CN107177627A

CN107177627A - 用于控制欧洲玉米螟的包含CRY1Ab和CYR2Aa的杀虫蛋白组合

Info

Publication number: CN107177627A
Application number: CN201710607190.7A
Authority: CN
Inventors: T·米德; K·纳瓦; N·P·斯托尔; J·J·希茨; A·T·伍斯利; S·L·伯顿
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2009-12-16
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2017-09-19
Also published as: NZ601105A; CL2014003381A1; RU2577141C2; IL220336A0; NZ630801A; UA111814C2; AU2010330915B2; MX348249B; RU2569460C2; WO2011075590A1; US20120324605A1; EP2512223A1; EP2512220A4; EP2512220A1; JP5907891B2; JP2013514776A; RU2012129899A; CA2782572A1; CL2012001634A1; WO2011075586A1

Abstract

本发明涉及用于控制欧洲玉米螟的包含CRY1Ab和CYR2Aa的杀虫蛋白组合，和管理昆虫抗性的方法。本发明部分地涉及叠加Cry1Ab蛋白和Cry2Aa蛋白以使得植物(特别是玉米)更持久并更少的倾向于允许昆虫发展对这两种毒素的任意一种的活性的抗性。这些叠加可以特别用于靶标欧洲玉米螟(ECB)。

Description

用于控制欧洲玉米螟的包含CRY1Ab和CYR2Aa的杀虫蛋白组合

本申请是2010年12月16日提交的申请号为201080064008.4(PCT申请号为PCT/US2010/060831)、发明名称为“用于控制欧洲玉米螟的包含CRY1Ab和CYR2Aa的杀虫蛋白组合，和管理昆虫抗性的方法”的发明专利申请的分案申请。

发明背景

人类种植玉米以用于食物和能量的供应。昆虫吃并损害植物从而破坏这些人类的努力。

目前已经通过植物表达编码来自苏云金芽孢杆菌的Cry1Fa蛋白的晶体(Cry)内毒素基因而实现了这些害虫的植物内转基因控制。Cry1Fa是目前Dow AgroSciences的Herculex^TM品牌下的转基因玉米种子(Herculex，Herculex-Extra，和Herculex-RW)中的毒素蛋白，其对FAW和ECB昆虫害虫有抗性。该蛋白通过结合至位于昆虫中肠内的特定受体并在肠细胞上形成孔而起作用。这些孔的形成阻止昆虫调节渗透压平衡并导致其死亡。

然而，存在一些情况，即昆虫可能能够通过其肠道中结合Cry1Fa的受体的遗传改变而发展对Cry1Fa活性的抗性。产生具有降低的结合Cry1Fa能力的受体的昆虫会对Cry1Fa的活性有抗性，从而在表达该蛋白的植物中存活。

当植物在生长状态期间持续表达单一的Cry毒素时，有这种情况，即昆虫可以通过昆虫肠道内的结合Cry1Fa毒素的受体的遗传改变而发展对该蛋白的活性的抗性。由受体的这些改变而引起的毒素结合的降低会导致Cry1Fa毒性的降低，并可能导致最终作物中表达的蛋白的效力降低。

发明概述

本发明部分地涉及叠加Cry1Ab蛋白和Cry2Aa蛋白以使得植物(特别是玉米)(cornor maize)更持久并更少的倾向于允许昆虫发展对这两种毒素的任意一种的活性的抗性。这些叠加可以特别用于靶标欧洲玉米螟(ECB)。

具体而言，本申请提供如下各项：

1.转基因植物，其包含编码Cry1Ab杀虫蛋白的DNA和编码Cry2Aa杀虫蛋白的DNA。

2.项1的转基因植物，所述植物进一步包含编码第三种杀虫蛋白的DNA，所述第三种蛋白选自Cry1Fa、Cry1Be、Cry1I和DIG-3。

3.项2的转基因植物，其中所述第三种蛋白选自Cry1Fa和Cry1Be，所述植物进一步包含编码选自Cry1Ca、Cry1Da、Cry1E和Vip3Ab的第四种和第五种杀虫蛋白的DNA。

