TW201738380A - 用於植物蟲害管理的四種vip與cry蛋白質毒素之組合 - Google Patents

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Abstract

本發明包括用於控制鱗翅類害蟲之方法與植物，尤其是大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)與黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)昆蟲。該植物以大豆植物為較佳，包括Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa與Vip3Ab1殺蟲蛋白質的一組合。描述使用該植物以延遲或防止昆蟲產生抗性的方法。

Description

用於植物蟲害管理的四種VIP與CRY蛋白質毒素之組合
本申請案主張發明名稱「用於植物蟲害管理的四種VIP與CRY蛋白質毒素之組合」，案號為62/324,490申請於2016年4月19日的美國臨時申請案的優惠期，該申請案中所揭露的內容通過引用併入本文。
本發明一般而言與應用於農業科學之分子生物學領域相關。更具體而言，某些實施例涉及使用DNA片段使殺蟲蛋白質表現於植物中的方法。揭露在基因轉殖植物細胞與植物時於併用保護劑之植物的發展中使用核酸片段的方法。
每年耗費數十億元以控制害蟲而且其對商業作物造成額外數十億元的危害損失。合成之有機化學殺蟲劑早已作為控制害蟲的主要工具，而生物殺蟲劑諸如從蘇力菌Bacillus thuringiensis(B.t.)衍生之殺蟲蛋白質已在一些地方扮演重要角色。透過以B.t.殺蟲蛋白質基因轉形以製造抗蟲植物的能力已革新現代農業並提高殺蟲蛋白質和其基因的重要性與價值。
多個B.t.蛋白質已被用以產生抗蟲基因轉殖植物，至今該植物已被成功註冊並商業化。這些包括用於玉米的Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F與Cry3Bb，用於棉花的Cry1Ac與Cry2Ab，以及用於馬鈴薯的Cry3A。表現這些 蛋白質之商業化產品表現單一蛋白質，除非在期望結合兩種蛋白質之殺蟲光譜的情況下，(例如用於玉米之Cry1Ab和Cry3Bb結合起來以分別對抗鱗翅類害蟲和根蟲)，或者當該蛋白質之獨立行為使得他們是用於在易感性昆蟲族群上延遲發展抗性的有用工具時，(例如用於棉花之Cry1Ac和Cry2Ab結合起來以提供對煙草青蟲的抗性管理)。亦見於美國專利申請公開號2009/0313717，其涉及用於控制玉米穗蟲Helicoverpa zea或玉米穗夜蛾Helicoverpa armigera之一Cry2蛋白質加上一Vip3Aa、Cry1F或Cry1A。世界專利WO 2009/132850涉及用於控制草地夜蛾Spodoptera frugiperda之Cry1F或Cry1A與Vip3Aa。美國專利申請公開號2008/0311096部分涉及用於控制抗Cry1F之歐洲玉米螟ECB的Cry1Ab。世界專利WO 2011/084634A1涉及用於控制秋行軍蟲之Vip3Ab和Cry1Ca。
該抗蟲基因轉殖植物的廣泛使用已引起關注害蟲族群將發展對由這些植物製造之該殺蟲蛋白質的抗性。已提出多種策略以維持基於B.t.之抗蟲性狀的用途，其包括採用高劑量蛋白質結合一庇護區(refuge)以及與不同毒素交替或共同採用(McGaughey等(1998)“B.t.抗性管理”Nature Biotechnol.16：144-146)。
用於昆蟲抗性管理(IRM)堆積(stack)而選用之蛋白質需獨立發揮其殺蟲效果使得對一蛋白質毒素發展之抗性不會對一第二蛋白質毒素賦予抗性(如，對蛋白質毒素沒有交互抗性)。舉例而言，若對“蛋白質A”有抗性之一害蟲族群對“蛋白質B”敏感，可得出結論這沒有交互抗性且結合蛋白質A與蛋白質B可有效地延遲對單獨蛋白質A的抗性。
在缺乏抗性昆蟲族群下，可根據與行為機制和交互抗性潛質 相關之其他特性評估。已提出在鑑定殺蟲蛋白質上使用受體媒介結合大致未顯示出交互抗性(美國專利編號5,866,784)。這種方式中固有之缺乏交互抗性的關鍵預測因子係為該殺蟲蛋白質在一不會在敏感昆蟲物種中競爭受體。
在兩種B.t.-衍生之毒素競爭同一受體的情況下，若在該昆蟲之該受體突變使得其中之一種毒素不在與該受體結合且因此不再對該昆蟲有殺蟲性，有可能該昆蟲也將對該第二種毒素(其競爭性地結合至相同受體)有抗性。意即該昆蟲對兩種B.t.毒素有交互抗性。然而，若兩種毒素結合至不同受體，這可能是該昆蟲不會同時對這兩種毒素具有抗性的跡象。
B.t.毒素列於官方B.t.命名委員會之網站上(Crickmore等；http：//www.btnomenclature.info/)。目前有超過70個主群之Cry(晶體蛋白質)毒素(Cry1-Cry74)，以及額外之Cyt和VIP(營養期殺蟲蛋白質)毒素等。各數字群組中之多個有大寫字母亞群，且該大寫字母亞群有小寫字母的子亞群。(例如Cry1有A-N，而Cry1A有at-j)。
生長於拉丁美洲與北美洲南部的大豆遭受許多鱗翅類害蟲造成之嚴重經濟損害。大豆夜蛾(SBL；Pseudoplusia includens)與黎豆夜蛾(VBC；Anticarsia gemmatalis)被認為是大豆在巴西的主要鱗翅類害蟲。在拉丁美洲剛開始在基因轉殖大豆上使用抗蟲特質以對抗蟲害。在此技術之早期商業化階段，用於大豆之該起始Cry毒素預期為Cry1Ac和Cry1Fa毒素。這兩種Bt毒素係同樣為抗蟲而用於轉殖基因玉米和棉花之Cry毒素。因為此兩種Bt基因高度使用於多種生長季節之多種作物，可預期有相當壓力翅類昆蟲對這些毒素發展抗性。因此，發展具有新的Cry毒素之基因轉殖作物將非常有益 於大豆抗蟲性狀策略的使用，其中該新的Cry毒素有超乎Cry1A和Cry1F級毒素所提供之不同作用模式與不同昆蟲腸道結合位置。
本發明提供具有四種Cry與Vip毒素(Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1)之一組合的基因轉殖大豆植物，該四種毒素可一起使用以對拉丁美洲之基本鱗翅類害蟲提供廣幅光譜的殺蟲活性。我們首次顯示這四種毒素不會競爭結合至在SBL或VBC中腸組織中和Cry1Ac或Cry1Fa結合的受體。這些結果強烈預測，當作為基因轉殖植物中堆積基因之組合表現時，上述蛋白質毒素將提供新的作用模式以抵銷現有之Cry1A和Cry1F抗性，且將減慢或防止對這蛋白質毒素之組合發展新的Bt抗性。
本發明包括一包含編碼Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1殺蟲蛋白質毒素之DNA的基因轉殖植物。該最佳之植物為一大豆植物。本發明進一步包括一植物之一種子，一大豆植物為較佳，其中該大豆種子包括編碼Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1殺蟲蛋白質毒素之DNA。本發明亦涵括在一農地上的多種植物，其包括非B.t.庇護區植物以及多個本發明之基因改造植物，其中所述之庇護區植物組成所述農地之所有作物的40%至5%之間。本發明進一步涵括種子之一混合物，其包括多種來自非B.t.庇護區植物之庇護種子以及多種本發明之基因改造種子，其中所述庇護區種子組成所述混合物中所有種子之40%至5%之間。亦主張一種用於控制鱗翅類害蟲的方法，其包括以一有效數量之本發明之基因改造植物接觸該害蟲。本發明亦包括一種製造本發明之植物的方法，其包括以包含編碼Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1殺蟲蛋白質毒素之DNA的基因表現建構體將一植物細胞基因轉形。
圖1顯示Cry1Ac之同源競爭以取代來自中腸膜囊泡之125I Cry1Ac的結合，其中該中腸膜囊泡係由大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)之幼蟲製備得。下方曲線代表以一單一結合位置模型擬合該數據，而上方曲線係以一雙結合位置模型擬合該數據。
