CN106455513B

CN106455513B - 用于控制玉米穗虫的Cry1D

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Publication number: CN106455513B
Application number: CN201580026637.0A
Authority: CN
Inventors: S·Y·坦; J·J·希茨; T·格兰西; K·C·麦克劳克林; A·伍斯利; S·E·渥尔登; D·阿拉比德; S·波尔坦; K·E·纳瓦; T·米德
Original assignee: Agrigenetics Inc
Current assignee: Agrigenetics Inc
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2015-03-20
Publication date: 2020-09-22
Anticipated expiration: 2035-03-20
Also published as: MX363928B; AU2015231111B2; UY36040A; US20230049002A1; US20200277622A1; EP3119187A4; AP2016009488A0; RU2016141272A3; RU2016141272A; US20150264940A1; US10683517B2; EP3119187A1; PH12016501823A1; CN106455513A; MX2016012275A; TW201542093A; US20180163224A1; BR102015006253B1; CA2942669A1; US20240076687A1

Abstract

本发明部分地涉及令人惊讶的发现，即Cry1Da针对玉米穗虫(CEW)，谷实夜蛾(Boddie)有活性。描述了在转基因植物中使用Cry1Da以防止严重作物损害的方法。使用表达全长、核心毒素区或嵌合Cry1Da的转基因玉米的叶和须生物测定法证明了针对CEW幼虫损伤的良好的昆虫保护。

Description

用于控制玉米穗虫的Cry1D

交叉引用

本申请要求于2014年3月21日提交的美国临时申请No.61/968,703的权益。明确将其公开内容完整并入本文。

发明背景

Cry1Da是一种已知的δ-内毒素，由苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的某些种类生成，在美国专利5,691,308中首次记载。后来，两篇独立的同行评议的文章已经报告了针对玉米穗虫(CEW)无活性：Karim等人(2000)和Frankenhuyzen(2009)。因此，后面所述的令人惊讶和预料不到的观察结果直接反驳了上述文章的结果，并且清楚地显示当Cry1Da基因在植物中表达时，Cry1Da针对CEW幼虫具有良好的杀虫活性。

发明概述

本发明部分涉及令人惊奇的发现，即Cry1Da对玉米穗虫(CEW)，谷实夜蛾(Helicoverpa zea)(Boddie)有活性。使用表达Cry1Da的全长、截短和嵌合形式的转基因玉米的叶和须生物测定法证明了针对CEW幼虫损伤的良好的昆虫保护。另外令人惊讶的是，发现与生成Cry1Fa的商业植物相比，在表达截短的Cry1Da的转基因植物中对CEW幼虫进食玉米须的防护更为优越。

CEW是难以用苏云金杆菌(Bt)蛋白控制的昆虫害虫，本文是关于表达Cry1Da的转基因玉米显示保护玉米须免受由该种昆虫引起的进食损伤的生物活性的观察结果的首次描述。成年CEW蛾通常在玉米须上产卵，新发的幼虫在进入穗前以玉米须为食。因此，如果玉米须组织中具有昆虫保护活性，将针对这种重要的破坏性玉米害虫引起的进食损伤提供显著的保护效应。

附图简述

图1：用CEW幼虫攻击的未转化的玉米(B-104)、表达YFP的转基因玉米(109812)、Herculexl^TM玉米(HX1)、或表达全长Cry1Da(109840)或截短的Cry1Da(109841)的转基因T-1玉米的百分比叶损伤活性。

序列简述

SEQ ID NO：1是具有DIG-911编码序列(CDS)的DNA片段。

SEQ ID NO：2是DIG-911蛋白(Cry1Da2/Cry1Ab嵌合杀虫毒素)的氨基酸序列，其由Cry1Da的核心毒素区段(氨基酸1至594，如在GENBANK登录号176415.1和美国专利5,691,308中公开)和源自Cry1Ab的原毒素区段(DIG-911氨基酸595至1139，基本上如GENBANK登录号AFK79795.1中公开)组成。

SEQ ID NO：3是具有DIG-180编码序列(CDS)的DNA片段。

SEQ ID NO：4是DIG-180(Cry1Fa2)蛋白。

SEQ ID NO：5是

(INVITROGEN)入门载体pDAB109825，其包含编码Cry1Da2核心毒素杀虫蛋白(SEQ ID NO：6)的玉米优化的编码序列(SEQ ID NO：5)。

SEQ ID NO：6是Cry1Da2核心毒素杀虫蛋白。

SEQ ID NO：7是AAD-1的引物；见表2

SEQ ID NO：8是AAD-1的引物

SEQ ID NO：9是AAD-1的探针

SEQ ID NO：10是壮观霉素抗性基因的引物

SEQ ID NO：11是壮观霉素抗性基因的引物

SEQ ID NO：12是壮观霉素抗性基因的探针

SEQ ID NO：13是玉米转化酶基因的引物

SEQ ID NO：14是玉米转化酶基因的引物

SEQ ID NO：15是玉米转化酶基因的探针

发明详述

本发明部分涉及令人惊讶的发现，即Cry1Da对玉米穗虫幼虫(CEW)，谷实夜蛾(Boddie)有活性。来自体外食料生物测定法的生物测定结果显示Cry1Da/Cry1Ab原毒素嵌合体对CEW幼虫导致显著的生长抑制和死亡。Cry1Da杀虫蛋白或毒素是包含SEQ ID NO：6中所示的核心毒素或其变体的任何杀虫蛋白。此类变体与SEQ ID NO：6具有至少95％的序列同一性，优选与SEQ ID NO：6具有99％的序列同一性。

使用表达Cry1Da的截短形式的转基因玉米的叶和须生物测定法证明了针对CEW幼虫损伤的良好的昆虫防护。在表达截短的Cry1Da的转基因玉米植物和表达Cry1Fa的商业

I(HX1)产品两者中观察到相当的针对CEW进食的叶保护。

令人惊讶的发现是，在表达截短的Cry1Da的转基因植物中对CEW幼虫进食玉米须的防护与HX1植物相比是优越的。以来自表达截短的Cry1Da的转基因玉米的须组织为食的昆虫的死亡率(约25％)在数字上好于对以来自HX1植物的须组织为食的昆虫中观察到的死亡率(＜10％)。

CEW是难以用苏云金杆菌(Bt)蛋白控制的昆虫害虫，本文是关于表达Cry1Da的转基因玉米显示保护玉米须免受由该种昆虫引起的进食损伤的生物活性的观察结果的首次描述。成年CEW蛾通常在玉米须上产卵，新发的幼虫在进入穗前以玉米须为食。因此，因此，如果玉米须组织中具有昆虫保护活性，将针对这种重要的破坏性玉米害虫引起的进食损伤提供显著的保护效应。本发明的部署选项包括在地理区域中，包括存在CEW并且CEW成问题的大豆和玉米种植区中使用Cry1Da蛋白。

本文中呈现的数据证明，与

相比，Cry1Da是用于通过须组织控制CEW的优秀的蛋白质。如本文中使用，术语“控制”包括生长抑制和/或死亡率。

在本文中显示Cry1Da/Cry1Ab原毒素嵌合体在食料昆虫生物测定法中具有针对谷实夜蛾的杀虫活性。当Cry1Da的截短形式在转基因玉米中表达时，保护植物免受由CEW或秋粘虫(FAW)，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)引起的叶和须进食损伤。这些结果是令人惊讶的，因为先前报告Cry1Da对CEW不具有活性(Karim，2000)，并且仅对FAW有活性(VanFrankenhuyzen，2009)。Cry1Da杀虫蛋白是已知的；然而，本发明是Cry1Da用于预防CEW对植物，特别是作物植物的严重损伤的新颖且预料不到的用途。

谷实夜蛾幼虫具有杂食性进食习惯。它喜好以富含氮的生殖结构和生长组织(如玉米须，穗，穗轴和雄穗，棉铃和芽，以及大豆荚)为食。由于植物损伤直接影响作物产率，它是一种非常重要的昆虫(对作物是害虫)。Cry1Da能够用于除了玉米外的高价值作物，如棉和大豆，以及蔬菜如番茄中控制此种昆虫。

昆虫抗性管理(IRM)描述用于降低昆虫害虫对杀虫药发生抗性的潜力的农作实践。对于在主要作物植物中使用Cry毒素而言，IRM是非常重要的，因为昆虫抗性对转基因作物中的Cry毒素使用造成了许多威胁。特定的IRM策略，如高剂量和结构化避难所，可以减少昆虫对某些Cry毒素形成抗性的可能性。有效的IRM实践可以降低形成抗性的风险。

美国环境保护局在其网站(epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)上公布了下列提供避难所植物构成的要求，避难所不携带Cry毒素，与生成对靶害虫有活性的单一Cry毒素的转基因作物一起使用。

“玉米螟防护的Bt(Cry1Ab或Cry1F)玉米产品的特定结构化需要如下：

-结构化避难所：

玉米带中20％非鳞翅目Bt玉米避难所；

棉带中50％非鳞翅目Bt避难所

-区块

内部(即，在Bt田内)

外部(即，距Bt田1/2英里(若可能的话，1/4英里)内的不同田地以使随机杂交最大化)

-田内条(In-filed Strip)

条宽必须至少为4行(优选地6行)以减少幼虫运动的影响”

另外，美国国家玉米种植者协会(National Corn Growers Association)，在其网站上：(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)也提供了关于避难所要求的类似指导。例如：

“玉米螟IRM的要求：

-将你至少20％的玉米面积种植避难所杂种

-在棉花生产区中，避难所必须是50％

-必须种植在距避难所杂种1/2英里内

-避难所可以在Bt田内种植成条；避难条必须宽至少4行

-只有达到靶昆虫的经济阈值时才可以用常规的杀虫剂处理避难所

-不能对避难玉米使用基于Bt的可喷射杀虫剂

-每个种植有Bt玉米的农场必须种植合适的避难所”

提供避难所的IRM效果的方式有多种，包括田间的各种几何种植图样(如上文所提及的)和袋中种子混合物(in-bag seed mixtures)，如由Roush等(见上文)及美国专利No.6,551,962进一步讨论的。

