CN102762733A

CN102762733A - 与Cry1Ca组合的Cry1Da用于管理抗性昆虫的用途

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Publication number: CN102762733A
Application number: CN2010800640258A
Authority: CN
Inventors: T.米德; K.纳瓦; N.P.斯托尔; J.J.希茨; A.T.伍斯利; S.L.伯顿
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Kedihua Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2009-12-16
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2030-12-16
Also published as: US20130007923A1; ZA201204926B; MX2012007123A; IL220320A; CA2782557A1; AU2010339918A1; AR079505A1; CA2782557C; CN102762733B; RU2569108C2; AU2010339918B2; BR112012014681A2; ES2710850T3; RU2012129909A; KR20120115978A; EP2513316A4; MX345508B; CL2012001625A1; JP2013514773A; US9796982B2

Abstract

本发明包括用于控制秋粘虫鳞翅目昆虫的方法和植物，所述植物包含Cry1Da杀虫蛋白和Cry1Ca杀虫蛋白，和包含此对蛋白质的其它蛋白质的各种组合以延迟或预防昆虫抗性的形成。

Description

与Cry1Ca组合的Cry1Da用于管理抗性昆虫的用途

发明背景

人类种植玉米以供食物和能量应用。人类还种植许多其它作物，包括大豆和棉花。昆虫食用并损害植物，并且由此削弱这些人类努力。每年花费数十亿美元来控制昆虫有害生物，并且它们造成的损害损失额外的数十亿。合成的有机化学杀虫剂已经是用于控制昆虫有害生物的主要工具，但是生物学杀虫剂，诸如自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)衍生的杀虫蛋白(insecticidal protein)已经在一些领域中发挥重要作用。经由用Bt杀虫蛋白基因转化生成昆虫抗性植物的能力已经使现代农业发生革命，而且提高杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。

已经使用几种Bt蛋白来创建至今已经成功登记并商业化的昆虫抗性转基因植物。这些包括玉米中的Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F和Cry3Bb、棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab、和马铃薯中的Cry3A。

除了在2种蛋白质的组合杀虫谱是期望的(例如，玉米中的Cry1Ab和Cry3Bb组合以分别提供对鳞翅目有害生物和根虫的抗性)或蛋白质的独立作用使它们可用作用于延迟易感昆虫群中抗性形成的工具(例如，棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab组合以提供烟草蚜虫的抗性管理)的情况中外，表达这些蛋白质的商业产品表达单一蛋白质。还可见美国专利申请公开文本No.2009/0313717，其涉及Cry2蛋白及Vip3Aa、Cry1F、或Cry1A以控制玉米夜蛾(Helicoverpa zea)或棉铃实夜蛾(armigerain)。WO 2009 132850涉及Cry1F或Cry1A和Vip3Aa以控制草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)。美国专利申请公开文本No.2008/0311096部分涉及Cry1Ab以控制Cry1F抗性ECB。

也就是说，已经导致此技术的快速且普遍采用的昆虫抗性转基因植物的一些质量(quality)还引起如下的忧虑，即有害生物群体会形成对由这些植物生成的杀虫蛋白的抗性。已经提示了保留基于Bt的昆虫抗性性状的效用的几种策略，其包括与避难所所(refuge)组合以及与不同毒素交替、或在不同毒素共部署中部署(deploy)高剂量的蛋白质(McGaughey等(1998),“B.t.ResistanceManagement,”Nature Biotechnol.16:144-146)。

为了在昆虫抗性管理(IRM)叠加中使用而选定的蛋白质需要独立地施加其杀虫效果，使得对一种蛋白质形成的抗性未赋予对第二种蛋白质的抗性(即，没有对蛋白质的交叉抗性)。如果例如在对“蛋白质A”有抗性的有害生物群对“蛋白质B”敏感，那么会推断没有交叉抗性，并且蛋白质A和蛋白质B的组合会有效延迟对单独的蛋白质A的抗性。

在没有抗性昆虫群的情况中，可以基于假设与作用机制和交叉抗性潜力相关的其它特征做出评估。已经提示了受体介导的结合在鉴定有可能不展现出交叉抗性的杀虫蛋白中的效用(van Mellaert等1999)。缺乏此方法中固有的交叉抗性的关键预测物(predictor)是杀虫蛋白在敏感的昆虫物种中不竞争受体。

在两种Bt毒素竞争相同受体的情况中，则若所述受体在所述昆虫中突变，使得毒素之一不再结合所述受体，并且如此针对昆虫不再是杀虫性的，则情况可能是昆虫也会对第二种毒素(其竞争性结合相同受体)有抗性。也就是说，昆虫被说成与这两种Bt毒素有交叉抗性。然而，若两种毒素结合两种不同受体，则这可以是如下的指示，即昆虫不会对那两种毒素同时有抗性。

例如，Cry1Fa蛋白可用于控制许多鳞翅目有害生物物种，包括欧洲玉米螟(European corn borer)(ECB；玉米螟(Ostrinia nubilalis)(Hübner))和秋粘虫(fall armyworm)(FAW；草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))，并且针对甘蔗螟(sugarcane borer)(SCB；小蔗螟(Diatraea saccharalis))是有活性的。Cry1Fa蛋白(如在含有事件TC1507的转基因玉米植物中生成的)负责供FAW控制用的行业领先的昆虫抗性性状。Cry1Fa在

SmartStax^TM、和WideStrike^TM产品中进一步部署。

其它Cry毒素列于官方B.t.命名委员会的站点(Crickmore等;lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。目前有几乎60个“Cry”毒素大类(Cry1-Cry59)，及其它Cyt毒素和VIP毒素等。许多数字组各自具有大写字母亚组，而大写字母亚组具有小写字母亚-亚组。(例如，Cry1具有A-L，而Cry1A具有a-i)。