圖2顯示如圖中標號所示之四種不同的Cry與Vip毒素之異源競爭以取代來自中腸膜囊泡之125I Cry1Ac的結合，其中該中腸膜囊泡係由大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)之幼蟲製備得。該多相曲線代表來自Cry1Ac之同源取代結果的擬合以作為比較。
圖3顯示Cry1Ac之同源競爭以取代來自中腸膜囊泡之125I Cry1Ac的結合，其中該中腸膜囊泡係由黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)之幼蟲製備得。該曲線代表以一單一結合位置模型擬合該數據。
圖4顯示如圖中標號所示之四種不同的Cry與Vip毒素之異源競爭以取代來自中腸膜囊泡之125I Cry1Ac的結合，其中該中腸膜囊泡係由黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)之幼蟲製備得。該黑色曲線代表來自Cry1Ac之同源取代結果的擬合以作為比較。
圖5顯示Cry1Fa之同源競爭以取代來自中腸膜囊泡之125I Cry1Fa的結合，其中該中腸膜囊泡係由大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)之幼蟲製備得。該黑色曲線代表以一單一結合位置模型擬合該數據。
圖6顯示如圖中標號所示之四種不同的Cry與Vip毒素之異源競爭以取代來自中腸膜囊泡之125I Cry1Fa的結合，其中該中腸膜囊泡係由黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)之幼蟲製備得。該黑色實線代表來自Cry1Fa 之同源取代結果的擬合以作為比較。
圖7顯示Cry1Fa之同源競爭以取代來自中腸膜囊泡之125I Cry1Fa的結合，其中該中腸膜囊泡係由黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)之幼蟲製備得。該曲線代表以一單一結合位置模型擬合該數據。
圖8顯示如圖中標號所示之四種不同的Cry與Vip毒素之異源競爭以取代來自中腸膜囊泡之125I Cry1Fa的結合，其中該中腸膜囊泡係由黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)之幼蟲製備得。該黑色實線代表來自Cry1Fa之同源取代結果的擬合以作為比較。
本發明有部分涉及驚奇的發現Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1不會和Cry1Ac或Cry1Fa競爭結合在大豆夜蛾(Pseudoplusia includens；SBL)或黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis；VBC)之中腸上的結合位置。因此，一Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1蛋白質能用於在基因轉殖大豆(以及其他植物，例如棉花和玉米)上之抗性管理，以延遲或預防對這些蛋白質單獨的抗性。本發明蛋白質之組合能有效保護植物(諸如大豆、玉米和棉花植物)免於抗Cry之SBL或VBC損害。意即，本發明的運用之一係用以保護大豆以及其他經濟重要植物物種免於受到可對包括但不限於Cry1A或Cry1F之Cry毒素發展抗性之昆蟲族群的損害和收成損失。
本發明因此講授包括但不限於Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1之一種昆蟲抗性管理(IRM)堆積，以預防或減緩SBL或VBC對這些蛋白質之任一發展抗性。
本發明提供用於控制鱗翅類害蟲之組成，該組成包括製造 Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1殺蟲蛋白質之組合的細胞。
本發明進一步包括經轉形以產生Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1殺蟲蛋白質的一宿主，其中該宿主係為一微生物或一植物細胞。本核酸在一或多種非蘇力菌啟動子之控制下的一基因建構體內為較佳的。本核酸密碼子可被植物優化(plant-optimized)以在一植物中加強表現。
另外意圖本發明提供一種控制鱗翅類害蟲的方法，該方法包括以包含一含Cry1Ca核心毒素蛋白質、含Cry2Aa核心毒素蛋白質、含Cry1Ea核心毒素蛋白質或進一步包含一含Vip3Ay1毒素蛋白質之一有效數量的組成接觸所述害蟲或所述害蟲之環境。古典3域B.t.毒素之核心毒素域容易被B.t.晶體毒素殺蟲蛋白質領域之技術人員辨別。
本發明之一實施例包括大豆或玉米植物，該植物包括一可表現於植物上編碼一Cry1Ca殺蟲蛋白質之基因、一可表現於植物上編碼一Cry2Aa殺蟲蛋白質之基因、一可表現於植物上編碼一Cry1Ea殺蟲蛋白質之基因以及一可表現於植物上編碼一Vip3Ab1殺蟲蛋白質之基因和此類植物之種子。
本發明之一進一步實施例包括一玉米或大豆植物，其中一可表現於植物上編碼一Cry1Ca殺蟲蛋白質之基因、一可表現於植物上編碼一Cry2Aa殺蟲蛋白質之基因、一可表現於植物上編碼一Cry1Ea殺蟲蛋白質之基因以及一可表現於植物上編碼一Vip3Ab1殺蟲蛋白質係被漸滲移入該所述玉米或大豆植物以及此類植物之種子。
如實例中所描述，使用放射性標記之Cry1Ac或Cry1Fa蛋白質之競爭性受體結合研究顯示Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa與Vip3Ab1蛋白質不會 在SBL和VBC組織中競爭結合至與Cry1Ac或Cry1Fa結合之該組織。這些結果亦指示Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa與Vip3Ab1蛋白質之該組合可為減緩在SBL與VBC族群中對這些蛋白質發展抗性的一有效方式。因此，部分基於本文所述之數據，認為合製(堆積)Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa與Vip3Ab1蛋白質可用以對SBL和VBC製造一IRM堆積。
其他蛋白質可增加至這一組合。例如，本發明亦部分涉及以Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa與Vip3Ab1四種或更多毒素之堆積(stack)或"堆疊(pyramid)"。在一些較佳之堆疊實施例中，該所選之毒素具有多個對SBL和/或VBC之單獨的作用位置。一些較佳之堆疊組合包括目標蛋白質加上Cry1F、Cry1D、Cry1B、Cry1E、VIP3Aa或VIP3B，作為以VBC和SBL為目標之第三蛋白質。所謂"單獨的作用位置"，是指任一給定之蛋白質不與彼此造成交互抗性。根據本發明，這些特殊之堆積可有利地且驚奇地對VBC和SBL提供多個作用位置。這可幫助減少或消除對庇護面積的需求。
我們展示出Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa與Vip3Ab1不會在SBL或VBC之腸道中和Cry1Ac或Cry1Fa競爭結合位置。亦見於世界專利WO/2011/075585 "用於昆蟲抗性管理的Vip3Ab與Cry1Fa之結合使用"。
