CN109152347A - 用于管理植物中的昆虫害虫的四种vip和cry蛋白毒素的组合 - Google Patents

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Abstract

主题发明包括用于控制鳞翅目害虫，特别是大豆夜蛾(大豆尺蠖)和黎豆毛虫(黎豆夜蛾)昆虫的方法和植物。所述植物，优选大豆植物，包含Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1杀虫蛋白的组合。描述了使用所述植物来延迟或预防昆虫产生抗性的方法。

Description

用于管理植物中的昆虫害虫的四种VIP和CRY蛋白毒素的组合
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年4月19日提交的题为“COMBINATION OF FOUR VIP AND CRYPROTEIN TOXINS FOR MANAGEMENT OF INSECT PESTS IN PLANTS”的美国临时申请No.62/324,490的权益，该临时申请的公开内容以引用的方式并入。
技术领域
本发明整体涉及应用于农业科学的分子生物学领域。更具体地讲，某些实施方案涉及使用DNA区段在植物中进行杀虫蛋白表达的方法。公开了在转基因植物细胞和植物中结合保护剂的植物开发中使用核酸区段的方法。
背景技术
每年需要花费数十亿美元来控制昆虫害虫，并且这些昆虫害虫对商业化行播作物带来的损害还造成了数十亿美元的损失。合成的有机化学杀昆虫剂已成为用于控制昆虫害虫的主要工具，但是生物杀昆虫剂，诸如来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,B.t.)的杀虫蛋白，在一些地区发挥着重要作用。通过用B.t.杀虫蛋白基因进行转化来产生抗虫植物的能力已经彻底改变了现代农业，并且提高了杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。
迄今为止，已经使用若干B.t.蛋白来产生已经成功注册和商业化的抗虫转基因植物。这些蛋白包括玉米中的Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F和Cry3Bb，棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab以及马铃薯中的Cry3A。除了以下情况外，表达这些蛋白的商业产品均表达单一蛋白质：希望得到两种蛋白质的组合杀虫谱(例如，玉米中的Cry1Ab和Cry3Bb相组合分别提供对鳞翅目害虫和根虫的抗性)，或蛋白质的独立作用使其可用作延迟在敏感昆虫群体中产生抗性的工具(例如，棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab相组合为烟草夜蛾提供抗性管理)。另见美国专利申请公开No.2009/0313717，其涉及Cry2蛋白加上Vip3Aa、Cry1F或Cry1A用于控制玉米穗夜蛾(Helicoverpa zea)或番茄夜蛾(Helicoverpa armigera)。WO 2009/132850涉及用于控制草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Cry1F或Cry1A和Vip3Aa。美国专利申请公开No.2008/0311096部分地涉及用于控制抗Cry1F的ECB的Cry1Ab。WO 2011/084634A1涉及用于控制秋粘虫的Vip3Ab和Cry1Ca。
抗虫转基因植物的广泛使用已引起害虫群体将对这些由植物产生的杀虫蛋白产生抗性的问题。已经提出了几种策略来保持基于B.t.的昆虫抗性性状的效用，它们包括以高剂量与庇护(refuge)相结合来使用蛋白质，以及不同毒素的交替或共用(McGaughey等人,(1998),“B.t.Resistance Management,”Nature Biotechnol.16:144-146)。
选择用于昆虫抗性管理(IRM)堆叠的蛋白质需要独立地发挥其杀虫作用，使得对一种蛋白质毒素产生的抗性不赋予对第二种蛋白质毒素的抗性(例如，不存在对蛋白质毒素的交叉抗性)。如果例如对“蛋白质A”具有抗性的害虫群体对“蛋白质B”敏感，则可以得出以下结论：不存在交叉抗性，并且蛋白质A和蛋白质B的组合将有效延迟对单独的蛋白质A的抗性。
在不存在抗性昆虫群体的情况下，可以根据与作用机制和交叉抗性可能性相关的其他特征进行评估。已经提出将受体介导的结合用于鉴定可能不表现出交叉抗性的杀虫蛋白(美国专利号5,866,784)。该方法固有的对缺乏交叉抗性的关键预测指标在于杀虫蛋白不竞争敏感昆虫物种中的受体。
在两种B.t.来源的毒素竞争相同受体的情况下，如果该受体在该昆虫中突变，导致其中一种毒素不再结合至该受体，因此不再对该昆虫具有杀虫性，那么该昆虫也可能对第二毒素(其竞争性结合相同的受体)具有抗性。也就是说，昆虫被认为对两种B.t.毒素具有交叉抗性。然而，如果两种毒素结合两种不同的受体，则这可能表明昆虫不会同时对这两种毒素产生抗性。
B.t.毒素列于B.t.命名委员会官方网站(Crickmore等人；http://www.btnomenclature.info/)上。目前有超过70种主要“Cry”毒素组(Cry1-Cry74)，还有另外的Cyt毒素和VIP毒素等等。每个数字组中的许多具有大写字母亚组，并且大写字母亚组具有小写字母亚亚组。(例如，Cry1具有A-N，Cry1A具有a-j)。
在拉丁美洲和北美洲南部生长的大豆遭受了很多不同的鳞翅目昆虫害虫造成的严重经济损害。在巴西，大豆夜蛾(SBL；大豆尺蠖(Pseudoplusia includens))和黎豆毛虫(VBC；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis))被视为大豆的主要鳞翅目昆虫害虫。将昆虫抗性性状用于转基因大豆来克服昆虫损害在拉丁美洲才刚刚开始。预期，在该技术商业化的早期，CrylAc和CrylFa毒素将是用于大豆的初始Cry毒素。这两种Bt毒素是用于转基因玉蜀黍和棉花的针对昆虫抗性的相同Cry毒素。由于这两种Bt基因在多个生长季节大量用于多种作物，预期鳞翅目昆虫产生对这些毒素的抗性将存在相当大的压力。因此，开发具有新型Cry毒素(除CrylA和Cryl F类毒素提供的那些之外，具有不同的作用模式和不同的昆虫肠道结合位点)的转基因作物对于用于大豆昆虫抗性性状策略将是非常有益的。
发明内容
本发明提供具有四种Cry和Vip毒素(CrylCa、Cry2Aa、CrylEa和Vip3Ab1)的组合的转基因大豆植物，所述四种Cry和Vip毒素可一起用于提供针对拉丁美洲的主要鳞翅目害虫的广谱杀虫活性。我们首次展示了，这四种毒素不竞争与结合SBL或VBC中肠组织中的CrylAc或CrylFa的受体的结合。这些结果有力地预示了，当上述蛋白质毒素作为堆叠基因在转基因植物中组合表达时，它们将提供抵消目前存在的CrylA和Cry1F抗性的任何存在的新型作用模式，并且将减缓或预防针对该蛋白质毒素组合的新Bt抗性的产生。
本发明包括包含编码CrylCa、Cry2Aa、CrylEa和Vip3Ab1杀虫蛋白毒素的DNA的转基因植物。最优选的植物是大豆植物。本发明还包括植物优选大豆植物的种子，其中所述大豆种子包含编码CrylCa、Cry2Aa、CrylEa和Vip3Ab1杀虫蛋白毒素的DNA。本发明还涵盖田地中的多棵植物，其包括非B.t.庇护植物和本发明的多棵遗传修饰的植物，其中所述庇护植物占所述田地中的所有作物植物的40％至5％。本发明还涵盖包含来自非B.t.庇护植物的多粒庇护种子和本发明的多粒遗传修饰的种子的种子混合物，其中所述庇护种子占所述混合物中的所有种子的40％至5％。还要求保护一种控制鳞翅目害虫的方法，其包括使害虫接触有效量的本发明的遗传修饰的植物。本发明还包括一种产生本发明的植物的方法，其包括使用包含编码CrylCa、Cry2Aa、CrylEa和Vip3Ab1杀虫蛋白毒素的DNA的遗传表达构建体遗传转化植物细胞。
