CN102821597A

CN102821597A - Vip3Ab和CRY1Fa用于管理抗性昆虫的组合用途

Info

Publication number: CN102821597A
Application number: CN2010800640120A
Authority: CN
Inventors: T.米德; K.纳瓦; N.P.斯托尔; J.J.希茨; A.T.伍斯利; S.L.伯顿
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Kedihua Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2009-12-16
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2030-12-16
Also published as: AR079504A1; ZA201204921B; CO6602149A2; KR101884478B1; US20120317682A1; JP5908408B2; MX343547B; BR112012014772A2; RU2012129907A; EP2512219A4; EP2512219B1; AU2010330914A1; IL220321A0; MX2012007120A; CN102821597B; NZ601100A; IL220321A; KR20120096570A; CA2782636A1; WO2011075585A1

Abstract

本发明包括用于控制鳞翅目昆虫的方法和植物，所述植物包含与Cry1Fa杀虫蛋白组合的Vip3Ab杀虫蛋白以延迟或预防昆虫抗性的形成。

Description

Vip3Ab和CRY1Fa用于管理抗性昆虫的组合用途

发明背景

人类种植玉米以供食物和能量应用。人类还种植许多其它作物，包括大豆和棉花。昆虫食用并损害植物，并且由此削弱这些人类努力。每年花费数十亿美元来控制昆虫害虫，并且它们造成的损害损失额外的数十亿。合成的有机化学杀虫剂已经是用于控制昆虫害虫的主要工具，但是生物学杀虫剂，诸如自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)衍生的杀虫蛋白(insecticidalprotein)已经在一些领域中发挥重要作用。经由用Bt杀虫蛋白基因转化生成昆虫抗性植物的能力已经使现代农业发生革命，而且提高杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。

已经使用几种Bt蛋白来创建至今已经成功登记并商业化的昆虫抗性转基因植物。这些包括玉米中的Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F和Cry3Bb、棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab、和马铃薯中的Cry3A。

除了在2种蛋白质的组合杀虫谱是期望的(例如，玉米中的Cry1Ab和Cry3Bb组合以分别提供对鳞翅目害虫(pest)和根虫的抗性)或蛋白质的独立作用使它们可用作用于延迟易感昆虫群中抗性形成的工具(例如，棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab组合以提供烟草蚜虫的抗性管理)的情况中外，表达这些蛋白质的商业产品表达单一蛋白质。还可见US 2009 0313717，其涉及Cry2蛋白及Vip3Aa、Cry1F、或Cry1A以控制玉米夜蛾(Helicoverpa zea)或棉铃实夜蛾(armigerain)。WO 2009 132850涉及Cry1F或Cry1A和Vip3Aa以控制草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)。US 2008 0311096部分涉及Cry1Ab以控制Cry1F抗性ECB。

也就是说，已经导致此技术的快速且普遍采用的昆虫抗性转基因植物的一些质量(quality)还引起如下的忧虑，即害虫群体会形成对由这些植物生成的杀虫蛋白的抗性。已经提示了保留基于Bt的昆虫抗性性状的效用的几种策略，其包括与避难所(refuge)组合以及与不同毒素交替、或在不同毒素共部署中部署(deploy)高剂量的蛋白质(McGaughey等(1998),“B.t.ResistanceManagement,”Nature Biotechnol.16:144-146)。

为了在IRM叠加中使用而选定的蛋白质需要独立地施加其杀虫效果，使得对一种蛋白质形成的抗性未赋予对第二种蛋白质的抗性(即，没有对蛋白质的交叉抗性)。如果例如在对“蛋白质A”的抗性方面选定的害虫群对“蛋白质B”敏感，那么会推断没有交叉抗性，并且蛋白质A和蛋白质B的组合会有效延迟对单独的蛋白质A的抗性。

在没有抗性昆虫群的情况中，可以基于假设与作用机制和交叉抗性潜力相关的其它特征做出评估。已经提示了受体介导的结合在鉴定有可能不展现出交叉抗性的杀虫蛋白中的效用(van Mellaert等1999)。缺乏此方法中固有的交叉抗性的关键预测物(predictor)是杀虫蛋白在敏感的昆虫物种中不竞争受体。

在两种Bt毒素竞争相同受体的情况中，则若所述受体在所述昆虫中突变，使得毒素之一不再结合所述受体，并且如此针对昆虫不再是杀虫性的，则情况可能是昆虫也会对第二种毒素(其竞争性结合相同受体)有抗性。也就是说，昆虫被说成与这两种Bt毒素有交叉抗性。然而，若两种毒素结合两种不同受体，则这可以是如下的指示，即昆虫不会对那两种毒素同时有抗性。

Cry1Fa可用于控制许多鳞翅目害虫物种，包括欧洲玉米螟(European cornborer)(ECB；玉米螟(Ostrinia nubilalis)(Hübner))和秋粘虫(fall armyworm)(FAW；草地夜蛾)，并且针对甘蔗螟(sugarcane borer)(SCB；小蔗螟(Diatraeasaccharalis))是有活性的。Cry1Fa蛋白(如在含有事件TC1507的玉米植物中生成的)负责供FAW控制用的行业领先的昆虫抗性性状。

SmartStax^TM、和WideStrike^TM产品中进一步部署。

因为可用于标记受体结合测定法中检测的蛋白质的最常见技术灭活Cry1Fa蛋白的杀虫活性，所以使用Cry1Fa蛋白进行(竞争性或同源性)受体结合研究的能力是有限的。

其它Cry毒素列于官方B.t.命名委员会的站点(Crickmore等;lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。目前有几乎60个“Cry”毒素大类(Cry1-Cry59)，及其它Cyt毒素和VIP毒素等。许多数字组各自具有大写字母亚组，而大写字母亚组具有小写字母亚-亚组。(例如，Cry1具有A-L，而Cry1A具有a-i)。

发明概述

本发明部分涉及令人惊讶的发现，即对Cry1Fa蛋白的杀虫活性有抗性的秋粘虫(草地夜蛾；FAW)群体对Vip3Ab蛋白的杀虫活性没有抗性。主题毒素对提供针对FAW的非交叉抗性作用。

凭借本公开内容的益处，如本领域技术人员会认可，表达Vip3Ab和Cry1Fa或其杀虫部分的植物会可用于延迟或阻止对单独的这些杀虫蛋白之任一种的抗性的形成。

本发明还得到如下的发现支持，即Vip3Ab和Cry1Fa彼此不竞争结合来自FAW的肠中的结合位点。

如此，本发明部分涉及与Cry1Fa蛋白组合使用Vip3Ab蛋白。生成Vip3Ab及Cry1Fa的植物(和种植有此类植物的土地面积)包括在本发明的范围内。

本发明还部分涉及三种毒素(或更多种)的三重叠加或“金字塔(pyramid)”，其中Vip3Ab和Cry1Fa是基础对(base pair)。在一些优选的金字塔实施方案中，选定的毒素具有针对FAW的非交叉抗性作用。这些三重叠加金字塔组合的一些优选的蛋白质是Cry1Fa及Vip3Ab及Cry1C、Cry1D、Cry1Be、或Cry1E。依照本发明，这些特定的三重叠加会有利地且令人惊讶地提供针对FAW的非交叉抗性作用。这可以帮助降低或消除避难所土地面积的需要。

在Cry1Fa针对FAW和欧洲玉米螟(ECB)两者有活性的情况中，且根据本文中呈现的数据，也可以选择四重(四位(four-way))叠加来提供4种蛋白质，其中4种中的3种具有针对ECB的非交叉抗性活性，且4种中的3种具有针对FAW的非交叉抗性活性。这可以通过使用Cry1Be(针对ECB和FAW两者有活性)及主题蛋白质对，加上针对ECB有活性的一种别的蛋白质获得。依照本发明，此类四重叠加是：