发明详述

本发明部分涉及令人惊讶的发现，Cry1Da和Cry1Ca在秋粘虫(FAW；草地夜蛾)的肠中不彼此竞争结合。如此，可以在转基因玉米(和其它植物，例如，例如棉花和大豆)中与Cry1Ca蛋白组合使用Cry1Da蛋白以延迟或阻止FAW形成对单独的这些蛋白质之任一的抗性。主题蛋白质对可以有效保护植物（诸如玉米植物和/或大豆植物）免于Cry抗性秋粘虫的损害。也就是说，使用本发明来保护玉米和其它经济上重要的植物物种免于由可以形成对Cry1Da或Cry1Ca的抗性的秋粘虫群体引起的损害和产量损失。

如此，本发明教导了昆虫抗性管理(IRM)叠加，其包含Cry1Da和Cry1Ca以阻止或减轻FAW形成对这些蛋白质之任一或两者的抗性。

本发明提供了用于控制鳞翅目有害生物的组合物，其包含生成Cry1Da杀虫蛋白和Cry1Ca杀虫蛋白的细胞。

本发明进一步包含经转化以生成Cry1Da杀虫蛋白和Cry1Ca杀虫蛋白两者的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。优选地，主题多核苷酸在遗传构建体中在非苏云金芽孢杆菌启动子的控制下。主题多核苷酸可以包含用于在植物中增强表达的密码子选择。

另外，意图本发明提供控制鳞翅目有害生物的方法，包括接触所述有害生物或所述有害生物的环境与有效量的组合物，该组合物含有含Cry1Da核心毒素的蛋白质，而且进一步含有含Cry1Ca核心毒素的蛋白质。

本发明的一个实施方案包括玉米植物和此类植物的种子，所述植物包含植物可表达的编码Cry1Ca杀虫蛋白的基因和植物可表达的编码Cry1Da杀虫蛋白的基因。

本发明的又一个实施方案包括玉米植物和此类植物的种子，其中植物可表达的编码Cry1Ca杀虫蛋白的基因和植物可表达的编码Cry1Da杀虫蛋白的基因已经基因渗入所述玉米植物中。

如实施例中所描述的，使用放射性标记的Cry1Da蛋白的竞争性受体结合研究显示了Cry1Ca蛋白在Cry1Da结合的FAW组织中不竞争结合。这些结果还指示Cry1Da和Cry1Ca蛋白的组合可以是减轻FAW群体中形成对这些蛋白质之任一的抗性的有效手段。如此，部分基于本文中所描述的数据，认为可以使用Cry1Ca和Cry1Da蛋白的共生成(叠加)来为FAW生成高剂量IRM叠加。

可以将其它蛋白质添加至此对。例如，本发明还部分涉及三种(或更多种)毒素的三重叠加或“金字塔”，其中Cry1Da和Cry1Ca是基础对(base pair)。在一些优选的金字塔实施方案中，选定的毒素具有针对FAW的三种不同作用位点。一些优选的“三种作用位点”金字塔组合包括蛋白质的主题基础对及Cry1Fa、Vip3Ab、Cry1Be、或Cry1E作为用于靶向FAW的第三蛋白。“不同作用位点”意指任何给定的蛋白质彼此不引起交叉抗性。依照本发明，这些具体的三重叠加会有利地且令人惊讶地提供了针对FAW的三种作用位点。这可以帮助降低或消除对避难所所土地面积的需要。

也可以依照本发明添加其它毒素/基因。例如，若Cry1Fa或Cry1Be与主题蛋白质对(Cry1Fa和Cry1Be两者针对FAW和欧洲玉米螟(ECB)都是有活性的)叠加，则对此三重叠加添加两种额外的蛋白质(其中两种添加的蛋白质靶向ECB)会提供针对FAW的三种作用位点，和针对ECB的三种作用位点。这两种添加的蛋白质(第四和第五蛋白)可以选自下组：Cry2A、Cry1I、DIG-3(见美国专利申请流水号61/284,278(2009年12月16日提交)和US 201000269223)、和Cry1Ab。这会导致具有针对两种昆虫(ECB和FAW)的三种作用位点的5蛋白质叠加。

如此，一种部署选项是与第三毒素/基因组合使用主题蛋白质对，并且使用此三重叠加以减轻FAW中形成对这些毒素之任一的抗性。因而，本发明还部分涉及三种(或更多种)毒素的三重叠加或“金字塔”。在一些优选的金字塔实施方案中，选定的毒素具有针对FAW的三种不同作用位点。

本发明的部署选项中包括的会是在FAW可以形成抗性群体的作物生长区使用本发明的两种、三种、或更多种蛋白质。

对于使用Cry1Fa及Cry1C，见美国专利申请流水号61/284,281(2009年12月16日提交)，其显示了Cry1C针对Cry1F抗性FAW有活性。对于使用Cry1Fa及Cry1D，见美国专利申请流水号61/284,252(2009年12月16日提交)，其显示了Cry1D针对Cry1F抗性FAW有活性。这两种应用还显示了Cry1C在FAW膜制备物中不与Cry1F竞争结合，并且Cry1D在FAW膜制备物中不与Cry1F竞争结合。在Cry1Fa针对FAW和ECB有活性的情况中，依照本发明，Cry1Da及Cry1Ca及Cry1Fa会有利地且令人惊讶地提供针对FAW的三种作用位点。这可以帮助降低或消除对避难所所土地面积的需要。

