JP5908408B2 - 抵抗性昆虫対応のためのVip3AbとCry1Faとの併用 - Google Patents
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Description
性であることによって、および本明細書で提示されるデータを考慮すると、4つのうちの
3つはECBに対して非交差抵抗性の活性を有し、4つのうちの3つはFAWに対して非
交差抵抗性の活性を有する、4つのタンパク質を提供するように四重(四方向の)スタッ
クを選択することもできる。これは、Cry1Be(ECBおよびFAWの両方に対して
活性)を対象のタンパク質の組と一緒に、加えてECBに対して活性である1つのさらな
るタンパク質と用いることにより得ることができよう。本発明により、そのような四重ス
タックは、Cry1Fと、Cry1Beと、Vip3Ab(FAWに対して活性)と、Cry1Ab、Cry2A、Cry1IまたはDIG−3(ECBに対して活性)とである。
本発明のさらなる具体例として、以下が挙げられる。
[1] Vip3Ab殺虫性タンパク質をコードするDNAおよびCry1F殺虫性タンパク質をコードするDNAを含むトランスジェニック植物。
[2] [1]に記載の植物の種子。
[3] 前記DNAが遺伝子移入された、[1]に記載の植物。
[4] [3]に記載の植物の種子。
[5] 非Bt緩衝帯植物および[1]に記載の複数の植物を備える植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の40%未満を構成する、圃場。
[6] 前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の30%未満を構成する、[5]に記載の植物の圃場。
[7] 前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の20%未満を構成する、[5]に記載の植物の圃場。
[8] 前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の10%未満を構成する、[5]に記載の植物の圃場。
[9] 前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の5%未満を構成する、[5]に記載の植物の圃場。
[10] 前記緩衝帯植物がブロックまたは帯状地にある、[5]に記載の植物の圃場。
[11] 非Bt緩衝帯植物からの緩衝帯種子および[2]に記載の複数の種子を含む種子混合物であって、前記緩衝帯種子は混合物の全ての種子の40%未満を構成する、種子混合物。
[12] 前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の30%未満を構成する、[11]に記載の種子混合物。
[13] 前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の20%未満を構成する、[11]に記載の種子混合物。
[14] 前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の10%未満を構成する、[11]に記載の種子混合物。
[15] 前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の5%未満を構成する、[11]に記載の種子混合物。
[16] 種子を播いて[5]に記載の植物の圃場を作製することを含む、昆虫によるバチルス・チューリンゲンシスに由来する殺虫性タンパク質への抵抗性の発達に対応する方法。
[17] Cry1C、Cry1D、Cry1BeおよびCry1Eからなる群から選択される第三の殺虫性タンパク質をコードするDNAをさらに含む、[1]に記載のトランスジェニック植物。
[18] 非Bt緩衝帯植物および[17]に記載の複数のトランスジェニック植物を備える植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の約20%未満を構成する、圃場。
[19] 約10%未満の緩衝帯植物を含む、[17]に記載の複数の植物を備える植物の圃場。
[20] 種子を播いて[19]に記載の植物の圃場を作製することを含む、昆虫によるバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)に由来する殺虫性タンパク質への抵抗性の発達に対応する方法。