Cry1F加Cry1Be加Vip3Ab(针对FAW有活性)加Cry1Ab、Cry2A、Cry1I或DIG-3(针对ECB有活性)。

附图简述

图1：全长Vip3Ab1针对野生型草地夜蛾(J.E.Smith),(FAW)和Cry1Fa抗性型草地夜蛾(J.E.Smith),(rFAW)的生长抑制(棒)和死亡率(◆)剂量响应。百分比生长抑制基于比较仅用缓冲液处理的8只幼虫的平均重量与对毒素暴露5天的幼虫重量。

图2：在通过SDS-PAGE分离后结合来自草地夜蛾的BBMV的¹²⁵I Cry1Fa的磷光图像。样品一式两份完成。¹²⁵I Cry1Fa的浓度是1nM。对照代表¹²⁵ICry1Fa在没有任何竞争配体的情况中结合BBMV的水平。1,000nM Cry1Fa代表¹²⁵I Cry1Fa在存在1,000nM非放射性标记的Cry1Fa的情况中结合BBMV的水平，显示自BBMV蛋白完全置换放射性标记的配体。1,000nM Vip3Ab1代表¹²⁵I Cry1Fa在存在1,000nM非放射性标记的Vip3Ab1的情况中结合BBMV的水平，显示此蛋白质甚至在以经标记的配体浓度的1,000倍添加时仍没有自草地夜蛾BBMV置换¹²⁵I Cry1Fa的能力。

图3：在通过SDS-PAGE分离后结合来自野生型草地夜蛾(FAW)或Cry1Fa抗性草地夜蛾(rFAW)的BBMV的¹²⁵I Cry1Fa的磷光图像(phosphor)。样品一式两份完成。¹²⁵I Cry1Fa的浓度是2.5nM。FAW-0代表¹²⁵I Cry1Fa在没有任何竞争配体的情况中结合野生型草地夜蛾BBMV的水平。FAW-1,000nM Cry1Fa代表¹²⁵I Cry1Fa在存在1,000nM非放射性标记的Cry1Fa的情况中结合野生型草地夜蛾BBMV的水平，显示自BBMV蛋白置换放射性标记的配体。rFAW-0代表¹²⁵I Cry1Fa在没有任何竞争配体的情况中结合Cry1Fa抗性草地夜蛾BBMV的水平。注意缺乏¹²⁵I Cry1Fa对来自抗性FAW的BBMV的结合。rFAW-1,000nM Cry1Fa代表¹²⁵I Cry1Fa在存在1,000nM非放射性标记的Vip3Ab1的情况中结合BBMV的水平，再次显示¹²⁵I Cry1Fa不能结合来自Cry1Fa抗性草地夜蛾的BBMV。

发明详述

如本文中报告的，转基因玉米(和其它植物；例如棉花和大豆)中生成的Vip3Ab毒素在控制已经形成对Cry1Fa活性的抗性的秋粘虫(FAW；草地夜蛾)中可以是非常有效的。如此，本发明部分涉及令人惊讶的发现，即对Cry1Fa有抗性的秋粘虫对Vip3Ab易感(即，没有交叉抗性)。换言之，本发明还部分涉及令人惊讶的发现，即Vip3Ab毒素有效保护植物(诸如玉米植物)免于Cry1Fa抗性秋粘虫的损害。关于此害虫的讨论，见例如Tabashnik,PNAS(2008),第105卷No.49,19029-19030。

本发明包括Vip3Ab毒素保护玉米和其它经济上重要的植物物种(诸如大豆)免于由秋粘虫进食(feeding)引起的损害和产量损失或对于已经形成对Cry1Fa的抗性的秋粘虫群的用途。

如此，本发明教导了包含Vip3Ab的IRM叠加以阻止或减轻秋粘虫对Cry1Fa的抗性形成。

本发明提供了用于控制鳞翅目害虫的组合物，其包含生成含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质和含有Vip3Ab核心毒素的蛋白质的细胞。

本发明进一步包含转化为生成Cry1Fa杀虫蛋白和Vip3Ab杀虫蛋白两者的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。优选地，主题多核苷酸在遗传构建体中在(可操作连接/包含)非苏云金芽孢杆菌启动子的控制下。主题多核苷酸可以包含在植物中表达增强的密码子选择。

另外，意图本发明提供一种控制鳞翅目害虫的方法，包括使所述害虫或所述害虫的环境与有效量的组合物接触，所述组合物含有含Cry1Fa核心毒素的蛋白质，并且进一步含有含Vip3Ab核心毒素的蛋白质。

本发明的一个实施方案包括玉米植物及此类植物的种子，所述玉米植物包含编码含有Vip3Ab核心毒素的蛋白质的植物可表达基因和编码含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质的植物可表达基因。

本发明的又一个实施方案包括玉米植物及此类植物的种子，其中已经将编码含有Vip3Ab核心毒素的蛋白质的植物可表达基因和编码含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质的植物可表达基因渐渗入所述玉米植物中。

如实施例中所描述的，使用放射性标记的Vip3Ab核心毒素蛋白的竞争结合研究显示了Cry1Fa核心毒素蛋白不竞争FAW昆虫组织中的Vip3Ab结合的结合。这些结果还指示，Cry1Fa和Vip3Ab蛋白的组合是一种减轻FAW群中对Cry1Fa的抗性形成(及同样地，对Vip3Ab的抗性形成)的有效手段，并且会有可能提高表达这两种蛋白质的玉米植物中对此害虫的抗性的水平。

如此，部分基于本文中所描述的数据，认为可以使用Vip3Ab和Cry1Fa蛋白的共生成(叠加)来生成针对FAW的高剂量IRM叠加。在Cry1Fa针对FAW和欧洲玉米螟(ECB)两者是有活性的情况中，主题毒素对针对FAW提供非竞争作用。

可以对此对添加其它蛋白质以扩充昆虫控制谱。

另一个部署选项会是与另一种第三毒素/基因组合使用Cry1Fa和Vip3Ab蛋白，以及使用此三重叠加来减轻FAW中对这些毒素之任一种的抗性的形成。如此，本发明的另一个部署选项会是在FAW可以形成抗性群体的作物生长区中使用两种、三种、或更多种蛋白质。

因而，本发明还部分涉及三种(或更多种)毒素的三重叠加或“金字塔”，其中Cry1Fa和Vip3Ab毒素是基础对。

在一些优选的金字塔实施方案中，三种选定的蛋白质提供针对FAW的非交叉抗性作用。一些优选的“三重作用”金字塔组合是Cry1Fa及Vip3Ab及Cry1C或Cry1D。见USSN 61/284,281(2009年12月16日提交)(其显示了Cry1C针对Cry1F抗性FAW是有活性的)和USSN 61/284,252(2009年12月16日提交)，其显示了Cry1D针对Cry1F抗性FAW是有活性的。这两种应用还显示了Cry1C不与Cry1F竞争FAW膜制备物中的结合，而且Cv1D不与Cry1F竞争FAW膜制备物中的结合。在一些实施方案中，Cry1Be或Cry1E可以与Vip3A和Cry1F(作为第三抗FAW蛋白)组合。对于Cry1Be与Cry1F的使用，见USSN 61/284,290(2009年12月16日提交)。对于Cry1E与Cry1F的使用，见USSN 61/284,278(2009年12月16日提交)。依照本发明，这些特定的三重叠加会有利地且令人惊讶地提供三种蛋白质，其提供针对FAW的非交叉抗性作用。这可以帮助降低或消除避难所土地面积的需要。

根据本文中呈现的数据，也可以选择四重(四位)叠加来提供针对ECB具有非交叉抗性作用的三种蛋白质和针对FAW具有非交叉抗性作用的三种蛋白质。这可以通过使用Cry1Be(针对ECB和FAW两者有活性)及Cry1Fa(针对ECB和FAW两者有活性)及主题Vip3Ab(针对FAW有活性)和具有ECB毒性的第四蛋白来获得(见2009年12月16日提交的USSN 61/284,290，其涉及Cry1Fa和Cry1Be的组合)。依照本发明，四重叠加的例子是：

