BR112012014803B1 - Métodos de gerenciamento do desenvolvimento de resistência a uma proteína vip3ab ou uma proteína cry1ca por um inseto, de produção de uma célula de planta e de controle de 5 um inseto lagarta-do-cartucho - Google Patents

Abstract

uso de vip3ab em combinação com cry1ca para gerenciamento de insetos resistentes. a presente invenção refere-se a métodos e plantas para o controle de insetos lepidópteros lagarta-do-cartucho, as referidas plantas compreendendo uma proteína inseticida vip3ab e uma proteína inseticida cry1ca, e várias combinações de outras proteínas compreendendo esse par de proteínas, para retardar ou impedir o desenvolvimento de resistência pelos insetos.

Description

Antecedentes da Invenção

Os seres humanos cultivam o milho para aplicações alimentícias e energéticas. Seres humanos também cultivam muitas outras safras, incluindo soja e algodão. Insetos comem e danificam as plantas e, desse modo, minam esses esforços humanos. Bilhões de dólares são gastos por ano para controlar pestes de inseto e bilhões adicionais são perdidos pelo dano que elas causam. Inseticidas químicos orgânicos sintéticos têm sido as ferramentas primárias usadas para controlar pestes de inseto, mas inseticidas biológicos, tais como as proteínas inseticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt), têm exercido um papel importante em algumas áreas. A capacidade de produzir plantas resistentes a inseto mediante transformação com genes de proteína inseticida Bt tem revolucionado a agricultura moderna e destacado a importância e valor de proteínas inseticidas e seus genes.

Várias proteínas Bt têm sido usadas para criar as plantas trans- gênicas resistentes a inseto que foram registradas e comercializadas com sucesso até o momento. Essas incluem Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F e Cry3Bb em milho, Cry1Ac e Cry2Ab em algodão e Cry3A em batata.

Os produtos comerciais que expressam essas proteínas expressam uma única proteína, exceto em casos onde o espectro inseticida combinado de 2 proteínas é desejado (por exemplo, Cry1Ab e Cry3Bb em milho combinadas para conferir resistência à pestes de lepidópteros e crisomelí- deo, respectivamente) ou onde a ação independente das proteínas as tornam úteis como uma ferramenta para retardar o desenvolvimento de resistência em populações de inseto suscetíveis (por exemplo, Cry1Ac e Cry2Ab em algodão combinadas para conferir gerenciamento de resistência à lagarta do tabaco). Vide também Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2009/0313717, a qual refere-se a uma proteína Cry2 mais uma Vip3Aa, Segue-se folha 1 a/50 Cry1F ou Cry1A para o controle de Helicoverpa zea ou armigerain. O docu-trole de Spodoptera frugiperda. A Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2008/031 1096 refere-se, em parte, à CrylAb para o controle de ECB resistente à Cry1F.

Isto é, algumas das qualidades de plantas transgênicas resisten- 5 tes a inseto que levaram à adoção rápida e disseminada dessa tecnologia também deram origem à preocupação de que as populações de pestes desenvolverão resistência às proteínas inseticidas produzidas por essas plantas. Várias estratégias foram sugeridas para preservar a utilidade de traços de resistência a inseto baseada em Bt, os quais incluem emprego de proteí- 10 nas em uma alta dose em combinação com uma proteção e alternando com ou co-empregando diferentes toxinas (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management", Nature Biotechnol. 16: 144-146).

As proteínas selecionadas para uso em uma pilha de gerencia-mento de resistência a inseto (Insect Resistant Management - IRM) precisam 15 exercer seu efeito inseticida independentemente, de modo que a resistência desenvolvida a uma proteína não venha a conferir resistência à segunda proteína (isto é, não haja resistência cruzada às proteínas). Se, por exemplo, uma população de peste que é resistente à "Proteína A" é sensível à "Proteína B", se pode concluir que não há resistência cruzada e que uma combi- 20 nação de Proteína A e Proteína B seria eficaz para retardar a resistência à Proteína A apenas.

Na ausência de populações de inseto resistentes, avaliações podem ser feitas com base em outras características que se presume estarem relacionadas ao mecanismo de ação e potencial de resistência cruzada.

A utilidade de ligação mediada por receptor na identificação de proteínas inseticidas que provavelmente não exibem resistência cruzada foi sugerida (van Mellaert et al. 1999). O fator de previsão chave de falta de resistência cruzada inerente nessa abordagem é que as proteínas inseticidas não com-petem pelos receptores em uma espécie de inseto sensível.

No caso em que duas toxinas Bt competem pelo menos receptor, então, se esse receptor sofre mutação, de modo que uma das toxinas não se liga mais a esse receptor e, assim, não é mais inseticida contra o in-seto, este poderia ser o caso onde o inseto também seria resistente à segunda toxina (a qual se liga competitivamente ao mesmo receptor). Isto é, o inseto é dito como tendo resistência cruzada a ambas as toxinas Bt. Contudo, se duas toxinas se ligam a dois receptores diferentes, isso poderia ser 5 uma indicação de que o inseto não seria simultaneamente resistente a essas duas toxinas.

Por exemplo, a proteína Cry1 Fa é útil no controle de muitas pestes de espécies lepidópteras, incluindo a broca do milho Europeu (ECB; Os- trinia nubilalis (Hubner)) e a lagarta-do-cartucho (FAW; Spodoptera frugiper- da) e é ativa contra a broca da cana-de-açúcar (SCB; Diatraea saccharalis). A proteína CrylFa, conforme produzida em plantas de milho transgênicas contendo o evento TCI 507, é responsável por um traço de resistência a in-seto sem paralelo na indústria para controle de FAW. CrylFa é ainda em-pregada nos produtos Herculex®, Smarts tax™ e WideStrike™.

Toxinas Cry adicionais são listadas no website do Official B.t.

Nomenclature Committee (Crickmore et al.', lifes- ci.sussex.ac.uk/homeZNeil_Crickmore/St/). Existem atualmente quase 60 grupos principais de toxinas "Cry" (Cry1-Cry59), com toxinas Cyt e toxinas VIP adicionais e semelhantes. Muitos de cada grupo numérico têm subgru- 20 pos em letra maiúscula e os subgrupos em letra maiúscula têm subgrupos em letra minúscula (Cry 1 tem A-L e Cry1 A tem a-i, por exemplo).

Breve Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se, em parte, ao uso de uma proteína Vip3Ab em combinação com uma proteína CrylCa. Plantas (e os acres plantados com tais plantas) que produzem ambas essas proteínas estão in-cluídas dentro do escopo da presente invenção.

A presente invenção refere-se, em parte, à surpreendente des-coberta de que a Vip3Ab não compete com a CrylCa pelos sítios de ligação no intestino da lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda; FAW).

A presente invenção refere-se também, em parte, à pilhas triplas ou "pirâmides" de três (ou mais) toxinas, com Vip3Ab e CrylCa sendo o par de base. Em algumas modalidades de pirâmide preferidas, a combinação das toxinas selecionadas confere ação de resistência não cruzada contra FAW. Algumas combinações de pirâmide com "três locais de ação" preferidas incluem o par de base de proteínas em questão mais CrylFa, CrylDa, CrylBe ou Cry1E como a terceira proteína para objetivação de FAW. Essas 5 pilhas triplas particulares proporcionariam, vantajosa e surpreendentemente, de acordo com a presente invenção, três locais de ação contra FAW. Isso pode ajudar a reduzir ou eliminar o requisito de acres de proteção.