4.根据项1-3任意一项的植物的种子，其中所述种子包含所述DNA。

5.植物田地，包含非-Bt避难所植物和多个项1-3任意一项的植物，其中所述避难所植物占(comprise)所述田地中所有作物植物的少于40％。

6.项5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中所有作物植物的少于30％。

7.项5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中所有作物植物的少于20％。

8.项5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中所有作物植物的少于10％。

9.项5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中所有作物植物的少于5％。

10.项5的植物田地，其中所述避难所植物是块状或条带。

11.种子混合物，包含来自非-Bt避难所植物的避难所种子，和多个项4的种子，其中所述避难所种子占混合物中全部种子的少于40％。

12.项11的种子混合物，其中所述避难所种子占混合物中全部种子的少于30％。

13.项11的种子混合物，其中所述避难所种子占混合物中全部种子的少于20％。

14.项11的种子混合物，其中所述避难所种子占混合物中全部种子的少于10％。

15.项11的种子混合物，其中所述避难所种子占混合物中全部种子的少于5％。

16.管理昆虫对Cry毒素的形成抗性的方法，所述方法包含种植种子以产生项5的植物田地。

17.项5-10中任意一项的田地，其中所述植物占地超过10英亩。

18.项1-3中任意一项的植物，其中所述植物选自玉米、大豆和棉花。

19.项18的植物，其中所述植物是玉米植物。

20.项1-3中任意一项的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含编码所述Cry1Ab杀虫蛋白的所述DNA和编码所述Cry2Aa杀虫蛋白的所述DNA，其中所述Cry1Ab杀虫蛋白具有与SEQ ID NO:1至少99％的同一性，并且所述Cry2Aa杀虫蛋白具有与SEQ ID NO:2至少99％的同一性。

21.项1-3中任意一项的植物，其中所述Cry1Ab杀虫蛋白包含SEQ ID NO:1，并且所述Cry2Aa杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2。

22.生产项20的植物细胞的方法。

23.控制欧洲玉米螟昆虫的方法，通过使所述昆虫接触Cry1Ab杀虫蛋白和Cry2Aa杀虫蛋白。

附图说明

图1显示了²⁵I Cry1Ab(0.5nM)与来自ECB的BBMV’s的特异性结合百分比对未标记同源Cry1Ab(◆)和异源Cry2Aa(□)的竞争。

发明详述

本发明部分地涉及叠加Cry1Ab蛋白和Cry2Aa蛋白以使得植物(特别是玉米)更持久并更少的倾向于允许昆虫发展对这两种毒素的任意一种的活性的抗性。这些叠加可以特别用于靶标欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)。

本发明也部分涉及三倍叠加或三种(或更多)蛋白毒素的“金字塔”，由Cry1Ab和Cry2Aa毒素作为基础对。(“分离的活性位点”，意思是给定的蛋白的任何一个不引起相互之间的交叉抗性。)增加靶向ECB的第三种蛋白能提供具有针对ECB的行为的第三个位点的蛋白。在一些优选的实施方式里，第三个蛋白可以选自DIG-3(参见US 2010-00269223)，Cry1I，Cry1Be，Cry2Aa，和Cry1Fa。参见例如USSN 61/284,278，提交于2009年12月16日。也参见US 2008-0311096。

从而，在一些优选的金字塔实施方式里，选择的毒素具有针对ECB的作用的分离的位点。此外，优选的金字塔组合为本发明的蛋白对加第三个IRM蛋白。

本发明的对或三倍叠加(对ECB活性)也可以与另外的蛋白组合——例如靶向秋粘虫(FAW)。这样的蛋白包括例如Vip3，Cry1C，Cry1D，和/或Cry1E。Cry1Be和/或Cry1Fa也可以用于靶向FAW和ECB。

GENBANK可以用于获得本文公开或提及的任何基因和蛋白的序列。参见附录A。

本发明也涉及三种杀虫蛋白(在一些优选实施方式里是Cry蛋白)，其对单一的靶标害虫有活性，但是不导致相互之间的交叉抗性。

生产这三种(至少)毒素的植物(和种植该植物的面积)也包含在本发明的范围之内。也可以加入其它的毒素/基因，但是这些特别的三倍叠加根据本发明可以便利地和令人惊讶地提供针对ECB的活性的三个位点。

本发明的对或三倍叠加(和/或其它蛋白的组合)能有助于减少或消除对避难所面积的需求(即，少于40％，少于20％，少于10％，少于5％，或甚至0％的避难所)。从而种植了超过10英亩的田地也包含在本发明之内。提供的多核苷酸优选在遗传构建体中并在非苏云金芽孢杆菌启动子的控制之下。提供的多核苷酸可以包含用于在植物中增强表达的密码子。

