CN102753013B - 组合使用Vip3Ab与Cry1Ca用于抗性昆虫的管理 - Google Patents

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Abstract

本发明包括用于控制秋粘虫鳞翅类昆虫的方法和植物，所述植物包括Vip3Ab杀虫蛋白和Cry1Ca杀虫蛋白，和包含本蛋白配对的其它蛋白的各种组合，用于延迟或防止昆虫发生抗性。

Description

组合使用Vip3Ab与Cry1Ca用于抗性昆虫的管理
发明背景
人类种植谷物用于粮食和能源应用。人类还种植许多其它的作物，包括大豆和棉花。昆虫吃掉并毁坏植物从而破坏了人类的努力。人们每年要花费数十亿美元用于控制害虫，并且它们还会造成另外数十亿美元的损失。合成的有机化学杀虫剂为用于控制害虫的主要工具，但是在一些区域，生物杀虫剂，例如来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)的杀虫蛋白，发挥着重要的作用。通过转化Bt杀虫蛋白基因产生昆虫抗性植物的能力给现代农业带来了革命，并提高了杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。
已经有数种Bt蛋白用于产生抗昆虫的转基因植物，它们现在已经被成功地注册并商业化。这些包括谷物/玉米(corn)中的Cry1Ab,Cry1Ac,Cry1F和Cry3Bb，棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab，和马铃薯中的Cry3A。
表达这些蛋白的商业产品表达单一的蛋白，但是在如下情况下例外，即期望2种蛋白的组合杀虫谱(例如在玉米中组合Cry1Ab和Cry3Bb以分别提供对鳞翅目害虫和食根昆虫的抗性)，或者蛋白的独立作用使它们可用作在易感昆虫群体中延迟抗性产生的工具(例如在棉花中组合Cry1Ac和Cry2Ab以提供对烟草青虫(tobacco budworm)的抗性管理)。另见美国专利申请公开No.2009/0313717，其涉及Cry2蛋白加Vip3Aa,Cry1F或Cry1A，用于控制谷实夜蛾(Helicoverpa zea)或棉铃虫(armigerain)。WO 2009/132850涉及Cry1F或Cry1A和Vip3Aa，用于控制秋粘虫(Spodoptera frugiperda)。美国专利申请公开No.2008/0311096部分涉及Cry1Ab，用于控制Cry1F抗性ECB。
也就是说，昆虫抗性转基因植物的一些品质虽然使这种技术被快速而广泛地采用，但是也带来了担忧，即害虫群体可能对这些植物所产生的杀虫蛋白产生抗性。已经提出了多种策略用于防止(preserve)基于Bt的昆虫抗性性状的效用，包括以高剂量使用蛋白质并与避难所组合，不同毒素交替使用或者共使用(McGaughey等.(1998),“B.t.Resistance Management,”NatureBiotechnol.16:144-146)。
被选择用于昆虫抗性管理(IRM)混杂的蛋白质需要独立地发挥其杀虫效果，从而对一种蛋白质产生的抗性不会赋予对第二种蛋白质的抗性(即对于蛋白质无交叉抗性)。如果例如对“蛋白A”有抗性的害虫群体对“蛋白B”敏感，则人们可以得出结论，蛋白A和蛋白B无交叉抗性并且它们的组合可有效延迟对单一蛋白A的抗性。
当没有抗性昆虫群体时，可以基于假定与作用机制和交叉抗性潜力相关的其它特征进行评估。已经有提议使用受体介导的结合来鉴定可能不会显示交叉抗性的杀虫蛋白(van Mellaert等1999)。在这种方法中固有的缺少交叉抗性的关键预测子(predictor)是杀虫蛋白在敏感昆虫物种中不会竞争受体。
在两种Bt毒素竞争相同受体的情况下，如果昆虫中的受体发生突变使得毒素之一不再与该受体结合从而对该昆虫不再具有杀虫性，则可能的情况是昆虫对第二种毒素(其竞争性结合相同的受体)也有抗性。也就是说，昆虫被称作对两种Bt毒素有交叉抗性。然而，如果两种毒素结合两种不同的受体，这可以指示昆虫不会同时对这两种毒素具有抗性。
例如，Cry1Fa蛋白可用于控制许多鳞翅类害虫物种，包括欧洲玉米螟(ECB;Ostrinia nubilalis(Hübner))和秋粘虫(FAW;Spodoptera frugiperda)，并且针对蔗螟(SCB;Diatraea saccharalis)有活性。Cry1Fa蛋白，如在含有事件TC1507的转基因玉米植物中产生的，负责工业领先的用于FAW控制的昆虫抗性性状。Cry1Fa进一步应用于SmartStaxTM和WideStrikeTM产品中。
在官方B.t.命名委员会的网站上列出了其它的Cry毒素(Crickmore等;lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。当前有接近60个主要的“Cry”毒素组(Cry1-Cry59)，还有额外的Cyt毒素和VIP毒素等。各数字组中的很多还有大写字母的亚群，并且大写字母亚群又有小写字母的子亚群。(例如，Cry1具有A-L，而Cry1A具有a-i)。
发明内容
本发明部分地涉及组合使用Vip3Ab蛋白与Cry1Ca蛋白。产生这两种蛋白的植物(和种植这类植物的田亩)包含在本发明的范围内。
本发明部分地涉及令人惊讶的发现，即Vip3Ab不与Cry1Ca竞争秋粘虫(Spodoptera frugiperda;FAW)肠中的结合位点。
本发明还部分地涉及三种(或更多种)毒素的三重混杂或“锥形混杂”，以Vip3Ab和Cry1Ca作为基础配对。在一些优选的锥形混杂实施方案中，所选毒素的组合提供了针对FAW的非交叉抗性作用。一些优选的“三作用位点”锥形混杂组合包括本基础蛋白配对加Cry1Fa,Cry1Da,Cry1Be或Cry1E，作为用于靶向FAW的第三蛋白。根据本发明，这些特殊的三重混杂有利地且令人惊讶地提供三个针对FAW的作用位点。这有助于减少或消除对于避难所田亩的需要。