Toxinas/genes adicionais podem também ser adicionados de acordo com a presente invenção. Por exemplo, se Cry1 Fa ou Cry1 Be são 10 empilhadas com o par de proteínas em questão (CrylFa e CrylBe são ambas ativas contra FAW e broca do milho Europeu (ECB)), a adição de duas proteínas adicionais a essa pilha tripla, em que as duas proteínas adiciona- idas objetivam ECB, proporcionaria três locais de ação contra FAW e três locais de ação contra ECB. Essas duas proteínas adicionadas (as quarta e 15 quinta proteínas) poderiam ser selecionadas do grupo consistindo de Cry2A, Cry11, DIG-3 e CrylAb. Isso resultaria em uma pilha de cinco proteínas tendo três locais de ação contra dois insetos (ECB e FAW).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se, em parte, à surpreendente des- 20 coberta de que a Vip3Ab e CrylCa não competem pela ligação uma com a outra no intestino de lagartas-do-cartucho (FAW; Spodoptera frugiperda). Assim, uma proteína Vip3Ab pode ser usada em combinação com uma proteína CrylCa em milho transgênico (e outras plantas; por exemplo, algodão e soja, por exemplo) para retardar ou impedir que a FAW venha a desenvol- 25 ver resistência à qualquer uma dessas proteínas isoladamente. O par de proteínas em questão pode ser eficaz na proteção de plantas (tais como plantas de milhos e/ou plantas de soja) contra dano por lagarta-do-cartucho resistente à Cry. Isto é, um uso da presente invenção é proteger o milho e outras espécies de planta economicamente importantes contra dano e perda 30 de rendimento causados por populações de lagarta-do-cartucho que poderiam desenvolver resistência à Vip3Ab ou CrylCa.

A presente invenção, assim, ensina uma pilha de gerenciamento de resistência a inseto (Insect Resistant Management - IRM) compreendendo Vip3Ab e CrylCa para prevenir ou aliviar o desenvolvimento de resistência pela FAW à qualquer uma ou ambas essas proteínas.

A presente invenção proporciona composições para o controle 5 de pestes de lepidópteros compreendendo células que produzem uma proteína inseticida Vip3Ab e uma proteína inseticida CrylCa.

A invenção ainda compreende um hospedeiro transformado para produzir uma proteína inseticida Vip3Ab e uma proteína inseticida CrylCa, em que o referido hospedeiro é um micro-organismo ou uma célula de plan- 10 ta. O(s) polinucleotídeo(s) em questão está(ão), de preferência, em um cons- truto genético sob o controle de (um) promotor(es) que não é(são) de Bacillus thuríngiensis. Os polinucleotídeos em questão podem compreender uso de códon para expressão intensificada em uma planta.

Adicionalmente, pretende-se que a invenção proporcione um 15 método de controle de pestes de lepidópteros compreendendo contato das referidas pestes ou do ambiente das referidas pestes com uma quantidade eficaz de uma composição que contém uma proteína contendo toxina central Vip3Ab e ainda contém uma proteína contendo toxina central CrylCa.

Uma modalidade da invenção compreende uma planta de milho 20 compreendendo um gene passível de expressão em planta que codifica uma proteína inseticida CrylCa e um gene passível de expressão em planta que codifica uma proteína inseticida Vip3Ab e cultivo de tal planta.

Uma outra modalidade da invenção compreende uma planta de milho em que um gene passível de expressão em planta que codifica uma 25 proteína inseticida CrylCa e um gene passível de expressão em planta que codifica uma proteína inseticida Vip3Ab foram introgredidos na referida planta de milho e cultivo de tal planta.

Conforme descrito nos Exemplos, estudos de ligação competitiva a receptor usando proteína CrylCa radio-rotulada mostram que a proteí- 30 na CrylCa não compete pela ligação em tecidos de FAW aos quais a Vip3Ab se liga. Esses resultados também indicam que a combinação de proteínas Vip3Ab e CrylCa pode ser um meio eficaz para aliviar o desenvolvi mento de resistência em populações de FAW à qualquer uma dessas proteínas. Assim, com base, em parte, nos dados descritos aqui, acredita-se que a co-produção (empilhamento) das proteínas CrylCa e Vip3Ab pode ser usada para produzir uma pilha IRM de alta dose para FAW.

Outras proteínas podem ser adicionadas a esse par. Por exemplo, a presente invenção refere-se também, em parte, à pilhas triplas ou "pi-râmides" de três (ou mais) toxinas, com Vip3Ab e Cry1 Ca sendo o par de base. Em algumas modalidades de pirâmide preferidas, as toxinas selecionadas têm três locais de ação distintos contra FAW. Algumas combinações 10 de pirâmide com "três locais de ação" preferidas incluem o par de base de proteínas em questão mais CrylFa, CrylDa, CrylBe ou Cry1E como a terceira proteína para objetivação de FAW. Por "locais de ação distintos", entenda-se que qualquer uma das dadas proteínas não causam resistência cruzada uma contra a outra. Essas pilhas triplas particulares proporcionari- 15 am, vantajosa e surpreendentemente, de acordo com a presente invenção, três locais de ação contra FAW. Isso pode ajudar a reduzir ou eliminar o requisito de acres de proteção.

Com relação a algumas modalidades específicas da presente in-venção, nós mostramos que uma população de FAW resistente à atividade 20 inseticida da proteína Cry1 Fa não é resistente à atividade inseticida da proteína Vip3Ab ou à atividade inseticida da proteína CrylCa. Nós demonstramos que a CrylCa não compete pelos sítios de ligação com a CrylFa e que a Vip3Ab não compete pelos sítios de ligação com a Cry1 Fa no intestino de FAW. Vide documento USSN 61/284.281 (depositado em 16 de Dezembro 25 de 2009) referente à CrylFa e CrylCa e Pedido PCT concorrentemente depositado intitulado "COMBINED USE OF Vip3Ab AND CRYIFa FOR MANAGEMENT OF RESISTANT INSECTS").

Assim, os pares de toxinas CrylFa mais Vip3Ab e CrylFa mais CrylCa em questão conferem ação de resistência não cruzada contra FAW.

A incapacidade da Vip3Ab1 de competir pela ligação com CrylCa no intestino de FAW demonstra que essas três toxinas de proteína (Cry1 Fa, Vip3Ab e CrylCa) representam uma pirâmide em pilha tripla de toxinas Cry que pro-porciona três interações de local alvo distintas no intestino de FAW. Essas pilhas triplas particulares, vantajosa e surpreendentemente, de acordo com a presente invenção, conferem ação de resistência não cruzada contra FAW. Além disso, ao demonstrar que essas três proteínas não competem umas . 5 com as outras, aqueles versados no campo reconhecerão que isso pode ajudar a reduzir ou eliminar o requisito de acres de proteção. Com o benefí-cio da presente divulgação, plantas que expressam a combinação tripla de CrylFa, Vip3Ab e CrylCa, serão úteis para retardar ou prevenir o desenvolvimento de resistência, em FAW, a uma única ou uma combinação dessas 10 proteínas.

Toxinas/genes adicionais podem também ser adicionados de acordo com a presente invenção. Por exemplo, se Cry1 Fa ou Cry1 Be são empilhadas com o par de proteínas em questão (Cry1 Fa e Cry1 Be são ambas ativas contra FAW e broca do milho Europeu (ECB)), a adição de duas 15 proteínas adicionais a essa pilha tripla, em que as duas proteínas adicionadas objetivam ECB, proporcionaria três locais de ação contra FAW e três locais de ação contra ECB. Essas duas proteínas adicionadas (as quarta e quinta proteínas) poderiam ser selecionadas do grupo consistindo de Cry2A, Cry11, DIG-3 (vide Pedido de Patente U.S. N° de Série 61/284.278 (deposi- tado em 16 de Dezembro de 2009) e documento US 2010 00269223) e CrylAb. Isso resultaria em uma pilha de cinco proteínas tendo três locais de ação contra dois insetos (ECB e FAW).

Assim, uma opção de emprego é usar o par de proteínas em questão em combinação com uma terceira toxina/gene e usar essa pilha tri- pia para aliviar o desenvolvimento de resistência, em FAW, à qualquer uma dessas toxinas. Assim sendo, a presente invenção refere-se também, em parte, à pilhas triplas ou "pirâmides" de três (ou mais) toxinas. Em algumas modalidades de pirâmide preferidas, as toxinas selecionadas têm três locais de ação distintos contra FAW.

Incluído dentre as opções de emprego da presente invenção estaria o uso de duas, três ou mais proteínas das proteínas em questão em regiões de crescimento de safras onde FAW pode desenvolver populações resistentes.