附图说明
图1.CrylAc的同源竞争以替代来自从大豆夜蛾(大豆尺蠖)幼虫制备的中肠膜囊泡的125I CrylAc的结合。下面的曲线代表用单结合位点模型来拟合数据，上面的曲线是用双结合位点模型来拟合数据。
图2.四种不同的Cry和Vip毒素(如图中标签所示)的异源竞争以替代来自从大豆夜蛾(大豆尺蠖)幼虫制备的中肠膜囊泡的125I CrylAc的结合。多相曲线代表来自CrylAc的同源替代结果的拟合以用于比较。
图3.CrylAc的同源竞争以替代来自从黎豆毛虫(黎豆夜蛾)幼虫制备的中肠膜囊泡的125I CrylAc的结合。曲线代表用单结合位点模型来拟合数据。
图4.四种不同的Cry毒素(如图中标签所示)的异源竞争以替代来自从黎豆毛虫(黎豆夜蛾)幼虫制备的中肠膜囊泡的125I Cry1Ac的结合。黑色曲线代表来自CrylAc的同源替代结果的拟合以用于比较。
图5.CrylFa的同源竞争以替代来自从大豆夜蛾(大豆尺蠖)幼虫制备的中肠膜囊泡的125I CrylFa的结合。黑色曲线代表用单结合位点模型来拟合数据。
图6.四种不同的Cry毒素(如图中标签所示)的异源竞争以替代来自从大豆夜蛾(大豆尺蠖)幼虫制备的中肠膜囊泡的125I CrylFa的结合。实心黑色曲线代表来自CrylFa的同源替代结果的拟合以用于比较。
图7.CrylFa的同源竞争以替代来自从黎豆毛虫(黎豆夜蛾)幼虫制备的中肠膜囊泡的125I CrylFa的结合。曲线代表用单结合位点模型来拟合数据。
图8.四种不同的Cry毒素(如图中标签所示)的异源竞争以替代来自从黎豆毛虫(黎豆夜蛾)幼虫制备的中肠膜囊泡的125I Cry1Fa的结合。实心黑色曲线代表来自Cry1Fa的同源替代结果的拟合以用于比较。
具体实施方式
主题发明部分地涉及以下出乎意料的发现：Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea和Vip3Ab1不与Cry1Ac或Cry1Fa竞争大豆夜蛾(大豆尺蠖；SBL)或黎豆毛虫(黎豆夜蛾；VBC)的肠道中的结合位点的结合。因此，Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea和Vip3Ab1蛋白可用于转基因大豆(以及其他植物；例如棉花和玉米)的抗性管理，以延迟或预防对这些蛋白质单独的抗性。主题蛋白质组合可以有效地保护植物(诸如大豆、玉蜀黍和棉花植物)免受抗Cry的SBL或VBC的损害。也就是说，主题发明的一个用途是保护大豆和其他经济上重要的植物物种免受昆虫群体导致的损害和产量损失，所述昆虫群体可产生对Cry毒素(包括但不限于Cry1A或Cry1F)的抗性。
因此，主题发明教导了包含但不限于Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea和Vip3Ab1的昆虫抗性管理(IRM)堆叠，所述堆叠预防或延缓SBL或VBC产生对任何这些蛋白质的抗性。
本发明提供了用于控制鳞翅目害虫的组合物，所述组合物包含产生Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea和Vip3Ab1杀虫蛋白的组合的细胞。
本发明还包括经转化为产生Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea和Vip3Ab1杀虫蛋白的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。一种或多种主题多核苷酸优选地在遗传构建体中处于一个或多个非苏云金芽孢杆菌启动子的控制下。主题多核苷酸密码子可以是植物优化的，以增强在植物中的表达。
本发明另外希望提供一种控制鳞翅目害虫的方法，其包括使所述害虫或所述害虫的环境接触有效量的组合物，该组合物包含：含有Cry1Ca核心毒素的蛋白质、含有Cry2Aa核心毒素的蛋白质、含有Cry1Ea核心毒素的蛋白质，或者还包含：含有Vip3Ab1毒素的蛋白质。经典3域B.t.毒素的核心毒素域是B.t.晶体毒素杀虫蛋白领域的普通技术人员容易辨别的。
本发明的一个实施方案包括包含编码Cry1Ca杀虫蛋白的植物可表达基因、编码Cry2Aa杀虫蛋白的植物可表达基因、编码Cry1Ea杀虫蛋白的植物可表达基因、和编码Vip3Ab1杀虫蛋白的植物可表达基因的大豆或玉蜀黍植物，以及这种植物的种子。
本发明的另一个实施方案包括这样的玉蜀黍或大豆植物：其中编码Cry1Ca杀虫蛋白的植物可表达基因、编码Cry2Aa杀虫蛋白的植物可表达基因、编码Cry1Ea杀虫蛋白的植物可表达基因、和编码Vip3Ab1杀虫蛋白的植物可表达基因已渗入所述玉蜀黍或大豆植物，以及包括这种植物的种子。
如实施例所述，使用放射性标记的Cry1Ac或Cry1Fa蛋白的竞争性受体结合研究显示，Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1蛋白不竞争Cry1Ac或Cry1Fa所结合的SBL和VBC组织中的结合。这些结果还表明，Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1蛋白的组合可以是延缓在SBL和VBC群体中产生对这些蛋白质的抗性的有效手段。因此，部分地基于本文所述的数据，认为Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1蛋白的共产生(堆叠)可用于产生SBL和VBC的IRM堆叠。
其他蛋白质也可加入该组合。例如，主题发明还部分地涉及四种或更多种毒素与Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1的堆叠或“堆塔”(pyramid)。在一些优选的堆塔实施方案中，所选的毒素具有多个针对SBL和/或VBC的单独的作用位点。一些优选的堆塔组合包括主题蛋白质加上Cry1F、Cry1D、Cry1B、Cry1E、VIP3Aa或VIP3B)，作为靶向VBC和SBL的第三蛋白质。所谓“单独的作用位点”，意指任何给定的蛋白质不会导致彼此的交叉抗性。根据主题发明，这些特定堆叠将有利地且出乎意料地提供多个针对VBC和SBL的作用位点。这可有助于减少或消除庇护英亩数要求。
我们证实了，在SBL或VBC的肠道中，Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1不与Cry1Ac或Cry1Fa竞争结合位点。另见WO/2011/075585"COMBINED USE OF Vip3Ab AND CRY1Fa FORMANAGEMENT OF RESISTANT INSECTS"。
因此，毒素Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1的主题组合提供了针对SBL和VBC的非交叉抗性作用。Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1不能在SBL和VBC的肠道中竞争Cry1Ac或Cry1F的结合表明，这六种蛋白质毒素(Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa、Vip3Ab1、Cry1F和Cry1Ac)代表了在SBL和VBC的肠道内提供3-4种单独的目标位点相互作用的Cry毒素。根据主题发明，这些特定堆叠将有利地且出乎意料地提供针对SBL和VBC的非交叉抗性作用。另外，通过这四种蛋白质不彼此竞争的展示，本领域的技术人员将认识到，这可有助于减少或消除庇护英亩数要求。正如本公开的有益效果那样，表达Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1的四重组合的植物可用于延迟或预防在SBL和VBC中产生对这些蛋白质的单独或组合的抗性。