可以根据本发明添加额外的毒素/基因。例如，如果Cry1Fa或Cry1Be与本蛋白对混杂(Cry1Fa和Cry1Be均针对FAW和欧洲玉米螟(ECB)两者有活性)，则向此三重混杂添加两种额外的蛋白质，其中这两种添加的蛋白靶向ECB，可以提供三个针对FAW的作用位点和三个针对ECB的作用位点。这两种添加的蛋白(第四和第五蛋白)可选自下组：Cry2A,Cry1I,DIG-3和Cry1Ab。这可产生五蛋白混杂，其具有针对两种昆虫(ECB和FAW)的三作用位点。
发明详述
本发明部分地涉及一项令人惊讶的发现，即Vip3Ab和Cry1Ca在秋粘虫(FAW;Spodoptera frugiperda)的肠中彼此不竞争结合。因此，Vip3Ab蛋白可与Cry1Ca蛋白组合用于转基因玉米(和其它植物；例如棉花和大豆)中，以延迟或防止FAW对这些蛋白的单独任一个产生抗性。本发明蛋白对能够有效地保护植物(例如玉米植物和/或大豆植物)免于Cry抗性秋粘虫的伤害。也就是说，本发明的一个用途是保护玉米和其它经济上重要的植物物种免于由于可对Vip3Ab或Cry1Ca产生抗性的秋粘虫群体导致的伤害和收得率损失(yield loss)。
因此，本发明教导了包含Vip3Ab和Cry1Ca的昆虫抗性管理(IRM)混杂，以防止或减缓FAW对这些蛋白之一或两者产生抗性。
本发明提供了用于控制鳞翅类害虫的组合物，其包含可产生Vip3Ab杀虫蛋白和Cry1Ca杀虫蛋白的细胞。
本发明进一步包括经转化以产生Vip3Ab杀虫蛋白和Cry1Ca杀虫蛋白的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。本多核苷酸优选地在遗传构建体中在非苏云金芽孢杆菌启动子的控制之下。本多核苷酸可以包含用于在植物中增强表达的密码子选择。
另外预期的是，本发明提供了一种控制鳞翅类害虫的方法，包括使所述害虫或所述害虫的环境与有效量的组合物接触，该组合物含有包含Vip3Ab核心毒素的蛋白，并进一步含有包含Cry1Ca核心毒素的蛋白。
本发明的一个实施方案包含玉米植物，其包含编码Cry1Ca杀虫蛋白的植物可表达基因和编码Vip3Ab杀虫蛋白的植物可表达基因，和这种植物的种子。
本发明进一步的实施方案包含玉米植物，其中编码Cry1Ca杀虫蛋白的植物可表达基因和编码Vip3Ab杀虫蛋白的植物可表达基因被渐渗入所述玉米植物中，和这种植物的种子。
如实施例中所述，使用放射性标记的Cry1Ca蛋白的竞争受体结合研究显示，Cry1Ca蛋白不竞争FAW组织中结合Vip3Ab的结合。这些结果还表明，Vip3Ab和Cry1Ca蛋白的组合可为在FAW群体中延缓对这些蛋白之一产生抗性的有效手段。因此，部分地基于本文所述的数据，认为Cry1Ca和Vip3Ab蛋白的共产生(混杂)可用于产生对于FAW的高剂量IRM混杂。
可以向这个配对添加其它的蛋白质。例如，本发明还部分地涉及三种(或更多种)毒素的三重混杂或“锥形混杂”，以Vip3Ab和Cry1Ca蛋白作为基础配对。在一些优选的锥形混杂实施方案中，所选的毒素具有针对FAW的三个不同的作用位点。一些优选的“三作用位点”锥形混杂组合包括本基础蛋白配对加Cry1Fa,Cry1Da,Cry1Be或Cry1E作为靶向FAW的第三蛋白。“不同的作用位点”，意思是给定蛋白彼此不会导致交叉抗性。根据本发明，这些特定的三重混杂有利地且令人惊讶地提供三个针对FAW的作用位点。这可有助于减少或消除对于避难所田亩的需要。
关于本发明的一些具体实施方案，我们显示对Cry1Fa蛋白的杀虫活性有抗性的FAW群体对Vip3Ab蛋白的杀虫活性或者对Cry1Ca蛋白的杀虫活性没有抗性。我们证明了在FAW的肠中，Cry1Ca不与Cry1Fa竞争结合位点，并且Vip3Ab与Cry1Fa竞争结合位点。关于Cry1Fa和Cry1Ca，参见USSN 61/284,281(2009年12月16日提交)和同时提交的题为"COMBINEDUSE OF Vip3Ab AND CRY1Fa FOR MANAGEMENT OF RESISTANTINSECTS"的PCT专利申请。
因此，本毒素配对Cry1Fa+Vip3Ab和Cry1Fa+Cry1Ca提供了针对FAW的非交叉抗性作用。Vip3Ab1在FAW的肠中不能与Cry1Ca竞争结合，证明这三种蛋白毒素(Cry1Fa,Vip3Ab和Cry1Ca)代表了Cry毒素的三重锥形混杂，其在FAW的肠内提供了三个不同的靶位点相互作用。根据本发明，这些特定的三重混杂有利地且令人惊讶地提供了针对FAW的非交叉抗性作用。此外，通过证明这三种蛋白不彼此竞争，本领域的技术人员会意识到，这有助于减少或消除对于避难所田亩的需要。作为本公开的益处，表达Cry1Fa,Vip3Ab和Cry1Ca三重组合的植物可用于延迟或防止这FAW种对这些蛋白的个体或组合产生抗性。
也可以根据本发明添加额外的毒素/基因。例如，如果Cry1Fa或Cry1Be与本蛋白对混杂(Cry1Fa和Cry1Be均针对FAW和欧洲玉米螟(ECB)两者有活性)，则向此三重混杂添加两种额外的蛋白质，其中这两种添加的蛋白靶向ECB，可提供三个针对FAW的作用位点和三个针对ECB的作用位点。这两种添加的蛋白(第四和第五蛋白)可选自下组：Cry2A,Cry1I,DIG-3(参见美国专利申请序列No.61/284,278(2009年12月16日提交)和US 201000269223)和Cry1Ab。这可产生五蛋白混杂，其具有针对两种昆虫(ECB和FAW)的三作用位点。
因此，一个应用选择是组合使用本蛋白配对与第三毒素/基因，并使用这种三重混杂在FAW中减缓对这些毒素中的任何一种产生抗性。因此，本发明还部分地涉及三种(或更多种)毒素的三重混杂或“锥形混杂”。在一些优选的锥形混杂实施方案中，所选毒素具有针对FAW的三个不同的作用位点。
在本发明的各种应用选择中包括在FAW可产生抗性群体的作物生长区中使用本蛋白中的两种、三种或更多种蛋白。