Com CrylFa sendo ativa contra FAW e ECB, Vip3Ab mais CrylCa mais CrylFa proporcionariam, vantajosa e surpreendentemente, de acordo com a presente invenção, três locais de ação contra FAW. Isso pode . 5 ajudar a reduzir ou eliminar o requisito de acres de proteção.

CrylFa é empregada nos produtos Herculex®, SmartStax™ e Wides Strike™. O par de genes em questão (Vip3Ab e CrylCa) poderia ser combinado, por exemplo, em um produto de CrylFa, tal como Herculex®, SmartStax™ e WideStrike™. Assim sendo, o par de proteínas em questão 10 poderia ser significativo na redução da pressão de seleção sobre essas e outras proteínas. O par de proteínas em questão poderia, assim, ser usado como nas três combinações gênicas para plantas de milho e outras (algodão e soja, por exemplo).

Conforme discutido acima, toxinas/genes adicionais podem tam- 15 bém ser adicionados de acordo com a presente invenção. Para o uso de Cry1E (para o controle de FAW), vide Pedido de Patente U.S. N° de Série 61/284.278 (depositado em 16 de Dezembro de 2009).

Plantas (e os acres plantados com tais plantas) que produzem qualquer uma das combinações de proteínas em questão estão incluídas 20 dentro do escopo da presente invenção. Toxinas/genes adicionais podem também ser adicionados, mas as pilhas particulares discutidas acima proporcionam, vantajosa e surpreendentemente, múltiplos locais de ação contra FAW e/ou ECB. Isso pode ajudar a reduzir ou eliminar o requisito de acres de proteção. Um campo assim plantado de mais de dez acres está, desse 25 modo, incluído dentro da presente invenção.

O GENBANK pode também ser usado para obter as sequências para qualquer um dos genes e proteínas divulgados ou mencionados aqui. Vide Apêndice A abaixo. Sequências relevantes também estão disponíveis em patentes. Por exemplo, a Patente U.S. No. 5.188.960 e Patente U.S. No. 5.827.514 descrevem proteínas contendo toxina central CrylFa adequadas para uso na realização da presente invenção. A Patente U.S. No. 6.218.188 descreve sequências de DNA otimizadas de planta que codificam proteínas contendo toxina central CrylFa que são adequadas para uso na presente invenção. O documento USSN 61/284.275 (depositado em 16 de Dezembro de 2009) fornece algumas proteínas CrylCa truncadas que podem ser usa-das de acordo com a presente invenção.

Combinações de proteínas descritas aqui podem ser usadas para controlar pestes de lepidópteros. Lepidópteros adultos, por exemplo, bor-boletas e mariposas, se alimentam primariamente do néctar de flores e são um efetuador de polinização significativos. Quase todas as larvas de lepidópteros, isto é, lagartas, se alimentam sobre plantas e muitas são pestes gra- ves. Lagartas se alimentam sobre ou dentro da folhagem ou sobre as raízes ou caule de uma planta, privando a planta de nutrientes e, muitas vezes, destruindo a estrutura de suporte físico da planta. Adicionalmente, lagartas se alimentam sobre os frutos, tecidos e grãos e farinhas armazenadas, arru-inando esses produtos para venda ou diminuindo gravemente seu valor.

Conforme usado aqui, referência à pestes de lepidópteros refere-se a vários estágios de vida da peste, incluindo estágios larvais.

Algumas toxinas quiméricas da presente invenção compreendem uma porção de toxina central N-terminal completa de uma toxina Bt e, em algum ponto além do final da porção de toxina central, a proteína tem uma transição uma sequência de pró-toxina heteróloga. A porção de toxina inseticidamente ativa N-terminal de uma toxina Bt é referida como a toxina "central". A transição do segmento de toxina central para o segmento de pró- toxina heteróloga pode ocorrer aproximadamente na união de toxina/pró- toxina ou, alternativamente, uma porção da pró-toxina nativa (que se esten- de além da porção de toxina central) pode ser retida, com a transição para a porção de pró-toxina heteróloga ocorrendo a jusante.

Como um exemplo, uma toxina quimérica da presente invenção é uma porção de toxina central completa de CrylCa (aproximadamente os primeiros 600 aminoácidos) e/ou uma pró-toxina heteróloga (os aminoácidos restantes até o C-término). Em uma modalidade preferida, a porção de uma toxina quimérica compreendendo a pró-toxina é derivada de uma toxina de proteína CrylAb. Em uma modalidade preferida, a porção de uma toxina quimérica compreendendo a pró-toxina é derivada de uma toxina de proteína CrylAb.

Aqueles versados no campo apreciarão que toxinas Bt, mesmo dentro de uma determinada classe, tal como CrylCa, variarão, até certo . 5 ponto, quanto ao comprimento e a localização precisa da transição da porção de toxina central para a porção de pró-toxina. Tipicamente, as toxinas CrylCa têm cerca de 1150 a cerca de 1200 aminoácidos de comprimento. A transição da porção de toxina central para a porção de pró-toxina ocorrerá, tipicamente, entre cerca de 50% a cerca de 60% da toxina de comprimento 10 total. A toxina quimérica da presente invenção incluirá a extensão total dessa porção de toxina central N-terminal. Assim, a toxina quimérica compreenderá pelo menos cerca de 50% do comprimento total da proteína de toxina Bt Cry1. Essa terá, tipicamente, pelo menos cerca de 590 aminoácidos. Com relação à porção de pró-toxina, a extensão total da porção de pró-toxina 15 CrylAb se estende da extremidade da porção de toxina central até o C- término da molécula.

Genes e toxinas. Os genes e toxinas úteis de acordo com a presente invenção incluem não apenas as sequências de comprimento total divulgadas, mas também fragmentos dessas sequências, variantes, mutan- 20 tes e proteínas de fusão as quais retêm a atividade pesticida característica das toxinas especificamente exemplificadas aqui. Conforme usado aqui, os termos "variantes" ou "variações" de genes referem-se à sequências de nu- cleotídeo as quais codificam as mesmas toxinas ou as quais codificam toxinas equivalentes tendo atividade pesticida. Conforme usado aqui, o termo 25 "toxinas equivalentes" refere-se à toxinas tendo a mesma ou essencialmente a mesma atividade biológica contra as pestes alvo que as toxinas reivindicadas.

Conforme usado aqui, the boundaries representam aproxima-damente 95% (Vip3Ab's e CrylCa's), 78% (Vip3Ab's e CrylCs) e 45% 30 (CryTs) de identidade de sequência, conforme "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum e D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807- 813. Esses cortes podem também ser aplicados à toxinas centrais apenas.

Será evidente para aqueles versados no campo que genes que codificam toxinas ativas podem ser identificados e obtidos através de vários . 5 meios. Os genes ou porções gênicas específicas exemplificados aqui podem ser obtidas dos isolados depositados em um depositório de cultura. Esses genes ou porções ou variantes dos mesmos, podem também ser construídos sinteticamente, por exemplo, mediante o uso de um sintetizador de gene. Variações gênicas podem também ser prontamente construídas usando téc- 10 nicas padrões para fazer mutações por pontos. Também, fragmentos desses genes podem ser feitos usando exonucleases ou endonucleases comercialmente disponíveis de acordo com procedimentos padrões. Por exemplo, enzimas tal como Bal31 ou mutagênese sítio-dirigida pode ser usada para cortar sistematicamente nucleotídeos das extremidades desses genes. Genes 15 que codificam fragmentos ativos podem também ser obtidos usando uma variedade de enzimas de restrição. Proteases podem ser usadas para obter diretamente fragmentos ativos dessas toxinas de proteína.

Fragmentos e equivalentes os quais retêm a atividade pesticida das toxinas exemplificadas estariam dentro do escopo da presente invenção.