昆虫毒素和昆虫活性变体。除了如本文中讨论的具体例示的基因和蛋白质外，包括杀虫活性变体。申请人意欲术语“变体”包括片段、某些缺失和插入突变体，以及某些融合蛋白。Cry1Da蛋白是经典的三结构域Cry毒素。在描述包括在本发明中的Cry1Da昆虫毒素的变体之前，可能有必要简要回顾一般的三结构域Cry毒素和Cry1Da昆虫毒素的构造。

大多数苏云金芽孢杆菌δ-内毒素晶体蛋白分子由两个功能区段组成。蛋白酶抗性核心毒素是第一区段，对应于蛋白质分子的大约第一个半部。完整的约130kDa原毒素分子通过昆虫肠道中的蛋白酶被快速加工为抗性核心区段。通过此处理而缺失的区段在本文中会称为“原毒素区段”。原毒素片段据信参与毒素晶体形成(Arvidson等人,(1989))。因此，原毒素区段可以通过减少毒素分子的蛋白酶加工(Haider等人,(1986)，或通过降低毒素溶解度(Aronson等人,(1991))限制核心对昆虫的可及性，从而传递昆虫对毒素的部分特异性。各种B.t.毒素(即使在某一类别内)的长度和从核心毒素部分转变为原毒素部分的精确位置均有一定程度的变化。从核心毒素部分到原毒素部分的转变通常会在全长毒素的约50％至约60％之间发生。

已经确定了Cry1Aa1，Cry2Aa1，Cry3Aa1，Cry3Bb1，Cry4Aa，Cry4Ba和Cry8Ea1的三维晶体结构。核心毒素的这些结构是显著相似的，并且由三个不同的结构域构成(在deMaagd等人，2003中综述)。

通过进行有限数目的氨基酸缺失、取代或添加创建的昆虫毒素变体。可以容易地对例示的氨基酸序列进行顺序的氨基酸缺失、取代和添加，并且可以通过生物测定法测试此类变异对杀虫活性的影响。只要改变的次数是有限数目，此类测试不会涉及不合理的实验。本发明包括核心毒素的杀虫活性变体，其中已经进行了最多达10个、最多达15个、或最多达20个氨基酸添加，缺失或取代。

包括Cry1Da杀虫活性变体，这些变体与例示的氨基酸序列至少95％，96％，97％，98％或99％相同(包括那些具有与例示的氨基酸序列至少95％，96％，97％，98％或99％相同的核心毒素区段者)。还包括与例示的序列具有至少90％，91％，92％，93％或94％同一性的相似的活性蛋白。

根据官方命名法，Cry和B.t.命名法基于约95％(例如Cry1Da)，78％(Cry1D)和45％(Cry1)序列同一性边界，按照“苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的命名法修订版(Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensisPesticidalCrystal Proteins)”N.Crickmore,D.R.Zeigler,J.Feitelson,E.Schnepf,J.Van Rie,D.Lereclus,J.Baum,and D.H.Dean.Microbiology and Molecular Biology Reviews(1998)Vol 62:807-813命名。

可以通过随机突变来制作变体，或者可以设计变体。在设计突变体的情况下，若在毒素的关键区域(关键区域负责生物活性，或参与确定三维构型并最终负责生物活性)中维持氨基酸同一性，则生成具有与天然毒素相似的活性的变体的几率较高。如果取代是保守的，保留活性的几率也较高。氨基酸可以归为以下类别：非极性、不带电荷的极性、碱性、和酸性。保守取代将某一类别的一种氨基酸替换为相同类型的另一种氨基酸，对该变体的生物活性造成实质改变的可能性最小。属于每个类别的氨基酸的实例见下表。

在一些情况下，也可以进行非保守取代。关键因素是这些取代必须不显著减损毒素的生物活性。变体包括由于诱变而在氨基酸序列上不同的多肽。本发明涵盖的变体蛋白质是生物活性的，即它们继续拥有天然蛋白质的所需生物活性，即保留杀虫活性。

也可以设计在序列水平上不同但保留相同或相似的整体关键三维结构、表面电荷分布等的变体蛋白。参见例如美国专利号7058515；Larson等人,(2002)；Stemmer(1994a,1994b,1995)；及Crameri等人,(1996a,1996b,1997)。

核酸编码Cry1Da昆虫毒素的分离的核酸是本发明的一个方面。这包括编码SEQ IDNO:2，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的核酸及其互补序列的核酸以及编码杀虫活性变体的其它核酸的主题新用途。通过“分离的”，申请人意图表明核酸分子已经从其天然环境中取出并且在人工作用下被置于不同的环境中。由于遗传密码的冗余性，本文中公开的氨基酸序列可以由多种不同的DNA序列来编码。创建这些编码相同或基本上相同的毒素的备选DNA序列在本领域技术人员的技能范围内。

本发明的编码序列可以可操作地连接到异源启动子，包括非B.t.启动子。此类序列可以包括在表达构建体、转化盒和表达盒中，包括例如在植物基因组中可重复地存在的那些表达构建体、转化盒和表达盒。

基因合成可以通过本领域公知的多种方法制备编码本文中描述的改进的Cry蛋白的基因。例如，可以通过亚磷酸三酯和亚磷酰胺化学制备合成基因区段和合成基因(Caruthers等人，1987)，商业供应商可以根据需要进行基因合成。全长基因可以以多种方式装配，包括例如通过限制性片段的连接或重叠寡核苷酸的聚合酶链反应装配(Stewart和Burgin，2005)。此外，可以通过使用位点特异性末端寡核苷酸的PCR扩增来造成末端基因缺失。

编码Cry1Da昆虫毒素的核酸可以，例如，通过任何目前若干商业供应商实施的方法合成构建来制备(参见例如美国专利号7482119B2)。这些基因或其部分或变体的合成构建也可以使用例如基因合成仪和例如美国专利号5380831的设计方法来进行。或者，合成基因或天然存在基因的变体可以使用用于生成点突变的标准分子生物学技术容易地构建。也可以使用商品化的外切核酸酶或内切核酸酶根据标准规程制备这些基因的片段。例如，可以使用诸如Bal31等酶或定点诱变系统地从这些基因的末端切除核苷酸。此外，可以使用多种限制酶获得编码活性毒素片段的基因片段。

在给定Cry1Da昆虫毒素的氨基酸序列的基础上，可以通过使用意图宿主优选的密码子对氨基酸序列反向翻译，然后使用备选密码子精修序列，以除去可能引起问题的序列并提供周期性终止密码子以消除非编码阅读框中的长开放编码序列，来设计编码序列。

序列同一性的定量为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，为了最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置的数目(即同一性百分比＝相同位置的数目/位置的总数目(例如重叠位置)x 100)的函数。在一个实施方案中，两个序列长度相同。可以使用与下文描述的技术类似的技术确定两个序列之间的百分比同一性，允许或不允许空位。在计算同一性百分比中，通常计算精确匹配。

两个序列之间的同一性百分比的测定可以使用数学算法来完成。此类算法的非限制性实例是Altschul等人(1990)，以及Karlin和Altschul(1990)，如Karlin和Altschul(1993)中所述进行了修改，并且纳入BLASTN和BLASTX程序中。BLAST搜索可以用于方便地鉴定与核酸或蛋白质数据库中的查询序列同源(相似)的序列。可以进行BLASTN搜索(评分＝100，字长＝12)鉴定与本发明所要求保护的核酸分子具有同源性的核苷酸序列。可以进行BLASTX搜索(评分＝50，字长＝3)鉴定与本发明所要求保护的杀虫蛋白分子具有同源性的氨基酸序列。

可以利用空位BLAST Altschul等人(1997)获得用于比较目的的空位比对。或者，可以使用PSI-Blast进行检测分子之间的远距离关系的迭代搜索Altschul等人(1997)。当利用BLAST，空位BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序的缺省参数。见www.ncbi.nlm.nih.gov。

用于比较序列的数学算法的非限制性实例是ClustalW算法(Thompson等,1994)。ClustalW比较序列并比对整个氨基酸或DNA序列，并因此可提供有关整个氨基酸序列或核苷酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法在多个可商购DNA/氨基酸分析软件包中使用，诸如Vector NTI Program Suite(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)的ALIGNX模块。当用ALIGNX比对氨基酸序列时，可方便地使用缺省设置，即10的空位开放罚分、0.1空位延伸罚分以及blosum63mt2比较矩阵，从而评估两个序列间的百分比氨基酸类似性(一致性)或同一性。当使用ALIGNX比对DNA序列时，可方便地使用缺省设置，即15的空位开放罚分、6.6的空位延伸罚分以及swgapdnamt比较矩阵，以评估两个序列间的百分比同一性。

用于比较序列的数学算法的另一非限制性实例是Myers和Miller(1988)的算法。该算法已整合至wSTRETCHER程序中，所述程序是wEMBOSS序列比对软件包(可在http://emboss.sourceforge.net/中获得)的一部分。wSTRETCHER应用标准动态规划算法(其使用线性空间)的修正版计算两个序列的最佳全局比对。用于计算比对的取代矩阵、空位插入罚分和空位延伸罚分可以具体指定。当使用wSTRETCHER比较核苷酸序列时，可与打分矩阵文件EDNAFULL一起使用16的空位开放罚分和4的空位延伸罚分。当用于比较氨基酸序列时，可与EBLOSUM62一起使用12的空位开放罚分和2的空位延伸罚分。

用于比较序列的数学算法的其它非限制性实例是Needleman和Wunsch(1970)的算法，其整合至序列比对软件包GAP版本10和wNEEDLE(http://emboss.sourceforge.net/)中。GAP版本10可应用以下参数从而用于确定序列同一性或相似性：对于核苷酸序列，应用50的空位权重(GAP Weight)和3的长度权重(Length Weight)，以及nwsgapdna.cmp打分矩阵，建立％同一性和％相似性。对于氨基酸序列比较，应用8的空位权重和2的长度权重，以及BLOSUM62打分矩阵，建立％同一性或％相似性。

wNEEDLE读取两个输入序列，在它们的全长上找出最佳比对(包括空位)，并在文件中写入它们的最佳全局序列比对。该算法应用含有每一种可能的残基或核苷酸匹配的值的打分矩阵，探索所有可能的比对并选择最佳的。wNEEDLE寻找具有最大可能得分的比对，其中比对的得分等于获自打分矩阵的匹配总分减去从比对序列中的开放和延伸空位产生的罚分。取代矩阵和空位开放及延伸罚分是用户指定的。当比较氨基酸序列时，使用10的缺省空位开放罚分、0.5的空位延伸罚分以及EBLOSUM62比较矩阵。当应用wNEEDLE比较DNA序列时，使用10的缺省空位开放罚分、0.5的空位延伸罚分以及EDNAFULL比较矩阵。