为了阻碍昆虫发展针对Cry蛋白的抗性的能力，我们鉴别了不竞争性结合至ECB肠受体蛋白的Cry毒素。发现Cry1Ab不取代结合至位于ECB幼虫的昆虫肠道中的受体的Cry2Aa。

我们发现Cry2Aa和Cry1Ab对ECB幼虫是毒性的，然而它们不完全与同样的受体位点结合；这显示它们的毒性不会在ECB中提供交叉抗性。

从而具有对Cry1Ab的发展的抗性的昆虫仍然会对Cry2Aa蛋白的毒性敏感，例如，其中Cry2Aa结合不同的受体位点。我们获得了生物化学数据支持该观点。从而转基因植物中表达的这些蛋白的组合提供了有用的和有价值的机制以减少田地中昆虫抗性的发展的可能性，并从而导致对避难所的需求减少。本文下面描述的数据显示Cry2Aa蛋白在昆虫肠中与相比于Cry1Ab分离的目标位点结合，从而会成为优秀的叠加成员。

如果抗性通过结合至Cry毒素的昆虫肠受体的亲和力的变化而发生，该变化必须同时发生在至少两个不同的受体上以使得昆虫在表达多种蛋白的植物上存活。发生这种情况的可能性是非常小的，从而增加了转基因产物的持久性以防止昆虫能够发展对蛋白的耐受性。

我们放射性碘标记了Cry1Ab蛋白并用放射性受体结合分析技术来测量其与位于昆虫肠膜中的推定受体蛋白的结合作用。肠膜通过Wolfersberger的方法制备为刷状缘膜载体(BBMV)。毒素的碘化作用通过来自Pierce Chemicals的碘珠或碘处理的试管来进行。放射性标记毒素的特定活性为约1-4μCi/μg蛋白。基本上通过Liang(1995)的流程进行了结合研究。

本文展现的数据显示相比于Cry1Ab，毒素结合昆虫肠中的分离的靶标位点，从而会成为优秀的叠加成员。

本发明可以用于多种植物。实例包括玉米，大豆和棉花。

根据本发明有用的基因和毒素包括但不仅是公开的全长序列而且包括这些序列的片段，变体，突变，和融合蛋白，其保留本文特别示例的毒素的特征性杀虫活性。如本文所用，术语基因的“变体”或“变异”指这样的核苷酸序列，其编码相同的毒素或者编码具有杀虫活性的等价毒素。如本文所用，术语“等价毒素”是指具有与所要求的毒素相同或基本上相同的针对目标害虫的生物活性的毒素。

如本文所用，边界展现约95％(例如，Cry1Ab的和Cry2Aa的)，78％(例如，Cry1A的和Cry2A的)，和45％(Cry1的和Cry2的)序列同一性，参考“Revision of the Nomenclaturefor the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins”，N.Crickmore，D.R.Zeigler，J.Feitelson，E.Schnepf，J.Van Rie，D.Lereclus，J.Baum，andD.H.Dean.Microbiology and Molecular Biology Reviews(1998)Vol 62:807-813。这些切断(cut offs)也可以仅提供于核心蛋白。

示例的毒素的保留杀虫活性的片段或等价物也在本发明的范围之内。同样，由于遗传密码子的冗余性，多种不同DNA序列可以编码本文公开的氨基酸序列。本领域技术人员能建立这些编码同样的，或基本上同样的毒素的可选的DNA序列。这些变体DNA序列在本发明的范围之内。如本文所用，涉及“基本上相同”的序列是指具有氨基酸取代、删除、添加或插入而不从本质上影响杀虫活性的序列。编码保留杀虫活性蛋白的基因的片段也包括在该定义之内。