[21] Cry1Fコア毒素含有タンパク質およびVip3Abタンパク質の両方の有効量を発現する細胞を含む、鱗翅類の有害生物を防除するための組成物。
[22] Cry1Fコア毒素含有タンパク質およびVip3Abタンパク質の両方を発現するように形質転換された、微生物または植物細胞である宿主を含む、[21]に記載の組成物。
[23] 鱗翅類の有害生物を防除する方法であって、前記有害生物に、または前記有害生物の環境に[21]に記載の組成物の有効量を提供することを含む方法。
[24] Cry1C、Cry1DおよびCry1Eからなる群から選択される第三の殺虫性タンパク質をコードするDNAをさらに含む、[1]に記載のトランスジェニック植物。
[25] Cry2A、Cry1I、Cry1AbおよびDIG−3からなる群から選択される第四のタンパク質および第五のタンパク質を生成する、[24]に記載のトランスジェニック植物。
[26] Cry2A、Cry1I、Cry1AbおよびDIG−3からなる群から選択される第四のタンパク質を生成する、[17]に記載のトランスジェニック植物。
[27] 種子を播いて[26]に記載の植物の圃場を作製することを含む、昆虫によるCry毒素への抵抗性の発達に対応する方法。
[28] 非Bt緩衝帯植物および[26]に記載の複数の植物を備える植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の約10%未満を構成する、圃場。
[29] 約5%未満の緩衝帯植物を備える、[28]に記載の圃場。
[30] 種子を播いて[28]または[29]に記載の植物の圃場を作製することを含む、昆虫によるCry毒素への抵抗性の発達に対応する方法。
[31] 非Bt緩衝帯植物からの緩衝帯種子および[26]に記載の植物からの複数の種子を含む種子混合物であって、前記緩衝帯種子は混合物の全ての種子の10%未満を構成する、種子混合物。
[32] 前記植物が10エーカーより多くを占める、[5]、[18]および[28]のいずれかに記載の圃場。
[33] トウモロコシ、ダイズおよびワタからなる群から選択される、[1]、[2]、[17]、[24]および[26]のいずれかに記載の植物。
[34] メイズ植物である、[1]、[2]、[17]、[24]および[26]のいずれかに記載の植物。
[35] 前記第三のタンパク質がCry1Beタンパク質である、[26]に記載のトランスジェニック植物。
[36] 種子を播いて[35]に記載の植物の圃場を作製することを含む、昆虫によるCry毒素への抵抗性の発達に対応する方法。
[37] 非Bt緩衝帯植物および[35]に記載の複数の植物を備える植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の約10%未満を構成する、圃場。
[38] 約5%未満の緩衝帯植物を備える、[37]に記載の圃場。
[39] 種子を播いて[37]または[38]に記載の植物の圃場を作製することを含む、昆虫によるCry毒素への抵抗性の発達に対応する方法。
[40] 非Bt緩衝帯植物からの緩衝帯種子および[35]に記載の植物からの複数の種子を含む種子混合物であって、前記緩衝帯種子は混合物の全ての種子の10%未満を構成する、種子混合物。
[41] 前記植物が10エーカーよりも多くを占める、[37]および[38]のいずれかに記載の圃場。
[42] トウモロコシ、ダイズおよびワタからなる群から選択される、[1]、[3]、[17]、[24]、[25]、[26]、[33]および[34]のいずれかに記載の植物。
[43] メイズ植物である、[42]に記載の植物。
[44] 前記植物細胞が、前記Cry1F殺虫性タンパク質をコードする前記DNAおよび前記Vip3Ab殺虫性タンパク質をコードする前記DNAを含み、前記Cry1F殺虫性タンパク質が配列番号1と少なくとも99%同一であり、前記Vip3Ab殺虫性タンパク質が配列番号2と少なくとも99%同一である、[1]、[3]、[17]、[24]、[25]、[26]、[33]および[34]のいずれかに記載の植物の植物細胞。
[45] 前記Cry1F殺虫性タンパク質が配列番号1を含み、前記Vip3Ab殺虫性タンパク質が配列番号2を含む、[1]、[3]、[17]、[24]、[25]、[26]、[33]および[34]のいずれかに記載の植物。
Cry1Fと、Cry1Beと、Vip3(FAWに対して活性)と、Cry1Ab、Cry2A、Cry1IまたはDIG−3(全てECBに対して活性)。