由于Cry1Fa对FAW和ECB有活性，根据本发明，Vip3Ab加Cry1Ca加Cet1Fa可有利地且令人惊讶地提供三个针对FAW的作用位点。这有助于减少或消除对于避难所田亩的需要。
Cry1Fa用于SmartStaxTM和WidesStrikeTM产品中。本基因配对(Vip3Ab和Cry1Ca)可组合入例如Cry1Fa产品如SmartStaxTM和WideStrikeTM。因此，本蛋白配对可显著减少对这些和其它蛋白的选择压力。本蛋白配对因此可以用在三基因组合中，用于玉米和其它植物(例如棉花和大豆)。
如上面所讨论的，也可以根据本发明添加另外的毒素/基因。关于Cry1E的使用(用于控制FAW)，参见美国专利申请系列No.61/284,278(2009年12月16日提交)。
可产生任何本蛋白组合的植物(和种植有这类植物的田亩)包含在本发明的范围内。也可以添加额外的毒素/基因，但是上面讨论的特定混杂有利地且令人惊讶地提供针对FAW和/或ECB的多个作用位点。这有助于减少或消除对于避难所田亩的需要。因此，如此种植超过10英亩的田地包含在本发明的范围内。
可以使用GENBANK获得本文公开或提及的任何基因和蛋白的序列。见下面的附录A。相关的序列也可在专利中得到。例如，美国专利No.5,188,960和美国专利No.5,827,514描述了适于实施本发明的含Cry1Fa核心毒素的蛋白质。美国专利No.6,218,188描述了适用于本发明的编码含Cry1Fa核心毒素的蛋白质的植物优化的DNA序列。USSN 61/284,275(2009年12月16日提交)提供了可根据本发明使用的一些截短的Cry1Ca蛋白。
本文所述的蛋白的组合可用于控制鳞翅类害虫。成年鳞翅类，例如蝶和蛾，主要以花蜜为食并且是显著的授粉效应物。几乎所有的鳞翅类幼虫，即毛虫，以植物为食，并且许多是严重的害虫。毛虫在叶子上面或内部或者植物根或茎上进食，剥夺植物营养，并且常常会破坏植物的物理支撑结构。此外，毛虫还以果实、织物、储存的谷粒和面粉为食，使这些产品毁坏而不能出售或者严重降低其价值。如本文所使用的，鳞翅类害虫是指害虫的各个生命阶段，包括幼虫阶段。
本发明的一些嵌合毒素包括Bt毒素的完整N-端核心毒素部分，并且在核心毒素部分末端之后的某点，蛋白质具有向异源原毒素(protoxin)序列的转变。Bt毒素的N端具有杀虫活性的毒素部分称作“核心”毒素。从核心毒素区段向异源原毒素区段的转变可发生在毒素/原毒素连接点附近，或者可选择地，天然原毒素的一部分(延伸越过核心毒素部分)可以被保留，而向异源原毒素部分的转变发生在其下游。
作为一个实例，本发明的一种嵌合毒素为Cry1Ca的完整核心毒素部分(约为前600个氨基酸)和/或异源原毒素(剩余氨基酸至C端)。在一个优选实施方案中，包含原毒素的嵌合毒素的部分源自Cry1Ab蛋白毒素。在一个优选实施方案中，包含原毒素的嵌合毒素的部分源自Cry1Ab蛋白毒素。
本领域的技术人员会意识到，Bt毒素，甚至在某种类型的毒素如Cry1Ca中，可以在一定程度上改变长度以及从核心毒素部分向原毒素部分转变的确切位置。通常，Cry1Ca毒素长度为大约1150-大约1200个氨基酸。从核心毒素部分向原毒素部分的转变通常发生在全长毒素的大约50%-大约60%。本发明的嵌合毒素包括该N端核心毒素部分的完整区域(expanse)。因此，嵌合毒素包括全长Cry1 Bt毒素蛋白的至少大约50%。这通常为至少大约590个氨基酸。关于原毒素部分，Cry1Ab原毒素部分的完整区域从核心毒素部分的末端延伸到该分子的C端。
基因和毒素。根据本发明，有用的基因和毒素不仅包括公开的全长序列，还包括保留了本文特别例示的毒素的特征杀虫活性的这些序列的片段、变体、突变体和融合蛋白。如本文所使用的，术语基因的“变体”或“变异”是指编码相同毒素或者编码具有杀虫活性的等价毒素的核苷酸序列。如本文所使用的，术语“等价毒素”是指对靶害虫具有与所要求保护的毒素相同或基本上相同的生物活性的毒素。
如本文所使用的，边界表示大约95%(Vip3Ab的和Cry1Be的)、78%(Vip3Ab的和Cry1C的)和45%(Cry1的)序列同一性，参见“Revision of theNomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins,”N.Crickmore,D.R.Zeigler,J.Feitelson,E.Schnepf，J.Van Rie,D.Lereclus,J.Baum,和D.H.Dean.Microbiology and Molecular Biology Reviews(1998)Vol 62:807-813。这些截断值(cut offs)也可仅应用于核心毒素。
本领域的技术人员应当显而易见，编码活性毒素的基因可以通过多种手段鉴定和获得。本文例示的特定基因或基因部分可从在培养物保藏中心保藏的分离物获得。这些基因或其部分或变体也可以通过例如使用基因合成仪合成构建。基因的变异可以使用用于制备点突变的标准技术容易地构建。另外，这些基因的片段可使用商业上可获得的外切核酸酶或内切核酸酶根据标准的程序进行制备。例如，可以使用酶如Bal31或定点诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。编码活性片段的基因也可使用多种限制酶获得。可以使用蛋白酶直接获得这些蛋白毒素的活性片段。
保留例示的毒素的杀虫活性的片段和等价物也在本发明的范围内。另外，由于遗传密码的冗余性，多种不同的DNA序列可编码本文公开的氨基酸序列。本领域的技术人员完全可以生成这些编码相同的或者基本上相同的毒素的可替换的DNA序列。这些变体DNA序列也在本发明的范围内。如本文所使用的，“基本上相同的”序列是指具有不会实质上影响杀虫活性的氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。编码保留了杀虫活性的蛋白的基因片段也包括在这个定义内。