Cry1F加Cry1Be加Vip3(针对FAW有活性)加(plus)(Cry1Ab、Cry2A、Cry1I、或DIG-3-针对ECB均有活性)。

US 2010 00269223中披露了DIG-3。

生成蛋白质的任何主题组合的植物(和种植有此类植物的土地面积)包括在本发明的范围内。也可以添加其它毒素/基因，但是上文讨论的特定叠加有利地且令人惊讶地提供针对FAW和/或ECB的多种作用模式。这可以帮助降低或消除避难所土地面积的需要。如此，超过10英亩如此种植的田地包括在本发明内。

也可以使用GENBANK来获得本文中公开的或提及的任何基因和蛋白质的序列。见下文附录A。

美国专利No.5,188,960和美国专利No.5,827,514描述了适用于用于实施本发明的含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质。美国专利No.6,218,188描述了编码适合于用于本发明的含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质的经植物优化的DNA序列。

Cry1Fa在

SmartStax^TM、和WidesStrike^TM产品中。vip3Ab基因可以组合到例如Cry1Fa产品诸如

中。因而，Vip3Ab的使用可以显著降低对这些和其它商业化蛋白质的选择压力。如此，Vip3Ab可以在3基因组合中用于玉米和其它植物(例如，棉花和大豆)。

可以使用本文中描述的蛋白质组合来控制鳞翅目害虫。成年鳞翅目，例如蝴蝶和蛾主要以花蜜为食，并且是传粉的重要实现物(effector)。几乎所有鳞翅目幼虫，即毛虫以植物为食，并且许多是严重的害虫。毛虫在叶上或内部进食或者以植物的根或茎为食，对植物剥夺营养物，而且经常破坏植物的物理支持结构。另外，毛虫以果实、织物、和贮存的谷物和面粉为食，毁坏出售的这些产品或者严重降低其价值。如本文中所使用的，提及鳞翅目害虫指害虫的各个生命阶段，包括幼虫阶段。

本发明的一些嵌合毒素包括Bt毒素的完整N端核心毒素部分，并且在超出核心毒素部分末端的某个点处，蛋白质具有向异源原毒素(protoxin)序列的过渡。Bt毒素的N端杀虫活性的毒素部分称为“核心”毒素。自核心毒素区段至异源原毒素区段的过渡可以大致在毒素/原毒素连接处发生或者，在备选中，可以保留天然原毒素的部分(超出核心毒素部分延伸)，其中在下游发生向异源原毒素部分的过渡。

举例而言，本发明的一个嵌合毒素是Cry1Fa的完整核心毒素部分(大致为前600个氨基酸)和异源原毒素(蛋白质C端的剩余部分)。在一个优选的实施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自Cry1Ab蛋白毒素。在一个优选的实施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自Cry1Ab蛋白毒素。

本领域技术人员会领会，Bt毒素(即使在某个种类诸如Cry1F内)在长度和核心毒素部分向原毒素部分过渡的精确位置上会以一定程度有所变化。通常，Cry1Fa毒素的长度是约1150至约1200个氨基酸。自核心毒素部分至原毒素部分的过渡通常会在全长毒素的约50%-约60%发生。本发明的嵌合毒素会包括整段(full expanse)的此N端核心毒素部分。如此，嵌合毒素会包含Cry1FaBt毒素蛋白的全长的至少约50%。这通常会是至少约590个氨基酸。关于原毒素部分，整段的Cry1Ab原毒素部分自核心毒素部分末端延伸至分子的C端。

基因和毒素。依照本发明有用的基因和毒素不仅包括公开的全长序列，而且还包括保留本文中明确例示的毒素的特征性杀虫(pesticidal)活性的这些序列、变体、突变体、和融合蛋白的片段。如本文中所使用的，术语基因的“变体”或“变异”指编码相同毒素或编码具有杀虫活性的等同毒素的核苷酸序列。如本文中所使用的，术语“等同毒素”指与要求保护的毒素具有相同或基本上相同的针对靶害虫的生物学活性的毒素。

如本文中所使用的，按照“Revision of the Nomenclature for the Bacillusthuringiensis Pesticidal Crystal Proteins,”N.Crickmore,D.R.Zeigler,J.Feitelson,E.Schnepf，J.Van Rie,D.Lereclus,J.Baum和D.H.Dean.Microbiology and Molecular Biology Reviews(1998)第62卷:807-813，边界代表约95%(Cry1Fa和Vip3Ab)、78%(Cry1F和Vip3Ab)、和45%(Cry1和Vip3Ab)序列同一性。这些截留也可以仅仅应用于核心毒素(例如对于Vip3Ab)。

对于本领域技术人员应当显而易见的是，可以经由几种手段鉴定并获得编码活性毒素的基因。可以自保藏于培养物保藏所的分离物获得本文中例示的特定基因或基因部分。也可以例如通过使用基因合成仪以合成方式构建这些基因或其部分或变体。可以使用用于生成点突变的标准技术来容易地构建基因的变异。还有，可以使用商品化的外切核酸酶或内切核酸酶依照标准的规程来生成这些基因的片段。例如，可以使用酶诸如Bal31或定点诱变自这些基因的末端系统性剪断核苷酸。也可以使用多种限制酶来获得编码活性片段的基因。可以使用蛋白酶来直接获得这些蛋白质毒素的活性片段。

保留例示的毒素的杀虫活性的片段和等同物会在本发明的范围内。还有，由于遗传密码的冗余，多种不同DNA序列可以编码本文中公开的氨基酸序列。完全在本领域技术人员的技术内的是创建编码相同的，或基本上相同的毒素的这些备选DNA序列。这些变体DNA序列在本发明的范围内。如本文中所使用的，提及“基本上相同的”序列指具有没有实质性影响杀虫活性的氨基酸取代、缺失、添加、或插入的序列。编码保留杀虫活性的蛋白质的基因的片段也包括在此定义中。

用于鉴定依照本发明有用的编码毒素的基因和基因部分的又一种方法是经由使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列凭借合适的标记物可以是可检出的或者可以以固有荧光生成，如记载于国际申请No.WO93/16094的。如本领域中公知的，若探针分子和核酸样品通过形成两种分子间强烈的键来杂交，则可以合理地假设探针和样品具有实质的同源性。优选地，通过本领域中公知的技术在严格条件下进行杂交，如记载于例如Keller,G.H.,M.M.Manak(1987)DNA Probes,Stockton Press,New York,N.Y.,第169-170页的。盐浓度和温度组合的一些例子如下(以严格性升高的次序)：2X SSPE或SSC于室温；1X SSPE或SSC于42°C；0.1X SSPE或SSC于42°C；0.1X SSPE或SSC于65°C。探针的检测提供了一种用于以已知的方式测定杂交是否已经发生的手段。此类探针分析提供一种用于鉴定本发明的毒素编码基因的快速方法。可以使用DNA合成仪和标准的规程来合成依照本发明作为探针使用的核苷酸区段。也可以使用这些核苷酸序列作为PCR引物以扩增本发明的基因。

变体毒素。已经在本文中明确例示本发明的某些毒素。因为这些毒素仅是本发明的毒素例示性的，所以应当容易显而易见的是，本发明包括具有例示毒素的相同或相似杀虫活性的变体或等同毒素(和编码等同毒素的核苷酸序列)。等同毒素与例示的毒素会具有氨基酸同源性。此氨基酸同源性通常会大于75%，优选大于90%，且最优选大于95%。氨基酸同源性在毒素中负责生物学活性或者牵涉决定最终负责生物学活性的三维构型的至关重要的区域中会是最高的。在这点上，某些氨基酸取代是可接受的，并且若这些取代在对于活性不是至关重要的区域中或者是不影响分子的三维构型的保守氨基酸取代，则可以是预期的。例如，氨基酸可以放入以下种类：非极性、不带电荷的极性、碱性、和酸性。其中的一类氨基酸用相同类型的另一种氨基酸替换的保守取代落入本发明的范围内，只要取代不实质性改变化合物的生物学活性。下文是属于每类的氨基酸的例子的列表。

表1

氨基酸的种类	氨基酸的例子
		非极性	Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Met,Phe,Trp
不带电荷的极性	Gly,Ser,Thr,Cys,Tyr,Asn,Gln
		酸性	Asp,Glu
碱性	Lys,Arg,His