Cry1Fa在

SmartStax^TM、和WidesStrike^TM产品中部署。诸如基因对(Cry1Da和Cry1Ca)可以组合入例如Cry1Fa产品诸如

SmartStax^TM、和WideStrike^TM中。因而，主题蛋白质对可以显著降低对这些和其它蛋白质的选择压力。如此，主题蛋白质对可以与在三种基因组合中一样用于玉米和其它植物(例如，棉花和大豆)。

如上文所讨论的，也可以依照本发明添加其它毒素/基因。对于使用Cry1E(用于控制FAW)，见美国专利申请流水号61/284,278(2009年12月16日提交)。对于使用Cry1Ab(用于控制ECB)，见美国专利申请公开文本No.2008/0311096。

生成蛋白质的任何主题组合的植物(和种植有此类植物的土地面积)包括在本发明的范围内。还可以添加其它毒素/基因，但是上文所讨论的特定叠加有利地且令人惊讶地提供了针对FAW和/或ECB的多个作用位点。这可以帮助降低或消除对避难所所土地面积的需要。如此，超过10英亩如此种植的田地包括在本发明内。

也可以使用那些GENBANK来获得本文中公开的或提及的任何基因和蛋白质的序列。见下文附录A。相关序列在专利中也可获得。例如，美国专利No.5,188,960和美国专利No.5,827,514描述了适用于用于实施本发明的含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质。美国专利No.6,218,188描述了编码适合于用于本发明的含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质的经植物优化的DNA序列。

可以使用本文中描述的蛋白质组合来控制鳞翅目有害生物。成年鳞翅目，例如蝴蝶和蛾主要以花蜜为食，并且是传粉的重要实现物(effector)。几乎所有鳞翅目幼虫，即毛虫以植物为食，并且许多是严重的有害生物。毛虫在叶上或内部进食或者以植物的根或茎为食，对植物剥夺营养物，而且经常破坏植物的物理支持结构。另外，毛虫以果实、织物、和贮存的谷物和面粉为食，毁坏出售的这些产品或者严重降低其价值。如本文中所使用的，提及鳞翅目有害生物指有害生物的各个生命阶段，包括幼虫阶段。

本发明的一些嵌合毒素包括Bt毒素的完整N端核心毒素部分，并且在超出核心毒素部分末端的某个点处，蛋白质具有向异源原毒素(protoxin)序列的过渡。Bt毒素的N端杀虫活性的毒素部分称为“核心”毒素。自核心毒素区段至异源原毒素区段的过渡可以大致在毒素/原毒素连接处发生或者，在备选中，可以保留天然原毒素的部分(超出核心毒素部分延伸)，其中在下游发生向异源原毒素部分的过渡。

举例而言，本发明的一个嵌合毒素是Cry1Da的完整核心毒素部分(大致为前600个氨基酸)和/或异源原毒素(剩余的C端氨基酸)。在一个优选的实施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自Cry1Ab蛋白毒素。在一个优选的实施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自Cry1Ab蛋白毒素。

本领域技术人员会领会，Bt毒素(即使在某个种类诸如Cry1Ca内)在长度和核心毒素部分向原毒素部分过渡的精确位置上会以一定程度有所变化。通常，Cry1Ca毒素的长度是约1150至约1200个氨基酸。自核心毒素部分至原毒素部分的过渡通常会在全长毒素的约50%-约60%发生。本发明的嵌合毒素会包括整段(full expanse)的此N端核心毒素部分。如此，嵌合毒素会包含Cry1 Bt毒素蛋白的全长的至少约50%。这通常会是至少约590个氨基酸。关于原毒素部分，整段的Cry1 Ab原毒素部分自核心毒素部分末端延伸至分子的C端。

基因和毒素。依照本发明有用的基因和毒素不仅包括公开的全长序列，而且还包括保留本文中明确例示的毒素的特征性杀虫(pesticidal)活性的这些序列、变体、突变体、和融合蛋白的片段。如本文中所使用的，术语基因的“变体”或“变异”指编码相同毒素或编码具有杀虫活性的等同毒素的核苷酸序列。如本文中所使用的，术语“等同毒素”指与要求保护的毒素具有相同或基本上相同的针对靶有害生物的生物学活性的毒素。

如本文中所使用的，按照“Revision of the Nomenclature for the Bacillusthuringiensis Pesticidal Crystal Proteins,”N.Crickmore,D.R.Zeigler,J.Feitelson,E.Schnepf，J.Van Rie,D.Lereclus,J.Baum和D.H.Dean.Microbiology and Molecular Biology Reviews(1998)第62卷:807-813，边界代表约95%(Cry1Da和Cry1Ca)、78%(Cry1D和Cry1C)、和45%(Cry1)序列同一性。这些截留也可以仅仅应用于核心毒素。

对于本领域技术人员应当显而易见的是，可以经由几种手段鉴定并获得编码活性毒素的基因。可以自保藏于培养物保藏所的分离物获得本文中例示的特定基因或基因部分。也可以例如通过使用基因合成仪以合成方式构建这些基因或其部分或变体。可以使用用于生成点突变的标准技术来容易地构建基因的变异。还有，可以使用商品化的外切核酸酶或内切核酸酶依照标准的规程来生成这些基因的片段。例如，可以使用酶诸如Bal31或定点诱变自这些基因的末端系统性剪断核苷酸。也可以使用多种限制酶来获得编码活性片段的基因。可以使用蛋白酶来直接获得这些蛋白质毒素的活性片段。

保留例示的毒素的杀虫活性的片段和等同物会在本发明的范围内。还有，由于遗传密码的冗余，多种不同DNA序列可以编码本文中公开的氨基酸序列。完全在本领域技术人员的技术内的是创建编码相同的，或基本上相同的毒素的这些备选DNA序列。这些变体DNA序列在本发明的范围内。如本文中所使用的，提及“基本上相同的”序列指具有没有实质性影响杀虫活性的氨基酸取代、缺失、添加、或插入的序列。编码保留杀虫活性的蛋白质的基因的片段也包括在此定义中。

