y otras células de plantas que comprenden el evento pDAB8264.42.32.1 . La invención se refiere además plantas de soya que tienen una tolerancia a múltiples herbicidas que incluyen herbicidas fenoxiauxínicos y/o ariloxialcanoato, glifosato, y/o glufosinato. Tales plantas de soya también pueden apilarse con genes que confieren una tolerancia a diversos otros herbicidas no selectivos y selectivos, que incluyen pero sin limitación, los herbicidas dicamba, imidazolinona, y HPPD. La invención comprende además novedosas composiciones genéticas de evento pDAB8264.42.32.1 y aspectos del rendimiento agronómico de plantas de soya que comprenden el evento pDAB8264.42.32.1 .

Esta invención se refiere en parte al cultivo de plantas y a plantas tolerantes a los herbicidas. Esta invención incluye un novedoso evento de transformación en plantas de soya que comprenden un polinucleótido, como se describe en la presente, insertado en un sitio específico dentro dei genoma de una celula de soya.

En algunas modalidades, dicho evento / polinucleótido puede estar “apilado” con otros rasgos que incluyen, por ejemplo, rasgos agronómicos y proteínas que inhiben insectos. Sin embargo, la presente invención incluye plantas que tienen el evento individual, como se describe en la presente.

Los rasgos adicionales se pueden apilar en el genoma de la planta o en el mismo locus que el evento pDAB8264.42.32.1 , por ejemplo, por medio de cruza de plantas, retransformación de la planta transgénica que contiene el evento pDAB8264.42.32.1 o adición de nuevos rasgos a través de la integración dirigida por recombinación homóloga.

Otras modalidades incluyen la excisión de una porción o de la totalidad del inserto transgénico y/o de las secuencias flanqueantes del evento pDAB8264.42.32.1. Al tener lugar la excisión, es posible dirigir al inserto y/o a un inserto adicional al sitio cromosómico adicional del evento pDAB8264.42.32.1. El inserto ejemplificado puede ser reemplazado, o es posible insertar uno o más insertos adicionales, de esta manera, junto con el inserto ejemplificado del evento de soya objeto.

En una modalidad, la presente invención abarca un sitio cromosómico de soya situado en el cromosoma 15. En algunas modalidades, el sitio dirigido comprende un ácido nucleico heterólogo. En algunas modalidades, el sitio cromosómico de soya está situado entre las secuencias flanqueantes establecidas en SEC ID NO:1 y SEC ID NO:2.

En una modalidad, la presente invención abarca un metodo para preparar una planta de soya transgénica, que comprende insertar un ácido nucleico heterólogo en una posición en el cromosoma 15. En otra modalidad, el ácido nucleico heterólogo se inserta en el cromosoma 15 cerca de o entre diversos segmentos de polinucleótido ejemplificados como se describe en la presente.

Además, la presente invención provee ensayos para detectar la presencia del evento de la presente en una muestra (de soyas, por ejemplo). Los ensayos pueden estar basados en la secuencia de ADN del constructo recombinante, insertado en el genoma de la soya, y sobre las secuencias genómicas que flanquean el sitio de la inserción. También se proveen kits y condiciones que son útiles en los ensayos.

Por lo tanto, la presente invención se refiere en parte a la clonación y análisis de las secuencias de ADN de la totalidad de inserto dado a título de ejemplo y de las regiones de borde del mismo (en líneas de soya transgénica). Estas secuencias son únicas. Sobre la base de estos insertos y de las secuencias de borde (y de unión) es posible generar cebadores específicos para los eventos, y se los generó. El análisis por PCR demostró que estos eventos pueden ser identificados mediante análisis de los amplicones de PCR generados con estos conjuntos de cebador específicos del evento. Por lo tanto, estos procedimientos y otros relacionados, pueden utilizarse para identificar de manera univoca líneas de soya que comprenden el evento de la presente invención.

La presente invención tambien se refiere en parte a ensayos de PCR Taqman de punto final para la detección del evento 8264.42.32.1 . Algunas modalidades están orientadas a ensayos con los que es posible un análisis de los cigotos. La presente invención se refiere además, en parte, al uso de un gen de referencia GMFL01-25-J19 (GenBank: AK286292.1 ) para la determinar los cigotos. Estos procedimientos, y otros relacionados, pueden utilizarse para identificar de manera unívoca la constitución genética del evento pDAB8264.42.32.1 y para cultivar líneas de soya que comprenden el evento.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1 : es un mapa de plásmido de pDAB8264.

Figura 2: es un diagrama esquemático que representa ubicaciones de cebadores para confirmar la secuencia de borde 5’ y 3’ del evento de soya pDAB8264.42.32.1 .

Figura 3: es un diagrama esquemático que representa ubicaciones de cebadores para confirmar el ADN no transformado y genómico donde el evento de soya pDAB8264.42.32.1.

Figura 4: es un diagrama esquemático que representa ubicaciones de cebadores para la detección con ensayo TAQMAN del evento de soya pDAB8264.42.32.1.

Breve Descripción de las Secuencias SEC ID NO:1 proporciona la secuencia de borde flanqueante 5’ para el evento de soya objeto pDAB8264.42.32.1.

SEC ID NO:2 proporciona la secuencia de borde flanqueante 3’ para el evento de soya objeto pDAB8264.42.32.1.

SEC ID NO: 3 proporciona el cebador 4232_WF1 .

SEC ID NO:4 proporciona el cebador 4232_WF3.

SEC ID NO:5 proporciona el cebador 4232_WF4.

SEC ID NO:6 proporciona el cebador 4232_WR1.

SEC ID NO:7 proporciona el cebador 4232_WR2.

SEC ID NO:8 proporciona el cebador 4232_WR3.

SEC ID NO:9 proporciona el cebador 4232_WR4.

SEC ID NO:10 proporciona el cebador ED_v1_C1 .

SEC ID NO:1 1 proporciona el cebador PAT_11.

SEC ID NO:12 proporciona el cebador 4232_3'F.

SEC ID NO:13 proporciona el cebador 4232_3'R.

SEC ID NO:14 proporciona probe 4232_3'P.

SEC ID NO:15 proporciona el cebador GMS1 16F.

SEC ID NO:16 proporciona el cebador GMS1 16R.

SEC ID NO: 17 proporciona la sonda GMS116Probe.

SEC ID NO:18 proporciona el inserto de cadena T pDAB8264 y secuencias flanqueantes genómicas parciales 5’ y 3’.

SEC ID NO:19 proporciona la secuencia genómica a inserto 5' (incluyendo esa unión) para el evento de soya objeto PDAB8264.42.32.1.

SEC ID NO:20 proporciona la secuencia genómica a inserto 3’ (incluyendo esa unión) para el evento de soya objeto pDAB8264.42.32.1.

SEC ID NO:21 proporciona la secuencia para plásmido pDAB8264.

Descripción Detallada de la Invención La invención descrita en la presente incluye novedosos eventos de transformación de plantas de soya (soya) que comprenden un casete para la expresión de genes de tolerancia a múltiples herbicidas insertados en un lugar específico dentro del genoma de una celula de soya. Específicamente, se desarrollaron nuevas líneas de soya que contienen el evento pDAB8264.42.32.1. Este evento transgénico proporciona tolerancia a múltiples herbicidas que incluyen herbicidas fenoxiauxínicos y/o ariloxialcanoato, glifosato y/o glufosinato. La tolerancia a múltiples herbicidas permite que los agricultores elijan una combinación óptima de herbicidas para manejar de mejor forma sus poblaciones de malezas individuales.

El inserto transgénico ejemplificado que comprende el evento pDAB8264.42.32.1 incluye elementos genéticos para la expresión de tres genes diferentes de tolerancia a los herbicidas: (1 ) un gen aad-12 sintético; (2) una secuencia EPSPS modificada procedente de maíz que codifica una proteína que contiene las mutaciones, a diferencia con el polipéptido EPSP de tipo salvaje: en los residuos aminoácidos 102 (de treonina a isoleucina) y 106 (de prolina a serina) y que confiere resistencia o tolerancia a los herbicidas glifosato; y (3) un gen pat gene que confiere una tolerancia o resistencia a los herbicidas glufosinato. El gen aad-12 fue derivado de elftia acidovorans y codifica una enzima proteína ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-12) capaz de desactivar herbicidas que tienen una parte a-cetoglutarato, lo que incluye los herbicidas fenoxialcanoato (por ejemplo, los herbicidas ácido fenoxiacético tales como 2,4-D y MCPA; y los herbicidas ácido fenoxibutanoico tales como 2,4-DB y MCPB) y los herbicidas piridiloxialcanoico (por ejemplo, los herbicidas ácido piridiloxiacético tales como triclopir y fluroxipir), lo que incluyen las formas ácidas, sales o ásteres de sus ingredientes activos.

La invención objeto también proporciona ensayos para detectar la presencia del evento objeto en una muestra. Los aspecto de la invención objeto incluyen métodos de diseño y/o producción de cualquier molécula de ácido nucleico de diagnóstico ejemplificada o sugerida en la presente, en particular aquellas con base parcial o total en las secuencias flanqueantes objeto.

Esta invención se refiere en parte a la cultivo de plantas y de plantas con tolerancia a los herbicidas. En algunas modalidades, dicha secuencia de polinucleótidos puede ser “apilada” con otros rasgos (tales como uno o más genes adicionales de tolerancia a los herbicidas) y/o con genes que codifican proteínas que inhiben insectos o proteínas de ARN inhibidoras, por ejemplo).

Sin embargo, la presente invención tambien incluye plantas que tienen un único evento, como se describe en la presente.

Más específicamente, la invención objeto se refiere en parte al evento de soya transgénica pDAB8264.42.32.1 , líneas de plantas que comprenden estos eventos y la clonación y el análisis de las secuencias de ADN de este inserto y/o sus regiones de borde. Las líneas de plantas de la invención objeto se pueden detectar usando las secuencias reveladas y sugeridas en la presente.

En algunas modalidades, un segmento de polinucleótido ejemplificado o descrito en la presente (tales como SEC ID NO: 1 . SEC ID NO:2, y/o el inserto entre ellas, tal como se representa en la Figura 2, por ejemplo) se puede escindir y posteriormente redireccionar con secuencias de polinucleótidos adicionales.

En algunas modalidades, esta invención se refiere a líneas de soya tolerantes a herbicidas y su identificación. La invención objeto se refiere en parte a detectar la presencia del evento sujeto a fin de determinar si la progenie de una cruza sexual contiene el evento de interés. Además, se incluye un método para detectar el evento y es de ayuda, por ejemplo, para cumplir con las regulaciones que requieren la aprobación de precomercialización y la rotulación de alimentos derivados de plantas de cultivo recombinantes, por ejemplo. Es posible detectar la presencia del evento objeto por medio de cualquier método de detección de ácidos nucleicos bien conocidos tales como reacción de polimerasa en cadena (PCR) o hibridación de ADN usando sondas de ácido nucleico. Aquí se tratan ensayos de PCR específicos de eventos. (Ver, por ejemplo, Windels et al. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459462, 1999) como otro ejemplo). Algunos de estos ejemplos se refieren al uso de un grupo de cebadores que va desde el inserto y el ADN flanqueante.

Se ejemplifica en la presente el evento de soya pDAB8264.42.32.1 y su selección y caracterización para la estabilidad y la expresión como planta entera y niveles moleculares de generación en generación. Se han secuenciado ambas secuencias flanqueantes del evento pDA8264.42.32.1 y se las ha descrito en la presente como SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2. Se desarrollaron ensayos específicos para el evento. Tambien ha sido mapeado sobre el genoma de la soya (cromosoma 16 de la soya). Es posible someter el evento pDAB8264.42.32.1 a una introgresión en cultivares de elite en los que conferirá una tolerancia a los herbicidas de fenoxiauxina, glifosato y glufosinato en líneas de soya endogamias e híbridas.

El gen EPSPS de la presente invención codifica una sintasa de ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshikimico. El gen EPSPS de tipo salvaje se aisló originalmente de Zea mays, y se depositó la secuencia bajo el número de acceso a GenBank X63374. Ver también la patente de los Estados Unidos No. 6.566.587 (en particular, la SEC ID No. 3 en ella).

Para obtener una elevada expresión de genes heterólogos en las plantas, puede ser preferible volver a diseñar dichos genes de manera tal que se expresen más eficientemente en las células de plantas. La modificación de la secuencia de nucleótidos de EPSP de plantas de tipo salvaje puede proveer dicha resistencia cuando se exprese en una celula de planta. Como se describe en la patente ‘587, cuando se compara un polipéptido de EPSPS con el polipéptido de tipo salvaje, la modificación para sustituir isoleucina en lugar de treonina en el residuo 102 y sustituir serina en lugar de prolina en la posición 106 de la proteína, el resultado es el polipéptido EPSPS mutante doble (2mEPSPS) utilizado en el inserto de la presente. Cuando se exprese en una célula de planta, provee tolerancia al glifosato. Como alternativa, el gen EPSPS de la presente, que también lleva la denominación de “gen 2mepsps” o DMMG, puede ser optimizado a efectos de mejorar la expresión tanto en las plantas dicotiledóneas así como también en las plantas monocotiledóneas, y en particular en la soya. Es posible seleccionar el uso de los codones en base al uso preferible para los codones hemicotiledóneos, es decir se puede rediseñar de manera tal que la proteína es codificada por codones que tienen una inclinación tanto hacia el uso de monocotiledóneas como de dicotiledóneas. Las secuencias perjudiciales y los sitios de restricción superfluos pueden ser removidos para incrementar la eficiencia de la transcripción/translación de la secuencia de codificación 2mepsps y para facilitar los pasos para el manipuleo del ADN. Una versión optimizada en hemicotiledónea del gen monocotiledóneo de la presente ha sido objeto de mayor detalle en la solicitud provisional U. S. (número de serie 61 /419.703) presentada el 3 de diciembre de 2010 intitulada “OPTIMIZED EXPRESSION OF GLYFOSATE RESISTANCE ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES IN PLANT CELLS”.

Como se mencionó previamente en la presente, la introducción e integración de un transgen en un genoma de la planta involucra algunos eventos aleatorios (de allí el nombre de “evento” para una expresión dada que se expresa). Es decir, con muchas téenicas de transformación tales como la transformación de Agrobacterium, el "gen gun”, y WHISKERS, no puede predecirse dónde se insertará el transgén en un genoma. Por lo tanto, identificar el ADN genómico flanqueante de planta en ambos lados del inserto puede ser importante para identificar una planta que tienen un dado evento de inserción. Por ejemplo, los cebadores de PCR pueden diseñarse de manera tal que generan un amplicón de PCR a través de la región de empalme del inserto y el genoma hospedante. Este amplicón de PCR puede utilizarse para identificar un tipo de inserto único o distinto.

Durante el proceso de la introducción de un inserto en el genoma de células de plantas, no es raro que tengan lugar algunas supresiones u otras alteraciones del inserto y/o de las secuencias genómicas flanqueantes. Por lo tanto, el segmento relevante de la secuencia de plásmido provista en la presente podría comprender algunas variaciones menores. Aplica los mismo para las secuencias flanqueantes provistas en la presente. Por lo tanto, una planta que comprenda un polinucleótido que tiene un intervalo de identidades con las secuencias flanqueantes y/o de inserto, se halla dentro de los alcances de la presente invención. La identidad con respecto a la secuencia de la presente invención puede ser una secuencia de polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de por lo menos 65%, con mayor preferencia, de por lo menos 70%, con mayor preferencia, de por lo menos 75%, con mayor preferencia, por lo menos 80%, y con mayor preferencia, por lo menos 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con una secuencia ejemplificada o descrita en la presente. Tambien es posible utilizar la hibridación y las condiciones de hibridación descritas en la presente para definir tales secuencias de plantas y polinucleótidos de la presente invención. La secuencia que comprende las secuencias flanqueantes más la secuencia completa del inserto, puede ser confirmada con respecto a la semilla registrada.

Como “eventos” se consideran originalmente eventos aleatorios, como parte de esta revelación por lo menos 2.500 semillas de una línea de soya que comprende el evento han sido presentadas y puestas a disposición al público sin restricciones (pero sujeto a derechos de patente), ante la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. El registro lleva la denominación depósito ATCC No. PTA-1 1993. 100 paquetes (25 semillas por paquete) de semillas de Glycine max (“semillas de semilla de soya Glycine max L.\ pDAB8264.42.32.1 ) fueron depositados el 1 1 de julio de 2011. El depósito se probó el 26 de julio de 201 1 y en dicha fecha, las semillas eran viables. Se hizo el registro y se lo mantendrá de acuerdo con y bajo los temimos del Tratado de Budapest con respecto a las registros de semillas a los fines del procedimiento de patente. Se mantendrá el registro sin restricción en el depósito de ATCC, que es un depósito público, durante un periodo de 30 años, o de cinco años despues del requerimiento más reciente, o durante la duración efectiva de la patente, lo que sea más prolongado, y se las reemplazará si se vuelven no viables durante dicho período.