DIG−3は、US201000269223で開示されている。
本発明による有用な遺伝子および毒素には、開示される完全長配列だけでなく、本明細書で具体的に例示される毒素の特徴的な殺虫活性を保持するこれらの配列の断片、変異体、突然変異体、および融合タンパク質も含まれる。本明細書で用いるように、遺伝子の「変異体」または「変形形態」という用語は、同じ毒素をコードするか、殺虫活性を有する同等毒素をコードするヌクレオチド配列を指す。本明細書で用いるように、用語「同等毒素」は、標的有害生物に対して特許請求する毒素と同じか事実上同じである生物的活性を有する毒素を指す。
本発明の特定の毒素が、本明細書で具体的に例示されている。これらの毒素は本発明の毒素の例示にすぎないので、本発明が例示毒素と同じか類似した殺虫活性を有する変異体または同等毒素(および同等毒素をコードするヌクレオチド配列)を含むことは容易に明らかなはずである。同等毒素は、例示される毒素とのアミノ酸相同性を有する。このアミノ酸相同性は、一般的に75%を超え、好ましくは90%を超え、最も好ましくは95%を超える。アミノ酸相同性は、生物的活性を担う毒素の重要領域、又は最終的に生物的活性を担う3次元構造の決定に関与する毒素の重要領域で最も高くなる。この点に関して、それらの置換が活性に重要でない領域にあるか、分子の3次元構造に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換であるならば、特定のアミノ酸置換が許容可能であり、期待できる。例えば、アミノ酸は以下のクラスに入れることができる:無極性、無電荷極性、塩基性および酸性。1つのクラスのアミノ酸が同じ種類の別のアミノ酸で置換される保存的置換は、その置換が化合物の生物的活性を実質的に変更しない限り本発明の範囲内である。下記は、各クラスに属するアミノ酸の例のリストである。
本発明の毒素をコードする遺伝子は、多種類の微生物または植物宿主に導入することができる。毒素遺伝子の発現は、直接または間接的に、殺虫剤の細胞内での生成および維持をもたらす。本発明の両毒素を発現するBt株を作製するために、接合移入および組換え移入を用いることができる。他の宿主生物体を毒素遺伝子の一方または両方で形質転換し、次に相乗効果を達成するために用いることもできる。適する微生物宿主、例えばシュードモナス(Pseudomonas)で、微生物を有害生物の位置へ施用することができ、そこでそれらは増殖して摂取される。この結果が有害生物の防除である。あるいは、毒素遺伝子を受け入れる微生物は、毒素の活性を長引かせ、細胞を安定させる条件の下で処理することができる。毒性活性を保持する処理細胞は、次に標的有害生物の環境に施用することができる。
Bt毒素を発現するバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)または組換え体の細胞は、毒素活性を長引かせ、細胞を安定させるために処理することができる。形成される殺虫剤マイクロカプセルは、安定化された細胞構造の中にBt毒素(複数可)を含み、このマイクロカプセルが標的有害生物の環境へ施用されるときに毒素を保護する。適する宿主細胞には、原核生物または真核生物のいずれかが含まれてよく、通常、哺乳動物などの高等生物体に有毒である物質を生成しない細胞に限定される。しかし、毒性物質が不安定であるか、哺乳動物宿主への毒性のいかなる可能性も避けるために施用量が十分に低い場合、高等生物体にとって有毒である物質を生成する生物体が用いることもできる。宿主としては、原核生物および真菌類などの下等真核生物が特に興味深い。
B.t.殺虫性遺伝子(複数可)を含む細胞宿主は、DNA構築物が選択有利性を提供し、細胞の実質的に全てまたは全てがB.t.遺伝子を保持するように選択培地を提供する、任意の便利な栄養培地で増殖させることができる。これらの細胞は次いで、従来の方法に従って収穫することができる。あるいは、収穫する前に細胞を処理することができる。