另一种用于鉴定根据本发明有用的编码毒素的基因和基因部分的方法是通过使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列可以通过用合适的标记加以检测或者可制成固有地发荧光，如国际申请No.WO93/16094中所述。如本领域众所熟知的，如果探针分子与核酸样品通过在两分子之间形成强键而杂交，则有理由假定，探针和样品具有相当的同源性。优选地，杂交通过本领域众所周知的技术在严格条件下进行，如例如在Keller，G.H.,M.M.Manak(1987)DNA Probes,Stockton Press,New York,N.Y.,pp.169-170中所述。盐浓度和温度组合的一些实例如下(按照严格性增强的顺序)：2X SSPE或SSC在室温；1X SSPE或SSC在42℃；0.1X SSPE或SSC在42℃；0.1X SSPE或SSC在65℃。探针的检测提供了一种用已知的方式确定杂交是否发生的方法。这种探针分析提供了用于鉴定本发明毒素编码基因的快速方法。根据本发明用作探针的核苷酸区段可以用DNA合成仪和标准的步骤合成。这些核苷酸序列也可以用作PCR引物以扩增本发明的基因。
变体毒素。本文特别例示了本发明的某些毒素。因为这些毒素仅仅是本发明毒素的实例，因此应当显而易见，本发明包括具有与例示毒素相同或相似杀虫活性的变体或等价毒素(和编码等价毒素的核苷酸序列)。等价毒素与例示毒素具有氨基酸同源性。该氨基酸同源性通常为大于75％，优选大于90%，最优选大于95%。氨基酸同源性在毒素的关键区域最高，所述关键区域决定其生物活性或者涉及最终负责生物活性的三维构型的确定。在此方面，某些氨基酸取代是可以接受的，并且如果这些取代位于对于活性非关键的区域内或者是不影响分子三维构型的保守氨基酸取代的话，其是可以预期的。例如，氨基酸可以在下面的分类中被替换：非极性、极性不带电荷、碱性和酸性。只要取代不会实质改变化合物的生物活性，一个类型的氨基酸被相同类型的另一种氨基酸代替的保守取代就属于本发明的范围。下面是属于每种类型的氨基酸的实例的列表。
  氨基酸类型   氨基酸实例
  非极性   Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Met,Phe,Trp
  极性不带电荷   Gly,Ser,Thr,Cys,Tyr,Asn,Gln
  酸性   Asp,Glu
  碱性   Lys,Arg,His
在一些情况下，也可以进行非保守取代。关键的因素是这些取代不会显著降低毒素的生物活性。
重组宿主。编码本发明毒素的基因可以被引入到很多种微生物或植物宿主内。毒素基因的表达直接或间接地导致细胞内产生和保持杀虫剂。交配转移和重组转移可用于产生表达本发明两种毒素的Bt株。其它的宿主生物体也可以用一种或两种毒素基因转化，然后用于实现协同效应。通过合适的微生物宿主例如假单胞菌属(Pseudomonas)，可以将微生物施加到害虫位置，并在那里增殖和被摄取。结果是控制害虫。可选择地，具有毒素基因的微生物可以在使毒素的活性延长并使细胞稳定的条件下被处理。然后将保留毒性活性的经处理的细胞施加到靶害虫的环境中。
当藉由合适的载体将Bt毒素基因引入到微生物宿主中，并将所述宿主以存活状态施加于环境时，重要的是应使用某些宿主微生物。选择已知占据一种或多种目标作物的“植物圈”(叶面(phylloplane)、叶围(phyllosphere)、根围(rhizosphere)和/或根面(rhizoplane))的微生物宿主。选择这些微生物使得能够与野生型微生物成功地竞争特定的环境(作物或其它昆虫栖息地)，以提供稳定地保持和表达可表达多肽杀虫剂的基因，并且理想地，提供使杀虫剂免于环境降解和失活的改进的保护。
已知大量的微生物在多种重要作物的叶面(植物叶子的表面)和/或根围(围绕植物根系的土壤)栖息。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物，如细菌例如假单胞菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单孢菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单细胞属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilius)、土壤杆菌属(Agrobactenum)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串球菌属(Leuconostoc)和产碱菌属(Alcaligenes)；真菌，特别是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。特别感兴趣的是如下的植物圈细菌物种，如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋酸杆菌(Acetobacter xylinum)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、浑球红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单孢菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱菌(Alcaligenes entrophus)和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandii)；和植物圈酵母物种，如深红酵母(Rhodotorula rubra)、粘红酵母(R.Glutinis)、海洋红酵母(R.Marina)、橙红酵母(R.aurantiaca)、浅白隐球菌(Cryptococcus albidus)、流散隐球菌(C.diffluens)、罗伦特隐球菌(C.Laurentii)、罗斯酵母(Saccharomycesrosei)、有孢酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、玫瑰掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香味掷孢酵母(S.odorus)、维罗纳克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)和出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)。特别感兴趣的是染色的微生物(pigmented microorganisms)。