Las semillas depositadas son parte de la presente invención. Es evidente que es posible cultivar plantas de soya a partir de estas semillas, y tales plantas son parte de la presente invención. La presente se refiere también a secuencias de ADN contenidas en dichas plantas de soya, que son útiles para detectar estas plantas y la descendencia de las mismas. Los métodos y kits de detección de la presente invención pueden ser utilizados para identificar cualesquiera uno, dos o la totalidad de los tres de estos eventos, en función de la utilización final prevista para el ensayo.

En la presente se proveen definiciones y ejemplos para ayudar a describir la presente invención y para guiar las personas con pericia en la especialidad a llevar la invención a la práctica. A menos que se indique otra cosa, debe entenderse que las definiciones comciden con el uso convencional por las personas con pericia en la especialidad correspondiente. Para la nomenclatura de las bases de ADN se utiliza el 37 CFR §1.822.

Tal como se lo utiliza en la presente, el termino “descendencia” indica la descendencia de cualquier generación de una planta genitora que comprende el evento de soya pDAB8264.42.32.1.

Se produce un “evento” transgénico mediante la transformación de células de plantas con ADN heterólogo, un constructo ácido nucleico que incluye un transgén de interés, regeneración de una población de plantas resultante de la inserción del transgén en el genoma de la planta, y selección de una planta en particular caracterizada por su inserción en una ubicación genómica particular. El término “evento” se refiere al transformante original y a la descendencia del transformante que incluye el ADN heterólogo. El término “evento” también se refiere a la descendencia producida por cruzamiento sexual entre el transformante y otra variedad que incluye el ADN genómico/de transgén. Aún después de retrocruzamiento repetido a un genitor recurrente, el ADN de transgén y el ADN genómico flanqueante (ADN genómico/de transgén) del genitor transformado se halla presente en la descendencia del cruce en la misma ubicación cromosomita. El término “evento” también se refiere al ADN del transformante original y de la descendencia del mismo, comprenden el ADN insertado y la secuencia genómica flanqueante inmediatamente adyacente al ADN insertado del que se proveería que se transferirá a una descendencia que recibe ADN insertado que incluye el transgén de interés como resultado de un cruce sexual de una línea genitora que incluye el ADN insertado (por ejemplo, el transformante original y la descendencia resultante de la autofecundación) y una línea genitora que no contiene el ADN insertado.

Una “secuencia de empalme” abarca el punto en el que el ADN insertado en el genoma se vincula al ADN del genoma de soya nativo que flanquea el punto de inserción, siendo suficiente para diagnosticar el evento, la identificación o detección de una u otra de las secuencias de empalme en el material genetico de una planta. Se incluyen las secuencias de ADN que abarcan las inserciones en el evento de Soyas aquí descrito y longitudes similares del ADN flanqueante. En la presente se proveen ejemplos específicos de tales secuencias de diagnóstico; sin embargo, otras secuencias que abarcan los empalmes de las inserciones, o los empalmes de las inserciones y la secuencia genómica, también tienen un valor de diagnóstico y podrían utilizarse de acuerdo con la presente invención.

La presente invención se refiere en parte a la identificación de eventos mediante tales secuencias flanqueantes, de empalme y de inserto. En la invención se incluyen cebadores de PCR y amplicones relacionados. De acuerdo con la presente invención, pueden utilizarse métodos de análisis por PCR en los que se utilizan amplicones que abarcan a través del ADN insertado y sus límites, para detectar o identificar variedades o líneas de soya transgénicas comercializadas derivadas de las líneas de soya transgénica registradas de la presente invención.

El plásmido binario, pDAB8264 (SEC ID NO:21 ) comprende los elementos geneticos ilustrados en la Figura 1. Los siguientes elementos genéticos (no se incluyen las secuencias de limite de cadena) se hallan contenidos dentro de la región de cadena T de pDAB8264. En la Tabla 1 , se provee la numeración de los residuos de los elementos genéticos con respecto a la SEC ID NO: 21 revelada en la presente.

Tabla 1 : Numeración de los residuos de los elementos genéticos que comprenden el plásmido binario pDAB8264 (SEC ID NO: 21 ).

Las secuencias SEC ID NOs: 19 y 20, respectivamente, son las secuencias flanqueantes 5' y 3' junto con las porciones 5' y 3' de la secuencia del inserto, como se describe con mayor detalle en lo que sigue, y por lo tanto incluyen las secuencias “de empalme" o de “transición” 5' y 3' del inserto y del ADN genómico. Con respecto a la SEC ID NO: 19, los residuos 1-1246 son la secuencia genómica flanqueante 5', y los residuos 1247-1250 son los residuos del extremo 5' del inserto. Con respecto a la SEC ID NO: 20, los residuos 1-176 son los residuos del extremo 3' del inserto, y los residuos 177-680 son la secuencia genómica flanqueante 3'. Por lo tanto la secuencia de empalme o la transición con respecto al extremo 5' del inserto tiene lugar en los residuos 1246-1247 de la SEC ID NO: 19. Por lo tanto la secuencia de empalme o transición con respecto al extremo 3' del inserto tiene lugar en los residuos 176-177 de la SEC ID NO: 20. Los polinucleótidos de la presente invención incluyen aquellos que comprenden, por ejemplo, 5, 10, 20, 50, 100, 150 ó 200 bases, o eventualmente más, y cualesquiera incrementos entre los mismos, en ambos lados de la secuencia de empalme. Por lo tanto, un cebador que abarque la secuencia de empalme podría comprender, por ejemplo, 5-10 bases que se hibridarían con la secuencia flanqueante y 5-10 bases que se hibridarían con la secuencia del inserto. De manera similar podrían diseñarse sondas y amplicones, si bien frecuentemente serian más largos que los cebadores.

Las secuencias del caso (que incluyen las secuencias flanqueantes) son únicas. Sobre la base de estas secuencias de inserto y de borde, se generaron cebadores específicos para los cebadores. El análisis por PCR demostró que las líneas de soya pueden ser identificadas en diferentes genotipos de soya mediante análisis de los amplicones de PCR generados mediante estos conjuntos de cebador específicos para los eventos. Por lo tanto, estos procedimientos, y otros procedimientos relacionados, pueden utilizarse para identificar de manera única estas líneas de soya. Las secuencias identificadas en la presente son únicas.

Las teenicas de detección de la presente invención son especialmente útiles en conjunción con la cultivo de plantas, para determinar cuáles plantas de descendencia comprenden un evento dado, después de que una planta genitora que comprende un evento de interés haya sido cruzado con otra línea de plantas en un esfuerzo por impartir uno o más rasgos adicionales en la descendencia. Estos métodos de análisis por PCR son útiles para los programas de cultivo de soya así como también para el control de calidad, especialmente para las semillas de soya transgénicas comercializadas. Ahora es también posible preparar kits para la detección por PCR de estas líneas transgénicas de soya. Esto puede ser útil en el registro del producto y en la gestoría del producto.

Por otra parte, las secuencias flanqueantes/genómicas de soya pueden utilizarse para identificar específicamente la ubicación genómica de cada inserto. Esta información puede utilizarse para preparar marcadores de sistema específicos para cada evento. Los mismos pueden utilizarse para estrategias de cultivo aceleradas y para establecer datos de vinculación.

Más aún, la información de secuencia flanqueante puede utilizarse para estudiar y caracterizar procesos de integración de transgenes, características de sitios de integración genómica, clasificación de eventos, estabilidad de transgenes y de sus secuencias flanqueantes, y la expresión de genes (especialmente referido al silenciado de genes, patrones de metilación de transgenes, efectos de posición, y potenciales elementos relacionados con la expresión tales como MARS [matrix attachment regions, regiones de fijación de matriz], y similares.

A la luz de la descripción objeto, se debe aclarar que la presente invención incluye semillas depositadas para el evento objeto el 1 1 de julio de 201 1 - disponible según el depósito ATCC No. PTA-1 1993. La presente invención tambien incluye una planta de soya tolerante a herbicida crecida de una semilla depositada en ATCC según su número de acceso en esta fecha. La presente invención también incluye partes de dicha planta, tales como hojas, muestras de tejido, semillas producidas por dicha planta, polen, harina (harina de soya) y similares (en donde ellos comprenden un inserto transgénico flanqueado por SEC ID NO:1 y SEC ID NO:2). La presente invención también incluye células no totipotentes de cualquiera de las plantas objeto (incluyendo células de las partes de tales plantas tal como se enumeró con anterioridad).

En vista de la revelación de la presente, debe ser evidente que la presente invención incluye semillas disponibles bajo el ATCC Deposit No. PTA-1 1336. La presente invención también incluye una planta de soya resistente a los herbicidas cultivada a partir de una semilla registrada con el ATCC bajo el número de acceso PTA-1 1336. La presente invención incluye además partes de dicha planta, tales como hojas, muestras de tejido, semillas producidas por dicha planta, polen, y similares (que comprenden un inserto transgenico flanqueado por las SEC ID NO:1 y SEC ID NO:2).

Más aún, la presente invención incluye descendentes y/o plantas de descendencia de plantas cultivadas a partir de la semilla registrada, preferentemente una planta de soya resistente a los herbicidas, en donde dicha planta tiene un genoma que comprende un ADN genómico de tipo salvaje /ADN de inserto de empalme como se describe en la presente. Tal como se lo utiliza en la presente, el término “soya” significa Glycine max e incluye todas las variedades que pueden reproducirse con una planta de soya.

La invención incluye además procesos para realizar cruces mediante la utilización de una planta de la presente invención a título de por lo menos un genitor. Por ejemplo, la presente invención incluye una planta híbrida Fi que tiene como uno o ambos genitores cualquiera de las plantas ejemplificadas en la presente. También dentro de la presente invención se encuentra la semilla producida mediante tales híbridos de la presente invención. Esta invención incluye un método para producir una semilla híbrida F·, mediante el cruce de una planta ejemplificada con una planta diferente ((por ejemplo un genitor endogámico) y cosechándose la semilla híbrida resultante. La presente invención incluye una planta ejemplificada que es sea un genitor hembra sea un genitor hembra. Las características de las plantas resultantes pueden mejorarse mediante una consideración cuidadosa de las plantas genitoras.

Es posible reproducir una planta de soya resistente a los herbicidas empezándose por cruzar sexualmente una primera planta genitora de soya consistente en una planta de soya cultivada a partir de semilla de cualquier de las líneas a las cuales se hizo referencia en la presente, y una segunda planta de soya genitora, con lo que se produce una pluralidad de primeras plantas de descendencia; seguidamente se selecciona una primera planta de descendencia que sea resistente a un herbicida (o que posea por lo menos uno de los eventos de la presente invención); se autofecunda la primera planta de descendencia, con lo que se produce una pluralidad de segundas plantas de descendencia; y a continuación se selecciona de entre las segundas plantas de descendencia una planta que sea resistente a un herbicida (o que posea por lo menos uno de los eventos de presente invención). Estos pasos pueden además incluir el retrocruzamiento de la primera planta de descendencia o de la segunda planta de descendencia con respecto a la segunda planta de soya genitora o con respecto a una tercera planta de soya genitora. A continuación es posible plantar una planta de cultivo de soya que comprende semillas de la presente invención, o la descendencia de la misma, Tambien debe entenderse que es posible aparear dos plantas transgénicas diferentes de manera de producir una descendencia que contiene dos genes exógenos segregantes añadidos. La autofecundación de una descendencia adecuada puede producir plantas que son homocigotos para ambos genes exógenos añadidos.

También se tiene en cuenta el retrocruzamiento a una planta genitora y el cruce con una planta no transgénica, como también la propagación vegetativa. En la téenica se conocen otros métodos de cultivo de uso común para diferentes rasgos y plantas de cultivo. Se ha utilizado el cultivo por retrocruzamiento para transferir para un rasgo heredado, sumamente deseable, en un cultivar homocigoto deseable o en una línea endogámica, que es su genitor recurrente. La fuente del rasgo a ser transformado recibe la designación de genitor donante. Se prevé que la planta resultante tendrá los atributos del genitor recurrente (por ejemplo, el cultivar) y el rasgo deseable transferido desde el genitor donante. Después del cruce inicial, los individuos que posean el fenotipo del genitor donante se seleccionan y cruzan repetidamente (se retrocruzan) con el genitor recurrente. Se prevé que el genitor resultante tendrá los atributos del genitor recurrente (por ejemplo, del cultivar) y el rasgo deseable transferido desde el genitor donante.

Las moléculas de ADN de la presente invención pueden utilizarse como marcadores moleculares en un método MAB (marker assisted breeding, cultivo asistido por marcador). Las moléculas de ADN de la presente invención pueden utilizarse en métodos (tales como, marcadores AFLP, marcadores RFLP, marcadores RAPD, SNPs, y SSRs) que identifican rasgos agronómicamente útiles genéticamente vinculados, conocidos por la persona con pericia en la especialidad. El rasgo de resistencia a los herbicidas puede rastrearse en la descendencia de un cruce con una planta de soya de presente invención (o descendencia de la misma y cualquier otro cultivar o variedad de soya) mediante los metodos MAB. Las moléculas de ADN son marcadores para este rasgo, y los métodos MAB que son conocidos de la persona con pericia en la especialidad pueden utilizarse para rastrear el o los rasgos de resistencia a los herbicidas en plantas de soya en las que por lo menos una línea de soya de la presente invención, o descendencia de la misma, era un genitor o ancestro. Los métodos de la presente invención pueden utilizarse para identificar cualquier variedad de soya que tenga el evento de la presente.

Los métodos de la presente invención incluyen un método para producir una planta de soya con tolerancia a los herbicidas, en donde dicho método comprende la introgresión del evento pDAB8264.42.32.1 en un cultivar de soya. Más específicamente, los métodos de la presente invención pueden comprender el cruce de dos plantas de la presente invención, o de una planta de la presente invención y cualquier otra planta. Los métodos preferidos comprenden además la selección de la descendencia de dicho cruce mediante el análisis de dicha descendencia en busca de un evento detectable de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, la presente invención puede utilizarse para rastrear el evento de la presente por intermedio de ciclos de cultivo con plantas que comprenden otros rasgos deseables, tales como rasgos agronómicos tales como los ensayados en varios ejemplos. Las plantas que comprenden el evento de la presente y el rasgo deseado pueden ser detectadas, identificadas, seleccionadas y utilizadas rápidamente en otros ciclos de cultivo, por ejemplo. El evento/rasgo de la presente tambien combinarse mediante cultivo, y rastrearse de acuerdo con la presente invención, con uno o más rasgos de resistencia a los insectos, y/o con otros rasgos de tolerancia a los herbicidas. Una modalidad de estos últimos es una planta que comprende el evento de la presente combinado con un gen que codifique una resistencia al herbicida dicamba.

Por lo tanto, la presente invención puede combinarse con, por ejemplo, rasgos adicionales que codifican la resistencia al glifosato (por ejemplo, glifosato oxidasa ( GOX ) bacteriano o de planta resistente), glifosato acetil transferasa (GAD, rasgos adicionales para la resistencia al glufosinato (por ejemplo, resistencia al bialafos (bar)), rasgos que confieren una resistencia al herbicida que inhibe la lactato sintasa (ALS) (por ejemplo, las azolinonas [tales como imazetapir], sulfoniureas, triazolopirimidinasulfonanilida, pirmidiniltiobenzoatos, y otros compuestos químicos [Csr1, SurA, et al.]), rasgos de resistencia al bromoxinil (por ejemplo, Bxn), rasgos para la resistencia al herbicida dicamba (Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 2003/0135879), rasgos para la resistencia a los inhibidores de la enzima HPPD (4-hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa), rasgos para la resistencia a los inhibidores de la fitoeno desaturasa (PDS), rasgos para la resistencia a los herbicidas que inhiben el fotosistema lis (por ejemplo, psbA), rasgos para la resistencia a los herbicidas que inhiben el fotosistema I, rasgos para la resistencia a los herbicidas inhibidores del PPO (protoporfirógeno oxidasa IX, por ejemplo, PPO-D, y rasgos para la resistencia a los herbicidas fenilurea (por ejemplo, CYP76B1). Es posible combinar uno o más de tales rasgos con la presente invención a efectos de proveer la capacidad de controlar, retardar y/o prevenir de manera efectiva los corrimientos de las malezas y/o de la resistencia a los herbicidas de múltiples clases.

La persona con pericia en la especialidad comprenderá que el gen aad-12 utilizado en la presente invención tambien provee una resistencia a los compuestos que son convertidos en herbicidas fenoxiacetato auxina (por ejemplo, 2,4-DB, MCPB, etc.). La parte de ácido butírico presente en el herbicida 2,4-DB se convierte mediante b-oxidación en el ácido 2,4-diclorofenoxiacético que es fitotóxico. De manera similar, el MCPB se convierte mediante b-oxidación en el MCPA que es fitotóxico. Los herbicidas ácido butanoico de por si no son herbicidas, pero se convierten en sus respectivo ácido a partir de b-oxidación dentro de las plantas sensibles de manera de producir la forma de ácido acético del herbicida que es fitotóxico. Las plantas capaces de una b-oxidación rápida no son dañadas por los herbicidas ácido butanoico. Sin embargo, las plantas que son capaces de una b-oxidación rápida y que pueden convertir el herbicida ácido butanoico en su forma acética son subsiguientemente protegidas por el AAD-12.

