CN102821596B

CN102821596B - CRY1Ca和CRY1Fa蛋白在昆虫抗性管理中的组合应用

Info

Publication number: CN102821596B
Application number: CN201080064000.8A
Authority: CN
Inventors: T.米德; K.纳瓦; N.P.斯托尔; J.J.希茨; A.T.伍斯利; S.L.伯顿
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Kedihua Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2009-12-16
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2030-12-16
Also published as: EP2512222A4; CL2012001626A1; AU2010330917B2; DK2512222T3; WO2011075588A1; KR101841295B1; ES2663283T3; CA2782548A1; EP2512222A1; HUE036759T2; US9567602B2; MX2012007121A; UA111936C2; CO6602147A2; UA112156C2; SI2512222T1; IL220341A0; RS57105B1; AR079500A1; JP2013514769A

Abstract

本发明包括控制鳞翅目昆虫的方法和植物，所述植物包含Cry1Fa杀虫蛋白和Cry1Ca杀虫蛋白，其组合以延迟或防止昆虫抗性的发展。

Description

CRY1Ca和CRY1Fa蛋白在昆虫抗性管理中的组合应用

人类种植玉米(corn)以供食物和能量应用。人类还种植许多其它作物，包括大豆和棉花。昆虫食用并损害植物，并且由此削弱这些人类努力。每年花费数十亿美元来控制昆虫害虫(pest)，并且它们造成的损害损失额外的数十亿。合成的有机化学杀虫剂已经是用于控制昆虫害虫的主要工具，但是生物学杀虫剂，诸如自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)衍生的杀虫蛋白(insecticidal protein)已经在一些领域中发挥重要作用。经由用Bt杀虫蛋白基因转化生成昆虫抗性植物的能力已经使现代农业发生革命，而且提高杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。

已经使用几种Bt蛋白来创建至今已经成功登记并商业化的昆虫抗性转基因植物。这些包括玉米中的Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F和Cry3Bb、棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab、和马铃薯中的Cry3A。

除了在2种蛋白质的组合杀虫谱是期望的(例如，玉米中的Cry1Ab和Cry3Bb组合以分别提供对鳞翅目害虫和根虫的抗性)或蛋白质的独立作用使它们可用作用于延迟易感昆虫群中抗性形成的工具(例如，棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab组合以提供烟草蚜虫的抗性管理)的情况中外，表达这些蛋白质的商业产品表达单一蛋白质。

也就是说，已经导致此技术的快速且普遍采用的昆虫抗性转基因植物的一些质量(quality)还引起如下的忧虑，即害虫(pest)群体会形成对由这些植物生成的杀虫蛋白的抗性。已经提示了保留基于Bt的昆虫抗性性状的效用的几种策略，其包括与避难所(refuge)组合以及与不同毒素交替、或在不同毒素共部署中部署(deploy)高剂量的蛋白质(McGaughey等(1998),“B.t.ResistanceManagement,”Nature Biotechnol.16:144-146)。

为了在IRM叠加中使用而选定的蛋白质需要独立地施加其杀虫效果，使得对一种蛋白质形成的抗性未赋予对第二种蛋白质的抗性(即，没有对蛋白质的交叉抗性)。如果例如在对“蛋白质A”的抗性方面选定的害虫群对“蛋白质B”敏感，那么会推断没有交叉抗性，并且蛋白质A和蛋白质B的组合会有效延迟对单独的蛋白质A的抗性。

在没有抗性昆虫群的情况中，可以基于假设与作用机制和交叉抗性潜力相关的其它特征做出评估。已经提示了受体介导的结合在鉴定有可能不展现出交叉抗性的杀虫蛋白中的效用(van Mellaert等1999)。缺乏此方法中固有的交叉抗性的关键预测物(predictor)是杀虫蛋白在敏感的昆虫物种中不竞争受体。

在两种Bt毒素竞争相同受体的情况中，则若所述受体在所述昆虫中突变，使得毒素之一不再结合所述受体，并且如此针对昆虫不再是杀虫性的，则情况可能是昆虫也会对第二种毒素(其竞争性结合相同受体)有抗性。也就是说，昆虫被说成与这两种Bt毒素有交叉抗性。然而，若两种毒素结合两种不同受体，则这可以是如下的指示，即昆虫不会对那两种毒素同时有抗性。

Cry1Fa可用于控制许多鳞翅目害虫物种，包括欧洲玉米螟(European cornborer)(ECB；玉米螟(Ostrinia nubilalis)(Hübner))和秋粘虫(fall armyworm)(FAW；草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))，并且针对甘蔗螟(sugarcane borer)(SCB；小蔗螟(Diatraea saccharalis))是有活性的。Cry1Fa蛋白(如在含有事件TC1507的玉米植物中生成的)负责供FAW控制用的行业领先的昆虫抗性性状。Cry1Fa在SmartStax^TM、和WideStrike^TM产品中进一步部署。

因为可用于标记受体结合测定法中检测的蛋白质的最常见技术灭活Cry1Fa蛋白的杀虫活性，所以使用Cry1Fa蛋白进行(竞争性或同源性)受体结合研究的能力是有限的。

其它Cry毒素列于官方B.t.命名委员会的站点(Crickmore等;lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。见所附的附录A。目前有几乎60个“Cry”毒素大类(Cry1-Cry59)，及其它Cyt毒素和VIP毒素等。许多数字组各自具有大写字母亚组，而大写字母亚组具有小写字母亚-亚组。(例如，Cry1具有A-L，而Cry1A具有a-i)。

发明概述

本发明部分涉及令人惊讶的发现，即在对Cry1Fa蛋白的杀虫活性的抗性方面选择的秋粘虫(草地夜蛾；FAW)群体对Cry1Ca蛋白的杀虫活性没有抗性。凭借本公开内容的益处，如本领域技术人员会认可，表达这两种杀虫蛋白或其杀虫部分的植物会可用于延迟或阻止对单独的这些杀虫蛋白之任一种的抗性的形成。

本发明还得到如下的发现支持，即Cry1Fa和Cry1Ca彼此不竞争结合来自FAW(或来自Diatraea saccharalis(甘蔗螟；SCB))的肠受体。

本发明还部分涉及三种(或更多种)毒素的三重叠加或“金字塔(pyramid)”，其中Cry1Fa和Cry1C毒素是基础对(base pair)。一种优选的金字塔提供至少两种蛋白质，其提供针对两种害虫，即FAW和ECB(欧洲玉米螟；玉米螟)的非交叉抗性活性：Cry1Fa加Cry1Ca加一种或多种抗ECB毒素诸如Cry1Ab。在一些优选的金字塔实施方案中，选定的毒素具有针对FAW的三种不同作用模式。优选的金字塔组合是Cry1Fa加CryCa及选自下组的另一种毒素/基因：Vip3Ab、Cry1D、Cry1Be、和Cry1E。生成这三种毒素的植物(和种植有此类植物的土地面积(acreage))包括在本发明的范围内。也可以添加其它毒素/基因，但是依照本发明，这些特定的三重叠加会有利地且令人惊讶地提供针对FAW的三种作用模式。这可以帮助降低或消除避难土地面积的需要。一般地，本发明还涉及使用针对单一靶害虫彼此不竞争的三种杀虫蛋白(在一些优选的实施方案中为Cry蛋白)。

附图概述

图1：秋粘虫(FAW)和对Cry1F抗性的秋粘虫(rFAW)的初生幼虫对玉米叶片体外造成的食用伤害率。pDAS5162转化之后筛选的转基因T0植物通过抗体DIG152RPC1免疫印迹筛选分为2组：不生产DIG109的植物(图的左侧)，和具有可探测水平的DIG-109的植物(图的中间)。DIG-109阳性植物用表达水平进行排序(从左至右；最低到最高)。DSM2的HP分析在36株pDAS5162转化系上完成。简单整合事件，定义为基因的1-2拷贝，在95%的样品中检测到。来自阳性和阴性对照植物的生物分析结果显示在图的右侧。

图2：Cry1Fa核心毒素，Cry1Ca核心毒素，和125I-标记的Cry1Ca核心毒素竞争性结合Spodoptera frugiperda BBMV。

序列简述

SEQ ID NO:1Cry1Ca核心/Cry1Ab原毒素嵌合蛋白1164aa(DIG-152)(pMYC2547版本)

SEQ ID NO:2第二个Cry1Ca核心/Cry1Ab原毒素嵌合蛋白1164aa(DIG-109)(玉米版本)

SEQ ID NO:3玉米优化的编码DIG-109的CDS bp

SEQ ID NO:4是Cry1Fa核心毒素。

SEQ ID NO:5是Cry1Ca核心毒素。

发明详述

如本文中报告的，转基因玉米(和其它植物；例如棉花和大豆)中生成的CRY1Ca毒素在控制已经形成对Cry1Fa活性的抗性的秋粘虫(FAW；草地夜蛾)中是非常有效的。如此，本发明部分涉及令人惊讶的发现，即对Cry1Fa有抗性的秋粘虫对CRY1Ca易感(即，没有交叉抗性)。

本发明还部分涉及令人惊讶的发现，即CRY1Ca毒素有效保护植物(诸如玉米植物)免于Cry1Fa抗性秋粘虫的损害。关于此害虫的讨论，见例如Tabashnik,PNAS(2008),第105卷No.49,19029-19030。

本发明包括CRY1Ca毒素保护玉米和其它经济上重要的植物物种免于由秋粘虫进食(feeding)引起的损害和产量损失或对于已经形成对Cry1Fa的抗性的秋粘虫群的用途。

如此，本发明教导了阻止或减轻秋粘虫对Cry1Fa和/或CRY1Ca的抗性形成的IRM叠加。

本发明提供了用于控制鳞翅目害虫的组合物，其包含生成含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质和含有CRY1Ca核心毒素的蛋白质的细胞。

本发明进一步包含转化为生成含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质和含有CRY1Ca核心毒素的蛋白质两者的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。优选地，主题多核苷酸在遗传构建体中在(可操作连接/包含)非苏云金芽孢杆菌启动子的控制下。主题多核苷酸可以包含在植物中表达增强的密码子选择。

另外，意图本发明提供一种控制鳞翅目害虫的方法，包括使所述害虫或所述害虫的环境与有效量的组合物接触，所述组合物含有含Cry1Fa核心毒素的蛋白质，并且进一步含有含CRY1Ca核心毒素的蛋白质。

本发明的一个实施方案包括玉米植物及此类植物的种子，所述玉米植物包含编码含有CRY1Ca核心毒素的蛋白质的植物可表达基因和编码含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质的植物可表达基因。

本发明的又一个实施方案包括玉米植物(和其它植物，例如棉花和大豆)及此类植物的种子，其中已经将编码含有CRY1Ca核心毒素的蛋白质的植物可表达基因和编码含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质的植物可表达基因渐渗入所述玉米植物中。

(对于Cry1C作为植物中的潜在生物杀虫剂的综述，参见Avisar et al.(2009).Avisar D，Eilenberg H，Keller M，Reznik N，Segal M，Sneh B，Zilberstein A(2009)The Bacillus thuringiensis delta-endotoxin Cry 1C as apotential bioinsecticide in plants.Plant Science 176:315-324.)