可以获得大量的方法用于将编码毒素的Bt基因在允许所述基因稳定保持和表达的条件下引入到微生物宿主中。这些方法是本领域技术人员众所周知的，并且例如在美国专利No.5,135,867中描述，该专利通过提述并入本文。
细胞的处理。可以对表达Bt毒素的苏云金芽孢杆菌或重组细胞进行处理以延长毒素活性和稳定细胞。在将所形成的杀虫微囊施于靶害虫的环境时，所述微囊将Bt毒素包含于已稳定化的细胞结构内并保护所述毒素。合适的宿主细胞可以包括原核生物或真核生物，通常被限制于那些不会对高等生物如哺乳动物产生实质毒性的细胞。然而，当毒性物质不稳定或者施加水平足够低以至可以避免对哺乳动物宿主的任何可能的毒性时，也可以使用会产生对高等生物有毒性的物质的生物。作为宿主，特别感兴趣的是原核生物和低等真核生物，如真菌。
尽管在一些情况下可以采用孢子，但是在处理时，细胞通常是完整的并且基本上处于可增殖的形式，而不是处于孢子形式。
微生物细胞(例如含有B.t.毒素基因的微生物)的处理可以通过化学或物理手段进行，或者通过化学和/或物理手段的组合进行，只要该技术不会有害地影响毒素的性质并且不会消除细胞保护毒素的能力即可。化学试剂的实例是卤化剂，特别是原子序号17-80的卤素。更特别地，碘可以在温和的条件下使用足够长的时间以获得期望的结果。其它合适的技术包括醛处理，如戊二醛；抗感染剂处理，如氯化苯甲烃铵(zephiran chloride)和氯化十六烷吡啶(cetylpyridiniumchloride)；醇处理，如异丙醇和乙醇；多种组织固定剂处理，如Lugol碘、布安氏固定剂(Bouin’s fixative)、多种酸和海利氏固定剂(Helly’s fixative)(参见：Humason,Gretchen L.,Animal Tissue Techniques,W.H.Freeman and Company,1967)；或物理(加热)和化学剂的组合，它们在把细胞施加于宿主环境时可以保留和延长细胞内产生的毒素的活性。物理手段的实例为短波辐射，如γ-辐射和X-辐射、冷冻、UV照射、冷冻干燥等。用于处理微生物细胞的方法在美国专利No.4,695,455和4,695,462中公开，所述专利通过提述并入本文。
细胞一般具有更强的结构稳定性，可提高对环境条件的抗性。当杀虫剂处于原型(proform)时，所选的细胞处理方法应当不抑制杀虫剂被靶害虫病原体从原型加工成成熟形式。例如，甲醛会交联蛋白质并可抑制多肽杀虫剂原型的加工。处理的方法应当能够保留至少相当部分的毒素的生物可用性或生物活性。
出于生产目的在选择宿主细胞时特别感兴趣的特征包括将B.t.基因引入宿主的便宜性，表达系统的可用性，表达效率，杀虫剂在宿主体内的稳定性，和附加遗传能力的存在性。用作杀虫剂微囊的感兴趣特征包括对杀虫剂的保护质量，如厚细胞壁、染色和细胞内包装或形成包涵体；在含水环境中的存活；缺乏哺乳动物毒性；吸引害虫摄食；容易杀死和固定而不会伤害毒素；等等。其它的考虑包括配制和操作的便宜性、经济性、储存稳定性等。
细胞生长。含有B.t.杀虫基因的细胞宿主可以在任何常规的营养培养基中生长，其中DNA构建体提供选择优势，提供选择性培养基使得基本上全部或者全部的细胞保留B.t.基因。然后可以根据常规方法收获这些细胞。可选择地，细胞可以在收获之前被处理。
产生本发明毒素的B.t.细胞可以用标准技术培养基和发酵技术培养。当完成发酵循环时，可以首先通过本领域众所周知的手段将B.t.孢子和结晶与发酵液分离来收获细菌。回收的B.t.孢子和结晶可以通过添加表面活性剂、分散剂、惰性载体和其它有利于操作和施用于特定靶害虫的组分配制成可润湿的粉末、液体浓缩物、颗粒或其它配制物。这些配制物和施用步骤是本领域众所周知的。
配制物。含有引诱剂和B.t.分离物孢子、结晶和毒素的配制的诱饵颗粒，或者含有可以从本文公开的B.t.分离物中获得的基因的重组微生物，可施于土壤。配制的产品也能够作为种子包被或根处理或全植物处理在作物周期(cropcycle)的晚期施加。B.t.细胞的植物和土壤处理可以作为可润湿的粉末、颗粒或尘埃通过与多种惰性材料混合而加以利用，所述惰性材料如无机矿物质(层状硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物材料(粉末状玉米穗轴、稻壳、核桃壳等)。配制物可以包括展布剂-粘着剂佐剂(spreader-sticker adjuvant)、稳定剂、其它杀虫添加剂或表面活性剂。液体配制物可为基于水的或非水的，并作为泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化的浓缩物等利用。成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。
本领域的技术人员会意识到，杀虫剂浓度可以变化很大，取决于特定制剂的性质，特别是它是否是浓缩的或者是否直接使用。杀虫剂以按重量计至少1%存在，并可为按重量计100%。干燥配制物中具有按重量计约1-95%的杀虫剂，而液体配制物一般为在液相中按重量计约1-60%的固体。配制物一般具有大约102-大约104个细胞/mg。这些配制物以每公顷大约50mg(液体或固体)至1kg或者更多施用。
所述配制物可通过喷雾、扬尘、撒布(sprinkling)等向鳞翅类害虫的环境(例如叶子或土壤)中施加。