En la especialidad se conocen métodos para aplicar herbicidas. Tales aplicaciones pueden incluir mezclas de tanque de más de un herbicida. Los herbicidas preferidos para su uso de acuerdo con la presente invención son combinaciones de glifosato, glufosinato, y un herbicida fenoxi auxina (tales como 2,4-D; 2,4-DB; MCPA; MCPB). Otras combinaciones preferidas incluyen mezclas de glifosato plus 2,4-D o glufosinato plus 2,4-D. Estos tres tipos de herbicidas pueden utilizarse en combinaciones ventajosas que serian aprobadas por una persona con pericia en la especialidad que tiene el beneficio de la presente revelación. Es posible aplicar uno o más de los herbicidas del caso a un campo/área antes de plantar en el mismo las semillas de la presente invención. Tales aplicaciones pueden efectuarse dentro de los 14 días, por ejemplo, de haberse plantado las semillas de la presente invención. Tambien es posible aplicar uno o más de los herbicidas del caso después de la plantación, antes de la emergencia. También es posible aplicar uno o más de los herbicidas del caso al terreno (para controlar las malezas) o sobre la parte superior de las malezas y/o sobre la parte superior de las plantas transgénicas de la presente invención. Los tres herbicidas del tema pueden rotarse o utilizarse en combinación para, por ejemplo, controlar o prevenir malezas que podrían tener una tolerancia frente a un herbicida pero no frente a otro. Pueden utilizarse diversos momentos para los tres herbicidas del caso, de diversas maneras, como es sabido de la persona con pericia en la especialidad.

Además, el evento de la presente puede ser apilado con uno o más rasgos adicionales de tolerancia a los herbicidas, uno o más rasgos de entradas adicionales (por ejemplo, resistencia a los insectos, resistencia a los hongos, o tolerancia al stress, et al.) o de salidas adicionales (por ejemplo, mayor rendimiento, mejor perfil de aceites, mejor calidad de las fibras, et al.), tanto transgenicos como no transgénicos. Por lo tanto, la presente invención puede utilizarse para proveer un paquete agronómico completo con una planta de cultivo de mejor calidad con la capacidad de controlar de manera flexible y efectiva desde el punto de vista de los costos, cualquier cantidad de plagas agronómicas.

Los métodos para integrar una secuencia de polinucleótidos dentro de un sitio cromosómico específico de una célula de planta por intermedio de precombinación homologa han sido descritos dentro de la especialidad. Por ejemplo, la integración específica de sitio, como se describe en la Solicitud de patente de los EE.UU. No. 2009/01 11 188 A1. describe el uso de recombinasas o integrasas para mediar la introducción de una secuencia polinucleótido donante en un blanco cromosómico. Además, en la Solicitud de patente International No. W O 2008/021207, se describe una precombinación homologa mediada por dedos de cinc para integrar una o más secuencias polinucleótidas donantes dentro de ubicaciones específicas del genoma. Puede recurrirse al uso de recombinasas tales como FLP/FRT como se describe en la patente de los Estados Unidos No. No. 6,720,475, o del CRE/LOX como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,658,772, para integrar una secuencia de polinucleótidos en un sitio cromosómico específico.

Finalmente, el uso de meganucleasas para apuntar a polinucleótidos donantes en ubicación cromosómica específica, como se describe en: Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060).

Hay varios otros metodos para la integración específica de sitio dentro de células de plantas, generalmente conocidos y aplicables (Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001 ) pp. 155-159). Por otra parte, pueden emplearse sistemas de recombinación específicos de sitio que han sido identificados en varios organismos procariotas y eucariotas inferiores, para su uso en las plantas. Los ejemplos de tales sistemas incluyen, pero sin limitación, el sistema recombinasa R/RS del plásmido pSR1 de la levadura Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203), y el sistema Gin/gix del fago Mu (Maeser y Kahlmann (1991 ) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176).

En algunas modalidades de la presente invención, puede ser deseable integrar o apilar uno o más transgenes en la proximidad de un evento transgénico existente. El evento transgénico puede ser considerado como un sitio genómico preferido que fue seleccionado en base a características únicas tales como sitio de la inserción único, segregación mendeliana normal y expresión estable, y una combinación superior de eficacia, que incluye una tolerancia a los herbicidas y una performance agronómica en y a través de múltiples ubicaciones ambientales. Los transgenes recién integrados deberían mantener las características de expresión transgénica de los transformantes existentes. Mas aún, el desarrollo de ensayos para la detección y confirmación del evento recien integrado quedaría superado ya que las secuencias genómicas flanqueantes y la ubicación cromosómica del evento recientemente integrado ya han sido identificados. Finalmente, la integración de un nuevo transgén en una ubicación cromosómica específica que está ligada a un » transgén existente facilitaría la introgresión del transgén en otros segundos planos genéticos por medio del cruce sexual en el que se utilizan métodos de cultivo convencionales.

En algunas modalidades de la presente invención, puede ser deseable extirpar secuencias de polinucleótidos desde un evento transgénico. Por ejemplo, la extirpación de transgén como se describe en la solicitud de patente provisional No. 61/297.628, describe el uso de nucleadas de dedos de cinc para remover una secuencia de polinucleótidos consistente en un casete de expresión de gen, desde un evento transgénico cromosómicamente integrado. La secuencia de polinucleótidos que se remueve puede ser un marcador seleccionable. Al tener lugar la extirpación y remoción de una secuencia de polinucleótidos es posible reapuntar al evento transgénico dirigido mediante la inserción de una secuencia de polinucleótidos. La extirpación de una secuencia de polinucleótidos y el subsiguiente redireccionamiento del evento transgénico dirigido proveen ventajas tales como la reutilización de un marcador seleccionable o la capacidad de superar cambios no previstos en el transcriptoma de planta que resulta de la expresión de genes específicos.

La presente invención revela en la presente un sitio específico sobre el cromosoma 15 en el genoma de la soya que es excelente para la inserción de heterólogos de ácido nucleico. Tambien se revela una secuencia flanqueante 5' y una secuencia flanqueante 3', que también pueden ser útiles para identificar y/o apuntar a la ubicación del sitio de inserción/apuntamiento en el cromosoma 15. Por lo tanto, la presente invención provee métodos para introducir heterólogos de ácidos nucleicos de interés en este sitio dirigido preestablecido o en la vecindad de este sitio dirigido. La presente invención también abarca una semilla de soya y/o una planta de soya que comprenden cualquier secuencia heteróloga de nucleótidos insertada en el sitio dirigido revelado o en la vecindad general de un sitio tal. Una opción para implementar una integración así apuntada consiste en extirpar y/o sustituir un inserto diferente en lugar del casete de expresión pat ejemplificado en la presente. En este aspecto general, la recombinación homóloga apuntada, por ejemplo y sin limitación, puede utilizarse de acuerdo con la presente invención.

Tal como se la utiliza en la presente, la expresión “apilamiento” de eventos o rasgos se refiere a combinar rasgos deseados en una única línea transgénica. Los reproductores de plantas apilan rasgos transgénicos para los cual efectúan cruces entre genitores cada uno de los cuales tiene un rasgo deseado y seguidamente identifican la descendencia que tiene estos dos rasgos deseados. Otra manera de apilar genes consiste en transferir dos o más genes en el núcleo de la célula de una planta al mismo tiempo durante la transformación.

Otra manera de apilar genes es mediante la retransformación de una planta transgenica con otro gen de interés. Por ejemplo, el apilamiento de genes pueden utilizarse para combinar dos o más rasgos diferentes, que incluyen por ejemplo, dos o más rasgos de insectos, uno o más rasgos de resistencia a los insectos, uno o más rasgos de resistencia a la enfermedades, dos o más rasgos de resistencia a los herbicidas, y/o rasgos de resistencia a los insectos y de resistencia a los herbicidas. El uso de un marcador seleccionable en adición a un gene de interés también puede ser considerado como un apilamiento de genes.

La expresión “recombinación heteróloga” se refiere a una reacción entre cualquier par de secuencias de nucleótidos que tienen sitios correspondientes que contienen una secuencia de nucleótidos similar a través de la cual las dos secuencias de nucleótidos pueden interactuar (recombinarse) de manera de formar una nueva secuencia de ADN recombinante. En la presente, los sitios de secuencias de nucleótidos similares reciben, cada uno de ellos, la denominación de “secuencia de homología”. En términos generales, la frecuencia de la recombinación homologa aumenta a medida que aumenta la longitud de la secuencia de homología. Por lo tanto, si bien la recombinación homóloga puede presentarse entre dos secuencias de nucleótidos que son menos que idénticos entre sí, la frecuencia de recombinación (o eficiencia) declina a medida que aumenta la divergencia entre las dos secuencias. La recombinación puede llevarse a cabo utilizando una secuencia de homología sobre cada una de las moléculas donante y blanco, con lo que se genera un producto de recombinación de “cruce simple”. Como alternativa, es posible colocar dos secuencias de homología sobre cada una de las secuencias de nucleótidos blanco y donante. La recombinación entre dos secuencias de homología sobre el donante con dos secuencias de homología sobre el blanco genera un producto de recombinación de “doble cruce”. Si -la secuencia de homología sobre la molécula donante flanquea una secuencia que deba ser manipulada (por ejemplo, una secuencia de interés), la recombinación de doble cruce con la molécula blanco resultará en un producto de recombinación en donde la secuencia de interés reemplaza una secuencia de ADN que se hallaba originalmente entre las secuencias de homologías sobre la molécula blanco. El intercambio de la secuencia de ADN entre el blanco y el donante por intermedio del evento de la recombinación de doble cruce recibe la denominación de “reemplazo de la secuencia”.

El evento de la presente permite la expresión transgénica de tres proteínas diferentes de tolerancia a los herbicidas, resultando una tolerancia a las combinaciones de herbicidas que controlarían casi la totalidad de las malezas de hojas anchas y de pasto. Este casete de expresión del rasgo de tolerancia a múltiples herbicidas/ inserto transgénico puede apilarse con otros rasgos de tolerancia a los herbicidas (por ejemplo, resistencia al glifosato, resistencia al glufosinato, resistencia a la imidazolinona, resistencia al dicamba, resistencia al HPPD, resistencia al bromoxinilo, et al.), y con rasgos de resistencia a los insectos (tales como Cry1F, CrylAb, CrylAc, Cry 34/45, CrylBe, CrylCa, CryIDa, CryIEa, CrylFa, proteínas insecticidas vegetativas (VIPS) - que incluyen VIP3A, y similares) por ejemplo. Además, las proteínas de tolerancia a los herbicidas eh el casete de expresión / inserto transgenico de la presente invención pueden servir como uno o más marcadores seleccionables para ayudar en la selección de transformantes primarios de plantas genéticamente diseñadas con un segundo gen o grupo de genes.

Estas combinaciones de rasgos dan origen a métodos novedosos para controlar las malezas y especies (similares), debido a la resistencia recientemente adquirida, o a la tolerancia inherente a los herbicidas (por ejemplo, glifosato). Por lo tanto, los métodos novedosos para controlar las malezas mediante el evento pDAB8264.42.32.1 se hallan dentro del alcance de la invención.

El uso de los rasgos transgénicos de la presente, apilados o transformados individualmente en plantas de cultivo, provee una herramienta para controlar otras plantas de cultivo voluntarias tolerantes a los herbicidas, que no contiene genes para conferir una tolerancia a los herbicidas fenoxi, piridiloxi, glifosato y/o glufosinato.

Una planta, o una semilla, preferidas, de la presente invención comprende en su genoma la secuencia del inserto, identificada en la presente, junto con por lo menos 20-500 o más nucleótidos flanqueantes contiguos en ambos lados del inserto, como se describe en la presente. A menos que se indique otra cosa, la referencia a secuencias flanqueantes se refiere a aquellas identificadas con respecto a SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2. Nuevamente, los eventos de la presente incluyen ADN heterólogo insertado entre las secuencias flanqueantes genómicas del caso inmediatamente adyacentes al ADN insertado. Podría preverse que la totalidad, o parte, de estas secuencias flanqueantes se transferirán a la descendencia que recibe el ADN insertado como un resultado del cruce sexual de una línea genitora que incluye el evento.

La presente invención incluye cultivos de tejidos de celulas regenerables de una planta de la presente invención. También se incluye una planta regenerada a partir de un cultivo de tejidos tal, particularmente donde dicha planta es capaz de expresar la totalidad de las propiedades morfológicas y fisiológicas de una variedad dada a título de ejemplo. Las plantas preferidas de la presente invención tienen la totalidad de las características fisiológicas y morfológicas de una planta de cultivo a partir de la semilla registrada. Esta invención comprende además la descendencia de dicha semilla y la semilla que posea los rasgos de calidad de interés.

Las manipulaciones (tales como mutación, y transfección, y cultivo) de plantas o semillas, o de partes de las mismas, pueden llevar a la creación de lo que puede denominarse variedades “esencialmente derivadas”. La International Union for the Protection of New Varieties of Plants (UPOV) ha provisto la siguiente directiva para determinar si una variedad ha sido esencialmente derivada de una variedad protegida: [A] se considerará que una variedad habría sido esencialmente derivada de otra variedad (“the inicial variety") cuando (i) ha sido derivada predominantemente a partir de la variedad inicial, o a partir de una variedad que su vez ha sido derivada predominantemente de la variedad inicial, sin dejar de conservar la expresión de las características esenciales que resultan del genotipo o de la combinación de genotipos de la variedad inicial; (ii) es claramente distinguible de la variedad inicial; y (iii) con la salvedad de diferencias que resultan del acto de la derivación, se conforma con la variedad inicial en la expresión de las características esenciales que resultan del genotipo o combinación de genotipos de la variedad inicial.

UPOV, Sixth Meeting with International Organizations, Ginebra, 30 de octubre de 1992; documento preparado por la Office of the Union.

Tal como se la utiliza en la presente, una “línea” es un grupo de plantas que presenta poca o ninguna variación genetica entre individuos para por lo menos un rasgo. Es posible crear tales líneas por medio de varias generaciones de autopolinización y selección, o mediante propagación vegetativa a partir de un único genitor para lo cual se utilizan téenicas para el cultivo de tejidos o células.

Tal como se los utiliza en la presente, los términos “cultivar” y “variedad” son sinónimos y se refieren a una línea que se utiliza para la producción comercial.

Las expresión “estabilidad” o “estable” significan que con respecto al componente dado, el componente se mantiene de generación en generación, y preferentemente por lo menos tres generaciones con sustancialmente el mismo nivel, por ejemplo, preferentemente ± 15%, con mayor preferencia, por lo menos ±10%, con mayor preferencia, ± 5%. La estabilidad puede ser afectada por la temperatura, ubicación, stress y el momento de la plantación. La comparición entre generaciones subsiguientes bajo condiciones de campo debería producir el componente de una manera similar.

La “utilidad comercial” se define por el hecho de que las plantas tienen un buen vigor y una elevada fertilidad, de manera tal que la planta puede ser producida por los granjeros que utilicen equipos de granja convencionales, y de manera tal que es posible extraer el aceite de la semilla mediante equipos de trituración y extracción convencional. Para que sea comercialmente útil, el rendimiento, medida por peso de la semilla, contenido de aceite, y aceite total producido por acre, se halla dentro del 15% del rendimiento promedio de una variedad comercial de soya comparable sin los rasgos Premium cultivados en la misma región.

“Agronómicamente elite” significa que una línea tiene características agronómicas deseables tal como rendimiento, madurez, resistencia a las enfermedades, y similares, además de la tolerancia a los herbicidas debida al o a los eventos de la presente. Los rasgos agronómicos, considerados individualmente o en cualquier combinación, como se indican en los siguientes Ejemplos, en una planta que comprende un evento de la presente invención, se hallan dentro de los alcances de la presente invención. Cualquiera y la totalidad de estas características agronómicas y puntos de datos pueden utilizarse para identificar tales plantas, sea como un punto o en cualquier extremo o en ambos extremos de un intervalo de características utilizadas para definir tales plantas.

Como reconocerá una persona con pericia en la especialidad a la luz de esta revelación, las modalidades preferidas de los kits pueden incluir sondas y/o cebadores dirigidos a y/o que comprenden “secuencias de empalme” o “secuencias de transición” (en las que la secuencia genómica flanqueante de la soya se encuentra con la secuencia del inserto). Por ejemplo, esto incluye sondas de polinucleótidos, cebadores, y/o amplicones diseñados para identificar una o ambas secuencias de empalme (en donde el inserto se encuentra con la secuencia flanqueante), como se indica en la Tabla 1. Un diseño común consiste en que un cebador se híbrida en la región flanqueante, y un cebador se híbrida en el inserto. Tales cebadores tienen frecuentemente cada uno de ellos una longitud de aproximadamente 15 residuos. Con esta disposición, pueden utilizarse los cebadores para generar/amplificar un amplicón detectable que indica la presencia de un evento de la presente invención. Estos cebadores pueden utilizarse para generar un amplicón que abarca (y que incluye) una secuencia de empalme como indicado arriba.