誘引剤ならびにB.t.分離株の胞子、結晶および毒素、または本明細書で開示されるB.t.分離株から入手できる遺伝子を含む組換え体微生物を含む製剤化された餌粒剤は、土壌に施用することができる。製剤化された製品は、種子コーティングまたは作物サイクルの後期段階で根部処理もしくは植物全体処理として施用することもできる。B.t.細胞の植物および土壌処理は、様々な不活性の材料、例えば無機鉱物(フィロシリケート、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩など)または植物材料(粉末状の穂軸、籾殻、クルミ殻など)と混合することによって、水和剤、粒剤または粉剤として使用することができる。製剤は、展着助剤、安定化剤、他の殺虫性添加剤または界面活性剤を含むことができる。液体製剤は水性または非水性であってよく、フォーム、ゲル、懸濁液、乳剤などとして使用することができる。これらの成分には、レオロジー調整剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤またはポリマーが含まれてよい。
本発明の殺虫性タンパク質の生成のための好ましい組換え体宿主は、形質転換された植物である。本明細書で開示されるようなBt毒素タンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野で周知である様々な技術を用いて植物細胞に挿入することができる。例えば、大腸菌(Escherichia coli)の複製系および形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む多数のクローニングベクターが、高等植物への外来遺伝子の挿入のための調製のために利用できる。ベクターとしては、例えば、とりわけpBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC184が挙げられる。したがって、Bt毒素タンパク質をコードする配列を有するDNA断片は、適する制限部位でベクターに挿入することができる。生じたプラスミドは、大腸菌(E. coli)への形質転換のために用いられる。大腸菌(E. coli)細胞は適する栄養培地で培養され、次に収穫され、溶解される。プラスミドを回収する。配列分析、制限酵素解析、電気泳動および他の生化学的分子生物学的方法が、分析方法として一般に実行される。各操作の後、用いたDNA配列を切断して次のDNA配列に連結することができる。各プラスミド配列は、同じか他のプラスミドにクローニングすることができる。植物への所望の遺伝子の挿入の方法によっては、他のDNA配列が必要なこともある。例えば、植物細胞の形質転換のためにTiまたはRiプラスミドが用いられるならば、TiまたはRiプラスミドT−DNAの少なくともライトボーダー、しかし多くの場合はライトボーダーとレフトボーダーとが、挿入される遺伝子の隣接領域として連結されなければならない。植物細胞の形質転換のためのT−DNAの使用は集中的に研究されており、EP120516、Lee and Gelvin (2008)、Hoekema (1985)、Fraley et al., (1986)およびAn et al., (1985)で十分に記載され、当技術分野でよく確立されている。
例えばRoush et al.は、「ピラミッド化」または「スタッキング」とも呼ばれる、殺虫性トランスジェニック作物についての対応のための2毒素戦略を概説している。(The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786)。
「コーンボーラー保護Bt(Cry1AbまたはCry1F)トウモロコシ製品の特定の構造化要件は、以下の通りである:
構造化緩衝帯:
コーンベルトで20%の非鱗翅目Btトウモロコシ緩衝帯;
コットンベルトで50%の非鱗翅目Bt緩衝帯
ブロック
内部(すなわち、Bt圃場内)
外部(すなわち、任意交配を最大にするためにBt圃場から1/2マイル(可能であれば1/4マイル)以内に別個の圃場)
圃場内の帯状地
幼虫の移動の影響を低減するために、帯状地は少なくとも4条(好ましくは6条)の幅でなければならない」
「コーンボーラーIRMの要件:
・トウモロコシ畑地の少なくとも20%に緩衝帯雑種を植える
・綿花生産地では、緩衝帯は50%でなければならない
・緩衝帯雑種の1/2マイル以内に植えなければならない
・緩衝帯は、Bt圃場内に帯状地として植えることができる;緩衝帯の帯状地は少なくとも4条の幅でなければならない
・標的昆虫の経済的許容限界に到達する場合だけ、緩衝帯を従来の殺虫剤で処理することができる
・Btベースの噴霧可能な殺虫剤を緩衝帯トウモロコシで用いることはできない
・Btトウモロコシのあらゆる農場に適当な緩衝帯を設けなければならない」