用于鉴定依照本发明有用的编码毒素的基因和基因部分的又一种方法是经由使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列凭借合适的标记物可以是可检出的或者可以以固有荧光生成，如记载于国际申请No.WO93/16094的。如本领域中公知的，若探针分子和核酸样品通过形成两种分子间强烈的键来杂交，则可以合理地假设探针和样品具有实质的同源性。优选地，通过本领域中公知的技术在严格条件下进行杂交，如记载于例如Keller,G.H.,M.M.Manak(1987)DNA Probes,Stockton Press,New York,N.Y.,第169-170页的。盐浓度和温度组合的一些例子如下(以严格性升高的次序)：2X SSPE或SSC于室温；1X SSPE或SSC于42°C；0.1X SSPE或SSC于42°C；0.1X SSPE或SSC于65°C。探针的检测提供了一种用于以已知的方式测定杂交是否已经发生的手段。此类探针分析提供一种用于鉴定本发明的毒素编码基因的快速方法。可以使用DNA合成仪和标准的规程来合成依照本发明作为探针使用的核苷酸区段。也可以使用这些核苷酸序列作为PCR引物以扩增本发明的基因。

变体毒素。已经在本文中明确例示本发明的某些毒素。因为这些毒素仅是本发明的毒素例示性的，所以应当容易显而易见的是，本发明包括具有例示毒素的相同或相似杀虫活性的变体或等同毒素(和编码等同毒素的核苷酸序列)。等同毒素与例示的毒素会具有氨基酸同源性。此氨基酸同源性通常会大于75%，优选大于90%，且最优选大于95%。氨基酸同源性在毒素中负责生物学活性或者牵涉决定最终负责生物学活性的三维构型的至关重要的区域中会是最高的。在这点上，某些氨基酸取代是可接受的，并且若这些取代在对于活性不是至关重要的区域中或者是不影响分子的三维构型的保守氨基酸取代，则可以是预期的。例如，氨基酸可以放入以下种类：非极性、不带电荷的极性、碱性、和酸性。其中的一类氨基酸用相同类型的另一种氨基酸替换的保守取代落入本发明的范围内，只要取代不实质性改变化合物的生物学活性。下文是属于每类的氨基酸的例子的列表。

氨基酸的种类	氨基酸的例子
		非极性	Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Met,Phe,Trp

不带电荷的极性	Gly,Ser,Thr,Cys,Tyr,Asn,Gln
		酸性	Asp,Glu
碱性	Lys,Arg,His

在一些情况中，也可以进行非保守取代。至关重要的因素是这些取代必须不显著降低毒素的生物学活性。

重组宿主。可以将编码本发明的毒素的基因导入极其多种微生物或植物宿主中。毒素基因的表达直接或间接导致杀虫剂(pesticide)的胞内生成和维持。可以使用接合转移和重组转移来创建表达本发明的两种毒素的Bt菌株。也可以用一种或两种毒素基因转化其它宿主生物体，所述毒素基因然后用于实现协同效应。凭借合适的微生物宿主，例如假单胞菌属(Pseudomonas)，可以将微生物应用于有害生物的位置，在那里它们会增殖并被摄取。结果是对有害生物的控制。或者，可以在延长毒素的活性并且稳定细胞的条件下处理为毒素基因做宿主的微生物。然后，可以将经处理的细胞(其保留毒性活性)应用于靶有害生物的环境。

在经由合适的载体将Bt毒素基因导入微生物宿主中，且将所述宿主应用于生活状态的环境的情况中，使用某些宿主微生物是必要的。选择如下的微生物宿主，已知所述微生物宿主占据一种或多种感兴趣作物的“植物圈”(叶面(phylloplane)、叶圈、根际、和/或根面)。这些微生物选择为使得能够在特定环境(作物和其它昆虫生境)中与野生型微生物成功竞争，提供表达多肽杀虫剂的基因的稳定维持和表达，且期望地，提供改善的保护杀虫剂免于环境降解和灭活。

已知大量微生物驻留于极其多种重要的作物的叶面(植物叶的表面)和/或根际(植物根周围的土壤)。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物，诸如细菌，例如假单胞菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilius)、土壤杆菌属(Agrobactenum)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳酸菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)、和产碱菌属(Alcaligenes)；真菌，特别是酵母，例如属酵母菌属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、和短梗霉属(Aureobasidium)。特别感兴趣的是植物圈细菌物种，诸如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、根癌土壤杆菌(Agrobacteniumtumefaciens)、类球红细胞(Rhodopseudomonas spheroids)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱菌(Alcaligenes entrophus)、和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandii)；和植物圈真菌物种，诸如深红类酵母菌(Rhodotorula rubra)、胶红类酵母菌(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母菌(R.aurantiaca)、白色隐球菌(Cryptococcus albidus)、液化隐球菌(C.diffluens)、劳伦梯氏隐球菌(C.laurentii)、罗氏酵母(Saccharomyces rosei)、S.pretoriensis、酿酒酵母(S.cerevisiae)、玫红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)、和出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpollulans)。特别感兴趣的是色素性微生物。

极其多种方法可用于在容许基因的稳定维持和表达的条件下将编码毒素的Bt基因导入微生物宿主中。这些方法是本领域技术人员公知的，并且记载于例如美国专利No.5135867，通过提及而将其收入本文。