在一些情况中，也可以进行非保守取代。至关重要的因素是这些取代必须不显著降低毒素的生物学活性。

重组宿主。可以将编码本发明的毒素的基因导入极其多种微生物或植物宿主中。毒素基因的表达直接或间接导致杀虫剂(pesticide)的胞内生成和维持。可以使用接合转移和重组转移来创建表达本发明的两种毒素的Bt菌株。也可以用一种或两种毒素基因转化其它宿主生物体，所述毒素基因然后用于实现协同效应。凭借合适的微生物宿主，例如假单胞菌属(Pseudomonas)，可以将微生物应用于害虫的位置，在那里它们会增殖并被摄取。结果是对害虫的控制。或者，可以在延长毒素的活性并且稳定细胞的条件下处理为毒素基因做宿主的微生物。然后，可以将经处理的细胞(其保留毒性活性)应用于靶害虫的环境。

在经由合适的载体将Bt毒素基因导入微生物宿主中，且将所述宿主应用于生活状态的环境的情况中，使用某些宿主微生物是必要的。选择如下的微生物宿主，已知所述微生物宿主占据一种或多种感兴趣作物的“植物圈”(叶面(phylloplane)、叶圈、根际、和/或根面)。这些微生物选择为使得能够在特定环境(作物和其它昆虫生境)中与野生型微生物成功竞争，提供表达多肽杀虫剂的基因的稳定维持和表达，且期望地，提供改善的保护杀虫剂免于环境降解和灭活。

已知大量微生物驻留于极其多种重要的作物的叶面(植物叶的表面)和/或根际(植物根周围的土壤)。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物，诸如细菌，例如假单胞菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilius)、土壤杆菌属(Agrobactenum)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳酸菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)、和产碱菌属(Alcaligenes)；真菌，特别是酵母，例如属酵母菌属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、和短梗霉属(Aureobasidium)。特别感兴趣的是植物圈细菌物种，诸如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、根癌土壤杆菌(Agrobacteniumtumefaciens)、类球红细胞(Rhodopseudomonas spheroids)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱菌(Alcaligenes entrophus)、和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandii)；和植物圈真菌物种，诸如深红类酵母菌(Rhodotorula rubra)、胶红类酵母菌(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母菌(R.aurantiaca)、白色隐球菌(Cyptococcus albidus)、液化隐球菌(C.diffluens)、劳伦梯氏隐球菌(C.laurentii)、罗氏酵母(Saccharomyces rosei)、S.pretoriensis、酿酒酵母(S.cerevisiae)、玫红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)、和出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpollulans)。特别感兴趣的是色素性微生物。

极其多种方法可用于在容许基因的稳定维持和表达的条件下将编码毒素的Bt基因导入微生物宿主中。这些方法是本领域技术人员公知的，并且记载于例如美国专利No.5135867，通过提及而将其收入本文。

细胞的处理。可以处理表达Bt毒素的苏云金芽孢杆菌或重组细胞以延长毒素活性并稳定细胞。形成的杀虫剂微囊体包含在已经稳定化的细胞结构内的一种或多种Bt毒素，并且在将微囊体应用于靶害虫的环境时会保护毒素。合适的宿主细胞可以包括原核生物或真核生物，通常不限于那些不生成对于高等生物体，诸如哺乳动物有毒性的物质的细胞。然而，可以使用生成对于高等生物体有毒性的物质的生物体，其中毒性物质是不稳定的或应用水平充分降低，从而避免对哺乳动物宿主的毒性的任何可能性。作为宿主，特别感兴趣的会是原核生物和低等真核生物，诸如真菌。

细胞通常会是完整的，并且在处理时基本上为增殖形式，而不是为孢子形式，尽管在一些情况中可以采用孢子。

可以通过化学或物理手段，或者通过化学和/或物理手段的组合来处理微生物细胞，例如含有一种或多种B.t.毒素基因的微生物，只要所述技术没有不利地影响毒素的特性，也不降低保护毒性的细胞性能。化学试剂的例子是卤化剂，特别是原子数17-80的卤素。更特别地，可以将碘在温和(mild)条件下且持续足够的时间使用，使得实现期望的结果。其它合适的技术包括用醛，诸如戊二醛；抗感染药，诸如氯化苄烷铵(zephiran chloride)和西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)；醇，诸如异丙基和乙醇；各种组织固定剂，诸如Lugol碘、Bouin氏固定剂、各种酸和Helly氏固定剂(见：Humason,Gretchen L.,Animal Tissue Techniques,W.H.Freeman and Company,1967)；或在对宿主环境施用细胞时保留并延长细胞中生成的毒素的活性的物理(热)和化学剂的组合处理。物理手段的例子是短波长辐射，诸如gamma-辐射和X-辐射、冷冻、UV照射、冻干等。用于处理微生物细胞的方法披露于美国专利No.4,695,455和4,695,462，通过提及而将其收入本文。

细胞一般会具有增强的结构稳定性，这会增强对环境条件的抗性。在杀虫剂为原型(proform)的情况中，细胞处理的方法应当选择为使得不抑制靶害虫病原体将原型加工成杀虫剂的成熟形式。例如，甲醛会交联蛋白质，而且可以抑制对多肽杀虫剂的原型的加工。处理方法应当至少保留毒素的生物利用度或生物活性的实质性部分。

出于生成目的选择宿主细胞中特别感兴趣的特征包括容易将一种或多种B.t.基因导入宿主中、表达系统的利用度、表达效率、杀虫剂在宿主中的稳定性、和辅助遗传性能的存在。作为杀虫剂微囊体使用的感兴趣特征包括杀虫剂的保护质量，诸如厚的细胞壁、色素沉着、和包含体的胞内包装或形成；在水性环境中存活；缺乏哺乳动物毒性；对摄食的害虫的吸引力；在不损害毒素的情况中容易杀死和固定；等等。其它考虑因素包括容易配制和处理、经济、贮存稳定性，等等。

细胞生长。可以将含有一种或多种B.t.杀虫基因的细胞宿主在任何便利的营养培养基中培养，其中DNA构建体提供选择优势，提供选择培养基，使得基本上所有或所有细胞保留B.t.基因。然后，可以依照常规的方式收获这些细胞。或者，可以在收获前处理细胞。

可以使用标准技术培养基和发酵技术来培养生成本发明的毒素的B.t.细胞。在完成发酵周期后，可以如下收获细菌，即首先通过本领域中公知的手段自发酵培养基分离B.t.孢子和晶体。可以通过添加表面活性剂、分散剂、惰性载体和其它组分将回收的B.t.孢子和晶体配制成可湿的粉末、液体浓缩物、颗粒剂或其它配制剂以便于针对特定的靶害虫的处理和应用。这些配制剂和应用规程是本领域中公知的。

配制剂(formulation)。可以将含有引诱剂和B.t.隔离群、或包含自本文中公开的B.t.隔离群可获得的基因的重组微生物的孢子、晶体、和毒素的配制的诱饵颗粒剂应用于土壤。也可以将配制的产物以种子涂层材料或根处理或总体植物处理在作物周期的后期阶段应用。B.t.细胞的植物和土壤处理可以以可湿的粉末、颗粒或粉尘采用，其通过混合各种惰性材料，诸如无机矿物质(叶硅酸盐(phyllosilicate)、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物材料(粉状玉米穗轴、稻壳、胡桃壳等)来实现。配制剂可以包含展着剂-粘着剂(spreader-sticker)佐剂、稳定剂、其它杀虫添加剂、或表面活性剂。液体配制剂可以是基于水性的或非水性的，并且以泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化的浓缩物等采用。成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂、或聚合物。

如本领域技术人员会领会的，杀虫浓度会随特定配制剂的性质，特别是它是浓缩物还是要直接使用而广泛变化。杀虫剂会以至少1%(按重量计)存在，并且可以是100%(按重量计)。干配制剂会具有约1-95%(按重量计)的杀虫剂，而液体配制剂一般会是液相中约1-60%(按重量计)的固体。配制剂一般会具有约10²至约10⁴个细胞/mg。这些配制剂会以每公顷约50mg(液体或干的)至1kg或更多施用。