Vip3Ab1は、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(フォールアーミーワーム)野生型幼虫に対して、およびバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)結晶毒素Cry1Faに抵抗性であるプエルトリコで発見されたスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)の圃場採取株に対して活性であることを示す実施例が与えられる。Cry1Fa毒素への抵抗性を発達させる昆虫はVip3Ab1の毒性に感受性であり続けるので、この生物学データは、昆虫でのCry1抵抗性の発達と戦うために用いられるVip3Ab1の有用性を支持する。
Cry1FaおよびVip3Ab1プロトキシンをコードする遺伝子を蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)発現株で発現させ、完全長タンパク質は不溶性封入体として単離された。洗浄した封入体は、20mM CAPS緩衝液、pH11、+10mM DDT、+0.1%2−メルカプトエタノールを含む緩衝液で37℃において2時間撹拌することによって可溶化した。溶液を37℃で10分間の27,000×gで遠心分離し、上清を0.5%(w/v)TCPK処理トリプシン(Sigma)で処理した。溶液を室温でさらなる1時間混合しながらインキュベートし、濾過し、次に20mM CAPS、pH10.5で平衡させたPharmacia Mono Q 1010カラムにロードした。ロードしたカラムを2カラム容量の緩衝液で洗浄した後に、15カラム容量の20mM CAPS中の0〜0.5MのNaClの直線濃度勾配を用いて、切断された毒素を1.0ml/分の流速で溶出させた。精製されたトリプシン切断Cryタンパク質は、約0.2〜0.3MのNaClで溶出した。タンパク質の純度は、SDS PAGEおよびクマシーブリリアントブルー色素を用いる可視化によって検査した。場合によっては、精製された毒素の組み合わせた分画を濃縮してSuperose 6カラム(直径1.6cm、長さ60cm)にロードし、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。モノマーの分子量の単一のピークを含む分画を合わせ、濃縮して、約60,000kDaの分子量を有するタンパク質の95%を超えて均質である調製物を生成した。
人工昆虫食を与えた新生仔スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(J.E. Smith)幼虫で行ったバイオアッセイで、精製タンパク質を殺虫活性について試験した。Cry1F抵抗性のFAWをプエルトリコのHerculex I(Cry1Fa)トウモロコシの圃場から収集し、連続飼育のためにDow AgroSciences Insectaryに持ち込んだ。この系統の抵抗性FAWの特徴付けは、Schlenzら(Schlenz et al., 2008)による内部報告書で概説されている。
オオタバコガ幼虫およびこれらの昆虫から調製されたBBMVに対して試験したとき、Cry1Fのヨウ素化はこのタンパク質の毒性および結合能力の両方を破壊することが報告されている(Luo et al., 1999; Sheets and Storer, 2001)。不活性化は、おそらくその結合部位の近くの改変されていないチロシン残基の必要性による。Iodo−bead法を用いてCry1Fをヨウ素化したとき、H.ビレセンス(H. virescens)からのBBMVを用いて特異的な結合特性を示す能力の全てをタンパク質は失った。Iodo−bead法を用いてCry1Fをヨウ素化するために非放射性標識NaIを用いることにより、ヨウ素化Cry1FはH.ビレセンス(H. virescens)に対するその殺虫活性も失った。