也可根据主题发明添加另外的毒素和基因。例如，如果Cry1Fa或Cry1Ac与主题蛋白质堆叠(Cry1Fa和Cry1Ac具有针对SBL和VBC的活性)，则将两个另外的蛋白质加入该堆叠(其中这两个另外的蛋白质靶向SBL和/或VBC)将提供至少3个针对这些害虫的单独的作用位点。这两个添加的蛋白质将产生具有最多4种作用模式的多毒素堆叠，所述作用模式具有针对两种昆虫(SBL和VBC)的活性。
由于Cry1Fa具有针对SBL和VBC的活性，根据主题发明，Vip3Ab1、Cry2Aa、Cry1Ea或Cry1Ca加上Cry1Fa将有利地且出乎意料地提供三个或更多个针对SBL和VBC的作用位点。这可有助于减少或消除庇护英亩数要求。
Cry1Fa用在SmartStaxTM、PowerCoreTM和WidesStrikeTM产品中。基因(Vip3Ab1、Cry2Aa、Cry1Ea和Cry1Ca)的主题组合可组合成例如Cry1Fa产品(诸如SmartStaxTM和WideStrikeTM)或Cry1A产品(诸如WideStrikeTM)。因此，主题4毒素组合对于减小对这些和其他cry蛋白毒素的选择压力可能是重要的。因此，主题4毒素组合可用于大豆、玉米和其他植物，诸如棉花；但是大豆是优选的。如上文所讨论，也可根据主题发明添加另外的Cry毒素或基于RNAi的杀昆虫剂。
B.t.命名委员会官方网站(Crickmore等人；http://www.btnomenclature.info/)和GENBANK列出的Cry毒素可用于获得本文公开或提及的任何基因和蛋白质的序列。相关序列也可在专利中获得。例如，美国专利No.5,188,960和美国专利No.5,827,514描述了适用于实施本发明的含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质。美国专利No.6,218,188描述了编码适用于本发明的含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质的植物优化的DNA序列。USSN 61/284,275(2009年12月16日提交)提供了可根据主题发明使用的一些截短的Cry1Da蛋白。
本文所述的蛋白质的组合可用于控制鳞翅目害虫。鳞翅目害虫成虫(例如蝴蝶和蛾)主要以花蜜为食，并且是授粉的重要实现者。几乎所有鳞翅目昆虫幼虫，即毛虫都以植物为食，并且很多是严重的害虫。毛虫以植物的叶子或叶子内部或者植物的根或茎为食，剥夺植物的营养物，并且经常破坏植物的物理支撑结构。另外，毛虫以果实、织物以及储存的谷物和面粉为食，毁坏这些供销售的产品或严重降低它们的价值。如本文所用，提及鳞翅目害虫是指害虫的各个生命阶段，包括幼虫阶段。
主题发明的一些嵌合毒素包含B.t.毒素的完全N-末端核心毒素部分，并且在超出核心毒素部分末端的一些点处，该蛋白质具有向异源原毒素序列的过渡。B.t.毒素的N-末端杀虫活性毒素部分称为“核心”毒素。从核心毒素区段到异源原毒素区段的过渡可出现在大约毒素/原毒素接合点处，或者在替代形式中，可以维持天然原毒素的一部分(延伸超出核心毒素部分)，而向异源原毒素部分的过渡出现在下游。
例如，主题发明的一种嵌合毒素是Cry1Ca、Cry1Ea或Cry2Aa的完全核心毒素部分(大约前600个氨基酸)和异源原毒素(C-末端的其余氨基酸)。在一个优选的实施方案中，嵌合毒素的包含原毒素的那部分来源于Cry1Ab蛋白毒素。
本领域的普通技术人员将认识到，B.t.毒素，即使在某个类别内，诸如Cry1Ea，其长度以及从核心毒素部分到原毒素部分的过渡的精确位置也会在一定程度上变化。通常，Cry1Ea毒素的长度为约1150至约1200个氨基酸。从核心毒素部分到原毒素部分的过渡通常将出现在全长毒素的约50％至约60％之间。主题发明的嵌合毒素将包括该N-末端核心毒素部分的全部范围。因此，嵌合毒素将包含Cry1B.t.毒素蛋白的全长的至少约50％。这通常将为至少约590个氨基酸。关于原毒素部分，Cry1Ab原毒素部分的全部范围从核心毒素部分的末端延伸至分子的C-末端。
基因和毒素.可根据主题发明使用的基因和毒素不仅包含所公开的全长序列，而且还包含维持本文特别示例的毒素的特征性杀虫活性的这些序列的片段、变体、突变体和融合蛋白。如本文所用，术语基因的“变体”或“变型”是指编码相同的毒素或编码具有杀虫活性的等效毒素的核苷酸序列。如本文所用，术语“等效毒素”是指具有与要求保护的毒素相同的或基本上相同的对目标害虫的生物学活性的毒素。
如本文所用，根据“Revision of the Nomenclature for the BacillusthuringiensisPesticidal Crystal Proteins,”N.Crickmore,D.R.Zeigler,J.Feitelson,E.Schnepf,J.Van Rie,D.Lereclus,J.Baum和D.H.Dean.Microbiology andMolecular Biology Reviews(1998),第62卷:807-813，边界表示大约95％(Vip3Ab、Cry1Ea、Cry1Ca和Cry2Aa)、78％(Vip3A、Cry1C、Cry1E和Cry2A)和45％(Cry1、Cry2和Vip3)的序列同一性。这些截止值也可以仅应用于核心毒素。
对本领域的技术人员应当显而易见的是，编码活性毒素的基因可以通过多种手段鉴定和获得。本文示例的特定基因或基因部分可以从保藏在培养物保藏所的分离株获得。这些基因或其部分或变体也可以通过合成方式构建，例如通过使用基因合成仪。基因的变型可以容易地使用制备点突变的标准技术来构建。另外，这些基因的片段也可以根据标准程序使用市售的外切核酸酶或内切核酸酶制备。例如，诸如Bal31或定点诱变的酶可用于从这些基因的末端系统地切割核苷酸。还可以使用多种限制性酶获得编码活性片段的基因。蛋白酶可以用于直接获得这些蛋白毒素的活性片段。
维持示例毒素的杀虫活性的片段和等同物在主题发明的范围内。另外，由于遗传密码的冗余性，多种不同的DNA序列可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同的或基本上相同的毒素的这些替代DNA序列完全在本领域中受过培训的人员的技能范围内。这些变体DNA序列在主题发明的范围内。如本文所用，提及“基本上相同的”序列是指具有不会实质性影响杀虫活性的氨基酸置换、缺失、添加或插入的序列。编码维持杀虫活性的蛋白质的基因片段也包括在该定义中。
根据主题发明用于鉴定编码毒素的基因和基因部分的另一种方法是通过使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列可以借助适当的标签来检测，或者可以如国际申请No.WO93/16094所述制备为固有地具有荧光。如本领域所熟知，如果探针分子和核酸样品通过在这两个分子间形成强键而杂交，则可以合理地假定该探针和样品具有实质性同源性。优选地，杂交通过本领域熟知的技术在严格条件下进行，如例如Keller,G.H.,M.M.Manak(1987)DNA Probes,Stockton Press,New York,N.Y.,第169-170页所述。盐浓度和温度组合的一些实例如下(按严格性逐渐增加的顺序)：2×SSPE或SSC，在室温下；1×SSPE或SSC，在42℃下；0.1×SSPE或SSC，在42℃下；0.1×SSPE或SSC，在65℃下。探针检测提供了以已知的方式确定杂交是否已经发生的手段。这种探针分析提供了鉴定主题发明的编码毒素的基因的快速方法。作为根据本发明的探针使用的核苷酸区段可以使用DNA合成仪和标准程序进行合成。这些核苷酸序列也可以用作PCR引物，以扩增主题发明的基因。