植物转化。用于产生本发明杀虫蛋白的优选重组宿主是转化的植物。编码如本文公开的Bt毒素蛋白的基因可以用多种本领域众所周知的技术插入植物细胞。例如，可以获得大量含有在大肠杆菌中的复制系统和允许选择转化细胞的标记的克隆载体，用于将外源基因插入高等植物。所述载体包括例如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，具有编码Bt毒素蛋白序列的DNA片段可在合适限制位点插入所述载体。最终的质粒可用于转化入大肠杆菌(E.Coli)。大肠杆菌细胞在合适的营养介质中培养，然后收获和裂解。回收质粒。作为分析方法，通常进行序列分析、限制分析、电泳和其它生物化学-分子生物学方法。在每个操作后，可以将所用的DNA序列切割并连接到下一个DNA序列。每个质粒序列可以克隆于相同和其它的质粒中。根据将期望基因插入植物的方法，其它的DNA序列可为必需的。如果例如使用Ti或Ri质粒用于转化植物细胞，那么至少Ti或Ri质粒T-DNA的右边界，但常常是左右两个边界，必须连接作为待插入基因的侧翼区。用于转化植物细胞的T-DNA的使用已经被广泛研究，并充分描述于EP 120516,Lee和Gelvin(2008),Hoekema(1985),Fraley等(1986),和An等(1985)中有，并且在本领域已经被良好建立。
一旦所插入的DNA被整合于植物基因组中，就会相对稳定。转化载体通常含有选择标记，其赋予转化的植物细胞对杀生物剂或抗生素(如双丙氨磷、卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素等)的抗性。因此，单独使用的标记应当允许选择转化的细胞，而非不含插入DNA的细胞。
大量的技术可用于将DNA插入植物宿主细胞。这些技术包括使用根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂的T-DNA转化、融合、注射、生物射弹(biolistics)(微粒子轰击)或电穿孔以及其它可能的方法。如果使用土壤杆菌转化，则待插入的DNA必须被克隆入特殊的质粒，即克隆入中间载体或者克隆入二元载体中。中间载体可以通过同源重组整合入Ti或Ri质粒，归因于与T-DNA中的序列同源的序列。Ti或Ri质粒还包括T-DNA转移必需的vir区(vir region)。中间载体自身在土壤杆菌中不能复制。中间载体可以通过辅助质粒(接合)转移到根癌土壤杆菌中。双元载体自身能够在大肠杆菌和土壤杆菌属中复制。它们包括选择标记基因和被T-DNA左右边界区框定的接头或多接头。它们能够被直接转化进入土壤杆菌属(Holsters等,1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌属包括携带致病区的质粒。该致病区是将T-DNA转移入植物细胞所必需的。可以含有额外的T-DNA。使用如此转化的细菌转化植物细胞。可以有利地用根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌培养植物外植体，用于将DNA转入植物细胞。然后在含有用于筛选的杀生物剂或抗生素的合适培养基中从感染的植物材料(例如叶片、茎杆区段、根，还有原生质体或悬浮培养的细胞)再生整个植物。然后测试如此获得的植物是否存在插入的DNA。在注射和电穿孔的情况中，对质粒没有特殊的要求。可以使用普通的质粒，例如pUC衍生物。
被转化的细胞以通常的方式在植物内生长。它们能够形成生殖细胞并将转化的性状传递到后代植物。这些植物可以正常的方式生长并与具有相同转化遗传因子和其它遗传因子的植物杂交。所得的杂交个体具有相应的表型特征。
在本发明的一个优选实施方案中，用其中密码子选择已对植物进行优化的基因转化植物。参见，例如美国专利No.5,380,831，其通过提述并入本文。虽然本文例示了一些截短的毒素，但是在Bt领域中众所周知的是，130kDa型(全长)毒素具有作为核心毒素的N端半部和作为原毒素“尾”的C端半部。因此，适当的“尾”可与本发明的截短/核心毒素一起使用。参见，例如美国专利No.6,218,188和美国专利No.6,673,990。此外，用于生成在植物中使用的合成Bt基因的方法是本领域已知的(Stewart和Burgin,2007)。优选的转化植物的一个非限制性实例是能育的玉米植物，其包含编码Vip3Ab蛋白的植物可表达基因，并进一步包含编码Cry1Ca蛋白的第二植物可表达基因。
将Vip3Ab-和Cry1Ca-确定的性状转移(或渐渗)到近交(inbred)玉米种系中可以通过轮回选择育种，例如通过回交实现。在这种情况下，期望的轮回亲本首先与携带赋予Vip3Ab-和Cry1C-确定的性状的合适基因的近交供体(非轮回亲本)杂交。然后将该杂交的后代与轮回亲本回交，其后选择所得后代的从非轮回亲本转移来的期望性状。在与轮回亲本回交3个，优选4个，更优选5个或更多个世代并对期望性状进行选择后，后代在控制被转移性状的座位(loci)处是杂合体，但在大多数或者基本上全部的其它基因处则与轮回亲本相似(参见，例如Poehlman & Sleper(1995)Breeding Field Crops,第4版,172-175;Fehr(1987)Principles of Cultivar Development,第1卷:Theory and Technique,360-376)。
昆虫抗性管理(IRM)策略。例如Roush等概述了(outline)双毒素策略，也称作“锥形”或“混杂”，用于管理杀虫转基因作物。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353,1777-1786)。美国环境保护局在其网站上(epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)公布了如下的要求，要求提供非转基因(即，非B.t.)避难所(非Bt作物/谷物的部分(section))用于与可产生针对靶害虫的单一Bt蛋白活性的转基因作物一起使用。