根据本发明的鉴别编码毒素的基因和基因部分的进一步的方法是通过使用寡核苷酸探针。这些探针是可探测的核苷酸序列。这些序列可以通过依靠合适的放射性标记或可以通过固有的荧光来实现可探测性，描述于国际申请号WO93/16094。本领域公知，如果探针分子和核酸样品通过形成两个分子间强烈的碱基配对键而杂交，则可以推定该探针和样品具有基本的序列同源性。优选地，杂交是在严紧条件下通过本领域公知的技术来进行，描述于例如Keller，G.H.，M.M.Manak(1987)DNA Probes，Stockton Press，New York，N.Y.，pp.169-170。盐浓度和温度组合的一些实例如下(为了增加严紧度)：2X SSPE或SSC在室温下；1X SSPE或SSC在42℃；0.1X SSPE或SSC在42℃；0.1X SSPE或SSC在65℃。探针的检测提供了用已知方式确定杂交是否发生的方法。这样的探针分析提供了鉴别本发明的毒素编码基因的快速方法。根据本发明的用作探针的核苷酸片段可以使用DNA合成器和标准过程来合成。这些核苷酸序列也可以用做PCR引物以扩增本发明的基因。

本文特别示例了本发明的某些毒素。由于这些毒素仅仅是本发明的毒素的示例，很显然本发明包含变体或等价毒素(和编码等价毒素的核苷酸序列)，所述等价毒素具有与示例毒素相同或类似的杀虫活性。等价毒素具有与示例毒素的氨基酸同源性。这种氨基酸同源性典型地大于75％，大于90％，并可以大于91，92，93，94，95，96，97，98，或99％。氨基酸序列的同源性在毒素的关键区域是最高的，所述关键区域对生物学活性起作用或者涉及三维构象的确定，其最终也为生物活性服务。在这点上，某些氨基酸取代是可接受的并且是被期望的，如果这些取代在对活性不关键的区域或者是不影响分子的三维构象的保守氨基酸取代。例如，氨基酸可以位于下列类别中：非极性；不带电极性，碱性，和酸性。保守性取代，即其中一类的氨基酸替换为同样类型的另一个氨基酸，也在本发明的范围内，只要该取代不本质上改变该化合物的生物活性。下面是属于每个类的氨基酸的实例的列表。在一些情况下，非保守取代也可以进行。一个重要事实是这些取代必须不显著损害蛋白的生物活性。

植物转化。一种用于生成本发明的杀虫蛋白的优选的重组宿主是经转化的植物。可以使用本领域中公知的多种技术来将如本文中所公开的编码Bt毒素蛋白的基因插入植物细胞中。例如，包含大肠杆菌(Escherichia coli)中的复制系统和容许选择经转化的细胞的标志物的大量克隆载体可用于准备好将外来基因插入高等植物中。例如，载体包括pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184，等等。因而，可以将具有编码Bt毒素蛋白的序列的DNA片段在合适的限制性位点插入载体中。可以使用所得的质粒对大肠杆菌转化将大肠杆菌细胞在合适的营养培养基中培养，然后收获并裂解。将质粒回收。序列分析、限制性分析、电泳、和其它生物化学-分子生物学方法一般作为分析方法实施。在每次操作后，可以将使用的DNA序列切割，并与下一DNA序列连接。可以在同一或其它质粒中克隆每个质粒序列。根据将期望的基因插入植物中的方法，其它DNA序列可以是必要的。如果例如使用Ti或Ri质粒转化植物细胞，那么至少Ti或Ri质粒T-DNA的右侧边界，但是经常是右侧和左侧边界必须作为要插入的基因的侧翼区连接。T-DNA转化植物细胞的用途已经透彻研究，并且充分记载于EP 120 516,Lee和Gelvin(2008),Hoekema(1985),Fraley等,(1986),及An等,(1985)，而且是本领域中完善建立的。

一旦将插入的DNA在植物基因组中整合，它便是相对稳定的。转化载体通常含有选择标志，其对经转化的植物细胞赋予对抗微生物剂或抗生素诸如Bialaphos、卡那霉素、G418、博来霉素、或潮霉素等的抗性。因而，个别采用的标志物应当容许选择经转化的细胞，而不是不含插入的DNA的细胞。