变体毒素.本文特别示例了主题发明的某些毒素。由于这些毒素仅仅是主题发明的毒素的示例，因此应显而易见的是，主题发明包括具有与示例毒素相同的或相似的杀虫活性的变体或等效毒素(以及编码等效毒素的核苷酸序列)。等效毒素将与示例毒素具有氨基酸同源性。该氨基酸同源性通常将大于75％，优选地大于90％，最优选地大于95％。氨基酸同源性在毒素的负责生物学活性或涉及三维构型的确定的关键区域中最高，所述三维构型最终负责生物学活性。就此而言，如果某些氨基酸置换处于对活性不关键的区域中或者是不影响分子的三维构型的保守氨基酸置换，则这些置换是可接受的并且可以是期望的。例如，氨基酸可以处于以下类别中：非极性、不带电极性、碱性和酸性。一种类别的氨基酸被相同类型的另一种氨基酸替代所借助的保守置换属于主题发明的范围，只要该置换不实质性改变化合物的生物学活性即可。下文是属于每个类别的氨基酸的实例的列表。
氨基酸的类别 氨基酸的实例
非极性 Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、
不带电极性 Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性 Asp、Glu
碱性 Lys、Arg、His
在一些情况下，也可以进行非保守置换。关键因素是这些置换不得显著减损毒素的生物学活性。
重组宿主.编码主题发明的毒素的基因可以引入多种微生物或植物宿主。毒素基因的表达直接或间接导致杀虫剂的细胞内产生和维持。接合转移和重组转移可用于产生表达主题发明的两种毒素的B.t.菌株。其他宿主生物体也可以用一种或两种毒素基因转化，然后用于实现协同效应。使用合适的微生物宿主，例如假单胞菌属(Pseudomonas)，可将微生物施用于害虫的环境中，微生物可以在该环境中增殖并且被摄食。结果是害虫的控制。或者，可以在延长毒素的活性和稳定细胞的条件下处理作为毒素基因宿主的微生物。然后可将维持毒性活性的处理后的细胞施用于目标害虫的环境。
当通过合适的载体将B.t.毒素基因引入微生物宿主，并将所述宿主以存活状态施用于环境时，使用某些宿主微生物是必须的。选择已知占据一种或多种所关注的作物的“植物圈”(叶面、叶圈、根际和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境(作物和其他昆虫栖息地)中与野生型微生物成功地竞争，提供表达多肽杀虫剂的基因的稳定维持和表达，以及如希望的那样，提供对杀虫剂的改进保护以免于环境降解和失活。
已知大量微生物栖息在多种重要作物的叶面(植物叶子的表面)和/或根际(植物根周围的土壤)。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。特别受关注的是微生物，诸如细菌，例如假单胞菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilius)、农杆菌属(Agrobactenum)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串球菌属(Leuconostoc)和产碱杆菌属(Alcaligenes)；真菌，特别是酵母，例如酵母菌属(Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和金黄担子菌属(Aureobasidium)。特别受关注的是植物圈细菌菌种，诸如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、根癌农杆菌(Agrobactenium tumefaciens)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱杆菌(Alcaligenes entrophus)和棕色固氮菌(Azotobacter vinlandii)；以及植物圈酵母菌种，诸如深红酵母(Rhodotorula rubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白隐球菌(Cryptococcus albidus)、流散隐球菌(C.diffluens)、罗伦隐球菌(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、粉红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、维罗纳克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)和暗金黄担子菌(Aureobasidium pollulans)。特别受关注的是有色的微生物。
有多种方法可用于在允许基因的稳定维持和表达的条件下将编码毒素的B.t.基因引入微生物宿主。这些方法是本领域的技术人员熟知的，并且在例如美国专利No.5,135,867中有所描述，该专利以引用的方式并入本文。
细胞的处理.可以处理表达B.t.毒素的苏云金芽孢杆菌或重组细胞，以延长毒素活性和稳定细胞。所形成的杀虫剂微囊包含已经稳定的B.t.毒素或细胞结构内的毒素，并且当将微囊施用于目标害虫的环境时，将保护毒素。合适的宿主细胞可以包括原核生物或真核生物，通常限于不产生对高等生物(诸如哺乳动物)有毒的物质的那些细胞。然而，可以使用产生对高等生物有毒的物质的生物，其中毒性物质是不稳定的或施用水平足够低，以避免对哺乳动物宿主产生毒性的任何可能性。特别受关注的宿主是原核生物和低等真核生物，诸如真菌。
细胞通常是完整的，并且在处理时基本上处于增殖形式，而不是孢子形式，尽管在某些情况下可以利用孢子。
微生物细胞(例如含有一个或多个B.t.毒素基因的微生物)的处理可以通过化学或物理手段，或通过化学和/或物理手段的组合进行，只要该技术不对毒素的性质造成有害影响，或不降低细胞保护毒素的能力即可。化学试剂的实例是卤化剂，特别是原子序数为17-80的卤素。更具体地讲，碘可以在温和条件下使用足够的时间以实现所需的结果。其他合适的技术包括用以下手段处理：醛，诸如戊二醛；抗感染剂，诸如氯化苯甲烷铵和西吡氯铵；醇，诸如异丙醇和乙醇；多种组织固定剂，诸如卢戈氏(Lugol)碘、波恩氏(Bouin)固定剂，多种酸和海利氏(Helly)固定剂(参见：Humason,Gretchen L.,Animal TissueTechniques,W.H.Freeman and Company,1967)；或物理(热)和化学剂的组合，当将细胞施用于宿主环境时，所述化学剂保持和延长细胞中产生的毒素的活性。物理手段的实例是短波长辐射(诸如γ辐射和X辐射)、冷冻、UV照射、冻干等等。微生物细胞的处理方法在美国专利No.4,695,455和4,695,462中公开，这些专利以引用的方式并入本文。
细胞通常具有增强的结构稳定性，这将增强对环境条件的耐受性。当杀虫剂处于前体形式时，应选择细胞处理方法，以使得不抑制目标害虫病原体将前体形式加工为杀虫剂的成熟形式。例如，甲醛将交联蛋白质，并且可抑制多肽杀虫剂的前体形式的加工。处理方法应维持毒素的至少大部分生物利用性或生物活性。
为了生产而选择宿主细胞时特别受关注的特征包括一个或多个B.t.基因引入宿主的容易性、表达系统的可用性、表达效率、杀虫剂在宿主中的稳定性以及辅助遗传能力的存在。所关注的用作杀虫剂微囊的特征包括杀虫剂的保护性质，诸如厚细胞壁、色素沉积以及包含体的细胞内包装或形成；在水环境中的存活；缺乏哺乳动物毒性；对害虫摄取的吸引力；易于杀死和固定而不对毒素造成损害；等等。其他考虑因素包括易于配制和处理、经济性、储存稳定性等等。