也可使用等价的程序。“等价程序”预期了任何的序列比较程序，其中对于任何讨论的两个序列，所述程序产生这样的比对，即当与由ALIGNX、wNEEDLE或wSTRETCHER产生的相应比对相比较时，所述比对具有同一的核苷酸或氨基酸残基匹配及同一的百分比序列同一性。所述％同一性是两个序列间同一的匹配除以报告的比对区(包括长度上的任何空位)的百分比，以及％相似性是两个序列间的匹配除以报告的比对区(包括长度上的任何空位)的百分比。

也可通过检视手工地进行比对。

重组宿主可以将本发明的昆虫毒素编码基因导入多种微生物或植物宿主中。毒素基因的表达直接或间接导致杀虫蛋白质的细胞内产生和保持。应用合适的微生物宿主，例如假单胞菌属(Pseudomonas)，可将微生物施用于害虫的环境中，微生物可以在那里增殖，并且被摄食。结果是害虫的控制。备选地，可以在延长毒素的活性和稳定细胞的条件下处理含有昆虫毒素基因的微生物。所处理的细胞保留毒性活性，然后可以应用于目标害虫的环境。来自本主题发明的非可再生性/非全能性植物细胞(包含至少一种主题的Cry毒素基因)包括在本主题基因之内。

当通过合适的载体将B.t.毒素基因导入微生物宿主，并且将所述宿主以活的状态应用于环境时，使用某些宿主微生物是必须的。选择已知占据一种或多种目的作物的“植物圈”(叶面、叶圈、根际和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境(作物和其他昆虫栖息地)与野生型本土微生物成功地竞争，提供表达多肽杀虫剂的基因的稳定保持和表达，以及如希望的那样，改进保护杀虫剂免于环境降解和失活。

已知多种微生物栖息在多种重要作物的叶面(植物叶子的表面)和/或根际(植物根周围的土壤)。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。尤其重要的是微生物，诸如细菌，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌(Acetobacter)、乳杆菌(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)、和产碱菌属(Alcaligenes)；真菌，尤其是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、和短梗霉属(Aureobasidium)。尤其重要的诸如以下的植物圈细菌种：丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)(以前为Rhizobium meliloti)、真养产碱菌(Alcaligenes entrophus)、和棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)；以及诸如以下的植物圈酵母种：深红酵母(Rhodotorularubra)、红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、变黄罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、佛地克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)、和出芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。还重要的是着色的微生物。

控制害虫的方法

当昆虫接触通过转基因植物表达、配制的蛋白质组合物、可喷雾的蛋白质组合物、诱饵基质或者其他递送系统递送的有效量的毒素时，结果通常是昆虫死亡，或昆虫不再进食使得昆虫可获得所述蛋白质的来源。

可以多种方式“施与”或提供主题蛋白质毒素与靶标昆虫接触。例如，可使用转基因植物(其中蛋白质由该植物表达，并存在于其中)，并且其为本领域公知的。还可实现毒素基因在植物特定组织中的选择性表达，诸如根、叶等。这例如可通过使用组织特异性启动子而实现。喷涂使用是另一实例，也是本领域公知的。可合适地配制该主题蛋白质用于预期的终端用途，并且然后喷雾(或以其它方式施与)至植物和/或植物周围/至待保护的植物附近——在发现侵染之前、发现靶标昆虫之后、之前及之后等。例如，还可使用诱饵颗粒，其也是本领域公知的。

转基因植物

该主题蛋白质可用于实际地保护任何类型的植物免遭昆虫害虫的损害。此类植物的实例包括玉米、向日葵、大豆、棉花、芸苔、稻、高粱、小麦、大麦、植物、观赏植物、胡椒(包括辣椒)、糖甜菜、果树以及草皮，仅略举数例。转化植物的方法是本领域公知的，并且在实施例中描述了示范性的转化方法。

本发明优选的实施方案是用编码该主题杀虫蛋白质或其变体的基因转化植物。经转化的植物由于在该转化植物的细胞中存在控制量的该主题杀虫蛋白或其变体，因此能耐受昆虫靶标害虫的攻击。通过将编码B.t.杀虫毒素杀虫特征的遗传材料整合至特定害虫摄食的植物的基因组中，成虫或幼虫在消费该食物植物后将死亡。已转化了大量的单子叶和双子叶植物。转基因农作物以及果树和蔬菜是商业上感兴趣的。此类作物包括但不限于玉米、稻、大豆、芸苔、向日葵、紫花苜蓿、高粱、小麦、棉花、花生、番茄、马铃薯等。存在多种将外源遗传材料导入植物细胞，以及获得稳定保持并表达该引入的基因的技术。此类技术包括将包被在微粒上的遗传物质直接导入细胞中(美国专利号4945050和美国专利号5141131)。可以使用土壤杆菌技术转化植物，参见美国专利号5177010、美国专利号5104310、欧洲专利申请号0131624B1、欧洲专利申请号120516、欧洲专利申请号159418B1、欧洲专利申请号176112、美国专利号5149645、美国专利号5469976、美国专利号5464763、美国专利号4940838、美国专利号4693976、欧洲专利申请号116718、欧洲专利申请号290799、欧洲专利申请号320500、欧洲专利申请号604662、欧洲专利申请号627752、欧洲专利申请号0267159、欧洲专利申请号0292435、美国专利号5231019、美国专利号5463174、美国专利号4762785、美国专利号5004863以及美国专利号5159135。其他转化技术包括WHISKERS^TM技术，参见美国专利号5302523和美国专利号5464765。电穿孔技术已经用于转化植物，参见WO87/06614、美国专利号5472869、美国专利号5384253、WO 9209696和WO 9321335。所有这些转化专利和公开均通过引用并入。除了多种用于转化植物的技术之外，与外源基因接触的组织类型也可以不同。此类组织将包括但不限于胚胎组织、I型和II型愈伤组织、胚轴、分生组织等。应用本领域技术人员范围内的合适技术，几乎所有植物组织均可在分化期间转化。

编码Cry1Da杀虫毒素的基因可应用各种如上公开的本领域公知的技术插入植物细胞中。例如，包含在大肠杆菌中起作用的允许对转化微生物细胞进行选择的标记物和复制系统的大量克隆载体可用于制备和修饰用于插入到高等植物中的外来基因。此类操作可包括例如，插入突变、截短、添加或取代，如预期用途所期望的那样。该载体例如包括pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，可以将编码Cry蛋白或其变体的序列插入到载体的适当限制性位点。所得到的质粒用于转化入大肠杆菌细胞，将得到的细胞在适当的营养培养基中进行培养，然后收获并裂解，回收可工作量的质粒。通常实施序列分析、限制性分析、电泳和其他生物化学-分子生物学方法作为分析的方法。每一次操作之后，切割所使用的DNA序列并且连接到下一个DNA序列中。可以将每一个操作的DNA序列克隆到相同的或者其他的质粒中。

对于含T-DNA的载体用于转化植物细胞的用途已经得以广泛研究并在欧洲专利申请号120 516；Lee和Gelvin(2008)；Fraley等(1986)以及An等(1985)中得以充分地叙述。

一旦插入的DNA被整合进入基因组，则它在随后的世代中是相对稳定的。用于转化植物细胞的载体通常含有编码赋予转化的植物细胞抗除草剂或者抗生素的蛋白质的可选择标记基因，诸如尤其是双丙膦、G418、博来霉素或潮霉素。单个应用的可选择标记基因因此应当允许选择转化了的细胞，同时通过选择化合物抑制不含插入DNA的细胞的生长。

大量的技术可用于将DNA插入到宿主植物细胞中。这些技术包括通过作为转化剂的根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌递送，用T-DNA转化。此外，也可使用植物原生质体与含有待递送DNA的脂质体的融合、直接注射DNA、基因枪转化(微粒轰击)或电穿孔，以及其他可能的方法。

在本发明优选的实施方案中，用其中针对植物优化了蛋白质编码区域的密码子选择的基因转化植物。例如参见美国专利号5380831，其在此通过引用并入。而且，有利地使用编码截短毒素的植物。截短的毒素通常编码全长毒素的约55％至约80％。产生用于植物中的合成B.t.基因的方法是本领域公知的(Stewart,2007)。

无论转化技术如何，优选将该基因掺入通过在载体中包含植物启动子从而适于在植物中表达B.t杀虫毒素基因和变体的基因转化载体中。除了植物启动子之外，可在植物细胞中有效地使用来自各种来源的启动子以表达外源基因。例如，可使用细菌来源的启动子，诸如章鱼氨酸合酶启动子、胭脂氨酸合酶启动子以及甘露碱合酶启动子。可使用病毒来源的启动子，例如，花椰菜花叶病毒35S和19S启动子、来自木薯叶脉花叶病毒的启动子等。植物启动子包括但不限于核酮糖-1,6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)、β-伴大豆球蛋白质(conglycinin)启动子、菜豆蛋白启动子、ADH(醇脱氢酶)启动子、热休克启动子、ADF(肌动蛋白解聚因子)启动子、遍在蛋白启动子、肌动蛋白启动子和组织特异性启动子。启动子还可含有可改善转录效率的某些增强子序列元件。典型的增强子包括但不限于ADH1-内含子1和ADH1-内含子6。可使用组成型启动子。组成型启动子在几乎所有的细胞类型并且在几乎所有的时间引导持续的基因表达(例如，肌动蛋白、遍在蛋白、CaMV 35S)。组织特异性启动子负责特定细胞或组织类型中的基因表达，诸如叶子或种子(例如，玉米醇蛋白、油质蛋白、油菜籽蛋白、ACP(酰基载体蛋白)启动子)，也可使用这些启动子。也可使用在植物发育的某些阶段活化，以及在特定植物组织及器官中活化的启动子。此类启动子的实例包括但不限于根特异性、花粉特异性、胚特异性、玉米穗丝特异性、棉纤维特异性、种子胚乳特异性、韧皮部特异性的启动子。

