BRPI0810672A2

BRPI0810672A2 - polinucleotídeo codificando uma proteína inibitória de inseto tic807, métodos para expressá-lo em uma planta, e para detectá-lo, identificá-lo ou isolá-lo assim como kit para tal, célula hospedeira transformada, métodos para controle e proteção de planta de um inseto-praga, proteína isolada, kit para sua detecção, vetor de dna recombinante para expressá-la, produto de consumo e anticorpo

Info

Publication number: BRPI0810672A2
Application number: BRPI0810672A
Authority: BR
Inventors: R Heck Gregory; Baum James; Flasinski Stanislaw; R Penn Stephen; Rao Sukuru Uma; Shi Xiaohong
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2007-04-27
Filing date: 2008-04-25
Publication date: 2019-10-08
Also published as: EP2142009A2; AR066338A1; WO2008134072A2; ZA200907357B; AP2995A; WO2008134072A4; US9546378B2; ES2644945T3; US20140194351A1; CA2685295C; CN101686705A; EP2142009A4; AU2008246051B2; WO2008134072A3; CA2685295A1; AP2009005006A0; CN101686705B; EP2142009B1; US20080295207A1; AU2008246051A1

Abstract

proteínas tóxicas ativas de bacillus thuringiensis para hemíptero e coleóptero é descrito um novo cristal de proteína de bacillus thuringiensis que exibe atividade inibitória de inseto. o crescimento de insetos lygus é significativamente inibido pelo fornecimento do novo cristal de proteína na dieta do inseto lygus. também são fornecidos polinucleotídeos que codifi-cam o cristal de proteína, plantas transgênicas e microrganismos que con-têm os polinucleotídeos, peptídeos isolados derivados do cristal de proteína e anticorpos dirigidos contra o cristal de proteína. também são descritos métodos para usar o cristal de proteína e polinucleotídeos que codificam o cristal de proteína para controlar insetos hemípteros.

Description

Campo da Invenção

Essa invenção refere-se, de modo geral, ao campo de proteínas de Bacillus thuringiensis inibitórias de inseto e, mais particularmente, a cristal de proteínas de B. thuringiensis que inibem insetos hemípteros. São descritos polinucleotídeos e proteínas isolados, plantas transgênicas e métodos segue-se página 1a

1a relacionados que fornecem a inibição de insetos hemípteros. Também são descritos métodos para a combinação de cristais de proteínas de B. thuringiensis que inibem insetos hemípteros com agentes de controle de insetos distintos para se obter níveis aumentados de inibição de inseto hemíptero, 5 manuseio da resistência de inseto hemíptero ou espectro expandido de controle de inseto-praga.

Técnica Relacionada

segue-se página 2 tóxicas para Dípteros, etc.

Recentemente, uma nova nomenclatura foi proposta que classifica sistematicamente as proteínas Cry baseado mais na homologia de sequência de aminoácidos do que nas especificidades para o inseto-alvo. Esse esquema de classificação e uma lista abrangente de genes inibitórios de inseto de B. thuringiensis estão resumidos na listagem de Proteínas Tóxicas Inseticidas como apresentada no site da web de Neil Crickmore, acessado através da Universidade de Cambridge na internet em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Circkmore/Bt/index.html.

Forma da Toxicidade do Cristal de Proteína

Todos os cristais de δ.-endotoxina são tóxicos para larvas de inseto pela ingestão. A solubilização do cristal no intestino médio dos insetos libera a forma de pró-toxina da δ.-endotoxina que, na maioria das vezes, é subsequentemente processada para uma toxina ativa por uma protease do intestino médio. As toxinas ativadas reconhecem e se ligam à borda em escova do epitélio do intestino médio do inseto através de receptores de proteínas. Vários receptores putativos de cristal de proteína foram isolados a partir de certas larvas de insetos (Jurat-Fuentes JL, Adang MJ. Biochemistry. 45(32):9688, 2006; Griffitts JS et al., Science. 307(5711):922, 2005; JuratFuentes JL, Adang MJ. Eur J Biochem.; 271(15):3127, 2004). A ligação de toxinas ativas é seguida pela intercalação e agregação de moléculas de toxina para formar poros dentro do epitélio do intestino médio. Esse processo leva ao desequilíbrio osmótico, inchamento, lise das células que revestem o epitélio do intestino médio e eventual mortalidade das larvas.

Com o advento das técnicas de genética molecular, vários genes de δ.-endotoxina foram isolados e suas sequências de DNA determinadas. Esses genes foram usados para construir certos produtos de B. thuringiensis geneticamente manipulados que foram aprovados para uso comercial. Pesquisas recentes têm mostrado novos sistemas de liberação de δ.-endotoxina desenvolvidos, incluindo plantas que contêm e expressam genes de δ.endotoxina geneticamente manipulados. O controle de infestações de Lepidópteros e Coleópteros em uma variedade de culturas de plantas transgêni cas, incluindo milho, algodão, batata, tomate e arroz, que expressam genes de δ.-endotoxina está bem estabelecido. As vantagens associadas com a expressão de genes de δ.-endotoxina em plantas cultivadas incluem o rendimento aumentado e o uso diminuído de inseticidas químicos. As vantagens das culturas transgênicas que expressam genes de δ.-endotoxina inibitória de inseto têm levado ao uso difundido em culturas tais como de milho e algodão.

Infelizmente, os genes de δ.-endotoxina que estão atualmente disponíveis não fornecem o controle de todas as pragas de insetos que infestam a produção agrícola. Em particular, insetos Hemípteros ainda devem ser controlados com o uso de inseticidas em culturas nas quais eles causam danos. Os insetos Hemípteros ou perfurantes/sugadores são especialmente danosos para as plantas já que eles também são conhecidos por transmitir vírus que danificam as plantas e tornam as plantas mais suscetíveis a infecção bacteriana ou fúngica. Assim, há uma necessidade de materiais e métodos adicionais que permitam a inibição de infestações de insetos Hemípteros em culturas. Há também uma necessidade de se obter vários tipos diferentes de agentes de controle de inseto Hemíptero com modos de ação distintos para uso em plantas transgênicas como ferramentas para o manuseio da resistência de inseto Hemíptero.

Dada a necessidade de agentes de controle de inseto Hemíptero, uma variedade de abordagens tem sido descritas. A Patente U.S. N^e5.723.440 descreve uma proteína Cyt1Ba1 com atividade pretendida contra insetos Hemípteros. Entretanto, Wellman-Desbiens e Cote (J. Econ. Entomol. 98(5):1469-1479, 2005) foram incapazes de confirmar essa atividade com o inseto Hemíptero Lygus hesperus. A Patente U.S. N° 5.885.963 descreve o uso de toxinas Cyt de B. thuringiensis israelensis que supostamente inibem pragas Hemípteras. Mais recentemente, US20060242732 descreve cristais de proteínas de B. thuringiensis com atividade contra o inseto Hemíptero Lygus lineolaris. Essas proteínas não estão relacionadas com as proteínas Cyt descritas nas Patentes dos Estados Unidos N° 5.723.440 e 5.885.963.

Sumário da Invenção

A presente invenção foi desenvolvida tendo em vista os problemas acima.

A invenção refere-se, primeiro, a um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína inibitória de inseto TIC807 ou um fragmento de proteína inibitória de inseto derivado dela, em que a proteína ou fragmento inibitórios de inseto compreendem uma sequência de polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeos correspondente contida dentro da SEQ ID NO:5. As sequências de polinucleotídeos da invenção também podem codificar sequências de polipeptídeos com pelo menos cerca de 80%, 90%, 95% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeos inibitória de inseto correspondente contida dentro da SEQ ID NO:5. Em certas modalidades, o polinucleotídeo codifica a sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO:5.

Polinucleotídeos isolados da invenção podem codificar uma proteína inibitória de inseto TIC807 ou um fragmento de proteína inibitória derivado dela que inibe um inseto Hemíptero, um inseto Heteróptero ou um inseto Homóptero. O inseto Hemíptero pode ser um inseto Lygus e o inseto Homóptero pode ser um afídeo, um gafanhoto ou uma mosca branca. A proteína inibitória de inseto TIC807 ou um fragmento de proteína inibitória derivado dela codificado inibe Lygus em uma concentração de pelo menos cerca de 5 ppm, 50 ppm, 250 ppm ou 500 ppm (partes por milhão) da proteína TIC807 ou fragmento de proteína na dieta de Lygus. O fragmento de proteína inibitória de inseto TIC807 codificado pelo polinucleotídeo compreende uma sequência de peptídeos de pelo menos 250 resíduos de aminoácidos. Esse polinucleotídeo isolado que codifica a proteína TIC807 pode ser modificado para expressão aperfeiçoada em plantas comparado com a sequência codificadora nativa. Uma modalidade de polinucleotídeo que codifica TIC807, que é planejado para expressão em plantas, é fornecida pela SEQ ID NO:6. Outras modalidades de polinucleotídeos que codificam TIC807 para expressão em plantas são fornecidas como SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NQ:50, SEQ

ID N0:51, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:53. Em outras modalidades, ο polinucleotídeo planejado para expressão em plantas codifica uma proteína TIC807 com um peptídeo N-terminal direcionado para o cloroplasto ou plastídeo. Uma modalidade é fornecida na SEQ ID NO:7 e compreende um polinucleotídeo planejado para expressão de toxina de TIC807 em plantas que também está ligado em fase com uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo direcionado para o plastídeo. O peptídeo direcionado para o plastídeo está operativamente ligado a TIC807 após a expressão e funciona para dirigir a inserção da toxina de TIC807 no plastídeo da planta.

Outros polinucleotídeos isolados da invenção incluem polinucleotídeos que hibridizam sob condições de alta estringência tanto com o gene nativo de TIC807 de B. thuringiensis (SEQ ID NO:4) quanto com o gene planejado para expressão aperfeiçoada em planta de TIC807, que tem um conteúdo de G+C enriquecido (SEQ ID NO:6) comparado com a sequência codificadora nativa descrita como SEQ ID NO:4. Polinucleotídeos que hibridizam sob condições estringentes podem ser selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7.

A invenção fornece ainda plantas transgênicas ou partes de plantas delas derivadas compreendendo uma proteína inibitória de inseto TIC807 ou um fragmento de proteína inibitória derivado dela, em que a proteína inibitória de inseto TIC807 ou um fragmento de proteína compreende uma sequência de polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeo correspondente contida dentro da SEQ ID NO:5. A planta ou parte da planta transgênica compreende a proteína ou fragmento de proteína TIC807 em uma concentração de pelo menos cerca de 5 pg a cerca de 250 pg de proteína ou fragmento de proteína TIC807 por grama de peso de tecido de planta fresco ou qualquer quantidade intermediária. O fragmento de proteína inibitória de inseto TIC807 codificado pelo polinucleotídeo compreende uma sequência de peptídeos de pelo menos 250 resíduos de aminoácidos. A parte da planta transgênica pode ser uma célula, uma folha, um caule, uma flor, uma sépala, um fruto, uma raiz ou uma semente.

A invenção também fornece células hospedeiras transformadas que compreendem um polinucleotídeo que codifica uma proteína inibitória de inseto TIC807 ou um fragmento de proteína inibitória de inseto derivado dela, em que a proteína ou fragmento inibitório de inseto compreende uma sequência de polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeos correspondente contida dentro da SEQ ID NO:5. O fragmento de proteína inibitória de inseto TIC807 codificado pelo polinucleotídeo compreende uma sequência de peptídeos de pelo menos 250 resíduos de aminoácidos. A célula hospedeira transformada pode ser uma célula bacteriana ou uma célula de planta. Células de planta transformadas da invenção podem ser selecionadas do grupo que consiste em células de planta de cevada, milho, aveia, arroz, centeio, sorgo, grama, cana de açúcar, trigo, alfafa, banana, brócolis, feijão, repolho, canola, cenoura, abóbora, couve-flor, aipo, um cítrico, algodão, pepino, eucalipto, linheiro, alho, uva, cebola, alface, ervilha, pimenta, batata, álamo, pinheiro, girassol, açafrão, soja, morango, beterraba, batata-doce, tabaco, tomate, planta ornamental, arbusto, noz, grão-de-bico, guandu, painço, lúpulo e grama de pastagem. Em certas modalidades, a célula de planta transformada é uma célula de planta de algodão. As plantas derivadas das células transformadas da planta hospedeira, as sementes produzidas a partir das plantas derivadas a partir da célula hospedeira transformada e a progênie de plantas a partir daquela semente também são consideradas pela invenção. Células hospedeiras bacterianas transformadas da invenção podem ser selecionadas do grupo que consiste emuma célula bacteriana de Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas e Rhizobium. Em certas modalidades, a célula bacteriana transformada é uma célula de Bacillus thuringiensis. Outra modalidade da invenção refere-se a uma cultura biologicamente pura ou isolada de uma cepa SIC8088 de Escherichia coli abrigando o vetor plC17040, depositada em 16 de março de 2007 na Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), Peoria, Illinois, USA e que tem o N° de Acesso NRRLB-50030.

A invenção fornece ainda métodos para controlar Lygus, com preendendo as etapas de: (a) fornecer uma quantidade inibitória de Lygus de uma proteína inibitória de inseto TIC807 ou um fragmento de proteína inibitória de inseto derivado dela, em que a proteína ou fragmento de proteína inibitória de inseto compreende uma sequência de polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeo correspondente contida dentro da SEQ ID NO:5; e (b) contatar o Lygus com a quantidade inibitória da sequência de polipeptídeo, controlando dessa maneira um inseto Lygus. A sequência de polipeptídeo usada nesse método também pode ter pelo menos cerca de 90% ou 100% de identidade de sequência de polipeptídeo inibitório correspondente contida dentro da SEQ ID NO:5. O fragmento de proteína inibitória de inseto TIC807 codificado pelo polinucleotídeo compreende uma sequência de peptídeos de pelo menos 250 resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade desse método, a quantidade inibitória de Lygus da sequência de polipeptídeo pode ser fornecida em uma dieta para Lygus da etapa (a) e o Lygus pode ser contatado na etapa (b) permitindo que o Lygus se alimente com a dieta. Em uma modalidade mais particular do método, a dieta do Lygus é uma planta transgênica. Quando a dieta do Lygus desse método é uma planta transgênica, a quantidade inibitória de Lygus da sequência de polipeptídeo está entre pelo menos cerca de 5 pg a cerca de 250 pg por grama de peso de tecido de planta transgênica. Em outras modalidades desse método, a quantidade inibitória de Lygus da sequência de polipeptídeo é fornecida na etapa (a) pela pulverização de uma composição que compreende o polipeptídeo sobre uma planta. A composição usada nessa modalidade do método compreende células bacterianas ou esporos bacterianos que expressam o polipeptídeo. Em modalidades particulares do método, as células bacterianas ou esporos bacterianos são células de Bacillus ou esporos de Bacillus. A composição usada nesse método também pode compreender cristais parasporais contendo o polipeptídeo. Em qualquer um desses métodos de controlar Lygus, a planta pode estar infestada por Lygus.