昆虫受体。如实施例中所描述的，使用放射性标记的CRY1Ca核心毒素蛋白的竞争受体结合研究显示了Cry1Fa核心毒素蛋白不竞争FAW昆虫组织中存在的CRY1Ca结合的高亲和力结合位点。这些结果指示，Cry1Fa和CRY1Ca蛋白的组合是一种减轻FAW群中对Cry1Fa的抗性形成(及同样地，对CRY1Ca的抗性形成)的有效手段，并且会有可能提高表达这两种蛋白质的玉米植物中对此害虫的抗性的水平。

如此，部分基于上文及本文中别处描述的数据，认为可以使用CRY1Ca和Cry1Fa蛋白的共生成(叠加)来生成针对FAW的高剂量IRM叠加。可以对此组合添加其它蛋白质以扩充昆虫控制谱。例如，在玉米中，Cry1Ab的添加会创建用于控制欧洲玉米螟的IRM金字塔。

另一个部署选项会是与CryAb蛋白组合使用Cry1Fa和CRY1Ca蛋白中的一种或两种来减轻抗性的形成。如此，本发明的另一个部署选项会是CryAb蛋白由于形成抗性群体已经在控制甘蔗螟(borer)变得无效作物生长区中使用Cry1Fa和CRY1Ca蛋白中的一种或两种。因而，根据本发明所用优选的"三重叠加"或"金字塔"组合是Cry1F plus Cry1C plus Cry1Ab。

本发明还部分涉及三种(或更多种)毒素的三重叠加或“金字塔”，其中Cry1Fa和CRY1Ca毒素是基础对。一种优选的金字塔提供至少两种蛋白质，其提供针对两种害虫，即FAW和ECB(欧洲玉米螟；玉米螟)的非交叉抗性活性：Cry1Fa及CRY1Ca及一种或多种ECB毒素诸如Cry1Ab (见US 20080311096)，因为Cry1F针对这两种昆虫都有活性。其它ECB毒素包括Cry1Be(见USSN 61/284,290；2009年12月16日提交)、Cry1I(见USSN 61/284,278；2009年12月16日提交),Cry2Aa(见USSN 61/284,278；2009年12月16日提交)和DIG-3(见US 201000269223)。在一些优选的金字塔实施方案中，选定的毒素具有针对FAW的三种不同作用模式。这些优选的金字塔组合是Cry1Fa加Cry1Ca加选自下组的另一种毒素/基因：Vip3Ab、Cry1D(见USSN 61/284,252；2009年12月16日提交)、Cry1Be、和Cry1E(见USSN 61/284,278；2009年12月16日提交)。生成这三种毒素的植物(和种植有此类植物的土地面积)包括在本发明的范围内。也可以添加其它毒素/基因，但是依照本发明，这些特定的三重叠加会有利地且令人惊讶地提供针对FAW的三种作用模式。这可以帮助降低或消除避难土地面积的需要。如此，超过10英亩如此种植的田地包括在本发明内。

例如，其它Vip3毒素列于所附附录A中。也可以使用那些GENBANK号来获得本文中公开的或提及的任何基因和蛋白质的序列。

美国专利No.5,188,960和美国专利No.5,827,514描述了适用于用于实施本发明的含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质。美国专利No.6,218,188描述了编码适合于用于本发明的含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质的经植物优化的DNA序列。

可以使用本发明中描述的毒素组合来控制鳞翅目害虫。成年鳞翅目，例如蝴蝶和蛾主要以花蜜为食，并且是传粉的重要实现物(effector)。几乎所有鳞翅目幼虫，即毛虫以植物为食，并且许多是严重的害虫。毛虫在叶上或内部进食或者以植物的根或茎为食，对植物剥夺营养物，而且经常破坏植物的物理支持结构。另外，毛虫以果实、织物、和贮存的谷物和面粉为食，毁坏出售的这些产品或者严重降低其价值。如本文中所使用的，提及鳞翅目害虫指害虫的各个生命阶段，包括幼虫阶段。

本发明的一些嵌合毒素包括Bt毒素的完整N端核心毒素部分，并且在超出核心毒素部分末端的某个点处，蛋白质具有向异源原毒素(protoxin)序列的过渡。Bt毒素的N端杀虫活性的毒素部分称为“核心”毒素。自核心毒素区段至异源原毒素区段的过渡可以大致在毒素/原毒素连接处发生或者，在备选中，可以保留天然原毒素的部分(超出核心毒素部分延伸)，其中在下游发生向异源原毒素部分的过渡。

举例而言，本发明的一个嵌合毒素是Cry1Fa的完整核心毒素部分(氨基酸1至601)和异源原毒素(C端的氨基酸602)。在一个优选的实施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自Cry1Ab蛋白毒素。作为第二个实施例，本发明的第二嵌合毒素（如SEQ ID NO:1所公开）具有CRY1Ca的完整核心毒素部分(氨基酸1至619)和异源原毒素(C端的氨基酸620)。在一个优选的实施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自Cry1Ab蛋白毒素。

本领域技术人员会领会，Bt毒素(即使在某个种类诸如Cry1F内)在长度和核心毒素部分向原毒素部分过渡的精确位置上会以一定程度有所变化。通常，CRY1Ca和Cry1Fa毒素的长度是约1150至约1200个氨基酸。自核心毒素部分至原毒素部分的过渡通常会在全长毒素的约50%-约60%发生。本发明的嵌合毒素会包括整段(full expanse)的此N端核心毒素部分。如此，嵌合毒素会包含Cry1Fa Bt毒素蛋白的全长的至少约50%或CRY1Ca Bt毒素蛋白的全长的至少约50%。这通常会是至少约590个氨基酸。关于原毒素部分，整段的Cry1Ab原毒素部分自核心毒素部分末端延伸至分子的C端。

基因和毒素。依照本发明有用的基因和毒素不仅包括公开的全长序列，而且还包括保留本文中明确例示的毒素的特征性杀虫(pesticidal)活性的这些序列、变体、突变体、和融合蛋白的片段。如本文中所使用的，术语基因的“变体”或“变异”指编码相同毒素或编码具有杀虫活性的等同毒素的核苷酸序列。如本文中所使用的，术语“等同毒素”指与要求保护的毒素具有相同或基本上相同的针对靶害虫的生物学活性的毒素。

如本文中所使用的，按照“Revision of the Nomenclature for the Bacillusthuringiensis Pesticidal Crystal Proteins,”N.Crickmore,D.R.Zeigler,J.Feitelson,E.Schnepf，J.Van Rie,D.Lereclus,J.Baum和D.H.Dean.Microbiology and Molecular Biology Reviews(1998)第62卷:807-813，边界代表约95%(Cry1Fa和1Da)、78%(Cry1F和Cry1C)、和45%(Cry1)序列同一性。这些截留也可以仅仅应用于核心毒素(对于Cry1F和Cry1C毒素)。

对于本领域技术人员应当显而易见的是，可以经由几种手段鉴定并获得编码活性毒素的基因。可以自保藏于培养物保藏所的分离物获得本文中例示的特定基因或基因部分。也可以例如通过使用基因合成仪以合成方式构建这些基因或其部分或变体。可以使用用于生成点突变的标准技术来容易地构建基因的变异。还有，可以使用商品化的外切核酸酶或内切核酸酶依照标准的规程来生成这些基因的片段。例如，可以使用酶诸如Bal31或定点诱变自这些基因的末端系统性剪断核苷酸。也可以使用多种限制酶来获得编码活性片段的基因。可以使用蛋白酶来直接获得这些蛋白质毒素的活性片段。

保留例示的毒素的杀虫活性的片段和等同物会在本发明的范围内。还有，由于遗传密码的冗余，多种不同DNA序列可以编码本文中公开的氨基酸序列。完全在本领域技术人员的技术内的是创建编码相同的，或基本上相同的毒素的这些备选DNA序列。这些变体DNA序列在本发明的范围内。如本文中所使用的，提及“基本上相同的”序列指具有没有实质性影响杀虫活性的氨基酸取代、缺失、添加、或插入的序列。编码保留杀虫活性的蛋白质的基因的片段也包括在此定义中。

用于鉴定依照本发明有用的编码毒素的基因和基因部分的又一种方法是经由使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列凭借合适的标记物可以是可检出的或者可以以固有荧光生成，如记载于国际申请No.WO93/16094的。如本领域中公知的，若探针分子和核酸样品通过形成两种分子间强烈的键来杂交，则可以合理地假设探针和样品具有实质的同源性。优选地，通过本领域中公知的技术在严格条件下进行杂交，如记载于例如Keller,G.H.,M.M.Manak(1987)DNA Probes,Stockton Press,New York,N.Y.,第169-170页的。盐浓度和温度组合的一些例子如下(以严格性升高的次序)：2X SSPE或SSC于室温；1X SSPE或SSC于42°C；0.1X SSPE或SSC于42°C；0.1X SSPE或SSC于65°C。探针的检测提供了一种用于以已知的方式测定杂交是否已经发生的手段。此类探针分析提供一种用于鉴定本发明的毒素编码基因的快速方法。可以使用DNA合成仪和标准的规程来合成依照本发明作为探针使用的核苷酸区段。也可以使用这些核苷酸序列作为PCR引物以扩增本发明的基因。

变体毒素。已经在本文中明确例示本发明的某些毒素。因为这些毒素仅是本发明的毒素例示性的，所以应当容易显而易见的是，本发明包括具有例示毒素的相同或相似杀虫活性的变体或等同毒素(和编码等同毒素的核苷酸序列)。等同毒素与例示的毒素会具有氨基酸同源性。此氨基酸同源性通常会大于75%，优选大于90%，且最优选大于95%。氨基酸同源性在毒素中负责生物学活性或者牵涉决定最终负责生物学活性的三维构型的至关重要的区域中会是最高的。在这点上，某些氨基酸取代是可接受的，并且若这些取代在对于活性不是至关重要的区域中或者是不影响分子的三维构型的保守氨基酸取代，则可以是预期的。例如，氨基酸可以放入以下种类：非极性、不带电荷的极性、碱性、和酸性。其中的一类氨基酸用相同类型的另一种氨基酸替换的保守取代落入本发明的范围内，只要取代不实质性改变化合物的生物学活性。表1提供属于每类的氨基酸的例子的列表。