因此，本發明之毒素Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa與Vip3Ab1的該組合提供對SBL與VBC之非交互抗性作用。Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa與Vip3Ab1不與在SBL和VBC腸道中Cry1Ac或Cry1F之結合競爭展示出這六個蛋白質毒素(Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa、Vip3Ab1、Cry1F與Cry1Ac)代表在SBL和VBC之腸道中提供3-4個單獨的目標位置交互作用之Cry毒素。根據本發明，這些特殊之堆積可有利地且驚奇地對VBC和SBL提供非交互抗性之作 用。此外，經由這四個蛋白質不與彼此競爭之展示，本領域之技術人員將認可這可幫助減少或消除對庇護面積的需求。如同本發明之益處，表現Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa與Vip3Ab1之四重組合的植物，於延遲或防止在SBL與VBC上對這些蛋白質單獨或其組合發展抗性上將是有用的。
根據本發明，亦可添加額外的毒素和基因。例如，若Cry1Fa或Cry1Ac與本發明之蛋白質(Cry1Fa和Cry1Ac對SBL和VBC為活性的)堆積，加入額外的蛋白質到此堆積將對這些害蟲提供至少三個獨自的作用位置，其中該兩個額外的蛋白質以SBL且/或VBC為目標。這兩個加入的蛋白質將導致對兩種昆蟲(SBL和VBC)具有高達四種模式之作用活性的一多毒素堆積。
根據本發明，當Cry1Fa對SBL和VBC有活性，Vip3Ab1、Cry2Aa、Cry1Ea或Cry1Ca加上Cry1Fa將有利地且驚奇地提供三個或更多作用位置對抗SBL和VBC。這可以幫助減少或消除對庇護面積的需求。
Cry1Fa係配置於Herculex®,SmartStaxTM,PowerCoreTM以及WidesStrikeTM產品。舉例而言，本發明之基因(Vip3Ab1、Cry2Aa、Cry1Ea與Cry1Ca)組合可結合至一Cry1Fa產品諸如Herculex®、SmartStaxTM和WideStrikeTM或Cry1A產品諸如WideStrikeTM。於是，本發明之四毒素組合在這些或其他Cry蛋白質毒素上減少選擇壓力係為重要的。因此，本發明之四毒素組合可用於大豆、玉米以及其他植物如棉花；然而大豆為較佳的。如上述討論，根據本發明，亦可添加額外的Cry毒素或基於RNAi之殺蟲劑。
Cry毒素列於官方B.t.命名委員會之網站上(Crickmore等.；http：//www.btnomenclature.info/)且可用GENBANK取得本發明所揭露或提及 之任一基因或蛋白質的序列。相關序列亦可在專利中獲得。例如，美國專利編號5,188,960與美國專利編號5,827,514描述包含適合用於實行本發明Cry1Fa核心毒素。美國專利編號6,218,188描述編碼包含適合用於本發明之Cry1Fa核心蛋白質的植物優化DNA序列。USSN 61/284,275(申請於2009年12月16日)提供一些截短的Cry1Da蛋白質，其根據本發明可被使用。
所述之蛋白質組合可用以控制鱗翅類害蟲。鱗翅類害蟲之成體，例如蝴蝶和蛾，主要覓食於花蜜上且為授粉之一重要的效應物。幾乎所有鱗翅類幼蟲，即毛蟲，於植物上覓食，而且他們許多都是嚴重的害蟲。毛蟲在一植物之葉子上或內、根或莖上覓食，剝奪植物的養分並且經常破壞該植物的物理性支撐結構。此外，毛蟲於果實、纖維以及儲存之穀粒與麵粉上覓食，毀壞這些販售用之產品或嚴重減少他們的價值。如本文所用，提及鱗翅類害蟲係指該害蟲之各種生命階段，包括幼蟲階段。
一些本發明之嵌合體毒素包括一B.t.毒素之完整的N端核心毒素部分，以及在超過該核心毒素部分之尾端後的某一點，該蛋白質轉換成一異源原毒素(protoxin)序列。一B.t.毒素之有殺蟲活性的毒素N端端部分係指稱為該核心毒素。從核心毒素片段轉換成該異源原毒素片段可大約發生在該毒素/原毒素接合處，或一替代方案，當該轉換成該異源原毒素發生在下游，該天然原毒素之一部分(延伸通過核心毒素部分)可被維持。
作為一實例，本發明之一嵌合體毒素係為Cry1Ca、Cry1Ea或Cry2Aa之一完整的核心毒素部分(大致為一開始的600個胺基酸)以及一異源原毒素(到C端所剩餘的胺基酸。)。在一較佳之實施例中，一嵌合體毒素之該部分包括由一Cry1Ab蛋白質毒素衍生而得之原毒素。
本技術領域之普通技術人員應理解，即便在一特定分類中諸如Cry1Ea，B.t.毒素在長度上以及從核心毒素部分轉換成原毒素部分之確切位置上有某些程度之變化。該Cry1Ea毒素之長度通常為約1150至約1200個胺基酸。從核心毒素部分轉換成原毒素部分通常發生在毒素全長度之約50%至約60%之間。本發明之該嵌合毒素將包括此N端核心毒素部分的完整區域。因此，該嵌合體毒素將包括該Cry1B.t.毒素蛋白質之全長的至少約50%。這通常至少大約為590個胺基酸。至於該原毒素部分，該Cry1Ab原毒素之完整區域從核心毒素之尾端延伸至該分子之C端。
基因與毒素：根據本發明，該有用的基因與毒素不止包括所揭露之全長度序列，亦包括保留本文具體示例之該毒素的特徵殺蟲活性的這些序列片段、變異體、突變體以及融合蛋白質。如本文所用，該術語基因之"變異體"或"變異"係指編碼相同毒素或編碼具殺蟲活性之等效毒素的核苷酸序列。如本文所用，該術語"等效毒素"係指對該目標害蟲具有與該主張之毒素相同或大致相同生物活性之毒素。
如本文所用，該界限代表大約95%(Vip3Ab的、Cry1Ea的、Cry1Ca的和Cry2Aa的)、78%(Vip3A的、Cry1C的、Cry1E的和Cry2A的)以及45%(Cry1的、Cry2的和Vip3的)序列相同度，根據“蘇力菌殺蟲晶體蛋白質命名法的修訂Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins,”N.Crickmore,D.R.Zeigler,J.Feitelson,E.Schnepf,J.Van Rie,D.Lereclus,J.Baum,and D.H.Dean，Microbiology and Molecular Biology Reviews(1998)Vol 62：807-813。這些截止值亦可施用至只有該核心毒素。
對本領域技術人員而言應該是顯而易見的，編碼活性毒素之 基因可被辨識並透過多種方式獲得。本文所示例之特定基因或基因部分可由沈積在一培養基之分離株獲得。這些基因或其部分或變異體亦可合成建構，例如使用一基因合成器。使用用於製造點突變之標準技術可容易建構基因之變異。以及，這些基因之片段可用市售之核酸外切酶或核酸內切酶根據標準程序產生。舉例而言，可用酶諸如Bal31或定點突變以系統性地從這些基因的末端切除核苷酸。編碼活性片段之基因亦可使用多種限制酶而獲得。可用蛋白酶以直接獲得這些蛋白質毒素之活性片段。
維持該殺蟲活性之該所示例之毒素的片段與等效毒素係在本發明之範圍內。以及，因為該基因編碼之重複性，多種不同之DNA序列可編碼本發明所述之胺基酸序列。創造這些編碼相同或大致相同之毒素的替代DNA序列係在本領域訓練之人員的技術內。這些變異的DNA序列係在本發明之範圍內。如本文所用，提及之"大致相同"序列係指具有胺基酸取代、刪除、增加或插入之序列，其實質上不影響殺蟲活性。編碼維持殺蟲活性之蛋白質的基因片段亦包含於此一定義內。
一用於鑑定編碼毒素之基因與根據本發明有用之基因片段的進一步方法係透過使用寡核苷酸探針。這些探針可偵測核苷酸序列。這些序列可藉由一適當的標記或可使其自帶螢光而偵測，如國際專利申請編號WO93/16094所述。如同本領域所熟知，若該探針分子以及核苷酸樣品藉由在該兩個分子間形成一強烈鍵結而雜交，可合理假設該探針與該樣品具有本質上的同源。較佳的是，雜交在嚴格條件下以本領域熟知之技術進行，例如如同Keller,G.H.,M.M.Manak(1987)DNA探針DNA Probes,Stockton Press,New York,N.Y.,pp.169-170中所述。鹽類濃度與溫度組合的一些實例 如下(依據嚴格度增加的順序)：2倍SSPE或SSC於室溫下；1倍SSPE或SSC在42℃；0.1倍SSPE或SSC在42℃；0.1倍SSPE或SSC在65℃。該探針之偵測提供一種用於測定雜交是否發生的方法。此類探針分析提供一種用於鑑定本發明之編碼毒素之基因的快速方法。根據本發明，該用作探針之核苷酸片段可用一DNA合成器和標準程序合成。這些核苷酸序列亦可用作PCR聚合酶連鎖反應之引子以擴增本發明之基因。
