BR102015006253A2

BR102015006253A2 - cry1d para controle da lagarta-da-espiga-do-milho

Info

Publication number: BR102015006253A2
Application number: BR102015006253A
Authority: BR
Inventors: Aaron T Woosley; Diaa Alabed; Joel J Sheets; Karen C Mclaughlin; Kenneth Narva; Sarah E Worden; Sek Yee Tan; Stephanie L Burton; Thomas Meade; Todd P Glancy
Original assignee: Agrigenetics Inc
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2015-03-20
Publication date: 2015-12-15
Also published as: ZA201606354B; AU2015231111B2; AR099800A1; EP3119187A1; NZ724242A; CN106455513A; EP3732958B1; IL247913A0; US11485983B2; CA2942669C; AP2016009488A0; US20230049002A1; EP3119187A4; TW201542093A; UY36040A; JP2017516840A; US20200277622A1; CL2016002301A1; PH12016501823A1; US10683517B2

Abstract

resumo patente de invenção: "cry1d para controle da lagarta-da-espiga-do-milho". a presente invenção refere-se em parte à surpreendente descoberta de que cry1da é ativa contra a lagarta-da-espiga-do-milho (cew), helicoverpa zea (boddie). encontram-se descritos métodos para uso de cry1da em plantas transgênicas para prevenir danos sérios à cultura. bioensaios de folhas e barba de milho usando milho transgênico expressando a região de toxina de núcleo de comprimento integral ou cry1da quimérica demonstraram proteção satisfatória de insetos contra danos causados por larvas de cew.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CRY1D PARA CONTROLE DA LAGARTA-DA-ESPIGA-DO-MILHO".

Referência Cruzada [001] Este pedido reivindica os benefícios do Pedido Provisório US N° 61/968,703, depositado em 21 de março de 2014, cuja descri- ção encontra-se aqui expressamente incorporada em sua totalidade.

Antecedentes [002] CrylDa é uma delta-endotoxina conhecida produzida por certas espécies de Bac/7/tvs thuringiensis e foi descrita pela primeira vez na Patente US 5,691,308. Mais recentemente foi relatado que era inativa contra a lagarta-da-espiga-do-milho (CEW) por dois ensaios revisados semelhantes, porém independentes: Karim et al. (2000) e Frankenhuyzen (2009). Consequentemente, as surpreendes e inespe- radas observações a seguir refutam diretamente esses resultados pu- blicados e mostram nitidamente que a CrylDa tem boa atividade inse- ticida contra larvas de CEW quando o gene é expresso em plantas.

Breve Sumário [003] A presente invenção refere-se em parte à surpreendente descoberta de que a CrylDa é ativa contra larvas de lagarta-da- espiga-do-milho (CEW), Helicoverpa zea (Boddie). Bioensaios de fo- lhas e barbas usando milho transgênico expressando uma versão de comprimento integral, uma versão truncada, e uma versão quimérica de CrylDa demonstraram boa proteção de inseto contra danos causa- dos por larvas de CEW. Outra descoberta surpreendente é que a pro- teção de larvas de CEW que se alimentam das barbas de milho mos- trou-se superior em plantas transgênicas expressando Cry1 Da trunca- da em comparação com plantas comerciais produtoras de CrylFa. [004] CEW é uma praga de inseto difícil de controlar com proteí- nas do Bacillus thuringiensis (Bt), e esta é a primeira observação des- crita em que milho transgênico expressando CrylDa demonstrou ativi- dade biológica para proteger as barbas de milho contra danos de ali- mentação causados por este inseto. Mariposas de CEW adultas tipi- camente depositam seus ovos sobre as barbas de milho, e as larvas recém-emergentes alimentam-se das barbas de milho para penetrar na espiga. Assim sendo, ter atividade protetora contra insetos localiza- da em tecidos da barba de milho vai proporcionar efeitos protetores significativos contra danos de alimentação causados por esta significa- tiva e destrutiva praga do milho.

Breve Descrição da Figura [005] Figura 1. Atividade percentual contra dano em folhas de milho não transformado (B-104), milho transgênico expressando YFP (109812), milho Herculexl ™ (HX1), ou milho T-1 transgênico expres- sando seja CrylDa de comprimento integral (109840), ou CrylDa truncada (109841) desafiada com larvas de CEW.

Breve Descrição das Sequências [006] A SEQ ID 1 é um fragmento de DNA tendo a sequência codifícadora (CDS) de DIG-911. [007] A SEQ ID 2 é a sequência aminoacídica da proteína DIG-911 (toxina inseticida quimérica Cry1 Da2/Cry1 amostra biológica, que consiste em um segmento de toxina de núcleo da CrylDa (amino- ácidos 1 a 594, como divulgado no GENBANK Acesso N° 176415.1 e na Patente US N° 5,691,308) e um segmento de protoxina derivado da CrylAb (DIG-911 aminoácidos 595 a 1139), essencialmente como di- vulgado no GENBANK Acesso N°AFK79795.1) [008] A SEQ ID 3 é um fragmento de DNA tendo a sequência codifícadora (CDS) de DIG-180. [009] A SEQ IDNMéa proteína DIG-180 (Cry1 Fa2). [0010] A SEQ ID Ν'! 5 é um vetor de entrada Gateway® (INVITROGEN) pDAB109825 compreendendo uma sequência codifi- cadora otimizada para milho (SEQ ID N* 5) que codifica uma proteína inseticida de toxina de núcleo Cry1Da2 (SEQ ID N* 6). [0011] A SEQ ID N® 6 é a proteína inseticida de toxina de núcleo Cry1Da2. [0012] A SEQ ID N* 7 é um iniciador para AAD-1; vi de Tabela 2. [0013] A SEQ ID N* 8 é um iniciador para AAD-1. [0014] A SEQ ID N* 9 é uma sonda para AAD-1. [0015] A SEQ ID N* 10 é um iniciador para o gene d e resistência à espectinomicina. [0016] A SEQ ID N* 11 é um iniciador para o gene de resistência à espectinomicina. [0017] A SEQ ID N* 12 é uma sonda para o gene de resistência à espectinomicina. [0018] A SEQ ID N* 13 é um iniciador para o gene d a invertase de milho. [0019] A SEQ ID N* 14 é um iniciador para o gene d a invertase de milho. [0020] A SEQ ID N* 15 é uma sonda para o gene da i nvertase de milho.

Descrição Detalhada [0021] A presente invenção refere-se em parte à surpreendente descoberta de que a CrylDa é ativa contra larvas de lagarta-da- espiga-do-milho (CEW), Helicoverpa zea (Boddie). Resultados de bio- ensaio de bioensaios de dieta in vitro mostraram que quimeras da pro- toxina Cry1 Da/Cry1 Ab resultam em significativa inibição de crescimen- to e mortalidade para larvas de CEW. Uma proteína ou toxina insetici- da CrylDa é qualquer proteína inseticida compreendendo a toxina de núcleo apresentada na SEQ ID N* 6 ou variantes da mesma. Tais va- riantes têm pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ

ID 6, de preferência 99% de identidade de sequência com a SEQ ID N* 6. [0022] Bioensaios de folhas e barbas usando milho transgênico expressando uma versão truncada de CrylDa demonstraram boa pro- teção de insetos contra danos causados por larvas de CEW. Proteção equiparável das folhas contra alimentação de CEW foi observada tanto nas plantas de milho transgênicas expressando CrylDa truncada quando no produto comercial Herculex® I (HX1) expressando CrylFa. [0023] Surpreendentemente, foi constatado que a proteção de lar- vas de sew que se alimentam de barba de milho é superior em plantas transgênicas expressando CrylDa truncada em comparação com plantas HX1. Os insetos se alimentando de tecido da barba de milho transgênico expressando CrylDa truncada experimentaram mortalida- de (-25%), que foi numericamente melhor que aquela observada para insetos se alimentando de tecido da barba de plantas HX1 (<10%). [0024] CEW é uma praga de inseto difícil de controlar com proteí- nas do Bacillus thuringiensis (Bt), e esta é a primeira observação des- crita em que milho transgênico expressando CrylDa demonstrou ativi- dade biológica para proteger as barbas de milho contra danos de ali- mentação causados por este inseto. Mariposas de CEW adultas tipi- camente depositam seus ovos sobre as barbas de milho e as larvas recém-emergentes alimentam-se das barbas de milho para penetrar na espiga. Assim sendo, ter atividade protetora contra insetos localiza- da em tecidos da barba de milho vai proporcionar efeitos protetores significativos contra danos de alimentação causados por esta significa- tiva e destrutiva praga do milho. As opções de implementação da pre- sente invenção incluem o uso de proteínas CrylDa em regiões geo- gráficas, incluindo regiões de cultivo de soja e milho nas quais as CEW estão presentes e representam um problema. [0025] Os dados apresentados neste relatório demonstram que a CrylDa é uma proteína excelente para controlar CEW através de teci- dos da barba em comparação com a Herculex 1®. Conforme usado neste relatório, os termos "controlar" e "controlando" incluem inibição de crescimento e/ou mortalidade. [0026] Neste relatório está mostrada uma quimera da protoxina Cry1Da/Cry1Ab que tem atividade inseticida contra H. zea em bioen- saios de dieta de inseto. Quando a forma truncada da CrylDa foi ex- pressa em milho transgênico, ela protegeu as plantas contra danos de alimentação em folhas e barbas causados seja pela CEW seja pela lagarta-militar (FAW), Spodoptera frugiperda. Estes resultados são surpreendentes já que a CrylDa foi anteriormente relatada como não sendo ativa contra CEW (Karim, 2000) e ativa somente contra FAW (Van Frankenhuyzen, 2009). A proteína inseticida CrylDa é conheci- da; entretanto, esta invenção apresenta um uso novo e inesperado da CrylDa para prevenir danos graves causados pela CEW em plantas, especialmente plantas de cultivo. [0027] Helicoverpa zea tem um hábito alimentar polífago quando larvas. Ela se alimenta de preferência de estruturas reprodutoras e te- cidos em desenvolvimento que são ricos em nitrogênio, tais como a barba, espiga, sabugo e pendão de milho, casulo e botão de algodão, assim como vagem de soja. Este é um inseto muito significativo (praga para culturas) por causa dos danos em plantas que impactam direta- mente o rendimento da cultura. Além do milho, a CrylDa é útil para controlar esta espécie de inseto em culturas de grande valor tais como algodão e soja, assim como vegetais tais como tomates. [0028] O gerenciamento de resistência a insetos (IRM) descreve práticas agrícolas usadas para reduzir o potencial de que pragas de inseto tornem-se resistentes a um pesticida. O IRM é de grande impor- tância no que diz respeito ao uso de toxinas Cry em plantas de cultivo importantes porque a resistência a insetos impõem numerosas amea- ças ao uso de toxinas Cry em culturas transgênicas. Estratégias espe- cíficas do IRM, tais como a alta dose e o refúgio estruturado são capa- zes de diminuir a probabilidade de que os insetos desenvolvam resis- tência a certas toxinas Cry. Práticas eficazes do IRM podem reduzir o risco de desenvolvimento de resistência. [0029] Em seu website, a Agência de Proteção Ambiental dos Es- tados Unidos ("United States Environmental Protection Agency") (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) pu- blica as seguintes exigências para oferecer refúgios compostos de plantas não contendo a toxina Cry para uso com culturas transgênicas produtoras de uma única toxina Cry ativa contra pragas alvo. "As exigências estruturadas específicas para produtos de milho Bt pro- tegido contra brocas (CrylAb ou Cry1F) com são as seguintes: - Refúgios estruturados: 20% de refúgio de milho Bt não lepidópetero em cinturão de milho; 50% de refúgio Bt não lepidópetero em cinturão de algodão - Blocos Internos (i.e., dentro do campo Bt) Externos (i.e., campos separados de 0,8 km (½ milha) (0,4 km (Va milha) se possível) do campo Bt para maximizar o acasalamen- to aleatório) - Faixas em campo As faixas devem ter pelo menos 4 fileiras de largura (de preferência (6 fileiras) para reduzir os efeitos do movimento larval" [0030] Além disso, a Associação Nacional dos Produtores de Mi- lho, em seu website: (ncga.com/insect-resistance-management-fact- sheet-bt-corn) também oferece orientações similares referentes às exigências de refúgio. Por exemplo: "Exigências do IRM da broca do milho: - Plantar pelo menos 20% de seus acres de milho com híbridos de re- fúgio - Nas regiões produtoras de algodão, o refúgio deve ser de 50% - Devem ser plantadas a 0,8 km (1/2 milha) dos híbridos de refúgio - O refúgio pode ser plantado como faixas dentro do campo Bt; as fai- xas de refúgio devem ter pelo menos 4 fileiras de largura - O refúgio deve ser tratado com pesticidas convencionais somente se limiares econômicos forem atingidos para o inseto alvo - Inseticidas borrifáveis à base de Bt não podem ser usados no milho de refúgio - Refúgio apropriado deve ser plantado em toda fazenda com milho Bt" [0031] Existem várias maneiras de oferecer os efeitos de IRM de um refúgio, incluindo vários padrões geométricos de plantio nos cam- pos (como mencionado acima) e misturas de sementes ensacadas, como discutido acima por Roush et al. (supra), e na Patente US N° 6,551,962. [0032] Toxinas de inseto, e variantes ativas de inseto. Além dos genes e proteínas especificamente exemplificados e discutidos acima, estão incluídas variantes inseticidamente ativas. Pelo termo "variante", os requerentes pretendem incluir fragmentos, certos mutantes de de- leção e de inserção, e certas proteínas de fusão. A proteína CrylDa é uma toxina Cry clássica de três domínios. Como um prefácio para a descrição de variantes da toxina de inseto CrylDa que estão incluídas na invenção, será útil fazer uma rápida revisão da arquitetura das toxi- nas Cry de três domínios em geral e da toxina de inseto CrylDa. [0033] A maioria das moléculas de proteína cristal da delta- endotoxina de Bacillus thuringiensis são compostos de dois segmentos funcionais. A toxina de núcleo resistente à protease é o primeiro seg- mento e corresponde a cerca da primeira metade da molécula de pro- teína. A molécula da protoxina de -130 kDa de comprimento integral é rapidamente processada para o segmento de núcleo resistente por proteases no intestino do inseto. O segmento que é deletado por este processamento será chamado neste relatório de "segmento de proto- xina". Acredita-se que o segmento de protoxina participa na formação de cristais de toxina (Arvidson et al., (1989). O segmento de protoxina pode assim transmitir uma especificidade parcial inseto para a toxina limitando a acessibilidade do núcleo para o inseto reduzindo o proces- samento de protease da molécula de toxina (Haider et al., (1986) ou reduzindo a solubilidade da toxina (Aronson et al., (1991). As toxinas de B.t., mesmo dentro de uma determinada classe, variam um pouco em termos de comprimento e da localização exata da transição da porção toxina de núcleo para a porção protoxina. A transição da por- ção toxina de núcleo para a porção protoxina vai ocorrer tipicamente entre cerca de 50% a cerca de 60% da toxina de comprimento integral. [0034] Estruturas cristalinas tridimensionais foram determinadas para Cry1Aa1, Cry2Aa1, Cry3Aa1, Cry3Bb1, Cry4Aa, Cry4Ba e Cry8Ea1. Estas estruturas para as toxinas de núcleo são acentuada- mente semelhantes e são compostas de três domínios distintos (revis- to em de Maagd et al., 2003). [0035] Variantes de toxinas de inseto criadas fazendo-se um nú- mero limitado de delecões, substituições, ou adições de aminoácidos.