表1

氨基酸的种类	氨基酸的例子
		非极性	Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Met,Phe,Trp
不带电荷的极性	Gly,Ser,Thr,Cys,Tyr,Asn,Gln
		酸性	Asp,Glu
碱性	Lys,Arg,His

在一些情况中，也可以进行非保守取代。至关重要的因素是这些取代必须不显著降低毒素的生物学活性。

重组宿主。可以将编码本发明的毒素的基因导入极其多种微生物或植物宿主中。毒素基因的表达直接或间接导致杀虫剂(pesticide)的胞内生成和维持。可以使用接合转移和重组转移来创建表达本发明的两种毒素的Bt菌株。也可以用一种或两种毒素基因转化其它宿主生物体，所述毒素基因然后用于实现协同效应。凭借合适的微生物宿主，例如假单胞菌属(Pseudomonas)，可以将微生物应用于害虫的位置，在那里它们会增殖并被摄取。结果是对害虫的控制。或者，可以在延长毒素的活性并且稳定细胞的条件下处理为毒素基因做宿主的微生物。然后，可以将经处理的细胞(其保留毒性活性)应用于靶害虫的环境。

在经由合适的载体将Bt毒素基因导入微生物宿主中，且将所述宿主应用于生活状态的环境的情况中，使用某些宿主微生物是必要的。选择如下的微生物宿主，已知所述微生物宿主占据一种或多种感兴趣作物的“植物圈”(叶面(phylloplane)、叶圈、根际、和/或根面)。这些微生物选择为使得能够在特定环境(作物和其它昆虫生境)中与野生型微生物成功竞争，提供表达多肽杀虫剂的基因的稳定维持和表达，且期望地，提供改善的保护杀虫剂免于环境降解和灭活。

已知大量微生物驻留于极其多种重要的作物的叶面(植物叶的表面)和/或根际(植物根周围的土壤)。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物，诸如细菌，例如假单胞菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilius)、土壤杆菌属(Agrobactenum)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳酸菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)、和产碱菌属(Alcaligenes)；真菌，特别是酵母，例如属酵母菌属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cyptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、和短梗霉属(Aureobasidium)。特别感兴趣的是植物圈细菌物种，诸如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、根癌土壤杆菌(Agrobacteniumtumefaciens)、类球红细胞(Rhodopseudomonas spheroids)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱菌(Alcaligenesentrophus)、和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandii)；和植物圈真菌物种，诸如深红类酵母菌(Rhodotorula rubra)、胶红类酵母菌(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母菌(R.aurantiaca)、白色隐球菌(Cryptococcus albidus)、液化隐球菌(C.diffluens)、劳伦梯氏隐球菌(C.laurentii)、罗氏酵母(Saccharomyces rosei)、S.pretoriensis、酿酒酵母(S.cerevisiae)、玫红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)、和出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpollulans)。特别感兴趣的是色素性微生物。

极其多种方法可用于在容许基因的稳定维持和表达的条件下将编码毒素的Bt基因导入微生物宿主中。这些方法是本领域技术人员公知的，并且记载于例如美国专利No.5135867，通过提及而将其收入本文。

细胞的处理。可以处理表达Bt毒素的苏云金芽孢杆菌或重组细胞以延长毒素活性并稳定细胞。形成的杀虫剂微囊体包含在已经稳定化的细胞结构内的一种或多种Bt毒素，并且在将微囊体应用于靶害虫的环境时会保护毒素。合适的宿主细胞可以包括原核生物或真核生物，通常不限于那些不生成对于高等生物体，诸如哺乳动物有毒性的物质的细胞。然而，可以使用生成对于高等生物体有毒性的物质的生物体，其中毒性物质是不稳定的或应用水平充分降低，从而避免对哺乳动物宿主的毒性的任何可能性。作为宿主，特别感兴趣的会是原核生物和低等真核生物，诸如真菌。

细胞通常会是完整的，并且在处理时基本上为增殖形式，而不是为孢子形式，尽管在一些情况中可以采用孢子。

可以通过化学或物理手段，或者通过化学和/或物理手段的组合来处理微生物细胞，例如含有一种或多种B.t.毒素基因的微生物，只要所述技术没有不利地影响毒素的特性，也不降低保护毒性的细胞性能。化学试剂的例子是卤化剂，特别是原子数17-80的卤素。更特别地，可以将碘在温和(mild)条件下且持续足够的时间使用，使得实现期望的结果。其它合适的技术包括用醛，诸如戊二醛；抗感染药，诸如氯化苄烷铵(zephiran chloride)和西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)；醇，诸如异丙基和乙醇；各种组织固定剂，诸如Lugol碘、Bouin氏固定剂、各种酸和Helly氏固定剂(见：Humason,Gretchen L.,Animal Tissue Techniques,W.H.Freeman and Company,1967)；或在对宿主环境施用细胞时保留并延长细胞中生成的毒素的活性的物理(热)和化学剂的组合处理。物理手段的例子是短波长辐射，诸如gamma-辐射和X-辐射、冷冻、UV照射、冻干等。用于处理微生物细胞的方法披露于美国专利No.4,695,455和4,695,462，通过提及而将其收入本文。

细胞一般会具有增强的结构稳定性，这会增强对环境条件的抗性。在杀虫剂为原型(proform)的情况中，细胞处理的方法应当选择为使得不抑制靶害虫病原体将原型加工成杀虫剂的成熟形式。例如，甲醛会交联蛋白质，而且可以抑制对多肽杀虫剂的原型的加工。处理方法应当至少保留毒素的生物利用度或生物活性的实质性部分。

出于生成目的选择宿主细胞中特别感兴趣的特征包括容易将一种或多种B.t.基因导入宿主中、表达系统的利用度、表达效率、杀虫剂在宿主中的稳定性、和辅助遗传性能的存在。作为杀虫剂微囊体使用的感兴趣特征包括杀虫剂的保护质量，诸如厚的细胞壁、色素沉着、和包含体的胞内包装或形成；在水性环境中存活；缺乏哺乳动物毒性；对摄食的害虫的吸引力；在不损害毒素的情况中容易杀死和固定；等等。其它考虑因素包括容易配制和处理、经济、贮存稳定性，等等。

细胞生长。可以将含有一种或多种B.t.杀虫基因的细胞宿主在任何便利的营养培养基中培养，其中DNA构建体提供选择优势，提供选择培养基，使得基本上所有或所有细胞保留B.t.基因。然后，可以依照常规的方式收获这些细胞。或者，可以在收获前处理细胞。

可以使用标准技术培养基和发酵技术来培养生成本发明的毒素的B.t.细胞。在完成发酵周期后，可以如下收获细菌，即首先通过本领域中公知的手段自发酵培养基分离B.t.孢子和晶体。可以通过添加表面活性剂、分散剂、惰性载体和其它组分将回收的B.t.孢子和晶体配制成可湿的粉末、液体浓缩物、颗粒剂或其它配制剂以便于针对特定的靶害虫的处理和应用。这些配制剂和应用规程是本领域中公知的。

配制剂(formulation)。可以将含有引诱剂和B.t.隔离群、或包含自本文中公开的B.t.隔离群可获得的基因的重组微生物的孢子、晶体、和毒素的配制的诱饵颗粒剂应用于土壤。也可以将配制的产物以种子涂层材料或根处理或总体植物处理在作物周期的后期阶段应用。B.t.细胞的植物和土壤处理可以以可湿的粉末、颗粒或粉尘采用，其通过混合各种惰性材料，诸如无机矿物质(叶硅酸盐(phyllosilicate)、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物材料(粉状玉米穗轴、稻壳、胡桃壳等)来实现。配制剂可以包含展着剂-粘着剂(spreader-sticker)佐剂、稳定剂、其它杀虫添加剂、或表面活性剂。液体配制剂可以是基于水性的或非水性的，并且以泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化的浓缩物等采用。成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂、或聚合物。

如本领域技术人员会领会的，杀虫浓度会随特定配制剂的性质，特别是它是浓缩物还是要直接使用而广泛变化。杀虫剂会以至少1%(按重量计)存在，并且可以是100%(按重量计)。干配制剂会具有约1-95%(按重量计)的杀虫剂，而液体配制剂一般会是液相中约1-60%(按重量计)的固体。配制剂一般会具有约10²至约10⁴个细胞/mg。这些配制剂会以每公顷约50mg(液体或干的)至1kg或更多施用。

可以通过喷雾、喷粉、喷洒等将配制剂应用于鳞翅目害虫的环境，例如叶或土壤。

植物转化。一种用于生成本发明的杀虫蛋白的优选的重组宿主是经转化的植物。可以使用本领域中公知的多种技术来将如本文中所公开的编码Bt毒素蛋白的基因插入植物细胞中。例如，包含大肠杆菌(Escherichia coli)中的复制系统和容许选择经转化的细胞的标志物的大量克隆载体可用于准备好将外来基因插入高等植物中。例如，载体包括pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184，等等。因而，可以将具有编码Bt毒素蛋白的序列的DNA片段在合适的限制性位点插入载体中。可以使用所得的质粒对大肠杆菌转化将大肠杆菌细胞在合适的营养培养基中培养，然后收获并裂解。将质粒回收。序列分析、限制性分析、电泳、和其它生物化学-分子生物学方法一般作为分析方法实施。在每次操作后，可以将使用的DNA序列切割，并与下一DNA序列连接。可以在同一或其它质粒中克隆每个质粒序列。根据将期望的基因插入植物中的方法，其它DNA序列可以是必要的。如果例如使用Ti或Ri质粒转化植物细胞，那么至少Ti或Ri质粒T-DNA的右侧边界，但是经常是右侧和左侧边界必须作为要插入的基因的侧翼区连接。T-DNA转化植物细胞的用途已经透彻研究，并且充分记载于EP 120516,Lee和Gelvin(2008),Hoekema(1985),Fraley等,(1986),及An等,(1985)，而且是本领域中完善建立的。

一旦将插入的DNA在植物基因组中整合，它便是相对稳定的。转化载体通常含有选择标志，其对经转化的植物细胞赋予对抗微生物剂或抗生素诸如Bialaphos、卡那霉素、G418、博来霉素、或潮霉素等的抗性。因而，个别采用的标志物应当容许选择经转化的细胞，而不是不含插入的DNA的细胞。