變種毒素：本發明之某些毒素已在此具體示例。因為這些毒素僅為本發明之毒素的示例，顯而易見，本發明包括具有與該示例性毒素相同或相似殺蟲毒性的變異體或等效毒素(以及編碼等效毒素之核苷酸序列)。等效毒素將與一示例之毒素具有胺基酸同源性。此一胺基酸同源性通常為大於75%，較佳為大於90%，且最佳為大於95%。在該毒素之關鍵區的該胺基酸同源性將為最高，其說明生物活性或參與三維構形之決定，該三維構形最終為該生物活性負責。在這方面，某些胺基酸取代為可接受的且可被預期，若這些取代不在對活性關鍵的區域或者為不影響該分子三維構形之保留式胺基酸取代。例如，胺基酸可處在以下分類中：非極性、極性不帶電、鹼性與酸性。一分類之一胺基酸被該同一類之另一胺基酸取代之保留式取代落在本發明之範圍內，只要該取代不會實質上改變該化合物之生物活性。以下列出屬於各分類之胺基酸實例。
在一些實例中，亦可製造非保留式取代。該關鍵因素係為這些取代必須不會顯著減損該毒素之生物活性。
重組宿主：編碼本發明之毒素的基因可被引入種類繁多之微生物的或植物宿主。該毒素基因之表現直接或間接地致使該殺蟲劑在細胞內製造並維持。接合轉移與重組轉移可被用來創造一B.t.菌株，其可表現本發明之兩種毒素。其他宿主有機體亦可用該毒素基因之一或兩者轉形然後使用以實現該加成效應。以合適之微生物宿主例如假單胞菌(Pseudomonas)，該微生物可施用至該害蟲之環境，微生物在那邊增殖並被攝入。該結果為該害蟲的控制。或者，可在延長該毒素之活性與穩定該細胞之條件下處理作為該毒素基因的該微生物。維持該有毒活性之處理過的細胞可接著施用至該目標害蟲之環境。
當該B.t.毒素基因經由一合適之載體而被引入至一微生物宿主，且該所述宿主以活的狀態施用至該環境，必須使用某些宿主。選擇已知佔領一或多個感興趣作物之植物圈(葉面、葉片、根圈和/或根面)的微 生物作為微生物宿主。這些微生物被選擇以便可在該特殊環境中(作物以及其他昆蟲棲所)成功與野生型微生物競爭、提供表現該多胜肽殺蟲劑之基因穩定維持與表現、並期望提供改善殺蟲劑之保護使環境免於劣化與去活性化。
已知大批微生物抑制種類繁多之重要作物的該葉面(植物葉子之表面)和/或該根圈(植物跟不周圍之土壤)。這些微生物包括細菌、藻類與真菌。特別感興趣的是微生物，諸如細菌如假單胞菌屬Pseudomonas、歐文氏菌屬Erwinia、沙雷氏菌屬Serratia、克雷伯氏菌屬Klebsiella、黃單胞菌屬Xanthomonas、鏈黴菌屬Streptomyces、根瘤菌屬Rhizobium、紅假單胞菌屬Rhodopseudomonas、嗜甲基菌屬Methylophilius、土壤桿菌屬Agrobactenum、醋酸桿菌屬Acetobacter、乳酸菌屬Lactobacillus、關節桿菌屬Arthrobacter、固氮菌Azotobacter、白念珠菌屬Leuconostoc以及產鹼桿菌屬Alcaligenes；真菌，特別是酵母菌如酵母屬Saccharomyces、芽生菌屬Cryptococcus、克魯維酵母屬Kluyveromyces、擲孢酵母屬Sporobolomyces、紅酵母屬Rhodotorula以及短梗黴菌屬Aureobasidium。特別有興趣之此類植物圈細菌物種種諸如丁香假單胞菌Pseudomonas syringae、螢光假單胞菌Pseudomonas fluorescens、黏質沙雷氏菌Serratia marcescens、木醋酸桿菌Acetobacter xylinum、根癌土壤桿菌Agrobactenium tumefaciens、隱球紅假單胞菌Rhodopseudomonas spheroides、野油菜黃單胞菌Xanthomonas campestris、目蓿根瘤菌Rhizobium melioti、真氧產鹼桿菌Alcaligenes entrophus以及維涅藍德固氮菌Azotobacter vinlandii；以及植物圈酵母物種諸如深紅酵母Rhodotorula rubra、粘紅酵母R.glutinis、海洋紅酵母R.marina、 授紅酵母R.aurantiaca、白色隱球菌酵母孢菌Cryptococcus albidus、流散隱球菌C.diffluens、羅倫特隱球菌C.laurentii、羅斯酵母Saccharomyces rosei、有孢酵母S.pretoriensis、釀酒酵母S.cerevisiae、拋孢酵母菌Sporobolomyces roseus、香味擲孢酵母S.odorus、維羅那克魯維酵母Kluyveromyces veronae以及出芽短梗黴Aureobasidium pollulans。特別感興趣的是著色微生物。
在允許基因之穩定維持和表達之條件下，可使用各式各樣的方法將一編碼一毒素之B.t.基因引入至一微生物宿主。這些方法係為本領域之技術人員所熟知，且例如在美國專利編號5,135,867所述，其通過引用併入本文。
細胞處理：蘇力菌或表現該B.t.毒素之重組細胞可經由處理以延長其有毒活性並穩定該細胞。所形成之殺蟲微囊包括在一細胞結構中之該B.t.毒素或毒素們，該細胞結構已被穩定且當該微囊被施用至該目標害蟲之環境時將保護該毒素。合適之宿主細胞可包括原核生物或真核生物，通常限制在不製造對高等生物如哺乳類有毒之物質的那些細胞。然而，當該有毒物質不穩定或適用程度低到不會對哺乳類宿主有任何毒性，可使用製造對高等生物有毒之物質的有機體。特別感興趣的將是以原核生物或低等真核生物如真菌作為宿主。
處理時，該細胞通常為完整且基本上處在增殖形式而非在一孢子形式，儘管在一些實例中可使用孢子形式。
可用化學性或物理性方式或一化學性和/或物理性方式的組合處理該微生物細胞，例如一包含該B.t.毒素基因之微生物，只要該技術不對該毒素性質有不好影響或不減少該細胞保護該毒素的能力。化學試劑之 實例為鹵化劑，特別是鹵化劑含分子數17-80。更具體的說，可在溫和條件下使用碘以及足夠時間以達到預期的結果。其他適合的技術包括以下列溶液處理：醛類如戊二醛；抗感染劑如殺藻胺氯化物和氯化十六烷基吡啶；醇類如異丙醇和乙醇；各種組織固定劑如盧戈氏碘液(Lugo iodine)、布恩氏固定劑(Boulin's fixative)和海利氏固定劑(Helly's fixative)(參見Humason,Gretchen L.，動物組織技術Animal Tissue Techniques,W.H.Freeman and Company,1967)；或一物理性(加熱)和化學試劑的組合，當該細胞進入該宿主環境時該化學試劑保持並延長在該細胞中所製造之毒素的活性。物理性方式之實例為短波輻射如伽馬輻射線和X-輻射線、冷凍、紫外光照射、冷凍乾燥等等。用於處理微生物細胞的方法係揭露於美國專利編號4,695,455和4,695,462，其通過引用併入本文。
該細胞通常有被強化之結構穩定性且其將增強對環境條件的抗性。當該殺蟲劑在一前型(proform)時，應選擇細胞處理法不會被該目標害蟲病原體抑制處理該殺蟲劑之前型至成熟型。例如，甲醛會交聯蛋白質並可抑制處理一多胜肽殺蟲劑之前型。本處理方法應至少維持該毒素大部分的生物有效性與生物活性。
選擇用於製造目的之宿主細胞時特別感興趣的特徵包括易於將該B.t.基因引入該宿主、表現系統的可用性、表現的效率、殺蟲劑於在宿主中的穩定性以及存有輔助遺傳的能力。用作殺蟲劑微囊之感興趣的特徵包括對殺蟲劑的保護特質如厚細胞壁、著色和細胞內包裝或形成包涵體；存活於水性環境；不具哺乳動物毒性；對害蟲有攝入吸引力、易於終止和固定而不損壞該毒素。其他考量包括易於製劑和處理、經濟性、穩定 性等等。
細胞生長：包含B.t.殺蟲基因的細胞宿主可在任何方便的營養培養基中生長，其中DNA建構體提供一選擇性優勢，提供一選擇性培養基使得基本上全部或全部細胞保留B.t.基因。接著可用常規方式獲取這些細胞。或者，可在獲取這些細胞前處理該細胞。