细胞的处理。可以处理表达Bt毒素的苏云金芽孢杆菌或重组细胞以延长毒素活性并稳定细胞。形成的杀虫剂微囊体包含在已经稳定化的细胞结构内的一种或多种Bt毒素，并且在将微囊体应用于靶有害生物的环境时会保护毒素。合适的宿主细胞可以包括原核生物或真核生物，通常不限于那些不生成对于高等生物体，诸如哺乳动物有毒性的物质的细胞。然而，可以使用生成对于高等生物体有毒性的物质的生物体，其中毒性物质是不稳定的或应用水平充分降低，从而避免对哺乳动物宿主的毒性的任何可能性。作为宿主，特别感兴趣的会是原核生物和低等真核生物，诸如真菌。

细胞通常会是完整的，并且在处理时基本上为增殖形式，而不是为孢子形式，尽管在一些情况中可以采用孢子。

可以通过化学或物理手段，或者通过化学和/或物理手段的组合来处理微生物细胞，例如含有一种或多种B.t.毒素基因的微生物，只要所述技术没有不利地影响毒素的特性，也不降低保护毒性的细胞性能。化学试剂的例子是卤化剂，特别是原子数17-80的卤素。更特别地，可以将碘在温和(mild)条件下且持续足够的时间使用，使得实现期望的结果。其它合适的技术包括用醛，诸如戊二醛；抗感染药，诸如氯化苄烷铵(zephiran chloride)和西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)；醇，诸如异丙基和乙醇；各种组织固定剂，诸如Lugol碘、Bouin氏固定剂、各种酸和Helly氏固定剂(见：Humason,Gretchen L.,Animal Tissue Techniques,W.H.Freeman and Company,1967)；或在对宿主环境施用细胞时保留并延长细胞中生成的毒素的活性的物理(热)和化学剂的组合处理。物理手段的例子是短波长辐射，诸如gamma-辐射和X-辐射、冷冻、UV照射、冻干等。用于处理微生物细胞的方法披露于美国专利No.4,695,455和4,695,462，通过提及而将其收入本文。

细胞一般会具有增强的结构稳定性，这会增强对环境条件的抗性。在杀虫剂为原型(proform)的情况中，细胞处理的方法应当选择为使得不抑制靶有害生物病原体将原型加工成杀虫剂的成熟形式。例如，甲醛会交联蛋白质，而且可以抑制对多肽杀虫剂的原型的加工。处理方法应当至少保留毒素的生物利用度或生物活性的实质性部分。

出于生成目的选择宿主细胞中特别感兴趣的特征包括容易将一种或多种B.t.基因导入宿主中、表达系统的利用度、表达效率、杀虫剂在宿主中的稳定性、和辅助遗传性能的存在。作为杀虫剂微囊体使用的感兴趣特征包括杀虫剂的保护质量，诸如厚的细胞壁、色素沉着、和包含体的胞内包装或形成；在水性环境中存活；缺乏哺乳动物毒性；对摄食的有害生物的吸引力；在不损害毒素的情况中容易杀死和固定；等等。其它考虑因素包括容易配制和处理、经济、贮存稳定性，等等。

细胞生长。可以将含有一种或多种B.t.杀虫基因的细胞宿主在任何便利的营养培养基中培养，其中DNA构建体提供选择优势，提供选择培养基，使得基本上所有或所有细胞保留B.t.基因。然后，可以依照常规的方式收获这些细胞。或者，可以在收获前处理细胞。

可以使用标准技术培养基和发酵技术来培养生成本发明的毒素的B.t.细胞。在完成发酵周期后，可以如下收获细菌，即首先通过本领域中公知的手段自发酵培养基分离B.t.孢子和晶体。可以通过添加表面活性剂、分散剂、惰性载体和其它组分将回收的B.t.孢子和晶体配制成可湿的粉末、液体浓缩物、颗粒剂或其它配制剂以便于针对特定的靶有害生物的处理和应用。这些配制剂和应用规程是本领域中公知的。

配制剂。可以将含有引诱剂和B.t.隔离群、或包含自本文中公开的B.t.隔离群可获得的基因的重组微生物的孢子、晶体、和毒素的配制的诱饵颗粒剂应用于土壤。也可以将配制的产物以种子涂层材料或根处理或总体植物处理在作物周期的后期阶段应用。B.t.细胞的植物和土壤处理可以以可湿的粉末、颗粒或粉尘采用，其通过混合各种惰性材料，诸如无机矿物质(叶硅酸盐(phyllosilicate)、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物材料(粉状玉米穗轴、稻壳、胡桃壳等)来实现。配制剂可以包含展着剂-粘着剂(spreader-sticker)佐剂、稳定剂、其它杀虫添加剂、或表面活性剂。液体配制剂可以是基于水性的或非水性的，并且以泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化的浓缩物等采用。成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂、或聚合物。

如本领域技术人员会领会的，杀虫浓度会随特定配制剂的性质，特别是它是浓缩物还是要直接使用而广泛变化。杀虫剂会以至少1%(按重量计)存在，并且可以是100%(按重量计)。干配制剂会具有约1-95%(按重量计)的杀虫剂，而液体配制剂一般会是液相中约1-60%(按重量计)的固体。配制剂一般会具有约10²至约10⁴个细胞/mg。这些配制剂会以每公顷约50mg(液体或干的)至1kg或更多施用。