Deleções, substituições, e adições de aminoácidos às sequências aminoacídicas exemplificativos podem ser feitas facilmente de forma sequencial e os efeitos de tais variações sobre a atividade inseticida podem ser testadaos por bioensaio. Visto que o número de alterações é de número limitado, tal ensaio não envolve experimentação excessi- va. A invenção inclui variantes inseticidamente ativas da toxina de nú- cleo nas quais até 10, ou até 15, ou até 20 adições, deleções, ou subs- tituições de aminoácidos foram feitas. [0036] Estão incluídas variantes inseticidamente ativas de CrylDa que são, inclusive aquelas tendo um segmento de toxina de núcleo que é, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticas a uma se- quência aminoacídica exemplificada como usada neste relatório.

Também estão incluídas proteínas ativas similares tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, ou 94% de identidade com uma sequência exemplificada. [0037] Segundo procedimentos de nomenclatura oficiais, a no- menclatura Cry e B.t. baseia-se em limites de aproximadamente 95% (Cry1Da’s, por exemplo), 78% (Cry1D's), e 45% (CryTs) de identidade de sequência, segundo a "Revision of the Nomenclature for the Baci- llus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins," N. Crickmore, D.R. Zei- gler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, & D.H.

Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. [0038] As variantes podem ser feitas por meio de mutações aleató- rias ou as variantes podem ser desenhadas. No caso de mutantes de- senhados, há uma grande probabilidade de gerar variantes com ativi- dade similar àquela da toxina nativa quando a identidade dos aminoá- cidos é mantida em regiões críticas da toxina que é responsável pela atividade biológica ou que estão envolvidas na determinação da con- figuração tridimensional que é essencialmente responsável pela ativi- dade biológica. Uma grande probabilidade de conservar a atividade também vai ocorrer se as substituições forem conservativas. Os ami- noácidos podem ser agrupados nas seguintes classes: não polar, polar não carregado, básico, e ácido. Substituições conservativas por meio das quais um aminoácido de uma classe é substituído por outro ami- noácido do mesmo tipo são menos prováveis de alterar materialmente a atividade biológica da variante. A seguir encontram-se listados exemplos de aminoácidos pertencentes a cada classe. [0039] Em alguns casos, substituições não conservativas também podem ser feitas. O fator crítico é que estas substituições não devem diminuir significativamente a atividade biológica da toxina. As variantes incluem polipeptídios que diferem em termos da sequência aminoací- dica devido à mutagênese. As proteínas variantes abrangidas pela presente invenção biologicamente ativas, isto é, elas continuam tendo a atividade biológica desejada da proteína nativa, isto é, conservam a atividade pesticida. [0040] Também é possível desenhar proteínas variantes que dife- rem no nível de sequência, mas que conservam a mesma estrutura tridimensional essencial global ou estrutura similar, a mesma distribui- ção superficial de cargas ou distribuição similar, entre outros fatores.

Vide por exemplo a Patente US N° 7058515; Larson et al., (2002);

Stemmer (1994a, 1994b, 1995); e Crameri et al., (1996a, 1996b, 1997). [0041] Ácidos nucleicos. Ácidos nucleicos isolados codificando toxinas de inseto CrylDa constituem um aspecto da presente inven- ção. Este inclui os novos usos em questão de ácidos nucleicos codifi- cando a SEQ ID 2, SEQ ID N* 4, e SEQ ID N* 6, e complementos das mesmas, assim como outros ácidos nucleicos que codificam vari- antes inseticidamente ativas. Por "isolado" as requerentes querem di- zer que as moléculas de ácido nucleico foram retiradas de seu ambi- ente nativo e foram colocadas em um ambiente diferente pela mão do homem. Por causa da redundância do código genético, uma variedade de diferentes sequências de DNA podem codificar as sequências ami- noacídicas divulgadas nesta invenção. O especialista bastante experi- ente sabe como criar estas sequências de DNA alternativas codifican- do as mesmas, ou essencialmente as mesmas, toxinas. [0042] Sequências codificadoras da presente invenção podem ser operacionalmente ligadas a um promotor heterólogo, inclusive um promotor não-S.f. Tais sequências podem ser incluídas em constru- ções de expressão, cassetes de transformação, e cassetes de expres- são inclusive aqueles presentes de forma reproduzível no genoma de uma planta, por exemplo. [0043] Síntese de genes. Genes codificando as proteínas Cry me- lhoradas descritas nesta invenção podem ser feitos por uma variedade de métodos bastante conhecidos na literatura. Por exemplo, segmen- tos gênicos sintéticos e genes sintéticos podem ser feitos pela química de fosfito triéster e fosforamidita (Caruthers et ai, 1987), e fornecedo- res comerciais encontram-se à disposição para a realização de síntese de genes por encomenda. Genes de comprimento integral podem ser agrupados de diversas maneiras incluindo, por exemplo, por ligação de fragmentos de restrição ou agrupamento por reação em cadeia da polimerase de oligonucleotídeos sobrepostos (Stewart & Burgin, 2005).

Além disso, deleções de genes terminais podem ser feitas por amplifi- cação por PCR usando oligonucleotídeos terminais sítio-específicos. [0044] Ácidos nucleicos codificando as toxinas de inseto CrylDa podem ser feitos, por exemplo, por construção sintéticas por métodos praticados atualmente por qualquer um dos diversos fornecedores co- merciais. (Vide, por exemplo, a Patente US N° 7482119 B2). Estes genes, ou porções ou variantes dos mesmos, também podem ser construídos sinteticamente, por exemplo, pelo uso de um sintetizador de genes e os métodos de desenho, por exemplo, da Patente US N° 5380831. Alternativamente, variações de genes sintéticos ou de ocor- rência natural podem ser facilmente construídas por técnicas tradicio- nais da biologia molecular para fazer mutações pontuais. Fragmentos desses genes também podem ser feitos usando-se exonucleases ou endonucleases comercialmente disponíveis de acordo com procedi- mentos tradicionais. Por exemplo, enzimas tais como Bal31 ou muta- gênese sítio-direcionada podem ser usadas para sistematicamente recortar nucleotídeos das extremidades desses genes. Também, fra- gmentos gênicos que codificam fragmentos da toxina ativa podem ser obtidos usando-se uma variedade de enzimas de restrição. [0045] Dada a sequência aminoacídica para uma toxina de inseto CrylDa, é possível desenhar uma sequência codificadora por transla- ção invertida da sequência aminoacídica usando códons preferidos pelo hospedeiro desejado, e em seguida refinamento da sequência usando códons alternativos para remover as sequências que poderíam causar problemas e oferecer códons de interrupção periódica para eliminar sequências codificadoras abertas compridas nas fases de lei- tura não codificadoras. [0046] Quantificação da identidade de sequência. Para determinar a percentagem de identidade de duas sequências aminoacídicas ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para efeitos de comparação ideal. A percentagem de identidade entre as duas sequências é função do número de posições idênticas com- partilhadas pelas sequências (i.e., percentagem de identidade = núme- ro de posições idênticas/número total de posições (por exemplo, posi- ções sobrepostas) x100). Em uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento. A percentagem de identidade entre as du- as sequências pode ser determinada por meio técnicas similares àque- las descritas abaixo, com ou sem permissão de lacunas. No cálculo da percentagem de identidade, são tipicamente contadas as correspon- dências exatas. [0047] A determinação da percentagem de identidade entre duas sequências pode ser feita por meio de um algoritmo matemático. Um exemplo não limitativo de tal algoritmo é aquele de Altschul et al. (1990), e Karlin e Altschul (1990), modificado como em Karlin e Al- tschul (1993), e incorporado nos programas BLASTN e BLASTX. Bus- cas no BLAST podem ser convenientemente usadas para identificar sequências homólogas (similares) a uma sequência de consulta em bancos de dados de ácidos nucleicos ou proteínas. Buscas no BLASTN podem ser efetuadas (escore = 100, tamanho da palavra = 12) para identificar sequências nucleotídicas tendo homologia com as moléculas de ácido nucleico reivindicadas invenção. Buscas no BLASTX podem ser efetuadas (escore = 50, tamanho da palavra = 3) para identificar sequências aminoacídicas tendo homologia com as moléculas de proteína inseticida reivindicadas invenção. [0048] Gapped BLAST Altschul et ai, (1997) pode ser utilizado pa- ra obter alinhamentos com hiatos para efeitos de comparação. Alterna- tivamente, PSI-Blast pode ser usado para a realização de uma busca iterada que detecta relações distantes entre moléculas Altschul et al., (1997). Quando os programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI-Blast são utilizados, os parâmetros de default dos respectivos programas podem ser usados. Vide www.ncbi.nlm.nih.gov. [0049] Um exemplo não limitativo de um algoritmo matemático uti- lizado para a comparação de sequências é o algoritmo ClustalW (Thompson et ai, (1994). O ClustalW compara sequências e alinha a sequência inteira de aminoácidos ou de DNA, e por conseguinte pode fornecer dados sobre a conservação de sequência da sequência ami- noacídica ou sequência nucleotídica inteiras. O algoritmo ClustalW é usado em vários pacotes de software de análise de DNA/aminoácidos comercialmente disponíveis, tais como o módulo ALIGNX da Vector NTI Program Suite (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Quando sequên- cias aminoacídicas são alinhadas com o ALIGNX, é possível usar con- venientemente as configurações de default com um penalty de abertu- ra de hiato de 10, um penalty de extensão de hiato de 0.1 e a matriz de comparação blosum63mt2 para avaliar a percentagem de seme- lhança (consenso) de aminoácidos ou de identidade entre as duas se- quências. Quando sequências de DNA são alinhadas com o ALIGNX, é possível usar convenientemente as configurações de default com um penalty de abertura de hiato de 15, um penalty de extensão de hiato de 6.6 e a matriz de comparação swgapdnamt para avaliar a percen- tagem de identidade entre as duas sequências. [0050] Um outro exemplo não limitativo de um algoritmo matemáti- co utilizado para a comparação de sequências é aquele de Myers e Miller (1988). Tal algoritmo está incorporado no programa wSTRET- CHER, que faz parte do pacote de softwares de alinhamento de se- quências wEMBOSS (disponível em http://emboss.sourceforge.net/). O wSTRETCHER calcula um alinhamento global ideal de duas sequên- cias usando uma modificação do algoritmo de programação dinâmica clássico que usar o espaço linear. A matriz de substituição, o "penalty de inserção de hiato" e os "penalties de extensão de hiato" usados pa- ra calcular o alinhamento podem ser especificados. Quando se utiliza o programa wSTRETCHER para comparar sequências nucleotídicas, um penalty de abertura de hiato de 16 e um penalty de extensão de hiato de 4 podem ser usados com o arquivo de matrizes de classifica- ção EDNAFULL. Quando usado para comparar sequências aminoací- dicas, um penalty de abertura de hiato de 12 e um penalty de extensão de hiato de 2 podem ser usados com o arquivo de matrizes de classifi- cação EBLOSUM62. [0051] Um outro exemplo não limitativo de um algoritmo matemáti- co utilizado para a comparação de sequências é aquele de Needleman e Wunsch (1970), que está incorporado no pacote de softwares de ali- nhamento de sequências GAP versão 10 e wNEEDLE (http://emboss.sourceforge.net/). GAP versão 10 pode ser usado para determinar a identidade ou semelhança de sequências usando os se- guintes parâmetros: para uma sequência nucleotídica, a % de identi- dade e a % de semelhança são encontradas usando "gap weight" de 50 e "length weight" de 3, e a matriz de classificação nwsgapdna. cmp. Para comparação de sequências aminoacídicas, a % de identi- dade e a % de semelhança são determinadas usando "gap weight" de 8 e "length weight" de 2, e o programa de classificação BLOSUM62. [0052] O wNEEDLE lê duas sequências de entrada, encontra o alinhamento ideal (incluindo hiatos) em todo o seu comprimento, e es- creve seu alinhamento de sequência global ideal para ser arquivado. O algoritmo explora todos os alinhamentos possíveis e escolhe a melhor, usando uma matriz de classificação que contém valores para cada re- síduo possível ou correspondência de nucleotídeo. O wNEEDLE en- contra o alinhamento com o escore máximo possível, onde o escore de um alinhamento é igual à soma das correspondências retiradas da matriz de classificação, menos os penalties que surgem da abertura e extensão de hiatos nas sequências alinhadas. A matriz de substituição e os penalties de abertura e extensão de hiatos são especificados pelo usuário. Quando sequências aminoacídicas são comparadas, um pe- nalty de abertura de hiato de default de 10, um penalty de extensão de hiato de 0.5, e a matriz de comparação EBLOSUM62 são usados.