A invenção também fornece oligonucleotídeos isolados compreendendo pelo menos 12 nucleotídeos contíguos de uma sequência contida dentro da proteína nativa TIC807 de Bacillus thuringiensis codificada pela SEQ ID NO:4 ou contida dentro do complemento da SEQ ID NO:4. Tais oligonucleotídeos isolados são úteis para detectar tanto a SEQ ID NO:4 quanto polinucleotídeos relacionados que codificam proteínas inibitórias de inseto relacionadas com TIC807. Os oligonucleotídeos isolados que compreendem pelo menos 12 nucleotídeos de uma sequência contida dentro de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:53 também são fornecidos pela invenção. Esses oligonucleotídeos isolados são úteis para detectar a SEQ ID NO:6, um polinucleotídeo planejado para uso em plantas que codifica uma proteína TIC807 ou polinucleotídeos relacionados que codifiquem proteínas TIC807. Kits para a detecção de uma sequência de polinucleotídeos em uma amostra que compreende um oligonucleotídeo que hibridiza especificamente com uma sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO:6 ou seu complemento e um polinucleotídeo de controle que hibridiza com o oligonucleotídeo também são fornecidos por essa invenção.

Outras modalidades da invenção incluem composições que compreendem pelo menos dois iniciadores de oligonucleotídeo degenerado com pelo menos 12 nucleotídeos, em que as sequências de nucleotídeos dos iniciadores de oligonucleotídeo degenerado são derivadas da sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO:5. Essas composições de iniciador de oligonucleotídeo são úteis para detectar sequências de polinucleotídeos tanto em amostras de planta quanto bacterianas que codifiquem proteínas TIC807.

A invenção fornece ainda métodos para detectar ou isolar um polinucleotídeo que codifique uma proteína TIC807 ou uma proteína relacionada a TIC807 em uma amostra, que compreendem as etapas de: (a) selecionar um par de iniciadores de oligonucleotídeo degenerado capazes de produzir um amplicon, em que as sequências dos iniciadores de oligonucleotídeo degenerado são derivadas de uma sequência de polipeptídeo de TIC807 de SEQ ID N:5; (b) produzir um amplicon a partir da sequência de polinucleotídeo na amostra; e (c) detectar ou isolar o amplicon, detectando ou isolando dessa maneira um polinucleotídeo que codifica uma proteína TIC807 ou uma proteína relacionada à TIC807 em uma amostra. Nesse método, o amplicon detectado ou isolado pode codificar um polipeptídeo que tem pelo menos 45%, 70% ou 90% de identidade de sequência com TIC807 (SEQ ID NO:5). Outros métodos fornecidos aqui para detecção ou isolamento de um polinucleotídeo que codifique uma proteína TIC807 em uma amostra compreendem as etapas de: (a) selecionar um oligonucleotídeo degenerado ou uma coleção de oligonucleotídeos degenerados, em que as sequências de nucleotídeos dos iniciadores de oligonucleotídeo degenerado são derivadas de uma sequência de polipeptídeos de TIC807 de SEQ ID NO:5; (b) hibridizar o dito oligonucleotídeo degenerado ou a coleção de oligonucleotídeos degenerados na amostra; (c) detectar a hibridização na amostra a um polinucleotídeo, detectando dessa maneira um polinucleotídeo que codifique uma proteína TIC807 em uma amostra; e (d) isolar o polinucleotídeo detectado pela hibridização na etapa (c). Nesse método, o polinucleotídeo detectado pode codificar um polipeptídeo que tem pelo menos 45%, 70% ou 90% de identidade de sequência com TIC807 (SEQ ID NO:5).

A invenção também fornece métodos para expressar uma proteína TIC807 em uma planta, que compreendem as etapas de: (a) inserir em um genoma de célula de planta uma sequência de ácido nucleico compreendendo, na direção 5’ para a direção 3’, uma molécula de DNA recombinante de fita dupla, em que a molécula de DNA recombinante de fita dupla compreende: i. um promotor que funcione em uma célula de planta; ii. uma sequência de polinucleotídeos que codifique um polipeptídeo que compreenda uma proteína inibitória de inseto TIC807 ou um fragmento de proteína inibitória de inseto derivado dela, em que a dita proteína inibitória de inseto ou fragmento de proteína compreende uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeos correspondente contida dentro de SEQ ID NO:5; e iii. uma sequência de nucleotídeos 3' não traduzida que funcione nas células da planta para induzir a poliadenilação, em que o dito promotor, a dita sequência de polinucleotídeos e a dita sequência de nucleotídeos não traduzi da estão operativamente ligadas; (b) obter uma célula de planta transformada contendo a sequência de ácido nucleico da etapa (a); e (c) regenerar, a partir da célula de planta transformada, uma planta transformada que expresse a proteína TIC807. Nesse método, a sequência de polinucleotídeo da etapa (a) pode codificar tanto uma proteína TIC807, que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5, quanto codificar a proteína TIC807 que tem a SEQ ID NO:5. Essa sequência de polinucleotídeos pode ser a SEQ ID NO:6 ou outra sequência planejada para expressão em plantas que codifique a proteína TIC807. Sequências de polinucleotídeos designadas para expressão em plantas incluem, mas não estão limitadas a SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:53. O fragmento de proteína inibitória de inseto TIC807 codificado pelo polinucleotídeo compreende uma sequência de peptídeos de pelo menos 250 resíduos de aminoácidos. Em outras modalidades desse método, a sequência de polinucleotídeos da etapa (a) está operativamente ligada a uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo direcionado ao plastídeo. O polipeptídeo da SEQ ID NO:8 compreende uma proteína TIC807 que está operativamente ligada ao polipeptídeo direcionado ao plastídeo que pode ser usado em certas modalidades desse método.

A invenção ainda fornece vetores de DNA recombinante compreendendo, na direção 5’ para 3’: i. um promotor que funcione em uma célula de planta; ii. uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende uma proteína inibitória de inseto TIC807 ou um fragmento de proteína inibitória de inseto derivado dela, em que a dita proteína inibitória de inseto ou fragmento de proteína compreende uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeos correspondente contida dentro de SEQ ID NO:5; e iii. uma sequência de nucleotídeos 3’ não traduzida que funcione nas células da planta para induzir a poliadenilação, em que o promotor, a dita sequência de polinucleotídeos e a dita sequência de nucleotídeos não traduzida estão operativamente ligadas. Nesses vetores, a se quência de polinucleotídeos também pode codificar tanto uma proteína TIC807, que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5, quanto codificar a proteína TIC807 que tem a SEQ ID NO:5. O fragmento de proteína inibitória de inseto TIC807 codificado pelo polinucleotídeo compreende uma sequência de peptídeos de pelo menos 250 resíduos de aminoácidos. Sequências de polinucleotídeos designadas para expressão em plantas incluem, mas não estão limitadas a SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:53. Em outras modalidades, a sequência de polinucleotídeos que codifica uma proteína TIC807 está operativamente ligada a uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo direcionado ao plastídeo. Um vetor da invenção pode compreender uma sequência de polinucleotídeos que codifique o polipeptídeo da SEQ ID NO:8, tal que a sequência de polinucleotídeos é a SEQ ID NO:7. Vetores da invenção podem compreender ainda um polinucleotídeo que codifique um gene marcador selecionável. Um gene marcador selecionável que confira resistência a AMPA, atrazina, bromoxinil, dalapon, dicamba, glifosato, higromicina, metotrexato, neomicina, fosfotricina, uma sulfonilureia ou 2,4-D e suas combinações, pode ser usado nos vetores da invenção.

Também são fornecidos por essa invenção produtos de consumo produzidos a partir de uma planta ou semente, em que o produto de consumo contém uma quantidade detectável de uma proteína TIC807 ou de um polinucleotídeo que codifique uma proteína TIC807. Esse produto de consumo pode ser derivado de uma planta de algodão ou de uma semente de planta de algodão, ou similarmente de milho, arroz, trigo, soja, grão de bico, guandu, cana de açúcar, beterraba e semelhantes. Por exemplo, quando o produto de consumo é derivado de uma planta de algodão ou de uma semente de planta de algodão, o produto de consumo pode ser algodão, óleo cereal ou cascas.

A invenção também fornece um método para controlar pelo menos um inseto-praga compreendendo as etapas de: (a) fornecer pelo menos dois agentes inibitórios de inseto-praga diferentes em uma composição, a composição compreendendo: (i) uma quantidade inibitória de inseto de uma proteína TIC807 e uma quantidade inibitória de inseto de (ii) pelo menos uma sequência de ribonucleotídeos que funcione após a ingestão pelo inseto-praga para inibir uma função biológica dentro do inseto-praga, e/ou (iii) uma quantidade inibitória de inseto de pelo menos uma proteína diferente da proteína TIC807, e (b) contatar o inseto-praga ou pragas com uma quantidade inibitória da composição. Nesse método, o inseto-praga controlado pode ser um inseto hemiptero, um inseto heteróptero ou um inseto homóptero. Um inseto hemiptero controlado pelo método pode ser um inseto Lygus. Um inseto homóptero controlado pelo método pode ser um afídeo, um gafanhoto ou uma mosca branca. Nesse método, uma proteína ou fragmento de proteína inibitória de inseto TIC807 compreende uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeos correspondente contida dentro de SEQ ID NO:5. Uma proteína TIC807 usada no método pode compreender um fragmento de proteína inibitória de inseto TIC807 com pelo menos 250 resíduos de aminoácidos de extensão. Quando uma função biológica é inibida por um ribonucleotídeo, a função biológica dentro do inseto-praga em ii) pode ser uma função biológica essencial. A função biológica essencial inibida pelo método pode ser fornecida por uma proteína essencial ou ácido ribonucleico do inseto-praga, a função predita dos quais é selecionada do grupo que consiste em formação de músculo, formação de hormônio juvenil, regulação de hormônio juvenil, regulação e transporte de íon, síntese de enzima digestiva, manutenção de potencial de membrana celular, biossíntese de aminoácidos, degradação de aminoácidos, formação de esperma, síntese de ferormônio, percepção de ferormônio, formação de antenas, formação de asa, formação de membro, desenvolvimento e diferenciação, formação de ovo, maturação larval, formação de enzima digestiva, síntese de hemolinfa, manutenção de hemolinfa, neurotransmissão, divisão celular, metabolismo de energia, respiração e apoptose. A função biológica essencial pode ser inibida em Lygus por uma sequência de ribonucleotídeos que compreende entre cerca de 21 a cerca de 5000 nucleotídeos contíguos, que exibe entre cerca de 80% a cer ca de 100% de identidade de sequência com uma sequência codificadora de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:24 até SEQ ID NO:39. Em outras modalidades desse método, a proteína inibitória de inseto diferente da proteína TIC807 pode ser derivada de Bacillus thuringiensis. Essa proteína inibitória de inseto diferente da proteína TIC807 pode ser selecionada do grupo que consiste emAXMI-027, AXMI-036, AXMI038, AXMI-018, AXMI-020, AXMI-021, AXMI-010, AXMI-003, AXMI-008, AXMI-006, AXMI-007, AXMI-009, AXMI-014, ET29, ET37, AXMI-004, AXMI028, AXMI-029, AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-009, AXMI-014, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127 e TIC128. Em outras modalidades, onde duas proteínas inibitórias de Lygus diferentes da proteína TIC807 são expressas na planta, as duas proteínas inibitórias de Lygus podem compreender TIC809 e TIC810. Em outras modalidades do método, um primeiro e um segundo insetos-praga podem ser controlados pela composição. Nessas modalidades do método, o segundo inseto-praga pode ser inibido tanto pela sequência de ribonucleotídeos da composição quanto pela proteína diferente de uma proteína TIC807 da composição. Esse segundo inseto-praga pode ser um inseto-praga lepidóptero. O segundo inseto-praga pode ser inibido por uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em uma proteína Cry 1A, uma proteína Cry 1B, uma Cry 1C, uma proteína quimérica Cry 1A/Cry 1F e uma proteína Cry 2Ab. Em certas modalidades do método para controlar pelo menos um inseto-praga, a composição fornece um efeito inibitório de inseto sinérgico. Em outras modalidades do método para controlar pelo menos um inseto-praga, a composição fornece um efeito inibitório de inseto aditivo. Nos métodos de controle de pelo menos um inseto-praga, a composição pode ser uma planta transgênica.

A invenção também fornece um método para proteger uma planta contra uma infestação por Lygus, compreendendo expressar uma quantidade inibitória de Lygus de pelo menos dois agentes inibitórios de Lygus diferentes na planta, onde os agentes inibitórios de Lygus compreendem (i) uma quantidade inibitória de Lygus de uma proteína TIC807; (ii) uma quantidade inibitória de Lygus de pelo menos uma proteína inibitória de Lygus dife rente de uma proteína TIC807; e/ou (iii) uma quantidade inibitória de Lygus de pelo menos uma sequência de ribonucleotídeos que funcione após a ingestão pelo Lygus para inibir uma função biológica dentro do Lygus. Essa função biológica essencial no Lygus pode ser fornecida por uma proteína essencial ou ácido ribonucleico do Lygus, a função predita dos quais é selecionada do grupo que consiste em formação de músculo, formação de hormônio juvenil, regulação de hormônio juvenil, regulação e transporte de íon, síntese de enzima digestiva, manutenção de potencial de membrana celular, biossíntese de aminoácidos, degradação de aminoácidos, formação de esperma, síntese de ferormônio, percepção de ferormônio, formação de antenas, formação de asa, formação de membro, desenvolvimento e diferenciação, formação de ovo, maturação larval, formação de enzima digestiva, síntese de hemolinfa, manutenção de hemolinfa, neurotransmissão, divisão celular, metabolismo de energia, respiração e apoptose. Essa função biológica essencial pode ser inibida em Lygus por uma sequência de ribonucleotídeos que compreende entre cerca de 21 a cerca de 5000 nucleotídeos contíguos, que exibe entre cerca de 80% a cerca de 100% de identidade de sequência com uma sequência codificadora de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste emSEQ ID NO:24 até SEQ ID NO:39. Em certas modalidades desse método, a proteína inibitória de Lygus diferente de uma proteína TIC807 é derivada de Bacillus thuringiensis. A proteína inibitória de Lygus diferente de TIC807 pode ser selecionada do grupo que consiste em AXMI027, AXMI-036, AXMI-038, AXMI-018, AXMI-020, AXMI-021, AXMI-010, AXMI-003, AXMI-008, AXMI-006, AXMI-007, AXMI-009, AXMI-014, ET29, ET37, AXMI-004, AXMI-028, AXMI-029, AXMI-007, AXMI-008, AXMI0080IÍ2, AXMI-OO9, AXMI-014, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127 e TIC128. Em outras modalidades onde duas proteínas inibitórias de Lygus diferentes de uma proteína TIC807 são expressas na planta, as duas proteínas inibitórias de Lygus podem compreender TIC809 e TIC810. Nesse método, uma proteína ou fragmento de proteína inibitória de inseto TIC807 compreende uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeos correspondente contida dentro de SEQ ID NO:5. Uma proteína TIC807 usada no método pode compreender um fragmento de proteína inibitória de inseto TIC807 com pelo menos 250 resíduos de aminoácidos de extensão. Em certas modalidades desse método, a expressão dos agentes inibitórios de Lygus fornece um efeito inibitório de Lygus sinérgico. Em outras modalidades desse método, a expressão dos agentes inibitórios de Lygus fornece um efeito inibitório de Lygus aditivo. Pelo uso desse método, a planta pode ser protegida contra Lygus hesperus ou Lygus lineolaris.