Também, em virtude da redundância do código genético, uma variedade de diferentes sequências de DNA podem codificar as sequências de aminoáci- do divulgadas aqui. Está bem dentro da capacidade daqueles versados no campo para criar essas sequências de DNA alternativas que codificam as mesmas ou essencialmente as mesmas toxinas. Essas sequências de DNA 25 variantes estão dentro do escopo da presente invenção. Conforme usado aqui, referência a "essencialmente a mesma" sequência refere-se à sequências as quais têm substituições, deleções, adições ou inserções de aminoá- cido as quais não afetam materialmente a atividade pesticida. Fragmentos de genes que codificam proteínas que retêm atividade pesticida também são 30 incluídos nessa definição.

Um outro método para identificação dos genes que codificam as toxinas e porções gênicas úteis de acordo com a presente invenção é medi-ante o uso de sondas de oligonucleotídeo. Essas sondas são sequências de nucleotídeo detectáveis. Essas sequências podem ser detectáveis em virtude de um rótulo apropriado ou podem ser tornadas inerentemente fluorescentes, conforme descrito no Pedido Internacional No. WO93/16094. Con- . 5 forme é bem conhecido na técnica, se a molécula de sonda e a amostra de ácido nucleico se hibridizam mediante formação de uma ligação forte entre as duas moléculas, pode-se presumir razoavelmente que a sonda e a amostra têm homologia substancial. De preferência, hibridização é conduzida sob condições estringentes por meio de métodos bem conhecidos na técnica 10 conforme descrito, por exemplo, em Keller, G. FL, M. M. Manak (1987) DNA

Probes, Stockton Press, New York, N.Y., páginas 169-170. Alguns exemplos de combinações de concentrações de sal e temperatura são como segue (em ordem crescente de estringência): 2X SSPE ou SSC em temperatura ambiente; 1X SSPE ou SSC a 42° C; 0,1X SSPE ou SSC a 42° C; 0,1X SS- 15 PE ou SSC a 65° C. Detecção da sonda constitui um meio para determinar, de uma maneira conhecida, se hibridização ocorreu. Tal análise de sonda proporciona um método rápido para identificação de genes que codificam toxina da presente invenção. Os segmentos de nucleotídeo os quais são usados como sondas de acordo com a invenção podem ser sintetizados u- 20 sando um sintetizador de DNA e procedimentos padrões. Essas sequências de nucleotídeo pode também ser usadas como primers de PCR para amplifi-car os genes da presente invenção.

Toxinas Variantes. Determinadas toxinas da presente invenção foram especificamente exemplificadas aqui. Uma vez que essas toxinas são 25 meramente exemplificativas das toxinas da presente invenção, será prontamente evidente que a presente invenção compreende toxinas variantes ou equivalentes (e sequências de nucleotídeo que codificam toxinas equivalentes) tendo a mesma ou atividade pesticida similar à toxina exemplificada. Toxinas equivalentes terão homologia de aminoácido com uma toxina exem- 30 plificada. Essa homologia de aminoácido será, tipicamente, maior do que 75%, de preferência será maior do que 90% e, ainda mais preferivelmente, será maior do que 95%. A homologia de aminoácido será maior em regiões críticas da toxina as quais respondem pela atividade biológica ou estão en-volvidas na determinação da configuração tridimensional a qual, por fim, é responsável pela atividade biológica. A esse respeito, determinadas substitu-ições de aminoácido são aceitáveis e podem ser esperadas se essas substi-tuições estão em regiões as quais não são críticas para atividade ou são substituições conservatives de aminoácido as quais não afetam a configura-ção tridimensional da molécula. Por exemplo, aminoácidos podem ser colo-cados nas classes a seguir: não polares, polares não carregados, básicos e ácidos. Substituições conservatives pelas quais um aminoácido de uma classe é substituído por outro aminoácido do mesmo tipo caem dentro do escopo da presente invenção, contando que a substituição não altere mate-rialmente a atividade biológica do composto. Abaixo está uma listagem de exemplos de aminoácidos pertencendo a cada classe.

Em alguns casos, substituições não conservatives podem tam bém ser feitas. O fator crítico é que essas substituições não devem prejudicar significativamente a atividade biológica da toxina.

Hospedeiros Recombinantes. Os genes que codificam as toxi-nas da presente invenção podem ser introduzidos em uma ampla variedade de hospedeiros microbianos ou vegetais. Expressão do gene de toxina resul-ta, direta ou indiretamente, na produção intracelular e manutenção do pesti-cida. Transferência conjugal e transferência recombinante podem ser usadas para criar uma cepa de Bt que expressa ambas as toxinas da presente invenção. Outros organismos hospedeiros podem também ser transformados com um ou ambos os genes de toxina, então, usados para obter o efeito si- nergístico. Com hospedeiros microbianos adequados, por exemplo, Pseudomonas, os micróbios podem ser aplicados ao local da peste, onde eles proliferarão e serão ingeridos. O resultado é controle da peste. Alternativa mente, o micróbio que hospeda o gene de toxina pode ser tratado sob con-dições que prolongam a atividade da toxina e estabilizam a célula. A célula tratada, a qual retém a atividade tóxica pode, então, ser aplicada ao ambiente da peste alvo.

Onde o gene de toxina Bt é introduzido via um vetor adequado em um hospedeiro microbiano e o referido hospedeiro é aplicado ao ambiente em um estado vivo, é essencial que determinados micróbios hospedeiros sejam usados. São selecionados hospedeiros microbianos os quais são co-nhecidos por ocupar a "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplano) de uma ou mais safras de interesse. Esses micro-organismos são selecionados de modo a serem capazes de competir com sucesso no ambiente particular (safra e outros habitats de insetos) com os micro-organismos do tipo silvestre, conferem manutenção e expressão estáveis do gene que expressa o polipeptídeo pesticida e, desejavelmente, conferem proteção aprimorada ao pesticida contra degradação ambiental e inativação.

Um grande número de micro-organismos são conhecidos por habitar o filoplano (a superfície das folhas planas) e/ou a rizosfera (o solo que circunda as raízes das plantas) de uma ampla variedade de safras im-portantes. Esses micro-organismos incluem bactérias, algas e fungos. De interesse particular são micro-organismos tais como bactérias, por exemplo, os gêneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, S- treptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacteri-um, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc e Alcaligenes' fungos, particularmente levedura, por exemplo, os gêneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodoto- rula e Aureobasidium. De interesse particular são espécies bacterianas da fitosfera, tais como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus e Azotobacter vinlandii; e espécies de levedura da fitosfera, tais como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pre- toriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae e Aureobasidium pollulans. De interesse particular são os microorganismos pigmentados.

Uma ampla variedade de métodos estão disponíveis para intro- 5 dução de um gene de Bt que codifica uma toxina em um hospedeiro microbiano sob condições as quais permitem manutenção e expressão estáveis do gene. Esses métodos são bem conhecidos por aqueles versados no campo e são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.135.867, a qual é incorporada aqui por referência.

Tratamento de Células. Bacillus thuringiensis ou células re-combinantes que expressam as toxinas Bt podem ser tratadas para prolongar a atividade da toxina e estabilizar a célula. A microcápsula pesticida que é formada compreende a toxina ou toxinas Bt dentro de uma estrutura celular que tenha sido estabilizada e protegerá a toxina quando a microcápsula é 15 aplicada ao ambiente da peste alvo. Células hospedeiras adequadas podem incluir procariotas ou eucariotas, normalmente estando limitadas àquelas células as quais não produzem substâncias tóxicas para organismos superiores, tais como mamíferos. Contudo, organismos os quais produzem substâncias tóxicas para organismos superiores poderiam ser usadas, onde as 20 substâncias tóxicas são instáveis ou o nível de aplicação suficientemente baixo de forma a evitar qualquer possibilidade de toxicidade a um hospedeiro mamífero. Como hospedeiros, de interesse particular serão os procariotas e os eucariotas inferiores, tais como fungos.

A célula usualmente estará intacta e estará substancialmente na 25 forma proliferativa quando tratada, ao invés de em uma forma de esporo embora, em alguns casos, esporos possam ser empregados.