Quando sequências de DNA são comparadas pelo wNEEDLE, um pe- nalty de abertura de hiato de 10, um penalty de extensão de hiato de 0.5, e a matriz de comparação EDNAFULL são usados. [0053] Programas equivalentes também podem ser usados. Por "programa equivalente" entende-se qualquer programa de comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento tendo correspondências idênticas de resíduos nucleo- tídicos ou aminoacídicos e uma percentagem de identidade de se- quência idêntica quando comparadas ao alinhamento correspondente gerado pelo ALIGNX, wNEEDLE, ou wSTRETCHER. A % de identida- de é a percentagem de correspondências idênticas entre as duas se- quências na região alinhada reportada (incluindo todos os hiatos no comprimento) e a % de semelhança é a percentagem de correspon- dências entre as duas sequências na região alinhada reportada (inclu- indo todos os hiatos no comprimento). [0054] O alinhamento também pode ser feito manualmente por inspeção. [0055] Hospedeiros recombinantes. Os genes codificadores de toxina de inseto da presente invenção podem ser introduzidos em am- pla variedade de hospedeiros microbianos ou vegetais. A expressão do gene de toxina de inseto resulta, direta ou indiretamente, na produ- ção intracelular e manutenção da proteína pesticida. Com hospedeiros microbianos adequados, por exemplo, Pseudomonas, os micróbios podem ser aplicados ao ambiente da praga, onde eles vão proliferar e ser ingeridos. O resultado é um controle da praga. Alternativamente, o micróbio que hospeda o gene de toxina de inseto pode ser tratado em condições que prolongam a atividade da toxina e estabilizam a célula. A célula tratada, que conserva a atividade tóxica, pode ser então apli- cada ao ambiente da praga-alvo. Células vegetais não regeneráveis / não totipotentes provenientes de uma planta da presente invenção (compreendendo pelo menos um dos genes da toxina Cry em questão) estão incluídas na presente invenção. [0056] Quando o gene da toxina de B.t. é introduzido em um vetor adequado em um hospedeiro microbiano, e o referido hospedeiro é aplicado ao ambiente ainda vivo, é essencialmente que certos micró- bios hospedeiros sejam usados. São selecionados hospedeiros de mi- cro-organismos que sabidamente ocupam a "fitosfera" (filoplano, filos- fera, rizosfera, e/ou rizoplano) de uma ou mais culturas de interesse.