Típicamente, el “touching down” del/de los cebadores en la secuencia flanqueante no está diseñado para hibridar más allá de aproximadamente 200 bases más allá del empalme. Por lo tanto, los cebadores de flanqueo típicos se diseñarían de manera de comprender por lo menos 15 residuos de cada cadena dentro de 15 bases en las secuencias flanqueantes desde el inicio del inserto. Es decir, los cebadores que comprenden una secuencia de un tamaño adecuado a partir de (o que se híbridan a) residuos dentro de aproximadamente 100 a 200-500 bases de cualquier secuencia de empalme, o de ambas, identificadas en lo que precede, se hallan dentro de los alcances de la presente invención. De manera similar es posible diseñar cebadores de inserto en cualquier parte sobre el inserto, pero los residuos en el inserto (que incluyen el complemento) dentro de aproximadamente 100 a 200-500 bases de la(s) secuencia(s) de empalme identificada(s) en lo que precede, pueden utilizarse, por ejemplo, a título no exclusivo, para este diseño de cebador.

Una persona con pericia en la especialidad tambien reconocerá que los cebadores y sondas pueden diseñarse de manera de hibridar, bajo una gama de condiciones de hibridación y/o PCR estándar, a segmentos de secuencias ejemplificadas en la presente (o complementos de los mismos), en donde el cebador o sonda no es perfectamente complementario con respecto a la secuencia ejemplificada. Es decir, es posible tolerar algún grado de falta de concordancia. Para un cebador de aproximadamente 20 nucleótidos, por ejemplo, típicamente no es necesario que uno o dos aproximadamente nucleótidos se liguen al cadena opuesto si la base falto de concordancia es interior o se halla en el extremo del cebador, es decir opuesto al amplicón. A continuación se proveen varias condiciones de hibridación adecuadas. En las sondas tambien pueden utilizarse análogos nucleótidos sintéticos, tales como inosina. Las sondas de PNA (Peptide nucleic acid, ácido nucleico de péptido), así como sondas de ADN y de ARN, también pueden utilizarse. Lo que es importante es que tales cebadores sirven para diagnosticar (capaces de identificar y distinguir de manera única) la presencia de un evento de la presente invención.

Cabe observar que pueden presentarse errores en la amplificación de PCR que podrían resultar en errores de secuenciación menores, por ejemplo. Es decir, a menos que se indique otra cosa, las secuencias listadas en la presente fueron determinadas mediante la generación de amplicones largos a partir de ADN genómicos de soya, seguido por clonación y secuenciado de los amplicones. No es inusual hallar ligeras diferencias y discrepancias menores en las secuencias generadas y determinadas de esta manera, dada la gran cantidad de ciclos de amplificación que son necesarios para generar suficientes amplicones para el secuenciado a partir de ADN genómicos. Una persona con pericia en la especialidad reconocería y advertiría que cualesquiera ajustes necesarios debidos a estos errores de secuenciado comunes se hallan dentro de los alcances de la presente invención.

Tambien debe observarse que no es raro que alguna secuencia genómica se suprima, por ejemplo, cuando se inserta una secuencia durante la creación de un evento. Por lo tanto, pueden aparecer algunas diferencias entre las secuencias flanqueantes del caso y las secuencias genómicas enumeradas en el GENBANK, por ejemplo.

Los componentes del “inserto” se ilustran en las Figuras y se exponen con mayor detalle en lo que sigue en los Ejemplos. Las secuencias polinucleótidas de ADN de estos componentes, o de fragmentos de los mismos, pueden utilizarse como cebadores o sondas de ADN en los métodos de la presente invención.

En algunas modalidades de la invención, se proveen composiciones y métodos para detectar la presencia de la región de inserción del transgén/genómica, en las plantas y semillas y similares, de una planta de soya. Se proveen secuencias de ADN que comprenden la secuencia de empalme de la región de inserción del transgén del caso/genómica provista en la presente, segmentos que comprenden una secuencia de empalme identificada en la presente, y complementos de cualquiera de tales secuencias ejemplificadas y cualesquiera segmentos de los mismos. La secuencia de empalme de la región de inserción abarca el empalme entre el ADN heterólogo insertado en el genoma y el ADN de la célula de soya que flanquea el sitio de la inserción. Tales secuencias pueden ser de diagnóstico para el evento dado.

Sobre la base de las secuencias de inserto y de límite, es posible generar cebadores específicos para los eventos. El análisis por PCR demostró que las líneas de soya de la presente invención pueden ser identificadas en diferentes genotipos de soya mediante análisis de los amplicones de PCR generados con estos conjuntos de cebadores específicos para los eventos. Estos procedimientos, y otros relacionados, pueden utilizarse para identificar de manera univoca estas líneas de soya. Por lo tanto, los amplicones de PCR derivados de tales pares de cebadores son únicos y pueden utilizarse para identificar estas líneas de soya.

En algunas modalidades, las secuencias de ADN que comprenden un fragmento continuo del transgen novedoso/región de inserción genómico son un aspecto de esta invención. Se incluyen secuencias de ADN que comprenden una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia de transgén del inserto y una longitud suficiente de polinucleótidos de secuencia genómica de soya de una o más plantas y/o secuencias de soya anteriormente mencionadas que son útiles como secuencias de cebador para la producción de un amplicón producto de diagnóstico para una o más de estas plantas de soya.

Hay modalidades alternativas relacionadas que forman parte de las secuencias de ADN que comprenden por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25 o más nucleótidos contiguos de una porción de transgén de una secuencia de ADN identificada en la presente, o complementos de la misma, y una longitud similar de la secuencia de ADN flanqueante de soya (tal como SEC ID NO: 1 y SEC ID NO:2 y segmentos de las mismas, o complementos de las mismas. Tales secuencias son útiles como cebadores de ADN en los metodos de amplificación de ADN. Los amplicones producidos mediante estos cebadores sirven para diagnóstico en cualesquiera de los eventos de soya a los que se hace referencia en la presente. Por ello, la invención incluye también los amplicones producidos mediante tales cebadores de ADN y cebadores homólogos.

Esta invención también incluye métodos para detectar la presencia de ADN, en una muestra, que corresponde al evento de soya al que se hizo referencia en la presente. Tales métodos pueden comprender: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con un conjunto de cebadores que, cuando se utiliza en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN de por lo menos unos de estos eventos de Soya, produce un amplicón diagnóstico para dicho(s) evento(s); (b) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, con lo que se produce el amplicón; y (c) detectar el amplicón.

Además, los métodos de detección de la presente invención incluyen un método para detectar la presencia de un ADN, en una muestra, correspondiente a dicho evento, en donde dicho método comprende: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que se híbrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con ADN de por lo menos uno de dichos eventos de soya y que no se híbrida bajo las condiciones de hibridación rigurosas con una planta de soya de control (ADN de no evento de interes); (b) someter la muestra y sonda a condiciones de hibridación rigurosas; y (c) detectar la hibridación de la sonda con respecto al ADN.

En otras modalidades, la presente invención incluye métodos para producir una planta de soya que comprende el evento pDAB8264.42.32.1 , en donde dicho método comprende los pasos siguientes: (a) cruzar sexualmente una primera línea de soya genitora (que comprende un casete de expresión de la presente invención, que confiere dicho rasgo de resistencia a los herbicidas a las plantas de dicha línea) y una segunda línea de soya genitora (que carece de este rasgo de tolerancia a los herbicidas) con lo que se produce una pluralidad de plantas descendientes; y (b) seleccionar una planta descendiente mediante el uso de marcadores moleculares. Tales métodos pueden opcionalmente comprender el paso adicional de retrocruzar la planta descendiente con la segunda línea de soya genitora de manera de producir una planta de soya de cultivo verdadero que comprende dicho rasgo de tolerancia a los herbicidas.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proveen métodos para determinar el carácter cigoto de la descendencia de un cruce con dicho evento. Dichos métodos pueden comprender poner en contacto una muestra, que comprende ADN de soya, con un conjunto de cebadores de la presente invención. Dichos cebadores, cuando se los utiliza en una reacción de amplificación ácido nucleico con ADN genómico de por lo menos uno de dichos eventos de Soya, produce un primer amplicón diagnóstico para por lo menos uno de dichos eventos de Soya. Tales metodos comprenden además la realización de una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, con lo que se provee el primer amplicón; detectar el primer amplicón; y poner en contacto la muestra que comprende ADN de soya con dicho conjunto de cebadores (dicho conjunto de cebadores, cuando se lo utiliza en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico de plantas de soya, produce un segundo amplicón que comprende el ADN genómico de soya; y llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, con lo que se produce el segundo amplicón. Los métodos comprenden además detectar el segundo amplicón, y comparar los amplicones primero y segundo en una muestra, en donde la presencia de ambos amplicones indica que la muestra es heterocigoto para la inserción del transgén.

Es posible desarrollar kits de detección de ADN que utilizan las composiciones reveladas en la presente y los métodos bien conocidos en el campo de la detección del ADN. Los kits son útiles para la identificación del evento del ADN de soya de la presente en una muestra, y se los puede aplicar a métodos para cultivar plantas de soya que contienen este ADN. Los kits contienen secuencias de ADN homólogas o complementarias con respecto a los amplicones, por ejemplo, revelados en la presente, o a secuencias de ADN homólogas o complementarias al ADN contenido en los elementos genéticos de transgén del evento de la presente. Estas secuencias de ADN pueden utilizarse en reacciones de amplificación de ADN o como sondas en un metodo de hibridación de ADN. Los kits también pueden contener los reactivos y materiales necesarios para la realización del método de detección.

Una “sonda” es una molécula de ácido nucleico aislada a la cual se halla fijada una molécula etiqueta o informante detectable convencional (tal como un isótopo radioactivo, un ligando, agente quimioluminiscente, o enzima). Una sonda de este tipo es complementaria de una cadena de un ácido nucleico dirigido, en el caso de la presente invención, a una cadena de ADN genómico de uno de dichos eventos de Soya, sea de una planta de soya sea de una muestra que incluye el ADN del evento. Las sondas de acuerdo con la presente invención incluyen no solamente ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos sino también poliamidas y otros materiales de sonda que se ligan específicamente a una secuencia blanco del ADN, y pueden utilizarse para detectar la presencia de dicha Secuencia de ADN blanco. La expresión “polinucleótido aislado” lleva la connotación que el polinucleótido se halla en un estado no natural ligado de manera no operable a un promotor heterólogo, por ejemplo. De manera similar, la expresión “proteína purificada” lleva la connotación de que la proteína se halla en un estado no natural.

Los “cebadores” son ácidos nucleicos aislados/sintetizados que están unidos por fusión a una cadena de ADN complementario mediante hibridación de ácidos nucleicos de manera de formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN blanco, y seguidamente se extienden a lo largo de la cadena de ADN blanco por una polimerasa, por ejemplo, una polimerasa de ADN. Los pares de cebadores de la presente invención se refieren a su uso para la amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos blanco, por ejemplo, mediante PCR (reacción en cadena de polimerasa) u otros metodos convencionales para la amplificación de ácidos nucleicos.

Por lo general, las sondas y los cebadores tienen una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271 , 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281 , 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291 , 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301 , 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 31 1 , 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321 , 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 , 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341 , 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351 , 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361 , 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371 , 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 , 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391 , 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 41 1 , 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 , 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431 , 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441 , 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451 , 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461 , 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471 , 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481 , 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491 , 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ó 500 polinucleótidos o más. Típicamente, tales sondas y cebadores hibridan específicamente a una secuencia blanco bajo condiciones de hibridación muy rigurosas. Es preferible que las sondas y los cebadores de acuerdo con la presente invención tengan una similitud de secuencia completa con la secuencia blanco, si bien mediante metodos convencionales es posible diseñar sondas que difieran de la secuencia blanco y que conservan la capacidad de hibridar una secuencia blanco.

Se describen metodos para preparar y utilizar sondas y cebadores, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al. , Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y., 1989. Los pares de cebadores de PCR pueden derivarse a partir de una secuencia conocida, mediante la utilización de programas de computadora previstas para esta finalidad.

Los cebadores y sondas basados en el ADN flanqueante y en la secuencia del inserto revelados n la presente pueden utilizarse para confirmar (y, en caso necesario, para corregir) las secuencias reveladas mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante la reclonación y secuenciado de tales secuencias.

Las sondas y los cebadores de ácidos nucleicos de la presente invención hibridan bajo condiciones rigurosas a una secuencia blanco de ADN. Puede utilizarse cualquier método convencional para la hibridación o amplificación de ácidos nucleicos para identificar la presencia de ADN de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas de ácidos nucleicos y los fragmentos de las mismas son capaces de hibridar específicamente a otras moléculas de ácido nucleico bajo determinadas circunstancias. Tal como se las utiliza en la presente, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridar específicamente entre sí las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico de doble cadena, anti-paralela. Se dice que una molecula de ácido nucleico es el “complemento” de otra molécula de ácido nucleico si presentan una complementariedad completa. Tal como se las utiliza en la presente, se dice que las moléculas presentan una “complementariedad completa” cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementaria con respecto a un nucleótido de la otra molécula. Se dice que dos moléculas son “mínimamente complementarias” si pueden hibridar entre sí con una suficiente estabilidad que les permita mantener unidad entre sí por fusión por lo menos bajo condiciones de “baja rigurosidad” convencionales. De manera similar, se afirma que las moléculas son “complementarias” entre sí pueden hibridarse entre sí con suficiente estabilidad que les permita permanecer unidas entre sí por fusión bajo condiciones de “elevada rigurosidad” convencionales. Las condiciones de rigurosidad convencionales han sido descritas por Sambrook et al. , 1989. Por ello es permisible apartarse de la complementariedad completa, siempre y cuando tales desvíos no excluyan por completo la capacidad de las moléculas de formar una estructura de doble cadena. Para que la molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda basta con que sea suficientemente complementaria en secuencia para tener la capacidad de formar una estructura de doble cadena bajo las condiciones particulares empleadas en cuanto a solvente y sal.

Tal como se utiliza en la presente, una secuencia sustancialmente homóloga es una secuencia de ácido nucleico que de manera específica se hibridará con el complemento de la molecula de ácido nucleico con la cual se la comparta bajo condiciones de baja rigurosidad. La expresión “condiciones rigurosas” se define funcionalmente con respecto a la hibridación de una sonda de ácido nucleico a un ácido nucleico blanco (es decir, a una secuencia de ácido nucleico de interés) mediante el procedimiento de hibridación expuesto en Sambrook et al. , 1989, at 9.52-9.55. Ver también Sambrook et al. , 1989 at 9.47-9.52 y 9.56-9.58. Por lo tanto, las secuencias de nucleótidos de la invención puede utilizarse por su capacidad de formar moléculas dúplex con tramos complementarios de fragmentos de ADN.

En función de la aplicación prevista, es posible variar las condiciones de hibridación para lograr variados grados de selectividad de la sonda con respecto a la secuencia blanco. Para aplicaciones que requieran una elevada selectividad, típicamente se emplearan condiciones relativamente rigurosas para formar los híbridos, por ejemplo, con respecto al Taqman de punto final y aplicaciones de PCR en tiempo real, se seleccionará aproximadamente 1.5 mM a aproximadamente 4,0 mM de MgCI2 a una temperatura de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 75 °C y se puede mantener varias veces, como se describe en la presente, para una rigurosidad creciente. Para otras téenicas de hibridación, típicamente se emplearán condiciones de sal relativamente baja y/o de temperaturas elevadas, tales como las provistas a aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M NaCI a temperaturas de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C. Las condiciones rigurosas, por ejemplo, podrían implicar lavar el filtro de hibridación por lo menos dos veces con tampón de lavado de elevada rigurosidad (0,2X SSC, 0, 1 % SDS, 65 °C). Las condiciones de rigurosidad adecuadas que promueven la hibridación de ADN, por ejemplo, 6,0X cloruro de sodio / citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido por un lavado de 2,0X SSC a 50 °C, son conocidas de las persona con pericia en la especialidad. Por ejemplo, es posible seleccionar la concentración de sal en el paso del lavado desde una baja rigurosidad de aproximadamente 2,0X SSC a 50 °C a la elevada rigurosidad de aproximadamente 0,2X SSC a 50 °C. Además, la temperatura en el paso de lavado puede incrementarse desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22 °C, a condiciones de elevada rigurosidad a aproximadamente 65 °C. Tanto la temperatura como la sal pueden variarse, o se mantiene constante la concentración de la concentración y se varía la temperatura, o inversamente. Dichas condiciones selectivas toleran cualquier eventual falta de concordancia entre la sonda y la cadena de la plantilla o del blanco. La detección de secuencias de ADN por intermedio de la hibridación es bien conocida por las personas con pericia en la especialidad, y las enseñanzas de las Solicitudes de patente de los EE. UU. Nros. 4.965.188 y 5.176.995 son un ejemplo de los metodos para análisis de hibridación.