製造本發明之毒素的B.t.細胞可使用標準技術培養基和發酵技術製造。當發酵循環完成時，可以使用本領域所熟知之方法先從發酵培養液中將B.t.孢子與結晶分離出而獲取該細菌。回收得之B.t.孢子與結晶可藉由添加介面活性劑、分散劑、惰性載體以及其他成份而配製成可濕性粉劑、液體濃縮物、顆粒或其他劑型，以協助處理並施用於特定目標害蟲。這些劑型與施用程序為本領域所熟知的。
劑型：可將包含引誘劑以及B.t.分離物之孢子、結晶和毒素之所製備的誘餌顆粒，或是包含本文所揭露之B.t.分離物獲得之基因的重組微生物施用至土壤。在作物週期之晚期亦可施用配製得之產物作為一種子包覆或根處理或全植物處理。藉由與多樣惰性材料混合，如無機礦物質(頁矽酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等等)或植物材料(粉狀玉米芯、稻穀、胡桃殼等等)，B.t.細胞之植物與土壤處理可作為可濕性粉劑、顆粒或粉劑使用。該劑型可包含塗布黏著劑佐劑、穩定劑、其他殺蟲添加劑或介面活性劑。液態劑型可為基於水或非基於水的並作為泡沫、凝膠、懸浮液、乳劑等等而使用。該成份可包括流變劑、介面活性劑、乳化劑、分散劑或聚合物。
本領域之技術人員應理解，取決於特定劑型之性質，殺蟲劑 濃度變化很大，特別是其是否為濃縮的或是否為直接使用的。殺蟲劑以重量計至少存有1%且以重量計可為100%。乾式劑型以重量計有大約1-95%之殺蟲劑，而液態劑型以重量計一般有大約1-60%固體在液相中。該劑型通常有約102至約104cells/mg。以每公頃50毫克(液態或乾式)至1公斤或更多施加這些劑型。
這些劑型可藉由噴霧、撒粉、噴灑等等而施加至該鱗翅類害蟲之環境如葉子或土壤。
植物轉形：用於製造本發明之殺蟲蛋白質之一較佳的重組宿主係為一被轉形的植物。非分化全能之植物細胞亦為本發明之一對象，並可用本發明之基因轉形以達到類似結果。可使用多種本領域所熟知之技術將編碼如本文所揭露之B.t.毒素蛋白質的基因插入植物細胞。例如，可有大量包含一大腸桿菌Escherichia coli之複製系統與一允許選擇該被轉形細胞之標記的選殖載體以用於準備將該外源基因插入高等植物。該載體包括特別是例如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184。因此，具有編碼一個別B.t.毒素蛋白質之序列的DNA片段或本發明之毒素組合可在合適之限制位插入至載體。所得之質體被用於轉形至大腸桿菌E.coli。大腸桿菌E.coli細胞在一合適之營養培養基培養，然後獲取並裂解。回收質體。序列分析、限制分析、電泳以及其他生化分子生物性方法為常進行之分析方法。在每次操作之後，所用之DNA序列可被切割並接合至下一DNA序列。每一質體序列可被轉殖於相同或其他質體。取決將期望之基因插入至植物的方法，可能需要其他DNA序列。舉例而言，若Ti或Ri質體用於該植物細胞之轉形，那麼至少Ti或Ri質體的右邊界，但通常是Ti或Ri質體T-DNA的右邊界和左邊 界，必須接合以作為待插入基因之側翼區。使用T-DNA於植物細胞之轉形已被深入研究並充分描述於歐洲專利EP 120 516,Lee和Gelvin(2008)、Hoekema(1985)、Fraley等(1986)以及An等(1985)，且在本領域已相當成熟。
一旦所插入之DNA被整合至植物基因組，便會相對穩定。轉形載體通常包含一選擇標記，該標記賦予轉形植物細胞對一殺生物劑或一抗生素，特別是例如雙丙胺磷(Bialaphos)、康黴素(Kanamycin)、G418、博萊黴素(Bleomycin)或潮黴素(Hygromycin)的抗性。單獨使用之標記應允許選擇轉化的細胞而非不包含插入DNA的細胞。
有大量可用於將DNA插入一植物宿主細胞的技術。這些技術包括使用根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens或毛根土壤桿菌Agrobacterium rhizogenes作為轉形試劑之T-DNA轉形、融合、注入、基因槍法(微粒撞擊)或電穿孔以及其他可能的方法。若土壤桿菌用於轉形，待插入DNA必須被轉殖至特殊質體，即或轉殖入一中間載體或轉殖入一二元載體。中間載體可藉由同源重組整合至該Ti或Ri質體，由於其序列與T-DNA之序列同源。Ti或Ri亦包括T-DNA轉移所必須之致病基因表現區(vir region)。中間載體無法在農桿菌中自我複製。中間載體可藉由輔助質體轉移至根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens(接合)。二元載體可在大腸桿菌E.coli和農桿菌中自我複製。他們包括一選擇標記基因以及一被T-DNA左右邊界區域框定之連接器或多連接器。他們可直接轉形至農桿菌(Holsters et al.,1978)。作為宿主細胞之農桿菌Agrobacterium包括攜帶一致病基因表現區的質體。致病基因表現區對將T-DNA轉移至該植物細胞而言是必須的。可包含額外的T-DNA。使用被如此轉形之細菌轉形植物細胞。可有效地用 根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens或毛根土壤桿菌Agrobacterium rhizogenes培養植物外植體，以將DNA轉移至該植物細胞。可從被感染之植物材料(例如葉片、莖段、根還有原生質體或懸浮培養的細胞)在一合適之介質中再生整個植物。如此得到之植物可接著測試是否存在該插入之DNA。在注射與電穿孔之情況下，對質體沒有特殊要求。可以使用普通的質體，例如pUC衍生物。
被轉形之細胞以一般方式在植物中生長。他們可形成生殖細胞並將該轉形之性狀傳遞至後代植物。此類植物可正常生長並與具有相同轉形遺傳因子或其他遺傳因子之植物雜交。所得之雜交個體具有相對應之表現型特徵。
在本發明之一較佳的實施例中，使用其密碼子已對植物最佳化之基因轉形植物。參見如美國專利編號5,380,831，其通過引用併入本文。儘管本文示例一些被截短之毒素，但在B.t.領域中眾所周知130kDa型(全長)毒素有一為核心毒素之N端半部以及為原毒素(protoxin)“尾端”之一C端半部。因此，適當的“尾端”可與本發明之截短/核心毒素一起使用。參見如美國專利編號6,218,188與美國專利編號6,673,990。此外，用來生成在植物使用之合成的B.t.基因的方法為本領域所熟知(Stewart與Burgin，2007)。一較佳的轉形植物的一非限制性實例為可孕性玉米植物，其包括編碼一Vip3Ab1蛋白質之一植物可表現基因，進一步包括編碼一Cry1Ca蛋白質之一第二植物可表現基因，進一步包括編碼一Cry1Ea蛋白質之一第三植物可表現基因，以及更進一步包括編碼一Cry2Aa蛋白質之一第四植物可表現基因。
將Cry1Ca-、Cry1Ea-、Cry2Aa-與Vip3Ab1-確定之性徵轉移或 漸滲(introgression)至精選大豆系，將可藉由使用傳統育種方法之異性雜交達成。將本發明之毒素組合漸滲入近親交配玉米系可藉由輪迴選拔育種達成，例如逆代雜交(backcrossing)。在這狀況下，一期望之輪迴親體先與一近親交配供給體(非輪迴親體)雜交，該近親交配供給體攜帶Cry1Ca-、Cry1Ea-、Cry2Aa-與Vip3Ab1-確定之性徵的適當基因。此雜交之後代接著與輪迴親體回交，接著在所產生之後代中選擇從非輪迴親體轉移之所期望的性徵。與輪迴親體逆代雜交三次、較佳為四次、更佳的是五次或更多代並選擇期望之性徵後，後代在控制被轉移之性徵之基因座係為異型結合，但對大多數或幾乎全部其他基因而言，其就像該輪迴親體一樣(參見如Poehlman & Sleper(1995)農地作物育種Breeding Field Crops,4th Ed.,172-175；Fehr(1987)Principles of Cultivar Development,Vol.1：Theory and Technique,360-376)。昆蟲抗性管理(IRM)策略：例如，Roush概述雙毒素策略，亦稱為"堆疊(pyramiding)"或"堆積(stacking)"，用於管理殺蟲基因轉殖作物。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353,17771786)。