Estes micro-organismos são selecionados de forma a serem capazes de competir com êxito no ambiente particular (cultura e outros habitats de insetos) com os micro-organismos indígenas do tipo selvagem, proporcionar manutenção e expressão estável do gene expressando o pesticida polipeptídico, e, desejavelmente, proporcionar proteção me- lhorada do pesticida contra degradação e inativação ambiental. [0057] São conhecidos um grande número de micro-organismos que habitam o filoplano (a superfície das folhas das plantas) e/ou a rizosfera (o solo em torno das raízes das plantas) de uma ampla varie- dade de culturas importantes. Estes micro-organismos incluem bacté- rias, algas, e fungos. De particular interesse são micro-organismos, tais como bactérias, por exemplo, do gênero Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Sinorhi- zobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Aceto- bacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, e Alca- ligenes; fungos, particularmente leveduras, por exemplo do gênero Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, e Aureobasidium. De particular interesse são espécies bacterianas da fitosfera tais como Pseudomonas syringae, Pseudomo- nas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobac- terium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Sinorhizobium meliloti (antiga Rhizobium meliloti), Alcaligenes eutrophus, e Azotobacter vinelandir, e espécies de leveduras da fitosfera tais como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Spo- robolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, e Aureobasi- dium pollulans. De particular interesse são os micro-organismos pig- mentados. [0058] Métodos de controle de pragas de inseto. Quando um inse- to entra em contato com uma quantidade eficaz de toxina distribuída via expressão em planta transgênica, composições proteicas formula- das, composições proteicas borrifáveis, uma matriz de isca ou outro sistema de distribuição, os resultados são tipicamente morte do inseto, ou os insetos não se alimentam da fonte que disponibiliza as toxinas para os insetos. [0059] As toxinas proteicas em questão podem ser "aplicadas" ou oferecidas para contatar os insetos alvo de diversas maneiras. Por exemplo, plantas transgênicas (onde a proteína é produzida pela plan- ta e está presente na mesma) podem ser usadas e são bastante co- nhecidas na literatura. A expressão dos genes da toxina também pode ser obtida seletivamente em tecidos específicos das plantas, tais como raízes, folhas etc. Isto também pode ser feito via o uso de promotores tecido-específicos, por exemplo. Aplicações do tipo spray-on são um outro exemplo e também são conhecidas na literatura. As proteínas em questão podem ser apropriadamente formuladas para o uso final desejado, e então borrifadas (ou aplicadas de alguma outra forma) so- bre a planta e/ou em torno da planta / nas proximidades da planta a ser protegida - antes de a infestação ser descoberta, depois que os insetos alvo são descobertos, antes e depois, entre outros. Iscas em grânulos, por exemplo, também podem ser usadas e são conhecidas na literatura. [0060] Planta transqênica. As proteínas em questão podem ser usadas para proteger praticamente todo tipo de planta contra danos causados por uma praga de inseto. Exemplos de tais plantas incluem milho, girassol, soja, algodão, canola, arroz, sorgo, trigo, cevada, ve- getais, plantas ornamentais, pimentas (incluindo pimentas quentes), beterraba, frutas, e relvas, para mencionar apenas algumas. Métodos para a transformação de plantas são bastante conhecidos na literatura, e métodos de transformação ilustrativos estão descritos nos Exemplos. [0061] Uma modalidade preferida da presente invenção é a trans- formação de plantas com genes codificando a proteína inseticida em questão ou suas variantes. As plantas transformadas são resistentes ao ataque por uma praga de inseto alvo em virtude da presença de quantidades controladas da proteína inseticida em questão ou suas variantes nas células da planta transformada. Com a incorporação de material genético que codifica as propriedades inseticidas das toxinas inseticidas de B.t. no genoma de uma planta comida por uma praga de inseto particular, o adulto ou as larvas morrem depois de consumir a planta. Numerosos membros das classificações monocotiledôneas e dicotiledôneas já foram transformados. Culturas agronômicas transgê- nicas assim como frutas e vegetais são de interesse de comercial. Tais culturas incluem, porém sem limitação, milho, arroz, soja, canola, gi- rassol, alfafa, sorgo, trigo, algodão, amendoim, tomate, batata, entre outras. Existem várias técnicas para a introdução de material genético estranho em células vegetais, e para a obtenção de plantas que man- têm e expressam estavelmente o gene introduzido. Tais técnicas in- cluem aceleração de material genético aplicado sobre micropartículas diretamente para dentro das células (Patente US N° 4945050 e Paten- te US N° 5141131). As plantas podem ser transformadas pela tecno- logia de Agrobacterium, vide Patente US N° 5177010, Patente US N° 5104310, Pedido de Patente Européia N°0131624B1, Pedido de Pa- tente Européia N° 120516, Pedido de Patente Européia N°159418B1, Pedido de Patente Européia N° 176112, Patente US N° 5149645, Pa- tente US N° 5469976, Patente US N° 5464763, Patente US N° 4940838, Patente US N° 4693976, Pedido de Patente E uropeia N° 116718, Pedido de Patente Européia N° 290799, Pedido de Patente Européia N° 320500, Pedido de Patente Européia N°6 04662, Pedido de Patente Européia N° 627752, Pedido de Patente Eu ropeia N° 0267159, Pedido de Patente Européia N° 0292435, Patente US N° 5231019, Patente US N° 5463174, Patente US N° 47627 85, Patente US N° 5004863, e Patente US N° 5159135. Outra tecn ologia de trans- formação inclui a tecnologia WHISKERS™, vide Patente US N° 5302523 e Patente US N° 5464765. A tecnologia de e letroporação também já foi usada para transformar plantas, vide documento WO 87/06614, Patente US N° 5472869, Patente US N° 5384 253, docu- mento WO 9209696, e documento WO 9321335. Todas estas patentes e publicações sobre transformação estão aqui incorporadas a título de referência. Além das numerosas tecnologias para transformar plantas, o tipo de tecido que é contatado com os genes estranhos também po- de variar. Tais tecidos incluem, porém sem limitação, tecido embriogê- nico, tecido caloso tipo I e II, hipocótilo, meristema, entre outros. Qua- se todos os tecidos vegetais podem ser transformados durante a des- diferenciação usando-se técnicas apropriadas conhecidas pelo espe- cialista na técnica. [0062] Genes codificando as toxinas inseticidas CrylDa podem ser inseridos em células vegetais por meio de uma variedade de técnicas que são bastante conhecidas na literatura divulgada acima. Por exem- plo, um grande número de vetores de clonagem compreendendo um marcador que permite a seleção das células microbianas transforma- das e um sistema de replicação funcional em Escherichia coli encon- tram-se disponíveis para a preparação e modificação de genes estra- nhos para inserção em plantas superiores. Tais manipulações podem incluir, por exemplo, a inserção de mutações, truncamentos, adições, ou substituições conforme desejado para o uso a que se destina. Os vetores compreendem, por exemplo, pBR322, série pUC, série M13mp, pACYC184, etc. Assim sendo, a sequência codificando a pro- teína Cry ou variantes pode ser inserida no vetor em um sítio de restri- ção adequado. O plasmídio resultante é usado para transformação de E. coli, cujas células são cultivadas em um meio nutriente adequado, e então colhidas e lisadas para que quantidades viáveis do plasmídio sejam recuperadas. Análise de sequências, análise de fragmentos de restrição, eletroforese, e outros métodos da bioquímica-biologia mole- cular são geralmente efetuados como métodos de análise. Depois de cada manipulação, a sequência de DNA usada pode ser clivada e uni- da à sequência de DNA seguinte. Cada sequência de DNA manipula- da pode ser clonada no mesmo plasmídio ou em outros plasmídios. [0063] O uso de vetores contendo T-DNA para a transformação de células vegetais já foi extensamente pesquisado e suficientemente descrito no Pedido de Patente Européia N° 120516; Lee e Gelvin (2008), Fraley et al., (1986), e An et al., (1985), e está bem consolida- do no campo. [0064] Depois que o DNA inserido é integrado no genoma da plan- ta, ele é relativamente estável em todas as gerações subsequentes. O vetor usado para transformar a célula vegetal normalmente contém um gene marcador selecionável codificando uma proteína que confere às células vegetais transformadas resistência a um herbicida ou a um an- tibiótico, tal como bialaphos, canamicina, G418, bleomicina, ou higro- micina, inter alia. O gene marcador selecionável empregado individu- almente deve, por conseguinte, permitir a seleção de células transfor- madas ao passo que o crescimento de células que não contêm o DNA inserido é suprimido pelo composto seletivo. [0065] Um grande número de técnicas está disponível para a in- serção de DNA em uma célula vegetal hospedeira. Essas técnicas in- cluem transformação com T-DNA distribuído por Agrobacterium tume- faciens ou Agrobacterium rhizogenes como o agente de transforma- ção. Adicionalmente, a fusão de protoplastos vegetais com lipossomas contendo o DNA a ser distribuído, injeção direta do DNA, transforma- ção biolística (bombardeamento de micropartículas), ou eletroporação, assim como outros métodos possíveis, podem ser empregados. [0066] Em uma modalidade preferida da presente invenção, as plantas serão transformadas com genes nos quais o uso de códon da região codificadora da proteína fora otimizado para plantas. Vide, por exemplo, Patente US N° 5380831, que está aqui incorporada a título de referência. Também, vantajosamente, plantas codificando uma to- xina truncada serão usadas. A toxina truncada tipicamente codificará cerca de 55% a cerca de 80% da toxina de comprimento integral. Mé- todos para criar genes de B.t. sintéticos para uso em plantas são co- nhecidos na literatura (Stewart 2007). [0067] Independente da técnica de transformação, o gene é de preferência incorporado em um vetor de transferência de genes adap- tado para expressar os genes da toxina inseticida de B.t. e variantes na célula vegetal incluindo no vetor um promotor vegetal. Além de promotores vegetais, promotores oriundos de diversas fontes podem ser usados de forma eficiente em células vegetais para expressar ge- nes estranhos. Por exemplo, promotores de origem bacteriana, tais como o promotor da octopina sintase, o promotor da nopalina sintase, o promotor da manopina sintase; promotores de origem viral, tais co- mo os promotores 35S e 19S do vírus do mosaico da couve-flor, entre outros, podem ser usados. Promotores vegetais incluem, porém sem limitação, a subunidade pequena da ribulose-1,6-bisfosfato (RUBP) carboxilase (ssu), o promotor da beta-conglicinina, o promotor da fa- seolina, o promotor da ADH (álcool desidrogenase), promotores do choque térmico, o promotor da ADF (fator de despolimerização da ac- tina), e promotores tecido-específicos. Os promotores também podem conter certos elementos de sequência intensificadores que podem me- lhorar a eficiência de transcrição. Intensificadores típicos incluem, po- rém sem limitação, ADH1-íntron 1 e ADH1-íntron 6. Promotores consti- tutivos podem ser usados. Promotores constitutivos direcionam a ex- pressão gênica contínua em praticamente todos os tipos de células e praticamente o tempo todo (por exemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S). Promotores tecido-específicos são responsáveis pela expressão gênica em tipos específicos de células ou tecidos, tais como as folhas ou sementes (por exemplo, zeína, oleosina, napina, ACP (proteína transportadora de acila)), e estes promotores também podem ser usa- dos. Também podem ser usados promotores que são ativos durante um certo estágio do desenvolvimento das plantas e também ativos em tecidos e órgãos específicos das plantas. Exemplos de tais promotores incluem, porém sem limitação, promotores que são raiz-específicos, pólen-específicos, embrião-específicos, barba de milho-específicos, fibra de algodão-específicos, endosperma de semente-específicos, floema-específicos, entre outros. [0068] Em certas circunstâncias pode ser desejável usar um pro- motor induzível. Um promotor induzível é responsável pela expressão de genes em respota a um sinal específico, tal como: estímulo físico (por exemplo, genes de choque térmico); luz (por exemplo RUBP car- boxilase); hormônio (por exemplo, glucocorticoide); antibiótico (por exemplo, tetraciclina; metabólitos; e estresse (por exemplo seca). Ou- tros elementos de transcrição e translação desejáveis que funcionam em plantas podem ser usados, tais como sequências líder não transla- dadas 5', sequências de término de transcrição de RNA e sequências de sinal de adição de poliadenilato. Numerosos vetores de transferên- cia de genes planta-específicos são conhecidos na literatura. [0069] Culturas transgênicas contendo traços de resistência a in- setos (IR) são predominantes em plantas de milho e algodão em toda a América do Norte, e o uso desses traços vem se expandindo no mundo inteiro. Culturas transgênicas comerciais combinando traços de IR e traços de tolerância a herbicidas (HT) já foram desenvolvidas por diversas empresas produtoras de sementes. Estas incluem combina- ções de traços de IR conferidos por proteínas inseticidas de B.t. e tra- ços de HT tais como tolerância a inibidores da acetolactato sintase (ALS) tais como sulfonilureias, imidazolinonas, triazolopirimidina, sul- fonanilidas, entre outros, inibidores da glutamina sintetase (GS) tais como bialaphos, glufosinato, entre outros, inibidores da 4- hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) tais como mesotriona, isoxa- flutol, entre outros, inibidores da 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sin- tase (EPSPS) tais como glifosato, entre outros, e inibidores da acetil- coenzima A carboxilase (ACCase) tais como haloxyfop, quizalofop, diclofop, entre outros. São conhecidos outros exemplos nos quais pro- teínas fornecidas de forma transgênica proporcionam tolerância da planta a classes químicas de herbicidas tais como herbicidas à base de fenóxi ácidos e herbicidas à base de piridiloxiacetatos auxina (vide documento WO 2007/053482 A2), ou herbicidas à base de fenóxi áci- dos e herbicidas à base de ariloxifenoxipropionatos (vide documento WO 2005107437 A2, A3). A capacidade de controlar vários problemas de pragas através de traços de IR é um conceito de produto comercial valioso, e a conveniência deste conceito de produto será reforçada se traços de controle de insetos e traços de controle de ervas daninhas forem combinados na mesma planta. Além disso, valor melhorado po- de ser obtido via combinações vegetais individuais de traços de IR conferidos por uma proteína inseticida de B.t. tal como aquela da pre- sente invenção com um ou mais traços de HT adicionais tais como aqueles mencionados acima, mais um ou mais traços de entrada adi- cionais (por exemplo, outro tipo de resistência a insetos conferida por proteínas inseticidas derivadas de B.t. ou outras proteínas inseticidas, resistência a insetos conferida por mecanismos tais como RNAi e simi- lares, resistência a doenças, tolerância ao estresse, utilização melho- rada de nitrogênio, entre outros), ou traços de saída (por exemplo alto teor de óleos, composição saudável de óleos, melhoramento nutricio- nal, entre outros). Tais combinações podem ser obtidas seja por meio de reprodução convencional (reprodução por estacas) ou conjunta como um novo evento de transformação envolvendo a introdução si- multânea de múltiplos genes (estaquia molecular). Os benefícios in- cluem a possibilidade de controlar pragas de insetos e controle melho- rado de ervas daninhas em uma planta de cultivo que oferece benefí- cios secundários ao produtor e/ou ao consumidor. Por conseguinte, a presente invenção pode ser usada em combinação com outros traços para proporcionar um pacote agronômico completo de qualidade me- lhorada da cultura com a possibilidade de controlar de forma flexível e com custo reduzido qualquer número de questões agronômicas. [0070] Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisó- rios, e publicações mencionados ou citados neste relatório estão in- corporados em sua integridade a título de referência à medida que não são inconsistentes com os ensinamentos explícitos deste relatório descritivo. [0071] A menos que especificamente indicado ou implícito, os ter- mos "um", "uma", e "o/a/os/as" significam "pelo menos um" conforme usado neste relatório. [0072] A seguir encontram-se exemplos que ilustram procedimen- tos para a prática da invenção. Estes exemplos não devem ser inter- pretados como limitativos. Todas as percentagens estão em peso e todas as proporções das misturas de solventes estão em volume a menos que indicado em contrário. Todas as temperaturas estão em graus Celsius. EXEMPLO 1 Construção de plasmídios codificando DIG-911 e DIG-180, e expres- são em hospedeiros bacterianos [0073] A proteína DIG-911 (toxina inseticida quimérica Cry1 Da2/Cry1 Ab; SEQ ID N* 2) consiste em um segmento de toxina de núcleo de CrylDa (aminoácidos 1 a 594, como divulgado no GENBANK Acesso N° 176415.1 e na Patente US N° 5,691,308) e um segmento de protoxina derivado de CrylAb (DIG-911 aminoácidos 595 a 1139), essencialmente como divulgado no GENBANK Acesso N° AFK79795.1). O uso do segmento de proteína de núcleo CrylDa em combinações com outras toxinas inseticidas Cry ou Vip já foi divulgado na Publicação de Pedidos de Patente NoS 20130007923, 20120331590, 20120331589, e 20120317681, mas o uso da proteína inseticida CrylDa para controlar a lagarta-da-espiga-do-milho (CEW;

Helicoverpa zea (Boddie)) não foi contemplado. [0074] A menos que indicado em contrário, as manipulações usando técnicas da biologia molecular e da bioquímica descritas neste exemplo e nos exemplos subsequentes foram efetuadas por metodo- logias tradicionais como aquelas divulgadas, por exemplo, em Sam- brook et al., eds. (1989 e atualizações, Molecular Cloning: A Labora- tory Manual, 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.), Ausubel et al., eds. (1995 e atualizações, Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York) e Harlow & Lane, eds. (1988, e atualizações, Antibodies: A Labo- ratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY). Métodos de clonagem tradicionais foram usados na construções de plasmídios de expressão de Pseudomonas fluorescens (Pf) cons- truídos geneticamente para produzir as proteínas DIG-911 e DIG-180 (i.e. Cry1Fa2; SEQ ID 4). As preparações dos plasmídios foram feitas usando-se o kit NUCLEOSPIN PLASMID (MACHEREY-NAGEL

Inc, Bethlehem, PA), seguindo-se as instruções de isolamento de plasmídio com baixo número de cópias apresentados pelo fornecedor. [0075] A estratégica de clonagem básica ocasionou a subclona- gem de um fragmento de DNA tendo a sequência codificadora de DIG- 911 ou DIG-180 (CDS), fornecida pela SEQ ID NM e SEQ ID N* 3, respectivamente, em pDOW1169 nos sítios de restrição Spel ou Xòal, e Xho\ ou Sa/I, e dessa forma a CDS de DIG-911 e de DIG-180 CDS foi colocada sob controle de expressão do promotor Ptac e do termi- nador rrnBT1T2 do plasmídio pKK223-3 (PL PHARMACIA, Milwaukee, Wl). pDOW1169 é um plasmídio de médio número de cópias com a origem de replicação RSF1010 e um gene pyrF (Patente US N° 7,618,799). Fragmentos de DNA compreendendo sequências de regi- ões codificadoras de proteínas podem ser clonados em DNA de pDOW1169 DNA em um sítio de restrição a jusante de um sítio de li- gação de ribossoma presente na sequência de pDOW1169 ou, alter- nativamente, um outro sítio de ligação de ribossoma pode ser introdu- zido como uma sequência presente no segmento de região codificado- ra a montante da região codificadora de proteína. DNA do plasmídio de expressão pDOW2848 (DIG-911) foi transformado por eletropora- ção em células DC454 (uma cepa de P. fluorescens de tipo quase sel- vagem tendo as mutações ApyrF e lsc::laclQI), e DNA de pDAB1817 (DIG-180) foi transformado em células MB214). As células transforma- das foram deixadas recuperar em meio à base de hidrolisado de SOC- Soy, e em seguida plaqueadas em meio seletivo (M9 ágar glicose sem uracila ou em meio LB contendo tetraciclina nas concentrações apro- priadas; Sambrook et al., supra). Os detalhes das manipulações mi- crobiológicas para P. fluorescens encontram-se disponíveis em Squi- res et al. (2004), Patente US N° 7,985,564, Patente US N° 7,681,799, e Pedido de Patente US N° 20080058262, aqui incorporados a título de referência. As colônias recombinantes foram identificadas por di- gestão de restrição de DNA de plasmídio miniprep. [0076] Análise do crescimento e expressão em frascos de agita- ção. A produção das proteínas DIG-911 e DIG-180 para caracteriza- ção e bioensaio com insetos foi realizada pela cepa de P. fluorescens cultivada em frasco de agitação DPf150 (ancorando o plasmídio pDOW2848) ou pela cepa Dpf129 (ancorando o plasmídio pDAB1817).