大量技术可用于将DNA插入植物宿主细胞中。那些技术包括使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂用T-DNA的转化、融合、注射、生物射弹(微粒轰击)、或电穿孔以及其它可能的方法。若使用土壤杆菌进行转化，则必须将要插入的DNA克隆入特殊的质粒中，即克隆入中间载体中或克隆入二元载体中。可以通过由于与T-DNA中的序列同源的序列所致的同源重组将中间载体整合入Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒还包含转移T-DNA必需的vir区。中间载体不能在土壤杆菌中自身复制。可以依靠辅助质粒将中间载体转移入根癌土壤杆菌中(接合)。二元载体在大肠杆菌和土壤杆菌中都能自身复制。它们包含选择标志基因和接头或多接头，其以右侧和左侧T-DNA边界区为框。可以将它们直接转化入土壤杆菌中(Holsters等,1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌包含携带vir区的质粒。vir区是将T-DNA转移入植物细胞中必需的。可以含有别的T-DNA。使用如此转化的细菌来转化植物细胞。有利地，可以将植物外植体与根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌一起培养以将DNA转移入植物细胞中。然后，可以在可含有供选择用的抗生素或抗微生物剂的选择培养基中自感染的植物材料(例如，叶块、柄(stalk)段、根，而且还有原生质体或悬浮培养的细胞)再生全植物。然后，可以对如此获得的植物测试插入的DNA的存在。在注射和电穿孔的情况中质粒没有特殊需要。有可能使用普通的质粒，诸如例如pUC衍生物。

经转化的细胞以常见的方式在植物内部生长。它们可以形成生殖细胞，并且将转化的性状传递给后代植物。可以将此类植物以正常的方式培养，并且与具有相同转化遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。所得的杂种个体具有相应的表型特性。

在本发明的一个优选的实施方案中，会用基因转化植物，其中已经对植物优化密码子选择。见例如美国专利No.5380831，在此通过提及而将其收录。虽然在本文中例示了一些截短的毒素，但是Bt领域中公知的是，130kDa型(全长)毒素具有作为核心毒素的N端半部分和作为原毒素“尾部”的C端半部分。如此，合适的“尾部”可以与本发明的截短的/核心毒素一起使用。见例如美国专利No.6218188和美国专利No.6673990。另外，用于创建用于植物的合成Bt基因的方法是本领域中已知的(Stewart和Burgin,2007)。优选的转化植物的一个非限制性例子是能育的玉米植物，其包含编码Cry1Da蛋白的植物可表达基因，而且进一步包含编码Cry1Be蛋白的第二植物可表达基因。

可以通过轮回选择育种，例如通过回交来实现Cry1Da-和Cry1Be-决定性状对近交玉米系的转移(或基因渗入。在此情况中，首先将期望的轮回亲本与携带适合于Cry1D-和Cry1C-决定性状的基因的供体近交物(非轮回亲本)杂交。然后，将此杂交的后代与轮回亲本回交(mate back)，接着在所得的后代中选择要自非轮回亲本转移的期望的性状。在与轮回亲本回交及选择期望的性状的3个，优选地4个，更优选地5个或更多个世代后，后代在控制所转移的性状的基因座方面会是杂合的，但是在大多数或几乎所有其它基因方面会与轮回亲本一样(见例如Poehlman和Sleper(1995)Breeding Field Crops,第4版,172-175；Fehr(1987)Principles of Cultivar Development,第1卷:Theory and Technique,360-376)。

昆虫抗性管理(IRM)策略。例如，Roush等概述了2毒素策略，又称作“金字塔化(pyramiding)”或“叠加”，用于管理杀虫转基因作物。(The RoyalSociety.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353,1777-1786)。

在其网站上，美国环境保护局(epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)公布了提供与生成针对靶害虫有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的非转基因(即，非B.t.)避难所(非Bt作物/玉米的部分)的下列要求。

“玉米螟防护的Bt(Cry1Ab或Cry1F)玉米产品的特定结构化需要如下：

结构化避难所：玉米带中20％非鳞翅目Bt玉米避难所；

棉花带中50％非鳞翅目Bt避难所

区组

内部(即，在Bt田内)

外部(即，在1/2英里(若可能的话，1/4英里)Bt田内的不同田地以使随机杂交最大化)

田间条(Strip)

条必须宽至少4行(优选地6行)以降低幼虫运动的效果”

另外，国家玉米种植者协会(National Corn Growers Association)，在其网站上：

(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)

还提供关于避难所需要的类似指导。例如：

“玉米螟IRM的要求：

-以避难杂种种植至少20％的玉米地

-在棉花生产区中，避难所必须是50％

-必须在1/2英里的避难杂种内种植

-避难所可以在Bt田内以条种植；避难条必须宽至少4行

-只有当对靶昆虫达到经济阈值时，可以用常规的杀虫剂处理避难所

-基于Bt的可喷射的杀虫剂不能对避难玉米使用

-必须在有Bt玉米的每个农场种植合适的避难所”