Tratamento da célula microbiana, por exemplo, um micróbio con-tendo o gene ou genes de toxina B.t, pode ser através de meios químicos ou físicos ou através de uma combinação de meios químicos e/ou físicos, 30 contanto que a técnica não afete prejudicialmente as propriedades da toxina, nem diminua a capacidade celular de proteção da toxina. Exemplos de reagentes químicos são agentes de halogenação, particularmente halogênios de número atômico 17-80. Mais particularmente, iodo pode ser usado sob condições suaves e durante um tempo suficiente para obter os resultados desejados. Outras técnicas adequadas incluem tratamento com aldeídos, tal como glutaraldeído; anti-infectivos, tais como cloreto de zefirano e cloreto de cetilpiridínio; álcoois, tais como álcool isopropílico e etanol; vários fixadores histológicos, tais como iodo Lugol, fixador de Bouin, vários ácidos e fixador de Helly (vide: Humason, Gretchen L, Animal Tissue Técnicas, W. H. Freeman and Company, 1967); ou uma combinação de agentes físicos (calor) e químicos que preservam e prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é administrada ao ambiente do hospedeiro. Exemplos de meios físicos são radiação com comprimento de onda curto, tal como radiação gama e raios X, congelamento, irradiação UV, liofilização e semelhantes. Métodos para tratamento de microbial células são divulgados nas Pats. U.S. Nos. 4.695.455 e 4.695.462, as quais são incorporadas aqui por referência.

As células têm, geralmente, estabilidade estrutural intensificada, a qual intensificará a resistência às condições ambientais. Onde o pesticida está em uma pró-forma, o método de tratamento celular deverá ser selecio-nado de modo a não inibir o processamento da pró-forma à forma madura do pesticida pela peste patogênica alvo. Por exemplo, formaldeído causará li-gação cruzada das proteínas e poderia inibir o processamento da pró-forma de um pesticida polipeptídico. O método de tratamento deverá reter pelo menos uma porção substancial da biodisponibilidade ou bioatividade da toxina.

Características de interesse particular na seleção de uma célula hospedeira para fins de produção incluem facilidade de introdução o gene ou genes de B.t. no hospedeiro, disponibilidade de sistemas de expressão, efi-ciência de expressão, estabilidade do pesticida no hospedeiro e a presença de capacidades genéticas auxiliares. Características de interesse para uso como uma microcápsula pesticida incluem qualidades protetoras para o pes-ticida, tais como paredes celulares espessas, pigmentação e engolfamento intracelular ou formação de corpos de inclusão; sobrevivência em ambientes aquosos; falta de toxicidade em mamífero; atratividade para ingestão pelas pestes; facilidade de morte e fixação sem dano à toxina; e semelhantes. Ou-tras considerações incluem facilidade de formulação e manipulação, custos, estabilidade ao armazenamento e semelhantes.

Crescimento de Células. O hospedeiro celular contendo o gene ou genes inseticidas de B.t. pode ser crescido em qualquer meio nutriente conveniente, onde o construto de DNA confere uma vantagem seletiva, constituindo um meio seletivo, de modo que substancialmente todas as célu-las retenham o gene de B.t. Essas células podem, então, ser coletadas de acordo com formas convencionais. Alternativamente, as células podem ser tratadas antes de coleta.

As células de B.t. que produzem as toxinas da invenção podem ser cultivadas usando meios padrões no campo e técnicas de fermentação. Quando de término do ciclo de fermentação, as bactérias podem ser coletadas primeiro separando os esporos e cristais de B.t. do caldo de fermentação através de meios bem conhecidos na técnica. Os esporos e cristais de B.t. recuperados podem ser formulados em um pó umidecível, concentrado líquido, grânulos ou outras formulações mediante a adição de tensoativos, dispersantes, veículos inertes e outros componentes para facilitar a manipu-lação e aplicação para pestes alvo particulares. Essas formulações e proce-dimentos de aplicação são todos bem conhecidos na técnica.

Formulações. Grânulos de isca formulados contendo um atraente e esporos, cristais e toxinas dos isolados de B.t. ou micróbios recombi- nantes compreendendo os genes obteníveis dos isolados de B.t. divulgados aqui, podem ser aplicados ao solo. O produto formulado pode também ser aplicado como um revestimento para semente ou tratamento para a raiz ou tratamento para a planta toda nos estágios posteriores do ciclo da safra. Tratamentos do solo e da planta com células de B.t. podem ser empregados como pós umedecíveis, grânulos ou pós, mediante mistura com vários materiais inertes, tais como minerais inorgânicos (filo-silicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos e semelhantes) ou materiais botânicos (sabugos de milho em pó, cascas de arroz, cascas de nozes e semelhantes). As formulações po- dem incluir adjuvantes dispersantes-aderentes, agentes de estabilização, outros aditivos pesticidas ou tensoativos. Formulações líquidas podem ser aquosas ou não aquosas e empregadas como espumas, géis, suspensões, concentrados emulsificáveis ou semelhante. Os ingredientes podem incluir agentes reológicos, tensoativos, emulsificantess, dispersantes ou polímeros.

Conforme será apreciado por aqueles versados na técnica, a concentração de pesticida variará amplamente, dependendo da natureza da formulação em particular, particularmente se ela é um concentrado ou tem de ser usada diretamente. O pesticida estará presente em pelo menos 1% em peso e pode ser 100% em peso. As formulações secas terão de cerca de 1-95% em peso do pesticida, enquanto que as formulações líquidas geralmente terão de cerca de 1 -60% em peso dos sólidos na fase líquida. As formulações geralmente terão de cerca de 102 a cerca de 104 células/mg. Essas formulações serão administradas em cerca de 50 mg (líquidas ou secas) a 1 kg ou mais por hectare.

As formulações podem ser aplicadas ao ambiente da peste lepi- dóptera, por exemplo, folhagem ou solo, através de pulverização, polvilha- mento, borrifação ou semelhante.

Transformação de Planta. Um hospedeiro recombinante prefe-rido para produção das proteínas inseticidas da presente invenção é uma planta transformada. Genes que codificam proteínas de toxina de Bt, conforme divulgado aqui, podem ser inseridas em células de planta usando uma variedade de técnicas, as quais são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, um grande número de vetores de clonagem compreendendo um sistema de replicação em Escherichia coli e um marcador que permite seleção das células transformadas estão disponíveis para o preparo para a inserção de genes estranhos em plantas superiores. Os vetores compreendem, por e- xemplo, pBR322, a série pUC, a série M13mp, pACYC184, inter alia. Assim sendo, o fragmento de DNA tendo a sequência que codifica a proteína de toxina de Bt pode ser inserido no vetor em um sítio de restrição adequado. O plasmídeo resultante é usado para transformação em E. coli. As células de E. coli são cultivadas em um meio nutriente adequado, então, coletadas e submetidas à lise. O plasmídeo é recuperado. Análise de sequência, análise de restrição, eletroforese e outros métodos biológicos moleculares- bioquímicos são, em geral, realizados como método de análise. Após cada manipulação, a sequência de DNA usada pode ser clivada e unida à próxima sequência de DNA. Cada sequência de plasmídeo pode ser clonada no mesmo ou em outros plasmídeo. Dependendo do método de inserção dos genes desejados na planta, outras sequências de DNA podem ser necessá-rias. Se, por exemplo, o plasmídeo Ti ou Ri é usado para a transformação da célula de planta, então, pelo menos a borda direita, mas frequentemente as bordas direita e esquerda do T-DNA dos plasmídeos Ti ou Ri, têm de ser unidas como a região de flanqueamento dos genes a serem inseridos. O uso de T-DNA para a transformação de células de planta foi intensivamente pes-quisado e suficientemente descrito no documento EP 120 516, Lee e Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et a!., (1986) e An et al., (1985) e é bem estabelecido na técnica.

Uma vez que o DNA inserido tenha sido integrado no genoma da planta, ele é relativamente estável. O vetor de transformação normalmente contém um marcador selecionável que confere, às células de planta trans-formadas, resistência a um biocida ou um antibiótico, tal como Bialaphos, Canamicina, G418, Bleomicina ou Higromicina, inter alia. O marcador indivi-dualmente empregado deverá, assim, permitir a seleção de células transfor-madas, ao invés de células que não contêm o DNA inserido.