大量技术可用于将DNA插入植物宿主细胞中。那些技术包括使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂用T-DNA的转化、融合、注射、生物射弹(微粒轰击)、或电穿孔以及其它可能的方法。若使用土壤杆菌进行转化，则必须将要插入的DNA克隆入特殊的质粒中，即克隆入中间载体中或克隆入二元载体中。可以通过由于与T-DNA中的序列同源的序列所致的同源重组将中间载体整合入Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒还包含转移T-DNA必需的vir区。中间载体不能在土壤杆菌中自身复制。可以依靠辅助质粒将中间载体转移入根癌土壤杆菌中(接合)。二元载体在大肠杆菌和土壤杆菌中都能自身复制。它们包含选择标志基因和接头或多接头，其以右侧和左侧T-DNA边界区为框。可以将它们直接转化入土壤杆菌中(Holsters等,1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌包含携带vir区的质粒。vir区是将T-DNA转移入植物细胞中必需的。可以含有别的T-DNA。使用如此转化的细菌来转化植物细胞。有利地，可以将植物外植体与根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌一起培养以将DNA转移入植物细胞中。然后，可以在可含有供选择用的抗生素或抗微生物剂的选择培养基中自感染的植物材料(例如，叶块、柄(stalk)段、根，而且还有原生质体或悬浮培养的细胞)再生全植物。然后，可以对如此获得的植物测试插入的DNA的存在。在注射和电穿孔的情况中质粒没有特殊需要。有可能使用普通的质粒，诸如例如pUC衍生物。

经转化的细胞以常见的方式在植物内部生长。它们可以形成生殖细胞，并且将转化的性状传递给后代植物。可以将此类植物以正常的方式培养，并且与具有相同转化遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。所得的杂种个体具有相应的表型特性。

在本发明的一个优选的实施方案中，会用基因转化植物，其中已经对植物优化密码子选择。见例如美国专利No.5380831，在此通过提及而将其收录。虽然在本文中例示了一些截短的毒素，但是Bt领域中公知的是，130kDa型(全长)毒素具有作为核心毒素的N端半部分和作为原毒素“尾部”的C端半部分。如此，合适的“尾部”可以与本发明的截短的/核心毒素一起使用。见例如美国专利No.6218188和美国专利No.6673990。另外，用于创建用于植物的合成Bt基因的方法是本领域中已知的(Stewart和Burgin,2007)。优选的转化植物的一个非限制性例子是能育的玉米植物，其包含编码Cry1Fa蛋白的植物可表达基因，而且进一步包含编码CRY1Ca蛋白的第二植物可表达基因。

可以通过轮回选择育种，例如通过回交来实现Cry1Fa-和CRY1Ca-决定性状对近交玉米系的转移(或渐渗入。在此情况中，首先将期望的轮回亲本与携带适合于Cry1F-和CRY1C-决定性状的基因的供体近交物(非轮回亲本)杂交。然后，将此杂交的后代与轮回亲本回交(mate back)，接着在所得的后代中选择要自非轮回亲本转移的期望的性状。在与轮回亲本回交及选择期望的性状的3个，优选地4个，更优选地5个或更多个世代后，后代在控制所转移的性状的基因座方面会是杂合的，但是在大多数或几乎所有其它基因方面会与轮回亲本一样(见例如Poehlman和Sleper(1995)Breeding Field Crops,第4版,172-175;Fehr(1987)Principles of Cultivar Development,第1卷:Theoryand Technique,360-376)。

昆虫抗性管理(IRM)策略。例如，Roush等概述了2毒素策略，又称作“金字塔化(pyramiding)”或“叠加”，用于管理杀虫转基因作物。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353,1777-1786)。

在其网站上，美国环境保护局(epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)公布了提供与生成针对靶害虫有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的非转基因(即，非B.t.)避难所(非Bt作物/玉米的部分或区组(block))的下列要求。

“玉米螟防护的Bt(Cry1Ab或Cry1F)玉米产品的特定结构化需要如下：

结构化避难所：玉米带中20%非鳞翅目Bt玉米避难所；

棉花带中50%非鳞翅目Bt避难所

区组

内部(即，在Bt田内)

外部(即，在1/2英里(若可能的话，1/4英里)Bt田内的不同田地以使

随机杂交最大化)

田间条(Strip)

条必须宽至少4行(优选地6行)以降低幼虫运动的效果”

另外，国家玉米种植者协会(National Corn Growers Association)，在其网站上：

(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)

还提供关于避难所需要的类似指导。例如：

“玉米螟IRM的要求：

-以避难杂种种植至少20%的玉米地

-在棉花生产区中，避难所必须是50%

-必须在1/2英里的避难杂种内种植

-避难所可以在Bt田内以条种植；避难条必须宽至少4行

-只有当对靶昆虫达到经济阈值时，可以用常规的杀虫剂处理避难所

-基于Bt的可喷射的杀虫剂不能对避难玉米使用

-必须在有Bt玉米的每个农场种植合适的避难所”

如由Roush等(例如第1780和1784右栏)所述，各自针对靶害虫有效的且具有很少或没有交叉抗性的两种不同蛋白质的叠加或金字塔化可以容许使用更小的避难所。Roush提示，对于成功的叠加，小于10%避难所的避难所大小可以提供与单一(非金字塔化)性状的约50%避难所相当的抗性管理。对于目前可用的金字塔化Bt玉米产品，美国环境保护局要求比对于单一性状产品(一般为20%)显著更少(一般为5%)的非Bt玉米的结构化避难所。

存在有提供避难所的IRM效果的多种方式，包括田间的各种几何种植样式(如上文所提及的)和袋中种子混合物，如由Roush等(见上文)及美国专利No.6,551,962进一步讨论的。

可以对主题双重或三重叠加或金字塔使用上述百分比、或类似的避难所比率。对于具有针对单一靶害虫的三种作用模式的三重叠加，目的会是0避难所(或例如小于5%避难所)。这特别适用于商业面积-例如超过10英亩的。

本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和出版物通过提及以它们与本说明书的明确教导不矛盾的程度完整收录。

以下是例示用于实施本发明的规程的实施例。这些实施例不应解释为限制性的。除非另有记录，所有百分比是按重量计，而所有溶剂混合物比例是按体积计。所有温度以摄氏度计。

如本文中所使用的，除非明确指示或暗示，术语“一个”、“一种”、和“该/所述”表示“至少一个/种”。

实施例1

设计嵌合的CrylCa核心毒素与CrylAb原毒素

嵌合毒素。用一个Cry毒素的核心毒素结构域与另一个Cry毒素的原毒素片段融合的嵌合蛋白质在之前已经被报道，例如US专利No.5593881和US专利No.5932209。一个Cry1Ca3δ外毒素蛋白序列存放在GenBank登记号AAA22343，在一个叫CryIC(b)的旧名称下。

本发明的Cyr1Ca嵌合蛋白变体包括这样的嵌合毒素，其包含源自Cry1Ca3杀虫毒素的N-端核心毒素片段与异源δ外毒素原毒素片段在所述核心毒素片段的末端之后几个点后的位置融合。从核心毒素向异源原毒素片段的转变可以发生在大约自身的核心毒素/原毒素连接或者，可选地，自身原毒素的部分(延伸过核心毒素片段)可以被保留，而向异源原毒素的转变发生在下游。在变体类型中，核心毒素和原毒素片段可以精确地包含其来源的自身毒素的氨基酸序列，或者可以包括氨基酸添加，删除，或取代，其不会减少，或者可能增强所述片段的生物学功能，当其与另一个融合的时候。

例如，本发明的嵌合蛋白包含源自Cry1Ca3的核心毒素片段和异源原毒素。在本发明的一个优选实施方式里，源自Cry1Ca3的核心毒素片段(619个氨基酸)与包含源自Cry1Ab δ-外毒素(545个氨基酸)的原毒素片段的异源片段融合。这个嵌合蛋白的1164氨基酸序列，本文称为DIG-152，在SEQ ID NO:1中公开。本发明的第二优选的实施方式包含这样的嵌合蛋白，其中Cry1Ca核心毒素片段(619个氨基酸)结合于源自Cry1Ab的第二个545氨基酸的原毒素片段。这第二个嵌合蛋白的1164氨基酸序列，本文称为DIG-109，在SEQ IDNO:2中公开(玉米优化的版本)。应当理解包含Cry1Ca核心毒素变体和源自Cry1Ab的原毒素的其它嵌合融合体也在本发明的范围之内。

注意DIG-152和DIG-109嵌合蛋白相互之间基本上是功能等同物，序列上的不同仅在于一个位置(氨基酸620，其将Cry1Ca核心毒素片段连接至Cry1Ab原毒素片段)。

实施例2

构建编码嵌合Cry1Ca核心/Cry1Ab原毒素蛋白的表达质粒并在假单胞菌中表达

标准克隆技术[例如描述于Sambrook et al.，(1989)和Ausubel et al.，(1995)，及其更新]被用于构建荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens，Pf)表达构建体pMYC2547，该构建体加工为生产全长DIG-152嵌合蛋白(以SEQ IDNO:1公开)。在荧光假单胞菌菌株MB214(菌株MB101的衍生株；荧光假单胞菌生物变型I)中进行，该菌株具有插入的修改的lac操纵子，如US专利No.5169760中所公开。基本克隆策略包括将编码DIG-152的DNA片段亚克隆进质粒载体，其中其置于来自pKK223-3质粒(PL Pharmacia，Milwaukee，WI)的Ptac启动子和rrnBT1T1终止子的控制之下。一个这样的质粒被命名为pMYC2547，而筛选的具有该质粒的MB214被命名为Dpf108。

摇瓶中的生长和表达分析用于表征和昆虫生物分析的DIG-152的生产通过摇瓶生长的荧光假单胞菌菌株Dpf108来完成。Ptac启动子驱动的DIG-152蛋白的生产如先前的US专利No.5527883描述的那样来操作。微生物学操作的细节参见Squires et al.，(2004)，US专利申请20060008877，US专利申请20080193974，和US专利申请20080058262，并入本文作为参考。摇瓶30℃起始培养24小时后通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导表达。培养物在诱导时和诱导后不同的时间取样。通过在600nm的光密度(OD600)来测量细胞密度。