如由Roush等(例如第1780和1784右栏)所述，各自针对靶害虫有效的且具有很少或没有交叉抗性的两种不同蛋白质的叠加或金字塔化可以容许使用更小的避难所。Roush提示，对于成功的叠加，小于10％避难所的避难所大小可以提供与单一(非金字塔化)性状的约50％避难所相当的抗性管理。对于目前可用的金字塔化Bt玉米产品，美国环境保护局要求比对于单一性状产品(一般为20％)显著更少(一般为5％)的非Bt玉米的结构化避难所。

存在有提供避难所的IRM效果的多种方式，包括田间的各种几何种植样式(如上文所提及的)和袋中种子混合物，如由Roush等(见上文)及美国专利No.6,551,962进一步讨论的。

可以对主题双重或三重叠加或金字塔使用上述百分比、或类似的避难所比率。对于具有针对单一靶害虫的三种作用模式的三重叠加，目的会是0避难所(或例如小于5％避难所)。这特别适用于商业面积—例如超过10英亩的。

本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和出版物通过提及以它们与本说明书的明确教导不矛盾的程度完整收录。

以下是例示用于实施本发明的规程的实施例。这些实施例不应解释为限制性的。除非另有记录，所有百分比是按重量计，而所有溶剂混合物比例是按体积计。所有温度以摄氏度计。

实施例

实施例1–Cry蛋白的¹²⁵I标记

碘化Cry毒素。纯化的截短的Cry毒素用碘化珠Iodo-Beads或Iodo-gen(Pierce)碘化。简单来说，两份碘化珠用500μL的磷酸盐缓冲液PBS(20mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH7.5)洗两次，铅屏蔽之后置于1.5mL离心管中。向其加入100μl的PBS。在通风橱中通过使用合适的放射活性操作技术，将0.5mCi的Na¹²⁵I(17.4Ci/mg，Lot 0114，Amersham)加入含碘化珠的PBS溶液中。组分在室温下反应5分钟，之后向溶液加入2-25μg的高纯度截短的Cry蛋白并反应另外的3-5分钟。反应通过从碘化珠中移除溶液并提供于PBS中平衡的0.5ml脱盐Zeba旋转柱(In Vitrogen)来终止。碘化珠分别用10μL的PBS洗两次，洗涤液用于脱盐柱。放射性溶液通过在1000x g下离心2分钟而洗脱经过旋转柱。通过该流程，在100mM磷酸盐缓冲液(pH8)中的cry毒素首先通过多次经过小的0.5ml多粘菌素柱去除脂多糖(LPS)。向iodo-gen试管(Pierce Chem.Co.)加入20μg的无LPS Cry1Da毒素，然后0.5mCi的Na¹²⁵I。反应混合物25℃下振荡15分钟。从试管中移除溶液，加入50μl的0.2M非放射性标记的NaI以结束反应。蛋白用PBS透析并三次改变缓冲液以移除任何未结合的¹²⁵I。

碘化Cry蛋白的放射性纯度通过SDS-PAGE，感光成像和γ计数来测定。简单来说，2μl的放射性蛋白通过SDS-PAGE分离。分离之后，用BioRad凝胶干燥设备根据生产商的说明来干燥凝胶。干燥的凝胶通过将其包装在聚酯膜(12μm厚)并暴露于分子动力学储存荧光屏(35cm x 43cm)1小时以成像。用Molecular Dynamics Storm 820感光成像仪来发展平板，图像用ImageQuant^TM软件分析。用刀片从凝胶上切下放射性条带和紧邻条带上方和下方的区域，并在γ计数器中计数。放射性仅在Cry蛋白条带和条带下方区域中检测到。条带上方没有检测到放射性，表明所有放射性污染物由比截短的Cry蛋白更小的蛋白组分组成。这些组分最可能代表降解产物。