Um grande número de técnicas estão disponíveis para inserção de DNA em uma célula de planta hospedeira. Essas técnicas incluem trans-formação com T-DNA usando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como agente de transformação, fusão, injeção, biolistics (bom-bardeamento de micropartícula) ou eletroporação, bem como outros possíveis métodos. Se Agrobactérias são usadas para a transformação, o DNA a ser inserido tem de ser clonado em plasmídeos especiais, isto é, em um vetor intermediário ou em um vetor binário. O vetor intermediário pode ser integrado no plasmídeo Ti ou Ri por meio de recombinação homóloga em virtude de sequências que são homólogas à sequências no T-DNA. O plasmídeo Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transferência do T-DNA.

Vetores intermediários não podem se reproduzir em Agrobacté- rias. O vetor intermediário pode ser transferido em Agrobacterium tumefaci- ens por meio de um plasmídeo auxiliar (conjugação). Vetores binários podem se reproduzir em E. coli e em Agrobactérias. Eles compreendem um gene marcador de seleção e um ligante ou poliligante o qual está em rede pelas regiões de borda de T-DNA Direita e Esquerda. Eles podem ser transformados diretamente em Agrobactérias (Holsters et al., 1978). As agrobactérias usadas como célula hospedeira têm de compreender um plasmídeo trazendo uma região vir. A região vir é necessária para a transferência do T- DNA na célula de planta. T-DNA adicional pode estar contido. A bactéria assim transformada é usada para a transformação de células de planta. Ex- plantes de planta podem, vantajosamente, ser cultivados com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes para a transferência do DNA na célula de planta. Plantas inteiras podem, então, ser regeneradas a partir do material de planta infectado (por exemplo, pedaços de folha, segmentos de caule, raízes, mas também protoplastos ou células cultivadas em suspensão) em um meio adequado, o qual pode conter antibióticos ou biocidas para seleção. As plantas assim obtidas podem, então, ser testadas quanto à presença do DNA inserido. Nenhuma demanda especial é com relação aos plasmídeos no caso de injeção e eletroporação. É possível usar plasmídeos comuns tais como, por exemplo, derivados de pUC.

As células transformadas crescem dentro das plantas da maneira usual. Eles podem formar células germe e transmitir o(s) traço(s) trans- formado(s) às plantas de prole. Tais plantas podem ser crescidas da maneira normal e cruzadas com plantas que têm os mesmos fatores hereditários transformados ou outros fatores hereditários. Os indivíduos híbridos resul-tantes têm as propriedades fenotípicas correspondentes.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, as plantas serão transformadas com genes em que o uso de códon tenha sido otimizados para plantas. Vide, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.380.831, a qual é aqui incorporada por referência. Embora algumas toxinas truncadas sejam exemplificadas aqui, é bem sabido na técnica de Bt que toxinas do tipo 130 kDa (comprimento total) têm uma metade N-terminal que é a toxina central e uma metade C-terminal que é uma "cauda" de pró-toxina, Assim, "caudas" apropriadas podem ser usada com toxinas truncadas / centrais da presente invenção. Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 6.218.188 e Patente U.S. No. 6.673.990. Além disso, métodos para criação de genes de Bt sintéticos para uso em plantas são conhecidos na técnica (Stewart e Burgin, 2007). Um e- xemplo não limitativo de uma planta transformada preferida é uma planta de milho fértil compreendendo um gene de planta passível de expressão que codifica uma proteína Vip3Ab e ainda compreendendo um segundo gene passível de expressão em planta que codifica uma proteína CrylCa.

Transferência (ou introgressão) do(s) traço(s) determinado(s) por Vip3Ab e CrylCa em linhagens de milho endógamas pode ser obtida através de melhoramento por seleção recorrente, por exemplo, por meio de re- cruzamento. Nesse caso, uma parental recorrente desejado é primeiro cruzado com um doador endógamo (o parental não recorrente) que traz o(s) gene(s) apropriado(s) para os traços determinados por Vip3Ab e Cry1. A prole desse cruzamento é, então, cruzada novamente com o parental recorrente, seguido por seleção na prole resultante para que o(s) traço(s) deseja- do(s) seja(m) transferido(s) do parental não recorrente. Após três, de preferência quatro, mais preferivelmente cinco ou mais gerações de re- cruzamentos com o parental recorrente com seleção pelo(s) traço(s) deseja- do(s), a prole será heterozigótica para loci que controlam o(s) traço(s) que está(ão) sendo transferido(s), mas será semelhante ao recorrente parental quanto à maioria ou quase todos os outros genes (vide, por exemplo, Poe- hlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4a Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376).

Estratégias de Gerenciamento de Resistência (IRM) a Inseto.Roush et al., por exemplo, esboçam duas estratégias com toxina, também denominadas "formação de pirâmide" ou "empilhamento", para gerencia-mento de safras transgênicas inseticidas (The Royal Society. Phil. Trans. R.Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).

Em seu website, a United States Environmental Protection A- gency (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/Bt_corn_refuge_2006.htm) pu-blica os requisitos a seguir para proporcionar refugos não transgênicos (isto é, não B.t.) (uma seção de safras / milho não Bt) para uso com safras trans- gênicas que produzem uma única proteína de Bt ativa contra pestes alvo.

"The specific structured requirements for corn borer-protected Bt (CrylAb ou Cry IF) corn products são como segue: Refugos estruturados: 20% de refugo de milho Bt não lepi- dóptero no cinturão do milho; 50% de refugo de Bt não lepidóptero no cinturão do algodão Blocos Interno (isto é, dentro do campo de Bt) Externo (isto é, campos distintos dentro de 14 milha (14 de milha se possível) do campo de Bt para maximizar o cruzamento aleatório) Tiras em-campo

As tiras devem ter pelo menos 4 fileiras de largura (de preferência 6 fileiras) para reduzir os efeitos de movimento larval"

Além disso, a National Corn Growers Association, em seu website: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-Bt-corn) também fornece orientação similar com relação aos requisitos do refugo. Por exemplo: "Requisitos da IRM para Broca do Milho: - Plantar pelo menos 20% de seus acres de milho para híbridos de refugo - Em regiões que produzem algodão, o refugo deve ser 50%> - Deve ser plantado dentro 1/2 milha dos híbridos de refugo - Refugo pode ser plantado como tiras dentro do campo de Bt, the refuge as tiras devem ter pelo menos 4 fileiras de largura - O refugo pode ser tratado com pesticidas convencionais apenas se limiares econômicos são atingidos para o inseto alvo - Inseticidas pulverizáveis baseados em Bt não podem ser usados sobre o milho de refugo - Refugo apropriado deve ser plantado em cada fazenda com mi-lho Bf

Conforme afirmado por Roush et al. (nas páginas 1780 e 1784, coluna da direita, por exemplo), empilhamento ou formação de pirâmide de duas proteínas diferentes, cada uma eficaz contra as pestes alvo e com pouca ou nenhuma resistência cruzada, pode permitir o uso de um refugo menor. Roush sugere que, para uma pilha com sucesso, um tamanho de proteção de menos de 10% de refugo, pode conferir gerenciamento de resistência comparável a cerca de 50% de refugo para um único traço (não estando em pirâmide). Para produtos de milho Bt em pirâmide atualmente disponíveis, a U.S. Environmental Protection Agency requer que significativamente menos (em geral 5%) refugo estruturado de milho não-Bt seja plantado do que para produtos com um único traço (em geral 20%).

Há várias formas de conferir os efeitos de IRM de uma proteção, incluindo diversos padrões de plantio geométrico nos campos (conforme mencionado acima) e misturas de semente em sacos, conforme ainda discu-tido por Roush etal. (supra) e Patente U.S. No. 6.551.962.

Os percentuais acima ou proporções de refugo similares podem ser usadas para as pilhas ou pirâmides duplas ou triplas em questão. Para pilhas triplas com três locais de ação contra uma única peste alvo, um objetivo seria refugo zero (ou menos de 5% de refugo, por exemplo). Isso é parti-cularmente verdadeiro para acres comerciais - acima de 10 acres, por e- xemplo.

Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios e publicações mencionados ou citados aqui são incorporados por referência na íntegra até o ponto em que eles não sejam inconsistentes com os ensi-namentos explícitos do presente relatório descritivo.

A menos que especificamente indicado ou implicado, os termos "um", "uma", "o" e "a" significam "pelo menos um(a)", conforme usado aqui.

Os seguintes são exemplos que ilustram procedimentos para a prática da invenção.

Esses exemplos não deverão ser construídos como limitativos. Todos os percentuais são em peso e todas as proporções de mistura de sol-vente são em volume, a menos que de outro modo mencionado. Todas as temperaturas são em graus Celsius.

EXEMPLOS Exemplo 1- Produção e processamento por tripsina de pro-teínas Vip3Ab e CrylCa.

Os genes que codificam as pró-toxinas CrylCa e Vip3Ab1 foram expressos em cepas de expressão de Pseudomonas fluorescens e as prote-ínas de comprimento total isoladas como corpos de inclusão insolúveis. Os corpos de inclusão lavados foram solubilizados por meio de agitação a 37 °C em tampão contendo tampão CAPS a 20 mM, pH de 11 + DDT a 10 mM + 2- mercaptoetanol a 0,1%, durante 2 horas. A solução foi centrifugada a 27.000 x g durante 10 min. a 37 °C e o sobrenadante tratado com TCPK a 0,5% (peso/v) tratado com tripsina (Sigma). Essa solução foi incubada com mistura durante mais 1 hora em temperatura ambiente, filtrada, então, carregada sobre uma coluna Pharmacia Mono Q 1010 equilibrada com CAPS a 20 mM, pH de 10,5. Após lavagem da coluna carregada com 2 volumes de coluna de tampão, a toxina truncada foi eluída usando um gradiente linear de NaCI a 0 a 0,5 M em CAPS a 20 mM em 15 volumes de coluna em uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min. Proteínas Cry truncadas purificadas por tripsina eluíram em NaCI a 0,2-0,3 M. A pureza das proteínas foi verificada através de SDS PAGE e com visualização usando corante de azul brilhante Coomassie. Em alguns casos, as frações combinadas da toxina purificada foram concentradas e carregadas sobre uma coluna Superose 6 (1,6 cm de dia., 60 cm de comprimento) e ainda purificadas por meio de cromatografia por exclusão de tamanho. Frações compreendendo um único pico do peso molecular mono- mérico foram combinadas e concentradas, resultando em um preparado mais de 95% homogêneo para uma proteína tendo um peso molecular de cerca de 60.000 kDa.

Processamento de Vip3Ab1 foi obtido de uma maneira similar começando com a proteína de 85 kDa de comprimento total purificada (DIG- 307). A proteína (12 mg) foi submetida à diálise em tampão de fosfato de sódio a 50 mM, pH de 8,4, então, processada mediante a adição de 1 mg de tripsina sólida e incubação durante 1 hora em temperatura ambiente. A solução foi carregada sobre uma coluna de troca de ânions MonoQ (1 cm de di- a., 10 cm. long) e eluída com um gradiente linear de NaCI de 0 a 500 mM em tampão de fosfato de sódio a 20 mM, pH de 8,4 sobre 7 volumes de coluna. Eluição da proteína foi monitorado através de SDS-PAGE. A principal banda processada tinha um peso molecular de 65 kDa, conforme determinado por meio de SDS-PAGE usando padrões de peso molecular para comparação.

Exemplo 2 - lodinação de proteína de toxina central CrylCa

Trabalho anterior indicou que CrylCa era muito difícil de radio- rotular usando métodos tradicionais embora, em uma seleção, poucos casos seriam radio-rotulados e funcionariam bem em um ensaio de ligação a re-ceptor. Nós decidimos radio-rotular CrylCa usando fluoresceína-5- maleimida 125l rádio-rotulada, o qual é um método que tem funcionado para radio-rotular ativamente CrylFa (Prov. 69919). lodinação de fluroesceína-5- maleimida e subsequente conjugação desse produto químico radio-rotulado com CrylCa resulta em radio-rotulação específica de cisteína da proteína. Tal procedimento de rotulação é, assim, altamente específica nos resíduos que são rotulados. O segmento de toxina central CrylCa (resíduos 29-619) contém dois resíduos de aminoácido cisteína, nas posições 210 e 438. Palmer et al. (1997) demonstraram que os anéis de fenila de fluoresceína-5- maleimida podem ser radio-iodinados e, então, reagidos com proteínas que contêm grupos sulfidrila (por exemplo, conforme proporcionado pelos resíduos de cisteína), resultando em alquilação das cisteínas livres na proteína e, assim, proporcionando uma proteína radioativamente rotulada. A toxina central CrylCa truncada por tripsina contém dois resíduos de cisteína e, assim, constitui um substrato para alquilação e radio-rotulação da proteína Nesses dois sítios (específicos).

Fluoresceína-5-maleimida (F5-M) foi dissolvida para 10 mM em DMSO (Sulfóxido de dimetila), então, diluída para 1 mM em solução salina tamponada com fosfato (PBS; fosfato de sódio a 20 mM, NaCI a 0,15 M, pH de 7,5), conforme determinado por meio do coeficiente de extinção molar de F 5-M (68.000 M'1cm'1). A uma solução a 100 μM de PBS contendo dois Glóbulos de lodinação Pierce (Thermo Fisher Scientific), 1,0 μCi de Na125l foi 5 adicionado por trás da proteção protótipo. A solução foi deixada misturar em temperatura ambiente durante 5 min, então, 10 μM da solução de F5-M a 1 mM foram adicionados. Após reação durante 10 min, a solução foi removido da reação de iodinação através de pipeteamento e 2 μg de proteína de toxina central CrylCa truncada altamente purificada por tripsina em PBS foram 10 adicionados à solução. A proteína foi incubada a 4o com a solução de F5-Miodinada durante 48 horas, quando a reação foi terminada mediante a adição β-mercaptoetanol para uma concentração final de 14 mM. A mistura de reação foi adicionada a uma coluna de centrifugação Zebra™ (Invitrogen) equilibrada em CAPS a 20 mM, KCI a 150 mM, pH de 9 e centrifugada a 1500 x 15 g durante 2 min para separar o corante iodinado não reagido da proteína. A proteína de toxina central CrylCa-fluoresceína rádio-rotulada com 125l foi contada em um contador gama para determinar sua radioatividade específica, admitindo uma recuperação de 80% da proteína de toxina de entrada.

A atividade específica da proteína de toxina central CrylCa ra- dio-rotulada era de aproximadamente 6,8 μCi/ μg de proteína. A proteína radio-rotulada foi também caracterizada através de SDS- PAGE e visualizada por meio de formação de imagem em fósforo para validar que a radioatividade medida estava covalentemente associada com a proteína de toxina central CrylCa. A imagem de géis de SDS-PAGE corados com Coomassie foi formada enrolando os mesmos em filme Mylar™ (espessura de 12 μm) e expondo os mesmos a uma tela de fósforo de armazenamento Molecular Dynamics (Sunnyvale, CA) (35 cm x 43 cm) durante 1 hora. As lâminas foram reveladas usando um Phosphor-lmager Molecular Dynamics Storm 820 e a imagem analisada usando o software ImageQuant™. Alguma radioativi- dade foi detectável na região do gel bem abaixo da banda de proteína de toxina central CrylCa (isto é, fragmentos menores do que a proteína de toxina central CrylCa em um tamanho de cerca de 10 kDa e menor). Esses contaminantes radioativos provavelmente representam pequenos peptídeos possivelmente associados na proteína CrylCa truncada em virtude da ação da tripsina usada para clivar a proteína em sua estrutura central.

Exemplo 3 - Ensaios de ligação competitiva a BBMVs de S.frugiperda com proteínas de toxina central CrylCa e Vip3Ab.