A invenção fornece ainda proteínas isoladas, em que a proteína isolada compreende uma sequência de polipeptídeos com pelo menos 9 aminoácidos de extensão que está contida dentro da SEQ ID NO:5. A proteína isolada pode ter uma sequência de polipeptídeos com pelo menos 12, 16,32 ou 250 aminoácidos de extensão. A proteína isolada com pelo menos 32 aminoácidos de extensão pode ter uma sequência de polipeptídeos com pelo menos cerca de 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeos correspondente contida dentro da SEQ ID NO:5. A proteína isolada da invenção pode ser uma proteína inibitória de inseto quando ela tem pelo menos 250 aminoácidos de extensão. A proteína inibitória de inseto isolada com pelo menos 250 aminoácidos pode inibir Lygus. Em certas modalidades, a proteína inibitória de inseto isolada com pelo menos 250 aminoácidos inibe Lygus com uma concentração de proteína na dieta de Lygus de pelo menos cerca de 5 ppm, 50 ppm, 250 ppm ou 500 ppm. A proteína isolada também pode ser a proteína da SEQ ID NO:5. A proteína isolada pode compreender ainda um transportador de proteína. Esse transportador de proteína pode ser uma albumina ou uma proteína KLH. As proteínas isoladas da invenção podem compreender ainda uma modificação covalente selecionada do grupo que consiste em um reagente indicador, um espaçador de aminoácido, um ligante de aminoácido, uma sequência de sinal, uma sequência de peptídeo de transito de cloroplasto, uma sequência direcional vacuolar, uma sequência de parada de transferência, um domínio transmembrana, um ligante de purificação de proteína ou suas combinações.

A invenção também fornece anticorpos que se ligam especifica mente a uma proteína TIC807 ou um epítopo peptídico derivado dela, em que a proteína TIC807 ou o epítopo compreendem pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO:5.

A invenção fornece ainda kits para detecção de uma proteína TIC807 em uma amostra que compreende: a) um anticorpo que se ligue especificamente a uma proteína TIC807 ou epítopo peptídico derivado dela, a proteína ou epítopo compreendendo pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO:5; e b) uma proteína TIC807 de controle ou epítopo peptídico derivado dela, que compreendem pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO:5.

Vantagens e aspectos adicionais da presente invenção, assim como a estrutura e a operação de várias modalidades da presente invenção, estão descritos em detalhes abaixo com relação as figuras anexas.

Breve Descrição das Figuras

As figuras anexas, que estão incorporadas e fazem parte do pedido, ilustram as modalidades da presente invenção e junto com a descrição servem para explicar os princípios da presente invenção. Nas figuras:

a Figura 1 ilustra um alinhamento global de Needleman-Wunsch entre TIC807 (SEQ ID NO:5) e Cry15Aa (SEQ ID NO:41).

Figura 2 ilustra o vetor de transformação de planta pMON105863 mediada por Agrobacterium que contém ambos o cassete de expressão em planta de TIC807 direcionado ao plastídeo e um cassete de seleção com neomicina dentro das sequências de borda de Agrobacterium.

Figura 3 ilustra o vetor de transformação de planta pMON105864 mediada por Agrobacterium que contém ambos um cassete de expressão em planta de TIC807 direcionado ao plastídeo e um cassete de seleção com neomicina dentro das sequências de borda de Agrobacterium.

Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas

I. Definições

Como usada aqui, a frase efeito aditivo, com referência à inibição de inseto, refere-se a um efeito inibitório obtido pela combinação de pelo menos dois agentes inibitórios de inseto distintos que é tanto: a) quantitativamente equivalente ao efeito aditivo predito da combinação dos dois agentes e/ou é b) qualitativamente equivalente a combinação de efeitos obtidos por cada agente administrado sozinho. Exemplos de efeitos quantitativos incluem, mas não são limitados a alterações na LC₅₀, EC₅₀, IC₅₀, percentual de mortalidade ou valores percentuais de subdesenvolvimento indicativos de atividade inibitória de inseto aumentada contra um inseto-alvo conhecido de ambos os agentes inibitórios de inseto. Exemplos de efeitos qualitativos aditivos incluem, mas não são limitados a um espectro expandido de inibição de inseto (isto é, insetos hemípteros e lepidópteros) que reflete a simples combinação do espectro exibido por cada agente inibitório de inseto (isto é, a combinação de inibição de inseto hemíptero fornecida por uma agente e a inibição de inseto lepidóptero fornecida pelo outro agente).

A frase sequência consenso como usada aqui, refere-se a uma sequência de aminoácidos, DNA ou RNA criada pelo alinhamento de duas ou mais sequências homólogas e que dá origem a uma nova sequência que representa a sequência de aminoácidos, DNA ou RNA comum.

A expressão construto como usada aqui, refere-se a qualquer molécula de polinucleotídeo recombinante tal como um plasmídeo, cosmídeo, vírus, molécula de polinucleotídeo que replica autonomicamente, fago ou molécula de DNA ou RNA linear ou circular, de fita única ou fita dupla, derivada de qualquer fonte, capaz de integração genômica ou replicação autônoma, compreendendo uma molécula de polinucleotídeo onde uma ou mais moléculas de polinucleotídeo estão ligadas de uma maneira funcionalmente operativa, isto é, operativamente ligadas.

A frase equivalentes funcionais biológicos como usada aqui, refere-se a peptídeos, polipeptídeos e proteínas que contêm uma sequência ou característica estrutural similar a uma proteína TIC807 da presente invenção e que exibem atividade inibitória de inseto igual ou similar de uma proteína TIC807 da presente invenção. Equivalentes funcionais biológicos também incluem peptídeos, polipeptídeos e proteínas que reagem (isto é, se ligam especificamente) com anticorpos monoclonais e/ou policlonais surgi dos contra uma proteína TIC807 e que exibem atividade inibitória de inseto igual ou similar de uma proteína TIC807.

A frase construto de DNA como usada aqui, refere-se a qualquer molécula de DNA na qual duas ou mais sequências distintas de DNA foram covalentemente ligadas. Exemplos de construtos de DNA incluem, mas não são limitados a plasmídeos, cosmídeos, vírus, BACs (cromossomo artificial de bactéria), YACs (cromossomo artificial de levedura), minicromossomos de planta, sequências que se replicam autonomicamente, derivadas de qualquer fonte, que são capazes de integração genômica ou replicação autônoma. Construtos de DNA podem ser reunidos por uma variedade de métodos incluindo, mas não limitados a técnicas de DNA recombinante, técnicas de síntese de DNA, técnicas de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) ou qualquer combinação de técnicas.

A frase um promotor heterólogo como usada aqui no contexto de um construto de DNA, refere-se tanto a: i) um promotor que é derivado de uma fonte distinta do gene estrutural operativamente ligado quanto ii) a uma promotor derivado da mesma fonte como o gene estrutural operativamente ligado, onde a sequência do promotor é modificada a partir de sua forma original.

A frase condições de alta estringência de hibridização refere-se a condições de hibridização de ácido nucleico que compreendem uma concentração de sal de cerca de 1X SSC, uma concentração de detergente de cerca de SDS 0,1% e uma temperatura de cerca de 50°C ou seus equivalentes.

A expressão homólogo como usada aqui, refere-se a um gene relacionado a um segundo gene pela identidade tanto das sequências de DNA quanto das sequências das proteínas codificadas.Genes que são homólogos podem ser genes separados pelo evento da especiação (veja ortólogo). Genes que são homólogos também podem ser genes separados pelo evento da duplicação genética (veja parálogo). Homólogos podem ser do mesmo ou de um organismo diferente e podem desempenhar a mesma função biológica no mesmo ou em um organismo diferente.

A expressão inseto como usada aqui, refere-se a qualquer forma embrionária, larval, de ninfa ou adulta de um inseto Aracnídeo, Coleóptero, Ctenofalídeo, Díptero, Hemiptero, Homóptero, Heteróptero, Himenóptero ou Lepidóptero.

A frase uma quantidade inibitória de inseto refere-se a uma quantidade de um polipeptídeo de TIC807, um ribonucleotídeo ou uma proteína diferente de TIC807 que resulta em qualquer inibição mensurável do crescimento do inseto, desenvolvimento do inseto, reprodução do inseto, comportamento alimentar do inseto, comportamento sexual do inseto e/ou qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados pela alimentação do inseto sobre uma planta. Similarmente, uma quantidade inibitória de Lygus refere-se a uma quantidade de um polipeptídeo de TIC807, um ribonucleotídeo ou uma proteína diferente de TIC807 que resulta em qualquer inibição mensurável do crescimento de Lygus, desenvolvimento de Lygus, reprodução de Lygus, comportamento alimentar de Lygus, comportamento sexual de Lygus e/ou qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados pela alimentação de Lygus sobre uma planta.

Como usado aqui para se referir a uma molécula de DNA isolada, é pretendido que a molécula de DNA seja aquela que está presente, sozinha ou em combinação com outras composições, mas não dentro de seu meio ambiente natural. Por exemplo, uma sequência codificadora, sequência de íntron, sequência líder não traduzida, sequência promotora, sequência de terminação da transcrição e semelhantes, que são encontradas naturalmente dentro do DNA de um genoma de planta não são consideradas estarem isoladas do genoma de planta desde que elas estejam dentro do genoma de planta no qual elas foram observadas primeiro. Entretanto, cada um desses componentes e subpartes desses componentes poderão ser isolados dentro do escopo dessa descrição desde que as estruturas e componentes não estejam dentro do genoma da planta. Similarmente, uma sequência de nucleotídeos que codifique uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis ou qualquer variante daquela proteína poderá ser uma sequência de nucleotídeos isolada desde que a sequência de nucleotídeos não es teja dentro do DNA da bactéria Bacillus thuringiensis a partir do qual a estrutura foi observada primeiro. Uma sequência de nucleotídeos artificial que codifique a mesma sequência de aminoácidos ou uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica aquela que a sequência de nucleotídeos nativa de Bacillus thuringiensis codifica, poderá ser considerada estar isolada para os propósitos dessa descrição. Para os propósitos dessa descrição, qualquer sequência de nucleotídeos transgênica, isto é, a sequência de nucleotídeos do DNA inserido no genoma das células de uma planta, poderá ser considerada para ser uma sequência de nucleotídeos isolada se ela estiver presente no plasmídeo usado para transformar as células da planta a partir da qual o evento transgênico apareceu, dentro do genoma do evento transgênico, presente em quantidades detectáveis em tecidos, na progênie, amostras biológicas ou produtos de consumo derivados do evento transgênico. A sequência de nucleotídeos ou qualquer fragmento derivado dela poderá, portanto, ser considerada estar isolada ou ser isolável se a molécula de DNA puder ser extraída das células ou tecidos ou de um homogenato de uma planta ou semente ou órgão de planta; ou puder ser produzida como um amplicon a partir do DNA ou RNA extraídos das células, tecidos ou homogenates de uma planta ou semente ou órgão de planta, qualquer um dos quais sendo derivado de tais materiais derivados do evento transgênico.

A frase sequência de ribonucleotídeos que funcione após a ingestão pelo inseto-praga para inibir uma função biológica refere-se a uma sequência de DNA que compreende uma sequência que é substancialmente homóloga a uma molécula de RNA codificada por uma sequência de nucleotídeos dentro do genoma do inseto, que fornece inibição do inseto.

Como usadas aqui, as expressões substancialmente homóloga ou homologia substancial, com referência a uma sequência de ácido nucleico ou de polipeptídeos, refere-se a uma sequência de ácido nucleico ou de polipeptídeos que tem cerca de 65% a cerca de 70% de identidade de sequência, ou mais preferivelmente entre cerca de 80% a cerca de 85% de identidade de sequência ou o mais preferivelmente entre cerca de 90% a cerca de 95% de identidade de sequência, a cerca de 99% ou 100% de iden tidade de sequência, com outra sequência de nucleotídeos ou de polipeptideos.

Como usada aqui, a frase efeito sinérgico, com referência a inibição de inseto, refere-se a um efeito inibitório obtido pela combinação de pelo menos dois agentes inibitórios de inseto distintos que é tanto: a) quantitativamente maior do que o efeito aditivo predito da combinação dos dois agentes e/ou é b) qualitativamente distinto de quaisquer efeitos obtidos por cada agente administrado sozinho. Exemplos de efeitos quantitativos incluem, mas não são limitados a alterações na LC_50> EC₅₀, IC₅₀, percentual de mortalidade ou valores percentuais de subdesenvolvimento indicativos de atividade inibitória de inseto aumentada contra um inseto-alvo conhecido de ambos os agentes inibitórios de inseto. Exemplos de efeitos qualitativos sinérgicos incluem, mas não são limitados a um espectro expandido de inibição de inseto (isto é, inibição de insetos hemípteros, homópteros e lepidópteros) que não reflete a simples combinação do espectro exibido por cada agente inibitório de inseto sozinho (isto é, a combinação de inibição de inseto hemíptero fornecida por uma agente e a inibição de inseto lepidóptero fornecida pelo outro agente).

A frase proteína TIC807 como usada aqui, refere-se a uma proteína inibitória de inseto com pelo menos 250 aminoácidos que exibe pelo menos 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeos correspondente contida dentro da SEQ ID NO:5.

A frase proteína relacionada à TIC807 como usada aqui, refere-se a uma proteína inibitória de inseto com pelo menos 250 aminoácidos que exibe pelo menos 45% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeos correspondente contida dentro da SEQ ID NO:5.