可以通过喷雾、喷粉、喷洒等将配制剂应用于鳞翅目害虫的环境，例如叶或土壤。

植物转化。一种用于生成本发明的杀虫蛋白的优选的重组宿主是经转化的植物。可以使用本领域中公知的多种技术来将如本文中所公开的编码Bt毒素蛋白的基因插入植物细胞中。例如，包含大肠杆菌(Escherichia coli)中的复制系统和容许选择经转化的细胞的标志物的大量克隆载体可用于准备好将外来基因插入高等植物中。例如，载体包括pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184，等等。因而，可以将具有编码Bt毒素蛋白的序列的DNA片段在合适的限制性位点插入载体中。可以使用所得的质粒对大肠杆菌转化将大肠杆菌细胞在合适的营养培养基中培养，然后收获并裂解。将质粒回收。序列分析、限制性分析、电泳、和其它生物化学-分子生物学方法一般作为分析方法实施。在每次操作后，可以将使用的DNA序列切割，并与下一DNA序列连接。可以在同一或其它质粒中克隆每个质粒序列。根据将期望的基因插入植物中的方法，其它DNA序列可以是必要的。如果例如使用Ti或Ri质粒转化植物细胞，那么至少Ti或Ri质粒T-DNA的右侧边界，但是经常是右侧和左侧边界必须作为要插入的基因的侧翼区连接。T-DNA转化植物细胞的用途已经透彻研究，并且充分记载于EP 120 516,Lee和Gelvin(2008),Hoekema(1985),Fraley等,(1986),及An等,(1985)，而且是本领域中完善建立的。

一旦将插入的DNA在植物基因组中整合，它便是相对稳定的。转化载体通常含有选择标志，其对经转化的植物细胞赋予对抗微生物剂或抗生素诸如Bialaphos、卡那霉素、G418、博来霉素、或潮霉素等的抗性。因而，个别采用的标志物应当容许选择经转化的细胞，而不是不含插入的DNA的细胞。

大量技术可用于将DNA插入植物宿主细胞中。那些技术包括使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂用T-DNA的转化、融合、注射、生物射弹(微粒轰击)、或电穿孔以及其它可能的方法。若使用土壤杆菌进行转化，则必须将要插入的DNA克隆入特殊的质粒中，即克隆入中间载体中或克隆入二元载体中。可以通过由于与T-DNA中的序列同源的序列所致的同源重组将中间载体整合入Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒还包含转移T-DNA必需的vir区。中间载体不能在土壤杆菌中自身复制。可以依靠辅助质粒将中间载体转移入根癌土壤杆菌中(接合)。二元载体在大肠杆菌和土壤杆菌中都能自身复制。它们包含选择标志基因和接头或多接头，其以右侧和左侧T-DNA边界区为框。可以将它们直接转化入土壤杆菌中(Holsters等,1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌包含携带vir区的质粒。vir区是将T-DNA转移入植物细胞中必需的。可以含有别的T-DNA。使用如此转化的细菌来转化植物细胞。有利地，可以将植物外植体与根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌一起培养以将DNA转移入植物细胞中。然后，可以在可含有供选择用的抗生素或抗微生物剂的选择培养基中自感染的植物材料(例如，叶块、柄(stalk)段、根，而且还有原生质体或悬浮培养的细胞)再生全植物。然后，可以对如此获得的植物测试插入的DNA的存在。在注射和电穿孔的情况中质粒没有特殊需要。有可能使用普通的质粒，诸如例如pUC衍生物。

经转化的细胞以常见的方式在植物内部生长。它们可以形成生殖细胞，并且将转化的性状传递给后代植物。可以将此类植物以正常的方式培养，并且与具有相同转化遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。所得的杂种个体具有相应的表型特性。

在本发明的一个优选的实施方案中，会用基因转化植物，其中已经对植物优化密码子选择。见例如美国专利No.5380831，在此通过提及而将其收录。虽然在本文中例示了一些截短的毒素，但是Bt领域中公知的是，130kDa型(全长)毒素具有作为核心毒素的N端半部分和作为原毒素“尾部”的C端半部分。如此，合适的“尾部”可以与本发明的截短的/核心毒素一起使用。见例如美国专利No.6218188和美国专利No.6673990。另外，用于创建用于植物的合成Bt基因的方法是本领域中已知的(Stewart和Burgin,2007)。优选的转化植物的一个非限制性例子是能育的玉米植物，其包含编码Cry1Fa蛋白的植物可表达基因，而且进一步包含编码Vip3Ab蛋白的第二植物可表达基因。

可以通过轮回选择育种，例如通过回交来实现Cry1Fa-和Vip3Ab-决定性状对近交玉米系的转移(或渐渗入。在此情况中，首先将期望的轮回亲本与携带适合于Cry1Fa-和Vip3Ab-决定性状的基因的供体近交物(非轮回亲本)杂交。然后，将此杂交的后代与轮回亲本回交(mate back)，接着在所得的后代中选择要自非轮回亲本转移的期望的性状。在与轮回亲本回交及选择期望的性状的3个，优选地4个，更优选地5个或更多个世代后，后代在控制所转移的性状的基因座方面会是杂合的，但是在大多数或几乎所有其它基因方面会与轮回亲本一样(见例如Poehlman和Sleper(1995)Breeding Field Crops,第4版,172-175;Fehr(1987)Principles of Cultivar Development,第1卷:Theoryand Technique,360-376)。

昆虫抗性管理(IRM)策略。例如，Roush等概述了2毒素策略，又称作“金字塔化(pyramiding)”或“叠加”，用于管理杀虫转基因作物。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353,1777-1786)。

在其网站上，美国环境保护局(epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)公布了提供与生成针对靶害虫有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的非转基因(即，非B.t.)避难所(非Bt作物/玉米的部分)的下列要求。

“玉米螟防护的Bt(Cry1Ab或Cry1F)玉米产品的特定结构化需要如下：

结构化避难所：玉米带中20%非鳞翅目Bt玉米避难所；

棉花带中50%非鳞翅目Bt避难所

区组(blocks)

内部(即，在Bt田内)

外部(即，在1/2英里(若可能的话，1/4英里)Bt田内的不同田地以使随机杂交最大化)

田间条(Strip)

条必须宽至少4行(优选地6行)以降低幼虫运动的效果”

另外，国家玉米种植者协会(National Corn Growers Association)，在其网站上：

(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)

还提供关于避难所需要的类似指导。例如：

“玉米螟IRM的要求：

-以避难所杂种种植至少20%的玉米地

-在棉花生产区中，避难所必须是50%

-必须在1/2英里的避难所杂种内种植

-避难所可以在Bt田内以条种植；避难所条必须宽至少4行

-只有当对靶昆虫达到经济阈值时，可以用常规的杀虫剂处理避难所

-基于Bt的可喷射的杀虫剂不能对避难所玉米使用

-必须在有Bt玉米的每个农场种植合适的避难所”

如由Roush等(例如第1780和1784右栏)所述，各自针对靶害虫有效的且具有很少或没有交叉抗性的两种不同蛋白质的叠加或金字塔化可以容许使用更小的避难所。Roush提示，对于成功的叠加，小于10%避难所的避难所大小可以提供与单一(非金字塔化)性状的约50%避难所相当的抗性管理。对于目前可用的金字塔化Bt玉米产品，美国环境保护局要求比对于单一性状产品(一般为20%)显著更少(一般为5%)的非Bt玉米的结构化避难所。

存在有提供避难所的IRM效果的多种方式，包括田间的各种几何种植样式(如上文所提及的)和袋中种子混合物，如由Roush等(见上文)及美国专利No.6,551,962进一步讨论的。

可以对主题双重或三重叠加或金字塔使用上述百分比、或类似的避难所比率。对于具有针对单一靶害虫的三种作用模式的三重叠加，目的会是0避难所(或例如小于5%避难所)。这特别适用于商业面积—例如超过10英亩的。

本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和出版物通过提及以它们与本说明书的明确教导不矛盾的程度完整收录。