Culturas de inóculo cultivado em meio M9 suplementado com 1% de glicose e elementos de traço foram usadas para inocular 50 mL de meio mínimo definido com 5% de glicerol (TEKNOVA Cat. # 3D7426, Hollister, CA). A expressão dos genes de DIG-911 ou DIG-180 via o promotor Ptac foi induzida pela adição de isopropil-p-D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG) depois de uma incubação inicial de 24 horas a 30° com agitação. As culturas tiveram amostras coletadas no momento da indução e em vários tempos pós-indução. A densidade celular foi medida por densidade ótica a 600 nm (OD600)· Outros meios de cultura adequados para o crescimento de Pseudomonas fluores- cens também podem ser utilizados, por exemplo, como descrito por Huang et al. (2007, Prot [0077] Fracionamento celular e análise por SDS-PAGE de amos- tras em frascos de agitação. Em cada tempo de amostragem alíquotas de 2 ml_ eram centrifugadas a 14000 x g por cinco minutos, e as pelo- tas de células eram armazenadas a -80°. Para extração das proteí- nas, as pelotas eram descongeladas e suspendidas em 0.5 ml_ de tampão fosfato pH7.2. As células foram lisadas por sonicação usando um sonicador BRANSON 250 (BRANSON ULTRASONICS, Danbury CT) usando uma microponteira de 0,3175 cm (1/8 polegada) de diâme- tro com uma produção constante de 20 unidades. Duas explosões de 45 segundos foram usadas com vários minutos de resfriamento da amostra em gelo entre as explosões. Depois que o lisado foi fraciona- do por centrifugação em uma microcentrífuga por 5 minutos a 14.000 rpm, o sobrenadante (fração solúvel) foi removido e a pelota foi sus- pendida em 0.5 ml de tampão fosfato (fração insolúvel). [0078] As amostras foram misturadas 1:3 com 4X tampão de amostra Laemmli contendo β-mercaptoetanol (Sambrook et al., supra.) e fervidas por 5 minutos antes de serem carregadas em um gel Tris de Glicina SDS poliacrilamida a 4-20% NOVEX® (INVITROGEN, Carls- bad, CA). Eletroforese foi efetuada no tampão de corrida Tris Glicina NOVEX® (INVITROGEN). Os géis foram coloridos com o corante Co- omassie da BIO-SAFE de acordo com õ protocolo do fabricante (BIO- RAD Inc., Hercules, CA). [0079] Preparação de corpos de inclusão. Preparações de corpos de inclusão (IB) da proteína Cry foram feitas nas células a partir de fermentações de P. fluorescens que produziram a proteína inseticida insolúvel de B.t., segundo demonstrado por SDS-PAGE e MALDI-MS (dessorção a laser assistida por matriz/espectrometria de massas por ionização). As pelotas de fermentação de P. fluorescens foram des- congeladas em um banho de água a 37°. As células foram ressuspen- sas a 25% p/v em tampão de lise (50 mM de Tris, pH 7.5, 200 mM de NaCI, 20 mM de sal dissódico de EDTA (ácido etilenodiaminatetra- acético), 1% de Triton X-100, e 5 mM de ditiotreitol (DTT); 5 mL/L de coquetel de inibidores de protease bacteriana (P8465 SIGMA- ALDRICH, St. Louis, MO) foram acrescentados imediatamente antes do uso. Uma suspensão perfeita foi obtida usando-se um homogenei- zador manual na configuração mais baixa (TISSUE TEAROR™, BIOSPEC PRODUCTS, Inc., Bartlesville, OK). Lisozima (25 mg de SIGMA L7651, de clara de ovo de galinha) foi adicionada à suspensão de células por misturação com uma espátula metálica, e a suspensão foi incubada à temperatura ambiente por uma hora. A suspensão foi resfriada em gelo por 15 minutos, e em seguida sonicada usando-se um sonicador BRANSON 250 (duas sessões de 1 minuto, 50% do ci- clo pesado, 30% de rendimento). A lise celular foi verificada por mi- croscopia. Mais 25 mg de lisozima foram acrescentados, quando ne- cessário, e a incubação e a sonicação foram repetidas. Quando a lise celular foi confirmada via microscopia, o lisado foi centrifugado a 11.500 x g por 25 minutos (4^ para formar a pelota de IB, e o sobre- nadante foi descartado. A pelota de IB foi ressuspensa com 100 ml_ de tampão de lise, homogeneizada com o misturador manual e centrifu- gada da mesma maneira que acima. A pelota de IB foi lavada várias vezes por ressuspensão (em 50 mL de tampão de lise), homogeneiza- ção, sonicação, e centrifugação até que o sobrenadante ficasse incolor e a pelota de IB ficasse de cor esbranquiçada. Para a lavagem final, a pelota de IB foi ressuspensa em água destilada (0.22 pm) filtrada esté- ril contendo 2 mM de EDTA, e centrifugada. A pelota final foi ressus- pensa em "estéril-" [0080] Solubilizacão de corpos de inclusão. Seus mL de suspen- sões de corpos de inclusão dos isolados de Pf DPf150 ou Dpf129 (contendo cerca de 30 mg/mL da proteína DIG-911 ou DIG-180) foram centrifugados na configuração mais alta de uma microcentrífuga (apro- ximadamente 14.000 x g) para pelotizar as inclusões. O sobrenadante de tampão de armazenamento foi removido e substituído por 25 mL de tampão carbonato de sódio 100 mM, pH 11, em um tubo cônico de 50 mL. As inclusões foram ressuspensas usando-se uma pipeta e turbi- Ihonadas para misturação completa. O tubo foi colocado sobre uma plataforma levemente oscilante a 4o por uma noite para extrair a prote- ína alvo. O extrato foi centrifugado a 30.000 x g por 30 minutos a 4o, e o sobrenadante resultante concentrado 5 vezes usando-se um disposi- tivo de filtro centrífugo de celulose regenerada AMICON ULTRA-15 (corte de peso molecular de 30.000; MILLIPORE). O tampão de amostra foi então trocado por CAPS (ácido 3-(ciclo-hexamino)1- propanossulfônico) 10 mM pH10, usando-se colunas PD-10 descartá- veis (GE HEALTHCARE, Piscataway, NJ). [0081] Análise por SDS-PAGE e quantificação da proteína nas preparações de IB foram feitas por descongelamento de uma alíquota de 1 mL da pelota de IB e diluição 1:20 com água destilada filtrada es- téril. A amostra diluída foi então fervida com 4X tampão de amostra redutor (250 mM de Tris, pH6.8, 40% de glicerol (v/v), 0.4% de azul de bromofenol (w/v), 8% de SDS (p/v) e 8% de β-mercapto-etanol (v/v)) e carregada em uma corrida de gel de Tris-glicina NOVEX® a 4-20%, em 12+2 poços (INVITROGEN) com 1X tampão Tris/glicina/SDS (BIO- RAD). O gel operado por aproximadamente 60 minutos a 200 volts e em seguida colorido com azul de Coomassie (50% de G-250/50% de R-250 em 45% de metanol, 10% de ácido acético), e descorado com 7% de ácido acético, 5% de metanol em água destilada. A quantifica- ção de faixas alvo foi feita por comparação dos valores densitométri- cos para as faixas contra amostras de albumina sérica bovina (BSA) operadas no mesmo gel para gerar uma curva padrão. O extrato con- centrado foi preparado por eletroforese por diluição 1:50 em tampão de amostra de LDS NuPAGE® (INVITROGEN) contendo 5 mM de diti- otreitol como agente redutor e aquecido a 95° por 4 minutos. A amos- tra foi carregada em raias em duplicata de gel NuPAGE® a 4-12% ao lado de cinco padrões de BSA variando de 0.2 e 2 pg/faixa (para gerar a curva-padrão). Voltagem foi aplicada a 200 V usando-se tampão de corrida de SDS MOPS (INVITROGEN) até que o corante de rastrea- mento atingisse o fundo do gel. O gel foi colorido com 0.2% de azul de Coomassie G-250 em 45% de metanol, 10% de ácido acético, e des- corado, primeiro rapidamente com 45% de metanol, 10% de ácido acé- tico, e finalmente com 7% de ácido acético, 5% de metanol até que o fundo ficasse claro. Subsequente à descoloração, o gel explorado com um multi-imageador FLUOR-S BIO-RAD. O software QUANTITY ONE v.4.5.2 do instrumento foi usado para obter os volumes subtraídos do valor de referência das faixas de proteína coloridas e para gerar a cur- va padrão para BSA que foi usada para calcular a concentração da proteína DIG-911 ou DIG-180 na solução de estoque. EXEMPLO 2 Atividade das toxinas inseticidas DIG-911 e DIG-180 produzidas em Pseudomonas fluorescens contra larvas de CEW [0082] Preparação de amostras e bioensaios. Preparações de cor- pos de inclusão em 10 mM de CAPS pH 10 foram diluídas no mesmo tampão para distribuir uma dose de 3.000, 1.000, 333,3, 111,1, 37,0, 12,3 ou 4,1 ng/cm2 da proteína CrylDa alvo. Todos os bioensaios con- tinham tratamentos de controle consistindo em 10 mM de tampão CAPS pH 10 ou água, que serviram como verificações de referência quanto à mortalidade ou inibição de crescimento. [0083] As concentrações de proteína no tampão de bioensaio fo- ram estimadas por eletroforese em gel usando BSA para criar uma curva-padrão para densitometria do gel, que foi medida usando-se um sistema de imageamento BIORAD (multi-imageador FLUOR-S com o software QUANTITY ONE versão 4.5.2). As proteínas na matriz de gel foram coloridas com corante à base de azul de Coomassie e descora- das antes da leitura. [0084] Larvas de CEW eclodiram dos ovos adquiridos de uma co- lônia mantida por insetário comercial (BENZON RESEARCH INC., Carlisle, PA). Os bioensaios foram conduzidos em bandejas plásticas de 128 poços especificamente projetadas para bioensaios de insetos (C-D INTERNATIONAL, Pitman, NJ). Cada poço continha 1.5 mL de dieta para múltiplas espécies de Lepidópteros (SOUTHLAND PRODUCTS, Lake Viilage, AR). Uma alíquota de 40 pL da amostra de proteína foi distribuída por meio de uma pipeta para a superfície de 1.5 cm2 da dieta de cada poço (26.7 pL/cm2). As concentrações de dieta foram calculadas como a quantidade (ng) de proteína de toxina inseti- cida por centímetro quadrado (cm2) de área superficial no poço. As bandejas tratadas foram mantidas em uma coifa até que o líquido so- bre a superfície da dieta tivesse evaporado ou sido absorvido na dieta. [0085] 24 a 48 horas depois da eclosão, larvas individuais foram coletadas com uma escova de pelo de camelo umedecida e deposita- das sobre a dieta tratada, uma larva por poço. Os poços infestados foram então vedados com folhas adesivas de plástico transparente, ventiladas para permitir a troca de gás (C-D INTERNATIONAL). As bandejas do bioensaio foram mantidas em condições ambientais con- troladas (28°, -60% de umidade relativa, 16:8 (luz: escuridão)) por 5 dias, e depois disso o número total de insetos expostos à cada amostra de proteína, o número de insetos vivos e mortos, e o peso dos insetos sobreviventes foram registrados. A percentagem de mortalidade e a per- centagem de inibição de crescimento foram calculadas para cada trata- mento. A inibição de crescimento (Gl) foi calculada da seguinte maneira: Gl = [1 — (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)] onde TWIT é o peso total de insetos no tratamento, TNIT é o número total de insetos no tratamento TWIBC é o peso total de insetos na verificação de referên- cia (controle de tampão), e TNIBC é o número total de insetos na verificação de refe- rência (controle de tampão). [0086] Os dados de mortalidade e inibição de crescimento foram analisados por uma regressão logística nominal (P<0.05). A Gl50 foi determinada como sendo a concentração de proteína de toxina inseti- cida na dieta à qual o valor da Gl foi de 50%, e a LC50 (concentração letal para 50%) foi registrada como a concentração de proteína de to- xina inseticida na dieta à qual 50% dos insetos de teste foram elimina- dos. A análise estatística (ANOVA unilateral) foi feita usando-se o sof- tware JMP® Pro (version 9.0.3; SAS, Cary, NC). A Tabela 1 mostra as atividades das proteínas DIG-911 e DIG-180 medidas nos bioen- saios de dieta.