Ensaios de ligação competitiva homólogos e heterólogos foram conduzidos usando 150 μg/mL de proteína BBMV e 2 nM da proteína de toxina central CrylCa radio-rotulada com 125l. As concentrações da proteína de toxina central CrylCa não radio-rotulada competitiva homóloga adiciona- da à mistura de reação foram 0,1, 1, 10, 100 e 1000 nM. A proteína Vip3Ab truncada por tripsina heteróloga foi testada a 10 e 1.000 nM e as proteínas foram adicionadas ao mesmo tempo que a proteína de toxina central CrylCa radioativo a fim de assegurar competição por ligação verdadeira. As incuba-ções foram realizadas durante 1 hora a 28° e a quantidade de proteína de toxina central CrylCa rotulada com 125l não ligada às BBMVs (isto é, não ligada a uma proteína de receptor de inseto) é separada da proteína ligada por meio de centrifugação da mistura de BBMV a 16.000 x g durante 8 min e remoção do sobrenadante da pelota resultante. A pelota é lavada três vezes com tampão de ligação gelado (PBS; Na2HPO4 a 11,9 mM, NaCI a 137 mM, KCI a 2,7 mM, pH de 7,4 mais albumina de soro bovino a 0,1%; Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) para remover completamente qualquer CrylCa rotulada com 125l não ligada restante. O fundo do tubo da centrífuga foi cortado e a pelota de proteína contida dentro dessa seção colocada em um tubo de cultura de vidro de 13 x 100 mm e contada em um contador gama durante 10 minutos para obter a quantidade de radioatividade ligada contida na fração de pelota. A quantidade de radioatividade na fração de proteína ligada fornece uma indicação da quantidade de Proteína Cry ligada ao o inseto receptor (total binding). Ligação não específica foi representada pelas contagens obtidas na pelota na presença de 1.000 nM de proteína de toxina central CrylCa não radio-rotulada. A quantidade de CrylCa radio-rotulada especifi-camente ligada à BBMV (ligação específica ) foi medida subtraindo-se o nível de ligação total da ligação não específica. Ligação total de cem porcento foi considerada como sendo a quantidade de ligação na ausência de qualquer proteína de toxina central CrylFa competidora. Os dados são expressos como percentual de 125l CrylCa ligada específica versus a concentração de ligante não rotulado competitivo.

Exemplo 4 - Sumário dos Resultados

Os resultados (Figura 1) mostram que a proteína CrylCa não ro-tulada homóloga impediu eficazmente a proteína de toxina central CrylCa radio-rotulada de se ligar especificamente às proteínas BBMV de uma maneira dependente da dose. Vip3Ab não desloca proteína de toxina central CrylCa rotulada com 125l ligada de sua(s) proteína(s) de receptor em qualquer uma das concentrações mostradas (10 ou 1.000 nM). A maior concentração de Vip3Ab testada (1.000 nM) representa uma concentração 500 vezes maior do que a CrylCa radio-rotulada usada no ensaio, demonstrando que a Vip3Ab não compete efetivamente com a ligação de CrylCa radio- rotulada em BBMV de S. frugiperda.

A Figura 1 é uma curva de dose-resposta para o deslocamento de CrylCa truncada por tripsina fluoresceína-5-maleimida 125l rádio-rotulada em BBMVs de larvas de S. frugiperda (FAW). A Figura mostra a capacidade da CrylCa não rotulada (•) de deslocar a CrylCa rotulada de uma maneira dependente da dose na faixa de 0,1 a 1.000 nM. O gráfico plota o percentual de CrylCa rotulada especificamente ligada (total ligado menos ligação não específica) versus a concentração dos ligantes não radio-rotulados adiciona-dos. A incapacidade da Vip3Ab1 não radio-rotulada (A) a 10 e 1.000 nM de deslocar a CrylCa radio-rotulada especificamente ligada é mostrada.

Lista de Referência Heckel, D.G., Gahan, L.J., Baxter, S.W., Zhao, J.Z., Shelton, A.M., Gould, F. e Tabashnik, B.E. (2007). The diversity of Bt resistance genes in species of Lepidoptera. J Invertebr Pathol 95, 192-197. Luo, K., Banks, D. e Adang, M.J. (1999). Toxicity, binding, and permeability analyses of four Bacillus thuringiensis cryl delta-endotoxins u- sing brush border membrane vesicles of spodoptera exigua and spodoptera frugiperda. Appl. Environ. Microbiol. 65, 457-464. Palmer, M., Buchkremer, M., Valeva, A. e Bhakdi, S. Cysteine-specific radioiodination of proteins with fluorescein maleimide. Analytical Bio-chemistry 253, 175-179. 1997. Ref Type: Journal (Full) Sambrook, J. e Russell, D.W. (2001). Molecular Cloning: A Labo-ratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory). Schlenz, M. L., Babcock, J. M. e Storer, N. P. Response of Cr- ylF-resistant and Susceptible European Corn Borer and Fall Armyworm Colonies to Cry1A.1O5 and Cryl2Ab2. DAI 0830, 2008. Indianápolis, Dow A- groSciences. Derbi Report. Sheets, J. J. e Storer, N. P. Analysis of CrylAc Binding to Proteins in Brush Border Membrane Vesicles of Corn Earworm Larvae (Heleothis zea). Interactions with Cry1F Proteins and Its Implication for Resistance in the Field. DAI-0417, 1-26. 2001. Indianápolis, Dow AgroSciences. Tabashnik, B.E., Liu, Y.B., Finson, N., Masson, L. e Heckel, D.G. (1997). One gene in diamondback moth confers resistance to four Bacillus thuringiensis toxins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A., 94, 1640-1644. Tabashnik, B.E., Malvar, T., Liu, Y.B., Finson, N., Borthakur, D., Shin, B.S., Park, S.H., Masson, L., de Maagd, R.A. e Bosch, D. (1996). Cross-resistance of the diamondback moth indicates altered interactions with domain II of Bacillus thuringiensis toxins. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2839- 2844. Tabashnik, B.E., Roush, R.T., Earle, E.D. e Shelton, A.M. (2000). Resistance to Bt toxins. Science 287, 42. Wolfersberger, M.G. (1993). Preparation and partial characteriza-tion of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the gypsy moth (Lymantria dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol 24, 139-147. Xu, X., Yu, L. e Wu, Y. (2005). Disruption of a cadherin gene as-sociated with resistance to CrylAc {deltaj-endotoxin of Bacillus thuringiensis in Helicoverpa armigera. Appl Environ Microbiol 71, 948-954. APÊNDICE A Lista de delta-endotoxinas - do website de Crickmore et al. (citado no pedido)

Claims (3)

1. Método de gerenciamento do desenvolvimento de resistência a uma proteína Vip3Ab ou uma proteína Cry1Ca por um inseto, caracteriza-do pelo fato de que compreende plantio de sementes para produzir um cam- po de plantas compreendendo plantas de refugo não Bt e uma pluralidade de plantas transgênicas transformadas com DNA que expressa uma proteína Vip3Ab apresentando SEQ ID NO: 1 e DNA que expressa uma proteína in-seticida Cry1Ca apresentando SEQ ID NO: 2.

2. Método de produção de uma célula de planta compreendendo DNA que codifica e expressa uma proteína inseticida Vip3Ab e DNA que co-difica e expressa uma proteína inseticida Cry1Ca, caracterizado pelo fato de que a referida proteína inseticida Vip3Ab apresenta SEQ ID NO: 1, e em que a referida proteína inseticida Cry1Ca apresenta SEQ ID NO: 2.

3. Método de controle de um inseto lagarta-do-cartucho, caracte- rizado pelo fato de que é mediante contato do referido inseto com uma planta transgênica compreendendo DNA que codifica e expressa uma proteína inseticida Vip3Ab e DNA que codifica e expressa uma proteína inseticida Cry1Ca, em que a referida proteína inseticida Vip3Ab apresenta SEQ ID NO: 1, e em que a referida proteína inseticida Cry1Ca apresenta SEQ ID NO: 2.