“针对抗玉米螟Bt(Cry1Ab和Cry1F)谷物/玉米产品的具体结构要求(structured requirement)如下：
结构避难所：
在谷物/玉米带中，20%非鳞翅类Bt谷物/玉米避难所
在棉花带中，50%非鳞翅类Bt避难所
块状地(blocks)
内部(即在Bt田地内)
外部(即Bt田地1/2英里(如果可能1/4英里)内的分离田地使随机配合最大化)
田地内的条带
条带必须至少4行宽(优选6行)以降低幼虫运动效应”。
此外，美国玉米生产者协会在其网站上(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)也提供了关于避难所要求的相似指导。例如：
“玉米螟IRM的要求：
-(避难所)种植在至少20%的玉米田亩以避免杂交
-在产棉区，避难所必须为50%
-(避难所)必须种植在避免杂交的1/2英里内
-避难所可以在Bt田内成条状种植；避难所条带必须至少4行宽
-只有对于靶昆虫达到了经济阈值时才可以用常规的杀虫剂处理避难所
-基于Bt的可喷洒杀虫剂不能用在避难所玉米上
-在每一块具有Bt玉米的农场上必须种植适当的避难所”
如Roush等所述(例如在1780和1784页右栏)，将均对靶害虫有效并且没有或者仅有很少交叉抗性的两种不同蛋白混杂或锥形混杂，可允许使用更小的避难所。Roush建议，对于成功的混杂，小于避难所10%的避难所尺寸可以提供与对于单一(非锥形混杂)性状大约50%避难所相当的抗性管理。对于目前可以获得的锥形混杂的Bt谷物/玉米产物，美国环境保护局要求所种植的非Bt谷物/玉米的结构避难所(一般5%)显著小于对单一性状产物的要求(一般20%)。
存在提供避难所的IRM效果的多种方法，包括田地内的多种几何种植模式(如上所述)和包装好(in-bag)的种子混合物，如Roush等(前文)和美国专利No.6,551,962中进一步讨论的。
上面的百分比或者相似的避难所比例可用于本双重或三重混杂或锥形混杂。对于具有针对单一靶害虫的三个作用位点的三重混杂，目标是零避难所(或者例如少于5%的避难所)。这对于商业田亩，例如超过10英亩的商业田亩，是特别真实的。
本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物通过提述以其全部内容并入，其程度为它们与本说明书的明确教导没有不一致。
除非特别指出或暗示，如本文所使用的，术语“一”、“一个”和“该”的意思是“至少一个”。
下面是说明实施本发明的步骤的实施例。这些实施例不应当认为是限制性的。除非另外指出，所有的百分比为按重量计，所有的溶剂混合物比例为按体积计。所有的温度为摄氏度。
实施例
实施例1-Vip3Ab和Cry1Ca蛋白的产生和胰蛋白酶处理
在荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)表达菌株中表达编码Cry1Ca和Vip3Ab1原毒素的基因，并将全长蛋白作为不溶性包涵体加以分离。通过在含有20mM CAPS缓冲液,pH 11,+10mM DDT,+0.1%2-巯基乙醇的缓冲液中在37°C搅拌2hr来溶解经洗涤的包涵体。所述溶液在37°C以27,000x g离心10min，并用0.5%(w/v)TCPK处理的胰蛋白酶(Sigma)处理上清液。该溶液在室温再混合温育1h，过滤，然后加载到用20mM CAPS pH 10.5平衡的PharmaciaMono Q 1010柱上。在用2倍柱体积的缓冲液洗涤加载的柱之后，用20mMCAPS中的线性梯度0-0.5M NaCl在15个柱体积中以1.0ml/min的流速洗脱截短的毒素。纯化的胰蛋白酶截短的Cry蛋白在大约0.2-0.3M NaCl洗脱。蛋白的纯度通过SDS PAGE并用Coomassie亮蓝染料可视化来检查。在一些情况下，将合并的纯化毒素的级分进行浓缩并加载到Superose 6柱(直径1.6cm,长60cm)上，并通过大小排阻层析进一步加以纯化。将包含单体(monomeric)分子量的单峰的级分合并并浓缩，得到具有大约60,000kDa的分子量的蛋白的超过95%同质的(homogeneous)制备物。
Vip3Ab1的处理用相似的方式实现，以纯化的全长85kDa蛋白(DIG-307)开始。将蛋白(12mg)透析入50mM磷酸钠缓冲液pH 8.4中，然后通过添加1mg固体胰蛋白酶并在室温温育1hr进行处理。将溶液加载到MonoQ阴离子交换柱(直径1cm，长10cm)上，并用20mM磷酸钠缓冲液pH8.4中0-500mM NaCl的线性梯度洗脱超过7个柱体积。蛋白的洗脱通过SDS-PAGE监测。如通过SDS-PAGE使用分子量标准用于比较所确定的，主要处理条带具有65kDa的分子量。
实施例2-Cry1Ca核心毒素蛋白的碘化
尽管在所选的少数几个实例中，Cry1Ca可以被放射性标记并且在受体结合测定中能够良好地发挥功能，但是先前工作表明，Cry1Ca非常难以用传统方法进行放射性标记。我们决定使用125I放射性标记的荧光素-5-马来酰亚胺(fluorescein-5-maleimide)对Cry1Ca进行放射性标记，这是一种已经用于活性放射性标记Cry1Fa的方法(Prov.69919)。荧光素-5-马来酰亚胺的碘化和随后该放射性标记的化学品与Cry1Ca的缀合导致蛋白的半胱氨酸特异性地放射性标记。因此，这种标记程序在所标记残基处是高度特异性的。Cry1Ca核心毒素区段(残基29-619)含有两个半胱氨酸氨基酸残基，在位置210和438。Palmer等(1997)证明，荧光素-5-马来酰亚胺的苯环可被放射性碘化，然后与含有巯基(例如，如通过游离半胱氨酸残基所提供的)的蛋白反应，导致蛋白中的游离半胱氨酸的烷基化，从而提供放射性标记的蛋白质。胰蛋白酶截短的Cry1Ca核心毒素含有两个半胱氨酸残基，因此为在这两个(特异性)位点将蛋白放射性标记和烷基化提供了底物。