在某些环境下，期望使用可诱导的启动子。可诱导启动子负责响应特定信号而表达，诸如：物理刺激(例如，热休克基因)；光(例如，RUBP羧化酶)；激素(例如，糖皮质激素)；抗生素(例如，四环素)；代谢物；以及胁迫(例如，干旱)。可使用在植物中起作用的其他期望的转录和翻译元件，诸如5’非翻译引导序列、RNA转录终止序列和聚腺苷酸附加信号序列。多种植物特异性基因转运载体是本领域公知的。

含有抗虫性(IR)性状的转基因作物在北美的玉米和棉花植物中是很流行的，并且这些性状的使用正在全球扩张。已由多个种子公司开发了合并有IR和抗除草剂(HT)性状的商业转基因作物。这些包括由B.t.杀虫蛋白赋予的IR性状和HT性状的组合，所述HT性状诸如是抗乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂，诸如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑嘧啶、sulfonanilides等；谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂，诸如双丙磷(bialaphos)、草铵膦等；4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)抑制剂，诸如米斯通除草剂(mesotrione)、isoxaflutole等；5烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂，诸如草甘膦等，以及乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂，诸如盖草能(haloxyfop)、喹禾灵(quizalofop)、禾草灵(diclofop)等。其他的实例是已知的，其中转基因提供的蛋白质给植物提供了对除草剂化学类的抗性，诸如卤代苯氧酸除草剂和吡啶基氧醋酸酯植物生长素除草剂(参见WO 2007/053482 A2)，或卤代苯氧酸除草剂和芳氧基苯氧基丙酸酯除草剂(参见WO 2005107437 A2,A3)。通过IR性状控制多种害虫问题的能力是有价值的商业产品概念，而且如果在相同的植物中合并昆虫控制性状和杂草控制性状，则增强了这一产品概念的便利性。此外，通过以下性状的单植物组合，可获得改良的价值：由B.t.杀虫蛋白赋予的IR性状，诸如本发明的那些；一种或多种附加的HT性状，诸如上面提及的那些；加上一种或多种额外的输入性状(例如，由B.t.衍生的或其他杀虫蛋白赋予的其他昆虫抗性，由诸如RNAi等机制赋予的昆虫抗性，疾病抗性，胁迫耐受性，改进的氮利用等)，或输出性状(例如，高油含量、健康油组成、营养改良等)。此类组合可通过常规育种(育种堆)或涉及同时导入多个基因的转化事件的结合(分子堆)而获得。有益性包括在作物植物中提供管理害虫的能力和经改进的杂草控制能力，其中所述作物植物还给生产者和/或消费者提供第二有益性。因此，本发明可与其他性状组合使用，从而提供改进的作物品质的完整农学包，具有灵活且成本有效地控制任意数量的农学问题的能力。本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和出版物通过提及以它们与本说明书的明确教导无不一致的程度完整收录。

如本文中所使用的，除非明确指示或暗示，术语“一个”、“一种”、和“该/所述”表示“至少一个/种”。

以下是例示用于实施本发明的规程的实施例。这些实施例不应解释为限制性的。除非另有记录，所有百分比是按重量计，而所有溶剂混合物比例是按体积计。所有温度以摄氏度计。

实施例1

构建编码DIG-911和DIG-180的质粒，并在细菌宿主中表达

DIG-911蛋白(Cry1Da2/Cry1Ab嵌合杀虫毒素；SEQ ID NO:2)由Cry1Da的核心毒素区段(氨基酸1至594，如在GENBANK登录号176415.1和美国专利号5,691,308中公开)和源自Cry1Ab的原毒素区段(DIG-911氨基酸595至1139，基本上如GENBANK登录号AFK79795.1中所公开)组成。Cry1Da核心毒素区段与其它Cry或Vip杀虫毒素组合使用先前已经公开于美国专利申请公开号20130007923，20120331590，20120331589和20120317681中，但是没有设想使用Cry1Da杀虫蛋白质控制玉米穗虫(CEW；谷实夜蛾(Boddie))。

除非另有指示，本实施例和后续实施例中描述的分子生物学和生物化学操作均按照标准方法实施，如例如Sambrook等编(1989及更新,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,N.Y.),Ausubel等编(1995及更新,Current Protocols in Molecular Biology.Greene Publishing andWiley-Interscience,New York)和Harlow&Lane编(1988及更新,Antibodies:ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,NY)公开的。生成DIG-911和DIG-180(即Cry1Fa2；SEQ ID NO:4)蛋白的工程化荧光假单胞菌(Pf)表达质粒的构建中使用标准克隆方法。使用NUCLEOSPIN PLASMIDKIT(MACHEREY-NAGEL Inc,Bethlehem,PA)，遵循供应商的低拷贝质粒分离用法说明实施质粒制备。

基本克隆策略需要将具有DIG-911或DIG-180编码序列(CDS)(分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3提供)的DNA片段亚克隆到pDOW1169中的SpeI或XbaI，和XhoI或SalI限制性位点处，从而将DIG-911和DIG-180CDS置于来自质粒pKK223-3(PL PHARMACIA,Milwaukee,WI)的Ptac启动子和rrnBT1T2终止子的表达控制下。pDOW1169是一种中等拷贝数质粒，具有RSF1010复制起点和pyrF基因(美国专利号7,618,799)。可以将包含蛋白质编码区序列的DNA片段克隆到pDOW1169DNA中核糖体结合位点下游(在pDOW1169序列内)的限制性位点处，或者备选地，可以导入单独的核糖体结合位点作为存在于蛋白质编码区上游的编码区片段上的序列。通过电穿孔将表达质粒pDOW2848(DIG-911)的DNA转化入DC454细胞(具有ΔpyrF突变和lsc::lacIQI的近野生型荧光假单胞菌菌株)中，并将pDAB1817DNA(DIG-180)转化入MB214细胞)。将转化的细胞回收在SOC-大豆水解产物培养基中，然后涂布在选择培养基上(缺少尿嘧啶的M9葡萄糖琼脂、或含有适当浓度的四环素的LB培养基；Sambrook等人，同上)。关于对荧光假单胞菌的微生物操作的详情可参见Squires等人(2004)，美国专利号7,985,564，美国专利号7,681,799和美国专利申请号20080058262(通过提及并入本文)。通过小提质粒DNA的限制性消化鉴定重组菌落。

在摇瓶中的生长和表达分析.通过摇瓶培养荧光假单胞菌菌株DPf150(含有质粒pDOW2848)或菌株Dpf129(含有质粒pDAB1817)产生用于表征和昆虫生物测定的DIG-911和DIG-180蛋白。在补充有1％葡萄糖和微量元素的M9培养基中培养种子培养物，使用该种子培养物接种50mL具有5％甘油的限定基本培养基(TEKNOVA Cat.#3D7426,Hollister,CA)。在30°震摇下初始温育24小时后，添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以诱导DIG-911或DIG-180基因在Ptac启动子下的表达。在诱导时和诱导后各个时间时对培养物取样。用600nm下的光密度(OD₆₀₀)为单位测量细胞密度。也可以利用其它适合于荧光假单胞菌生长的培养基，例如如记载于Huang等人(2007，Prot。

摇瓶样品的细胞分级和SDS-PAGE分析。在每个取样时间，将2mL的等份试样以14000x g离心5分钟，细胞离心沉淀贮存在-80°。对于蛋白质提取，将离心沉淀融化悬浮在0.5mL磷酸盐缓冲液pH7.2中。通过超声处理裂解细胞，超声处理使用BRANSON 250SONIFIER(BRANSON ULTRASONICS,Danbury CT)，使用1/8英寸直径的微尖端，恒定输出20个单位。45秒爆击两次，两次爆击之间将样品在冰上冷却几分钟。通过在微量离心机中以14,000rpm离心5分钟将裂解物分级后，除去上清液(可溶性级分)，并且将离心沉淀悬浮于0.5ml磷酸盐缓冲液(不溶性级分)中。

将样品与含有β-巯基乙醇的4X Laemmli样品缓冲液(Sambrook等人，同上)以1:3混合，并且煮沸5分钟，之后上样到

4-20％Tris甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶(INVITROGEN,Carlsbad,CA)。在Tris甘氨酸

运行缓冲液(INVITROGEN)中实施电泳。根据制造商(BIO-RAD Inc.,Hercules,CA)方案用BIO-SAFE考马斯染色剂将凝胶染色。

包含体制备。对生成不溶性B.t.杀虫蛋白的来自荧光假单胞菌发酵的细胞实施Cry蛋白包含体(IB)制备，不溶性B.t.杀虫蛋白的生成通过SDS-PAGE和MALDI-MS(基质辅助激光解吸/电离质谱术)证明。在37°水浴中融化荧光假单胞菌发酵离心沉淀。将细胞在裂解缓冲液(50mM Tris，pH 7.5，200mM NaCl，20mM EDTA二钠盐(乙二胺四乙酸)，1％Triton X-100和5mM二硫苏糖醇(DTT)中重悬至25％w/v；在即将使用前添加5mL/L细菌蛋白酶抑制剂混合物(P8465SIGMA-ALDRICH,St.Louis,MO)。使用设置到最低档的手持式匀浆器(TISSUETEAROR^TM,BIOSPECPRODUCTS,Inc.,Bartlesville,OK)获得彻底的悬浮液。用金属刮刀搅拌将溶菌酶(25mg SIGMAL7651，来自鸡卵白)添加至细胞悬浮液，并且在室温将悬浮液温育1小时。在冰上将悬浮液冷却15分钟，然后使用BRANSON 250 SONIFIER超声处理(两个1分钟时段，50％工作循环，30％输出)。通过显微术检查细胞裂解。若必要的话，再添加25mg溶菌酶，并且重复温育和超声处理。当通过显微术确认细胞裂解时，以11,500xg将裂解物离心25分钟(4°)以形成IB离心沉淀，并且弃去上清液。用100mL裂解缓冲液重悬IB离心沉淀，如上文用手持式混合器匀浆化并离心。通过重悬(在50mL裂解缓冲液中)、匀浆化、超声处理和离心来重复清洗IB离心沉淀，直到上清液变为无色并且IB离心沉淀变得坚固并且颜色为灰白色。对于最终清洗，在含有2mM EDTA的无菌过滤(0.22μm)蒸馏水中重悬IB离心沉淀，并且离心。在无菌中重悬最终离心沉淀。