美國環境保護局在其網站(epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)發表下述要求，要求提供非基因轉殖(例如非B.t.庇護植物)庇護區，其為一區域之非B.t.植物，與可製造對害蟲有活性之一單一B.t.蛋白質的基因轉殖作物一起使用。
"用於對抗玉米螟之Bt(Cry1Ab或ry1F)玉米產品之具體結構性要求如下：結構性的庇護區：在玉米帶中，20%非鱗翅類Bt玉米庇護區；在棉花帶中，50%非鱗翅類Bt庇護區。區塊內部(即在Bt田地之內)、外部 (即在該Bt農地之1/2英里內分開的農地，(可能的話1/4英里)以最大化隨機交配)。農地內帶狀，帶狀必須至少4行寬(6行為較佳的)以減少幼蟲運動效應"
此外，美國國家玉米生產者協會在其網站上：(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)亦提供對該庇護區需求之類似的指導。例如："玉米螟IRM之要求：
-種植至少20%之玉米田成庇護區混合
-在棉花製造區域，庇護區必須為50%
-必須種植在該庇護區混合之1/2英里之內
-庇護區必須在該Bt田地內種植成帶狀；該庇護區帶狀必須至少4行寬
-庇護區可用傳統殺蟲劑處理，只有當對目標昆蟲達到經濟門檻時
-基於Bt之可噴霧的殺蟲劑不可用於該庇護區玉米
-在每一塊有Bt玉米的農田必須種植適當的庇護區
如同Roush等所述(例如在1780頁與1784頁右欄)，兩種不同蛋白質之堆積或堆疊可允許用於一較小的庇護區，其中該兩個蛋白質之每一個均對該目標害蟲有活性且具有少許或沒有交叉抗性。Roush建議對一成功的堆積，一庇護區大小少於10%庇護區，可提供與對一單一(非堆疊的)性狀約50%庇護區相匹敵之抗性管理。對目前可用之堆疊B.t.玉米產品，美國環境保護局要求明顯較少(通常5%)之種植非B.t.玉米的結構性庇護區，與單一性狀產品(通常為20%)相比。
有多種方法在一庇護區提供該IRM效應，包括在農地上各樣幾何種植樣式(如上述)以及袋裝種子混合物，如Roush等之進一步討論(前 文)以及美國專利編號6,551,962。
上述百分比或類似之庇護比率，可用於本雙重、三重或四重堆積或堆疊。對以三或四個對一單一目標害蟲之作用位置的三重或四重堆積而言，目標可為0庇護區(或例如至少5%庇護區)。對商業化面積，例如超過10英畝，尤其如此。
本文所提及之所有專利、專利申請、臨時申請與出版品皆通過引用併入本文，其限度與本說明書之明確教導沒有不一致。
除非特別指出或暗示，如本文所用之該術語“一”、“一個”和“該”象徵“至少一個”。
以下是用於實施本發明之說明程序的實例。這些實例不應解釋為限制性的。除非另外說明，所有百分比皆為以重量計且所有溶劑混合物比例皆為以體積計。所有溫度皆為攝氏度。
實例
實例1-Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa與Vip3Ab1蛋白質之製造與胰蛋白酶處理
編碼Cry1Ca、Cry1Ea與Cry2Aa原毒素之基因被表現於螢光假單胞菌Pseudomonas fluorescens表現株且該全長度蛋白質作為不可溶之包涵體而被分離。被洗出之包涵體藉由在37℃下於包含20mMCAPS緩衝劑、pH值11、+10mM DDT、+0.1% 2-巰乙醇之緩衝液中攪拌2小時而溶解。該溶液在37℃於27,000 x g下離心10分鐘，且以0.5%(重量/體積)TPCK處理之胰蛋白酶(西格瑪Sigma)處理該上清液。將此溶液與混合物一起於室溫下額外溫育一小時、過濾，接著載入至一Pharmacia Mono QTM 1010管柱以20mM CAPS pH 10.5平衡。以2管柱體積之緩衝液沖洗該所載入之管柱，以一線性梯度0至0.5M氯化鈉於20mM CAPS於15管柱體積以流速1.0毫升/分洗滌該被截短之毒素。純化之胰蛋白酶截短的Cry蛋白質於大約0.2-0.3M氯化鈉下洗滌。用SDS PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)檢查該蛋白質之純度，使用考馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue)染料顯影。在某些情況下，將純化之毒素之結合的餾分(fraction)濃縮並載入至一Superose 6管柱(直徑1.6公分、長度60公分)，並以尺寸排阻層析法進一步純化。結合包含單一分子量之一單峰的餾分，並濃縮而產生一具分子量約60,000kDa之蛋白質超過95%同質的製劑。
從純化之全長85kDg蛋白質開始，以一相似方法處理Vip3Ab1。該蛋白質(12mg)被透析至50mM磷酸鈉緩衝液、pH8.4，接著加入1mg固態胰蛋白酶處理並在室溫下溫育1小時。將該溶液載入一MonoQTM陰離子交換管柱(直徑1公分，長度10公分)，並以一線性梯度之氯化鈉從0至500mM於20mM磷酸鈉緩衝液中pH8.4超過7管柱體積洗滌。以SDS-PAGE監測該蛋白質之洗滌。該主要處理帶有一分子量65kDa，如SDS-PAGE使用分子量標準比較而測得。
實例2-Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa與Vip3Ab1在SBL與VBC上之殺蟲活性
B.t.殺蟲毒素Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa與Vip3Ab1被證明在包括大豆夜蛾(Pseudoplusia includens，SBL)與黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis，VBC)之鱗翅類物種為有活性的。
樣品製備與生物檢驗測試：包涵體製備於10mM CAPS pH10被適當地稀釋於10mM CAPS、pH10，且所有生物檢驗測試包含一包括緩衝 液之控制處理，其作為死亡率之背景檢查。
在生物檢查測試緩衝液之蛋白質濃度係藉由使用BSA為凝膠密度測定產生一標準曲線之凝膠電泳估算，其係使用一BioRad影像系統(Fluor-S MultiImagerTM使用Quantity One軟體版本4.5.2)。在該凝膠基質之蛋白質以考馬斯藍染色並在讀值前去染色。
以在人造昆蟲飼料上新生之鱗翅類幼蟲進行生物檢驗測試，測試所純化之蛋白質的殺蟲活性。SBL與VBC之幼蟲從卵孵化，該卵係從一由商業養蟲室(Benzon Research Inc.,Carlisle,PA)所維持之一群體而得。
在特別為昆蟲生物檢驗測試設計之128孔塑膠托盤(C-D International,Pitman,NJ)上進行這些生物檢驗測試。每一微孔包含1.0mL之多物種鱗翅類飼料(Southland Products,Lake Village,AR)。一40μL等分之蛋白質樣品使用吸量管傳送至每一孔(26.7μL/cm2)之1.5cm2飼料表面。Cry蛋白質濃度係以在孔表面積之每平方公分(cm2)內的蛋白質數量(ng)計算。將處理過之托盤放在通風儲直到該飼料表面積內之液體蒸發或被吸收至飼料內。
在羽化之幾個小時內，以一濕潤之駱駝毛刷揀起個別幼蟲，並放至已被處理之飼料，每一微孔一幼蟲。以透明塑膠黏著片密封感染的微孔，通風以允許氣體交換(C-D International,Pitman,NJ)。將生物檢驗測試托盤在控制之環境條件下(28℃、相對濕度~60%、16：8[亮：暗])放五天，之後紀錄暴露至每一蛋白質樣品的總數以及死亡昆蟲的數目。對每一種處理均計算死亡率百分比。