实施例2–BBMV制备方法

可溶性BBMV’s的制备和分离。末龄草地贪夜蛾/草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)，玉米螟(Ostrinia nubilalis)或玉米夜蛾(Heleothis.zea)幼虫禁食过夜然后在早上在冰上冷却15分钟后解剖。从体腔中移出中肠组织，保留在后肠之后连接在表皮上。中肠置于9X体积的冰冷的均匀化缓冲液(100mM甘露醇，5mM EGTA，17mM Tris碱，pH7.5)，补加蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich P-2714)根据供应商的说明稀释。组织均匀化玻璃组织均化器的15个冲程。BBMV’s通过Wolfersberger(1993)的MgCl₂沉淀法来制备。简单来说，相等体积的24mM MgCl₂在300mM甘露醇中的溶液与中肠匀浆混合，搅拌5分钟并在冰上保持15分钟。溶液在2500x g下4°离心15分钟。保存上清液，沉淀小块悬浮于原始体积的0.5X稀释的均匀化缓冲液并再次离心。合并两次上清液并在27000x g下4°离心30分钟以形成BBMV部分。沉淀小块悬浮于BBMV储存缓冲液(10mM HEPES，130mM KCl，10％甘油，pH7.4)使蛋白浓度为约3mg/mL。用牛血清白蛋白(BSA)作为标准使用Bradford法(1976)确定蛋白浓度。用Sigma分析根据生产商的说明进行碱性磷酸酶测试之后冷冻样品。BBMV部分中该标记酶的特异活性典型地增加7倍，相比于初始中肠均化物部分中发现的。BBMV’s分装为250μL样品，液氮中闪冻并在-80°保藏。

实施例3–检测¹²⁵I Cry蛋白结合BBMV蛋白的方法

¹²⁵I Cry蛋白与BBMV’s的结合。为了确定用于结合分析的BBMV蛋白的最佳量，制作了饱和曲线。¹²⁵I-放射性标记的Cry蛋白(0.5nM)在28°下在结合缓冲液(8mM NaHPO₄，2mMKH₂PO₄，150mM NaCl，0.1％牛血清白蛋白，pH7.4)中与0-500μg/mL范围的量的BBMV蛋白一起孵育1小时。总体积为0.5mL。结合的¹²⁵I Cry蛋白通过下述方法从未结合部分中分离：取样150μL的反应混合物并从1.5ml离心管中以三份置于500μl离心管中，室温下以14000x g离心样品6分钟。轻柔地移除上清液，沉淀小块用冰冷的结合缓冲液洗3次。切下包含沉淀小块的离心管底部，置于13x 75mm玻璃培养管中，样品在γ计数器中分别计数5分钟。样品中包含的计数减去背景计数(无任何蛋白的反应)对BBMV蛋白浓度绘图。使用的蛋白的最佳浓度被确定为0.15mg/ml的BBMV蛋白。

为了确定结合动力学，制作了饱和曲线。简单来说，BBMV’s(150μg/ml)在28℃下用浓度增加的¹²⁵I Cry毒素孵育1小时，所述浓度从0.01到10nM范围。通过以下方法确定总的结合：每种浓度分别取样150μl三份，离心样品并计数，如上所述。非特异性结合以同样的方式来检测，将1000nM的同源胰蛋白酶化的非放射性Cry毒素加入反应混合物以饱和所有非特异性受体。特异性结合以总结合与费特异性结合之间的差值来计算。

同源和异源竞争性结合分析用150μg/ml BBMV蛋白和0.5nM的¹²⁵I放射性标记的Cry蛋白来进行。加入反应混合物的竞争性的非放射性标记的Cry毒素的浓度在0.045至1000nM的范围，并于放射性配体同时加入，以确保真实的结合竞争。28°下进行孵育1小时，结合至其受体毒素的¹²⁵I-标记的Cry蛋白的量如上所述测量并减去非特异性结合。非特异性结合用1000mM的非-放射标记的Cry1Ca核心毒素蛋白存在下获得的计数来表示。在不存在任何竞争者配体下测定总共百分之百的结合。结果以百分比总共特异性结合对加入的竞争性配体的浓度以半对数点绘图。

实施例4–结果总结

图1显示了²⁵I Cry1Ab(0.5nM)与来自ECB的BBMV’s的特异性结合百分比对未标记同源Cry1Ab(◆)和异源Cry2Aa(□)的竞争。Cry1Ab同源竞争的取代曲线形成S形曲线并展现放射性配体的50％取代为约3nM的Cry1Ab。Cry2Aa在1000nM的浓度(比被取代的¹²⁵ICry1Ab大2000倍)导致少于50％的取代。误差棒代表由三份测试获得的值的范围。

参考资料

Wolfersberger，M.G.，(1993)，Preparation and Partial Characterization ofAmino Acid Transporting Brush Border Membrane Vesicles from the Larval Midgutof the Gypsy Moth(Lymantria Dispar).Arch.Insect Biochem.Physiol.24:139-147.