Tabela 1 Atividades das proteínas DIG-911 e CrylFa em bioensaios de dieta contra larvas recém-nascidas de lagarta-da-espiga-do-milho (CEW). * = Intervalo de confiança [0087] Os dados da Tabela 1 documentam a surpreendente des- coberta de que a proteína DIG-911, compreendendo o segmento de toxina de núcleo CrylDa, exibe tanto atividade de mortalidade quanto atividade de inibição de crescimento contra larvas da lagarta-da- espiga-do-milho (CEW). Este resultado contrasta com os resultados reportados por terceiros de que a proteína CrylDa é inativa contra a lagarta-da-espiga-do-milho (See Karim et al. (2000) Pesticide Bioche- mistry and Physiology 67(3):198-216; e Frankenhuyzen (2009) Journal of Invertebrate Pathology. 101:1-16). EXEMPLO 3 Construção de vetores de transformação de plantas [0088] Vetores de entrada Gateway® (INVITROGEN) foram cons- truídos por métodos tradicionais de clonagem molecular. O vetor de entrada pDAB109825 compreende uma sequência codificadora otimi- zada para milho (SEQ ID N* 5) que codifica uma proteína inseticida de toxina de núcleo Cry1Da2 (SEQ ID 6). O vetor de entrada pDAB109840 compreende uma sequência codificadora otimizada para milho que codifica uma proteína inseticida de comprimento integral Cry1Da2. A expressão em planta da sequência codificadora de toxina de núcleo Cry1Da2 fica sob controle de uma cópia de um promotor de ubiquitina 1 de milho com o íntron 1 associado (Patente US N° 5,510,474). Um fragmento compreendendo uma 3'UTR de um gene de peroxidase 5 de milho (ZmPer5 3'UTR; Patente US N° 6,699,984) foi usado para terminar a transcrição do mRNA de Cry1Da2. Um vetor de transformação/expressão (pDAB109841) para transformação de em- brião de milho mediada por Agrobacterium foi construído por meio do uso de métodos tradicionais de clonagem e reações de recombinação Gateway® empregando um vetor binário de destinação típico (pDAB109805) e o vetor de entrada pDAB109825 descrito acima. O vetor binário de destinação pDAB109805 compreende uma região co- difícadora de proteína de tolerância a herbicida AAD-1 (Patente US N° 7,838,733, e Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 107:20240-20245) sob controle de expressão de uma cópia de um promotor de vírus baciliforme de cana-de-açúcar (SCBV; essencial- mente como descrito na Patente US N° 6,093,569). U ma sequência 5'UTR sintética compreendida de sequências de uma 5'UTR do gene da proteína de revestimento do vírus da estria do milho (MSV) e o ín- tron 6 de um gene da álcool desidrogenase 1 de milho (ADH1) é posi- cionada entre a extremidade 3' do segmento do promotor de SCBV e códon de início da região codificadora AAD-1. Um fragmento compre- endendo uma 3'UTR de um gene da lipase de milho (como acima) foi usado para terminar a transcrição do mRNA de AAD-1. [0089] Um vetor binário de controle negativo (pDAB101556) com- preendido de uma região codificadora do gene marcador da proteína fluorescente amarela (YFP) (Shagin et al. (2004) Molecular Biology and Evolution 21:841-850) sob controle de expressão de uma cópia de um promotor da ubiquitina 1 do milho com o íntronl (como acima) e um fragmento compreendendo uma 3'UTR de um gene da peroxidase 5 do milho (ZmPer5 3'UTR; Patente US N° 6,699,984). O pDAB101556 compreende ainda uma região codificadora da proteína de tolerância a herbicidas AAD-1 (como acima) sob controle de ex- pressão de uma segunda cópia do promotor da ubiquitina 1 do milho com o íntronl (como acima), e uma 3'UTR de um gene da lipase de milho (como acima). EXEMPLO 4 Transformação de milho mediada por Agrobacterium [0090] Transformação mediada por Agrobacterium foi usada para integrar estavelmente uma região codificadora da toxina de núcleo Cry1Da2 no genoma da planta e dessa formar gerar células, tecidos, e plantas de milho transgênicas que produzem uma proteína inseticida Cry1Da2 de comprimento integral ou truncada. Métodos de transfor- mação de milho empregando vetores de transformação superbinários ou binários são conhecidos na literatura, como descrito, por exemplo, na Publicação PCT Internacional N° WO2010/120452. Os tecidos transformados foram selecionados por sua capacidade de crescer em meio contendo R-Haloxyfop. [0091] Iniciação da cultura de Aarobacterium. Estoques de glicerol dos vetores de projeto foram providos na cepa hospedeira DAt13192 de Agrobacterium tumefaciens (WO 2012/016222A2). Culturas de Agrobacterium foram semeadas a partir de estoques de glicerol em meio mínimo AB (Watson, et al., (1975) J. Bacteriology 123:255-264) e incubadas a 20Ό no escuro por 3 dias contendo anti bióticos apropria- dos. As culturas foram então semeadas sobre uma placa de meio YEP (gm/L: extrato de levedura, 10; Peptona, 10; NaCI, 5) com antibióticos e incubadas a 20Ό no escuro por 1-3 dias. [0092] No dia de uma experiência, uma mistura de meio de inocu- lação e acetossiringona (Frame et al. (2011) Methods in Molecular Bio- logy 710:327-341) foi preparada em um volume apropriado para o nú- mero de construções na experiência e pipetada em um balão de 250 ml_ estéril de descartável. O meio de inoculação contém: 2.2 gm/L de sais de MS; vitaminas de MS modificado (Frame et al., ibid.) 68.4 gm/L

de sacarose; 36 gm/L de glicose; 115 mg/L de L-prolina; e 100 mg/L de mio-inositol; a um pH 5.4.) Acetossiringona foi adicionada ao balão contendo meio de inoculação até uma concentração final de 200 μΜ a partir de uma solução de estoque 1 M em dimetil sulfóxido a 100%. [0093] Para cada construto, 1 ansada inoculante de Agrobacterium proveniente da placa de YEP foi suspendida em 15 mL da mistura meio de inoculação/acetossiringona dentro de um tubo de centrífuga de 50 mL estéril e descartável, e a densidade ótica da solução a 550 nm (OD550) foi medida em um espectrofotômetro. A suspensão foi en- tão diluída até uma OD550 de 0.3 a 0.4 usando-se mais uma quantida- de da mistura meio de inoculação/acetossiringona. O tubo com a sus- pensão de Agrobacterium foi então colocado horizontalmente sobre um agitador de plataforma ajustado em cerca de 75 rpm à temperatura ambiente e agitado por 1 a 4 horas antes do uso. [0094] Esterilização de espigas e isolamento de embriões. Espigas da linhagem endógama B104 de Zea mays (Hallauer, et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406) foram produzidas em uma estufa e colhi- das 10 a 12 depois da polinização. As espigas colhidas foram descas- cadas e esterilizadas na superfície por imersão em uma solução a 20% de alvejante comercial (alvejante germicida Ultra Clorox®, 6,15% de hipoclorito de sódio; com duas gotas de TWEEN 20) por 20 minu- tos, seguido por três enxagues em água desionizada estéril dentro de uma coifa de fluxo laminar. Embriões zigóticos imaturos (1,8 a 2,2 mm de comprimento) foram assepticamente excisados de cada espiga e distribuídos em um ou mais tubos de microcentrífuga contendo 2,0 mL de suspensão de Agrobacterium à qual foram adicionados 2 pL do tensoativo BREAK-THRU® S233 a 10% (EVONIK INDUSTRIES; Es- sen, Alemanha). [0095] Cocultivo de Agrobacterium. Subsequente ao isolamento, os embriões foram colocados sobre uma plataforma oscilante por 5 minutos. O conteúdo do tubo foi então despejado sobre uma placa de meio de cocultivo, que continha 4,33 gm/L de sais de MS; vitaminas de MS modificado; 30 gm/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH (ácido 3,6-dicloro-o-anísico ou ácido 3,6-dicloro- 2-metoxibenzoico); 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de hidrolisado enzimático de caseína; 15 mg/L de AgN03; 200 μΜ de acetossiringona em DMSO; e 3 gm/L de agar (SIGMA-ALDRICH, cultura de células ve- getais testada) a um 5.8. A suspensão líquida de Agrobacterium foi removida com uma pipeta de transferência estéril e descartável e a placa de cocultivo contendo os embriões foi colocada na parte traseira da coifa de fluxo laminar com a tampa entreaberta por 30 minutos, e depois deste período os embriões foram orientados com o escutelo voltado para cima usando-se um fórceps estéril com a ajuda de um microscópio. A placa foi levada de volta para a coifa de fluxo laminar com a tampa entreaberta por mais 15 minutos. A placa foi então fe- chada, selada com fita médica Micropore™ da 3M™, e colocada em uma incubadora a 25Ό com luz contínua a uma intensidade luz de aproximadamente 60 pEm'2 s'1. [0096] Seleção de calos e regeneração de eventos transqênicos.

Subsequente ao período de cocultivo, os embriões foram transferidos para meio de repouso, que era composto de 4.33 gm/L de sais de MS; vitaminas de MS modificado; 30 gm/L de sacarose; 700 mg/L de L- proiina; 3.3 mg/L de dicamba em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de hidrolisado enzimático de caseína; 15 mg/L de AgN03; 0.5 gm/L de MES (ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico mono-hidratado;

Phytotechnologies labr.; Lenexa, KS); 250 mg/L de cefotaxima; e 7,0 gm/L de ágar; em um pH 5.8. No máximo 36 embriões foram transferi- dos para cada placa. As placas foram envolvidas com fita Micropore™ e incubadas a 27°C com luz contínua a uma intensidade de luz de aproximadamente 50 pmol m-2 s-1 por 7 a 10 dias. Os embriões com calo (<18/placa) foram então transferidos para o meio de seleção I, que era compreendido de meio de repouso (acima) porém com apenas 6,5 gm/L de ágar, e com 100 nM de ácido R-Haloxyfop (0,0362 mg/L.