En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico de la presente invención se hibridará específicamente a uno o más de los cebadores (o amplicones u otras secuencias) ejemplificados o sugeridos en la presente, que incluyen complementos y fragmentos de los mismos, bajo condiciones de elevada rigurosidad. En un aspecto de la presente invención, una molecula de ácido nucleico marcadora de la presente invención tiene la secuencia de ácido nucleico indicada en la presente en una de las secuencias dada a título de ejemplo, o complementos y/o fragmentos de la misma.

En otro aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico marcadora de la presente invención tiene en común una identidad de secuencias de entre 80% y 100% o 90% y 100% con dichas secuencias de ácido nucleico. En otro aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico marcadora comparte una identidad de secuencia de 95% y 100% con tal secuencia. Tales secuencias pueden utilizarse como marcadores en métodos de cultivo de plantas para identificar la descendencia de cruces genéticos. La hibridación de la sonda con respecto a la molécula de ADN blanco puede detectarse mediante cualquier cantidad de métodos conocidos de las personas con pericia en la especialidad; los mismos pueden incluir, pero sin limitación, rótulos fluorescentes, rótulos radioactivos, rótulos basados en anticuerpos, y rótulos quimioluminiscentes.

En cuanto a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico blanco (por ejemplo, por PCR) mediante una amplificación particular del par de cebadores, las “condiciones rigurosas” son condiciones que permiten que el cebador se hibride solamente a la secuencia de ácido nucleico blanco al que se ligaría el cebador que tiene la secuencia de tipo salvaje correspondiente (o su complemento) y preferentemente para producir un único producto de amplificación, el amplicón.

La expresión “especifico para (una secuencia blanco)” indica que una sonda o cebador se híbrida bajo condiciones de hibridación rigurosas solamente a la secuencia blanco en una muestra que comprende la secuencia blanco.

Tal como se las utiliza en la presente, las expresiones “ADN ampliado” o “amplicón” se refiere al producto de la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico blanco, es decir a una parte de la plantilla de ácidos nucleicos. Por ejemplo, para determinar si la planta de soya resultante de un cruce sexual contiene ADN genómico de evento transgenico de la planta de soya de la presente invención, el ADN extraído de una muestra de tejido de soya puede ser sometido a un método de amplificación de ácido nucleico mediante el par de cebadores que incluye el cebador derivado de la secuencia flanqueante en el genoma de planta adyacente al sitio de la inserción del ADN heterólogo insertado, y un segundo cebador derivado del ADN heterólogo derivado a partir del ADN heterólogo de manera de producir un amplicón es decir diagnostico para la presencia del ADN. El amplicón tiene una longitud y tiene una secuencia que también es de diagnóstico para el evento. La longitud del amplicón puede variar entre la longitud combinada de los pares de cebadores plus un par de nucleótidos de base, y/o la longitud combinada de los pares de cebador 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321 , 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 , 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341 , 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351 , 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361 , 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371 , 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 , 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391 , 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 41 1 , 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 , 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431 , 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441 , 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451 , 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461 , 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471 , 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481 , 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491 , 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, o 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 o más pares de base de nucleótidos (más o menos cualquiera de los incrementos mencionados arriba). Como alternativa, el par de cebadores puede derivarse de la secuencia flanqueante en ambos lados del ADN insertado de manera de producir un amplicón que incluye la secuencia entera de ácidos nucleicos. Un miembro del par de cebadores derivado de la secuencia genómica de la planta puede estar situado a una distancia de la secuencia de ADN insertada. Esta distancia puede variar entre un par de bases de nucleótidos y aproximadamente veinte mil pares de base de nucleótidos. El uso del termino “amplicón” excluye específicamente los dímeros de cebadores que pueden formarse en la reacción de ampliación termica de ADN.

La amplificación de ácidos nucleicos puede llevarse a cabo mediante cualquier de los diversos métodos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la téenica, que incluyen la PCR. En la técnica se conoce una variedad de métodos de amplificación, y los mismos se han descrito, Ínter alia, en la patente de los Estados Unidos No. 4,683,195 y en la patente de los Estados Unidos No. 4,683,202. Se han desarrollado métodos de amplificación de PCR para ampliar hasta 22 kb de ADN genómico. Estos métodos así como también otros métodos conocidos en el campo de la amplificación del ADN pueden utilizarse en la práctica de la presente invención. La secuencia del inserto de ADN transgénico heterólogo o de la secuencia genómica flanqueante de un evento de soya de la presente puede verificarse (y corregirse en caso de necesidad) mediante la ampliación de tales secuencias del evento mediante los cebadores derivados de las secuencias provistas en la presente seguido por secuenciado estándar de ADN del amplicón de PCR o del ADN clonado.

El amplicón producido mediante estos métodos puede ser detectado mediante una pluralidad de técnicas. La electroforesis de gel de agarosa y el teñido con bromuro de etidio es un método bien conocido para detectar amplicones de ADN. Otro método de este tipo es el Genetic Bit Analysis en el que se diseña un oligonucleótido de ADN que se superpone tanto a la secuencia adyacente flanqueante de ADN como a la secuencia de ADN insertado. El oligonucleótido se inmoviliza en pocilios de una placa de microcavidades. Despues del PCR de al región de interés (en el que se utiliza un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante adyacente), es posible hibridar un producto de PCR de cadena simple al oligonucleótido inmovilizado para lo cual se utiliza una reacción de extensión con polimerasa de ADN y ddNTPs específico para la siguiente base prevista. La lectura puede ser fluorescente o estar basada en ELISA. Una señal indica la presencia del inserto/secuencia flanqueante debido a la amplificación, hibridación, y extensión de base simple, exitosas.

Otro método es la téenica de Pirosecuenciado como se describe en Wnge (Innov. Pharma. Tech. 00: 18-24, 2000). En este método se diseña un oligonucleótido que se superpone al empalme entre el ADN genómico adyacente y el ADN del inserto. Se híbrida el oligonucleótido al producto de PCR de cadena simple de la región de interés (un cebador en la secuencia del inserto y un cebador en la secuencia genómica flanqueante) y se incuba en la presencia de una polimerasa de ADN, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y luciferina. Se añaden los DNTP individualmente, y la incorporación tiene como resultando una señal de luz medida. Una señal de luz indica la presencia del inserto de transgén/secuencia flanqueante debido a la amplificación, hibridación, y extensión simple o de base múltiple, exitosas.

La Polarización de Fluorescencia es otro metodo que puede utilizarse para detectar un amplicón de la presente invención. En este método, se diseña un oligonucleótido que se superpone al empalme del ADN genómico flanqueante insertado. Se híbrida el oligonucleótido en forma de un producto de PCR de cadena simple a partir de la región de interés (un cebador en el ADN insertado y un cebador en la secuencia genómica flanqueante de ADN) y se incuba en la presencia de una polimerasa de SN y de un ddNTP etiquetado fluorescentemente. La extensión de base simple resulta en la incorporación del ddNTP. Es posible medir la incorporación como un cambio en la polarización para lo cual se utiliza un fluorómetro. Un cambio en la polarización indica la presencia de la secuencia flanqueante debida a la amplificación, hibridación, y extensión de base simple, exitosas.

El TAQMAN (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) es un método para detectar la presencia y para cuantificar la presencia de una Secuencia de ADN. En pocas palabras, se diseña una sonda oligonucleótido FRET que se superpone al empalme de la secuencia flanqueante y del ADN del inserto. La sonda FRET sonda y los cebadores de PCR (un cebador en la Secuencia de ADN del inserto y un cebador en la secuencia genómica flanqueante) son cielados en la presencia de una polimerasa termoestable y de dNTP. Durante la amplificación específica, la Taq ADN polimerasa limpia y liberta la parte fluorescente y la aleja de la parte de apagado sobre la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia flanqueante / de transgen debido a la amplificación e hibridación exitosas.

Se han descrito Balizas Moleculares para su uso en la detección de secuencias. En pocas palabras, se diseña una sonda de oligonucleótidos FRET que se superpone al empalme genómico flanqueante y de ADN del inserto. La estructura, única, de la sonda de FRET tiene como resultado que contiene la estructura secundaria que mantiene las partes fluorescente y de apagado en una estrecha proximidad. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la Secuencia de ADN del inserto y un cebador en la secuencia genómica flanqueante) son cielados en la presencia de una polimerasa termoestable y de los dNTP. Después de la amplificación de PCR exitosa, la hibridación de la sonda FRET con la secuencia blanco tiene como resultado la remoción de la estructura secundaria de la estructura y la separación espacial de las partes fluorescente y de apagado. Resulta una señal fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia genómica/de transgén del inserto debida a la amplificación e hibridación exitosas.

Habiendo revelado una ubicación en el genoma de la soya que es excelente para una inserción, la presente invención también incluye una semilla de soya y/o una planta de soya que comprende por lo menos una secuencia de codificación no aad12/pat/2mepsps en o alrededor de la vecindad general de esta ubicación genómica. Una opción es la que consiste en reemplazar un inserto diferente en lugar del inserto ejemplificado en la presente. En estos aspectos generales, puede utilizarse la recombinación homóloga de blanco, por ejemplo, de acuerdo con la presente invención. Este tipo de teenología ha sido tratado en por ejemplo, el documento WO 03/080809 A2 y en la correspondiente sSolicitud de patente de los EE.UU. publicada (U.S. 2003/0232410). Por lo tanto, la presente invención incluye plantas y celulas de plantas que comprenden un inserto heterólogo (en lugar o junto multicopias del inserto ejemplificado), flanqueado por la totalidad o por una parte reconocible de las secuencias flanqueantes identificadas en la presente como SEC ID NO: 1 y SEC ID NO:2. También podría apuntarse de esta(s) manera(s) a una copia adicional (o a copias adicionales) del inserto ejemplificado o de cualquiera de sus componentes para su inserción.

La totalidad de las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisorias y publicaciones a las que se hace referencia o que se mencionan en la presente se incorporan a título de referencia en su totalidad en la medida en que no sean incompatibles con las enseñanzas explícitas de este memoria descriptiva.

Se incluyen los siguientes ejemplos a efectos de ilustrar los procedimientos para la implementación de la invención y para demostrar determinadlas modalidades preferidas de la invención. Estos ejemplos no han de interpretarse como una limitación. Las personas con pericia en la especialidad deben tener en cuenta que las técnicas reveladas en los siguientes ejemplos representan enfoques específicos utilizados para ilustrar modos de realización preferidos. Sin embargo, las personas con pericia en la especialidad deberían tener presentes a la luz de la presente revelación que es posible efectuar muchos cambios en estas modalidades específicas sin dejar de obtener los mismos resultados, ello sin apartarse del espíritu y alcances de la invención. A menos que se indique otra cosa, todos los porcentajes se expresan en peso y todas las proporciones de las mezclas de solventes son en volumen a menos que se indique otra cosa.

A menos que se indique otra cosa, se utilizan las siguientes abreviaturas. bp par de bases °C grados centígrados DNA ácido desoxirribonucleico DIG digoxigenina EDTA ácido etilenediaminetetraacetico b kilobase ? g microgramo ? L microlitro mL mililitro M masa molar OLP sonda superpuesta PCR reacción de cadena de polimerasa PTU unidad de transcripción de planta SDS dodecilsulfato sódico SOP procedimiento de abertura estándar SSC una solución tampón que contiene una mezcla de cloruro de sodio y citrato de sodio, pH 7,0 TBE una solución tampón que contiene una mezcla de base Tris, ácido bórico y EDTA, pH 8,3 V voltios Ejemplos Ejemplo 1 : Transformación y Selección del 2mEPSPS y evento de soya pDAB8264.42.32.1 Se generó soya transgeníca ( Glycine max) que contiene el evento de soya pDAB8264.42.32.1 mediante transformación mediada por Agrobacterium, de explantes de nodos cotiledonarios de soya. La cepa de Agrobacterium desarmada EHA101 (Hood et al., 1993), que el vector binario pDAB8264 (Figura 1 ) que contiene el marcador seleccionable, pat v6, y los genes de interés, aacf-12 v1 y 2mepsps v1, dentro de la región de ADN de la cadena T, fue utilizada para iniciar la transformación.

La transformación mediada por Agrobacterium se llevó a cabo mediante un procedimiento modificado de Zeng et al. (2004). En pocas palabras, unas semillas de soyas (cv Maverick) fueron hechas germinar sobre un medio basal y se aislaron nodos cotiledonarios que fueron infectados con Agrobacterium. La iniciación de los brotes, su elongación, y los medios de raigambre fueron complementados con cefotaxima, timentina y vancomicina para la remoción del Agrobacterium. Se empleó la selección de glufosinato para inhibir el crecimiento de los brotes no transformados. Los brotes seleccionados fueron transferidos a medio de raigambre para el desarrollo de las raíces, despues de lo cual se los transfirió a una mezcla de suelo para la aclimatación de las plántulas.

Las hojuelas terminales de las plántulas seleccionadas recibieron una pintura foliar con glufosinato para seleccionar transformantes putativos. Las plántulas seleccionadas fueron transferidas al invernadero, se las dejó aclimatarse y seguidamente se pintaron sus hojas con glufosinato a efectos de reconfirmar la tolerancia y se las adoptó como transformantes putativos. Las plantas seleccionadas fueron muestreadas y se llevó a cabo los análisis moleculares para la confirmación del gen marcador seleccionable y/o del gen de interés. Se permitió que la semillas de planta T0 se autofertilicen en el invernadero de manera de obtener semillas Ti .

Este evento, el evento de soya pDAB8264.42.32.1 , fue generado a partir de un aislado transformado independiente. Las plantas ? fueron retrocruzadas e introgresadas en variedades elite a lo largo de generaciones subsiguientes. Se seleccionó el evento en base a sus características únicas tales como único sitio de la inserción, segregación mendeliana normal y expresión estable, y una combinación superior de eficacia, que incluyen una tolerancia a los herbicidas y una performance agronómica. Los siguientes ejemplos contiene los datos que se utilizaron para caracterizar el evento de soyapDAB8264.42.32.1.

Ejemplo 2: Caracterización de la expresión proteica en el evento de soya pDAB8264.42.32.1 Las propiedades bioquímicas de las proteínas recombinantes AAD-12, 2mEPSPS y PAT expresadas en el evento de soya pDAB8264.42.32.1 fueron caracterizadas. El ensayo cuantitativo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) es un ensayo bioquímico conocido en el arte que se puede usar para caracterizar las propiedades bioquímicas de las proteínas y confirma la expresión de estas proteínas en los eventos de soya.

Ejemplo 2.1 : Expresión de la proteína PAT en tejidos vegetales Se determinaron niveles de proteína PAT en el evento de soya pDAB8264.42.32.1. La proteína PAT soluble y extraíble se midió usando un metodo de ensayo cuantitativo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) de tejido de hoja de soya.

Las muestras de tejidos de soya se aislaron de las plantas de ensayo y se prepararon para análisis de expresión. La proteína PAT se extrajo de tejidos de planta de soya con una solución fisiológica tamponada con fosfato que contiene el detergente Tween-20 (PBST) con 1 % de polivinilpirrolidona (PVP). El tejido de planta se centrifugó; el sobrenadante acuoso se recolectó, se diluyó con tampón apropiado de ser necesario y se analizó usando un kit de PAT ELISA en un formato de sándwich. El kit se usó según el protocolo sugerido por el fabricante (Envirologix, Portland, ME). Este ensayo midió la proteína PAT expresada.

El análisis de detección se realizó para investigar la estabilidad de expresión y la posibilidad de herencia tanto de forma vertical (entre generaciones) como horizontal (entre linajes dentro de una generación) en el evento de soya pDAB8264.42.32.1. De las generaciones T3 a T5 del evento de soya pDAB8264.42.32.1 , la expresión era estable y consistente a lo largo de todos los linajes. Ejemplo 2.2: Expresión de la proteína AAD-12 y 2mEPSPS en tejidos de plantas Se determinaron los niveles de proteínas AAD-12 y 2mEPSPS en el evento de soya pDAB8264.42.32.1 . Las proteínas solubles, extraíbles se midieron usando un método de ensayo cuantitativo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) de tejido de hoja de soya.

Se aislaron muestras de tejidos de soya de las plantas de ensayo y se prepararon para análisis de expresión. Las proteínas AAD-12 y 2mEPSPS se extrajeron de los tejidos de planta de soya con una solución fisiológica tamponada con fosfato que contenía el detergente Tween-20 (PBST) con 1 % de albúmina de suero bovino (BSA). El tejido de planta se centrifugó; el sobrenadante acuoso se recolectó, se diluyó con tampón apropiado de ser necesario y se analizó usando los kits de ELISA AAD-12 y GA21 , respectivamente, en un formato de sándwich. El kit se usó según el protocolo sugerido por el fabricante (AAD-12: número de catálogo 20-0161 , Beacon Analytical Systems, Inc., Saco, Mayne; 2mEPSPS: catálogo No. 7020100, Strategic Diagnostics, Newark, DE). De las generaciones T4 a T6 del evento de soya pDAB8264.42.32.1 , la expresión de AAD-12 y 2mEPSPS era estable y consistente a lo largo de todos los linajes.