可以通过喷雾、喷粉、喷洒等将配制剂应用于鳞翅目有害生物的环境，例如叶或土壤。

植物转化。一种用于生成本发明的杀虫蛋白的优选的重组宿主是经转化的植物。可以使用本领域中公知的多种技术来将如本文中所公开的编码Bt毒素蛋白的基因插入植物细胞中。例如，包含大肠杆菌(Escherichia coli)中的复制系统和容许选择经转化的细胞的标志物的大量克隆载体可用于准备好将外来基因插入高等植物中。例如，载体包括pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184，等等。因而，可以将具有编码Bt毒素蛋白的序列的DNA片段在合适的限制性位点插入载体中。可以使用所得的质粒对大肠杆菌转化将大肠杆菌细胞在合适的营养培养基中培养，然后收获并裂解。将质粒回收。序列分析、限制性分析、电泳、和其它生物化学-分子生物学方法一般作为分析方法实施。在每次操作后，可以将使用的DNA序列切割，并与下一DNA序列连接。可以在同一或其它质粒中克隆每个质粒序列。根据将期望的基因插入植物中的方法，其它DNA序列可以是必要的。如果例如使用Ti或Ri质粒转化植物细胞，那么至少Ti或Ri质粒T-DNA的右侧边界，但是经常是右侧和左侧边界必须作为要插入的基因的侧翼区连接。T-DNA转化植物细胞的用途已经透彻研究，并且充分记载于EP 120 516,Lee和Gelvin(2008),Hoekema(1985),Fraley等,(1986),及An等,(1985)，而且是本领域中完善建立的。

一旦将插入的DNA在植物基因组中整合，它便是相对稳定的。转化载体通常含有选择标志，其对经转化的植物细胞赋予对抗微生物剂或抗生素诸如Bialaphos、卡那霉素、G418、博来霉素、或潮霉素等的抗性。因而，个别采用的标志物应当容许选择经转化的细胞，而不是不含插入的DNA的细胞。

大量技术可用于将DNA插入植物宿主细胞中。那些技术包括使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂用T-DNA的转化、融合、注射、生物射弹(微粒轰击)、或电穿孔以及其它可能的方法。若使用土壤杆菌进行转化，则必须将要插入的DNA克隆入特殊的质粒中，即克隆入中间载体中或克隆入二元载体中。可以通过由于与T-DNA中的序列同源的序列所致的同源重组将中间载体整合入Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒还包含转移T-DNA必需的vir区。中间载体不能在土壤杆菌中自身复制。可以依靠辅助质粒将中间载体转移入根癌土壤杆菌中(接合)。二元载体在大肠杆菌和土壤杆菌中都能自身复制。它们包含选择标志基因和接头或多接头，其以右侧和左侧T-DNA边界区为框。可以将它们直接转化入土壤杆菌中(Holsters等,1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌包含携带vir区的质粒。vir区是将T-DNA转移入植物细胞中必需的。可以含有别的T-DNA。使用如此转化的细菌来转化植物细胞。有利地，可以将植物外植体与根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌一起培养以将DNA转移入植物细胞中。然后，可以在可含有供选择用的抗生素或抗微生物剂的选择培养基中自感染的植物材料(例如，叶块、柄(stalk)段、根，而且还有原生质体或悬浮培养的细胞)再生全植物。然后，可以对如此获得的植物测试插入的DNA的存在。在注射和电穿孔的情况中质粒没有特殊需要。有可能使用普通的质粒，诸如例如pUC衍生物。

经转化的细胞以常见的方式在植物内部生长。它们可以形成生殖细胞，并且将转化的性状传递给后代植物。可以将此类植物以正常的方式培养，并且与具有相同转化遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。所得的杂种个体具有相应的表型特性。

在本发明的一个优选的实施方案中，会用基因转化植物，其中已经对植物优化密码子选择。见例如美国专利No.5380831，在此通过提及而将其收录。虽然在本文中例示了一些截短的毒素，但是Bt领域中公知的是，130kDa型(全长)毒素具有作为核心毒素的N端半部分和作为原毒素“尾部”的C端半部分。如此，合适的“尾部”可以与本发明的截短的/核心毒素一起使用。见例如美国专利No.6218188和美国专利No.6673990。另外，用于创建用于植物的合成Bt基因的方法是本领域中已知的(Stewart和Burgin,2007)。优选的转化植物的一个非限制性例子是能育的玉米植物，其包含编码Cry1Da蛋白的植物可表达基因，而且进一步包含编码Cry1Ca蛋白的第二植物可表达基因。

可以通过轮回选择育种，例如通过回交来实现Cry1Da-和Cry1Ca决定性状对近交玉米系的转移(或基因渗入。在此情况中，首先将期望的轮回亲本与携带适合于Cry1D-和Cry1C-决定性状的基因的供体近交物(非轮回亲本)杂交。然后，将此杂交的后代与轮回亲本回交(mate back)，接着在所得的后代中选择要自非轮回亲本转移的期望的性状。在与轮回亲本回交及选择期望的性状的3个，优选地4个，更优选地5个或更多个世代后，后代在控制所转移的性状的基因座方面会是杂合的，但是在大多数或几乎所有其它基因方面会与轮回亲本一样(见例如Poehlman和Sleper(1995)Breeding Field Crops,第4版,172-175;Fehr(1987)Principles of Cultivar Development,第1卷:Theoryand Technique,360-376)。

昆虫抗性管理(IRM)策略。例如，Roush等概述了2毒素策略，又称作“金字塔化(pyramiding)”或“叠加”，用于管理杀虫转基因作物。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353,1777-1786)。

在其网站上，美国环境保护局(epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)公布了提供与生成针对靶有害生物有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的非转基因(即，非B.t.)避难所所(非Bt作物/玉米的部分)的下列要求。

“玉米螟防护的Bt(Cry1Ab或Cry1F)玉米产品的特定结构化需要如下：

结构化避难所所：玉米带中20%非鳞翅目Bt玉米避难所所；

棉花带中50%非鳞翅目Bt避难所所

区组

内部(即，在Bt田内)

外部(即，在1/2英里(若可能的话，1/4英里)Bt田内的不同田地以使随机杂交最大化)