對死亡率+++=LC50<100ng/cm2；++=LC50在100-1,000ng/cm2之間，以及+=LC50在1,000和3,000ng/cm2之間。
實例3-Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa核心毒素蛋白質之碘化
該放射性標記之Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa蛋白質以SDS-PAGE定性並由螢光成像檢視以驗證該測得之放射性與該Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa核心毒素蛋白質為共價性結合。考馬斯染色之SDS-PAGE凝膠藉由將其包覆於MylarTM底片(12μm厚)中成像，並將其暴露在一Molecular Dynamics(Sunnyvale,CA)存儲螢光螢幕(35cm x 43cm)中1小時。使用一Molecular Dynamics Storm 820螢光成像器顯影並使用ImageQuantTM軟體分析影像。在Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa核心毒素蛋白質帶下之微孔的凝膠區域中可偵測一些放射活性。這些放射活性污染物可能代表小胜肽可能在截短之Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa蛋白質內結合，歸因於用以切斷蛋白質至其核心結構的胰蛋 白酶的作用。
實例4-對來自SBL與VBC之BBMV(刷狀緣魔囊泡)的競爭性結合檢驗與核心毒素蛋白質Cry1Ca、Cry1Ea、Cry2Aa與Vip3Ab1。
同源與異源競爭結合檢驗係使用150μg/mL BBMV蛋白質與2nM之該125I-放射性標記之Cry1Ac或Cry1F核心毒素蛋白質進行。同源競爭之非放射性標記的Cry1Ac或Cry1F核心毒素蛋白質加入至該反應混合的濃渡為0.1、1、10、100以及1000nM。異源胰蛋白酶截短之Cry1Ca、Cry1Ea或Cry2Aa或全長之Vip3Ab1蛋白質在0.1、1、10、100以及1000nM測試，且該蛋白質和具放射活性之Cry1Ac或Cry1F同一時間加入已確保真正的結合競爭。在28℃進行溫育1小時，且藉由在16,000 x g下將該BBMV混合物離心8分鐘將未和BBMV結合(即未和一昆蟲售體蛋白質結合)之125I-標記之Cry1Ac或Cry1F核心毒素蛋白質的量與結合之蛋白質的量分開，並自所得之沈澱物移除上清液。以冰冷之結合緩衝液(PBS；11.9mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl、pH7.4加上0.1%牛血清蛋白；西格瑪-奧瑞奇Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)沖洗沈澱物三次，以完全移除任何殘留之未結合的125I標記之Cry1Ac或Cry1F。剪下離心管末端並將包含在內之蛋白質沈澱物放置於一13 x 100mm玻璃培養管，並在一伽馬計數器計數10分鐘以獲得包含在沈澱餾分中結合之放射活性的量。結合之蛋白質餾分內之放射活性的量係對結合至昆蟲受體之Cry蛋白質(全部結合)的量提供指示。於存有1,000nM之非放射性標記之Cry1Ac或Cry1F核心毒素蛋白質時，在沈澱物中所得之量代表非專一性結合。放射性標記之Cry1Ac或Cry1F特定結合至BBMV的量(專一性結合)係藉由將全部結合程度減去非專一性結合而量測得。100百分比之完全結合 係視為沒有任何Cry1Ac或Cry1F核心毒素蛋白質競爭者時的結合量。以特殊結合之125I Cry1Ac或Cry1F之百分比對競爭性未標記之配體濃度來表示數據。
實例5-結果歸納
結果(圖1和3)顯示同源未標記之Cry1Ac蛋白質從專一性結合至BBMV蛋白質在劑量依存性下有效地取代放射性標記之Cry1Ac核心毒素蛋白質。Vip3Ab1在任一所示濃度(0.1、1、10、100或1,000nM)並未從其受體蛋白質取代結合的125I標記之Cry1Ac核心毒素白質。所測試之Vip3Ab1的最高濃度(1,000nM)代表比檢驗測試中所用之放射性標記Cry1Ac濃度的500倍高，顯示Vip3Ab1無法有效地與SBL或VBC BBMV中放射性標記之Cry1Ac的結合相競爭。Cry1Ca在任一所示濃度(0.1、1、10、100或1,000nM)並未從其受體蛋白質取代結合的125I標記之Cry1Ac核心毒素白質。所測試之Cry1Ca的最高濃度(1,000nM)代表比檢驗測試中所用之放射性標記Cry1Ac濃度的500倍高，顯示Cry1Ca無法有效地與SBL或VBC BBMV中放射性標記之Cry1Ac的結合相競爭。Cry1Ea在任一所示濃度(0.1、1、10、100或1,000nM)並未從其受體蛋白質取代結合的125I標記之Cry1Ac核心毒素白質。所測試之Cry1Ea的最高濃度(1,000nM)代表比檢驗測試中所用之放射性標記Cry1Ea濃度的500倍高，顯示Cry1Ea無法有效地與SBL或VBC BBMV中放射性標記之Cry1Ac的結合相競爭。Cry2Aa在任一所示濃度(0.1、1、10、100或1,000nM)並未從其受體蛋白質取代結合的125I標記之Cry1Ac核心毒素白質。所測試之Cry2Aa的最高濃度(1,000nM)代表比檢驗測試中所用之放射性標記Cry2Aa濃度的500倍高，顯示Cry2Aa無法有效地與SBL或VBC BBMV中放射性標記 之Cry1Ac的結合相競爭(圖2與4)。
圖1為對125I放射性標記螢光素-5-馬來亞醯胺胰蛋白脢截短之Cry1Ac在來自大豆夜蛾(Pseudoplusia includens；SBL)幼蟲之BBMV蛋白質內的取代的一劑量反應曲線。該圖顯示從0.1至1,000nM之範圍內，非標示之Cry1Ac(●)在劑量依存性下取代標示之Cry1Ac的能力。該圖表繪製專一性結合標記之Cry1Ac(全部結合減去非專一性結合)對非放射性標記之配體所加入之濃度的百分比。所示(圖2)為非放射性標記之Vip3Ab1(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1Ac。所示(圖2)為非放射性標記之Cry1Ca(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1Ac。所示(圖2)為非放射性標記之Cry1Ea(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1Ac。所示(圖2)為非放射性標記之Cry2Aa(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1Ac。
圖3為對125I放射性標記螢光素-5-馬來亞醯胺胰蛋白脢截短之Cry1Ac在來自黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis VBC)幼蟲之BBMV蛋白質內的取代的一劑量反應曲線。該圖顯示從0.1至1,000nM之範圍內，非標示之Cry1Ac(●)在劑量依存性下取代標示之Cry1Ac的能力。該圖表繪製專一性結合標記之Cry1Ac(全部結合減去非專一性結合)對非放射性標記之配體所加入之濃度的百分比。所示(圖4)為非放射性標記之Vip3Ab1(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1Ac。所示(圖4)為非放射性標記之Cry1Ca(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1Ac。所示(圖4)為非放射性標記之Cry1Ea (▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1Ac。所示(圖4)為非放射性標記之Cry2Aa(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1Ac。