A frase operativamente ligado como usada aqui, refere-se à ligação de sequências de ácido nucleico, tal que uma sequência pode fornecer uma função necessária para uma sequência ligada. No contexto de um promotor, operativamente ligado significa que o promotor está conectado com uma sequência de interesse tal que a transcrição daquela sequência de interesse é controlada e regulada por aquele promotor. Quando a sequência de interesse codifica uma proteína e quando a expressão daquela proteína é desejada, operativamente ligado significa que o promotor está ligado à sequência de tal maneira que o transcrito resultante será eficientemente traduzido. Se a ligação do promotor com a sequência codificadora é uma fusão transcricional e a expressão da proteína é desejada, a ligação é feita de maneira que o primeiro códon de iniciação da tradução no transcrito resultante seja o códon de iniciação da sequência codificadora. Alternativamente, se a ligação do promotor com a sequência codificadora é uma fusão traducional e a expressão da proteína é desejada, a ligação é feita de maneira que o primeiro códon de iniciação da tradução na sequência 5’ não traduzida associada com o promotor e está ligado tal que o produto resultante da tradução está em fase com a fase de leitura aberta traducional que codifica a proteína v/vkjMViiLiuv CÍVIMW HWOIUIVU VJMO OUI UjJGI Cl IIVC1II ICI IIC II” gadas incluem, mas não são limitadas a sequências que fornecem funções de expressão de gene (isto é, elementos de expressão de gene tais como promotores, regiões 5’ não traduzidas, introns, regiões codificadoras de proteína, regiões 3’ não traduzidas, sítios de poliadenilação e/ou terminadores transcricionais), sequências que fornecem transferência de DNA e/ou funções de integração (isto é, sequências de borda de T-DNA, sítios de reconhecimento de recombinase específica para o sítio, sítios de reconhecimento de integrase), sequências que fornecem funções seletivas (isto é, marcadores de resistência a antibióticos, genes biossintéticos), sequências que fornecem funções de marcador rastreável (isto é, genes repórteres), sequências que facilitam as manipulações in vitro ou in vivo das sequências (isto é, sequências poliligantes, sequências de recombinação específicas para o sítio) e sequências que fornecem funções de replicação (isto é, origens bacterianas de replicação, sequências de replicação autônoma, sequências centroméricas).

Como usadas aqui, as frases ou expressões identidade de sequência, similaridade de sequência ou homologia são usadas para descrever relacionamentos de sequência entre duas ou mais sequências de nucleotídeos. O percentual de identidade de sequência entre duas sequên cias é determinado pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação, em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) quando comparada com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. O percentual é calculado pela determinação do número de posições nas quais a base de ácido nucleico ou o resíduo de aminoácido ocorrem em ambas as sequências para se obter o número de posições pareadas, dividindo o número de posições pareadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para se obter o percentual de identidade de sequência. Uma sequência que é idêntica em cada posição na comparação com uma sequência de referência é dita ser idêntica à sequência de referência e vice-versa. Uma primeira sequência de nucleotídeos quando observada na direção 5’ para 3’ é dita ser um complemento ou complementar a uma segunda sequência ou sequência de referência de nucleotídeos observada na direção 3’ para 5’, se a primeira sequência de nucleotídeos exibe complementaridade completa com a segunda sequência ou sequência de referência. Como usado aqui, moléculas de sequências de ácido nucleico são ditas exibir complementaridade completa quando cada nucleotídeo de uma das sequências lida de 5’ para 3’ é complementar a cada nucleotídeo da outra sequência quando lida de 3’ para 5’. Uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência de nucleotídeos de referência exibirá uma sequência idêntica ao inverso da sequência de complemento da sequência de nucleotídeo de referência.

Como usada aqui, a frase sequência de polipeptídeo correspondente contida dentro da SEQ ID NO:5 refere-se a uma sequência de polipeptídeos dentro da SEQ ID NO:5 que obterá o percentual de identidade mais alto quando alinhada com outra sequência de polipeptídeo.

Como usada aqui, uma janela de comparação refere-se a um segmento conceituai de pelo menos 6 posições contíguas, geralmente cerca de 50 a cerca de 100, mais geralmente cerca de 100 a cerca de 150, no qual uma sequência é comparada a uma sequência de referência com o mesmo número de posições contíguas após as duas sequências estarem otimamente alinhadas. A janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) de cerca de 20% ou menos quando comparada com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ótimo de duas sequências. Aqueles versados na técnica podem consultar os métodos detalhados usados para o alinhamento de sequência no Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis., USA) ou consultar Ausubel et al. (1998) para uma discussão detalhada de análise de sequência.

A expressão regeneração como usada aqui, refere-se a qualquer método de obtenção de uma planta completa a partir de uma semente, uma célula de planta, um grupo de células de planta, tecido de calo planta ou um pedaço retirado de uma planta.

A expressão transformação como usada aqui refere-se a um processo para introduzir uma sequência de DNA exógeno (por exemplo, um vetor, uma molécula de DNA recombinante) em uma célula ou protoplasto, no qual o DNA exógeno é incorporado em um cromossomo ou é capaz de replicação autônoma.

A expressão planta transgênica refere-se a uma planta ou sua progênie derivada de uma célula de planta ou protoplasto transformados, em que o DNA da planta contém uma molécula de DNA exógeno introduzida não originalmente presente em uma planta nativa, não transgênica da mesma espécie.

As frases RNA estabilizado, dsRNA estabilizado e siRNA estabilizado referem-se a combinações de RNA transcrito, com orientação em senso e antissenso, separadas por sequências curtas que permitem a formação de uma estrutura em forma de grampo ou semicircular na molécula de RNA.

A frase tecido vascular como usada aqui refere-se a quaisquer tecidos ou células contidas dentro do feixe vascular de uma planta, incluindo, mas não limitado a células ou tecidos de floema, protofloema, metafloema, xilema, protoxilema ou metaxilema.

A expressão vetor como usada aqui, refere-se a qualquer construto de polinucleotídeo recombinante que pode ser usado para o propósito da transformação, isto é, a introdução de DNA heterólogo em uma célula hospedeira.

II. Polinucleotídeos da Invenção

Uma variedade de polinucleotídeos que codificam proteínas inibitórias de inseto TIC807 são considerados por essa invenção. Tais polinucleotídeos são úteis para a produção de proteínas inibitórias de inseto TIC807 em células hospedeiras quando operativamente ligados a um promotor adequado, sequências de terminação da transcrição e/ou poliadenilação. Tais polinucleotídeos também são úteis como sondas para isolamento de polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos que codifiquem proteínas TIC807.

Uma fonte de polinucleotídeos que codificam TIC807 é a cepa de Bacillus thuringiensis que contém o polinucleotídeo de TIC807 de SEQ ID NO:4, que codifica o polipeptídeo TIC807 de SEQ ID NO:5. Essa sequência de polinucleotídeos foi isolada originalmente de um Bacillus thuringiensis hospedeiro e, assim, é adequada para a expressão do polipeptídeo de TIC807 codificado em outros hospedeiros bacterianos. Por exemplo, a SEQ ID NO:4 pode ser usada para expressar a proteína TIC807 em hospedeiros bacterianos que incluem, mas não são limitados a células bacterianas hospedeiras de Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas e Rhizobium. As sondas de SEQ ID NO:4 também são úteis como sondas para o isolamento de polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos que codificam proteínas TIC807. Tais sondas podem ser usadas para identificar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos derivados de cepas de Bacillus.

O polinucleotídeo que codifica proteínas TIC807 também pode ser sintetizado de novo a partir de uma sequência de polipeptídeos de TIC807. A sequência do gene do polinucleotídeo pode ser deduzida a partir de uma sequência de polipeptídeos de TIC807 através do uso do código genético. Programas de computador, tais como BackTranslate (GCG® Pac kage, Acclerys, Inc. San Diego, CA) podem ser usados para converter uma sequência de peptídeos na sequência de nucleotídeos correspondente que codifica o peptídeo. Exemplos de sequências de polipeptídeo de TIC807 que podem ser usadas para se obter sequências que codificam os nucleotídeos correspondentes incluem, mas não são limitados a sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO:5 de TIC807.

Além disso, sequências sintéticas de polipeptídeo de TIC807 da invenção podem ser planejadas de maneira que elas serão expressas na planta. A Patente U.S. N² 5.500.365 descreve um método para a síntese de genes de planta para aperfeiçoar o nível de expressão da proteína codificada pelo gene sintetizado. Esse método refere-se a modificação das sequências do gene estrutural do transgene exógeno, tornando-os mais eficientemente transcritos, processados, traduzidos e expressos pela planta. Características de genes que são bem expressos na planta incluem a eliminação de sequências que podem causar junção de íntron indesejado ou poliadenilação na região codificadora de um transcrito de gene, enquanto se retém substancialmente a sequência de aminoácidos da porção tóxica da proteína inseticida. Um método similar para se obter expressão intensificada de transgenes em plantas monocotiledôneas é descrito na Patente U.S. N²5.689.052. Sequências de polinucleotídeos exemplares planejadas para a expressão de uma proteína TIC807 em plantas incluem, mas não são limitadas a SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:53.

III. Oliqonucleotídeos isolados, Kits e Métodos para Isolamento e/ou Detecção de Polinucleotídeos que Codificam Proteínas TIC807

Oligonucleotídeos isolados para identificação, detecção ou isolamento de polinucleotídeos que codificam proteínas TIC807 também são fornecidos pela presente invenção.

Em uma modalidade, os oligonucleotídeos isolados compreendem pelo menos 12 nucleotídeos contíguos de uma sequência contida dentro do gene que codifica TIC807 de SEQ ID NO:4 de Bacillus thuringiensis ou contida dentro de um complemento de SEQ ID NO:4. Tais oligonucleotídeos podem ser usados na hibridização ou em métodos baseados em PCR para a identificação e o isolamento de polinucleotídeos que codificam proteínas TIC807 a partir de cepas de Bacillus thuringiensis. Tais oligonucleotídeos podem ser usados também para confirmar a presença ou a ausência de um polinucleotídeo que codifique TIC807 em uma célula hospedeira. Reconhece-se ainda que os oligonucleotídeos podem ser usados para mutagenizar a SEQ ID NO:4 quando eles compreendem sequências adicionais que compreendem não pareamentos com a SEQ ID NO:4. Tais oligos para mutagênese são úteis para a identificação de variantes de TIC897 com atividade inibitória de inseto intensificada.

Em outra modalidade, os oligonucleotídeos isolados compreendem pelo menos 12 nucleotídeos contíguos de uma sequência contida dentro do polinucleotídeo de SEQ ID NO:6 ou contida dentro de um complemento de SEQ ID NO:6. O polinucleotídeo de SEQ ID NO:6 é designado especificamente para expressão em plantas transgênicas e codifica a proteína TIC807 de SEQ ID NO:5. Em outras modalidades ainda, os oligonucleotídeos isolados compreendem pelo menos 12 nucleotídeos contíguos de uma sequência contida dentro do polinucleotídeo de SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NQ:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:53 ou contida dentro do complemento de SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NQ:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:53. Tais oligonucleotídeos podem ser usados na hibridização ou em métodos baseados em PCR para detectar polinucleotídeos de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:53 em amostras derivadas de plantas transgênicas. Quando a amostra é uma amostra de ácido ribonucleico, os oligonucleotídeos podem ser usados na hibridização ou métodos baseados em PCR para quantificar os níveis de expressão do transgene de TIC807. Quando a amostra é uma amostra de ácido desoxirribonucleico, os oligonucleotídeos podem ser usados na hibridi zação ou métodos baseados em PCR para determinar a presença ou a ausência do transgene de TIC807 na amostra. Também é antecipado que os oligonucleotídeos derivados de SEQ ID NO:6 podem ser usados para determinar a presença ou a ausência de um transgene de TIC807 em uma amostra de ácido desoxirribonucleico derivada de um produto de consumo. Dada a excelente sensibilidade de certos métodos de detecção de ácido nucleico que empregam oligonucleotídeos, é antecipado que os oligonucleotídeos derivados de SEQ ID NO:6 também podem ser usados para detectar um transgene de TIC807 em produtos de consumo derivados de fontes combinadas, onde apenas uma fração do produto de consumo é derivada de uma planta transgênica contendo a SEQ ID NO:6. Reconhece-se ainda que os oligonucleotídeos podem ser usados para mutagenizar a SEQ ID NO:6 quando eles compreendem sequências adicionais que compreendem não pareamentos com a SEQ ID NO:6. Tais oligos para mutagênese são úteis para a identificação de variantes de TIC897 com atividade inibitória de inseto intensificada e/ou expressão aumentada em células hospedeiras de planta transgênica.

Entende-se, é claro, que os oligonucleotídeos da invenção podem compreender ainda sequências adicionais que não são idênticas ou complementares às sequências de polinucleotídeos que codificam proteínas TIC807. As sequências adicionais podem incluir, mas não se limitam a sequências usadas como adaptadores que facilitam a clonagem, mutagênese ou a detecção. Os oligonucleotídeos da invenção podem compreender ainda modificações covalentes adicionais. As modificações covalentes podem incluir, mas não são limitadas a marcadores detectáveis tais como isótopos, fluoróforos e haptenos. A biotina é um hapteno particularmente útil.

Kits para a detecção de uma sequência de polinucleotídeo de TIC807 em uma amostra que compreende pelo menos um oligonucleotídeo que hibridiza especificamente com a sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:53 ou seus complementos também são considerados por essa invenção.

No contexto de kits dessa invenção, a expressão hibridiza especificamente significa que os oligonucleotídeos hibridizarão e detectarão as SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:53 em uma amostra de uma planta transformada com uma ou mais cópias de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NQ:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:53, mas não hibridizarão e detectarão quaisquer outras sequências em uma planta não transgênica de controle que não contenha as SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:53. Esses kits também podem compreender um polinucleotídeo de controle que hibridize com o dito oligonucleotídeo, instruções de uso e/ou reagentes para hibridização ou detecção de hibridização dos oligonucleotídeos de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:53. Em certas aplicações, incluindo, mas não limitadas àquelas que usam uma Reação em Cadeia da Polimerase, os kits compreenderão naturalmente mais do que um oligonucleotídeo que hibridiza especificamente com a sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:53.

IV. Oligonucleotídeos Degenerados, Composições de Oligonucleotídeos Degenerados e Métodos de Uso

Oligonucleotídeos degenerados, composições compreendendo oligonucleotídeos degenerados e métodos para usar tais oligonucleotídeos para identificar, detectar ou isolar polinucleotídeos que codificam a proteína TIC807 também são considerados por essa invenção. Embora tais oligonucleotídeos degenerados sejam derivados da SEQ ID NO:5, aqueles versados na técnica compreenderão que tais oligonucleotídeos podem ser usados para identificar uma variedade de proteínas TIC807 e proteínas relacionadas a TIC807. Tais proteínas TIC807 são preditas ter pelo menos 70%, 80%,

90%, 95%, 98% e 100% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO:5 e ter atividade inibitória de inseto. As proteínas relacionadas a TIC807 têm pelo menos 45% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5 e têm atividade inibitória de inseto.