如本文中所使用的，除非明确指示或暗示，术语“一个”、“一种”、和“该/所述”表示“至少一个/种”。

以下是例示用于实施本发明的规程的实施例。这些实施例不应解释为限制性的。除非另有记录，所有百分比是按重量计，而所有溶剂混合物比例是按体积计。所有温度以摄氏度计。

实施例

实施例1：实施例概述

给出如下的实施例，其显示了Vip3Ab1针对草地夜蛾(秋粘虫)野生型幼虫，并且针对对苏云金芽孢杆菌晶体毒素Cry1Fa有抗性的存在于波多黎各的草地夜蛾的田间收集菌株有活性。此生物学数据支持要使用的Vip3Ab1抗击昆虫中的Cry1抗性形成的效用，因为形成对Cry1Fa毒素抗性的昆虫会继续对Vip3Ab1毒素易感。

类似地，在草地夜蛾中，经¹²⁵I放射性标记的Cry1Fa结合受体蛋白，并且可以使用非放射性标记的Cry1Fa置换结合。然而，Vip3Ab1在这些实验中不能自其受体置换¹²⁵I Cry1Fa的结合。这些结果指示与Cry1Fa相比，Vip3Ab1具有独特的结合位点。Vip3Ab1针对对Cry1Fa有抗性的昆虫施加毒性的能力基于其获得证明的在这些毒素结合的位点处的非相互作用。呈现了别的数据，其显示了草地夜蛾中的Cry1Fa抗性性质是由于Cry1Fa不能结合自此昆虫制备的BBMV。Vip3Ab1针对丧失其结合Cry1Fa的能力的Cry1Fa抗性草地夜蛾幼虫的生物学活性进一步支持与Cry1Fa相比的Vip3Ab1的非相互作用靶位点。

实施例2：Cry1Fa和Vip3Ab1蛋白的纯化和胰蛋白酶加工。

在荧光假单胞菌表达菌株中表达编码Cry1Fa和Vip3Ab1原毒素的基因，并将全长蛋白以不溶性内含体分离。通过于37°C在含有20mM CAPS缓冲液，pH 11,+10mM DD T,+0.1%2-巯基乙醇的缓冲液中搅动2小时来溶解清洗的内含体。将溶液以27,000xg于37°C离心10分钟，并将上清液用0.5%(w/v)经TCPK处理的胰蛋白酶(Sigma)处理。将此溶液在混合情况下于室温再温育1小时，过滤，然后上样到用20mM CAPS pH 10.5平衡的Pharmacia Mono Q1010柱上。在用2个柱体积的缓冲液清洗上样柱后，在15个柱体积中以1.0ml/分钟的流速使用20mM CAPS中0至0.5M NaCl的线性梯度洗脱截短的毒素。纯化的经胰蛋白酶截短的Cry蛋白于约0.2-0.3M NaCl洗脱。通过SDS PAGE及使用考马斯亮蓝染料显现检查蛋白质的纯度。在一些情况中，将纯化的毒素的组合级分浓缩，并上样到Superose 6柱(直径1.6cm,长60cm)上，并通过大小排阻层析来进一步纯化。将包含单体分子量的单一峰的级分组合，并浓缩，生成在具有约60,000kDa的分子量的蛋白质方面大于95%同质的制备物。

以由Monte Badger提供的纯化的全长85kDa蛋白质(DIG-307)开始，以相似的方式实现对Vip3Ab1的加工。将蛋白质(12mg)透析到50mM磷酸钠缓冲液,pH 8.4中，然后通过添加1mg固体胰蛋白酶，并于室温温育1小时来加工。将溶液上样到MonoQ阴离子交换柱(直径1cm,长10cm.)上，并在7个柱体积里用20mM磷酸钠缓冲液,pH 8.4中的0至500mM的NaCl线性梯度洗脱。通过SDS-PAGE监测蛋白质的洗脱。主要的加工条带具有65kDa的分子量，如使用分子量标准品进行比较的SDS-PAGE测定的。

实施例3：昆虫生物测定法。

在用按人工昆虫饮食的新生草地夜蛾(J.E.Smith)幼虫进行的生物测定法中对纯化的蛋白质测试杀虫活性。将Cry1F抗性FAW自波多黎各的HerculexI(Cry1Fa)玉米田地收集，并且带到Dow AgroSciences Insectary继续饲养。在Schlenz等(Schlenz等,2008)的内部报告中概述了抗性FAW的此菌株的表征。

在128孔饲料生物测定盘(C-D International,Pitman,NJ)中进行昆虫生物测定法。每个孔含有0.5mL多物种鳞翅目饮食(Southland Products,LakeVillage,AR)。将在10mM CAPS,pH 10.5中以多个浓度稀释的纯化的Cry或Vip3Ab1蛋白的40μL等分试样或对照溶液通过移液到每孔的1.5cm²饮食表面(26.7μL/cm²)上来递送。每份样品测试16个孔。阴性对照是不含蛋白质的缓冲液溶液空白。阳性对照包括Cry1F的制备物。将经处理的盘在通风橱中保持，直至饮食表面上的液体已经蒸发或者被吸收到饮食中。

在羽化(eclosion)几个小时内，用湿润的骆驼毛刷挑出个体幼虫，并存放在经处理的饮食上，每个孔1个幼虫。然后，用开孔以容许气体交换的清洁塑料粘着片(adhesive sheet)(C-D International,Pitman,NJ)密封受侵染的孔。将生物测定盘在受控的环境条件(28°C,约40%RH,16:8[L:D]光周期)下保持。在5天后，记录暴露于每种蛋白质样品的昆虫的总数、死亡昆虫的数目和存活昆虫的重量。

实施例4：Cry1Fa毒素的碘化。

已经报告了Cry1F的碘化以在针对烟草蚜虫(tobacco budworm)幼虫和自这些昆虫制备的BBMV测试时破坏此蛋白质的毒性和结合能力两者(Luo等,1999;Sheets和Storer,2001)。灭活推测是由于需要在其结合位点附近的未修饰的酪氨酸残基所致。在使用碘珠法碘化Cry1F时，蛋白质丧失使用来自烟芽夜蛾(H.virescens)的BBMV实现的其展现出特异性结合特征的所有能力。采用碘珠法使用非放射性标记的NaI来碘化Cry1F，碘化的Cry1F也丧失其针对烟芽夜蛾的杀虫活性。

我们实验室的早期研究证明了可以使用在半胱氨酸残基处特异性烷基化蛋白质的经马来酰亚胺缀合的标记试剂来荧光标记Cry1Fa。因为Cry1Fa胰蛋白酶核心毒素含有第205位的单一半胱氨酸残基，用此类试剂标记蛋白质会导致蛋白质在单一特定位点的烷基化。确定的是，可以用荧光素-5-马来酰亚胺荧光标记Cry1Fa，而且经标记的蛋白质保留杀虫活性。基于经半胱氨酸荧光素标记的Cry1Fa的生物学活性的保留，确定的是我们也可以通过Palmer等,(Palmer等,1997)的方法放射性碘化标记物的荧光素部分，并将其附接于Cry1Fa的半胱氨酸，并且具有保留生物学活性的经放射性标记的Cry1Fa。

将荧光素-5-马来酰亚胺在DMSO中以10mM(4.27mg/ml)溶解，然后在PBS中稀释至1mM，如通过其摩尔消光系数68,000M^-1cm^-1所测定的。在铅屏蔽后面对含有2个碘珠的70μl PBS溶液添加0.5mCi Na¹²⁵I。容许溶液于室温混合5分钟，然后添加10μl 1mM荧光素-5-马来酰亚胺。容许反应物反应10分钟，然后移除碘珠。对反应的溶液添加PBS中的2μg高度纯化的经胰蛋白酶截短的Cry1Fa核心毒素。将蛋白质与碘化的荧光素-5-马来酰亚胺溶液于4°C温育48小时。通过以14mM添加2-巯基乙醇来停止反应。然后，将反应混合物添加至在20mM CAPS、150mM KCl，pH 9中平衡的Zebra旋转柱，并以1,500xg离心2分钟以分开未反应的碘化染料与蛋白质。在gamma计数器中计算经¹²⁵I放射性标记的荧光素-Cry1Fa以测定基于输入毒素的假设的80%回收测定的其比活。还通过SDS-PAGE表征蛋白质，并通过磷光成像来显现以确保测量的放射性与Cry1Fa蛋白共价联合。