Ejemplo 2.3: Estudios de eficacia de expresión Se realizaron estudios de nivel de expresión en campo en el estadio de planta V3 en el evento de soya pDAB8264.42.32.1. Los estudios del nivel de expresión se realizaron en todos los tratamientos de pulverización así como para las parcelas no pulverizadas. Estos experimentos se completaron usando los protocolos descritos previamente. Los valores de expresión eran similares para todos los tratamientos pulverizados, así como para las parcelas pulverizadas y no pulverizadas con diferentes combinaciones de herbicidas (Tabla 2). No se observó una lesión significativa en las plantas en ningún punto del estudio.

Tabla 2. Tratamiento con herbicidas y concentraciones de los herbicidas usados en los estudios de expresión de proteínas Ejemplo 3: Clonación y caracterización de la secuencia de ADN en el Inserto y las regiones de borde blanqueante del evento de soya pDAB8264.42.32.1 Para caracterizar y describir el sitio de inserción genómico, se determinaron las secuencias de las regiones de borde de T-ADN flanqueantes genómicas del evento de soya pDAB8264.42.32.1 . Se confirmó la secuencia del evento de soya genómica pDAB8264.42.32.1 , que comprende 1 ,246 bp de la secuencia de borde flanqueante 5’ (SEC ID NO:1 ) y 504 bp de la secuencia de borde flanqueante 3’ (SEC ID NO:2). La amplificación de PCR en base a las secuencias de borde del evento de soya pDAB8264.42.32.1 validó que las regiones de borde eran de origen de soya y que las regiones de articulación son secuencias únicas para el evento de soya pDAB8264.42.32.1 . Las regiones de articulación se pueden usar para la identificación específica del evento de soya pDAB8264.42.32.1. Además, el sitio de inserción de cadena T se caracterizó amplificando el fragmento genómico correspondiente a la región de las secuencias de borde flanqueante identificadas del genoma de soya no transformada de tipo silvestre. La comparación del evento de soya pDAB8264.42.32.1 con la secuencia genómica de tipo silvestre reveló aproximadamente 38 bp de deleción del locus original. En general, la caracterización de la secuencia de inserto y de borde de evento de soya pDAB8264.42.32.1 indicó que estaba presente una copia intacta de la cadena T en el genoma de soya.

Tabla 3. Lista de cebadores y sus secuencias usadas en la confirmación de ADN genómico de soya en el evento de soya -PDAB8264.42.32.1.

Tabla 4. Condiciones para la amplificación estándar de PCR de las regiones de borde y secuencias específicas de evento en el evento de soya pDAB8264.42.32.1 Tabla 5. Mezcla de PCR para amplificación estándar de PCR de las regiones de borde y secuencias específicas del evento en el evento de soya pDAB8264.42.32.1 Ejemplo 3.1 : Confirmación de secuencias genómicas de soya Los bordes flanqueantes 5’ y 3' alineados en una secuencia shotgun completa de Glycine max del cromosoma 15, indican que el transgen del evento de soya pDAB8264.42.32.1 se insertó en el genoma de soya cromosoma 15. Para confirmar el sitio de inserción del transgén de evento de soya pDAB8264.42.32.1 del genoma de soya, se llevó a cabo PCR con diferentes pares de cebadores (Figura 2, Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5). El ADN genómico del evento de soya -pDAB8264.42.32.1 y otras líneas transgénicas o no transgénicas de soya se usó como una plantilla. Así, para confirmar si las secuencias de borde 5’ eran correctos cebadores específicos 2mEPSPS v1 , por ejemplo, se usaron ED_v1_C1 y cebadores diseñados de acuerdo con la secuencia de borde de extremo 5’ clonado y/o su secuencia de alineación en el cromosoma 15 del genoma de soya, nombrados 4232-WF1 , 4232-WF3 y 4232-WF4, para amplificar el segmento de ADN que extiende el gen 2mEPSPS v1 a la secuencia de borde de extremo 5’. De modo similar, para la confirmación de la secuencia de borde de extremo 3’ clonada, un cebador específico de pat, por ejemplo PAT_11 y cuatro cebadores diseñados de acuerdo con la secuencia de borde de extremo 3’ clonada y/o su secuencia de alineación en el cromosoma 15 del genoma de soya, nombrados 4232-WR1 , 4232-WR2, 4232-WR3 y 4232-WR4, se usaron para amplificar segmentos de ADN que extienden el gen pat a la secuencia de borde de extremo 3’. Los fragmentos de ADN con los tamaños pronosticados se amplificaron sólo de ADN genómico del evento de soya pDAB8264.42.32.1 con cada par de cebadores, un cebador ubicado en el borde flanqueante del evento de soya pDAB8264.42.32.1 y un cebador específico de transgen, pero no de muestras de ADN de otras líneas de soya transgénica o control no transgénico. Los resultados indican que las secuencias de borde 5’ y 3’ clonadas son las secuencias de borde flanqueante del inserto de cadena T para el evento de soya pDAB8264.42.32.1 .

Para luego confirmar la inserción de ADN de cadena T de sitio genómico en el genoma de soya, se completó una amplificación por PCR que extendía las secuencias de borde de soya en ADN genómico que no contenía el inserto de cadena T para el evento de soya pDAB 8264.42.32.1. Un cebador diseñado de acuerdo con la secuencia de borde de extremo 5’, 4232-WF1 y dos cebadores para la secuencia de borde de extremo 3’, 4232-WR1 y 4232-WR2, se usaron para amplificar la secuencia de borde de extremo 5’ y los segmentos de ADN de la secuencia de borde de extremo 3’ donde se integraba la cadena T de pDAB8264. Como se esperaba, la amplificación por PCR con el par de cebadores de 4232-WF1 y 4232-WR1 amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,4 kb del ADN genómico de los controles de soya no transgénicos y otras líneas transgénicas de soya pero no del evento de soya -pDAB8264.42.32.1. De modo similar, las reacciones por PCR completadas con el par de cebadores de 4232-WF1 y 4232-WR2 produjeron un fragmento de ADN de aproximadamente 2,5 kb del ADN genómico de los controles de soya no transgénicos y otras líneas de soya transgenicas pero no del dvento de soya -pDAB8264.42.32.1. La alineación de las secuencias de borde 5’ y 3’ identificadas del evento de soya pDAB8264.42.32.1 con una secuencia shotgun de genoma completo de Glycine max de cromosoma 15 reveló una supresión de 38 bp del locus genómico original (Figura 3). Estos resultados demostraron que el transgén del evento de soya pDAB8264.42.32.1 se insertó en el sitio del cromosoma 15 del genoma de soya.

Ejemplo 4: evento de soya pDAB8264.42.32.1 Caracterización a través de transferencia Southern Se utilizó el análisis por transferencia Southern para establecer el patrón de integración del evento de soya pDAB8264.42.32.1. Estos experimentos generaron datos que demostraron la integración y la integridad de los transgenes aad-12 v1 y 2mEPSPS v1 dentro del genoma de la soya. El evento de soya pDAB8264.42.32.1 fue caracterizado como un evento de integración simple y extensión completa que contiene una sola copia de aacf-12 v1 y 2mEPSPS v1 PTU a partir del plásmido pDAB8264.

Los datos de la transferencia Southern sugirieron que un fragmento de cadena T de longitud total está inserto en el genoma del evento de soya pDAB8264.42.32.1 . Se llevó a cabo un análisis detallado por transferencia Southern mediante el uso de una sonda específica para el inserto aacf-12 v1 y gen 2mEPSPS v1 contenido en la región de integración de la cadena T de pDAB8264 y enzimas de restricción descriptivas que presentan lugares de segmentación dentro del plásmido y producen fragmentos de hibridación internos al plásmido o a los fragmentos que abarcan la unión del plásmido con ADN genómico de la soya (fragmentos límite). Los pesos moleculares indicados a partir de la hibridación Southern para la combinación de la enzima de restricción y la sonda fueron únicos para el evento y establecieron sus patrones de identificación. Asimismo, estos análisis mostraron que el fragmento plásmido había sido insertado en el ADN genómico de la soya sin nuevas disposiciones de aacf-12 v1 y 2mEPSPS v1 PTU.

Ejemplo 4.1 : Conjunto de muestras de hoja de soya y aislamiento de ADN genómico (gADN) Se extrajo ADN genómico de tejido vegetal de la hoja cosechada de plantas de soya individuales que contenían el evento de soya pDAB8264.42.32.1. Además, se aisló el gADN de una planta de soya convencional, Maverick, que contiene el antecedente genetico que representa la línea de sustancia, sin genes aad-12 v1 y 2mEPSPS v1 . Se extrajo el ADN genómico individual del tejido de la hoja liofilizado mediante el método CTAB estándar (Sambrook et al (1989)). Después de la extracción, se cuantificó el ADN de forma espectrofluorométrica mediante el uso del reactivo Pico Green (de Invitrogen, Carlsbad, California). Luego, se visualizó el ADN sobre un gel de agarosa para confirmar las concentraciones del análisis de Pico Green y para determinar la calidad del ADN.

Ejemplo 4.2: Digestión y separación de ADN Para la caracterización molecular por transferencia Southern del evento de soya pDAB8264.42.32.1 , se digirieron 10 microgramos (10 pg) de ADN genómico. Se digirió el ADN genómico de la soya pDAB8264.42.32.1 y de la línea Maverick de soya no transgenica mediante el agregado de alrededor de cinco unidades de enzima de restricción seleccionada por microgramo de ADN y el tampón de reacción correspondiente a cada muestra de ADN. Se incubó cada muestra a una temperatura de alrededor de 37 °C durante la noche. Las enzimas de restricción Hindlll, Ncol, Nsil y Pací fueron usadas en forma individual para las digestiones (New England Biolabs, Ipswich, Massachussets). Además, la muestra control de hibridación positiva fue preparada mediante la combinación de ADN plásmido, pDAB8264 con ADN genómico a partir de la variedad Maverick de soya no transgénica. El cóctel de ADN plásmido/ADN genómico fue digerido mediante el uso de los mismos procedimientos y la enzima de restricción como las muestras de prueba. Después de incubar las digestiones durante la noche, se añadieron 25 pL de solución QUIK-PRECIP PLUS (EdgeBiosystems, Gaithersburg, MD) y se precipitaron las muestras de ADN digeridas con isopropanol. Se volvió a suspender los gránulos en 15 ml de tampón de carga 1X (0,01 % de azul bromofenol, 10,0 mM de EDTA, 10,0% de glicerol, 10,0 mM de Tris con un pH de 7,5). Luego, se sometieron a electroforesis los marcadores de tamaño molecular y las muestras de ADN a través de 0,85% de geles de agarosa con un tampón 0,4X TAE a 35 voltios durante alrededor de 18 a 22 horas para lograr la separación de fragmentos. Se tiñeron los geles con bromuro de etidio y se visualizó el ADN bajo luz ultravioleta (UV).

Ejemplo 4.3: Transferencia Southern y tratamiento de membrana Se llevó a cabo un análisis por tratamiento Southern esencialmente de la forma descripta por Memelink (1994). En resumen, despues de la separación electroforética y de la visualización de los fragmentos de ADN, se depuraron los geles con HCI 0,25 M durante alrededor de 20 minutos y luego se los expuso a una solución de desnaturalización (NaOH 0,4 M, NaCI 1 ,5 M) durante alrededor de 30 minutos seguido de una solución de neutralización (NaCI 1 ,5 M, Tris 0,5 M con un pH de 7,5) durante al menos 30 minutos. La transferencia Southern fue llevada a cabo durante la noche sobre membranas de nylon a través del uso de un sistema de absorción por capilaridad con 10x SSC. Después de la transferencia, el ADN fue unido a la membrana por entrecruzamiento UV seguido de un breve lavado de la membrana con una solución de 2x SSC. Este proceso produjo membranas de transferencia Southern preparadas para la hibridación.

Ejemplo 4.4: Etiquetado e hibridación de sondas de ADN Se detectaron los fragmentos de ADN unidos a la membrana de nylon mediante el uso de una sonda etiquetada. Las sondas fueron generadas por una incorporación a base de PCR de un nucleótido etiquetado de digoxigenina (DIG), [DIG-11 ]-dUTP, en el fragmento de ADN amplificado a partir de plásmido pDAB8264 mediante el uso de cebadores específicos respecto de elementos de genes (Tabla 6). La generación de sondas de ADN por síntesis de PCR fue llevada a cabo mediante el uso del kit de síntesis de sondas PCR DIG (de Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) según los procedimientos recomendados por el fabricante.

Se analizaron las sondas etiquetadas por electroforesis de gel de agarosa para determinar la calidad y la cantidad. Luego, se usó una cantidad conveniente de sonda etiquetada para hibridación al ADN objetivo en las membranas de nylon para la detección de los fragmentos específicos mediante el uso de los procedimientos esencialmente descriptos para DIG Easy Hyb Solution (de Roche Diagnostics, Indianápolis, IN). En resumen, las transferencias de membrana de nylon que contenían el ADN fijo fueron lavadas brevemente con 2x SSC y prehibridadas con entre 20 y 25 mi de DIG Easy Hyb Solution en botellas de hibridación a una temperatura aproximada comprendida entre 45 y 55 °C durante alrededor de 2 horas en un horno de hibridación. Luego, se decantó la solución de prehibridación y se la reemplazó con alrededor de 15 mi de DIG Easy Hyb Solution previamente calentada que contenía una cantidad conveniente de sondas específicas desnaturalizadas al hervirlas en un baño de agua durante alrededor de 5 minutos. Luego, se llevó a cabo el paso de hibridación a una temperatura aproximada comprendida entre 45 y 55 °C durante la noche en el horno de hibridación.

Al final de la hibridación de sondas, se decantaron las sondas que contenían las soluciones DIG Easy Hyb en tubos limpios y se las almacenó una temperatura aproximada de -20 °C. Estas sondas podrían ser vueltas a usar dos veces según el procedimiento recomendado por el fabricante. Las transferencias de membrana fueron enjuagadas brevemente y se las lavó dos veces en recipientes limpios de plástico con un tampón de lavado de baja astringencia (2x SSC, SDS al 0, 1 %) durante alrededor de cinco minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados con un tampón de lavado de alta astringencia (0, 1 x SSC, SDS al 0, 1 %) durante 15 minutos cada una a una temperatura aproximada de 65 °C. Las transferencias de membrana fueron brevemente lavadas con 1 x tampón de ácido maleico del set de tampón de lavado y bloqueo DIG (de Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) durante alrededor de 5 minutos. Esto fue seguido del bloqueo en un tampón de bloqueo 1 x durante 2 horas y de una incubación con anticuerpo anti-DIG-AP (fosfatasa alcalina) (de Roch Diagnostics, Indianápolis, IN), en un tampón de bloqueo 1 x tambien durante un mínimo de 30 minutos. Después de 2 o 3 lavados con 1x tampón de lavado, las sondas de ADN específicas permanecían unidas a las transferencias de membrana y se visualizaron los estándares de ADN de DIG etiquetado mediante el uso del sistema de detección de ácido nucleico quimioluminiscente CDP-Star (de Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) según la recomendación del fabricante. Se expusieron las transferencias a una película de quimioluminiscencia durante uno o más puntos temporales para detectar fragmentos de hibridación y para visualizar los estándares de tamaño molecular. Se revelaron películas con un revelador de películas All-Pro 100 Plus (Konlca Minolta, Osaka, Japón) y se escanearon las imágenes. La cantidad y los tamaños de bandas detectadas fueron documentados para cada sonda. Se usó un marcador II de peso molecular de ADN de DIG etiquetado (DIG MWM II) y un marcador Vil de peso molecular de ADN de DIG etiquetado (DIG MWM Vil), visibles despues de la detección de DIG según lo descripto, para determinar el tamaño del fragmento de hibridación en las transferencias Southern.

Tabla 6. Ubicación y longitud de las sondas empleadas en el análisis por transferencia Southern.