As foram envolvidas com fita Micropore™ e incubadas a 27°C com luz contínua a uma intensidade de luz de aproximadamente 50 pEm'2 sec' 1 por 7 dias. Os calos proliferados (<12/placa) foram então transferidos para o meio de seleção II, que era compreendido de meio de repouso (acima) porém com apenas 6.5 gm/L de agar, e com 500 nM de ácido R-Haloxyfop (0,181 mg/L). As placas foram envolvidas e incubadas a 27°C com luz contínua a uma intensidade de luz de aproximadamente 50 μΕιτΓ2 sec"1 por 14 dias. [0097] Neste estágio, os calos resistentes (<9/placa) foram transfe- ridos para o meio de pré-regeneração. O meio de pré-regeneração continha 4,33 gm/L de sais de MS; vitaminas de MS modificado; 45 gm/L de sacarose; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mio-inositol; 50 mg/L de hidrolisado enzimático de caseína; 1,0 mg/L de AgN03; 0,5 gm/L de MES; 0,5 mg/L de ácido naftalenoacético em NaOH; 2.5 mg/L de ácido abscísico em etanol; 1 mg/L de 6-benzilaminopurina; 250 mg/L de cefotaxima; 5,5 gm/L de ágar; e 500 nM de ácido R-Haloxyfop (0,181 mg/L), a um pH 5.8. As placas foram envolvidas e incubadas a 27Ό com luz contínua a uma intensidade de luz de a proximadamente 50 pErrf2 sec'1 por 7 dias. Os calos em regeneração (<6/placa) foram então transferidos para o meio de regeneração em Phytatrays™ (Sig- ma-Aldrich) e incubados a 28Ό com 16 horas de luz/8 horas de escu- ridão por dia a uma intensidade de luz de aproximadamente 150 μιτιοΙ m'2s'1 por 14 dias ou até o desenvolvimento de rebentos. O meio de regeneração continha 4.33 gm/L de sais de MS; vitaminas de MS mo- dificado; 60 gm/L de sacarose; 0,50 gm/L de MES; 125 mg/L de cefo- taxima; 5.5 gm/L de agar; e 500 nM de ácido R-Haloxyfop (0.181 mg/L), a um pH 5.8. Rebentos pequenos com raízes primárias foram então isolados e transferidos para meio de elongação sem seleção (i.e., meio de regeneração sem ácido R-Haloxyfop e com 30 gm/L de sacarose em vez de 60 gm/L de sacarose) para crescerem ainda mais.

As plântulas enraizadas com cerca de 6 cm ou mais foram transplan- tados para o solo e levadas para uma câmara de crescimento para en- rijecimento. [0098] Transferência e estabelecimento de plantas To na estufa para ensaio e produção de sementes. Tecidos vegetais transformados selecionados por sua capacidade de crescer em meio contendo Ha- loxyfop foram transplantados do Phytatrays™ para pequenos vasos (T. O. Plastics, 3.5" SVD) preenchidos com meio de crescimento (PROMIX BX; Premier Tech Horticulture), cobertos com "humidomes" (Arco Plastics Ltd.), e em seguida enrijecidos em uma câmara de cres- cimento (28Ό dia/24O noite, fotoperíodo de 16 hor as, 50-70% de umidade relativa, intensidade de luz de 200 pEm'2 sec~1). Quando as plantas atingiram o estágio V3-V4, elas foram então transplantadas na mistura de solo Sunshine Custom Blend 160 e cultivadas até floresce- rem na estuga (tipo de exposição à lux: foto ou assimilação; limite de luz alta: 1200 PAR; dia com duração de 16 horas; 27Ό dia/24cC noi- te). Plântulas transgênicas putativas foram analisadas quanto ao nú- mero de cópias de transgenes por ensaios de PCR em tempo real quantitativos usando iniciadores desenhados para detectar o número relativo de cópias dos transgenes, e os eventos tendo apenas uma ou duas cópias do gene de Cry1Da2 integrado foram transplantados para vasos de 18,93 litros (5 galões). Observações foram feitas periodica- mente para localizar quaisquer fenótipos anormais. Plantas da geração T-i foram obtidas por autopolinização das barbas das plantas transgê- nicas T0 com pólen coletado das plantas T0 e plantio das sementes resultantes. Sementes T-ι do evento 109841 [3]-106 foram plantadas e selecionadas por borrifação das plantas com Quizalofop, e conserva- ção das plantas sobreviventes até o estágio de reprodução para obter barbas para bioensaios da iagarta-da-espiga-do-milho e análises da mancha ocidental. [0099] Plantas de milho transgênicas foram produzidas de forma similar subsequente à transformação com o vetor binário pDAB101556 ancorando um cassete de expressão do gene da proteína fluorescente amarela. EXEMPLO 5 Análises moleculares e bioquímicas de tecidos de milho transqênicos [00100] Sonda de hidrólise qPCR para análise do número de có- pias. Análises moleculares foram empregadas para rastrear eventos simples com baixo número de cópias. Tecido foliar foi coletado de plantas transgênicas putativas enraizadas antes do transplante para o solo. O DNA foi extraído com um kit QIAGEN MagAttract™ usando o Biosprint96, robô de extração QIAGEN e os protocolos recomendados pelo fabricante. A análise do número de cópias de transgene integrado foi feita usando-se ensaios de sonda de hidrólise específicos para o gene AAD-1. Além disso, contaminação por integração inadvertente do esqueleto plasmídico do vetor binário foi detectada por um ensaio de sonda de hidrólise específico para o gene da resistência à espectino- micina (Spec) carregado pelo esqueleto do vetor binário. O ensaio da sonda de hidrólise para genes de milho endógenos Invertase; (Gen- Bank™ Acesso N° U16123) foi desenvolvido como um padrão de refe- rência interno. A Tabela 2 lista as sequências oligonucleotídicas dos componentes do ensaio da sonda de hidrólise (sintetizados por Inte- grated DNA Technologies, Coralville, IA & Applied Biosystems, Foster City, CA). Reações de PCR da sonda de hidrólise Biplex foram mon- tadas de acordo com a Tabela 3 com cerca de 10 ng de DNA, e as condições de ensaio estão apresentadas na Tabela 4.

Tabela 2 Lista de iniciadores nucleotídicos de sentido normal e de sentido inver- tido e sondas fluorescentes usadas para detecção do número de có- pias do transgene e da expressão relativa. * Os marcadores de sonda fluorescentes são: FAM = 6-carbóxi fluo- resceína amidita; HEX = hexacloro-fluoresceína; MGB & VIC = "Minor Groove Binder"; VIC® é um marcador fluorescente patenteado da INVITROGEN.

Tabela 3 Mistura de PCR da sonda de hidrólise para análise do número de có- pias de DNA do transgene.

Tabela 4 Condições do termociclador para amplificação por PCR da sonda de hidrólise. [00101] Para amplificação, a mistura LIGHTCYCLER®480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) foi preparada a uma concentração final de 1X em uma reação multiplex de 10 pL de volu- me, 0,4 μΜ de cada iniciador, e 0,2 pM de cada sonda. A porção fluo- rescente FAM (6-carbóxi fluoresceína amidita) foi excitada a 465 nm e a fluorescência foi medida a 510 nm; os valores correspondentes para a porção fluorescente HEX (hexaclorofluoresceína) foram 533 nm e 580 nm. O nível de fluorescência gerado para cada reação foi anali- sado usando-se o sistema de PCR em tempo real Lightcycler®480 Ro- che de acordo com as recomendações do fabricante. O número de có- pias de transgene foi determinado por comparação de resultados do Lightcycler®480 de valores de genes alvo/de referência para amostras desconhecidas com valores de genes alvo/de referência de padrões de número de cópias conhecidos (1-Copy representando plantas he- mizigóticas, 2-Copy representando plantas homozigóticas). [00102] Escores Cp, i.e., o ponto no qual o sinal de fluorescência cruza o limiar de fundo usando o algoritmo de pontos de ajuste (sof- tware Lightcycler® versão1.5), e o módulo Relative Quant, foram usa- dos para fazer a análise dos dados de PCR em tempo real. [00103] No software de algoritmo de pontos de ajuste Lightcycler®, foi feito um gráfico dos dados por plotagem do logaritmo da concentra- ção de gabarito de DNA de entrada contra os valores Cp medidos. A inclinação da curva é um parâmetro de comparação desejado; por conseguinte o log número de entrada inicial pode ser um ponto de par- tida arbitrário na curva, com a advertência de que os valores de con- centração arbitrários usados para o gabarito de DNA de entrada são representativos da diluição seriada efetiva usada. Por exemplo, para uma diluição seriada 1 para 10, as concentrações de entrada efetivas podem ser 1000, 100, 10 etc., para cujos pontos o software de algorit- mo de pontos de ajuste LC480 plota 3, 2, 1 etc. como os logaritmos das entradas. Usando uma regressão linear, o melhor ajuste resultante desta linha (log entrada vs Cp) é então usado para estimar uma incli- nação (m) a partir de uma equação de formato y = mx+b. Existe uma relação inversa entre a quantidade de gabarito inicial e o valor Cp, e portanto a inclinação (m) é sempre negativa. [00104] Uma reação de PCR perfeita (i.e., 100% eficiente) duplica o gabarito total a cada ciclo. A eficiência da PCR (Eff) é calculada co- mo: Eff = 10e(-1/m). Assim sendo, a inclinação (m) do gráfico de log entrada vs Cp será de -3.3219 para uma reação perfeitamente eficien- te (cuja eficiência é definida como 2.00). [00105] Em outras palavras, uma reação de PCR 100% eficiente é definida por: 2.0 = 10e(-1/-3.3219). O software de algoritmo de pontos de ajuste LC480 reporta o valor da eficiência pela primeira fórmula.

Assim, uma reação 99% eficiente tem um valor de Eff de 1.99 e não de 0.99. Para que isto seja expressado como eficiência percentual, sub- trair 1 deste valor e multiplicar por 100. Ou, %Eff = [(10e(-1/m)-1)] x 100. [00106] Detecção da proteína Crv1Da2 truncada produzida pela planta. Proteínas foram extraídas de 200 a 240 mg de barbas de milho (coletadas de espigas não polinizadas) em 0.6 mL de PBST (tampão PBS contendo 0,05 % de Tween 20). Uma pérola de aço de 2 mm foi adicionada, e os tubos foram tampados e fixados em um GENO/GRINDER (CERTIPREP; Metuchen, NJ), e agitados por 5 mi- nutos a 1500 rpm. Os tubos foram centrifugados a 4000 rpm por 7 mi- nutos a 4Ό, e os sobrenadantes contendo as proteín as solúveis foram armazenados a -80Ό até serem usados. [00107] As concentrações de proteínas totais foram determinadas usando-se o kit PIERCE 660 nm PROTEIN ASSAY kit (THERMO SCIENTIFIC; Rockford, IL) seguindo-se as instruções do fabricante.

Análises da mancha imunoquímica de proteínas foram conduzidas usando-se um anticorpo policlonal gerado em coelhos usando-se pro- cedimentos tradicionais (vide, por exemplo, Harlow, E., & Lane, D.P. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Labora- tories, Cold Spring Harbor, NY, e suas atualizações). Amostras foram preparadas e as proteínas foram separadas por eletroforese em géis de Bis-Tris a 4-12% NUPAGE no tampão de corrida MES de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante para eletroforese desnaturan- te (INVITROGEN). As proteínas foram transferidas para uma membra- na de nitrocelulose por 80 minutos a 30 V em tampão de transferência NUPAGE. As manchas foram bloqueadas por 1 hora à temperatura ambiente em 5% de leite/PBST (PBS com 0.05% de Tween-20) e en- tão sondadas com um anticorpo primário (específico para a proteína de toxina de núcleo CrylDa) e então com anticorpos secundários por uma hora cada à temperatura ambiente na solução de bloqueio, com enxague entre cada anticorpo por 15 minutos em PBST. O desenvol- vimento de manchas foi feito usando-se o substrato "ECL WESTERN blotting substrate" da PIERCE de acordo com o protocolo do fabricante (THERMO FISHER SCIENTIFIC, Rockford, IL). A presença de proteí- nas Cry1 Da truncadas foi confirmada em extratos de amostras em du- plicata dos tecidos das barbas de plantas de milho geradas a partir do evento 109841 [3]-106 (plantas 109841 [3J-106.AJ001.008, 109841 [3]- 106.AJ001.013, 109841 [3J-106.AJ001.020, 109841 [3]-106.AJ001.027, e 109841 [3]-106.AJ001.028). Duas faixas foram tipicamente detecta- das, uma na mobilidade correspondente a aproximadamente 65 kDa, que corresponde ao tamanho molecular da proteína Cry1Da2 codifica- da pela construção pDAB109841, e uma segunda faixa tendo uma mobilidade correspondente a proteínas um pouco inferiores a 65 kDa.

As proteínas menores podem corresponder aos produtos remanescen- tes depois da divagem dos aminoácidos 1-28 do terminal N da proteí- na de toxina de núcleo CrylDa. (Processamento de alguns aminoáci- dos N-terminais de proteínas Cry1 é frequentemente detectado). Ne- nhuma dessas faixas foi vista em extratos de barba de plantas B104 não transgênicas.