O planejamento de sequências de oligonucleotídeos degenerados a partir de sequências de peptídeo é alcançado através do uso do código genético, de acordo com o qual os códons correspondentes a cada um dos aminoácidos codificados são sintetizados. Oligonucleotídeos degenerados podem compreender também uma combinação de oligonucleotídeos que compreendem todas as sequências em potencial que codificam uma dada sequência de peptídeo. Alternativamente, os oligonucleotídeos degenerados também podem compreender uma sequência que contém uma base neutra (isto é, uma base que pode parear adequadamente com todos os nucleotídeos em uma dada posição). As bases neutras incluem, mas não se limitam a inosina. Considerações envolvidas no planejamento e uso de iniciadores ou sondas de oligonucleotídeos degenerados são bem conhecidas por aqueles versados na técnica (veja Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira Edição), Sambrook e Russell, Cold Spring Harbor Press, 2001).

Essa invenção descreve e reivindica composições compreendendo pelo menos dois iniciadores de oligonucleotídeos degenerados com pelo menos 12 nucleotídeos da sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO:5. Tais composições também podem ser usadas na hibridização ou em métodos baseados na reação em cadeia da polimerase para isolamento e detecção de polinucleotídeos que codifiquem proteínas TIC807 ou proteínas relacionadas a TIC807. Os oligonucleotídeos degenerados dessa composição podem compreender ainda sequências adicionais que não são idênticas ou complementares às sequências de polinucleotídeos que codificam proteínas TIC807. As sequências adicionais podem incluir, mas não se limitam a sequências usadas como adaptadores que facilitam a clonagem, mutagênese ou a detecção. Os oligonucleotídeos degenerados da invenção podem compreender ainda modificações covalentes adicionais. As modificações covalentes podem incluir, mas não são limitadas a marcadores detectáveis tais como isótopos, fluoróforos e haptenos. A biotina é um hapteno particularmente útil.

O uso de iniciadores de oligonucleotídeos degenerados em métodos baseados em PCR para isolamento ou detecção de polinucleotídeos que codifiquem uma proteína TIC807 ou uma proteína relacionada a TIC807 em uma amostra é especificamente considerado. Resumidamente, um par de iniciadores de oligonucleotídeos degenerados capazes de produzir um amplicon é selecionado e usado em uma reação em cadeia da polimerase com uma amostra que contém um polinucleotídeo que codifique uma proteína TIC807 ou uma proteína relacionada a TIC807. Uma fonte adequada de amostras para esse método inclui, mas não está limitada a várias cepas de Bacillus thuringiensis. Os oligonucleotídeos degenerados são capazes de produzir um amplicon quando os oligonucleotídeos correspondem a sequências preditas de fita senso e antisenso e estão em uma orientação de 5’ para 3’ que iniciará a síntese mediada pela DNA polimerase de uma fita de DNA que é complementar ao outro oligonucleotídeo em oposição. Os iniciadores de oligonucleotídeos degenerados são derivados de uma sequência de polipeptídeos de TIC807 de SEQ ID NO:5. Esse amplicon pode ser detectado pelo uso de um corante introduzido para produzir um amplicon. O amplicon também pode ser isolado pela clonagem do fragmento de amplicon isolado em um plasmídeo, cosmídeo, bacteriófago ou outro vetor de clonagem. Uma vez clonado, esse amplicon pode ser ainda caracterizado pelo sequenciamento para determinar o percentual de identidade do amplicon-proteína codificada com TIC807 (SEQ ID NO:5). Está previsto que polinucleotídeos que codificam proteínas TIC807 com pelo menos 70% ou pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:5 e proteínas relacionadas com TIC807 com pelo menos 45% de identidade com a SEQ ID NO:5 podem ser detectados ou isolados por esses métodos. Tais proteínas TIC807 ou proteínas relacionadas com TIC807 podem ser, subsequentemente, selecionadas quanto a atividade inibitória de inseto.

Os oligonucleotídeos degenerados de TIC807 também podem ser usados como sondas em métodos baseados na hibridização para detectar ou isolar polinucleotídeos que codificam proteínas TIC807 ou proteínas relacionadas com TIC807. Métodos para a detecção de um polinucleotídeo que codifique uma proteína TIC807 em uma amostra, compreendem primeiro selecionar um oligonucleotídeo degenerado ou uma coleção de oligonucleotídeo degenerado derivado de uma sequência de polipeptídeo de TIC807 de SEQ ID NO:5. Esses oligonucleotídeos degenerados podem compreender ainda marcadores detectáveis tais como isótopos, fluoróforos e haptenos. A biotina é um hapteno particularmente útil. As amostras incluem, mas não são limitadas a amostras derivadas de várias cepas de Bacillus thuringiensis. A amostra pode ser uma biblioteca de plasmídeo, cosmídeo ou clones de bacteriófagos derivados de uma ou mais cepas de Bacillus thuringiensis. O oligonucleotídeo degenerado ou a coleção de oligonucleotídeos degenerados são hibridizados à amostra sob condições de estringência adequadas. Essas condições estão relacionadas a extensão do(s) oligonucleotídeo(s) degenerado(s), ao grau de degeneração, seu conteúdo G+C, ao percentual de identidade de sequência desejado ou projetado das sequências-alvo na amostra e outros fatores. A hibridização a um polinucleotídeo é detectada por métodos que incluem, mas não se limitam a métodos radiométricos, fluorométricos, luminométricos e/ou baseados em ELISA. Após a detecção, o polinucleotídeo pode ser isolado por diluição seriada e rehibridização. Todas as etapas acima relacionadas de planejamento de oligonucleotídeo degenerado, marcação de oligonucleotídeo, preparação de biblioteca, hibridização, detecção e isolamento são bem conhecidas por aqueles versados na técnica ((veja Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira Edição), Sambrook e Russell, Cold Spring Harbor Press, 2001). Está previsto que polinucleotídeos que codificam proteínas TIC807 com pelo menos 70% ou pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:5 e proteínas relacionadas com TIC807 com pelo menos 45% de identidade com a SEQ ID NO:5 podem ser detectados ou isolados por esses métodos. Tais proteínas TIC807 ou proteínas relacionadas com TIC807 podem ser, subsequentemente, selecionadas quanto a atividade inibitória de inseto após a expressão em uma cepa acristalífera de Bacillus thuríngiensis. As proteínas TIC807 ou proteínas relacionadas à TIC807 podem inibir uma praga de hemíptero tal como Lygus. Alternativamente, as proteínas TIC807 ou proteínas relacionadas à TIC807 podem inibir outros insetos-praga incluindo pragas de Aracnídeos, Coleópteros, Ctenofalídeos, Dípteros, Himenópteros ou Lepidópteros ou podem inibir ambas as pragas de hemípteros e de outras famílias de insetos-praga.

V. Construtos de DNA Compreendendo Cassetes de Expressão Bacteriana de TIC807

Para expressar proteínas TIC807 em hospedeiros bacterianos, polinucleotídeos que codificam TIC807 são operativamente ligados a promotores adequados e sequências de terminação da transcrição que funcionam em hospedeiros bacterianos para se obter cassetes de expressão bacterianos. Promotores e sinais de terminação que funcionam em células bacterianas podem ser derivados de genes bacterianos, genes de bacteriófagos ou métodos sintéticos. Esses cassetes de expressão podem então ser transferidos para vetores bacterianos adequados que compreendem origens de replicação e marcadores selecionáveis através de técnicas de DNA recombinante padronizadas.

Na prática dessa invenção, promotores bacterianos, sinais de terminação e vetores que funcionam em Bacillus hospedeiros são particularmente úteis para a expressão de polipeptídeos de TIC807. Em muitos casos, o gene de TIC807 que compreende seu promotor endógeno e as sequências de terminação pode ser usado para a expressão de proteínas TIC807 em células hospedeiras de Bacillus que incluem, mas não se limitam a Bacillus thuríngiensis hospedeiros. Para tais experimentos, o uso de um vetor de transferência que funcione em ambos os hospedeiros, E. coli e Bacillus é particularmente útil. Exemplos de tais vetores de transferência incluem, mas não são limitados a vetores tais como pEG854 descrito na Patente U.S. N² 5.650.308. Esses vetores de transferência incluem genes marcadores de resistência a antibiótico permitindo a transformação de Bacillus hospedeiros. Bacillus thuríngiensis hospedeiros preferidos incluem, mas não são limitados a cepas hospedeiras acristaliferas de B. thuringiensis (deficiente em proteína Cry) tais como EG10368 e EG10650 (descritas na Patente U.S. N- 5.759.538). Quando a proteína TIC807 é expressa em cepas hospedeiras acristaliferas de B. thuringiensis (deficiente em proteína Cry), a proteína TIC807 é facilmente isolada como um cristal parasporal após a indução de esporulação nas células hospedeiras. Esse sistema fácil de expressão em Bacillus thuringiensis pode ser assim usado para testar grandes números de variantes de proteína TIC807 quanto a atividade inibitória de inseto.

VI. Construtos de DNA que Compreendem Cassetes de Expressão em Planta de TIC807

A construção de cassetes de expressão para uso em plantas monocotiledôneas ou plantas dicotiledôneas está bem estabelecida. Cassetes de expressão são construtos de DNA onde várias sequências promotoras, codificadoras e de poliadenilação estão operativamente ligadas. Em geral, cassetes de expressão compreendem tipicamente um promotor que está operativamente ligada a uma sequência de interesse que está operativamente ligado a uma sequência de interesse que está operativamente ligada a uma região de poliadenilação ou de terminação. Em certas circunstânncias que incluem, mas não se limitam a expressão de transgenes em plantas monocotiledôneas, também pode ser útil incluir uma sequência de íntron. Quando uma sequência de íntron é incluída, ela é tipicamente colocada em uma região líder 5’ não traduzida do transgene. Em certas circunstancias, também pode ser útil incorporar sequências 5’ não traduzidas específicas em um transgene para intensificar a estabilidade do transcrito ou para promover a tradução eficiente do transcrito.

Uma variedade de promotores pode ser usada na prática dessa invenção. Uma ampla classe de promotores úteis é referida como promotores constitutivos já que eles são ativos na maioria dos órgãos de planta durante o desenvolvimento da planta. Por exemplo, o promotor pode ser um promotor viral, tal como um promotor CaMV35S ou FMV35S. Os promotores CaMV35S e FMV35S são ativos em uma variedade de tecidos de planta transformada e na maioria dos órgãos de planta (por exemplo, calo, folha, semente e raiz). Versões intensificadas ou duplicadas dos promotores CaMV35S e FMV35S são particularmente úteis na prática dessa invenção (Patente U.S. N^s 5.378.619). Outros promotores úteis são promotores de nopalina sintase (NOS) e octopina sintase (OCS) (que são transportados em plasmídeos que induzem tumor de A. tumefaciens), os promotores 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), o promotor de ubiquitina do milho, o promotor Act1 de arroz e o promotor 35S do Vírus do Mosaico da Escrofulária (FMV) (veja, por exemplo, Patente U.S. N² 5.463.175). Deduz-se que esse grupo de promotores exemplares não é limitante e que aquele versado na técnica pode empregar outros promotores que não estão explicitamente citados aqui na prática dessa invenção.

Promotores que são ativos em certos tecidos de planta (isto é, promotores específicos para tecidos) também podem ser usados para dirigir a expressão de proteínas TIC807 ou de outros agentes inibitórios de inseto. Como certos insetos-pragas hemípteros são insetos perfurantes/sugadores que se alimentam tipicamente pela inserção de suas proboscides no tecido vascular das plantas hospedeiras, promotores que direcionam a expressão de agentes inibitórios de inseto no tecido vascular das plantas transgênicas são particularmente úteis na prática dessa invenção. Vários promotores de Caulimovírus incluindo, mas não limitado aos promotores CaMV35S, CaMV19S, FMV35S e suas versões intensificadas ou duplicadas, tipicamente liberam altos níveis de expressão em tecidos vasculares e são, assim, úteis para a expressão de proteínas TIC807 ou outros agentes inibitórios de inseto. Vírus limitados ao floema tais como o vírus do tungro do arroz (Bhattacharyya-Pakrasi et al., Plant J. 4[1] 71-79, 1993) e o vírus da mancha amarela de comelina (Medberry et al., Plant Cell 4:185-192, 1992) também contêm promotores úteis que são ativos em tecidos vasculares. Para o controle de insetos hemípteros que se alimentam do floema, promotores específicos para a célula do floema ou preferidos para o floema podem ser usados para expressar proteínas TIC807 ou outros agentes inibitórios de inseto no floema de plantas transgênicas. Exemplos de promotores úteis específicos para o floema incluem, mas não são limitados a promotores de gene tipo PP2 (Pa37 tente U.S. Ν- 5.495.007), promotores de sacarose sintase (Yang and Russell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148, 1990), promotores de glutamina sintetase (Edwards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3459-3463, 1990) e promotores H+-ATPase da membrana plasmática específicos para floema (DeWitt et al., Plant J. 1 [1]: 121-128, 1991), promotores de prunasina hidrolase (Patente U.S. N² 6.797.859) e um transportador de sacarose de arroz (Patente U.S. N² 7.186.821). Para o controle de pragas hemipteras que se alimentam do tecido do xilema, uma variedade de promotores que são ativos no tecido do xilema incluindo, mas não limitado ao protoxilema ou metaxilema podem ser usados. Promotores ativos no tecido do xilema incluem, mas não se limitam a promotores associados com as vias biossintéticas de fenilpropanoide, tais como promotores de fenilalanina amônia-liase (PAL), rio nínomo+n Λ Kíz-lr-z-x-vríloo*' o ^/1VIHVIVIVO unidii icáiv T“l HUI VAlldbc? ρΓνΓΠυΐυΐ ÜÔ UC UUllldfCtLU ohidroxilase, promotores de O-metil transferase (OMT), promotores de 4cumarato:CoA ligase (4CL) (Patente U.S. N² 6.831.208), promotores de cinamoil-CoA redutase (CCR) promotores de cinamil álcool desidrogenase (CAD).