摇瓶样品的细胞分离和SDS-PAGE分析在每个取样时间，样品的细胞密度调节至OD₆₀₀=20，1mL的部分在14000x g下离心5分钟。细胞小块在-80°下冷冻。使用EasyLyse^TM细菌蛋白提取溶液(生物技术，Madison，WI)来产生来自冷冻的摇瓶细胞小块样品的可溶和不溶部分。每个细胞小块重悬于EasyLyse^TM溶液并在溶菌缓冲液中进一步以1:4稀释，并在室温下振荡孵育30分钟。溶菌液在14000rpm下4°离心20分钟，回收上清液作为可溶部分。沉淀(不溶部分)然后重悬于等体积的磷酸缓冲盐溶液(PBS；11.9mM Na₂HPO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.4)。

样品与包含β-巯基乙醇的2X Laemmli样品缓冲液(Sambrook et al.，supra.)以1:1混合并煮沸5分钟之后上样于Criterion XT Bis-Tris 12%凝胶(Bio-RadInc.，Hercules，CA)。在推荐的XT MOPS缓冲液中进行电泳。凝胶用Bio-SafeCoomassie Stain根据生产商(Bio-Rad)的步骤来染色并用Alpha Innotech成像系统(San Leandro，CA)照相。

包涵体制备。DIG-152蛋白包涵体(IB)的制备在生产可溶性Bt杀虫蛋白的荧光假单胞菌发酵的细胞上进行，并通过SDS-PAGE和MALDI-MS(基质辅助激光解吸/电离质谱)来验证。荧光假单胞菌发酵菌体在37°水浴中解冻。细胞以25%w/v重悬于溶菌缓冲液[50mM Tris，pH 7.5，200mM NaCl，20mMEDTA二钠盐(乙二胺四乙酸)，1%Triton X-100，和5mM二硫苏糖醇(DTT)；5mL/L的细菌蛋白酶抑制剂混合物(编号#P8465；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在使用前加入]。细胞用手持式均化器在最低设置下悬浮(Tissue Tearor，BioSpec Products，Inc.，Bartlesville，OK)。溶菌酶(25mg的Sigma L7651，来自鸡蛋白)通过金属勺加入细胞悬浮液，悬浮液在室温下孵育1小时。悬浮液在冰上冷却15分钟，然后用Branson Sonifier 250(两次1-分钟过程，在50%负载循环，30%输出下)超声破碎。细胞溶菌液用显微镜检查。如果需要的话加入额外的25mg溶菌酶，重复孵育和超声破碎过程。通过显微镜确认细胞溶菌之后，溶菌液在11500x g下离心14分钟(4°)以形成IB小块，弃去上清液。IB小块用100mL溶菌缓冲液重悬，用手持式混合器均匀化并离心如前所述。IB小块重复用重悬液洗涤(在50mL溶菌缓冲液中)，均匀化，超声，然后离心直到上清液变得无色而IB小块变得稳定并发白的颜色。最后的洗涤后，IB小块重悬于包含2mM EDTA的无菌过滤(0.22μm)的蒸馏水，并离心。最后的小块重悬于包含2mM EDTA的无菌过滤的蒸馏水，并以1mL的分量在-80°下储存。

IB制备中蛋白质的SDS-PAGE分析与定量通过解冻1mL分量的IB小块并用无菌过滤的蒸馏水以1:20稀释来进行。稀释的样品随后用4X还原样品缓冲液[250mM Tris，pH6.8，40%甘油(v/v)，0.4%溴酚蓝(w/v)，8%SDS(w/v)和8%β-巯基乙醇(v/v)]煮沸并上样于4-20%Tris-甘氨酸，12+2孔凝胶(Invitrogen)用1X Tris/甘氨酸/SDS(BioRad)跑胶。在200伏特下跑胶60分钟然后用考马斯蓝(50%G-250/50%R-250在45%甲醇，10%乙酸中)染色，然后用7%乙酸，5%甲醇的蒸馏水溶液脱色。目标条带的定量通过对比该条带与在同样的凝胶上跑的牛血清白蛋白(BSA)标准条带的密度值以产生标准曲线。

包涵体的溶解。6mL来自Pf克隆DPf108的DIG-152包涵体悬浮物在Eppendorf model 5415C微离心的最高速设置(约14000x g)下离心以使包涵体成小块。移除储存缓冲液上清液并用25mL的pH11的100mM碳酸钠缓冲液代替，在50mL锥形管中。包涵体用移液管重悬并涡旋以充分混合。试管置于轻柔摇晃的平台上在4°下过夜以萃取目标蛋白。萃取物在30000x g下4°离心30分钟，获得的上清液用Amicon Ultra-15再生纤维素离心过滤设备(30,000分子量切断；微孔)浓缩5倍。样品缓冲液然后改变为10mM CAPS[3-(环己胺)1-丙磺酸]pH 10用可置换的PD-10柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)。

包涵体蛋白的溶解和胰蛋白酶活化。在某些实例中，来自Pf克隆DPf108的DIG-152包涵体悬浮液在Eppendorf model 5415C微离心的最高速设置(约14000x g)下离心以使包涵体成小块。移除储存缓冲液上清液并用pH11的100mM CAPS代替以提供蛋白质浓度为约50mg/mL。试管在室温下摇动3小时以充分溶解蛋白质。胰蛋白酶以等于5%-10%(w:w，基于IB粉末的初始重量)的量加入并通过孵育同时摇动在4°下过夜或在室温下摇动90-120分钟来完成消化。通过10000x g下离心15分钟来移除不溶物质，上清液用于MonoQ离子交换柱(10mm乘10cm)。活化的DIG-152蛋白用0%至100%的1M NaCl梯度经25个柱体积来洗脱。合并包含活化蛋白的部分，并且需要的话，用如前所述的Amicon Ultra-15重生纤维素离心过滤设备浓缩至少于10mL。材料然后通过Superdex 200柱(16mm乘60cm)，所用缓冲液包含100mM NaCl.10%甘油，0.5%Tween-20和1mM EDTA。通过SDS-PAGE分析确定了活化的(酶截短的)蛋白洗脱液为65-70mL。合并包含活化蛋白的部分并用上文所述的离心浓缩器浓缩。

凝胶电泳。浓缩的蛋白制备物通过用LDS样品缓冲液(Invitrogen)以1:50稀释后用于电泳，所述缓冲液含5mM DTT作为还原试剂并加热至95°4分钟。样品上样于4-12%凝胶的双倍泳道上，旁边是5个BSA标准，从0.2μg至2μg/泳道的范围(用于制作标准曲线)。提供200V的电压并用MOPS SDS跑胶缓冲液(Invitrogen)直到示踪染料到达凝胶底部。凝胶用0.2%考马斯蓝G-250的45%甲醇和10%乙酸的溶液染色，并脱色，第一次简单地用45%甲醇，10%乙酸，然后长时间用7%乙酸，5%甲醇直到背景被清除。脱色之后，凝胶用BioRad Fluor-S MultiImager扫描。该仪器的QuantityOne Software v.4.5.2用于获得染色蛋白条带的去背景的体积并产生BSA标准曲线，其用于计算储存的溶液中嵌合DIG-152蛋白的浓度。

实施例3

荧光假单胞菌中生产的DIG-152的杀虫活性

DIG-152蛋白的杀虫活性在秋粘虫(FAW，Spodoptera frugiperda(J.E.Smith))幼虫和Cry1F-抗性FAW(rFAW)的幼虫上验证。

样品制备与生物分析。包涵体制备物(自身全长蛋白或胰蛋白酶活化的蛋白)通过交换方法例如透析或PD-10柱转入10mM CAPS pH10缓冲液中。然后样品适当地稀释于10mM CAPS pH10中，所有的生物分析包含一个该缓冲液组成的对照处理，其作为死亡率或生长抑制的背景对照。

生物分析缓冲液的蛋白浓度通过凝胶电泳用BSA制作对凝胶密度的标准曲线来评估，用上文所述的BioRad成像系统来测量。凝胶基体中的蛋白质用基于考马斯蓝的染料染色并在读取前脱色。

纯化的蛋白在生物测量中测试杀虫活性，通过初生鳞翅目幼虫在人工昆虫食物上进行。FAW的幼虫由商业昆虫饲养所(Benzon Research Inc.，Carlisle，PA)保持的克隆得到的卵所孵化。rFAW的幼虫由个人拥有的克隆(DowAgroSciences，Indianapolis，IN)收获的卵所孵化。

生物分析在特别设计为昆虫生物分析的128孔塑料盘(C-D International，Pitman，NJ)上进行。每个孔含1.0mL的多物种鳞翅目食物(SouthlandProducts，Lake Village，AR)。40μL分量的蛋白样品用移液器递送至每孔的1.5cm²食物表面(即，26.7μL/cm²)。食物浓度计算为孔中每平方厘米表面面积的DIG-152蛋白的量(ng)。处理过的盘保持在通风橱中直到食物表面的液体蒸发或被吸收进入食物。

羽化数小时之后，用湿润的驼毛刷捡起单个的幼虫并叠加放在处理过的食物上，每孔一只幼虫。侵染的孔用干净塑料的粘性薄膜密封，并开通风口以允许气体交换(C-D International)。生物分析盘保持在控制的环境条件下[28°，约40%相对湿度(RH)，16小时:8小时(光：暗)]保持5天，到时间后所有昆虫暴露于每种蛋白样品，记录死亡昆虫数量，和存活昆虫的重量。计算每个处理的百分比死亡率和百分比生长抑制。百分比生长抑制(GI)用下式计算：

%GI=[1–(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]x 100

其中TWIT是该处理中昆虫总重量(Total Weight of Insects in theTreatment)；

TNIT是该处理中昆虫总数(Total Number of Insects in the Treatment)；

TWIBC是背景检测(缓冲液对照)中昆虫总重量(Total Weight of Insects inthe Background Check)，而TNIBC是背景检测(缓冲液对照)中昆虫总数(TotalNumber of Insects in the Background Check)。

GI50确定为%GI值为50时食物中嵌合DIG-152蛋白的浓度。LC₅₀(50%死亡浓度)记录为50%的测试昆虫被杀死时食物中DIG-152蛋白的浓度。统计学分析(One-way ANOVA)用JMP软件(SAS，Cary，NC)进行。

表2展示了DIG-152蛋白对秋粘虫昆虫幼虫的摄取生物分析。

表2.GI₅₀和LC₅₀值(ng/cm²)，从顶部加载DIG-152蛋白的昆虫食物计算。

本发明的DIG-152蛋白具有该特征，即秋粘虫(Spodoptera frugiperda)初生幼虫的生长在摄取DIG-152蛋白之后被抑制。进一步，对Cry1Fa毒性有抗性的秋粘虫幼虫与野生型秋粘虫幼虫一样对DIG-152敏感。这些Cry1Fa抗性昆虫对Cry1Ca的敏感性的重要意义在上文中有详细讨论。