田间条(Strip)

条必须宽至少4行(优选地6行)以降低幼虫运动的效果”

另外，国家玉米种植者协会(National Corn Growers Association)，在其网站上：

(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)

还提供关于避难所所需要的类似指导。例如：

“玉米螟IRM的要求：

-以避难所杂种种植至少20%的玉米地

-在棉花生产区中，避难所所必须是50%

-必须在1/2英里的避难所杂种内种植

-避难所所可以在Bt田内以条种植；避难所条必须宽至少4行

-只有当对靶昆虫达到经济阈值时，可以用常规的杀虫剂处理避难所所

-基于Bt的可喷射的杀虫剂不能对避难所玉米使用

-必须在有Bt玉米的每个农场种植合适的避难所所”

如由Roush等(例如第1780和1784右栏)所述，各自针对靶有害生物有效的且具有很少或没有交叉抗性的两种不同蛋白质的叠加或金字塔化可以容许使用更小的避难所所。Roush提示，对于成功的叠加，小于10%避难所所的避难所所大小可以提供与单一(非金字塔化)性状的约50%避难所所相当的抗性管理。对于目前可用的金字塔化Bt玉米产品，美国环境保护局要求比对于单一性状产品(一般为20%)显著更少(一般为5%)的非Bt玉米的结构化避难所所。

存在有提供避难所所的IRM效果的多种方式，包括田间的各种几何种植样式(如上文所提及的)和袋中种子混合物，如由Roush等(见上文)及美国专利No.6,551,962进一步讨论的。

可以对主题双重或三重叠加或金字塔使用上述百分比、或类似的避难所所比率。对于具有针对单一靶有害生物的三种作用位点的三重叠加，目的会是0避难所所(或例如小于5%避难所所)。这特别适用于商业面积—例如超过10英亩的。

本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和出版物通过提及以它们与本说明书的明确教导不矛盾的程度完整收录。

如本文中所使用的，除非明确指示或暗示，术语“一个”、“一种”、和“该/所述”表示“至少一个/种”。

以下是例示用于实施本发明的规程的实施例。这些实施例不应解释为限制性的。除非另有记录，所有百分比是按重量计，而所有溶剂混合物比例是按体积计。所有温度以摄氏度计。

实施例

实施例1：Cry蛋白的¹²⁵I标记

Cry毒素的碘化。使用碘珠(Iodo-Bead)或Iodo-gen (Pierce)来碘化纯化的截短的Cry毒素。简言之，将两个碘珠用500μL磷酸盐缓冲盐水PBS(20mM磷酸钠、0.15M NaCl,pH7.5)清洗两次，并放入具有100μL PBS的1.5mL离心管中。添加0.5mCi经¹²⁵I标记的碘化钠，容许组分于室温反应5分钟，然后将1μgCry1Da核心毒素蛋白添加至溶液，并容许再反应3至5分钟。通过自碘化珠移出溶液来终止反应，并将其应用于在50mM CAPS,pH10.0、1mM DTT (二硫苏糖醇)、1mM EDTA、和5%甘油中平衡的Zeba^TM旋转柱(Invitrogen)。将碘化珠用10μL PBS清洗两次，并也将清洗缓冲液应用于Zeba^TM脱盐柱。通过以1,000x g离心2分钟将放射性溶液洗脱通过旋转柱。然后，将经¹²⁵I放射性标记的Cry1Da核心毒素蛋白针对50mM CAPS,pH10.0、1mM DTT、1mMEDTA、和5%甘油透析。

将两个碘珠用500μl磷酸盐缓冲盐水PBS(20mM磷酸钠、0.15M NaCl，pH 7.5)清洗两次，并放入铅屏蔽后面的1.5ml离心管中。对此添加100μl PBS。在防护帽(hood)中并且经由使用合适的放射性处理技术，将0.5mCi Na¹²⁵I(17.4Ci/mg,Lot 0114,Amersham)添加至具有碘珠的PBS溶液。容许组分于室温反应5分钟，然后将2-25μg高度纯的经截短的Cry蛋白添加至溶液，并容许再反应3-5分钟。通过将溶液除去碘珠，并将其应用于PBS中平衡的0.5ml脱盐Zeba旋转柱(InVitrogen)来终止反应。将碘珠各用10μl PBS清洗两次，并也将清洗溶液应用于脱盐柱。通过以1,000x g离心2分钟将放射性溶液洗脱通过脱盐柱。在Cry1Da的情况中，使用Iodo-gen法来进行放射性标记方法。使用此方法，首先将100mM磷酸盐缓冲液(pH 8)中的cry毒素清除脂多糖(LPS)，这通过将其多次通过小的0.5ml多粘菌素柱来进行。对iodo-gen管(PierceChem.Co.)添加20μg无LPS的Cry1Da毒素，然后是0.5mCi Na¹²⁵I。将反应混合物于25°C摇动15分钟。自管取出溶液，并添加50μl 0.2M非放射性标记的NaI以淬灭反应。用3次缓冲液交换针对PBS透析蛋白质以除去任何未结合的¹²⁵I。

通过SDS-PAGE、磷光成像(phosphorimaging)和gamma计数测定碘化的Cry蛋白的放射性纯度。简言之，通过SDS-PAGE分离2μl放射性蛋白质。分离后，使用BioRad凝胶干燥装置遵循制造商的用法说明书干燥凝胶。通过将干燥的凝胶在Mylar膜(厚12μm)中包裹，并将它们在Molecular Dynamics储存磷光体屏(storage phosphor screen)(35cm x 43cm)下暴露1小时来对它们成像。使用Molecular Dynamics Storm 820磷光成像仪(phosphorimager)显现板，并使用ImageQuant^TM软件分析图像。使用剃刀刀片自凝胶切出放射性条带以及刚刚在该条带上方和下方的区域，并在gamma计数器中计数。仅在Cry蛋白条带中及在条带下方的区域中检出放射性。在条带上方没有检出放射性，指示所有放射性污染物由比截短的Cry蛋白小的蛋白质组分组成。这些组分最有可能代表降解产物。