タンパク質定量化およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の標準方法は、例えばSambrookら(Sambrook and Russell, 2001)、およびその最新版で教示される通りに用いた。終齢S.フルギペルダ(S. frugiperda)幼虫を一晩絶食させ、その後、氷上で15分間冷やしたのちに解剖した。中腸組織を体腔から取り出し、外皮に接着した後腸を残した。中腸を、供給元の推奨通りに希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma−Aldrich P−2714)を補充した、9倍容量の氷冷ホモジナイゼーション緩衝液(300mMマンニトール、5mM EGTA、17mMトリス塩基、pH7.5)に入れた。15ストロークのガラス組織ホモジナイザーで組織をホモジナイズした。BBMVは、WolfersbergerのMgCl2沈殿法(Wolfersberger, 1993)によって調製した。簡潔には、300mMマンニトール中の24mM MgCl2溶液の等量を中腸ホモジネートと混合し、5分間撹拌し、氷上で15分間静置させた。4℃で15分間の2,500×gで溶液を遠心分離した。上清を保存し、元の容量の0.5倍希釈のホモジナイゼーション緩衝液にペレットを懸濁して再び遠心分離した。これら2つの上清を合わせ、4℃で30分間の27,000×gで遠心分離してBBMV分画を形成した。ペレットをBBMV保存緩衝液(10mM HEPES、130mM KCl、10%グリセロール、pH7.4)に懸濁して、約3mg/mlのタンパク質濃度にした。タンパク質濃度は、標準としてBSAを用いて測定した。
ΔOD/(分*mg)=アミノペプチダーゼ率(ΔOD/ml*分)/[タンパク質](mg/ml)
還元(すなわち、5%β−メルカプトエタノール、BME)および変性(すなわち、4%SDSの存在下で90℃で5分間加熱)条件の下で、SDS−PAGEによるタンパク質の分析を実行した。タンパク質を4%から20%のトリス−グリシンポリアクリルアミドゲル(BioRad;Hercules、CA)のウェルに加え、200ボルトで60分間分離した。クマシーブリリアントブルーR−250(BioRad)で1時間の染色によってタンパク質のバンドを検出し、7%酢酸中の5%メタノール溶液で脱色した。BioRad Fluro−S Multi Imager(商標)を用いてゲルを画像化し、分析した。タンパク質バンドの相対的な分子量は、ゲルの1つのウェルに加えられたBenchMark(商標)タンパク質ラダー(Invitrogen、Carlsbad、CA)の試料で観察された既知の分子量のタンパク質の移動度との比較によって決定した。
ヨウ素化Cryタンパク質の放射純度およびプルダウンアッセイでの放射性Cry1Faの測定は、SDS−PAGEおよび蛍光画像化で決定された。簡潔には、タンパク質の分離および固定の後にゲルをマイラー膜(厚さ12μm)で包み、次にMolecular Dynamics貯蔵蛍光スクリーン(35cm×43cm)の下でゲルを少なくとも一晩、および4日まで曝露させることによって、SDS−PAGEゲルを画像化した。Molecular Dynamics Storm 820蛍光造影装置を用いてプレートを現像し、ImageQuant(商標)ソフトウェアを用いて画像を分析した。
野生型およびCry1Fa抵抗性のS.フルギペルダ(S. frugiperda)幼虫に対して様々な用量で試験された完全長Vip3Ab1タンパク質のバイオアッセイからの死滅率の結果を、図1に示す。出願人は、野生型S.フルギペルダ(S. frugiperda)幼虫に対しては試験された最高濃度(9,000ng/cm2)で100%死滅率を、およびより低い用量でより低いレベルの死滅率を得た。LC−50は、約2,000ng/cm2と推定された。Vip3Ab1は幼虫の増殖を阻害することにおいてS.フルギペルダ(S. frugiperda)に対して非常に効果的で、1,000ng/cm2以上の濃度で95%を超える成長阻害であった。両方のS.フルギペルダ(S. frugiperda)幼虫で観察された高レベルの成長阻害は、より長い時間放置されたならば、これらの昆虫が死滅へと進行する可能性が高いことを示唆する。
Claims (3)
- Cry1Fコア毒素含有タンパク質およびVip3Abタンパク質の両方の殺虫性活性量を発現する細胞を含む、フォールアーミーワーム(FAW;スポドプテラ・フルギペルダ)を防除するための組成物。
- Cry1Fコア毒素含有タンパク質およびVip3Abタンパク質の両方を発現するように形質転換された、微生物または植物細胞である宿主を含む、請求項1に記載の組成物。
- フォールアーミーワーム(FAW;スポドプテラ・フルギペルダ)を防除する方法であって、前記有害生物に、または前記有害生物の環境に請求項1に記載の組成物の殺虫性活性量を提供することを含む方法。
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