Ejemplo 4.5: Resultados de la transferencia Southern La Tabla 7 muestra los tamaños de fragmentos esperados y observados con una digestión y una sonda en particular, sobre la base de los sitios de enzimas de restricción conocidos de aad-12 v1 y 2mEPSPS v1 PTU. Se identificaron dos tipos de fragmentos a partir de estas digestiones e hibridaciones: fragmentos internos, donde los sitios de enzimas conocidos flanquean la región de sondas y se encuentran completamente contenidos en la región de inserción de aad-12 v1 y 2mEPSPS v1 PTU y fragmentos límite, donde un sitio de enzima conocido se encuentra ubicado en un extremo de la región de sondas y donde se espera un segundo sitio en el genoma de la soya. Los tamaños de fragmentos límite varían según el evento porque, en la mayoría de los casos, los sitios de integración de fragmentos de ADN son únicos para cada evento. Los fragmentos límite proveen un medio para ubicar un sitio de enzima de restricción respecto del ADN integrado y para evaluar la cantidad de inserciones de ADN. Los análisis por transferencia Southern completados en múltiples generaciones de evento de soya pDAB8264.42.32.1 arrojaron datos que sugirieron que se insertó una copia baja, de aací-12 v1 y 2mEPSPS v1 PTU fde plásmido pDAB8264 en el genoma de la soya del evento de soya pDAB8264.42.32.1 .

Tabla 7. Fragmentos de hibridación pronosticados y observados en el análisis de transferencia Southern. 1. Los tamaños de fragmentos esperados se basan en el mapa de plásmido de pDAB8264. 2. Los tamaños de fragmentos observados se consideran aproximadamente a partir de estos análisis y se basan en los tamaños indicados del marcador de peso molecular de ADN rotulado con DIG II y fragmentos de Mark Vil.

Las enzimas de restricción Hindlll y Ncol se unen y clavan sitios de restricción únicos en plásmido pDAB8264. Posteriormente, estas enzimas se seleccionaron para caracterizar el inserto del gen aad-12 v1 en el evento de soya pDAB8264.42.32.1 . Se predijo que los fragmentos de borde de >4078 bp o >3690 bp hibridan con la sonda despues de las digestiones de Hindlll o Ncol, respectivamente (Tabla 7). Se observaron bandas de hibridación aací-12 v1 individuales de ~4100 bp y ~6700 cuando se usaron Hind III o Ncol, respectivamente. La hibridación de la sonda en bandas de aquellos tamaños sugiere la presencia de un sitio de inserción único para el gen aad-12 v1 en el genoma del evento de soya pDAB8264.42.32.1. La enzima de restricción Nsil se seleccionó para liberar un fragmento que contiene la unidad de transcripción de planta aad-12 v1 (PTU; promotor/gen/terminador) (Tabla 7). El fragmento pronosticado de ~4900 bp se observó con la sonda después de la digestión de Nsil. Los resultados obtenidos con la digestión de enzimas de las muestras de pDAB8264.42.32.1 seguido por hibridación de sonda indicaron que un aad-12 v1 PTU intacto de plásmido pDAB8264 se insertó en el genoma del evento de soya pDAB8264.42.32.1 .

Las enzimas de restricción Hindlll, Ncol y Nsil se unen y clivan sitios de restricción en plásmido pDAB8264. Posteriormente, estas enzimas se seleccionaron para caracterizar el iserto génico de 2mEPSPS v1 en el evento de soya pDAB8264.42.32.1 . Se pronosticó que los fragmentos de borde de >4260 bp, >3749 o >5199 bp hibridan con la sonda después de las digestiones de Hindlll, Ncol y Nsil, respectivamente (Tabla 7). Se observaron bandas individuales de hibridación de 2mEPSPS v1 de ~5300 bp, 18000 y ~7500 bp cuando se usaron Hindlll, Neo! y Nsil, respectivamente. La hibridación de la sonda en bandas de este tamaño sugiere la presencia de un sitio de inserción único para el gen de 2mEPSPS v1 en el genoma del evento de soya pDAB8264.42.32.1. La enzima de restricción Pací se seleccionó para liberar un fragmento que contiene la unidad de transcripción de planta 2mEPSPS v1 (PTU; promotor/gen/terminador) (Tabla 7). Se observaron fragmentos pronosticados de ~6700 bp con la sonda despues de las digestiones de Pací. Los resultados obtenidos con la digestión de enzimas de muestras del evento de soya pDAB8264.42.32.1 seguido por hibridación de sonda indicó que un 2mEPSPS v1 PTU intacto de plásmido pDAB8264 se insertó en en genoma de soya del evento de soya pDAB8264.42.32.1.

Ejemplo 4.6: Ausencia de secuencias estructurales También se llevó a cabo análisis de Southern blot para verificar la ausencia del gen de resistencia a espectinomicina (specR), elemento de Ori Rep y proteína de inicio de la replicación trfA (elemento trf A) en el evento de soya pDAB8264.42.32.1. No se espera una hibridación específica en resistencia a espectinomicina, elemento Ori Rep o elemento trf A en muestras del evento de soya pDAB8264.42.32.1 cuando se incluyen controles positivos (ADN plásmido pDAB8264 añadido al ADN genómico de Maverick) y negativos (ADN genómico de Maverick) para el análisis Southern.

Despues de la digestión de Hindlll o Ncol y la hibridación con la sonda específica specR, se observó una banda de tamaño esperada de ~9300 bp o ~5200 bp en la muestra de control positiva (pDAB8264 añadido a ADN genómico de Maverick), respectivamente. La sonda specR no hibridaba en muestras del control negativo y evento de soya pDAB8264.42.32.1. De modo similar, se detectó una banda de tamaño esperado de ~7400 bp en la muestra de control positivo (pDAB8264 añadido al ADN genómico de Maverick) pero ausente de las muestras del control negativo y el evento de soya pDAB8264.42.32.1 después de digestión de Ncol e hibridación con la sonda específica de OriRep. Además, sólo se detectó una banda de tamaño esperado de ~9,300 bp en la muestra de control positivo (pDAB8264 añadido a ADN genómico de Maverick) pero ausente de las muestras del control negativo y el evento de soya pDAB8264.42.32.1 después de la digestión de Hindlll e hibridación con la sonda específica de trfA. Estos datos indican la ausencia del gen de resistencia a espectinomicina, elemento de Ori Rep y proteína de inicio de la replicación trfA en el evento de soya pDAB8264.83.2.1.

Ejemplo 5: Ensayo agronómico y de rendimiento en campo y tolerancia a herbicidas Se corrieron ensayos agronómicos replicados para evaluar las características agronómicas del evento de soya pDAB8264.42.32.1. La mayoría de los ensayos en campo se plantaron en distintas ubicaciones geográficas a lo largo de los Estados Unidos donde se cultiva la variedad de soya que contiene el evento de soya pDAB8264.42.32.1. Se completaron tres grupos de experimentos. La primera serie de experimentos compararon la eficacia agronómica de plantas del evento de soya pDAB8264.42.32.1 pulverizadas con los herbicidas 2,4-D y glifosato con plantas de evento de soya pDAB8264.42.32.1 que no se pulverizaron con herbicidas. La segunda serie de experimentos compararon la eficacia agronómica de plantas del evento de soya pDAB8264.42.32.1 con las plantas de control de Maverick cercanas a isolina. Finalmente, una tercera serie de experimentos se completó para ensayar la tolerancia de plantas del evento de soya pDAB8264.42.32.1 a aplicaciones de glufosinato.

Los primeros experimentos compararon plantas del evento de soya pDAB8264.42.32.1 que se rociaron con sal de 2,4-D dimetilamina a 1 120 g ae/ha (Weedar 64, Nufarm, Burr Ridge, IL) y glifosato a 1 120 g ae/ha (Durango, Dow AgroSciences, Indianápolis, IN), con plantas del evento de soya pDAB8264.42.32.1 que no se habían rociado. Se aplicaron tratamientos con herbicidas en los estadios de crecimiento V3 y R2. El ensayo en campo, que consistía en secciones pulverizadas y no pulverizadas, se realizó como diseños en bloque completos aleatorios durante dos años de crecimiento separados. El ensayo en campo de 2010 consistió en dos replicaciones por 25 entradas en cada bloque y el ensayo en campo de 201 1 consistió en cuatro replicaciones por 26 entradas en cada bloque. Para ambos experimentos, cada parcela consistía en dos filas, de 12,5 pies de largo, 30 pulgadas plantadas aparte con un callejón de 2,5 pies entre parcelas. En toda la estación, las parcelas de campo se mantuvieron bajo prácticas agronómicas normales y se mantuvieron libres de malezas. En toda la estación, se midieron una cantidad de características agronómicas. Estas características y el estadio de crecimiento cuando se recolectaron los datos se enumeran en la Tabla 8.

Tabla 8. Lista de características agronómicas medidas en ensayos de campo para comparar el evento de soya pDAB8264.42.32.1 con Maverick.

Al final de la estación de crecimiento, se combinaron los datos de todas las ubicaciones y se realizó un análisis de ubicación cruzada. Se realizó el análisis de los datos y se informan medias de mínimos cuadrados del análisis para las diferentes características de los cultivos en la Tabla 9. Para las variables en las que se midió el efecto significativo de entrada, se realizó una posterior separación media usando el testo de Student para efectuar la comparación entre plantas pulverizadas y no pulverizadas del evento de soya pDAB8264.42.32.1. El nivel de probabilidad para determinar la significancia se fijó en p = 0,05. El evento de soya pDAB8264.42.32.1 mostró tolerancia a la mezcla en tanque de 2,4-D y glifosato. Por el contrario, ninguna de las plantas de Maverick que se pulverizaron con la mezcla en tanque de 2,4-D y glifosato era tolerante a los tratamientos con herbicidas.

Tabla 9. Medias de mínimos cuadrados del análisis de ubicación cruzada en comparación de plantas rociadas del evento de soya pDAB8264.42.32.1 con plantas no pulverizadas durante los años 2010 y 201 1. Para cada rasgo, los valores no seguidos por la misma letra son diferentes de acuerdo con el test de Student. tolerancia a las aplicaciones de mezcla en tanque de glifosato y 2,4-D tanto en el estadio V3 como R2 de desarrollo de crecimiento. A pesar de que hubo una ligera lesión cuando se aplicaron inicialmente los herbicidas, las plantas no estaban lesionadas de forma significativa y crecieron respecto a la respuesta a la lesión 14 días despues de la aplicación. Todos los rasgos se midieron a excepción de 100 en peso de semilla y la incidencia de la enfermedad exhibió una paridad entre plantas del evento de soya pDAB8264.42.32.1 con herbicidas y las plantas del evento de soya pDAB8264.42.32.1 que no se habían tratado con herbicidas. Así, la aplicación de las tasas de campo de 2,4-D y glifosato a las plantas del evento de soya pDAB8264.42.32.1 no dio como resultado ningún cambio significativo de las características agronómicas o los rasgos que serían nocivos para el rendimiento agronómico de las plantas del evento de soya PDAB8264.42.32.1.

Los segundos experimentos compararon el rendimiento agronómico para seleccionar las características agronómicas entre las plantas de evento de soya pDAB8264.42.32.1 y plantas de control cerca de isolina de Maverick. Los ensayos en campo se realizaron como diseños en bloque completos aleatorios durante dos años de crecimiento separados. El ensayo en capo de 2010 consistió en dos replicaciones por 25 entradas en cada bloque y el ensayo en campo de 2011 consistió en cuatro replicaciones por 26 entradas en cada bloque. Para ambos experimentos, cada parcela consistía en dos filas, de 12,5 pies de largo, 30 pulgadas plantadas aparte con un callejón de 2,5 pues entre las parcelas. En toda la estación, las parcelas del campo se mantuvieron bajo prácticas agronómicas normales y se mantuvieron libres de malezas. A lo largo de la estación, se midieron una cantidad de características agronómicas.

Estas características y el estadio de crecimiento cuando se recolectaron los datos se enumeran en la Tabla 8.

Al final de la estación de crecimiento, se combinaron los datos de todas las ubicaciones y se realizó un análisis de ubicación cruzada. El análisis de los datos se llevó a cabo y se informan las medias de mínimos cuadrados del análisis para las diferentes características de los cultivos en la Tabla 10. Para las variables en las que se midió el efecto significativo de entrada, se realizó una posterior separación media usando el testo de Student para realizar una comparación entre Maverick y el evento de soya pDAB8264.42.32.1. El nivel de probabilidad para determinar la significancia se fijó en p = 0,05.

Tabla 10. Medias de mínimos cuadrados del análisis de ubicación cruzada en comparación de plantas rociadas del evento de soya pDAB8264.42.32.1 con plantas de Maverick durante los años 2010 y 2011 . Para cada rasgo, los valores no seguidos por la misma letra son diferentes de acuerdo con el test de Student.

Todos los rasgos medidos a excepción de la pigmentación de las semillas exhibieron una paridad entre el evento de soya pDAB8264.42.32.1 y Maverick. Las plantas del evento de soya pDAB8264.42.32.1 dieron como resultado una tasa de pigmentación de las semillas de 1.8 en comparación con las plantas de Maverick que dieron como resultado una tasa de pigmentación de semillas de 1 ,3. Esta diferencia no es una diferencia grande para los productores y no altera el rendimiento del cultivo ni esta diferencia daría como resultado una diferencia agronómica importante que alteraría el rendimiento del cultivo. Los resultados indican que el evento de soya pDAB8264.42.32.1 se puede desarrollar de forma diferente que Maverick respecto de algunas características agronómicas, pero la diferencia es mínima y no está fuera del rango normal de soyas cultivadas comercialmente.

Para evaluar la tolerancia a herbicida glufosinato del evento de soya pDAB8264.42.32.1 , el evento se plantó en un ensayo de eficacia en Indiana durante la estación de cultivo de 2010. El cultivar Maverick, que se había transformado originalmente para producir el evento de soya pDAB9582.816.15.1 , se plantó en cada nursery y se incluía como control en los experimentos. El evento se aleatorios con otros eventos que estaban en el mismo estadio de ensayo y consistían en cuatro replicaciones. Maverick se incluyó como el control no transformado. El ensayo se realizó como un diseño de parcela con separación modificada con tratamientos como parcelas completas y eventos como subparcelas. Un tratamiento con glufosinato a 822 g ae/ha y un tratamiento de control no pulverizado se aplicaron a las plantas de soya. Los tratamientos se aplicaron en los estadios de crecimiento V5 y R2. La tolerancia a herbicida se midió evaluando las plantas respecto de la lesión a las 6 horas y 7 días después del tratamiento. La lesión se evaluó evaluando visualmente la clorosis, la necrosis de las hojas y la muerte de la planta. El evento de soya pDAB8264.42.32.1 exhibía una robusta tolerancia a la aplicación del herbicida glufosinato. Por el contrario, ninguna de las plantas de Maverick fueron tolerantes a los tratamientos con herbicida.

Ejemplo 6: ensayo TaqMan específico del evento Se desarrolló un ensayo TAQMAN específico del evento para detectar la presencia del evento de soya pDAB8264.42.32.1 y para determinar el estado de cigsidad de plantas en las poblaciones de cría. El evento de soya pDAB8264.42.32.1 contiene la cadena T del vector binario pDAB8264 (Figura 4). Para la detección específica del evento de soya pDAB8264.42.32.1 , los cebadores específicos TAQMAN y las sondas se diseñaron de acuerdo con las secuencias de ADN ubicadas en la articulación inserto a planta 5’ (SEC ID NO:19) o 3’ (SEC ID NO:20) (Figura 4). Un ensayo específico de evento para el evento de soya pDAB8264.42.32.1 se diseñó para detectar específicamente un fragmento de ADN de 131 bp que extiende la articulación de integración 3’ usando dos cebadores y una sonda MGB específica del blanco sintetizada por Applied Biosystems (ABI) que contenía el reportero FAM en su extremo 5’. La especificidad de este metodo de detección TAQMAN para el evento de soya pDAB8264.42.32.1 se ensayó contra 11 diferentes eventos que contienen 2mEPSPS v1 y aad-12 v1 PTUs y una variedad de soya de control no transgénica (Maverick) en formato doble con el gen de referencia endógeno específico, GMFL01-25-J19 (cADN de Glycine max, GenBank: AK286292.1 ).

Ejemplo 6.1 : aislamiento de gADN Se ensayaron muestras de ADN genómico (gADN) de 11 diferentes eventos de soya y variedades de soya no transgénicas en este estudio. El ADN genómico se extrajo usando el kit modificado Qiagen MAGATTRACT PLANTA DNA (Qiagen, Valencia, CA). Se usaron discos de hojas de soya frescos, 8 por muestra, para extracción de gADN. Las muestras se diluyeron con agua libre de ADNasa, dando como resultado una concentración de aproximadamente 10 ng/pL a los fines de este estudio.

Ejemplo 6.2: ensayo de TaqMan y resultados Se diseñaron cebadores específicos de TAQMAN y sonda para un evento de soya pDAB8264.42.32.1 de ensayo específico de TAQMAN. Estos reactivos se pueden usar con las condiciones enumeradas más abajo para detectar el evento de soya pDAB8264.42.32.1. La Tabla 11 enumera las secuencias de cebadores y sondas que se desarrollaron específicamente para la detección del evento de soya pDAB8264.42.32.1.

Tabla 11. Cebadores y sondas de PCR TAQMAN.