细胞的生长.含有一个或多个B.t.杀虫基因的细胞宿主可以在任何便利的DNA构建体在其中提供选择性优势的营养培养基中生长，从而提供选择性培养基，使得基本上全部或全部细胞保持B.t.基因。然后可以根据传统方式收获这些细胞。或者，可以在收获之前处理细胞。
可以使用标准领域培养基和发酵技术培养产生本发明的毒素的B.t.细胞。在完成发酵周期时，可以通过首先由本领域熟知的手段从发酵液分离B.t.孢子和晶体来收获细菌。可以通过添加表面活性剂、分散剂、惰性载剂以及有助于针对特定目标害虫进行处理和施用的其他组分来将回收的B.t.孢子和晶体配制为可湿性粉末、液体浓缩物、颗粒或其他制剂。这些制剂和施用程序都是本领域熟知的。
制剂.可将含有引诱剂以及B.t.分离株的孢子、晶体和毒素，或包含可从本文公开的B.t.分离株获得的基因的重组微生物的配制诱饵颗粒施用于土壤。配制产品也可以在作物周期的后期作为种子包衣或根处理或整株植物处理来施用。B.t.细胞的植物和土壤处理可以通过与多种惰性材料，诸如无机矿物质(页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等等)或植物材料(粉状玉米棒、稻壳、胡桃壳等等)混合而作为可湿性粉末、颗粒或粉剂来施用。这些制剂可包括分散-粘着佐剂、稳定剂、其他杀虫添加剂或表面活性剂。液体制剂可以是水基或非水性的并作为泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化浓缩物等使用。各成分可包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。
如本领域的技术人员所理解，杀虫浓度将根据特定制剂的性质，特别是它是浓缩物还是直接使用而广泛变化。杀虫剂将以至少1重量％存在，并且可以是100重量％。干燥制剂将具有约1-95重量％的杀虫剂，而液体制剂通常在液相中具有约1-60重量％的固体。制剂通常每mg将具有约102至约104个细胞。这些制剂以每公顷约50mg(液体或干燥)至1kg或更多施用。
制剂可以通过喷雾、撒粉、喷洒等等施用于鳞翅目害虫的环境，例如叶子或土壤。
植物转化.用于产生主题发明的杀虫蛋白的优选重组宿主是转化植物。非全能植物细胞也是本发明的目的，并且可以用主题基因转化以实现相似的结果。本文公开的编码B.t.毒素蛋白的基因可以使用本领域熟知的多种技术插入植物细胞。例如，包含大肠杆菌(Escherichia coli)中的复制系统和允许选择转化细胞的标记的大量克隆载体可用于将外源基因插入高等植物。载体包括例如特别是pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184。因此，具有编码单一B.t.毒素蛋白或主题毒素组合的序列的DNA片段可插入载体的合适限制性位点。所得的质粒用于转化至大肠杆菌。在合适的营养培养基中培养大肠杆菌细胞，然后收获和裂解。回收质粒。序列分析、限制性分析、电泳和其他生物化学-分子生物学方法通常作为分析方法实施。在每次操纵之后，可以切割所使用的DNA序列并且连接至下一个DNA序列。每个质粒序列可以克隆到相同的或其他质粒中。根据将所需基因插入植物的方法，其他DNA序列可能是必要的。如果例如将Ti或Ri质粒用于植物细胞的转化，则Ti或Ri质粒T-DNA的至少右边界，但通常是右边界和左边界必须作为待插入基因的侧翼区而连接。T-DNA用于植物细胞的转化已得到广泛研究，并在EP 120 516,Lee和Gelvin(2008),Hoekema(1985),Fraley等人,(1986)和An等人,(1985)中有充分描述，且在本领域中已研究透彻。
一旦插入的DNA整合进植物基因组，它就是相对稳定的。转化载体通常含有赋予转化植物细胞对杀生物剂或抗生素(诸如特别是双丙氨膦、卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)的抗性的选择性标记。因此，单独利用的标记应当允许选择经转化的细胞，而不是不含所插入的DNA的细胞。
很多技术可用于将DNA插入植物宿主细胞。这些技术包括使用根癌农杆菌或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂用T-DNA进行转化、融合、注射、基因枪(微粒轰击)或电穿孔以及其他可能的方法。如果将农杆菌用于转化，则必须将待插入的DNA克隆进特殊质粒，即克隆进中间载体或克隆进二元载体。由于与T-DNA中的序列同源的序列，中间载体可以通过同源重组整合进Ti或Ri质粒。Ti或Ri质粒还包含T-DNA的转移所必需的vir区。中间载体本身不能在农杆菌中复制。中间载体可借助辅助质粒(缀合)转移至根癌农杆菌。二元载体本身可在大肠杆菌和农杆菌两者中复制。它们包含与右T-DNA边界区和左T-DNA边界区同框的选择性标记基因和接头或多聚接头。它们可以直接转化至农杆菌(Holsters等人,1978)。用作宿主细胞的农杆菌属将包含携带vir区的质粒。vir区对于T-DNA转移至植物细胞是必需的。可以含有另外的T-DNA。这样转化的细菌用于植物细胞的转化。植物外植体可有利地用根癌农杆菌或发根农杆菌栽培，以将DNA转移至植物细胞。然后可以在合适的培养基中从感染的植物材料(例如，叶片、茎段、根部以及原生质体或悬浮培养的细胞)再生整株植物，所述培养基可以含有用于选择的抗生素或杀生物剂。然后可以测试插入的DNA是否存在于这样获得的植物中。就注射和电穿孔而言，对质粒没有特殊要求。可以使用普通质粒，例如pUC衍生物。
转化细胞以常见的方式在植物中生长。它们可以形成生殖细胞，并且将一个或多个转化性状传递给子代植物。此类植物可以以正常的方式生长，并且与具有相同的转化遗传因子或其他遗传因子的植物杂交。所得的杂种个体具有对应的表型性质。
在主题发明的一个优选实施方案中，用其中密码子使用已针对植物而优化的基因转化植物。参见例如美国专利No.5,380,831，该专利据此以引用的方式并入。虽然本文示例了一些截短的毒素，但是130kDa型(全长)毒素具有作为核心毒素的N-末端半部和作为原毒素“尾部”的C-末端半部在B.t.领域中是熟知的。因此，适当的“尾部”可与主题发明的截短/核心毒素一起使用。参见例如美国专利No.6,218,188和美国专利No.6,673,990。此外，产生用于植物的合成B.t.基因的方法是本领域已知的(Stewart和Burgin,2007)。优选的转化植物的一个非限制性实例是包含编码Vip3Ab1蛋白的植物可表达基因、还包含编码Cry1Ca蛋白的第二植物可表达基因、还包含编码Cry1Ea蛋白的第三植物可表达基因、以及还包含编码Cry2Aa蛋白的第四植物可表达基因的可育玉蜀黍植物。
Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1决定的一个或多个性状转移或渗入优良大豆品系中可以使用传统育种方法通过性远交实现。主题毒素组合渗入近交玉蜀黍品系中可以通过轮回选择育种，例如通过回交实现。在这种情况下，首先将所需的轮回亲本与携带Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1决定的性状的一个或多个适当基因的供体近交系(非轮回亲本)杂交。然后将该杂交的子代与轮回亲本回交，然后在所得的子代中选择要从非轮回亲本转移的所需的一个或多个性状。在与轮回亲本回交三代，优选地四代，更优选地五代或更多代，以选择所需的一个或多个性状之后，子代将是控制转移的一个或多个性状的基因座的杂合子，但是大部分或几乎所有其他基因与轮回亲本相同(参见例如Poehlman&Sleper(1995)Breeding Field Crops,第4版,172-175；Fehr(1987)Principles of CultivarDevelopment,第1卷:Theory and Technique,360-376)。昆虫抗性管理(IRM)策略.例如，Roush概述了杀虫转基因作物管理的双毒素策略，也称为“堆塔”或“堆叠”。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353,17771786)。