Tabela 5 Análise de plantas T1 quanto ao nível relativo de transcrição de RNA (RTL) e expressão de proteína. *As medições foram conduzidas por análise da mancha ocidental e quantifi- cadas por LC/MS/MS como conhecido na literatura. EXEMPLO 6 Bionsaio de tecidos transqênicos de milho [00108] Bioensaios da folha V5 com eventos de milho Ti. Bandejas de bioensaio (32 poços/bandeja; C-D International) foram parcialmente preenchidas com uma solução de ágar a 2% e o ágar foi deixado soli- dificar. Duas seções de folha (cerca de 6,45x10'4 m2 [uma polegada quadrada] de área) foram retiradas de cada planta e cada uma delas foi colocada em um poço diferente das bandejas de 32 poços. Dez lar- vas recém-nascidas de Helicoverpa zea (CEW) (cerca de 24 a 48 ho- ras após a eclosão) foram colocadas em cada poço. As bandejas fo- ram seladas com tampas pegajosas perfuradas para permitir ventila- ção durante o teste e foram então colocadas a 28°C, 40% de umidade relativa, 16 horas de luz:8 horas de escuridão. Depois de três dias, um escore de dano percentual simples na área foliar foi obtido para cada pedaço de folha. A média aritmética dos escores de dano para cada teste foi calculada. [00109] Bioensaios de seda da laqarta-da-espiqa-do-milho. Espi- gas não polinizadas foram coletadas, seu comprimento foi medido, e as espigas foram armazenadas a 4Ό até serem usadas para bioen- saio. Cerca de 10 mL de ágar em água a 2% foram colocados no fun- do de cada poço de ensaio (cerca de 6,45χ10'4 m2 [uma polegada quadrada]) de uma bandeja de bioensaio de 32 poços para fornecer umidade para as barbas e larvas de lagarta-da-espiga-do-milho. Cinco cordões de barba (cerca de 10 cm de comprimento) foram oferecidos como alimento a dois neonatos de CEW em cada poço. Cada evento foi testado em quatro réplicas (poços) em um formato completamente randomizado. Depois da infestação com insetos, as bandejas foram seladas com tampas pegajosas perfuradas para permitir ventilação durante o teste. As bandejas foram colocadas a 28Ό , 60% de umida- de relativa, 16 horas de luz:8 horas de escuridão. No 3o dia após a in- festação, o dano percentual nas barbas foi registrado por avaliação visual da quantidade de fezes sobre os tecidos das barbas. O número de insetos vivos, mortos e desaparecidos foi registrado por evento e a mortalidade larval percentual foi estimada. [00110] Atividade de CrvIDa produzida pela planta sobre larvas de CEW. Análises da mancha imunoquímica detectaram a proteína de toxina de núcleo CrylDa nas barbas de espigas de plantas transgêni- cas pDAB109841 T-ι, e as barbas proporcionaram excelente proteção contra danos de alimentação causados por larvas de H. zea, tendo apenas 4.6% de dano em barbas nos bioensaios (Tabela 6). As bar- bas provenientes de plantas transgênicas de milho de controle negati- vo produzindo a proteína fluorescente amarela não inseticida (YFP; construção pDAB101556), ou de plantas B104 não transgênicas, so- freram de 90% a 95% de dano médio às barbas causado por larvas de H. zea. Além disso, a mortalidade das larvas que se alimentaram das barbas de plantas produzindo a proteína de toxina de núcleo CrylDa foi de 26.8%, ao passo que não foi observada mortalidade das larvas nas amostras de plantas de controle negativo. A construção CrylDa ofereceu excelente proteção das folhas das amostras no estágio V5, com as plantas transgênicas pDAB 109851 tendo 12% a 25% de danos em folhas causados pela H. zea (Tabela 6), ao passo que as plantas de controle negativo (B104 e produtoras de YFP) sofreram quase 100% de danos em folhas. Os resultados dos bioensaios de barbas e folhas demonstraram que a proteína de toxina de núcleo CrylDa é al- tamente eficaz na proteção de plantas de milho contra danos causa- dos por larvas de H. zea.

Tabela 6 Resultados de bioensaios de larvas recém-nascidas de H. zea sobre amostras de plantas produtoras da toxina de núcleo CrylDa, em com- paração com plantas de controle negativo. As médias em uma coluna foram separados pelo teste HSD de Tukey-Kramer. * Média de 4 réplicas ** NA = Não aplicável *** Os níveis não conectados pela mesma letra em uma coluna são significativa- mente diferentes. [00111] A Tabela 7 mostra a mortalidade percentual, dano percen- tual em folhas e dano percentual em barbas de H. zea. A quantidade de dano nas barbas foi avaliada de acordo com a quantidade visível de fezes de inseto sobre os tecidos. O dano percentual nas folhas foi ava- liado de acordo com uma avaliação visual da área de alimentação lar- val em um pedaço de folha de 6,45*10'4 m2 (uma polegada quadrada). A variedade de milho B104 e a construção 101556 (ou construção 109812 para dano em folhas) foram controles negativos provenientes do cultivar híbrido e da proteína fluorescente amarela (YFP) de contro- le, respectivamente, ao passo que HX1 era um híbrido comercial Her- culex® I, expressando a proteína CrylFa. A construção era 109841 milho T1 expressando a versão truncada da CrylDa. Os dados foram analisados por ANOVA e pelo teste de separação de médias de Tukey-Kramer.

Tabela 7 Mortalidade percentual, dano percentual em folhas e dano percentual em barbas de H. zea. *SEM = desvio-padrão da média. As etras entre parênteses designam níveis esta- tísticos. Os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferen- tes (P<0.05). **A construção 109812 foi a YFP de controle negativo para o bioensaio de dano em folhas. EXEMPLO 7 Eficácia no campo da proteína de toxina de núcleo CrylDa contra CEW [00112] Sementes de oito eventos B104 transgênicos pDAB109841 T-ι foram testadas em lotes de teste no campo na estação DOW AGROSCIENCES Field Station, Fowler, Indiana. Estes eventos foram analisados por técnicas moleculares da maneira descrita acima e foi constatado que eram eventos de uma única cópia sem sequências de- tectáveis do esqueleto do vetor binário. Todos os eventos foram testa- dos como plantas T-ι segregando 1:1 (hemizigóticas:nulas) para um evento de integração Cry1Da/AAD1. Os controles negativos foram plantas B104 (nulas) não transgênicas. [00113] Os lotes de teste continham uma fileira de 6,1 metros (20 pés) para cada espécie de inseto testada. Os tratamentos foram plan- tados em um desenho na forma de blocos completos aleatorizados com quatro réplicas. As entradas experimentais foram tratadas no es- tágio V2 com ASSURE® II (DUPONT™ CROP PROTECTION, Wil- mington, DE) a 184 gm equivalentes de ácido por hectare (ae/ha) + 1% de COC para eliminar as plantas nulas. ASSURE® II contém o ingre- diente ativo (ai) Quizalofop P-etil etil(R)-2-4-[4-6-cloroquinoxalin-2-il óxi)-fenóxi]propionato. O produto comercial contém 399,16 g (0.88 Ib) de ingrediente ativo por 3,79 litros (por galão) e 1.0% (v/v) de concen- trado de óleo de cultura (COC). COC é um óleo parafínico refinado emulsificável contendo cerca de 85% de óleo parafínico e cerca de 15% de emulsificantes. Contagens de apoio ("stand counts") foram fei- tas 2 semanas após o tratamento. Cinco plantas por lote foram avalia- das quanto aos danos causados pelos insetos. [00114] Ovos de lagarta-da-espiga-do-milho (CEW; Helicoverpa zea Boddie) foram fornecidos pela BENZON RESEARCH. Para avaliar a eficácia contra CEW, cada planta recebeu 5 larvas de CEW no segun- do instar sobre as barbas das espigas no dia 21/08/2012 durante a flo- ração (estágio de crescimento principal #6). No dia 04/09/2012, as espigas foram examinadas quanto as cinco larvas e aos danos de ali- mentação, determinados de acordo com os critérios relacionados na Tabela 87.

Tabela 8 Critérios para avaliação dos danos causados pela lagarta-da-espiga- do-milho. [00115] Ensaios de imunoabsorvência ligados à enzima quantitati- vos (ELISA) usando protocolos tradicionais foram usados para avaliar os níveis da proteína foliar CrylDa em cada evento. Os ELISAs foram realizados usando-se múltiplas diluições de extratos vegetais e usan- do-se os reagentes e as instruções essencialmente da maneira indica- da pelos fornecedores do kit de ELISA. O anticorpo de CrylDa des- crito acima foi usado.

Tabela 9 Resultados de testes analíticos e de alimentação dos insetos em plan- tas cultivadas em campo. As médias foram separadas pelo teste HSD de Tukey-Kramer. * Níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes, ** N/A = Não aplicável [00116] Houve uma ampla gama de níveis de acumulação de CrylDa, de 67 ng/cm2 a 135 ng/cm2. Todos os eventos pDAB 109841 testados proporcionaram um nível estatisticamente similar de proteção contra CEW, tanto nos níveis de consumo de grão quanto nos níveis de infestação das espigas, independentemente do nível de produção de CrylDa.

Referências Frankenhuyzen, K. 2009. Minireview: Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal proteins. Journal of Invertebrate Patho- logy. 101:1-16.

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Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of a new Le- pidoptera-specific crystal protein gene from Bacillus thuringiensis. Nucl.

Acids Res. 18:5545.

Payne, J., & A. J. Sick. 1997. Patente US N°5,691,308.

Claims

1. Método para o controle de danos causados pela lagarta- da-espiga-de-milho a plantas, caracterizado por compreender oferecer uma proteína inseticida CrylDa ou variante à referida lagarta-da- espiga-de-milho para ingestão.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida proteína inseticida CrylDa ou variante é produzida por uma célula vegetal e está presente na mesma.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida proteína inseticida CrylDa ou variante é produzida por uma planta inteira fértil e está presente na mesma.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida proteína inseticida CrylDa compreende uma região de toxina de núcleo que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID N°: 6.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida proteína inseticida CrylDa compreende uma região de toxina de núcleo que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID N* 6.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida planta é selecionada do grupo que consiste em milho, soja, e algodão.

7. Pluralidade de plantas em um campo compreendendo plantas de refúgio não-Bt e uma pluralidade de plantas de expressão de uma proteína inseticida compreendendo uma toxina de núcleo CrylDa, caracterizada pelo fato de que as referidas plantas de refúgio compreendem menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, ou menos de 5% de todas as plantas de cultivo no referido campo.

8. Pluralidade de plantas de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que as referidas plantas ocupam mais de 10 acres.

9. Pluralidade de plantas de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que não há plantas de refúgio.

10. Pluralidade de plantas de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que as referidas plantas de refúgio estão em blocos ou faixas.

11. Mistura de sementes compreendendo sementes de re- fúgio de plantas de refúgio não-Bt, e uma pluralidade de sementes ca- pazes de expressar CrylDa, caracterizada pelo fato de que as referi- das sementes de refúgio compreendem menos de 40% , menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, ou menos de 5% de todas as sementes na mistura.

12. Método de controle de um inseto do tipo lagarta-da- espiga-de-milho, caracterizado por deixar que o referido inseto alimen- te-se de qualquer uma das plantas como definidas nas reivindicações 7-10.

13. Método para o controle de danos causados pela lagar- ta-da-espiga-de-milho a plantas, caracterizado por compreender trans- formar uma célula vegetal com uma sequência de DNA que expressa uma região codificadora compreendendo a SEQ ID N* 6, regenerar uma planta transgênica fértil a partir da referida célula vegetal trans- formada, coletar as sementes carregando a referida sequência de DNA a partir das referidas plantas transformadas, cultivar as sementes das referidas plantas transformadas, e deixar que a referida lagarta- da-espiga-de-milho alimente-se da proteína expressa pela referida se- quência de DNA.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que a sequência de DNA é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NQ 6.

15. Método para o controle de danos causados pela lagar- ta-da-espiga-de-milho a plantas, caracterizado por compreender culti- var sementes produzidas pela referida planta transformada que ex- pressa uma região codificadora compreendendo a SEQ ID N* 6, e deixar que a referida lagarta-da-espiga-de-milho alimente-se da prote- ína expressa pela referida sequência de DNA.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que a sequência de DNA é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NQ 6.