实施例5：溶解的BBMV的制备和分级。

采用蛋白质量化和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的标准方法，如例如Sambrook等(Sambrook和Russell,2001)及其更新中教导的。

将末龄草地夜蛾幼虫禁食过夜，然后在冰上冷冻15分钟后解剖。自体腔取出中肠组织，留下附着于体壁的后肠。将中肠在9X体积的冰冷均质化缓冲液(300mM甘露醇、5mM EGTA、17mM Tris碱，pH7.5)(其补充有如供应商推荐的那样稀释的蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich P-2714))中放置。用玻璃组织匀浆器的15次撞击(stroke)将组织均质化。通过Wolfersberger(Wolfersberger,1993)的MgCl₂沉淀法制备BBMV。简言之，将300mM甘露醇中的等体积24mM MgCl₂溶液与中肠均浆混合，搅动5分钟，并容许在冰上竖立15分钟。将溶液于4°C以2,500x g离心15分钟。将上清液保留，并将团粒悬浮到初始体积的0.5X稀释的均质化缓冲液中，并再次离心。将两种上清液组合，并于4°C以27,000xg离心30分钟以形成BBMV级分。将团粒以约3mg/mL蛋白质浓度悬浮到BBMV贮存缓冲液(10mM HEPES、130mM KCl、10%甘油，pH7.4)中。使用BSA作为标准品测定蛋白质浓度。

测定L-亮氨酸-对-硝基苯胺氨肽酶活性(BBMV级分的一种标志物酶)，之后冷冻样品。简言之，将50μl L-亮氨酸-对-硝基苯胺(PBS中的1mg/ml)添加至标准比色皿中的940ml 50mM Tris HCl。将比色皿在Cary 50 Bio分光光度计中放置，相对于405nm的吸光度读数校零，并且通过添加10μl昆虫中肠均浆或昆虫BBMV制备物启动反应。将405nm的吸光度增加于室温监测5分钟。基于每个单位的对测定法添加的总蛋白质的吸光度的线性增加期间随时间的吸光度增加的动力学基于以下等式测定均浆和BBMV制备物的比活：

ΔOD/(分钟*mg)=氨肽酶速率(ΔOD/ml*分钟)/[蛋白质](mg/ml)

此酶的比活通常比存在于起始中肠均浆级分中的比活升高7倍。将BBMV等分取样到250μl样品中，在N₂中速冻，并于–80°C贮存。

实施例6：电泳

还原性(即在5%β-巯基乙醇中，BME)和变性(即，在存在4%SDS的情况中于90°加热5分钟)条件下进行通过SDS-PAGE对蛋白质的分析。将蛋白质上样到4%至20%tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(BioRad;Hercules,CA)的孔中，并于200伏特分离60分钟。通过用考马斯亮蓝R-250(BioRad)染色1小时来检测蛋白质条带，并用7%乙酸中的5%甲醇溶液脱色。将凝胶成像，并使用BioRadFluro-S Multi Imager^TM分析。通过与上样到凝胶的一个孔中的BenchMark^TM蛋白质梯(Invitrogen,Carlsbad,CA)样品中观察到的已知分子量蛋白质的迁移率比较来测定蛋白质条带的相对分子量。

实施例7：成像

通过SDS-PAGE和磷光成像(phosphorimaging)测定碘化的Cry1蛋白的放射性纯度和放射性Cry1Fa在拉下(pull down)测定法中的测量。简言之，通过将凝胶在Mylar膜(厚12μm)中包裹，在分离并固定蛋白质后，然后将凝胶在Molecular Dynamics储存磷光体屏(storage phosphor screen)(35cmx43cm)下至少暴露过夜，且多至4天来对SDS-PAGE凝胶成像。使用Molecular DynamicsStorm 820磷光成像仪(phosphorimager)显现板，并使用ImageQuant^TM软件分析图像。

实施例8：结果的汇总

图1中显示了来自在多个剂量针对野生型和Cry1Fa抗性草地夜蛾幼虫测试的全长Vip3Ab1蛋白的生物测定法的死亡率结果。针对野生型草地夜蛾幼虫，我们在测试的最高浓度(9,000ng/cm²)时获得100%死亡率，并且在较低的剂量降低死亡率水平。在约2,000ng/cm²评估LC-50。Vip3Ab1在抑制幼虫生长方面针对草地夜蛾是高度有效的，其中在1,000ng/cm²和更高的浓度为大于95%生长抑制。对这两种草地夜蛾幼虫观察到的生长抑制的高水平提示了，若保持较长的时段，则这些昆虫最有可能会进展为死亡。

还进行生物测定法以比较Vip3Ab1针对野生型草地夜蛾对Cry1Fa抗性草地夜蛾的生物学活性(图1)。百分比生长抑制以垂直棒标示，而百分比死亡率以菱形符号标示。暴露于毒素后5天测量的死亡率在所有测试的浓度对于这两种昆虫类型都低于50%。对生长抑制获得清楚的剂量响应。Vip3Ab1在高于1,000ng/cm²的浓度导致对Cry1Fa敏感性和Cry1Fa抗性草地夜蛾幼虫两者的幼虫生长的大于95%抑制，并且在约40ng/cm²时导致对野生型草地夜蛾的幼虫生长的约50%抑制。Vip3Ab1在测试的所有浓度(下至最低的4.1ng/cm²)导致对Cry1Fa抗性草地夜蛾的大于50%生长抑制。如此，Vip3Ab1具有针对Cry1Fa抗性草地夜蛾幼虫的高活性。

进行其它生物测定法重复以产生中值致死浓度(LC50)、中值生长抑制浓度。表2显示了与对照相比对于Vip3Ab1而言Cry1F易感性草地夜蛾和Cry1F抗性草地夜蛾的(GI50)和95%置信区间。

表2

进行放射性标记的竞争结合测定法来测定Vip3Ab1是否在Cry1Fa在FAW中结合的相同位点处相互作用。开发竞争测定法以测量Vip3Ab竞争经¹²⁵I放射性标记的Cry1Fa的结合的能力。图2显示了在结合BBMV蛋白后通过SDS-PAGE分离的放射性Cry1Fa的磷光图像(phosphorimage)。在没有任何竞争性配体的情况中，可以检出与BBMV蛋白联合的¹²⁵I Cry1Fa。在存在1,000nM未标记的Cry1Fa(与测定法中使用的经标记蛋白质的浓度相比多500倍)的情况中温育时，检出与¹²⁵I Cry1Fa对应的非常少量的放射性。如此，此结果显示了未标记的Cry1Fa与经放射性标记的Cry1Fa有效竞争对受体蛋白的结合，如会预期的，因为这些同源蛋白结合相同位点。在使用1,000nM未标记的Vip3Ab1蛋白作为竞争蛋白进行相同实验时，我们没有看到¹²⁵I Cry1Fa结合来自草地夜蛾的BBMV蛋白的水平变化，指示Vip3Ab1没有竞争¹²⁵ICry1Fa的结合。此结果解读为指示Vip3Ab1不与Cry1Fa在相同位点结合。

昆虫可以经由许多不同生物化学机制形成对Cry蛋白毒性的抗性，但是最常见机制是由于Cry毒素蛋白结合其在昆虫肠中的特定受体的能力降低所致(Heckel等,2007;Tabashnik等,2000;Xu等,2005)。这可以经由小的点突变、大的基因删除、或经由其它遗传或生物化学机制来引起。在我们调查来自Cry1Fa抗性草地夜蛾的BBMV蛋白以了解其对Cry1Fa的抗性的性质时，我们发现了与自野生型昆虫制备的BBMV相比，自Cry1Fa抗性昆虫制备的BBMV不太能够结合经¹²⁵I放射性标记的Cry1Fa(图3)。如此，草地夜蛾中对Cry1Fa的抗性机制是由于Cry1Fa对来自抗性昆虫的BBMV的结合的水平极大降低所致。因为我们在图2中显示了Vip3Ab1不竞争Cry1Fa的结合，所以这进一步证明Vip3Ab1不应受到牵涉Cry1Fa对其特异性受体结合的抗性机制影响。这在生物测定法中得到证明。如此，Vip3Ab1补充Cry1Fa的活性，因为它具有针对相似昆虫的生物学活性，仍不与这些Cry蛋白结合相同受体位点，并且如此不受会牵涉Cry毒素结合的降低的抗性机制影响。我们从这些研究推断Vip3Ab1是一种与Cry1Fa组合作为昆虫抗性管理方法的卓越昆虫毒素，所述昆虫抗性管理方法用于提供针对可以已经形成对这些蛋白质之任一种的抗性的昆虫的生物学活性，而且还预防抗性昆虫。

参考文献列表

Heckel,D.G.,Gahan,L.J.,Baxter,S.W.,Zhao,J.Z.,Shelton,A.M.,Gould,F.,and Tabashnik,B.E.(2007).The diversity of Bt resistance genes in species ofLepidoptera.J Invertebr Pathol 95,192-197.