Las condiciones múltiples de PCR para la amplificación son las siguientes: 1 X Roche PCR Buffer, 0,4 mM de cebador delantero específico de evento, 0,4 mM de cebador inverso específico de evento, 0,4 mM de cebador GMS1 16 F, 0,4 mM de cebador GMS1 16 R, 0,2 mM de sonda específica de evento, 0,2 mM de sonda GMS1 16, 0, 1 % de PVP, 6-20 ng de gADN en una reacción total de 10 pL. El cóctel se amplificó usando las siguientes condiciones: i) 95 °C durante 10 min. , ii) 95 °C durante 10 seg, iii) 60 °C durante 40 seg, iv) etapa de repetición ii-iii para 40 ciclos, v) 40 °C de mantenimiento. La PCR en tiempo real se llevó a cabo en el ROCHE LIGHTCICLER 480. Los análisis de datos se basaron en la medición del punto de cruza (valor Cp) determinado por medio del software LIGHTCICLER 480, que es el número de ciclo de PCR en donde la tasa de cambio en la fluorescencia alcanza su máximo.

El metodo de detección TAQMAN para el evento de soya pDAB8264.42.32.1 se ensayó contra 11 diferentes eventos que contienen 2mEPSPS v1 y aacf-12 v1 PTUs y una variedad de soya no transgénica en formato doble con el gen de referencia endógeno específico de soya, GMFL01-25-J19 (GenBank: AK286292.1 ). El ensayo específicamente detectó el evento de soya pDAB8264.42.32.1 y no produjo o amplificó cualquier resultado falso-positivo de los controles (es decir, los 1 1 diferentes eventos que contienen 2mEPSPS v1 y aad-12 v1 PTUs y una variedad de soya no transgénica). Los cebadores y las sondas específicos del evento se pueden usar para la detección del evento de soya pDAB8264.42.32.1 y estas condiciones y reactivos son aplicables para ensayos de cigosidad.

Ejemplo 7: Secuencia esperada del evento de soya PDAB8264.42.32.1 SEC ID NO:18 proporciona la secuencia esperada del evento de soya pDAB8264.42.32.1. Esta secuencia contiene la secuencia flanqueante genómica 5', el inserto de cadena T esperado de pDAB8264 y las secuencias flanqueantes genómicas 3'. Respecto de SEC ID NO: 18, los residuos 1-1246 son secuencia flanqueante genómica 5', los residuos 1247-1 1507 son residuos del inserto de cadena T pDAB8264 y los residuos 1 1508-1201 1 son secuencia flanqueante genómica 3'. La secuencia de articulación o transición respecto del extremo 5' del inserto así ocurre en los residuos 1246-1247 de SEC ID NO: 18. La secuencia de articulación o transición respecto del extremo 3' del inserto así ocurre en los residuos 1 1507-1 1508 de SEC ID NO: 18.

Se debe observar que la SEC ID NO:18 es la representación esperada del evento de soya pDAB8264.42.32.1 y se ensambló desde una alineación de SEC ID NO: 19, SEC ID NO:20 y la cadena t de pDAB8264. La secuencia real del inserto de cadena T del evento de soya pDAB8264.42.32.1 se puede desviar ligeramente de la SEC ID NO:18 (por ejemplo, residuos 1247-11507). Durante el proceso de transformación de introducción un inserto de cadena T en el genoma de celulas de plantas, no es poco común que se produzcan algunas supresiones u otras alteraciones del inserto. Más aún, se pueden producir errores en la amplificación PCR que pueden resultar en menores errores de secuenciación. Por ejemplo, las secuencias flanqueantes enumeradas en la presente se determinaron por generación de amplicones de los ADN genómicos de soya y luego clonación y secuenciación de los amplicones. No es inusual hallar ligeras diferencias y menores discrepancias en las secuencias generadas y determinadas de esta manera, dados las muchas ruedas de amplificación que son necesarias para generar un suficiente amplicón para secuenciación de ADN genómicos. Un experto en el arte reconocerá y deberá tomar conocimiento de que cualquier ajuste necesario debido a estos tipos de errores o discrepancias de secuenciación comunes está dentro del alcance de la presente invención. Así, el segmento relevante de la secuencia de plásmidos proporcionada en la presente puede comprender algunas variaciones menores. Así, una planta que comprende un polinucleótido que tiene cierto rango de identidad con la secuencia de inserto objeto está dentro del alcance de la presente invención. La identidad con la secuencia de SEC ID NO:18 o cualquier de sus segmentos tal como se trata en la presente puede ser una secuencia de polinucleótidos con al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencia con una secuencia ejemplificada o descrita en la presente. La secuencia de las secuencias flanqueantes más la secuencia de inserto se puede confirmar con referencia a la semilla depositada. Así, se pueden identificar algunas diferencias entre SEC ID NO:18 y el inserto real de cadena T del evento de soya pDAB8264.42.32.1 se puede identificar y están dentro del alcance de la presente invención.

Ejemplo 8: Uso del sitio de inserción del evento de soya pDAB8264.42.32.1 para integración dirigida El rendimiento agronómico consistente del transgen del evento de soya pDAB8264.42.32.1 en varias generaciones en condiciones de campo sugiere que estas regiones identificadas alrededor del sitio de inserción del evento de soya pDAB8264.42.32.1 en el cromosoma 15 proporciona buenas ubicaciones genómicas para la integración dirigida de otros genes transgenicos de interés. Esta integración dirigida supera los problemas con el llamado “efecto de posición” y el riesgo de crear una mutación en el genoma después de la integración del transgén en el huésped. Otras ventajas de esta integración dirigida incluyen, pero sin limitación, reducción de la gran cantidad de eventos de transformación que deben ser controlados y ensayados antes de obtener una planta transgénica que exhibe el nivel deseado de expresión transgénica sin exhibir también anomalías resultantes de la inserción inadvertida del transgén en un importante locus en el genoma huésped. Más aún, esta integración dirigida permite apilar transgenes que hagan más eficiente la cruza de líneas de plantas elite con ambos genes.

Usando las enseñanzas reveladas, un experto en el arte es capaz de dirigir ácidos polinucleicos de interés al mismo sitio de inserción como aquel en el evento de soya pDAB8264.42.32.1 o a un sitio en cercana proximidad al sitio de inserción en el evento de soya pDAB8264.42.32.1. Un método de este tipo se revela en la solicitud de patente internacional No. W02008/021207, incorporada en la presente por referencia en su totalidad.

Brevemente, hasta 20 Kb de la secuencia genómica flanqueante 5’ del sitio de inserción y hasta 20 Kb de la secuencia genómica flaqueante 3' del sitio de inserción SEC ID NO: 18 se usan para flanquear el gen o los genes de interés que se pretenden insertar en un evento de soya genómico pDAB8264.42.32.1 por medio de recombinación homologa. El gen o los genes de interés se pueden ubicar exactamente como en el sitio de inserción del evento de soya pDAB8264.42.32.1 o se pueden ubicar en cualquier lugar dentro de las regiones de 20 Kb alrededor de los sitios de inserción del evento de soya pDAB8264.42.32.1 para conferir un nivel consistente de expresión transgénica sin efectos nocivos sobre la planta. Los vectores de ADN que contienen el gen o genes de interés y secuencias flanqueantes se pueden proporcionar en células de planta mediante uno de los diversos métodos conocidos por los expertos en el arte, incluyendo, pero sin limitación, la transformación mediada por Agrobacterium. La inserción del vector de ADN donante en el sitio blanco del evento de soya pDAB8264.42.32.1 también se puede mejorar por medio de uno de los diversos métodos incluyendo, pero sin limitación, la coexpresión o la regulación hacia arriba de genes mejoradores de la recombinación o la regulación hacia debajo de genes de supresión de recombinación endógena.

Por otra parte, se sabe en el arte que el clivaje de doble cadena de secuencias específicas en el genoma se pueden usar para aumentar la frecuencia de recombinación homologa, por ende, la inserción en el sitio de inserción del evento de soya pDAB8264.42.32.1 y sus regiones flanqueantes se pueden mejorar por expresión de endonucleasas naturales o diseñadas específicas de la secuencia para clivar estas secuencias. Así, usando las enseñanzas proporcionadas en la presente, se puede insertar cualquier ácido nucleico heterólogo en un sitio blanco ubicado entre o cerca de la SEC ID NO:1 y SEC ID NO:2 y en algunos ejemplos, dentro o cerca de la SEC ID NO:18.

Ejemplo 9: Excisión del casete de expresión del gen pat del evento de soya pDAB8264.42.32.1 La eliminación de un casete de expresión genico de marcador seleccionable puede ser ventajosa para la inserción objeto en el evento de soya pDAB8264.42.32.1. La eliminación del marcador seleccionable pat del evento de soya pDAB8264.42.32.1 permite la reutilización del marcador seleccionable pat en la integración dirigida de ácidos polinucleicos dentro de la ubicación genómica del evento de soya pDAB8264.42.32.1 en posteriores generaciones de soya.

Usando las enseñanzas reveladas, un experto en el arte es capaz de escindir ácidos polinucleicos de interés del evento de soya pDAB8264.42.32.1. Uno de estos métodos se revelan en la patente US No. de serie 13/01 1 .666, incorporada en la presente por referencia en su totalidad.

Brevemente, se diseñan endonucleasas específicas de secuencias como nucleasas de dedos de zinc que reconocen, unen y clivan secuencias de ADN específicas que flanquean un casete de expresión génica. Las nucleasas de dedos de zinc se suministran en la célula de planta cruzando una planta principal que contiene casetes de expresión de nucleasa de dedos de zinc transgénicos a una segunda planta principal que contiene el evento de soya pDAB8264.42.32.1 . La progenie resultante crece hasta madurez y se analiza respecto de la pérdida del casete de expresión pat por pintura de las hojas con un herbicida que contiene glufosinato. Las plantas de progenie que no son resistentes al herbicida se confirman por vía molecular y se avanza para la autofertilización. La excisión y eliminación del casete de expresión pat se confirma por vía molecular en la progenie obtenida de la autofertilización. Usando las enseñanzas proporcionadas en la presente, cualquier ácido nucleico heterólogo se puede escindir del cromosoma 15 de soya en un sitio objeto ubicado entre SEC ID NO: 1 y SEC ID NO:2, con preferencia dentro de la SEC ID NO:18.

Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de preparación de un cassette de expresión para una planta de soya que comprende producir un polinucleótido heterólogo unido operativamente a un promotor insertado en un segmento de ADN genómico de soya que comprende SEC ID NO: 1 y SEC ID NO:2.

2. Una molécula de polinucleótido aislada, en donde dicha molécula comprende al menos 15 nucleótidos y mantiene la hibridación en condiciones de lavado rigurosas con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:1 y SEC ID NO:2.

3. Un polinucleótido aislado, en donde dicho polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs:3-21.

4. Un método de inserción de un transgén en un segmento de ADN de un genoma de soya, donde dicho segmento de ADN comprende un extremo 5’ que comprende SEC ID NO: 1 y un extremo 3’ que comprende residuos de nucleótido SEC ID NO:2.

5. Un método de cruza de una planta de soya, donde dicho método comprende la cruza una primera planta de soya que comprende un inserto transgénico entre SEC ID NO:1 y SEC ID NO:2, con una segunda planta de soya para producir una tercera planta de soya que comprende un genoma y el ensayo de dicha tercera planta de soya en cuanto a la presencia de dicho inserto transgénico entre SEC ID NO:1 y SEC ID NO:2 en dicho genoma.

6. Un metodo de introgresión de un rasgo de tolerancia a herbicida en una planta de soya, donde dicho método comprende la cruza de una primera planta de soya que comprende SEC ID NO:19 y SEC ID NO:20 con una segunda planta de soya para producir una tercera planta de soya que comprende un genoma y el ensayo de dicha tercera planta de soya respecto de la presencia de al menos una de SEC ID NO: 19 y SEC ID NO:20 en dicho genoma.

7. Un método de control de malezas, donde dicho método comprende la aplicación de al menos uno de un herbicida de ariloxialcanoato, glifosato, bialafos, fosfinotricina o glufosinato a un campo, donde dicho campo comprende una planta de soya transgénica que comprende un inserto transgénico en SEC ID NO: 1 , SEC ID NO:2, o entre ADN genómico flanqueante de SEC ID NO: 1 y SEC ID NO:2, en donde dicho inserto transgénico comprende residuos 1247-1 1507 de SEC ID NO: 18.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dichos herbicidas se seleccionan y se aplican de forma simultánea y/o de forma secuencial.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho herbicida de ariloxialcanoato está seleccionado del grupo que consiste en 2,4-D; 2,4-DB; MCPA; y MCPB.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho método comprende la aplicación de al menos un herbicida adicional a dicho campo.

1 1. El metodo de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho al menos un herbicida adicional es dicamba.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende la plantación de una semilla en el campo dentro de los 14 días de la aplicación de los herbicidas, donde dicha planta crece de dicha semilla.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho al menos un herbicida se aplica en la misma estación de crecimiento.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho al menos un herbicida se aplica por sobre la parte superior de dicha planta.

15. Un casete de expresión en plantas, insertado de forma transgénica en el cromosoma 15 de una planta en un locus que flanquea o incluye SEC ID NO: 1 y SEC ID NO:2, que comprende: a. una primera unidad de transcripción vegetal que expresa un gen de tolerancia a herbicida de glifosato; b. una segunda unidad de transcripción vegetal que expresa un gen de tolerancia a herbicida de ariloxialcanoato; y c. una tercera unidad de transcripción vegetal que expresa un gen de tolerancia a herbicida de glufosinato.

16. Un método para identificar el evento pDAB8264.42.32.1 en una muestra, que comprende la detección de una secuencia de articulación de pDAB8264.42.32.1 , presente en la semilla depositada con el número de acceso a ATCC PTA-1 1993, con una sonda o al menos un cebador que se une específicamente o amplifica dicha secuencia de articulación, en donde dicha secuencia de articulación comprende residuos 1246-1247 de SEC ID NO:19 o residuos 176-177 de SEC ID NO:20.

17. El metodo de acuerdo con la reivindicación 16, que también comprende la amplificación de un fragmento de ADN a partir de un ácido nucleico presente en dicha muestra usando una reacción en cadena de polimerasa con al menos dos cebadores, en donde dicho primer cebador se une específicamente a una secuencia de inserto dentro de la SEC ID NO:18 o su complemento y un segundo cebador que se une específicamente con una secuencia dentro de una secuencia flanqueante seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO:2.

18. Un método para determinar la cigosidad del evento de una planta de soya que comprende el evento de soya pDAB8264.42.32.1 , presente en la semilla depositada con el número de acceso de ATCC PTA-1 1993, donde dicho evento comprende un constructo transgénico, donde dicho constructo transgénico está flanqueado con un ADN genómico de soya flanqueante 5' y un ADN genómico de soya flanqueante 3', donde dicho método comprende: obtener una muestra de ADN de ADN genómico de dicha planta de soya; producir una muestra contactada poniendo en contacto dicha muestra de ADN con a. un primer cebador de evento y un segundo cebador de evento, en donde dicho primer cebador de evento se une específicamente con dicho constructo transgenico, donde dicho segundo cebador de evento se une específicamente con dicho ADN flanqeuante genómico de soya 5' o dicho ADN flanqueante genómico de soya 3' y en donde dicho primer cebador de evento y dicho segundo cebador de evento producen un amplicón de evento cuando se someten a condiciones de PCR TAQMAN b. un cebador delantero de referencia y un cebador inverso de referencia que producen un amplicón de referencia a partir de un gen de referencia de soya endógeno cuando se someten a condiciones de PCR TAQMAN c. una sonda de evento fluorescente que híbrida con dicho amplicón de evento d. una sonda de referencia fluorescente que híbrida con dicho amplicón de referencia; someter dicha muestra contactada a condiciones de PCR TAQMAN de punto final en base a fluorescencia; cuantificar dicha sonda de evento fluorescente que híbrida en dicho amplicón de evento; cuantificar dicha sonda de referencia fluorescente que híbrida en dicho amplicón de referencia; comparar cantidades de sonda de evento fluorescente hibridado con la sonda de referencia fluorescente hibridada; y determinar la cigosidad de pDAB8264.42.32.1 comparando las relaciones de fluorescencia de la sonda de evento fluorescente hibridada y la sonda de referencia fluorescente hibridada.

19. El metodo de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho ADN flanqueante 5’ comprende SEC ID NO:1 y dicho ADN flanqueante 3' comprende SEC ID NO:2.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho segundo cebador de evento se une con SEC ID NO:21 .

21. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho gen de referencia comprende o híbrida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO:17.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicha sonda de evento comprende SEC ID NO: 14.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dichos cebadores de evento son SEC ID NO:12 y SEC ID NO:13.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dichos cebadores de evento consisten en SEC ID NO:12 y SEC ID NO: 13, dichos cebadores de referencia consisten en SEC ID NO: 15 y SEC ID NO:16, dicha sonda de evento consiste en SEC ID NO:14 y dicha sonda de referencia consiste en SEC ID NO:17.

25. Un polinucleótido aislado que es al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:1 , SEC ID NO:2, SEC ID NO:18, SEC ID NO:19, SEC ID NO:20 y sus complementos.