包含体的溶解。将来自Pf分离株DPF150或Dpf129(含有约30mg/mL的DIG-911或DIG-180蛋白)的6mL包含体悬浮液在微量离心机(约14,000xg)的最高当设置下离心，以沉淀包含体。在50mL锥形管中除去贮存缓冲液上清，并用25mL 100mM碳酸钠缓冲液(pH11)替换。使用移液管将包含物重悬，并涡旋振荡以彻底混合。于4°将管置于轻柔摇动的平台上过夜以提取靶蛋白。将提取物在4℃以30,000xg离心30分钟，并且使用AMICON ULTRA-15再生纤维素离心滤器装置(30,000分子量截留；MILLIPORE)将所得上清液浓缩5倍。然后，使用一次性PD-10柱(GE HEALTHCARE,Piscataway,NJ)将样品缓冲液变为10mM CAPS(3-(环己氨基)-1-丙磺酸)pH10。

IB制备物中蛋白质的SDS-PAGE分析和定量如下进行：融化1mL等份试样的IB离心沉淀，用无菌过滤的蒸馏水以1:20稀释。然后，将稀释的样品用4X还原样品缓冲液(250mMTris，pH6.8，40％甘油(v/v)，0.4％溴酚蓝(w/v)，8％SDS(w/v)和8％β-巯基乙醇(v/v))煮沸，并上样到用1X Tris/甘氨酸/SDS缓冲液(Bio-Rad)运行的

4-20％Tris-甘氨酸，12+2孔凝胶(INVITROGEN)上。在200伏特运行凝胶约60分钟，然后用考马斯蓝(45％甲醇，10％乙酸中的50％G-250/50％R-250)染色，并用含7％乙酸、5％甲醇的蒸馏水脱色。在相同凝胶上运行牛血清清蛋白(BSA)样品产生标准曲线，通过将条带的密度计值与这些样品比较，来进行靶标条带的量化。将浓缩的提取物在含有5mM二硫苏糖醇(作为还原剂)的

LDS样品缓冲液(INVITROGEN)中以1:50稀释，并在95°加热4分钟，以准备电泳。将样品一式两道加载在4-12％

凝胶中，一并添加范围为0.2至2μg/道的5个BSA标准品(用于生成标准曲线生成)。使用MOPS SDS运行缓冲液(INVITROGEN)，施加200V电压，直到追踪染料到达凝胶底部。用在45％甲醇、10％乙酸中的0.2％考马斯蓝G-250染色凝胶，然后先用45％甲醇、10％乙酸短暂脱色，再用7％乙酸、5％甲醇脱色，直到背景消除。脱色后，用BIO-RAD FLUOR-S MULTIIMAGER扫描凝胶。使用仪器自带的QUANTITY ONE v.4.5.2软件获得染色蛋白质条带的背景扣除的体积，并且生成BSA标准曲线，用于计算储备溶液中的DIG-911或DIG-180蛋白质的浓度。

实施例2

荧光假单胞菌中生成的DIG-911和DIG-180杀虫毒素针对CEW幼虫的活性

样品制备和生物测定法.将10mM CAPS pH10中的包含体制备物用相同的缓冲液稀释，以产生3,000、1,000、333.3、111.1、37.0、12.3或4.1ng/cm²靶Cry1Da蛋白的剂量。所有生物测定法均含有由10mM CAPS pH10缓冲液或水构成的对照处理，充当死亡率或生长抑制的背景检查。

通过凝胶电泳估计生物测定缓冲液中的蛋白质浓度，凝胶电泳使用BSA创建凝胶密度计量用的标准曲线，凝胶密度计量使用BIORAD成像系统(具有QUANTITY ONE软件版本4.5.2的FLUOR-S MULTIIMAGER)来测量。用基于考马斯蓝的染料染色凝胶基质中的蛋白质，然后脱色，之后读出。

从养虫服务商(BENZON RESEARCH INC.,Carlisle,PA)维持的群落获得卵，从卵孵化CEW的幼虫。在特别为昆虫生物测定法设计的128孔塑料盘(C-D INTERNATIONAL,Pitman,NJ)中进行生物测定法。每孔含有1.5mL多物种鳞翅目食料(SOUTHLAND PRODUCTS,LakeVillage,AR)。用移液管将40μL蛋白质样品等分试样加到每个孔的1.5cm²食料表面(26.7μL/cm²)上。食料浓度作为孔中每平方厘米(cm²)表面积的杀虫毒素蛋白的量(ng)计算。将处理的盘保持在通风橱中，直到食料表面上的液体已经蒸发或吸收到食料中。

在24至48小时孵化过程中，用湿润的骆驼毛刷挑出个别的幼虫，放置在经处理的食料上，每个孔放一只幼虫。然后，用透明的粘性塑料片密封带虫的孔，通气以允许气体交换(C-D INTERNATIONAL)。将生物测定盘在受控环境条件(28°，约60％相对湿度，16:8(光照:黑暗))下保持5天，之后记录暴露于每种蛋白质样品的昆虫总数、活昆虫和死亡昆虫的数目，以及存活昆虫的重量。对每种处理计算死亡百分比和百分比生长抑制。生长抑制(GI)计算如下：

GI＝[1–(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]

其中TWIT是处理中的昆虫的总重量，

TNIT是处理中的昆虫总数

TWIBC是背景检查中的昆虫总重量(缓冲液对照)，和

TNIBC是背景检查中的昆虫总数(缓冲液对照)。

通过名义逻辑回归(nominal logistic regression)分析死亡和生长抑制数据(P<0.05)。确定GI₅₀为GI值为50％时食料中杀虫毒素蛋白的浓度，并且记录LC₅₀(50％致死浓度)为50％的测试昆虫被杀死时食料中杀虫毒素蛋白的浓度。统计分析(单因素ANOVA)使用

Pro软件(版本9.0.3；SAS,Cary,NC)完成。表1显示了食料生物测定法中测量的DIG-911和DIG-180蛋白的活性。

表1

DIG-911和Cry1Fa蛋白在食料生物测定法中针对玉米穗虫(CEW)的新生幼虫的活性。

*＝置信区间

表1的数据记录了一个令人惊讶的发现，即包含Cry1Da核心毒素区段的DIG-911蛋白展现出针对玉米穗虫(CEW)幼虫的死亡和生长抑制活性。此结果与其他人报告的Cry1Da蛋白对玉米穗虫无活性的结果(参见Karim等人(2000)Pesticide Biochemistry andPhysiology 67(3):198-216；及Frankenhuyzen(2009)Journal of InvertebratePathology.101:1-16)形成了对比。

实施例3

植物转化载体的构建

通过标准分子克隆方法构建

(INVITROGEN)入门载体。入门载体pDAB109825包含一段玉米优化的编码序列(SEQ ID NO:5)，其编码Cry1Da2核心毒素杀虫蛋白(SEQ ID NO:6)。入门载体pDAB109840包含一段玉米优化的编码序列，其编码Cry1Da2全长杀虫蛋白。Cry1Da2核心毒素编码序列的植物表达在具有相关内含子1的玉米泛素1启动子一个拷贝的控制之下(美国专利号5,510,474)。Cry1Da2 mRNA的转录使用包含来自玉米过氧化物酶5基因的3'UTR(ZmPer5 3'UTR；美国专利号6,699,984)的片段来终止。采用典型的目的地二元载体(pDAB109805)和上文描述的入门载体pDAB109825，使用标准克隆方法实施

重组反应，构建了用于土壤杆菌介导玉米胚转化的转化/表达载体(pDAB109841)。上述二元目的地载体pDAB109805包含AAD-1除草剂耐受性蛋白质编码区，其表达处于1个拷贝的甘蔗杆状病毒启动子(SCBV；大体如美国专利号6,093,569中所述)的控制之下(美国专利号7,838,733和Wright等人(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:20240-20245)。SCBV启动子区段的3'端与AAD-1编码区的起始密码子之间有一合成的5'UTR序列，由来自玉米条纹病毒(MSV)壳体蛋白基因5'UTR和来自玉米醇脱氢酶1(ADH1)基因的内含子6的序列构成。使用包含来自玉米脂肪酶基因的3'UTR的片段(如上文)终止AAD-1mRNA的转录。

阴性对照二元载体(pDAB101556)包含：一个拷贝的具有内含子1的玉米泛素1启动子(如上文)、一个包含来自玉米过氧化物酶5基因的3'UTR(ZmPer53'UTR；美国专利号6,699,984)的片段、以及处于上述二者的表达控制下的黄色荧光蛋白(YFP)标志物基因编码区(Shagin等人(2004)Molecular Biology and Evolution 21:841-850)。pDAB101556还包含一个AAD-1除草剂耐受性蛋白质编码区(如上文)，其处于第二个拷贝的具有内含子1的玉米泛素1启动子(如上文)和来自玉米脂肪酶基因的3'UTR(如上文)的表达控制下。

实施例4

土壤杆菌介导的玉米转化

使用土壤杆菌介导的转化将Cry1Da2核心毒素编码区稳定整合到植物基因组中，由此生成这样的转基因玉米细胞，组织和植物，所述细胞、组织和植物生成全长或截短的Cry1Da2杀虫蛋白。采用超二元或二元转化载体的玉米转化方法是本领域中已知的，如记载于例如国际PCT公开号WO2010/120452中。经转化的组织基于在含有R-吡氟氯禾灵的培养基上生长的能力而被选择。

土壤杆菌培养启动.项目载体的甘油原液在根癌土壤杆菌宿主菌株DAt13192(WO2012/016222A2)中提供。从甘油原液将土壤杆菌培养物划线到AB基本培养基(Watson等人,(1975)J.Bacteriology 123:255-264)上，并在20℃在黑暗中温育3天，含有适当的抗生素。然后，将培养物划线到到含有抗生素的YEP培养基(gm/L：酵母提取物，10；蛋白胨，10；NaCl，5)板上，并且在20℃黑暗中温育1-3天。

在实验当天，以适合于实验中的构建体数目的体积制备接种培养基和乙酰丁香酮的混合物(Frame等人(2011)Methods in Molecular Biology 710:327-341)，并且移液至无菌的一次性的250mL烧瓶中。接种培养基含有：2.2gm/L MS盐；改良的MS维生素(Frame等人，同上)68.4gm/L蔗糖；36gm/L葡萄糖；115mg/L L-脯氨酸；和100mg/L肌肉肌醇；在pH5.4)。将乙酰丁香酮(100％二甲亚砜中的1M储备溶液)添加至含有接种培养基的烧瓶中，至终浓度为200μM。