Liang，Y.，Patel，S.S.，and Dean，D.H.，(1995)，Irreversible BindingKinetics of Bacillus thuringiensis Cry1A Delta-Endotoxins to Gypsy Moth BrushBorder Membrane Vesicles is Directly Correlated to Toxicity.J.Biol.Chem.，270，24719-24724.

附录A

delta-内毒素的列表–来自Crickmore等网站(申请中引用)

登录号是NCBI条目(若可获得的话)

序列表

<110> 陶氏益农公司(Dow AGROSCIENCES LLC)

<120> 用于控制欧洲玉米螟的包含CRY1Ab和CYR2Aa的杀虫蛋白组合，和管理昆虫抗性的方法(COMBINED USE OF CRY1Ab AND CRY2Aa FOR MANAGEMENT OF RESISTANT INSECTS)

<130> DAS-P0200-US

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 612

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cry1Ab

<400> 1

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly

20 25 30

Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser

35 40 45

Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile

50 55 60

Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile

65 70 75 80

Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala

85 90 95

Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu

100 105 110

Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu

115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser

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610

<210> 2

<211> 633

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cry2Aa

<400> 2

Met Asn Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr Ile Cys Asp Ala Tyr

1 5 10 15

Asn Val Val Ala His Asp Pro Phe Ser Phe Glu His Lys Ser Leu Asp

20 25 30

Thr Ile Gln Lys Glu Trp Met Glu Trp Lys Arg Thr Asp His Ser Leu

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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180 185 190

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610 615 620

Val Pro Thr Asn Leu Pro Pro Leu Tyr

625 630

Claims

1.一种产生包含编码Cry1Ab杀虫蛋白的DNA和编码Cry2Aa杀虫蛋白的DNA的转基因玉米植物的方法，包括

a)产生基因转化的玉米植物细胞，所述细胞产生Cry1Ab杀虫蛋白和Cry2Aa杀虫蛋白，该玉米植物细胞被至少一个、例如两个编码所述杀虫蛋白的多核苷酸转化，使得该玉米植物细胞积累由所述至少一个多核苷酸表达的所述杀虫蛋白，且其中所述Cry1Ab杀虫蛋白与SEQ ID NO:1至少99％相同，且所述Cry2Aa杀虫蛋白与SEQ ID NO:2至少99％相同；且

b)从所述基因转化的玉米植物细胞再生能育的玉米植物。

2.权利要求1的方法，其中所述玉米植物进一步包含编码第三种杀虫蛋白的DNA，所述第三种蛋白选自Cry1Fa、Cry1Be、Cry1I和DIG-3。

3.权利要求2的方法，其中所述第三种蛋白选自Cry1Fa和Cry1Be，所述玉米植物进一步包含编码选自Cry1Ca、Cry1Da、Cry1E和Vip3Ab的第四种和第五种杀虫蛋白的DNA。

4.一种管理欧洲玉米螟昆虫对Cry蛋白形成抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生玉米植物的田地，所述玉米植物的田地包含非-Bt避难所玉米植物和多个转基因玉米植物，其中所述避难所植物占所述田地中所有玉米植物的少于40％，所述转基因玉米植物包含编码Cry1Ab杀虫蛋白的DNA和编码Cry2Aa杀虫蛋白的DNA。

5.权利要求4的方法，其中所述转基因玉米植物进一步包含编码第三种杀虫蛋白的DNA，所述第三种蛋白选自Cry1Fa、Cry1Be、Cry1I和DIG-3。

6.权利要求5的方法，其中所述转基因玉米植物进一步包含编码第四和第五种杀虫蛋白的DNA，所述第四和第五种杀虫蛋白选自Cry1Ca、Cry1Da、Cry1E和Vip3Ab。

7.权利要求4的方法，其中所述避难所玉米植物占所述田地中所有作物植物的少于30％。

8.权利要求4的方法，其中所述避难所玉米植物占所述田地中所有作物植物的少于20％。

9.权利要求4的方法，其中所述避难所种子占混合物中全部种子的少于10％。

10.权利要求4的方法，其中所述避难所种子占混合物中全部种子的少于5％。

11.权利要求4的方法，其中所述避难所玉米植物是块状或条带。

12.权利要求1-3中任意一项的方法，其中所述Cry1Ab杀虫蛋白包含SEQ ID NO:1，并且所述Cry2Aa杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2。