Elementos intensificadores transcricionais também podem ser usados em conjunto com qualquer promotor que seja ativo em uma célula de planta ou com qualquer elemento promotor basal que requeira um intensificador para atividade em uma célula de planta. Elementos intensificadores transcricionais podem ativar a transcrição em várias células de planta e têm geralmente 100-200 pares de bases de extensão. Os elementos intensificadores podem ser obtidos por síntese química ou pelo isolamento a partir de elementos regulatórios que incluem tais elementos e podem compreender nucleotídeos flanqueadores adicionais que contêm sítios de enzimas de restrição úteis para facilitar a manipulação da subseqüência. Elementos intensificadores podem ser colocados, tipicamente, na região 5’ do sítio cap de mRNA associados com um promotor, mas também podem ser localizados em regiões que estão a 3’ do sítio cap (isto é, dentro da região 5’ não traduzida, um intron ou a 3’ de um sítio de poliadenilação) para fornecer níveis aumentados de expressão de genes operativamente ligados. Elementos in tensificadores também podem ser multimerizados (fornecidos em qualquer número finito de cópias ligadas) para fornecer níveis aumentados de expressão de genes operativamente ligados. Intensificadores multimerizados incluem, mas não são limitados a cópias em duplicata, triplicata ou quadruplicata de intensificadores em qualquer orientação ou combinação de orientações. Intensificadores são geralmente derivados de promotores virais de planta, particularmente aqueles do grupo de Culimoviridae com DNA de fita dupla, que compreende os caulimovírus e badnavírus. Os promotores virais de planta ou intensificadores virais derivados de planta podem fornecer expressão constitutiva acentuada de genes operativamente ligados em plantas transgênicas. Intensificadores derivados de fragmentos desses promotores demonstraram intensificar eficazmente o desempenho de promotores que direcionam a expressão de transgenes em plantas. Exemplos de vírus de planta úteis para o isolamento de intensificadores incluem, mas não são limitados ao vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (veja, por exemplo, Odel et al., Nature 313:810, 1985), o vírus do mosaico da escrofulária (Patente U.S. N- 5.378.619), o vírus da ferrugem circular do cravo (CERV) (Hull et al., (1986) EMBO Journal 5:3083-3090), o vírus do mosaico da nervura da mandioca (CsVMV) (Calvert et al. (1995) J. Gen. Virol. 76:1271-1278 e Patente U.S. N² 6.963.021), o vírus do mosaico da maravilha (MMV) (Dey et al. (1999) Plant Mol Biol. 40:771-82), o virus da folha amarela enrolada de Oestrum (CmYLCV) (Stavolone et al. (2003) Plant Mol Biol. 53:663-73), virus Multan da folha enrolada do algodão (CLCuMV) (Xie et al. (2003) Plant Mol Biol. 53:1-14), vírus da mancha amarela de comelina (CoYMV) (Patente U.S. N² 6.963.021) e o caulimovírus da listra clorótica do amendoim (PCLSV) (Patente U.S. N² 5.850.019). Duplicações de intensificadores são usadas em versões intensificadas dos promotores CaMV 35S e FMV 35S.

Várias sequências líder 5’ não traduzidas também podem ser operativamente ligadas a uma sequência codificadora de interesse em um cassete de expressão em planta. Assim, o cassete de expressão em planta pode conter uma ou mais sequências líder 5’ não traduzidas que servem para aumentar a expressão de sequências codificadoras de ácido nucleico operativamente ligadas, codificando tanto TIC807 quanto outras proteínas de interesse. Sem tentar ser limitado pela teoria, tais sequências líder 5’ não traduzidas podem aumentar a eficiência traducional do mRNA resultante e/ou aumentar a estabilidade do mRNA resultante para fornecer níveis aumentados da proteína de interesse operativamente ligada e codificada na planta transgênica. Exemplos de outras sequências líder 5’ incluem, mas não se limitam a sequências líder não traduzidas dSSU 5’, PetHSP70 5’ e GmHSP17.9 5’. Uma sequência intensificadora traducional derivada de uma sequência líder não traduzida do mRNA do gene da proteína de revestimento do vírus do mosaico da alfafa pode ser colocada entre o promotor e o gene de interesse para aumentar a eficiência traducional do gene de interesse operativamente ligado (Patente U.S. N² 6.037.527).

Um íntron também pode ser incluído no construto de expressão de DNA, especialmente em circunstâncias nas quais a sequência de interesse é para ser expressa em plantas monocotiledôneas. Para uso em planta monocotiledônea, introns tais como o íntron hsp70 do milho (Patente U.S. N° 5.424.412), o íntron da ubiquitina do milho, o íntron 1 de Adh (Callis et aL, 1987), o íntron de sacarose sintase (Vasil et al., 1989) ou o íntron Act1 de arroz (McElroy et al., 1990) podem ser usados. íntrons para plantas dicotiledôneas que são úteis incluem íntrons tais como o íntron CAT-1 (Cazzonnelli and Velten,2003), o íntron pKANNIBAL (Wesley et al., 2001; Collier et al., 2005), o íntron PIV2 (Mankin et al. , 1997) e o íntron de “Super Ubiquitina” (Patente U.S. N² 6.596.925; Collier et al., 2005) que tenham sido operativamente integrados nos transgenes. Está previsto que esse grupo de íntrons exemplares não é limitante e aquele versado na técnica poderá empregar outros íntrons que não estão explicitamente citados aqui na prática dessa invenção.

Em outras modalidades da invenção, sequências que codificam peptídeos que fornecem a localização de uma proteína TIC807 em organelas subcelulares podem ser operativamente ligadas a sequências que codificam o polipeptídeo de TIC807. Os polipeptídeos de TIC807 que estão operativamente ligados a um peptídeo de sinal são esperados entrar na via de secreção e podem ser retidos pelas organelas tais como o reticulo endoplasmático (ER) ou direcionados para o vacúolo pela ligação operativa dos peptídeos de retenção ou de direcionamento apropriados à terminação C do polipeptídeo de TIC807. Exemplos de peptídeos de direcionamento vacuolar incluem, mas não são limitados ao sinal de direcionamento vacuolar CTPP do gene da lecitina de cevada. Exemplos de peptídeos de direcionamento para o ER incluem, mas não são limitados a um peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de KDEL. Sem tentar ser limitado pela teoria, a localização de polipeptídeos de TIC807 tanto no reticulo endoplasmático quanto no vacúolo pode fornecer propriedades desejadas, tais como expressão aumentada em plantas transgênicas e/ou eficácia aumentada na inibição de insetos em plantas transgênicas.

A localização de proteínas TIC807 em plastídeos de plantas, incluindo mas não limitada a cloroplastos, é considerada aqui especificamente. A localização no plastídeo é tipicamente obtida pela ligação operativa de uma sequência de peptídeo de transito do cloroplasto a terminação N da proteína TIC807. Peptídeos de transito do cloroplasto (ou CTPs) que podem ser usados para localizar as proteínas TIC807 em plantas transgênicas podem ser derivados de proteínas nucleares de planta codificadas que são direcionadas para plastídeos. Proteínas nucleares de planta codificadas que são direcionadas para plastídeos incluem, mas não são limitadas a proteínas envolvidas na biossíntese de lipídeo, amido ou aminoácido, assim como proteínas envolvidas na fotossíntese. Peptídeos de transito de cloroplasto que podem ser usados incluem, mas não são limitados a CTPs de genes de Amido Sintase Ligada a Grânulo codificada, genes de Ácido Graxo Desaturase de plastídeo, genes EPSPS e genes da subunidade pequena de RUBISCO. Um CTP exemplar é o CTP de EPSPS de Arabidopsis. Um ácido nucleico exemplar (SEQ ID NO:7) que codifica um CTP de EPSPS de Arabidopsis que está operativamente ligado a uma proteína TIC807 é aqui fornecido. Sem tentar ser limitado pela teoria, a localização de polipeptídeos de TIC807 em plastídeos pode fornecer propriedades desejadas, tais como expressão aumentada em plantas transgênicas e/ou eficácia aumentada na inibição de insetos em plantas transgênicas. A expressão aumentada de outras proteínas de Bacillus thuringiensis através do uso de peptídeos direcionados para o cloroplasto tais como CrylBb (Pedido de Patente U.S. N- 10/525318), Cry2Ab (Patente U.S. N^s 6.489.542) e Cry3Bb (Patente U.S. N² 6.501.009) foi documentada. Sem ser limitado pela teoria, a expressão aumentada de proteína TIC807 em uma planta transgênica pode fornecer níveis aumentados de inibição de inseto, um espectro expandido de inibição de inseto-praga e/ou um grau aumentado de manuseio de resistência de inseto-praga.

Como observado acima, a sequência de interesse também pode ser operativamente ligada a uma região 3’ não traduzida contendo um sinal de poliadenilação. Esse sinal de poliadenilação fornece a adição de uma sequência poliadenilada à terminação 3’ do RNA. As regiões não traduzidas 3’ do gene de nopalina sintase (NOS) do piasmídeo indutor de tumor (Ti) de Agrobacterium e 3’ do gene ssRUBISCO E9 de ervilha contêm sinais de poliadenilação e representam exemplos não limitantes de tais regiões 3’ não traduzidas que podem ser usadas na prática dessa invenção. É entendido que esse grupo de regiões de poliadenilação exemplares não é limitante e que aquele versado na técnica poderá empregar outras regiões de poliadenilação que não estão explicitamente citadas aqui na prática dessa invenção.

Os construtos de DNA que compreendem cassetes de expressão em planta descritos acima são mantidos tipicamente em vários vetores. Vetores contêm sequências que fornecem a replicação do vetor e sequências covalentemente ligadas em uma célula hospedeira. Por exemplo, vetores bacterianos conterão origens de replicação que permitem a replicação do vetor em um ou mais hospedeiros bacterianos. Vetores de transformação em plantas mediada por Agrobacterium compreendem tipicamente sequências que permitem a replicação em ambas E. coli e Agrobacterium assim como uma ou mais sequências limitantes posicionadas de modo a permitir a integração do cassete de expressão no cromossomo da planta. Tais vetores de Agrobacterium podem ser adaptados para uso tanto em Agrobacterium tumefaciens quanto em Agrobacterium rhizogenes. Os marcadores selecionáveis que codificam genes que conferem resistência a antibióticos também estão tipicamente incluídos nos vetores para fornecer sua manutenção em hospedeiros bacterianos.

VII. Plantas Transoênicas Inibitórias de Inseto e Métodos para Obter Plantas Transqênicas Inibitórias de Inseto

Métodos de obtenção de uma planta transgênica capaz de inibir insetos também são fornecidos por essa invenção. Primeiro, vetores de expressão adequados para a expressão da proteína TIC807 em várias plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas são introduzidos em uma planta, uma célula de planta ou em um tecido de planta usando as técnicas de transformação aqui descritas. Depois, uma planta transgênica contendo ou compreendendo o vetor de expressão de TIC807 é obtida pela regeneração da planta transgênica a partir da planta, célula de planta ou tecido de planta que recebeu o vetor de expressão. A etapa final é obter uma planta transgênica que expresse uma quantidade inibitória de inseto do polipeptídeo de TIC807. Plantas transgênicas que expressam quantidades inibitórias de inseto de proteínas TIC807 consideradas aqui incluem, mas não são limitadas à cevada, milho, aveia, arroz, centeio, sorgo, grama, cana de açúcar, trigo, alfafa, banana, brócolis, feijão, repolho, canola, cenoura, abóbora, couve-flor, aipo, um cítrico, algodão, pepino, eucalipto, linheiro, alho, uva, cebola, alface, ervilha, pimenta, batata, álamo, pinheiro, girassol, açafrão, soja, morango, beterraba, batata-doce, tabaco, tomate, planta ornamental, arbusto, noz, grão-debico, guandu, painço, lúpulo e grama de pastagem.

Vetores de expressão de TIC807 podem ser introduzidos nos cromossomos de uma planta hospedeira através de métodos tais como transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por Rhizobium, transformação mediada por Sinorhizobium, transformação mediada por partícula, transfecção de DNA, eletroporação de DNA ou transformação mediada por vibrissas. Métodos adequados para transformação de plantas incluem quaisquer métodos pelos quais o DNA pode ser introduzido em uma célula, tais como pela eletroporação como ilustrado pela Patente U.S. N²5.384.253; bombardeio com microprojéteis como ilustrado nas Patentes U.S. N— 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; e 6.403.865;

transformação mediada por Agrobacterium como ilustrada nas Patentes U.S. N— 5.635.055; 5.824.877; 5.591.616; 5.981.840; e 6.384.301; e transformação por protoplasto como ilustrada na Patente U.S. N^a 5.508.184, etc. Os métodos acima mencionados para introdução de transgenes são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e estão descritos no Pedido de Patente U.S. N² 20050289673 (transformação do milho mediada por Agrobacterium), Patente U.S. N² (transformação da soja mediada por Agrobacterium), Patente U.S. N^e 6.365.807 (transformação do arroz mediada por partícula), e Patente U.S. N² 5.004.863 (transformação do algodão mediada por Agrobacterium). Através da aplicação de técnicas tais como essas, as células de virtualmente qualquer espécie de planta podem ser estavelmente transformadas e essas células desenvolvidas em plantas transgênicas. Outras técnicas que podem ser particularmente úteis no contato da transformação do algodão estão descritas nas Patentes U.S. N— 5.846.797; 5.159.135 e 6.624.344; e técnicas para a transformação de plantas de Brassica estão descritas, em particular, por exemplo, na Patente U.S. N² 5.750.871; e técnicas para a transformação de soja estão descritas, por exemplo, em Zhang et al., 1999 e na Patente U.S. N^Q 6.384.301; e técnicas para a transformação de milho estão descritas no WO9506722. Métodos para usar bactérias tais como Rhizobium ou Sinorhizobium para transformar plantas estão descritos em Broothaerts et al., Nature, 2005, 10:433:629-33). Entende-se ainda que o vetor de expressão de TIC807 pode compreender sítios de recombinação específicos para sítio atuante em cis reconhecidos pelas recombinases específicas para o sítio, incluindo Ore, Flp, Gin, Sre, pinD, lnt-B13 e R. Métodos para a integração de moléculas de DNA em localizações específicas nos genomas de plantas transgênicas através do uso de recombinases específicas para o sítio podem ser usados (Patente U.S. N° 7.102.055). Aqueles versados na técnica avaliarão que qualquer uma dessas técnicas de transferência de gene pode ser usada para introduzir o vetor de expressão no cromossomo de uma célula de planta, um tecido de planta ou em uma planta.