对于每种构建体，将来自YEP板的1个接种环的土壤杆菌悬浮在无菌一次性50mL离心管内的15mL接种培养基/乙酰丁香酮混合物中，在分光光度计中测量溶液的550nm光密度(OD₅₅₀)。然后，使用另外的接种培养基/乙酰丁香酮混合物将悬浮液稀释至OD₅₅₀0.3至0.4。然后，在室温下将土壤杆菌悬浮液管水平放置在设定为约75rpm的平台摇动器上，并且在使用前摇动1至4小时。

穗灭菌和胚分离。在温室中生成来自玉米近交系B104(Hallauer等人(1997)CropScience 37:1405-1406)的穗，并且在授粉后10至12天收获。将收获的穗脱壳，并且如下表面灭菌：在商业漂白剂(Ultra

Germicidal Bleach，6.15％次氯酸钠；具有两滴TWEEN 20)的20％溶液中浸没20分钟，然后在层流通风橱内部的无菌去离子水中漂洗三次。从每个穗无菌切出未成熟的合子胚(长1.8至2.2mm)，并分配到含有2.0mL土壤杆菌悬浮液的一个或多个微量离心管中，所述管中已经添加有2μL 10％

S233表面活性剂(EVONIK INDUSTRIES；Essen,Germany)。

土壤杆菌共培养.分离后，将胚置于振荡器平台上5分钟。然后，将管的内容物倒到共培养培养基的板上，所述共培养培养基含有4.33gm/L MS盐；改良的MS维生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L-脯氨酸；3.3mg/L在KOH中的麦草畏(3,6-二氯-o-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100mg/L肌肉肌醇；100mg/L酪蛋白酶水解产物；15mg/L AgNO₃；200μM在DMSO中的乙酰丁香酮；和3gm/L琼脂(SIGMA-ALDRICH，测试的植物细胞培养物)。用无菌的一次性转移移液管除去液体土壤杆菌悬浮液，并在盖子半打开的状态下将含有胚的共培养板置于层流通风橱的后部，历时30分钟，此段时间后，在显微镜的帮助下使用无菌镊子将各个胚小盾片面朝上定向。在盖子半打开的状态下将板返回到层流通风橱的后部，再等15分钟。然后，，盖住平板，用3M^TMMicropore^TM医用胶带密封，并置于25℃的培养箱中约60μEm^-2sec^-1光强度的连续光条件下。

愈伤组织选择和转基因事件的再生.共培养期后，将胚转移至休眠培养基，所述休眠培养基组成如下：4.33gm/L MS盐；改良的MS维生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L-脯氨酸；3.3mg/L在KOH中的麦草畏；100mg/L肌肉肌醇；100mg/L酪蛋白酶水解产物；15mg/L AgNO₃；0.5gm/L MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物；Phytotechnologieslabr.；Lenexa,KS)；250mg/L头孢噻肟；和7.0gm/L琼脂；pH 5.8。将不超过36个胚移到每块板上。用Micropore^TM带包裹板，并在27℃用连续光以大约50μmol m^-2s^-1光强度温育7至10天。然后，将具有愈伤组织(<18/平板)的胚转移到选择培养基I，选择培养基I由休眠培养基(上述)构成，但仅含有6.5gm/L琼脂，以及100nM R-吡氟氯禾灵酸(0.0362mg/L)。用Micropore^TM胶带包裹板，并在27℃用约50μEm^-2sec^-1光强度的连续光温育7天，然后，将增殖的愈伤组织(<12个/平板)转移至选择培养基II，所述选择培养基II由休眠培养基(上述)构成，但仅用6.5gm/L琼脂，并且具有500nM R-吡氟氯禾灵酸(0.181mg/L)。包裹板，并且在27℃用约50μEm^-2sec^-1光强度的连续光温育14天。

在此阶段，将抗性愈伤组织(<9个/平板)移至预再生培养基。预再生培养基含有4.33gm/L MS盐；改良的MS维生素；45gm/L蔗糖；350mg/L L-脯氨酸；100mg/L肌肉肌醇；50mg/L酪蛋白酶水解产物；1.0mg/L AgNO₃；0.5gm/L MES；0.5mg/L萘乙酸(在NaOH中)；2.5mg/L脱落酸(在乙醇中)；1mg/L 6-苄基氨基嘌呤；250mg/L头孢噻肟；5.5gm/L琼脂；和500nM R-吡氟氯禾灵酸(0.181mg/L)。包裹板，并在27℃用大约50μEm^-2sec^-1光强度的连续光温育7天。然后，将再生愈伤组织(<6个/平板)转移到Phytatrays^TM(Sigma-Aldrich)中的再生培养基，并在28℃以约150μmol m^-2s^-1光强度以每天16小时光/8小时黑暗温育14天或直到形成枝条。再生培养基含有4.33gm/L MS盐；改良的MS维生素；60gm/L蔗糖；0.50gm/LMES；125mg/L头孢噻肟；5.5gm/L琼脂；和500nM R-吡氟氯禾灵酸(0.181mg/L)，pH 5.8。然后，分离具有初生根的小枝条，并转移到无选择的延长培养基(即，没有R-吡氟氯禾灵酸和用30gm/L蔗糖代替60gm/L蔗糖的再生培养基)以进一步生长。将约6cm或更高的生根小植株移植到土壤中，并移至生长室进行炼苗(harden off)。

温室中的T₀植物的转移和定植以进行测定法和种子生产.对于基于其在含有吡氟氯禾灵的培养基上生长的能力而选择出的转化植物组织，将它们从Phytatrays^TM移植到填充有生长培养基(PROMIX BX；Premier Tech Horticulture)的小盆(T.O.Plastics,3.5”SVD)中，用humidomes(Arco PlasticsLtd.)覆盖，然后在生长室中炼苗(28℃白天/24℃黑夜，16小时光周期，50-70％RH，200μEm^-2sec^-1光强度)。当植物达到V3-V4阶段时，将它们移植到Sunshine Custom Blend 160土壤混合物中，在温室(光暴露类型：光或同化；高光限制：1200PAR；16小时白天长度；27℃白天/24℃黑夜)中培植至开花。对于推定的转基因小植物，通过定量实时PCR测定法分析转基因拷贝数(使用设计为检测转基因的相对拷贝数的引物)，将仅具有1个或2个拷贝的整合Cry1Da2基因的事件移植到5加仑盆中。定期进行观察以追踪任何异常的表型。用从T₀植物收集的花粉对T₀转基因植物的须自花传粉，种植所得的种子获得T₁世代的植物。种植来自事件109841[3]-106的T₁种子，并且如下所述进行选择：用喹禾灵喷雾植物，并且保持存活的植物直到繁殖阶段以获得须，用于玉米穗虫生物测定法和western印迹分析。

类似地在用含有黄色荧光蛋白基因表达盒的二元载体pDAB101556转化后，生成了转基因玉米植物。

实施例5

转基因玉米组织的分子和生物化学分析

用于拷贝数分析的水解探针qPCR.采用分子分析筛选低拷贝的、简单的事件。在移植到土壤前，从生根的推定转基因植物收集叶组织。使用QIAGENMagAttract^TM试剂盒，使用Biosprint96,QIAGEN提取机器人和供应商推荐的方案提取DNA。使用针对AAD-1基因的特异性水解探针测定法分析综合转基因拷贝数。另外，通过对二元载体主链上携带的壮观霉素(Spec)抗性基因特异的水解探针测定检测由二元载体质粒主链的无意整合所致的污染。开发了用于内源玉米基因转化酶；(GenBank^TM登录号U16123)的水解探针测定法作为内部参照标准。表2列出了水解探针测定组分(由Integrated DNA Technologies,Coralville,IA&Applied Biosystems,Foster City,CA合成)的寡核苷酸序列。根据表3用约10ng DNA建立二重(Biplex)水解探针PCR反应，在表4中呈现了测定条件。

表2

用于转基因拷贝数和相对表达检测的正向和反向核苷酸引物和荧光探针的列表。

*荧光探针标记物是：FAM＝6-羧基荧光素亚酰胺(6-Carboxy FluoresceinAmidite)；HEX＝六氯荧光素；MGB&VIC＝“小沟粘合剂”；

是来自INVITROGEN的专有荧光标记物。

表3

用于转基因DNA拷贝数分析的水解探针PCR混合物

表4

用于水解探针PCR扩增的热循环仪条件。

为了扩增，在10μL体积多重反应中以1X终浓度，0.4μM的每种引物和0.2μM的每种探针制备

480探针主混合物(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)。在465nm激发FAM(6-羧基荧光素亚酰胺)荧光部分，并且在510nm测量荧光；HEX(六氯荧光素)荧光部分的对应值为533nm和580nm。使用Roche

480实时PCR系统，根据制造商的推荐，分析每个反应生成的荧光水平。将未知样品的靶标/参照基因值的

480输出与已知拷贝数标准品的靶标/参考基因值(1-拷贝表示半合子植物，2-拷贝表示纯合植物)进行比较，来确定转基因拷贝数。

使用Cp分数(即，使用拟合点算法(

软件版本1.5)和相对定量模块，荧光信号与背景阈值交叉的点)来实施实时PCR数据的分析。

在

拟合点算法软件中，通过将输入的DNA模板浓度的对数与测量的Cp值绘图产生数据的图。曲线的斜率是期望的比较参数；因此，初始对数输入数可以是曲线上的任意起始点，要注意的是，用于输入DNA模板的任意浓度值代表所使用的实际连续稀释。例如，对于10倍连续稀释系列，实际输入浓度可以是1000，100，10等，对于这些点，LC480拟合点算法软件用作为输入之对数的3，2，1等绘图。使用线性回归，然后使用此线的得到的最佳拟合(输入对数对Cp)，从形式y＝mx+b的等式来估计斜率(m)。起始模板量和Cp值之间存在反相关，因此斜率(m)总是负的。

完全(即100％有效)PCR反应每个循环使总模板加倍。如下计算PCR效率(Eff)：Eff＝10e(-1/m)。因此，对于完全有效的反应(其效率定义为2.00)，对数输入对Cp的图的斜率(m)将为-3.3219。