美国环境保护署(United States Environmental Protection Agency)在他们的网站上(epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)公布了提供非转基因庇护植物(例如，非B.t.庇护植物，它是非B.t.植物的一部分)以与产生对害虫有活性的单一B.t.蛋白的转基因作物一起使用的以下要求。
“欧洲玉米螟保护的Bt(Cry1Ab或Cry1F)玉米产品的具体结构要求如下：结构化庇护：玉米带中20％非鳞翅目昆虫Bt玉米庇护；棉花带中50％非鳞翅目昆虫Bt庇护。块内部(即，在Bt田内)、外部(即，在Bt田的1/2英里(如有可能1/4英里)内的单独田地，以使随机交配最大化)。田间带，带的宽度必须为至少4行(优选地6行)，以减少幼虫移动的影响”
此外，美国国家玉米种植者协会在他们的网站上：
(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)也提供了关于庇护要求的类似指导。例如：“欧洲玉米螟IRM的要求：
-玉米种植英亩数的至少20％为庇护杂种
-在棉花生产区域，庇护必须为50％
-必须种植在庇护杂种的1/2英里内
-庇护可以在Bt田内带状种植；庇护带的宽度必须为至少4行
-仅在达到目标昆虫的经济阈值的情况下，才可以用传统杀虫剂对庇护进行处理
-基于Bt的喷雾杀昆虫剂不能用于庇护玉米
-必须在每个Bt玉米农场种植适当的庇护”
如Roush等人(例如，第1780页和第1784页右列)所述，两种不同蛋白质的堆叠或堆塔(每种对目标害虫有效，并且交叉抗性很小或没有)可允许使用较小的庇护。Roush提出，对于成功的堆叠，小于10％的庇护大小可提供相当于单一(非堆塔)性状的约50％庇护的抗性管理。对于目前可用的堆塔B.t.玉米产品，美国环境保护署要求所种植的非B.t.玉米的结构化庇护(通常5％)显著小于单一性状产品(通常20％)。
有很多方式来提供庇护的IRM效果，包括田中各种几何种植图案(如上所述)和袋内种子混合物，如Roush等人,(出处同上)和美国专利No.6,551,962进一步讨论。
上述百分比或类似的庇护比率可用于主题的二重、三重或四重堆叠或堆塔。对于具有针对单一目标害虫的三个或四个作用位点的三重或四重堆叠，目标将是零庇护(或例如小于5％庇护)。对于例如大于10英亩的商业英亩数尤其如此。
本文提到或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物全文均以引用的方式并入，以它们没有与本说明书的明确教导不一致为限。
除非特别指明或暗示，如本文所用的术语“一个”、“一种”和“该/所述”表示“至少一个/种”。
以下是示出实践本发明的程序的实施例。这些实施例不应被理解为是限制性的。除非另外指明，所有百分比均以重量计，所有溶剂混合物比例均以体积计。所有温度均以摄氏度计。
实施例
实施例1-Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1蛋白的产生和胰蛋白酶加工。
编码Cry1Ca、Cry1Ea和Cry2Aa原毒素的基因在荧光假单胞菌表达菌株中表达，全长蛋白质以不溶性包含体分离。通过在含有20mM CAPS缓冲液(pH 11)+10mM DDT+0.1％2-巯基乙醇的缓冲液中在37℃下搅拌2小时来溶解经洗涤的包含体。在37℃下以27,000×g将溶液离心10min，用经0.5％(w/v)TCPK处理的胰蛋白酶(Sigma)来处理上清液。在室温下，通过混合将该溶液再温育1小时，过滤，然后上样到用20mM CAPS pH10.5平衡的PharmaciaMono QTM1010柱。在用2倍柱体积的缓冲液洗涤上样后的柱之后，使用溶于20mM CAPS的0至0.5M NaCl的线性梯度以15倍柱体积、1.0ml/min的流速洗脱截短的毒素。以约0.2-0.3MNaCl洗脱经纯化的胰蛋白酶截短的Cry蛋白。通过SDS PAGE检查蛋白质的纯度，并使用考马斯亮蓝染料显色。在一些情况下，浓缩纯化毒素的组合级分，上样到Superose 6柱(直径1.6cm，长度60cm)，并通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。将包含单体分子量的单个峰的级分组合，并浓缩，得到对于分子量为约60,000kDa的蛋白质均一性大于95％的制备物。
从纯化的全长85kDa蛋白质开始，以类似的方式实现了Vip3Ab1的加工。将蛋白质(12mg)透析至50mM磷酸钠缓冲液(pH8.4)中，然后通过添加1mg固体胰蛋白酶并在室温下温育1小时来加工。将该溶液上样到MonoQTM阴离子交换柱(直径1cm，长度10cm)，并使用溶于20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.4)中的0至500mM NaCl的线性梯度以超过7倍柱体积洗脱。通过SDS-PAGE监测蛋白质的洗脱。如通过SDS-PAGE使用用于比较的分子量标准所确定，主要加工带的分子量为65kDa。
实施例2–Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1对SBL和VBC的杀虫活性
B.t.杀虫毒素Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1显示出对鳞翅目昆虫物种(包括大豆尺蠖(SBL)和黎豆夜蛾(VBC))具有活性。
样品制备和生物测定.在10mM CAPS(pH 10)中适当稀释溶于10mM CAPS(pH10)的包含体制备物，并且所有生物测定均包括由该缓冲液组成的对照处理，该对照处理作为死亡率的背景检查。
通过凝胶电泳使用BSA产生凝胶光密度的标准曲线来估计生物测定缓冲液中的蛋白质浓度，凝胶光密度使用BioRad成像系统(Fluor-S MultiImagerTM和Quantity One软件4.5.2版)来测定。用考马斯蓝染料对凝胶基质中的蛋白质染色，并在读数前褪色。
在生物测定中测试纯化蛋白质的杀虫活性，所述生物测定使用新生鳞翅目昆虫幼虫对人工昆虫食料进行。从商业化昆虫饲养所(Benzon Research Inc.,Carlisle,PA)维持的群落获得的卵孵化SBL和VBC的幼虫。
这些生物测定在特别为昆虫生物测定设计的128孔塑料托盘(C-DInternational,Pitman,NJ)中进行。每个孔含有1.0mL多物种鳞翅类食料(SouthlandProducts,Lake Village,AR)。通过移液管将40μL蛋白质样品等分试样递送到每个孔的1.5cm2食料表面上(26.7μL/cm2)。以每个孔中每平方厘米(cm2)表面积的蛋白质的量(ng)计算Cry蛋白浓度。将处理后的托盘保持在通风橱中，直到食料表面上的液体蒸发或吸收到食料中为止。
在孵化后的几个小时内，用湿润的骆驼毛刷拾取幼虫个体，将其放置在经处理的食料上，每孔一个幼虫。然后将经侵扰的孔用带孔以容许气体交换的透明塑料胶带(C-DInternational,Pitman,NJ)密封。使生物测定托盘在受控环境条件(28℃，～60％相对湿度，16:8[光照:黑暗])下保持5天，之后，记录暴露于每种蛋白质样品的昆虫总数和死亡昆虫数。计算每次处理的死亡率百分比。
表2