O uso de vetores de transformação de planta que compreendem duas moléculas separadas de T-DNA, um T-DNA contendo o gene ou genes de interesse (isto é, um ou mais genes inibitórios de inseto de interesse) e outro T-DNA contendo um gene marcador selecionável e/ou registrável, também é considerado. Nesses dois vetores de T-DNA, o cassete ou cassetes de expressão em planta compreendendo o gene ou genes de interesse estão contidos dentro de um grupo de sequências de borda de T-DNA e o cassete ou cassetes de expressão em planta compreendendo os genes marcadores selecionáveis e/ou registráveis estão contidos dentro de outro grupo de sequências de borda de T-DNA. Nas modalidades preferidas, as sequências de borda de T-DNA que flanqueiam os cassetes de expressão em planta compreendem ambas as sequências da borda esquerda e da borda direita de T-DNA que estão operativamente orientadas para fornecer a transferência e a integração dos cassetes de expressão em planta no genoma da planta. Quando usado com uma Agrobacterium hospedeira adequada na transformação de planta mediada por Agrobacterium, o vetor de dois T-DNA fornece a integração de uma molécula de T-DNA contendo o gene ou genes de interesse em uma localização cromossômica e a integração do outro T-DNA contendo o marcador selecionável e/ou registrável em outra localização cromossômica. As plantas transgênicas que contêm ambos os genes de interesse e os genes marcadores selecionáveis e/ou registráveis são obtidas inicialmente pela seleção e/ou registro do(s) gene(s) marcador(es) e rastreadas quanto a expressão dos genes de interesse. Linhagens distintas de plantas transgênicas contendo ambos, o(s) gene(s) marcador(es) e o(s) gene(s) de interesse são subsequentemente cruzadas para se obter uma população de progênie de plantas transgênicas que segregam ambos o(s) gene(s) marcador(es) e o(s) gene(s) de interesse. A progênie de plantas que contém apenas o(s) gene(s) de interesse pode ser identificada por qualquer combinação de técnicas de análise de DNA, RNA ou proteína. Métodos para usar vetores com dois T-DNA foram descritos nas Patente U.S. N° 6.265.638, Patente U.S. N² 5.731.179, Pedido de Patente U.S. N²2003110532A1, e Pedido de Patente U.S. N² 20050183170A1.

Métodos para introdução de mini-cromossomos em plantas compreendendo centrômeros de planta que fornecem a manutenção do mi nicromossomo recombinante em uma planta transgênica também podem ser usados na prática dessa invenção (Patente U.S. N^s 6.972.197). Nessas modalidades da invenção, as plantas transgênicas abrigam os minicromossomos como elementos extra-cromossômicos que não estão integrados nos cromossomos da planta hospedeira.

Plantas transgênicas são obtidas, tipicamente, pela ligação do gene de interesse (isto é, nesse caso de um cassete de expressão de TIC807) a um gene marcador selecionável, introduzindo os transgenes ligados em uma célula de planta, um tecido de planta ou em uma planta por qualquer um dos métodos descritos acima e regenerando ou recuperando de outra maneira a planta transgênica sob condições que requerem a expressão do dito gene marcador selecionável para o desenvolvimento da planta. O gene marcador selecionável pode ser um gene que codifique uma proteína neomicina fosfotransferase, uma proteína fosfinotricina acetiltransferase, uma proteína 5-enol-piruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) resistente a glifosato, uma proteína higromicina fosfotransferase, uma proteína diidropteroato sintase, uma proteína acetolactato sintase insensível a sulfonilureia, uma proteína Q insensível à atrazina, uma proteína nitrilase capaz de degradar bromoxinil, uma proteína de-halogenase capaz de degradar o dalapon, uma proteína 2,4-diclorofenoxiacetato monoxigenase, uma proteína diidrofolato redutase insensível ao metotrexato e uma proteína octopina sintase insensível a aminoetilcisteína. Os agentes seletivos correspondentes usados em conjunto com cada gene podem ser: neomincina (para a seleção de proteína neomicina fosfotransferase), fosfinotricina (para a seleção de proteína fosfinotricina acetiltransferase), glifosato (para a seleção de proteína 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) resistente a glifosato), higromicina (para a seleção de proteína higromicina fosfotransferase), sulfadiazina (para a seleção de proteína diidropteroato sintase), clorsulfuron (para a seleção de proteína acetolactato sintase insensível a sulfonilureia), atrazina (para a seleção de proteína Q insensível à atrazina), bromoxinila (para a seleção de proteína nitrilase), dalapon (para a seleção de proteína dehalogenase), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (para a seleção de proteína 2,4 diclorofenoxiacetato monoxigenase), metotrexate (para a seleção de proteína diidrofolato redutase insensível ao metotrexato) ou aminoetilcisteina (para a seleção de proteína octopina sintase insensível à aminoetilcisteina).

Plantas transgênicas também podem ser obtidas pela ligação de um gene de interesse (isto é, nesse caso um cassete de expressão de TIC807) a um gene marcador registrável, introduzindo os transgenes ligados em uma célula de planta por qualquer um dos métodos acima descritos e regenerando as plantas transgênicas a partir das células transformadas que são positivas para a expressão do gene marcador registrável. O gene marcador registrável pode ser um gene que codifique uma proteína betaglicuronidase, uma proteína verde fluorescente, uma proteína amarelo fluorescente, uma proteína vermelha fluorescente, uma proteína betagalactosidase, um proteína luciferase derivada de um gene luc, uma proteína luciferase derivada de um gene lux, uma proteína sialidase, uma proteína estreptomicina fosfotransferase, uma proteína nopalina sintase, uma proteína octopina sintase ou uma proteína cloranfenicol acetil transferase.

Quando o vetor de expressão é introduzido em uma célula de planta ou tecido de planta, as células ou tecidos transformados são tipicamente regenerados em plantas completas pelo cultivo dessas células ou tecidos sob condições que promovem a formação de uma planta completa (isto é, o processo de regenerar folhas, caules, raízes e, em certas plantas, tecidos reprodutores). O desenvolvimento ou regeneração de plantas transgênicas a partir de protoplastos únicos de planta ou de vários explantes é bem conhecido na técnica (Horsch, R.B. et al., 1985). Essa regeneração e o processo de crescimento envolvem tipicamente as etapas de seleção das células transformadas e cultivo das células selecionadas sob condições que fornecerão plantulas enraizadas. Os ramos enraizados transgênicos resultantes são plantados posteriormente em um meio de crescimento de planta apropriado como o solo. Aiternativamente, os transgenes também podem ser introduzidos no meristema de ramo de planta e as plantas regeneradas sem passar através do estágio de calo de cultura de tecido (Patente U.S. N7.002.058). Quando o transgene é introduzido diretamente em uma planta, ou mais especificamente no tecido meristemático de uma planta, uma semente pode ser colhida da planta e selecionada ou marcada quanto a presença do transgene. No caso de espécies de planta transgênica que se reproduzem sexuadamente, as sementes podem ser coletadas das plantas que foram propagadas (autopolinizadas) ou cruzadas-fora (isto é, usadas como um doador ou receptor de pólen) para estabelecer ou manter a linhagem da planta transgênica. As plantas transgênicas que não se reproduzem sexuadamente podem ser propagadas vegetativamente para estabelecer ou manter a linhagem da planta transgênica. Como usado aqui, linhagem de planta transgênica refere-se a plantas transgênicas derivadas de um evento de transformação onde o transgene foi inserido em uma ou mais localizações no genoma da planta. Em um aspecto relacionado, a presente invenção também abrange uma semente produzida pela planta transformada, a progênie de tal semente e uma semente produzida pela progênie da planta transgênica original, produzida de acordo com o processo acima. Tais progênie e sementes terão um transgene codificando a proteína TIC807 estavelmente incorporado nos seus genomas e tais plantas da progênie herdarão as características proporcionadas pela introdução de um transgene estável em um estilo Mendeliano. Todas as tais plantas transgênicas que têm incorporados em seus genomas segmentos de DNA que codificam uma ou mais proteínas ou polipeptídeos TIC807 são aspectos dessa invenção. Também é reconhecido que plantas transgênicas que contêm os construtos de DNA aqui descritos e materiais derivados deles podem ser identificadas através do uso de PCR ou outros métodos que podem detectar especificamente as sequências nos construtos de DNA.

Uma vez que a planta transgênica é regenerada ou recuperada, uma variedade de métodos pode ser usada para identificar ou obter uma planta transgênica que expresse uma quantidade inibitória de inseto de TIC807. Um grupo de métodos gerais é realizar ensaios que medem a quantidade de TIC807 que é produzida. Por exemplo, vários métodos de detecção baseados em anticorpo que empregam anticorpos que reconhecem TIC807 podem ser usados para quantificar a quantidade de TIC807 produzi da. Exemplos de tais ensaios baseados em anticorpo incluem, mas não são limitados a ELISA, RIAs ou outros métodos, nos quais um anticorpo que reconhece TIC807 é detectavelmente marcado com uma enzima, um isótopo, um fluoróforo, um lantanídeo e semelhantes. Usando a proteína TIC807 purificada ou isolada com padrão de referência em tais ensaios (isto é, fornecendo quantidades conhecidas de TIC807), a quantidade de TIC807 presente no tecido da planta em um mol por grama de material de planta ou massa por grama de material de planta pode ser determinada. A proteína TIC807 será tipicamente expressa na planta transgênica a nível de partes por milhão ou ppm, onde níveis de microgramas de proteína TIC807 estão presentes em quantidades de gramas de peso de tecido fresco de planta. Nesse caso, 1 micrograma de proteína TIC807 por 1 grama de tecido fresco de planta pode representar uma concentração de TIC807 de 1 ppm. Uma quantidade inibitória de inseto de proteína TIC807 é de pelo menos 5 ppm (isto é, 5 pg de proteína TIC807 por grama de peso de tecido fresco de planta). Em modalidades preferidas, uma quantidade inibitória de inseto de proteína TIC807 é de pelo menos 50 ppm (isto é, 50 pg de proteína TIC807 por grama de peso de tecido fresco de planta). Em modalidades mais preferidas, a quantidade de TIC807 é de pelo menos 250 ppm (isto é, 250 pg de proteína TIC807 por grama de peso de tecido fresco de planta).

Alternativamente, a quantidade de mRNA de TIC807 produzido pela planta transgênica pode ser determinada para identificar plantas que expressam quantidades inibitórias de inseto de proteína TIC807. Técnicas que relacionam a quantidade de proteína produzida à quantidade de RNA produzido são bem conhecidas daqueles versados na técnica e incluem métodos tais como construção de uma curva-padrão que relacione níveis de RNA específico (isto é, mRNA de TIC807) à níveis de proteína TIC807 (determinados por métodos imunológicos e outros). Métodos para quantificar mRNA de TIC807 envolvem, tipicamente, a hibridização específica dé um polinucleotídeo tanto com o mRNA de TIC807 quanto com o cDNA (DNA complementar) ou produto de PCR derivados do RNA de TIC807. Tais sondas de polinucleotídeo podem ser derivadas tanto da fita de senso e/ou anti senso das sequências de nucleotídeos do transgene que codifica a proteína TIC807. A hibridização de uma sonda de polinucleotídeo ao mRNA ou cDNA de TIC807 pode ser detectada por métodos que incluem, mas não se limitam ao uso de sondas marcadas com um isótopo, um fluoróforo, um lantanídeo ou um hapteno tal como biotina ou digoxigenina. A hibridização da sonda marcada pode ser detectada quando o RNA de TIC807 está em solução ou imobilizado sobre um suporte sólido tal como uma membrana. Quando quantificar o RNA de TIC807 pelo uso de uma Reação em cadeia da Polimerase quantitativa com transcriptase reversa (qRT-PCR), o produto de PCR derivado de TIC807 pode ser detectado pelo uso de qualquer uma das sondas de polinucleotídeo marcadas anteriormente mencionadas, pelo uso de um corante interposto tal como brometo de etídeo ou SYBR green ou pelo uso de uma sonda de hibridização que contenha um fluoróforo e um repressor, tal que a emissão do fluoróforo é detectada apenas quando o fluoróforo é liberado pela atividade de 5’ nuclease da polimerase usada na reação de PCR (isto é uma reação TaqMan®; Applied Biosystems, Foster City, CA) ou quando o fluoróforo e o repressor são deslocados pela síntese mediada pela polimerase da fita complementar (isto é, sondas Scorpion® ou Molecular Beacon®). Vários métodos para a condução da análise por qRT-PCR para quantificar níveis de mRNA estão bem caracterizados (Bustin, SA; Journal of Molecular Endocrinology 29, 23, 2002). As sondas fluorescentes que são ativadas pela ação de enzimas que reconhecem complexos de ácido nucleico não pareados (isto é, Invader®, Third Wave, Technologies, Madison, Wl) também podem ser usadas para quantificar RNA. Aqueles versados na técnica também entenderão que técnicas de quantificação de RNA, tais como Quantitative Nucleic Acid Sequence Based Amplification (Q-NASBA TM), podem ser usadas para quantificar o mRNA que codifica a proteína TIC807 e identificar plantas que a expressam.

Plantas transgênicas que expressam quantidades inibitórias de inseto de TIC807 também podem ser identificadas ensaiando essas plantas diretamente para a inibição de inseto. Como Lygus é um fitofago, um inseto que pica e suga, a expressão in planta e o teste de proteínas tóxicas pode ser demonstrado de uma maneira que permitirá a alimentação do inseto com uma planta e seus tecidos associados. Vários fatores são críticos na seleção de uma espécie de planta para transformação que permitirá testar as proteínas tóxicas. A planta deve ser facilmente transformável e o tecido derivado da planta deve ser do tipo que é preferido pelo inseto-praga. Para esse propósito, é preferível usar uma planta que tem folhas ou outros órgãos com uma área superficial grande o bastante para se acoplar uma barreira que iniba a mobilidade do inseto-praga e que force o organismo a se alimentar do órgão da planta. Além disso, o tecido vascular do órgão da planta deve estar próximo o suficiente da superfície do órgão para permitir que o insetopraga sonde, penetre e subsequentemente se alimente. Também é preferível que a planta usada na transformação seja do tipo que pode ser facilmente induzida para se desenvolver a partir de um calo indiferenciado.

Insetos tal como Lygus, quando se alimentam sobre uma planta de algodão, tipicamente se alimentam primariamente nos botões das flores ou nas cápsulas. A transformação do algodão é bem conhecida na técnica; entretanto, o tempo que leva para ir da transformação de células de planta até uma planta de algodão completamente desenvolvida é muito longo para ser prático em propósitos de rastreamento. Portanto, o tecido de um calo indiferenciado de algodão pode ser o material inicial para teste de planta transgênica preferido quando se estuda a alimentação de Lygus sobre células de algodão transformadas com as proteínas TIC807. As células de algodão são transformadas com construtos que contêm o gene que codifica a proteína TIC807. O tecido do calo é deixado se desenvolver em tecido de cultura após a transformação em uma placa de Petri. As ninfas de Lygus são então colocadas na placa de Petri que contém o calo. A cobertura segura da placa de Petri previne a fuga das ninfas de Lygus. Qualquer material que previna a fuga de Lygus, mas que permite a troca gasosa na placa de Petri, por exemplo, Parafilm®, pode ser usado para fechar a tampa da placa de Petri. Um percentual de ninfas de Lygus encontrará o tecido do calo e se alimentará. Os escores para a mortalidade e subdesenvolvimento são então calculados levando em consideração os antecedentes de morte que ocorre ram com aqueles insetos que falharam em se alimentar sobre o tecido do calo. As ninfas de Lygus também podem ser exibidas com tecido de calo de controle que não está transformado com o gene que codifica TIC807 como um controle para o crescimento normal de ninfa sobre o tecido do calo.