换言之，如下定义100％有效PCR反应：2.0＝10e(-1/-3.3219)。LC480拟合点算法软件通过第一公式报告效率值。因此，99％有效反应的Eff值是1.99，而不是0.99。为了将其表示为百分比效率，从此值中减去1并乘以100。或者，％Eff＝[(10e(-1/m)-1)]x 100。

植物生成的截短的Cry1Da2蛋白的检测.从200至240mg的穗须(从未传粉的穗中收集)中提取蛋白质到0.6mL的PBST(含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液)中。加入一颗2mm钢珠，将管加盖并固定在GENO/GRINDER(CERTIPREP；Metuchen,NJ)中，并以1500rpm震摇5分钟。将管在4℃以4000rpm离心7分钟，并且将含有可溶性蛋白质的上清液贮存在-80℃直至使用。

使用PIERCE 660nm蛋白质测定试剂盒(THERMO SCIENTIFIC；Rockford,IL)根据供应商的用法说明测定总蛋白质浓度。使用标准方法，使用在兔中生成的多克隆抗体进行蛋白质免疫印迹分析(参见例如Harlow,E.,and Lane,D.P.(1988)Antibodies:A LaboratoryManual.Cold Springs Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,NY，及其更新)。制备样品，并且根据制造商建议的关于变性电泳的方案(Invitrogen)通过在MES运行缓冲液中的NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶上进行来电泳分离蛋白质。在NUPAGE转移缓冲液中30V下，历时80分钟将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。印迹在室温在5％乳/PBST(具有0.05％Tween-20的PBS)中封闭1小时，然后用一抗(对Cry1Da核心毒素蛋白特异性)探查，再用二抗探查1小时，二者分别在室温在封闭溶液中进行，在两种抗体之间在PBST中漂洗15分钟。使用PIERCE的ECL WESTERN印迹法底物根据制造商的方案(THERMO FISHER SCIENTIFIC,Rockford,IL)显影印迹。在从事件109841[3]-106(植物109841[3]-106.AJ001.008，109841[3]-106.AJ001.013，109841[3]-106.AJ001.020，109841[3]-106.AJ001.027，和109841[3]-106.AJ001.028)生成的玉米植物的须组织的一式两份样品的提取物中证实了截短的Cry1Da蛋白的存在。通常检测到两条带，一条的迁移率对应于大约65kDa，相当于由构建体pDAB109841编码的Cry1Da2蛋白的分子大小，另一个条带的迁移率对应于略小于65kDa的蛋白质。较小的蛋白质可能对应于从Cry1Da核心毒素蛋白的N端切割氨基酸1-28后剩余的产物。(经常检测到几个N-末端氨基酸被从Cry1蛋白加工掉)。在来自非转基因B104植物的须提取物中没有看到此类带。

表5

对T1植物分析RNA相对转录水平(RTL)和蛋白质表达。

*通过Western分析进行测量并且通过如本领域中已知的LC/MS/MS量化。

实施例6

转基因玉米组织的生物测定法

具有T₁玉米事件的V5叶生物测定法.生物测定盘(32孔/盘；C-D International)部分填充2％琼脂溶液，并使琼脂固化。从每个植物采集两个叶切片(面积约1平方英寸)，并将每个放置在32孔盘的不同孔中。将十个新生谷实夜蛾(CEW)幼虫(在孵化后约24至48小时)放入每个孔中。用穿孔的粘性盖密封盘以便在测试期间能够通气，然后置于28℃，40％RH，16小时光照:8小时黑暗。三天后，对每个叶块采用简单的百分比叶面积损伤评分。对每个测试的损伤评分取平均值。

玉米穗虫须生物测定法.收集未传粉的穗，测量其长度，并将穗在4℃贮存直到用于生物测定。将约10mL的2％水琼脂置于32孔生物测定盘的每个测定孔(约1平方英寸)的底部，以向须和玉米穗虫幼虫提供水分。将五股须(长约10cm)喂给每孔中的两只CEW新生虫。每个事件以完全随机化格式的四个重复(孔)进行测试。昆虫侵袭后，用穿孔的粘性盖密封盘以在测试期间通气。将托盘置于28℃，60％RH，16小时光照:8小时黑暗。在侵染后3天时，通过目视评估须组织上的虫粪量来记录百分比须损伤。记录每个事件活的、死亡的和丢失的昆虫的数目，并估计百分比幼虫死亡。

植物生成的Cry1Da对CEW幼虫的活性.免疫印迹分析检测到T₁pDAB109841转基因植物的穗须中的Cry1Da核心毒素蛋白，并且这些须提供了针对由谷实夜蛾的摄食损伤的极好的保护，在生物测定中仅具有4.6％的须损伤(表6)。来自生成非杀虫黄色荧光蛋白(YFP；构建体pDAB101556)的阴性对照转基因玉米植物或非转基因B104植物的须受到谷实夜蛾幼虫所致的须损伤平均达90％至95％。此外，以来自生成Cry1Da核心毒素蛋白的植物的须为食的幼虫的死亡率为26.8％，而在阴性对照植物样品上没有观察到幼虫的死亡。Cry1Da构建体对V5阶段样品给予极好的叶保护，其中pDAB109851转基因植物由谷实夜蛾引起的叶损伤为12％至25％(表6)，而阴性对照植物(生成B104和YFP)几乎经历100％的叶损伤。来自须和叶生物测定法两者的结果均证明，Cry1Da核心毒素蛋白对于保护玉米植物免受谷实夜蛾幼虫损害是高度有效的。

表6

与阴性对照植物相比，谷实夜蛾新生幼虫在来自生成Cry1Da核心毒素的植物的样品上的生物测定的结果。一列内的各均值是根据Tukey-Kramer HSD检验加以分离的。

*4个重复的平均值

**NA＝不适用

***一列内不连接相同字母的水平(levels not connected by the same letterwithin a column)有显著差异。

表7显示了谷实夜蛾的百分比死亡率，百分比叶损伤和百分比须损伤。须损伤的量根据组织上的目测昆虫虫粪(frass)量进行评分。百分比叶损伤根据1平方英寸叶切块上的幼虫进食面积的目测评估进行评分。玉米品种B104和构建体101556(对于叶损伤则为构建体109812)分别是来自杂交栽培种和黄色荧光蛋白(YFP)对照的阴性对照，而HX1是表达Cry1Fa蛋白的商业杂种

I。构建体109841是表达Cry1Da的截短形式的T1玉米。数据通过ANOVA和Tukey-Kramer均值分离检验进行分析。

表7

谷实夜蛾的百分比死亡率，百分比叶损伤和百分比须损伤。

*SEM＝均值的标准误差。括号中的字母指统计学水平。不连接相同字母的水平是显著差异的(P<0.05)。

**构建体109812是用于叶损伤生物测定法的YFP阴性对照。

实施例7：

Cry1Da核心毒素蛋白对CEW的田间效力

在DOW AGROSCIENCES田间站(Fowler,印地安那州)的田间测试样地中测试来自8个T₁pDAB109841转基因B104事件的种子。这些事件已经通过如上文描述的分子技术分析，证明是单拷贝事件且没有可检测的二元载体主链序列。所有事件均是作为Cry1Da/AAD1整合事件以1:1(半合:空)分离的T₁植物测试。阴性对照是非转基因B104(空)植物。

对于每种测试的昆虫物种，测试地块有一个20英尺的行。处理组按照随机完全区组设计种植四个重复。在V2阶段用每公顷184gm酸当量(ae/ha)的

II(DUPONT^TMCROP PROTECTION,Wilmington,DE)+1％COC处理实验入选植物，以淘汰空植物。

II含有活性成分(ai)喹禾灵P-乙基(R)-2-4-[4-6-氯喹恶啉-2-基氧基)-苯氧基]丙酸乙酯。商业产品含有每加仑0.88磅ai和1.0％(v/v)作物油浓缩物(COC)。COC是含约85％石蜡基油和约15％乳化剂的可乳化精制石蜡基油。处理后2周统计出苗率(standcount)。每个地块对5株植物评估昆虫损害。

玉米穗虫卵(CEW；谷实夜蛾Boddie)由BENZON RESEARCH提供。为了评估对CEW的功效，在开花期间(主要生长阶段#6)，在2012/08/21，每株植物在穗须上接收5只第二龄CEW幼虫。在2012/09/04，检查穗的活幼虫和摄食损伤，根据表87中列出的标准确定。

表8

玉米穗虫损伤评估标准。

使用标准规程的定量酶联免疫吸附测定(ELISA)评价每个事件中的Cry1Da叶蛋白水平。ELISA使用多个稀释度的植物提取物，并使用基本上如ELISA试剂盒供应商提供的试剂和用法说明来实施。使用如上文描述的Cry1Da抗体。

表9

在田间种植的植物上的分析和昆虫摄食测试的结果。各均值是通过Tukey-KramerHSD检验分离的。

*不连接相同字母的水平是显著差异的。

**N/A＝不适用

Cry1Da积累水平变化范围较宽，从67ng/cm²至135ng/cm²。不管Cry1Da生成水平如何，所测试的所有pDAB109841事件在籽粒被食和穗侵袭水平方面都提供了统计学上相似水平的针对CEW的保护。

参考文献

Frankenhuyzen,K.2009.Minireview:Insecticidal activity of Bacillusthuringiensis crystal proteins.Journal of Invertebrate Pathology.101:1-16.

Karim S.,Ridzuddin,S.,Gould,F.,Dean,D.H.2000.Determination ofReceptor Binding Properties of Bacillus thuringiensisδ-Endotoxins to CottonBollworm(Helicoverpazea)and Pink Bollworm(Pectinophoragossypiella)MidgutBrush Border Membrane Vesicles.Pesticide Biochemistry and Physiology 67(3):198-216.

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Payne,J.,and A.J.Sick.1997.US Patent No.5,691,308.