杀虫蛋白对SBL和VBC的生物测定结果，测定死亡率
对于死亡率，+++＝LC50<100ng/cm2；++＝LC50在100-1,000ng/cm2之间；+＝LC50在1,000和3,000ng/cm2之间。
实施例3-Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa核心毒素蛋白的碘化
通过SDS-PAGE表征放射性标记的Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa蛋白，并通过磷光体成像来显现，以验证所测定的放射性与Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa核心毒素蛋白共价相关。通过将考马斯染色的SDS-PAGE凝胶包裹在MylarTM膜(厚度12μm)中，并暴露在MolecularDynamics(Sunnyvale,CA)储磷屏(35cm×43cm)下1小时来成像。使用Molecular DynamicsStorm 820荧光成像仪对板显影，并使用ImageQuantTM软件分析图像。在Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa核心毒素蛋白带下的凝胶区孔中可检测到一些放射性。由于用于将蛋白质切割为其核心结构的胰蛋白酶的作用，这些放射性污染物可能代表可能与截短的Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa蛋白相关的小肽。
实施例4-来自SBL和VBC的BBMV与
Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa和Vip3Ab1的核心毒素蛋白的竞争性结合测定。
使用150μg/mL BBMV蛋白和2nM 125I放射性标记的Cry1Ac或Cry1F核心毒素蛋白进行同源和异源竞争性结合测定。加入反应混合物中的同源竞争性非放射性标记的Cry1Ac或Cry1F核心毒素蛋白的浓度为0.1、1、10、100和1000nM。在0.1、1、10、100和1000nM下测试异源胰蛋白酶截短的Cry1Ca、Cry1Ea或Cry2Aa或者全长Vip3Ab1蛋白，在加入放射性Cry1Ac或Cry1F核心毒素蛋白的同时加入蛋白质，以确保真实结合性竞争。在28℃下温育1小时，通过以16,000×g离心BBMV混合物8分钟从结合的蛋白质分离未结合到BBMV(即，未结合到昆虫受体蛋白质)的125I标记的Cry1Ac或Cry1F核心毒素蛋白的量，将上清液从所得的沉淀物移除。用冰冷的结合缓冲液(PBS；11.9mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl pH7.4加上0.1％牛血清白蛋白；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)洗涤沉淀物三次，以完全移除任何其余未结合的125I标记的Cry1Ac或Cry1F。截留离心管的底部，将包含在该部分内的蛋白质沉淀物放置于13×100mm玻璃培养管中，在γ计数器中计数10分钟，得到沉淀物级分中所含的所结合的放射性的量。结合的蛋白质级分中的放射性量提供了结合至昆虫受体的Cry蛋白的量(总结合)的指示。在存在1,000nM非放射性标记的Cry1Ac或Cry1F核心毒素蛋白的情况下在沉淀物中获得的计数代表非特异性结合。通过从非特异性结合减去总结合水平来测定特异性结合至BBMV的放射性标记的Cry1Ac或Cry1F的量(特异性结合)。百分之百的总结合被视为在不存在任何竞争剂Cry1Ac或Cry1F核心毒素蛋白的情况下的结合量。数据以特异性结合的125I Cry1Ac或Cry1F对竞争性未标记的配体的浓度的百分比表示。
实施例5-结果汇总
结果(图1和图3)显示，同源性未标记的Cry1Ac蛋白质以剂量依赖性方式有效地替代放射性标记的Cry1Ac核心毒素蛋白与BBMV蛋白的特异性结合。在所示的任一浓度(0.1、1、10、100或1,000nM)下，Vip3Ab1不从其一种或多种受体蛋白替代所结合的125I标记的Cry1Ac核心毒素蛋白。所测试的Vip3Ab1的最高浓度(1,000nM)代表该浓度比测定中所用的放射性标记的Cry1Ac大500倍，这表明Vip3Ab1在SBL或VBCBBMV中并不有效地竞争放射性标记的Cry1Ac的结合。在所示的任一浓度(0.1、1、10、100或1,000nM)下，Cry1Ca不从其一种或多种受体蛋白替代所结合的125I标记的Cry1Ac核心毒素蛋白。所测试的Cry1Ca的最高浓度(1,000nM)代表该浓度比测定中所用的放射性标记的Cry1Ac大500倍，这表明Cry1Ca在SBL或VBCBBMV中并不有效地竞争放射性标记的Cry1Ac的结合。在所示的任一浓度(0.1、1、10、100或1,000nM)下，Cry1Ea不从其一种或多种受体蛋白替代所结合的125I标记的Cry1Ac核心毒素蛋白。所测试的Cry1Ea的最高浓度(1,000nM)代表该浓度比测定中所用的放射性标记的Cry1Ea大500倍，这表明Cry1Ea在SBL或VBCBBMV中并不有效地竞争放射性标记的Cry1Ac的结合。在所示的任一浓度(0.1、1、10、100或1,000nM)下，Cry2Aa不从其一种或多种受体蛋白替代所结合的125I标记的Cry1Ac核心毒素蛋白。所测试的Cry2Aa的最高浓度(1,000nM)代表该浓度比测定中所用的放射性标记的Cry2Aa大500倍，这表明Cry2Aa在SBL或VBCBBMV中并不有效地竞争放射性标记的Cry1Ac的结合(图2和图4)。
图1是替代来自大豆尺蠖(SBL)幼虫的BBMV中的125I放射性标记的荧光素-5-马来酰亚胺胰蛋白酶截短的Cry1Ac的剂量反应曲线。图中示出了非标记的Cry1Ac(●)在0.1至1,000nM的范围内以剂量依赖性方式替代标记的Cry1Ac的能力。图中描绘了特异性结合的标记的Cry1Ac(总结合减去非特异性结合)与所添加的非放射性标记的配体的浓度的百分比。示出了非放射性标记的Vip3Ab1(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1Ac(图2)。示出了非放射性标记的Cry1Ca(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1Ac(图2)。示出了非放射性标记的Cry1Ea(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1Ac(图2)。示出了未标记的Cry2Aa(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1Ac(图2)。
图3是替代来自黎豆夜蛾(VBC)幼虫的BBMV中的125I放射性标记的荧光素-5-马来酰亚胺胰蛋白酶截短的Cry1Ac的剂量反应曲线。图中示出了非标记的Cry1Ac(●)在0.1至1,000nM的范围内以剂量依赖性方式替代标记的Cry1Ac的能力。图中描绘了特异性结合的标记的Cry1Ac(总结合减去非特异性结合)与所添加的非放射性标记的配体的浓度的百分比。示出了非放射性标记的Vip3Ab1(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1Ac(图4)。示出了非放射性标记的Cry1Ca(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1Ac(图4)。示出了非放射性标记的Cry1Ea(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1Ac(图4)。示出了未标记的Cry2Aa(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1Ac(图4)。