实施例2：BBMV制备方案

溶解的BBMV的制备和分级。将末龄草地夜蛾、玉米螟、或玉米夜蛾(Heleothis.Zea)幼虫禁食过夜，然后在早晨在冰上冷冻15分钟后解剖。自体腔取出中肠组织，留下附着于体壁的后肠。将中肠在9X体积的冰冷均质化缓冲液(300mM甘露醇、5mM EGTA、17mM tris.碱，pH7.5)(其补充有如供应商推荐的那样稀释的蛋白酶抑制剂混合物¹¹(Sigma-Aldrich P-2714))中放置。用玻璃组织匀浆器的15次撞击(stroke)将组织均质化。通过Wolfersberger(1993)的MgCl₂沉淀法制备BBMV。简言之，将300mM甘露醇中的等体积24mM MgCl₂溶液与中肠均浆混合，搅动5分钟，并容许在冰上竖立15分钟。将溶液于4°以2,500x g离心15分钟。将上清液保留，并将团粒悬浮到初始体积的0.5X稀释的均质化缓冲液中，并再次离心。将两种上清液组合，并于4°以27,000x g离心30分钟以形成BBMV级分。将团粒悬浮到10ml均质化(homogienization)缓冲液中，并补充蛋白酶抑制剂，并以27,000x g于4°C再离————————————

¹混合物组分的终浓度(以μM计)是AEBSF(500)、EDTA(250mM)、苯丁抑制素(Bestatin)(32)、E-64(0.35)、亮抑酶肽(Leupeptin)(0.25)和抑肽酶(0.075)。心30分钟以清洗BBMV。将所得的团粒以约3mg/mL蛋白质浓度悬浮到BBMV贮存缓冲液(10mM HEPES、130mM KCl、10%甘油，pH7.4)中。通过使用Bradford法(1976)用牛血清清蛋白(BSA)作为标准品测定蛋白质浓度。使用Sigma测定法遵循制造商的用法说明书在冷冻样品前进行碱性磷酸酶测定。BBMV级分中的此标志物酶的比活通常比存在于中肠均浆级分中的比活升高7倍。将BBMV等分取样到250μL样品中，在液氮中速冻，并于–80°贮存。

实施例3：测量¹²⁵I Cry蛋白结合BBMV蛋白的方法

¹²⁵I Cry蛋白对BBMV的结合。为了测定BBMV蛋白用于结合测定法的最佳量，产生饱和曲线。将¹²⁵I放射性标记的Cry蛋白(0.5nM)于28°C与多个量的BBMV蛋白(范围为在结合缓冲液(8mM NaHPO₄、2mM KH₂PO₄、150mMNaCl、0.1%牛血清清蛋白，pH 7.4)中的0-500μg/ml)一起温育1小时。总体积是0.5ml。通过将150μl反应混合物一式三份从1.5ml离心管取样到500μl离心管中，并以14,000x g将样品于室温离心6分钟来分开结合的¹²⁵I Cry蛋白与未结合的。温和地除去上清液，并且将团粒用冰冷的结合缓冲液温和清洗三次。切出含有团粒的离心管底部，并将其放入13x 75-mm玻璃培养管中。将样品各自在gamma计数器中计数5分钟。自背景计数(没有任何蛋白质的反应)扣除样品中含有的计数，并相对于BBMV蛋白质浓度绘图。使用的蛋白质的最佳浓度测定为0.15mg/ml BBMV蛋白。

为了测定结合动力学，产生饱和曲线。简言之，将BBMV(150μg/ml)于28°C与增加浓度的¹²⁵I Cry毒素(范围为0.01至10nM)一起温育1小时。通过一式三份取样150μl各个浓度，离心样品，并计数来测定总体结合，如上文所描述的。以相同的方式测定非特异性结合，其中对反应混合物添加1,000nM同源的经胰蛋白酶处理的非放射性Cry毒素以饱和所有非特异性受体结合位点。特异性结合以总体结合和非特异性结合间的差异计算。

使用150μg/ml BBMV蛋白和0.5nM¹²⁵I放射性标记的Cry蛋白进行同源和异源竞争结合测定法。对反应混合物添加的竞争性非放射性标记的Cry毒素的浓度在0.045至1,000nM的范围内，并且与放射性配体同时添加，以确保实际的结合竞争。于28°C实施温育1小时，并如上文所描述的，扣除非特异性结合测量与其受体毒素结合的¹²⁵I Cry蛋白的量。在没有任何竞争物配体的情况中测定100%总体结合。将结果在半对数图上以百分比总体同源性结合对添加的竞争性配体的浓度绘图。

实施例4：结果的汇总

图1显示了在来自FAW的BBMV中¹²⁵I Cry1Da(0.5nM)对未标记的同源Cry1Da(○)和异源Cry1Ca(■)的竞争的百分比特异性结合。Cry1Da的同源竞争的置换曲线产生s形(sigmoidal)形状的曲线，显示在约1.5nM Cry1Da的50%放射性配体置换。Cry1Ca在任何测试浓度(多至1,000nM，或用于测定法的¹²⁵ICry1Da浓度的2,000倍)都不置换¹²⁵I Cry1Da的特异性结合。

参考文献列表

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附录A

delta-内毒素的列表–来自Crickmore等网站(申请中引用)登录号是NCBI条目