将荧光素-5-马来酰亚胺(F5-M)溶解于DMSO(二甲基亚砜)中至10mM，然后在磷酸缓冲盐水(PBS;20mM磷酸钠,0.15M NaCl,pH7.5)中稀释到1mM，如通过F 5-M的摩尔消光系数(68,000M-1cm-1)所确定的。在铅屏蔽之后向含有2个Pierce Iodination Bead (Thermo Fisher Scientific)的100μL PBS溶液中添加1.0mCi Na125I。将溶液在室温混合5min，然后添加10μL 1mMF 5-M溶液。反应10min后，用移取从碘化反应移出溶液，并向所述溶液添加2μg溶于PBS中的高度纯化的胰蛋白酶截短的Cry1Ca核心毒素蛋白。蛋白与碘化的F 5-M溶液在4°温育48hr，此时通过添加β-巯基乙醇至14mM的终浓度终止反应。将反应混合物添加于在20mM CAPS,150mM KCl,pH9中平衡的ZebraTM旋转柱(Invitrogen)，在1500x g离心2min以将未反应的碘化染料与蛋白分离。125I放射性标记的荧光素-Cry1Ca核心毒素蛋白在γ计数器中计数以确定其比放射性(specific radioactivity)，假定输入毒素蛋白的回收率为80%。
放射性标记的Cry1Ca核心毒素蛋白的比活性为大约6.8μCi/μg蛋白。放射性标记的蛋白还通过SDS-PAGE表征并通过磷光成像显现，以验证所测得的放射性与Cry1Ca核心毒素蛋白共价相联。Coomassie染色的SDS-PAGE凝胶通过将它们包覆于Mylar膜(12μm厚)中并将其在分子动力学储存荧光屏(Molecular Dynamics storage phosphor screen)(35cm x 43cm)(Sunnyvale,CA)下曝光1小时来成像。平板用分子动力学Storm 820磷光成像仪(MolecularDynamics Storm 820phosphorimager)显影，并用ImageQuantTM软件对图像进行分析。在Cry1Ca核心毒素蛋白条带颇下面一些的凝胶区中(即比Cry1Ca核心毒素蛋白更小的片段，尺寸为大约10kDa或更小)可以检测到一些放射性。这些放射性污染很可能代表由于用于将蛋白切割为其核心结构的胰蛋白酶的作用可与截短的Cry1Ca蛋白相联的小肽。
实施例3-Cry1Ca和Vip3Ab核心毒素蛋白与来自秋粘虫(S.frugiperda) 的BBMVs的竞争性结合测定法
同源和异源竞争结合测定法用150μg/mL BBMV蛋白和2nM的125I-放射性标记的Cry1Ca核心毒素蛋白进行。添加到反应混合物的同源竞争性非放射性标记的Cry1Ca核心毒素蛋白的浓度为0.1,1,10,100和1000nM。异源胰蛋白酶截短的Vip3Ab蛋白在10和1,000nM进行测试，所述蛋白与放射性的Cry1Ca核心毒素蛋白同时添加以确保真实的结合竞争。温育在28°进行1hr。通过将BBMV混合物以16,000x g离心8min并从所得的沉淀移出上清而将未结合于BBMV’s的(即，没有与昆虫受体蛋白结合的)125I-标记的Cry1Ca核心毒素蛋白的量与结合的蛋白分离。沉淀用冰冷的结合缓冲液(PBS;11.9mMNa2HPO4,137mM NaCl,2.7mM KCl,pH7.4加0.1%牛血清白蛋白;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)洗涤三次以完全除去任何残余的未结合的125I标记的Cry1Ca。将离心管底部切下，并将此部分中所含的蛋白沉淀置于13x 100mm玻璃培养管中，并在γ计数器中计数10分钟以获得沉淀级分中含有的结合放射性的量。结合蛋白级分中放射性的量提供了与昆虫受体结合(总结合)的Cry蛋白的量的指示。非特异性结合用在1,000nM的非放射性标记的Cry1Ca核心毒素蛋白存在下沉淀中获得的计数表示。与BBMV特异性结合(特异性结合)的放射性标记的Cry1Ca的量通过用总结合水平减去非异性结合加以测量。在没有任何竞争者Cry1Fa核心毒素蛋白存在下的结合量被认为是百分之百的总结合。数据表示为特异性结合的125I Cry1Ca相对于竞争性未标记配体的浓度的百分比。
实施例4-结果的总结
结果(图1)显示，同源未标记的Cry1Ca蛋白可以剂量依赖的方式有效地取代放射性标记的Cry1Ca核心毒素蛋白与BBMV蛋白的特异性结合。Vip3Ab在任何显示的浓度(10或1,000nM)不取代125I标记的Cry1Ca核心毒素蛋白与其受体蛋白的结合。测试的Vip3Ab的最高浓度(1,000nM)为测定法中所用放射性标记的Cry1Ca的浓度的500倍，证明Vip3Ab在秋粘虫BBMV中不与放射性标记的Cry1Ca有效地竞争结合。
图1是125I放射性标记的荧光素-5-马来酰亚胺胰蛋白酶截短的Cry1Ca在来自秋粘虫(FAW)幼虫的BBMV’s中的取代(displacement)的剂量响应曲线。图中显示了未标记的Cry1Ca(●)在0.1-1,000nM的范围内以剂量依赖的方式取代标记的Cry1Ca的能力。该图描绘了特异结合的标记的Cry1Ca (总结合减去非特异性结合)相对于所添加的非放射性标记的配体的浓度的百分比。显示了非放射性标记的Vip3Ab1(▲)在10和1,000nM不能取代特异结合的放射性标记的Cry1Ca。
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附录A
δ-内毒素列表–来自Crickmore等网站(申请中引用)
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1.一种制备杀虫转基因植物细胞的方法，包括将可操作的编码SEQ ID NO: 1的Vip3Ab杀虫蛋白的DNA和编码SEQ ID NO: 2的Cry1Ca杀虫蛋白的DNA导入可再生的植物细胞，并再生能育转基因植物。
2.权利要求1的方法，其中所述杀虫转基因植物细胞选自下组：玉米细胞、大豆细胞和棉花细胞。
3. 权利要求2的方法，其中所述植物细胞是玉米植物细胞。
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