Luo,K.,Banks,D.,and Adang,M.J.(1999).Toxicity,binding,andpermeability analyses of four bacillus thuringiensis cry1 delta-endotoxins usingbrush border membrane vesicles of spodoptera exigua and spodoptera frugiperda.Appl.Environ.Microbiol.65,457-464.

Palmer，M.,Buchkremer，M,Valeva,A,and Bhakdi,S.Cysteine-specificradioiodination of proteins with fluorescein maleimide.Analytical Biochemistry253,175-179.1997.

Ref Type:Journal(Full)

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Schlenz,M.L.,Babcock,J.M.,and Storer,N.P.Response ofCry1F-resistant and Susceptible European Corn Borer and Fall ArmywormColonies to Cry1A.105 and Cry12Ab2.DAI 0830,2008.Indianapolis,DowAgroSciences.Derbi Report.

Sheets,J.J.and Storer,N.P.Analysis of Cry1Ac Binding to Proteins inBrush Border Membrane Vesicles of Corn Earworm Larvae(Heleothis zea).Interactions with Cry1F Proteins and Its Implication for Resistance in the Field.DAI-0417,1-26.2001.Indianapolis,Dow AgroSciences.

Tabashnik,B.E.,Liu,Y.B.,Finson,N.,Masson,L.,and Heckel,D.G.(1997).One gene in diamondback moth confers resistance to four Bacillus thuringiensistoxins.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94,1640-1644.

Tabashnik,B.E.,Malvar,T.,Liu,Y.B.,Finson,N.,Borthakur，D.,Shin,B.S.,Park,S.H.,Masson,L.,de Maagd,R.A.,and Bosch,D.(1996).Cross-resistance ofthe diamondback moth indicates altered interactions with domain II of Bacillusthuringiensis toxins.Appl.Environ.Microbiol.62,2839-2844.

Tabashnik,B.E.,Roush,R.T.,Earle,E.D.,and Shelton,A.M.(2000).Resistance to Bt toxins.Science 287,42.

Wolfersberger，M.G.(1993).Preparation and partial characterization ofamino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgutof the gypsy moth(Lymantria dispar).Arch.Insect Biochem.Physiol 24,139-147.

Xu,X.,Yu,L.,and Wu,Y.(2005).Disruption of a cadherin gene associatedwith resistance to Cry1Ac{delta}-endotoxin of Bacillus thuringiensis inHelicoverpa armigera.Appl Environ Microbiol 71,948-954.

附录A

delta-内毒素的列表–来自Crickmore等网站(申请中引用)

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Claims

1.一种转基因植物，其包含编码Vip3Ab杀虫蛋白的DNA和编码Cry1F杀虫蛋白的DNA。

2.权利要求1的植物的种子。

3.权利要求1的植物，其中所述DNA被渐渗入所述植物中。

4.权利要求3的植物的种子。

5.包含非Bt避难所植物和权利要求1的多个植物的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于40%。

6.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于30%。

7.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于20%。

8.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于10%。

9.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于5%。

10.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物在区组或条中(in blocksor strips)。

11.种子混合物，其包含来自非Bt避难所植物的避难所种子和权利要求2的多个种子，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于40%。

12.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于30%。

13.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于20%。

14.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于10%。

15.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于5%。

16.一种管理昆虫形成对源自苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要求5的植物田地。

17.权利要求1的转基因植物，所述植物进一步包含编码第三杀虫蛋白的DNA，所述第三蛋白选自下组：Cry1C、Cry1D、Cry1Be、和Cry1E。

18.包含非Bt避难所植物和权利要求17的多个转基因植物的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于约20%。

19.包含权利要求17的多个植物的植物田地，其中所述田地包含小于约10%避难所植物。

20.一种管理昆虫形成对源自苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要求19的植物田地。

21.一种用于控制鳞翅目害虫的组合物，其包含表达有效量的含有Cry1F核心毒素的蛋白质和Vip3Ab蛋白两者的细胞。

22.权利要求21的组合物，其包含经转化以表达含有Cry1F核心毒素的蛋白质和Vip3Ab蛋白两者的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。

23.一种控制鳞翅目害虫的方法，包括对所述害虫或对所述害虫的环境给予有效量的权利要求21的组合物。

24.权利要求1的转基因植物，所述植物进一步包含编码第三杀虫蛋白的DNA，所述第三蛋白选自下组：Cry1C、Cry1D、和Cry1E。

25.权利要求24的转基因植物，其中所述植物生成选自下组的第四蛋白和第五蛋白：Cry2A、Cry1I、Cry1Ab、和DIG-3。

26.权利要求17的转基因植物，其中所述植物生成选自下组的第四蛋白：Cry2A、Cry1I、Cry1Ab、和DIG-3。

27.一种管理昆虫形成对Cry毒素的抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要求26的植物田地。

28.包含非Bt避难所植物和权利要求26的多个植物的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于约10%。

29.权利要求28的田地，其中所述田地包含小于约5%避难所植物。

30.一种管理昆虫形成对Cry毒素的抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要求28或29的植物田地。

31.种子混合物，其包含来自非Bt避难所植物的避难所种子和来自权利要求26的植物的多个种子，其中所述避难所种子占(comprise)所述混合物中的所有种子的小于10%。

32.权利要求5、18和28中任一项的田地，其中所述植物占据超过10英亩。

33.权利要求1、2、17、24、和26中任一项的植物，其中所述植物选自下组：玉米、大豆、和棉花。

34.权利要求1、2、17、24、和26中任一项的植物，其中所述植物是玉米植物。

35.权利要求26的转基因植物，其中所述第三蛋白是Cry1Be蛋白。

36.一种管理昆虫形成对Cry毒素的抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要求35的植物田地。

37.包含非Bt避难所植物和权利要求35的多个植物的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于约10%。

38.权利要求37的田地，其中所述田地包含小于约5%避难所植物。

39.一种管理昆虫形成对Cry毒素的抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要求37或38的植物田地。

40.种子混合物，其包含来自非Bt避难所植物的避难所种子和来自权利要求35植物的多个种子，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于10%。

41.权利要求37和38中任一项的田地，其中所述植物占超过10英亩。

42.权利要求1、3、17、24、25、26、33和34中任一项的植物，其中所述植物选自下组：玉米、大豆和棉花。

43.权利要求42的植物，其中所述植物是玉米植物。

44.权利要求1、3、17、24、25、26、33、和34中任一项的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含编码所述Cry1F杀虫蛋白的所述DNA和编码所述Vip3Ab杀虫蛋白的所述DNA，其中所述Cry1F杀虫蛋白与SEQ ID NO:1是至少99%同一的，且所述Vip3Ab杀虫蛋白与SEQ ID NO:2是至少99%同一的。

45.权利要求1、3、17、24、25、26、33、和34中任一项的植物，其中所述Cry1F杀虫蛋白包含SEQ ID NO:1，且所述Vip3Ab杀虫蛋白包含SEQ IDNO:2。