序列表

<110> 美国陶氏益农公司

<120> 用于控制玉米穗虫的Cry1D

<130> DAS-74266

<150> 61968703

<151> 2014-03-21

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3420

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> DIG-911 DNA; Cry1Da2/Cry1Ab嵌合毒素, 来自pDOW2848

<400> 1

atggaaataa ataatcaaaa ccaatgtgtg ccttacaatt gtttaagtaa tcctaaggag 60

ataatattag gcgaggaaag gctagaaaca gggaatactg tagcagacat ttcattaggg 120

cttattaatt ttctatattc taattttgta ccaggaggag gatttatagt aggtttacta 180

gaattaatat ggggatttat agggccttcg caatgggata tttttttagc tcaaattgag 240

caattgatta gtcaaagaat agaagaattt gctaggaatc aggcaatttc aagattggag 300

gggctaagca atctttataa ggtctatgtt agagcgttta gcgactggga gaaagatcct 360

actaatcctg ctttaaggga agaaatgcgt atacaattta atgacatgaa tagtgctctc 420

ataacggcta ttccactttt tagagttcaa aattatgaag ttgctctttt atctgtatat 480

gttcaagccg caaacttaca tttatctatt ttaagggatg tttcagtttt cggagaaaga 540

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gtttatacta accattgtgt ggatacgtat aatcagggat taaggcgttt ggaaggtcgt 660

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gatattgttg cgttttttcc aaattatgat attagaacat atccaattca aacagctact 780

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gcaagctatc caaccttttc agctgctgaa agtgctataa ttagaagtcc tcatttagta 900

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gggcacttgg taaattcttt ccgcacagga accactacta atttgataag atccccttta 1020

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gtagcaaata ggagtggtac atttagatat tcacagccac cttcgtatgg aatttcattt 1620

ccaaaaacta tggacgcagg tgaaccacta acatctcgtt cgttcgctca tacaacactc 1680

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gtttatatag atcgaattga atttataccg gttactgcaa cactggaggc agagtctgac 1800

ttggaaagag cacagaaggc ggtgaatgct ctgttcactt cgtccaatca gattgggctc 1860

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aagatagatg aatcgaaact caaagcctac acaagatacc agttgagagg ttacatcgag 2220

gacagtcaag accttgagat ctacctcatc agatacaacg ccaaacatga gacagtcaat 2280

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catcactcac accacttctc cttggacata gacgttggct gtaccgacct gaacgaagac 2400

ctcggtgtgt gggtgatctt caagatcaag actcaagatg gccatgccag gctaggcaat 2460

ctggagtttc tagaagagaa accacttgtt ggagaagccc tcgctagagt gaagagggct 2520

gagaagaagt ggagggacaa gagagagaag ttggaatggg aaacaaacat tgtgtacaaa 2580

gaagccaaag aaagcgttga cgctctgttt gtgaactctc agtatgatag gctccaagct 2640

gataccaaca tagctatgat tcatgctgca gacaaacgcg ttcatagcat tcgggaagct 2700

taccttcctg aacttagcgt gattccgggt gtcaatgctg ctatctttga agagttagaa 2760

gggcgcatct tcactgcatt ctccttgtat gatgcgagga atgtcatcaa gaatggtgac 2820

ttcaacaatg gcctatcctg ctggaatgtg aaagggcacg tagatgtaga agaacagaac 2880

aatcaccgct ctgtccttgt tgttcctgag tgggaagcag aagtttcaca agaagttcgt 2940

gtctgtcctg gtcgtggcta cattcttcgt gttaccgcgt acaaagaagg atacggagaa 3000

ggttgcgtca ccatacacga gattgagaac aacaccgacg agctgaagtt cagcaactgc 3060

gtcgaggagg aagtctaccc aaacaacacc gtaacttgca atgactacac tgcgactcaa 3120

gaggagtatg agggtactta cacttctcgc aatcgaggat acgatggagc ctatgagagc 3180

aactcttctg tacccgctga ctatgcatca gcctatgagg agaaggctta caccgatgga 3240

cgtagggaca atccttgcga atctaacaga ggctatgggg actacacacc gttaccagcc 3300

ggctatgtca ccaaagagtt agagtacttt ccagaaaccg acaaggtttg gattgagatt 3360

ggagaaacgg aaggaacatt cattgttgat agcgtggagt tacttctgat ggaggaatga 3420

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> DIG-911蛋白的氨基酸序列(Cry1Da2/Cry1Ab嵌合杀虫毒素，其由Cry1Da的核心毒素毒素(氨基酸1至594, 如GENBANK登录号176415.1和美国专利号5,691,308公开的)和

<400> 2

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Asn Pro Lys Glu Ile Ile Leu Gly Glu Glu Arg Leu Glu Thr Gly Asn

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915 920 925

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<211> 3447

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> DIG-180 DNA; Cry1Fa2

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<210> 4

<211> 1148

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> DIG-180蛋白质; Cry1Fa2

<400> 4

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<223> Cry1Da2 v4 DNA 来自pDAB109841 (截短的Cry1Da; 玉米优化的)

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> Cry1Da2 v4蛋白质 (截短的Cry1Da)

<400> 6

Met Glu Ile Asn Asn Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Lys Glu Ile Ile Leu Gly Glu Glu Arg Leu Glu Thr Gly Asn

20 25 30

Thr Val Ala Asp Ile Ser Leu Gly Leu Ile Asn Phe Leu Tyr Ser Asn

35 40 45

Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Val Gly Leu Leu Glu Leu Ile Trp

50 55 60

Gly Phe Ile Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ile Phe Leu Ala Gln Ile Glu

65 70 75 80

Gln Leu Ile Ser Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile

85 90 95

Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Lys Val Tyr Val Arg Ala

100 105 110

Phe Ser Asp Trp Glu Lys Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu

115 120 125

Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Ile Thr Ala Ile

130 135 140

Pro Leu Phe Arg Val Gln Asn Tyr Glu Val Ala Leu Leu Ser Val Tyr

145 150 155 160

Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Ile Leu Arg Asp Val Ser Val

165 170 175

Phe Gly Glu Arg Trp Gly Tyr Asp Thr Ala Thr Ile Asn Asn Arg Tyr

180 185 190

Ser Asp Leu Thr Ser Leu Ile His Val Tyr Thr Asn His Cys Val Asp

195 200 205

Thr Tyr Asn Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Gly Arg Phe Leu Ser Asp

210 215 220

Trp Ile Val Tyr Asn Arg Phe Arg Arg Gln Leu Thr Ile Ser Val Leu

225 230 235 240

Asp Ile Val Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Ile Arg Thr Tyr Pro Ile

245 250 255

Gln Thr Ala Thr Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Leu Asp Leu Pro Phe

260 265 270

Ile Asn Glu Asn Leu Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Phe Ser Ala

275 280 285

Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe Leu Asn

290 295 300

Ser Phe Thr Ile Tyr Thr Asp Ser Leu Ala Arg Tyr Ala Tyr Trp Gly

305 310 315 320

Gly His Leu Val Asn Ser Phe Arg Thr Gly Thr Thr Thr Asn Leu Ile

325 330 335

Arg Ser Pro Leu Tyr Gly Arg Glu Gly Asn Thr Glu Arg Pro Val Thr

340 345 350

Ile Thr Ala Ser Pro Ser Val Pro Ile Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Ile

355 360 365

Thr Gly Leu Asp Asn Ser Asn Pro Val Ala Gly Ile Glu Gly Val Glu

370 375 380

Phe Gln Asn Thr Ile Ser Arg Ser Ile Tyr Arg Lys Ser Gly Pro Ile

385 390 395 400

Asp Ser Phe Ser Glu Leu Pro Pro Gln Asp Ala Ser Val Ser Pro Ala

405 410 415

Ile Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Leu Glu Arg Ile

420 425 430

Ser Gly Pro Arg Ile Ala Gly Thr Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser

435 440 445

Ala Ser Pro Thr Asn Glu Val Ser Pro Ser Arg Ile Thr Gln Ile Pro

450 455 460

Trp Val Lys Ala His Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Val Ile Lys Gly

465 470 475 480

Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Thr Arg Asn Ser Met Gly Glu

485 490 495

Leu Gly Thr Leu Arg Val Thr Phe Thr Gly Arg Leu Pro Gln Ser Tyr

500 505 510

Tyr Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Val Ala Asn Arg Ser Gly Thr Phe

515 520 525

Arg Tyr Ser Gln Pro Pro Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Pro Lys Thr Met

530 535 540

Asp Ala Gly Glu Pro Leu Thr Ser Arg Ser Phe Ala His Thr Thr Leu

545 550 555 560

Phe Thr Pro Ile Thr Phe Ser Arg Ala Gln Glu Glu Phe Asp Leu Tyr

565 570 575

Ile Gln Ser Gly Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Thr

580 585 590

Ala Thr Leu Glu Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg

595 600

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> AAD1F引物

<400> 7

tgttcggttc cctctaccaa 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> AAD1R引物

<400> 8

caacatccat caccttgact ga 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> AAD1P探针

<400> 9

cacagaaccg tcgcttcagc aaca 24

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> SPC1A引物

<400> 10

cttagctgga taacgccac 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> SPC1S引物

<400> 11

gaccgtaagg cttgatgaa 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> TQSPC探针

<400> 12

cgagattctc cgcgctgtag a 21

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> InvertaseF引物

<400> 13

tggcggacga cgacttgt 18

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> InvertaseR引物

<400> 14

aaagtttgga ggctgccgt 19

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> InvertaseP探针

<400> 15

cgagcagacc gccgtgtact t 21

Claims

1.一种控制玉米穗虫对植物的损伤的方法，该方法包括对玉米穗虫提供SEQ ID NO:6的Cry1Da杀虫蛋白以供摄食。

2.权利要求1的方法，其中所述Cry1Da杀虫蛋白由植物细胞生成，并且存在于植物细胞中。

3.权利要求1的方法，其中所述Cry1Da杀虫蛋白由能育的全植物生成，并且存在于能育的全植物中。

4.权利要求3的方法，其中所述植物选自下组：玉米、大豆和棉花。

5.一种控制玉米穗虫对植物的损伤的方法，所述方法包括用表达包含SEQ ID NO:5的编码区的DNA序列转化植物细胞，从转化的植物细胞再生能育的转基因植物，从所述转基因植物收集携带所述DNA序列的种子，种植所述转基因植物的种子，并且允许所述玉米穗虫以由所述DNA序列表达的蛋白质为食。

6.一种控制玉米穗虫对植物的损伤的方法，该方法包括种植由所述包含SEQ ID NO:5的编码区的经转化的植物生成的种子，并且允许所述玉米穗虫以由所述DNA序列表达的蛋白质为食。