结果(图5和图7)显示，同源性未标记的Cry1F蛋白质以剂量依赖性方式有效地替代放射性标记的Cry1F核心毒素蛋白与BBMV蛋白特异性结合。在所示的任一浓度(0.1、1、10、100或1,000nM)下，Vip3Ab1不从其一种或多种受体蛋白替代所结合的125I标记的Cry1F核心毒素蛋白。所测试的Vip3Ab1的最高浓度(1,000nM)代表该浓度比测定中所用的放射性标记的Cry1F大500倍，这表明Vip3Ab1在SBL或VBCBBMV中并不有效地竞争放射性标记的Cry1F的结合。在所示的任一浓度(0.1、1、10、100或1,000nM)下，Cry1Ca不从其一种或多种受体蛋白替代所结合的125I标记的Cry1F核心毒素蛋白。所测试的Cry1Ca的最高浓度(1,000nM)代表该浓度比测定中所用的放射性标记的Cry1F大500倍，这表明Cry1Ca在SBL或VBCBBMV中并不有效地竞争放射性标记的Cry1F的结合。在所示的任一浓度(0.1、1、10、100或1,000nM)下，Cry1Ea不从其一种或多种受体蛋白替代所结合的125I标记的Cry1F核心毒素蛋白。所测试的Cry1Ea的最高浓度(1,000nM)代表该浓度比测定中所用的放射性标记的Cry1Ea大500倍，这表明Cry1Ea在SBL或VBCBBMV中并不有效地竞争放射性标记的Cry1F的结合。在所示的任一浓度(0.1、1、10、100或1,000nM)下，Cry2Aa不从其一种或多种受体蛋白替代所结合的125I标记的Cry1F核心毒素蛋白。所测试的Cry2Aa的最高浓度(1,000nM)代表该浓度比测定中所用的放射性标记的Cry2Aa大500倍，这表明Cry2Aa在SBL或VBCBBMV中并不有效地竞争放射性标记的Cry1F的结合(图6和图8)。
图5是替代来自大豆尺蠖(SBL)幼虫的BBMV中的125I放射性标记的荧光素-5-马来酰胰蛋白酶截短的Cry1F的剂量反应曲线。图中示出了非标记的Cry1F(●)在0.1至1,000nM的范围内以剂量依赖性方式替代标记的Cry1F的能力。图中描绘了特异性结合的标记的Cry1F(总结合减去非特异性结合)与所添加的非放射性标记的配体的浓度的百分比。示出了非放射性标记的Vip3Ab1(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1F(图6)。示出了非放射性标记的Cry1Ca(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1F(图6)。示出了非放射性标记的Cry1Ea(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1F(图6)。示出了非放射性标记的Cry2Aa(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1F(图6)。
图7是替代来自黎豆夜蛾(VBC)幼虫的BBMV中的125I放射性标记的荧光素-5-马来酰亚胺胰蛋白酶截短的Cry1F的剂量反应曲线。图中示出了非标记的Cry1F(●)在0.1至1,000nM的范围内以剂量依赖性方式替代标记的Cry1F的能力。图中描绘了特异性结合的标记的Cry1F(总结合减去非特异性结合)与所添加的非放射性标记的配体的浓度的百分比。示出了非放射性标记的Vip3Ab1(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1F(图8)。示出了非放射性标记的Cry1Ca(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1F(图8)。示出了非放射性标记的Cry1Ea(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1F(图8)。示出了非放射性标记的Cry2Aa(▲)不能在0.1、1、10、100和1,000nM下替代特异性结合的放射性标记的Cry1F(图8)。
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Claims (20)

1.一种转基因植物，其包含编码CrylCa、Cry2Aa、CrylEa和Vip3Ab1杀虫蛋白毒素的DNA。
2.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述植物选自大豆、玉蜀黍和棉花。
3.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述植物是大豆植物。
4.根据权利要求1所述的植物的种子，其中所述种子包含编码CrylCa、Cry2Aa、CrylEa和Vip3Ab1杀虫蛋白毒素的DNA。
5.根据权利要求2所述的植物的种子，其中所述种子包含编码CrylCa、Cry2Aa、CrylEa和Vip3Ab1杀虫蛋白毒素的DNA。
6.根据权利要求3所述的植物的种子，其中所述种子包含编码CrylCa、Cry2Aa、CrylEa和Vip3Ab1杀虫蛋白毒素的DNA。
7.田地中的多棵植物，所述植物包括非苏云金芽孢杆菌庇护植物和根据权利要求1所述的多棵植物，其中所述庇护植物占所述田地中的所有作物植物的40％至5％。
8.田地中的多棵植物，所述植物包括非苏云金芽孢杆菌庇护植物和根据权利要求2所述的多棵植物，其中所述庇护植物占所述田地中的所有作物植物的40％至5％。
9.田地中的多棵植物，所述植物包括非苏云金芽孢杆菌庇护植物和根据权利要求3所述的多棵植物，其中所述庇护植物占所述田地中的所有作物植物的40％至5％。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的多棵植物，其中所述庇护植物布置成块状或带状。
11.一种种子混合物，其包含来自非苏云金芽孢杆菌庇护植物的多粒庇护种子和根据权利要求4所述的多粒种子，其中所述庇护种子占所述混合物中的所有种子的40％至5％。
12.一种种子混合物，其包含来自非苏云金芽孢杆菌庇护植物的多粒庇护种子和根据权利要求5所述的多粒种子，其中所述庇护种子占所述混合物中的所有种子的40％至5％。
13.一种种子混合物，其包含来自非苏云金芽孢杆菌庇护植物的多粒庇护种子和根据权利要求6所述的多粒种子，其中所述庇护种子占所述混合物中的所有种子的40％至5％。
14.一种管理昆虫对苏云金芽孢杆菌毒素产生抗性的方法，所述方法包括在田地中种植种子，以产生根据权利要求7所述的多棵植物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述昆虫选自大豆夜蛾(大豆尺蠖)和黎豆毛虫(黎豆夜蛾)。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述多棵植物是大豆。
17.根据权利要求7至9中任一项所述的多棵植物，其中所述植物占据超过10英亩。
18.一种控制鳞翅目害虫的方法，所述方法包括使所述害虫接触有效量的根据权利要求1至3中任一项所述的植物。
19.一种产生根据权利要求1所述的植物的方法，所述方法包括用包含编码CrylCa、Cry2Aa、CrylEa和Vip3Ab1杀虫蛋白毒素的DNA的遗传表达构建体遗传转化植物细胞。
20.一种产生根据权利要求3所述的植物的方法，所述方法包括用包含编码CrylCa、Cry2Aa、CrylEa和Vip3Ab1杀虫蛋白毒素的DNA的遗传表达构建体遗传转化植物细胞。
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