实施例4

设计编码DIG-109蛋白的玉米密码子优化的序列

植物分子生物学领域技术人员能理解多个DNA序列可以设计为编码一种氨基酸序列。增加感兴趣的蛋白的编码区域的表达的通常含义是将编码区域改变为这样的方式，即其密码子组成类似宿主的总体密码子组成，在其中基因一定会表达。关于设计和产生合成性基因的教导参见例如WO1997/13402和US专利号5380831。

设计并合成了具有玉米偏好密码子的DNA序列以在转基因单子叶植物中产生DIG-109嵌合杀虫蛋白。根据从GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)存放的序列获得的706个蛋白编码序列计算了对玉米(Zea mays L.)的密码子使用表。忽略任何使用少于用于该氨基酸的密码子总共的约10%的多余密码子之后，计算出玉米密码子设置的加权平均值。代表每个密码子的加权平均值用下式计算：

C1的加权平均值%=1/(%C1+%C2+%C3+etc.)x%C1x 100

其中C1是所讨论的密码子，而%C2，%C3，etc.表示其余同义密码子的平均%使用值。

为了获得编码SEQ ID NO:2的1164个氨基酸的DIG-109蛋白的玉米密码子优化的DNA序列，进行了编码Cry1Ca核心毒素片段的自身cry1Ca DNA序列的密码子取代，以获得具有玉米优化的偏好密码子表的全部密码子组成。以类似的形式，进行了编码Cry1Ab原毒素片段的自身cry1Ab DNA序列的密码子取代，以获得具有玉米优化的偏好密码子表的全部密码子组成。对序列进行了进一步精致化以消除不希望的限制性酶识别位点，潜在的植物内含子剪接位点，长段的A/T或C/G残基，和其它可能干扰植物细胞中RNA稳定性、转录或翻译编码区域的基序。进行了其它改变以引入需要的限制性酶识别位点，并消除长的内在开放阅读框(不同于+1的阅读框)。这些改变均在保留大致的玉米偏好密码子组合的约束下进行。完整的玉米密码子优化序列(编码DIG-109蛋白)作为SEQ ID NO:3公开。DNA片段的合成通过商业供应商(DNA2.0，Menlo Park，CA)来进行。

实施例5

构建包含编码DIG-109蛋白的植物-可表达基因的植物转化载体

农杆菌超级双元系统(Japan Tobacco，Tokyo，JP)被便利地用于单子叶植物宿主的转化。该超级双元系统使用pSB11穿梭载体质粒，其含有由多克隆位点分离出的T-DNA右边界重复(RB)和T-DNA左边界重复(LB)。通过标准DNA克隆方法制备了pSB11的一个衍生物(称为pDAB7691)。质粒pDAB7691包含玉米优化的DIG-109编码序列(CDS；即，SEQ ID NO:3)在玉米泛素1启动子的转录控制之下并连接内含子1(US专利号5510474)和玉米Per53’不翻译区域(3'UTR)(US专利号7179902)。进一步，pDAB7691含有植物选择标记基因，包含Dow AgroSciences DSM2CDS(WO 2008/070845A2)在水稻肌动蛋白1启动子的转录控制之下并连接内含子1(US专利号5641876)和玉米脂肪酶3’UTR(US专利号7179902)。pDAB7691的T-区域的组分的物理排列简要示意如下：

RB>玉米Ubi1启动子:DIG-109CDS:玉米Per53'UTR>水稻Act1启动子:DSM2CDS:玉米Lip 3'UTR>LB

通过标准DNA克隆方法制备了pSB11的第二个衍生物(称为pDAB100276)。质粒pDAB100276包含玉米优化的DIG-109编码序列(CDS；即，SEQ ID NO:3)在玉米泛素1启动子的转录控制之下并连接内含子1和玉米Per53’UTR。进一步，pDAB100276含有植物选择标记基因，包含DowAgroSciences AAD1CDS(US专利申请号20090093366)，在玉米泛素1启动子的转录控制之下并连接内含子1和玉米脂肪酶3’UTR。pDAB100276的T-区域的组分的物理排列简要示意如下：

RB>玉米Ubi1启动子:DIG-109CDS:玉米Per53'UTR>玉米Ubi1启动子:AAD-1CDS:玉米Lip 3'UTR>LB

为了准备农杆菌的转化，具有质粒pDAB7691或质粒pDAB100276的大肠杆菌细胞克隆株DH5α在37°下在含壮观霉素(100μg/mL)的LB琼脂培养基(g/L：细菌用胰蛋白胨，10；细菌用酵母提取物，5；NaCl，10；琼脂，15)中生长过夜。含有结合转移质粒pRK2013的菌株DH5α细胞在含卡那霉素(50μg/mL)的LB琼脂上生长。平板在4°下孵育以等候含质粒pSB1的根瘤农杆菌菌株LBA4404可以使用。

实施例6

转化农杆菌以产生超级双元载体

农杆菌超级双元体系，其使用含质粒pSB1的根瘤农杆菌菌株LBA4404，能便利地用于转化单子叶植物宿主。构建和确认超级双元载体的方法学已经被很好地建立，参见pSB1的操作手册(Japan Tobacco)。标准微生物学和分子生物学方法用于产生和确认超级双元质粒pDAS5162，这是包含质粒pSB1和pDAB7691的共合体，以及超级双元质粒pDAS5848，这是包含质粒pSB1和pDAB100276的共合体。

实施例7

在玉米植物中生产DIG-109

农杆菌介导的玉米的转化来自Hi-II F1杂交(Armstrong et al.，1991)的种子平铺在含有95%的Metro-Mix 360无土培养基(Sun Gro Horticulture，Bellevue，WA)和5%的粘壤土的混合物的5加仑罐中。植物在温室中生长，使用高压钠和金属氯化物灯以16小时光照:8小时黑暗的光周期的组合。进行控制下的近亲授粉以获得不成熟的F2胚用于转化。授粉后约10天后当不成熟的胚为1.0mm-2.0mm之间的大小时收获玉米穗。

感染和共培养。玉米穗脱壳并通过肥皂液擦洗来表面灭菌，浸没在20%商业漂白剂(含5%次氯酸钠)保持20分钟，然后用无菌水漂洗3次。包含pDAS5162的根瘤农杆菌细胞的悬浮液，具有编码DIG-109蛋白的基因和含有DSM2植物选择标记基因的超级双元质粒，通过转移1或2个循环的细菌[在含100mg/L壮观霉素，10mg/L四环素，和150mg/L链霉素的YEP固体培养基(g/L：细菌用酵母提取物，10；细菌用蛋白胨，10；NaCl，5；琼脂，15)上28°下生长2-3天]至5mL的含100μM乙酰丁香酮的液体感染培养基[LS Basal培养基(Linsmaier and Skoog，1965)，N6维生素(Chu etal.，1975)，1.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，68.5g/L蔗糖，36.0g/L葡萄糖，6mM L-脯氨酸，pH 5.2]来准备。

可选地，包含pDAS5848的根瘤农杆菌细胞的悬浮液，具有编码DIG-109蛋白的基因和含有AAD-1植物选择标记基因的超级双元质粒，通过转移1或2个循环的如上所述生长的细菌至5mL的含100-200μM乙酰丁香酮的液体感染培养基来准备。

在两种情况下，溶液涡旋振荡直到形成均一的悬浮液，用Klett-Summerson色度计以紫色过滤器调节浓度至终浓度为200Klett单位(对pDAS5162转化)，或光学浓度550nm处为1.2(对pDAS5848)转化。未成熟胚直接分离至含2mL感染培养基的微离心管中。移除培养基并用1mL的农杆菌溶液替换，农杆菌/胚溶液室温孵育5-10分钟。然后胚被转入含100μM乙酰丁香酮(对pDAS5162转化)或含100-200μM的乙酰丁香酮(对pDAS5848转化)的共培养基[LS Basal培养基，N6维生素，1.5mg/L 2,4-D，30.0g/L蔗糖，6mML-脯氨酸，0.85mg/L AgNO₃，2.8g/L结冷胶(PhytoTechnology Laboratories，Lenexa，KS)，pH 5.8]，20°下黑暗中培养3-4天。

共培养之后，胚转移至含MS盐和维生素，6mM L-脯氨酸，100mg/L肌醇，500mg/L MES，30g/L蔗糖，1.5mg/L 2,4-D，0.85mg/LAgN0₃，250mg/L头孢噻肟(Cefotaxime)，2.8g/L结冷胶，pH 5.8的休眠培养基中。约7天后，胚转移至补充了3mg/L双丙氨膦(对pDAS5162转化)或补充了100nM吡氟氯禾灵(haloxyfop)(对pDAS5848转化)的相同培养基中(选择培养基)。约8周后转化的个体被鉴别出来并通过转移至新鲜筛选培养基2周时间来胀大从而再生和分析。

再生和种子产生。对于再生，培养物转移至补充了3mg/L双丙氨膦(对pDAS5162转化)或补充了100nM吡氟氯禾灵(对pDAS5848转化)的“28”诱导培养基(MS盐和维生素，30g/L蔗糖，5mg/L苄基氨基嘌呤，0.25mg/L 2，4-D，250mg/L头孢噻肟，2.5g/L结冷胶，pH 5.7)。低光照条件下(14μEm^-2s^-1)孵育1周，然后高光照条件下(约89uEm^-2s^-1)1周。组织随后转移至“36”重生培养基(与诱导培养基相同，除了缺乏植物生长调节因子)。当植物苗为3-5cm长时，将其转移至含SHGA培养基[(Schenk and Hildebrandt(1972)盐和维生素；PhytoTechnologies Labr.)，1.0g/L肌醇，10g/L蔗糖and 2.0g/L结冷胶，pH 5.8]的玻璃培养试管中以允许进一步的生长和芽和根的发育。植物被移植至于前文所述相同的土壤混合物中并在温室中生长至开花。进行控制的授粉以获得种子。

玉米转化领域的技术人员将理解其它方法对玉米转化和筛选转化植物也是可以的，当使用其它植物可表达的选择性标记基因(例如除草剂耐受基因)时。

实施例8

生产DIG-109蛋白的玉米植物的生物化学分析和昆虫生物分析

DIG-109蛋白在转基因玉米植物中的生产从植物幼苗(T0代)的叶提取的蛋白中检测。两片6mm直径的玉米叶圆片放置在深孔96集群试管箱(CostarCat#3957)的一个样品试管里，冷冻在-80°直到分析那天。这时候，两份4.5mm锌包被的Daisy^TM BB’s加入每个(冷冻)试管，连同200μL的提取缓冲液一起，所述缓冲液包含PBS(磷酸盐缓冲液；Fisher Cat#BP665-1)加0.05%吐温20。盖上每个试管，试管箱置于玻珠研磨机(Kleco^TM 4-96Pulverizer；GarciaManufacturing，Visalia，CA)在最大设置下3分钟。研磨成粉的样品在2500x g下离心5分钟，含有可溶蛋白的上清液用于免疫分析。