結果(圖5與7)顯示同源未標記之Cry1F蛋白質從專一性結合至BBMV蛋白質在劑量依存性下有效地取代放射性標記之Cry1F核心毒素蛋白質。Vip3Ab1在任一所示濃度(0.1、1、10、100或1,000nM)並未從其受體蛋白質取代結合的125I標記之Cry1F核心毒素白質。所測試之Vip3Ab1的最高濃度(1,000nM)代表比檢驗測試中所用之放射性標記Cry1F濃度的500倍高，顯示Vip3Ab1無法有效地與SBL或VBC BBMV中放射性標記之Cry1F的結合相競爭。Cry1Ca在任一所示濃度(0.1、1、10、100或1,000nM)並未從其受體蛋白質取代結合的125I標記之Cry1F核心毒素白質。所測試之Cry1Ca的最高濃度(1,000nM)代表比檢驗測試中所用之放射性標記Cry1F濃度的500倍高，顯示Cry1Ca無法有效地與SBL或VBC BBMV中放射性標記之Cry1F的結合相競爭。Cry1Ea在任一所示濃度(0.1、1、10、100或1,000nM)並未從其受體蛋白質取代結合的125I標記之Cry1F核心毒素白質。所測試之Cry1Ea的最高濃度(1,000nM)代表比檢驗測試中所用之放射性標記Cry1Ea濃度的500倍高，顯示Cry1Ea無法有效地與SBL或VBC BBMV中放射性標記之Cry1F的結合相競爭。Cry2Aa在任一所示濃度(0.1、1、10、100或1,000nM)並未從其受體蛋白質取代結合的125I標記之Cry1F核心毒素白質。所測試之Cry2Aa的最高濃度(1,000nM)代表比檢驗測試中所用之放射性標記Cry2Aa濃度的500倍高，顯示Cry2Aa無法有效地與SBL或VBC BBMV中放射性標記之Cry1F的結合相競爭(圖6與8)。
圖5為對125I放射性標記螢光素-5-馬來亞醯胺胰蛋白脢截短之Cry1F在來自大豆夜蛾(Pseudoplusia includens；SBL)幼蟲之BBMV蛋白質內的取代的一劑量反應曲線。該圖顯示從0.1至1,000nM之範圍內，非標示之Cry1F(●)在劑量依存性下取代標示之Cry1F的能力。該圖表繪製專一性結合標記之Cry1F(全部結合減去非專一性結合)對非放射性標記之配體所加入之濃度的百分比。所示(圖6)為非放射性標記之Vip3Ab1(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1F。所示(圖6)為非放射性標記之Cry1Ca(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1F。所示(圖6)為非放射性標記之Cry1Ea(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1F。所示(圖6)為非放射性標記之Cry2Aa(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1F。
圖7為對該125I放射性標記螢光素-5-馬來亞醯胺胰蛋白脢截短之Cry1F在來自黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis VBC)幼蟲之BBMV蛋白質內的取代的一劑量反應曲線。該圖顯示從0.1至1,000nM之範圍內，非標示之Cry1F(●)在劑量依存性下取代標示之Cry1F的能力。該圖表繪製專一性結合標記之Cry1F(全部結合減去非專一性結合)對非放射性標記之配體所加入之濃度的百分比。所示(圖8)為非放射性標記之Vip3Ab1(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1F。所示(圖8)為非放射性標記之Cry1Ca(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1F。所示(圖8)為非放射性標記之Cry1Ea(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1F。所示 (圖8)為非放射性標記之Cry2Aa(▲)無法在0.1、1、10、100與1,000nM下取代專一性結合之放射性標記Cry1F。
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Claims (20)

  1. 一種包括編碼Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1殺蟲蛋白質毒素之DNA的基因轉殖植物。
  2. 如請求項1所述之基因轉殖植物，其中該植物係選自包括大豆、玉米和棉花之群組。
  3. 如請求項1所述之基因轉殖植物，其中該植物係為大豆植物。
  4. 一種如請求項1所述之植物的種子，其中所述種子包括編碼Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1殺蟲蛋白質毒素的DNA。
  5. 一種如請求項2所述之植物的種子，其中所述種子包括編碼Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1殺蟲蛋白質毒素的DNA。
  6. 一種如請求項3所述之植物的種子，其中所述種子包括編碼Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1殺蟲蛋白質毒素的DNA。
  7. 一種農地裡的多個植物，該植物包括非B.t.庇護區植物以及多個如請求項1所述之植物，其中該庇護區植物組成該所述農地之所有作物的40%至5%之間。
  8. 一種農地裡的多個植物，該植物包括非B.t.庇護區植物以及多個如請求項2所述之植物，其中該庇護區植物組成該所述農地之所有作物的40%至5%之間。
  9. 一種農地裡的多個植物，該植物包括非B.t.庇護區植物以及多個如請求項3所述之植物，其中該庇護區植物組成該所述農地之所有作物的40%至5%之間。
  10. 如請求項7至9之任一項所述之多個植物，其中所述庇護區植物係安排成區塊或帶狀。
  11. 一種包括多個來自非B.t.庇護區植物之庇護區種子與如請求項4所述之多個種子的種子混合物，其中該庇護區種子組成該混合物中所有種子之40%至5%之間。
  12. 一種包括多個來自非B.t.庇護區植物之庇護區種子與如請求項5所述之多個種子的種子混合物，其中所述之庇護區種子組成該混合物中所有種子之40%至5%之間。
  13. 一種包括多個來自非B.t.庇護區植物之庇護區種子與如請求項6所述之多個種子的種子混合物，其中所述之庇護區種子組成該混合物中所有種子之40%至5%之間。
  14. 一種管理一昆蟲對一B.t.毒素之抗性發展的方法，該方法包括在一農地上種植種子以製造多個如請求項7所述之植物。
  15. 如請求項14所述之方法，其中該昆蟲係選自包括大豆夜蛾與黎豆夜蛾之群組。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該多個植物係為大豆。
  17. 如請求項7至9之任一項所述之多個植物，其中該植物佔地多於10英畝。
  18. 一種控制鱗翅類害蟲的方法，該方法包括以如請求項1至3之任一項所述之植物的一有效數量接觸該害蟲。
  19. 一種製造如請求項1所述之一植物的方法，該方法包括以包含編碼Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1殺蟲蛋白質毒素之DNA的基因表現建構體將一植物細胞基因轉形。
  20. 一種製造如請求項3所述之一植物的方法，該方法包括以包含編碼Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ea與Vip3Ab1殺蟲蛋白質毒素之DNA的基因表現建構體將一植物細胞基因轉形。
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