提取的玉米叶蛋白的免疫印迹分析显示DIG152RPC1多克隆抗体(从胰蛋白酶活化的Cry1Ca核心毒素蛋白免疫的兔获得)不与从非转基因植物叶中提取的蛋白发生交叉反应。在pDAS5162转化的植物的提取物中，通过DIG152PRC1抗体检测到了几种蛋白种类。

显然，尽管通过pDAS5162转化而引入玉米的转基因编码全长DIG-109蛋白，玉米细胞内的蛋白水解活性将初生的蛋白质加工为充足的稳定的小分子量种类。

从独立分离的用pDAS5162构建体转化的转基因玉米植物中收获的叶的昆虫毒性通过秋粘虫(FAW，Spodoptera frugiperda(J.E.Smith))的初生幼虫和Cry1F-抗性FAW(rFAW)的幼虫来进行体外检测。FAW卵从商业供应商(Benzon)获得，而rFAW卵来自专利权人的种群(Dow AgroSciences)。来自温室生长的T0植物在从实验室移植至温室约2周后的叶片段样品用于昆虫生物分析。每株植物的两片叶片(每片约1平方英寸)置于32孔盘(CD International)的分离的孔中，在约3mL的固体化2%琼脂上。卵在多种类鳞翅目食物(Southland Products)上孵化出，选择小于24小时的初生幼虫。每叶片段约10只幼虫被用驼毛刷小心放置在每孔中，侵染的盘用盘提供的带孔盖封闭，保持在28°，40%RH，16小时光照:8小时黑暗3天。测试结束时记录每个叶片的百分比伤害(%DAM)。平均伤害比率用于确定对每种类型的测试昆虫哪些植物具有最少的伤害。所有昆虫的测试重复数次。

数据用JMP统计软件(SAS，Cary，NC)分析，对每种昆虫类型，平均每种植物的%DAM分数。“Fit Y by X”模型用于单项ANOVA分析。需要分析每种处理的平均%DAM分数之间的显著差异时使用Tukey-Kramer均值分离。与从类似年龄的对照植物获得的%DAM分数进行了对比。阳性对照植物由商业上Herculex I^TM杂合体种子生长，其生产Cry1Fa B.t.毒素。阴性对照(即非转化植物)由Hi II和B104系以及一个Herculex I^TM变异系(所述Herculex I^TM杂合体的不含Cry的母本)代表。

图1总结了这些昆虫生物分析测试获得的结果。这是一个令人惊异的发现，即转基因叶中DIG-109的生产与%DAM比率之间的正相关性。对于FAW，F=35.3；d.f.=1，33；P<0.0001；r²=0.52，而对于rFAW，F=25.3；d.f.=1，33；P<0.0001；r²=0.43。进一步的惊人的和新颖的发现是，所有对Cry1FaB.t.毒素抗性的秋粘虫幼虫仍然被DIG-109B.t.毒素的进食所抑制。

应当理解玉米的其它昆虫害虫也可以以类似的方式进行测试。这些害虫包括，但不限于：Agromyza parvicornis(玉米杂交斑潜蝇)，Agrotis ipsilon(小地老虎)，Anticarsia gemmatalis(绒毛豆毛虫)，Diatraea grandiosella(西南玉米螟)，Diatraea saccharalis(甘蔗螟)，Elasmopalpus lignosellus(小玉米茎蛀虫)，Helicoverpa zea(玉米夜蛾)，Heliothis virescens(烟草夜蛾)，Ostrinianubilalis(欧洲玉米螟)，Cry1F-抗性O.nubilalis，Plutella xylostella(小菜蛾)，Cry1-抗性P.xylostella，Spodoptera exigua(甜菜夜蛾)，和Trichoplusia ni(甘蓝银纹夜蛾)。

pDAS5848转化的转基因玉米植物(T0代)也通过昆虫生物分析和免疫分析进行检测。叶提取物中的DIG-109蛋白的量通过商业上可获得的Cry1CELISA检测试剂盒(Envirologix^TM，Portland，MA；Cat#AP007)来定量，检测的DIG-109蛋白的水平以百万分之几(ppm；1ppm表示提取物中每mg的总共可溶蛋白1ng的DIG-109蛋白)来表示。

FAW和rFAW的食用伤害编码如下：0=无伤害或小孔的食用标记，1=25%-50%的叶片被吃，而2=几乎所有叶片被消耗或没有叶片剩余。被保护的植物是伤害值为0.67或更低的那些。

表3中的数据显示出T0植物中ELISA检测到的DIG-109蛋白的存在与体外生物分析中秋粘虫幼虫造成的食用伤害的控制之间有正相关性。具有最高检测水平的DIG-109蛋白的植物(植物5848-005.4)具有最低的叶进食伤害得分。来自具有190-230ppm范围的低水平的可检测DIG-109蛋白的叶片也受到更少的食用伤害，相比于阴性对照植物(即，未转化对照B104和HiII)的叶片锁观察到的，后者具有1.7或1.8的平均伤害得分。在所有检测的pDAS5848叶片中，检测到的主要DIG-109蛋白种类包含成对出现的大约60kDa和55kDa大小的肽。

表3.pDAS5848转化的转基因玉米叶中DIG-109蛋白的水平和秋粘虫食用伤害的降低。

^aNA=不适用；^bSD=平均值的标准偏差

因此本发明具有这样的特点，玉米植物中生产的DIG-109蛋白使得植物对秋粘虫幼虫和Cry1F抗性秋粘虫幼虫的进食伤害有抗性。

实施例9

Cry1Fa和Cry1Ca核心毒素蛋白与分离的草地贪夜蛾刷状缘膜载体的竞争性结合实验

下列实施例评价了Cry1核心毒素蛋白与昆虫肠组织中的假定受体的竞争性结合。显示出125I-标记的Cry1Ca核心毒素蛋白以高亲和力结合至从草地贪夜蛾(秋粘虫)制备的刷状缘膜载体(Brush Border Membrane Vesicles，BBMV’s)，并且Cry1Fa核心毒素蛋白不与该结合竞争。

纯化Cry蛋白。编码包含Cry1Ca核心毒素和Cry1Ab原毒素的嵌合蛋白的基因在荧光假单胞菌表达株中表达，如实施例2所述。以类似的方式，编码包含Cry1Fa核心毒素(603氨基酸)和Cry1Ab原毒素(545氨基酸)的嵌合蛋白的基因在Pf系统中表达。用实施例2的方法纯化蛋白，进行胰蛋白酶消化以从全长蛋白产生活化的核心毒素，产品用实施例2的方法纯化。胰蛋白酶处理的(活化的核心毒素)蛋白为>95%纯度并具有以SDS-PAGE实验确定约65kDa的分子量。

蛋白定量和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的标准方法以教导的方法进行，例如，参见Sambrook et al.(1989)andAusubel et al.(1995)，及其更新。

可溶性BBMV’s的制备和分离。末龄草地贪夜蛾幼虫禁食过夜然后在冰上冷却15分钟后解剖。从体腔中移出中肠组织，保留在后肠之后连接在表皮上。中肠置于9X体积的冰冷的均匀化缓冲液(100mM甘露醇，5mM EGTA，17mM Tris碱，pH7.5)，补加蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich P-2714)根据供应商的说明稀释。组织均匀化玻璃组织均化器的15个冲程。BBMV’s通过Wolfersberger(1993)的MgCl₂沉淀法来制备。简单来说，相等体积的24mMMgCl₂在300mM甘露醇中的溶液与中肠匀浆混合，搅拌5分钟并在冰上保持15分钟。溶液在2500x g下4°离心15分钟。保存上清液，沉淀小块悬浮于原始体积的0.5X稀释的均匀化缓冲液并再次离心。合并两次上清液并在27000xg下4°离心30分钟以形成BBMV部分。沉淀小块悬浮于BBMV储存缓冲液(10mM HEPES，130mM KCl，10%甘油，pH7.4)使蛋白浓度为约3mg/mL。用牛血清白蛋白(BSA)作为标准确定蛋白浓度。用QuantiChrom^TM DALP-250碱性磷酸酶分析试剂盒(Gentaur Molecular Products，Kampenhout，BE)根据生产商的说明进行碱性磷酸酶(BBMV部分的标记性酶)测试之后冷冻样品。该酶的特定活性典型地增加7倍，相比于初始中肠均化物部分中发现的。BBMV’s分装为250μL样品，液氮中闪冻并在-80°保藏。

电泳。蛋白的SDS-PAGE分析在还原(即，在5%β-巯基乙醇，BME中)和变性(即，在2%SDS存在下加热至90°5分钟)条件下进行。蛋白上样于4%至20%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(BioRad;Hercules，CA)孔中并在200伏特下分离60分钟。

蛋白条带通过Coomassie Brilliant Blue R-250(BioRad)染色1小时，并用5%甲醇的7%乙酸溶液脱色之后检测。凝胶成像并用BioRad Fluro-S MultiImager^TM分析。蛋白条带的相对分子量通过与上样于凝胶的一个孔中的BenchMark^TM Protein Ladder(LifeTechnologies，Rockville，MD)样品中观察到的已知分子量蛋白的迁移率对比而确定。

碘化Cry1Ca核心毒素蛋白。纯化的Cry1Ca核心毒素蛋白用PierceIodination Beads (Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL)碘化。简单来说，两份碘化珠用500μL的PBS(20mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH7.5)洗两次，与100μLPBS置于1.5mL离心管中。加入0.5mCi的125I-标记的碘化钠，组分在室温下反应5分钟，之后向溶液加入1μg的Cry1Ca核心毒素蛋白并反应另外的3-5分钟。通过滴加来自碘化珠的溶液来终止反应，并提供于50mM CAPS，pH10.0，1mM DTT(二硫苏糖醇)，1mM EDTA，和5%甘油平衡的Zeba^TM旋转柱(Invitrogen)。碘化珠用10μL的PBS洗两次，洗涤液用于Zeba^TM脱盐柱。放射性溶液通过在1000x g下离心2分钟而洗脱经过旋转柱。然后125I-放射标记的Cry1Ca核心毒素蛋白用50mM CAPS，pH10.0，1mM DTT，1mMEDTA，和5%甘油透析。

成像。通过SDS-PAGE和感光成像来检测碘化的Cry1Ca核心毒素蛋白的放射纯度。简单来说，用BioRad凝胶干燥设备根据生产商的说明来干燥SDS-PAGE凝胶。干燥的凝胶通过将其包装在聚酯膜(12μm厚)并暴露于分子动力学储存荧光屏(35cm x 43cm)1小时以成像。用Molecular Dynamics Storm820感光成像仪来发展平板，图像用ImageQuant ^TM软件分析。

实施例10

125I-标记的Cry1核心毒素蛋白结合至来自草地贪夜蛾的BBMV’s

用125I-放射标记的Cry1Ca核心毒素蛋白产生饱和曲线以确定用于与Cry1Ca和Cry1Fa核心毒素蛋白的结合分析的BBMV蛋白的最佳量。0.5nM的125I-放射标记的Cry1Ca核心毒素蛋白在28°下在结合缓冲液(8mM NaHPO₄，2mM KH₂PO₄，150mM NaCl，0.1%BSA，pH7.4)中与从0μg/mL至500μg/mL的量的BBMV蛋白一起孵育1小时(总体积为0.5mL)。结合至BBMV蛋白的125I-标记的Cry1Ac核心毒素蛋白通过下述方法从未结合部分中分离：取样150μL的反应混合物以三份置于分离的1.5mL离心管中，室温下以14000x g离心样品8分钟。轻柔地移除上清液，沉淀小块用冰冷的结合缓冲液洗3次。切下包含沉淀小块的离心管底部，置于13x 75mm玻璃培养管中，样品在γ计数器中分别计数5分钟。获得的CPM(数每分钟)减去背景CPM(无BBMV蛋白的反应)对BBMV蛋白浓度绘图。根据其它结果，用于结合分析的BBMV蛋白的最佳浓度被确定为150μg/mL。

实施例11

来自草地贪夜蛾的BBMVs与Cry1Ca和Cry1Fa核心毒素蛋白的竞争性结合分析

用150μg/mL BBMV蛋白和0.5μg/mL的125I-放射标记的Cey1Ca核心毒素蛋白进行同源和异源竞争性结合分析。加入反应混合物的竞争性非-放射标记的Cry1Fa核心毒素蛋白的浓度在0.045nM至1000nM的范围，并与放射性Cry1Ca核心毒素蛋白同时加入，以确保真实的结合竞争。28°下进行孵育1小时，如上所述测量结合至BBMV(特异性结合)的125I-标记的Cry1Ca核心毒素蛋白的量。非特异性结合用1000mM的非-放射标记的Cry1Ca核心毒素蛋白存在下获得的计数来表示。在不存在任何竞争者Cry1Fa核心毒素蛋白下结合的量被认为是总共百分之百的结合。

用125I0标记的Cry1Ca核心毒素蛋白的受体结合分析测定了Cry1Fa核心毒素蛋白从来自草地贪夜蛾的BBMV’s的结合位点上取代放射性标记的配体的能力。结果(图2)显示Cry1Fa不会取代结合在其受体蛋白上的125I-标记的Cry1Ca核心毒素蛋白，在高达300nM的浓度下(放射性结合配体的浓度的600倍)。与预期相符，未标记的Cry1Ca核心毒素蛋白能从其结合蛋白上取代放射性标记的Cry1Ca核心毒素蛋白，显示出S形剂量响应曲线，50%取代发生在5nM时。

从而显示出Cry1Ca核心毒素蛋白与草地贪夜蛾BBMV中不结合Cry1Fa核心毒素蛋白的结合位点发生作用。

参见图2：Cry1Fa核心毒素，Cry1Ca核心毒素，和125I-标记的Cry1Ca核心毒素结合草地贪夜蛾BBMV’s的竞争。

实施例12

Cry1Ca核心毒素蛋白和生物素标记的Cry1Fa核心毒素蛋白与小蔗螟 (Diatraea saccharalis)BBMVs的竞争性结合

下列实施例评价了Cry1核心毒素蛋白与昆虫肠组织中的假定受体的竞争性结合。显示出生物素-标记的Cry1Fa核心毒素蛋白以高亲和力结合至从小蔗螟(Diatraea saccharalis)制备的刷状缘膜载体(Brush Border MembraneVesicles，BBMV’s)，并且Cry1Fa核心毒素蛋白不与该结合竞争。

可溶性BBMV’s的制备和分离。末龄小蔗螟幼虫禁食过夜然后在冰上冷冻15分钟后解剖。BBMV的制备根据实施例10中描述的方法来进行。

用125I-标记的Cry1Fa核心毒素蛋白的竞争性结合分析结果可能具有有限的生物学适用性，因为Cry1Fa蛋白的碘化导致蛋白在昆虫进食生物分析中没有活性。与之相比，发现生物素化的Cry1Fa核心毒素蛋白保留了其针对昆虫的毒性。进一步，能够测量这种(生物素化的)蛋白与受体在非生物素化(竞争性)Cry核心毒素蛋白存在下的相互作用。在BBMV蛋白电泳和整个样品转移至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上后，这样的竞争性实验能检测生物素-标记的Cry1Fa核心毒素蛋白与小蔗螟BBMV的结合。连接至辣根过氧化物酶的抗生物素蛋白，与增强的化学发光试剂联合，用于显像生物素-标记的Cry1Fa核心毒素蛋白。

Cry1Fa核心毒素蛋白通过Pierce EZ-Sulfo-NHS-LC生物素化试剂盒(Thermo Fisher Scientific)用生物素标记。简单来说，40μL的Sulfo-NHS-LC-生物素(10mg/mL在二甲亚砜中)加入500μL的Cry1Fa核心毒素蛋白(2.0mg/mL)在pH7.2的0.1M磷酸钠缓冲液中。反应在4°下孵育过夜，然后未反应的Sulfo-NHS-LC-生物素用Zeba^TM脱盐柱去除。结合至Cry1Fa核心毒素蛋白的生物素用Pierce HABA-抗生物素蛋白取代分析(Thermo Fisher Scientific)根据生产商的描述来测量。

生物素标记的Cry1Fa核心毒素蛋白(2.5nM)在28°下与0.2mg由小蔗螟制备的BBMV’s[以总体积1.0mL]在500倍过量的未标记Cry1Fa或Cry1Ca核心毒素蛋白存在或不存在下孵育1小时。未结合的生物素-标记的Cry1Fa核心毒素蛋白通过在16000x g下离心10分钟来移除，获得的沉淀小块用冰冷的结合缓冲液洗3次。沉淀小块悬浮于15μL的4X Laemmli样品缓冲液中，涡旋振荡并超声以确保完全溶解，并加热至90°3分钟。整个样品上样于4%至20%的Tris甘氨酸凝胶，通过SDS-PAGE分离，根据供应商的说明(BioRad)电转移至PVDF膜上。1000ng的Cry1Fa核心毒素蛋白和Cry1Ca核心毒素蛋白也在凝胶上跑胶作为阴性对照。生物素-标记的Cry1Fa核心毒素蛋白用抗生物素蛋白-连接的辣根过氧化物酶以1:15000稀释液现象，所述稀释液具有West Pico Peroxide Solution与Luminal Enhancer Solution (Thermo FisherScientific，Catalog numbers 1859674and 1859675)的1:1的混合物增强的化学发光。用Biorad Fluor-S MultiImager通过Quantity One v.4.5.2软件记录条带。

结果证明了检测到生物素-标记的Cry1Fa核心毒素蛋白结合小蔗螟BBMV中的受体，并进一步显示未生物素化的Cry1Fa核心毒素蛋白在500倍过量浓度下从其受体上完全取代结合的生物素化的Cry1Fa核心毒素蛋白。相反，500倍过量浓度的Cry1Ca核心毒素蛋白不能取代结合的生物素化的Cry1Fa核心毒素蛋白，表明Cry1Ca核心毒素蛋白不与Cry1Fa核心毒素蛋白竞争性结合小蔗螟(D.Saccharalis)BBMV中的位点。从而证明了，与草地贪夜蛾(S.frugiperda)的BBMVs获得的结果类似，Cry1Fa核心毒素蛋白和Cry1Ca核心毒素蛋白结合小蔗螟BBMVs中分别的结合位点。

参考文献

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附录A

delta-内毒素的列表-来自Crickmore等网站(申请中引用)

登录号是NCBI条目(若可获得的话)

Claims

1.产生转基因植物的方法，包括将编码SEQ ID NO:5的Cry1C杀虫蛋白的DNA和编码SEQ ID NO:4的Cry1F杀虫蛋白的DNA转化到宿主植物中。

2.权利要求1的方法，其中编码SEQ ID NO:5的Cry1C杀虫蛋白的DNA和编码SEQ ID NO:4的Cry1F杀虫蛋白的DNA被渐渗入所述植物。

3.管理秋粘虫对Cry毒素形成抗性的方法，所述方法包含种植种子以产生植物田地，其中所述田地包含多个转基因植物，所述转基因植物包含编码SEQ ID NO:5的Cry1C杀虫蛋白的DNA和编码SEQ ID NO:4的Cry1F杀虫蛋白的DNA。

4.权利要求3的方法，其中所述田地包含非-Bt避难所植物。

5.权利要求3的方法，其中所述避难所植物占(comprise)所述田地中所有作物植物的少于40％。

6.权利要求3的方法，其中所述避难所植物占所述田地中所有作物植物的少于30％。

7.权利要求3的方法，其中所述避难所植物占所述田地中所有作物植物的少于20％。

8.权利要求3的方法，其中所述避难所植物占所述田地中所有作物植物的少于10％。

9.权利要求3的方法，其中所述避难所植物占所述田地中所有作物植物的少于5％。

10.权利要求3的方法，其中所述避难所植物是在块状或条带中。

11.一种控制鳞翅目害虫的组合物，其包含细胞，所述细胞表达有效量的含SEQ ID NO:4的Cry1F核心毒素的蛋白和含SEQ ID NO:5的Cry1C核心毒素的蛋白。

12.权利要求11的组合物，其包含宿主，所述宿主经转化以表达含SEQID NO:4的Cry1F核心毒素的蛋白和含SEQ ID NO:5的Cry1C核心毒素的蛋白，其中所述宿主是微生物或植物细胞。

13.控制秋粘虫昆虫的方法，包括对所述昆虫或对所述昆虫的环境提供有效量的权利要求11的组合物。

14.权利要求1的方法，其中所述宿主植物选自玉米，大豆和棉花。

15.权利要求1的方法，其中所述宿主植物是玉米植物。