Um tecido alternativo para a inibição mediada pela proteína TIC807 é o tecido da folha. Qualquer planta que possua um tecido de folha com uma área superficial suficiente para colocar uma barreira que previna a fuga de Lygus pode ser usada. Por exemplo, as células de alfafa, do milho, da soja ou da alface podem ser transformadas com construtos que contêm o gene ou genes de interesse que codificam a proteína tóxica que foram otimizados para expressão em monocotiledônea ou dicotiledônea. As células transformadas são deixadas desenvolver em tecido de calo e então subsequentemente regeneradas em plantas. Os insetos-praga tal como ninfas de Lygus são então deixados para se alimentar quando a planta atingiu um nível de maturidade suficiente, tal como quando as folhas cresceram até um tamanho que permite o uso de uma barreira física para prevenir a fuga de Lygus. A barreira para prevenir a fuga das ninfas de Lygus pode ser qualquer dispositivo comercialmente disponível ou feito em casa que permita o contato das ninfas de Lygus com o tecido da folha e que permita ao inseto sondar e se alimentar do tecido vascular da folha. As gaiolas com clipe similares àquelas descritas por Mowry (1993) (J. Agric. Entomol. 10:181-184) podem ser suficientes para conter as ninfas de Lygus para alimentação. Os escores de mortalidade e subdesenvolvimento são então determinados com relação aos antecedentes de morte que ocorrerão com aqueles insetos que falharam em se alimentar sobre o tecido da folha. As ninfas de Lygus também podem ser exibidas com tecido de folha de controle que não está transformado com o gene que codifica TIC807 como um controle para o crescimento normal de ninfa sobre o tecido do calo.

Os ensaios de inibição de inseto in planta podem ser usados para identificar plantas transgênicas que inibem qualquer um de uma grande variedade de insetos-praga que perfuram e/ou sugam os fluidos das células e tecidos de plantas que deveríam estar restritos ao tecido do ensaio. Em particular, tais ensaios de inibição podem ser usados para testar plantas que expressam TIC807 e/ou outros agentes inibitórios de inseto. Outros agentes inibitórios de inseto incluem, mas não são limitados a i)sequências de ribonucleotídeos que funcionam após a ingestão pelo dito inseto-praga pela inibição de uma função biológica dentro do dito inseto e ii) proteínas não TIC807 que são inibitórias de inseto. Esses insetos-praga incluem aqueles insetos-praga que perfuram e depois sugam a seiva do floema ou conteúdos celulares assim como aqueles que maceram as células na vizinhança da zona de alimentação e depois absorvem o fluido que é liberado das células maceradas através de suas proboscides. Os insetos atingidos pelas proteínas TIC807 e outros agentes inibitórios aqui descritos incluem vários insetos hemípteros, homópteros e heterópteros. A inibição de insetos tais como Lygus, moscas brancas, gafanhotos e afídeos é especificamente considerada pelo uso de TIC807 e outros agentes inibitórios de inseto aqui descritos.

VIII. Métodos de Controle de Inseto em Planta Transqênica

As plantas transgênicas da presente invenção que compreendem os polinucleotídeos que codificam TIC807 ou seus fragmentos inseticidas podem ser usadas nos métodos para controle de infestações por insetos. Plantas transgênicas de cevada, milho, aveia, arroz, centeio, sorgo, grama, cana de açúcar, trigo, alfafa, banana, brócolis, feijão, repolho, canola, cenoura, abóbora, couve-flor, aipo, um cítrico, algodão, pepino, eucalipto, linheiro, alho, uva, cebola, alface, ervilha, pimenta, batata, álamo, pinheiro, girassol, açafrão, soja, morango, beterraba, batata-doce, tabaco, tomate, planta ornamental, arbusto, noz, grão-de-bico, guandu, painço, lúpulo e grama de pastagem podem ser usadas nesses métodos. As plantas transgênicas, tais como plantas de alfafa, canola, algodão, alface e morango, que são atacadas pelos insetos-praga hemípteros inibidos pelas proteínas TIC807 são especificamente consideradas por essa invenção. Até mais especificamente consideradas pela presente invenção são as plantas de algodão transgênicas que compreendem polinucleotídeos que codificam TIC807 ou seus fragmentos inseticidas que estão protegidas contra a infestação do inseto da espécie Lygus. As plantas transgênicas da presente invenção são particularmente eficazes para controlar espécies de insetos que picam e/ou sugam os fluidos das células e tecidos de plantas incluindo, mas não limitados a insetos de planta da família Miridae, tais como percevejos castanhos de planta do oeste Lygus espécie hesperus), percevejos castanhos de planta (Lygus espécie lineolaris) e percevejos brancos de legumes (Lygus elisus) e percevejos mal-cheirosos (espécie da família Pentatomidae).

Tipos específicos de plantas transgênicas que expressam proteínas TIC807 que inibem insetos-praga específicos são considerados por essa invenção. As plantas de algodão transgênico que expressam proteínas TIC807 que inibem insetos Hemípteros incluindo Lygus, gafanhotos e afídeos são consideradas especificamente. As plantas de algodão transgênico que expressam a proteína TIC807 da SEQ ID NO:5 são esperadas inibir Lychiq tacnon/o /mi / i/miç lin&rJQrie* Ao r\l*-»r-»+oQ vu t-jryuíO nHUv/GHO. /“VO picil lido LI dl IOLJC7I IIUCIO UC dliaict, VC1IIUICI, alface e morango que expressam a proteína TIC807 da SEQ ID NO:5 e que inibem Lygus também são consideradas especificamente.

As plantas transgênicas que expressam quantidades inibitórias de inseto das proteínas TIC807 são identificadas primeiro por qualquer um dos métodos aqui descritos. A inibição inicial de inseto pode ser conduzida em condições ambientais controladas (isto é, câmaras de crescimento fechadas ou estufas). As plantas transgênicas também podem ser submetidas à infestação de insetos em campos de teste e comparadas contra plantas de controle não transgênicas. Tipicamente, as plantas de controle não transgênicas incluirão ambas as plantas tratadas com inseticidas e plantas não tratadas. As linhagens de planta transgênica (isto é, plantas transgênicas derivadas de eventos de transformação distintos que compreendem inserções de transgene em diferentes localizações genômicas) que exibem a melhor atividade inibitória de inseto são selecionadas para o desenvolvimento potencial para uso em uma variedade de circunstâncias genéticas diferentes (isto é, cultivares geneticamente distintos, variedades e/ou germeplasmas híbridos). Métodos de introdução de transgenes em germeplasmas distintos e de produção de lotes de semente que compreendem primariamente a semente transgênica são conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, o transgene pode ser fixado em um estado homozigoto em um evento genético desejado. Uma vez que o transgene é fixado naquele evento, a planta transgênica homozigota pode ser usada para produzir semente transgênica de culturas não híbridas. Alternativamente, a planta transgênica homozigota pode ser usada como uma doadora ou receptora de pólen para produzir semente transgênica de culturas híbridas.

Tipos específicos de plantas transgênicas que expressam proteínas TIC807 que inibem insetos-praga específicos são considerados por essa invenção. As plantas de algodão transgênico que expressam proteínas TIC807 que inibem insetos Hemípteros incluindo Lygus, gafanhotos e afídeos são consideradas especificamente. As plantas de algodão transgênico que expressam a proteína TIC807 da SEQ ID NO:5 são esperadas inibir Lygus hesperus ou Lygus lineolaris. As plantas transgênicas de alfaia, canola, alface e morango que expressam a proteína TIC807 da SEQ ID NO:5 e que inibem Lygus também são consideradas especificamente.

IX. Métodos de Controle e Composições Não Transgênicas

As composições de proteína TIC807 aqui descritas encontrarão utilidade particular como agentes inibitórios de inseto para aplicação tópica e/ou sistêmica em áreas de cultura, pastagens, frutas, vegetais e plantas ornamentais. Mais especificamente, TIC807 pode ser usada em composições que compreendem uma quantidade inibitória de inseto de uma composição de proteína TIC807. Em relação a isso, as composições de proteína TIC807 feitas de preparações de cristal de proteína TIC807 por esporos de Bacillus thuringiensis são particularmente úteis. A composição de proteína TIC807 pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5 ou de uma proteína inibitória de inseto com pelo menos 250 aminoácidos que exiba pelo menos 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeo correspondente contida dentro da SEQ ID NO:5.

A composição inibitória de inseto também pode compreender uma célula de Bacillus thuringiensis ou uma cultura dessa células ou uma mistura de uma ou mais células de Bacillus thuringiensis que expressam um ou mais cristais de proteínas TIC807 da invenção. Em certos aspectos, pode ser desejável preparar composições que contenham uma pluralidade de cristais de proteínas, tanto nativas quanto modificadas, para o tratamento de um ou mais tipos de insetos suscetíveis.

Os inventores consideram que quaisquer métodos de formulação conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser empregados usando as proteínas descritas aqui, para preparar tais composições inibitórias de inseto. Pode ser desejável formular preparações com células inteiras, extratos celulares, suspensões celulares, homogenatos celulares, lisados celulares, sobrenadantes celulares, filtrados celulares ou péletes celulares de uma cultura celular (preferivelmente uma cultura de célula bacteriana, tal como uma cultura de Bacillus thuringiensis) que expressem um ou mais segmentos de DNA de TIC807 para produzir a(s) proteína(s) ou peptídeo(s) i iGkjvi vvwiiivzciviwyb/. ^/b iiiuiuuuo μαία μισμαιαι ιαιο ιυι 11 lUicii^Wb bclO UUnhecidos por aqueles versados na técnica e podem incluir, por exemplo, a desidratação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma ou mais culturas de células bacterianas, tais como células SIC8091, SIC8092, SIC8093 e SIC8094 de Bacillus, que expressam o(s) peptídeo(s) de TIC807 de interesse.

Em uma modalidade, a composição inibitória de inseto compreende uma suspensão dispersível em óleo compreendendo células bacterianas lisadas ou não lisadas, esporos ou cristais que contêm um ou mais dos novos cristais de proteína aqui descritos. Preferivelmente, as células são células de Bacillus thuringiensis, entretanto, qualquer célula hospedeira bacteriana que expresse os novos segmentos de ácido nucleico aqui descritos e que produzam um cristal de proteína é considerada ser útil, tal como Bacillus spp., incluindo B. megaterium, B. subtilis, B. cereus, Escherichia spp., incluindo E. colie/ou Pseudomonas spp., incluindo P. cepacia, P. aeruginosa e P. fluorescens. Alternativamente, a suspensão dispersível em óleo pode consistir de uma combinação de uma ou mais das seguintes composições: células bacterianas lisadas ou não lisadas, esporos, cristais e/ou cristais de proteínas purificadas.

Em uma segunda modalidade, a composição inibitória de inseto compreende um grânulo ou pó dispersível em água. Esse grânulo ou pó pode compreender células bacterianas Usadas ou não lisadas, esporos ou cristais que contêm um ou mais dos novos cristais de proteína aqui descritos. As fontes preferidas para essas composições incluem células bacterianas tais como células de B. thuringiensis, entretanto, bactérias dos gêneros Bacillus, Escherichia e Pseudomonas que tenham sido transformadas com um segmento de DNA aqui descrito e que expressem o cristal de proteína também são consideradas serem úteis. Alternativamente, o grânulo ou o pó podem consistir de uma combinação de uma ou mais das seguintes composições: células bacterianas lisadas ou não lisadas, esporos, cristais e/ou cristais de proteínas purificadas.

Em uma terceira modalidade importante, a composição inibitória de inseto compreende um pó hidratável, spray, emulsão, solução coloidal, aquosa ou orgânica, um pó fino, pélete ou concentrado coloidal. Tal composição pode conter células bacterianas lisadas ou não lisadas, esporos, cristais ou extratos celulares como descritos acima, que contenham um ou mais dos novos cristais de proteína aqui descritos. As células bacterianas preferidas são células de B. thuringiensis, entretanto, bactérias tais como B. megaterium, B. subtilis, B. cereus, E. coli ou Pseudomonas spp. que tenham sido transformadas com um segmento de DNA aqui descrito e que expressem o cristal de proteína também são consideradas serem úteis. Tais formas secas de composições inseticidas podem ser formuladas para dissolver imediatamente depois de umedecidas ou, alternativamente, dissolverem com liberação controlada, liberação sustentada ou outra maneira que depende de tempo. Alternativamente, tal composição pode consistir de uma combinação de uma ou mais das seguintes composições: células bacterianas lisadas ou não lisadas, esporos, cristais e/ou cristais de proteínas purificadas.

Em uma quarta modalidade, a composição inibitória de inseto compreende uma solução ou suspensão aquosa ou cultura celular de células bacterianas lisadas ou não lisadas, esporos e/ou cristais ou uma mistura de células bacterianas lisadas ou não lisadas, esporos e/ou cristais, tais como aqueles descritos acima que contenham um ou mais dos novos cristais de proteína aqui descritos. Tais soluções ou suspensões aquosas podem ser fornecidas como uma solução-estoque concentrada que é diluída antes da aplicação ou, altemativamente, como uma solução diluída pronta para aplicação.

Para esses métodos que envolvem a aplicação de células bacterianas, o hospedeiro celular que contém o(s) gene(s) da proteína TIC807 pode ser cultivado em qualquer meio nutriente conveniente, onde o construto de DNA fornece uma vantagem seletiva, fornecendo um meio seletivo tal que todas ou substancialmente todas as células retenham o gene de Bacillus thuringiensis. Essas células podem então ser coletadas de acordo com métodos convencionais. Alternativamente, as células podem ser tratadas antes da coleta.

Quando as composições inseticidas compreendem células, esporos e/ou cristais de B. thuringiensis que contêm os cristais de proteína modificados de interesse, tais composições podem ser formuladas em uma variedade de maneiras. Elas podem ser empregadas como pós hidratáveis, grânulos ou pós finos, pela mistura com vários materiais inertes, tais como minerais inorgânicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos e semelhantes) ou materiais botânicos (espigas pulverizadas, cascas de arroz, cascas de nozes e semelhantes). As formulações podem incluir adjuvantes dispersantes-aglutinantes, agentes estabilizadores, outros aditivos pesticidas ou tensoativos. As formulações líquidas podem ser baseadas em água ou não aquosas e empregadas como espumas, suspensões, concentrados emulsificáveis ou semelhantes. O ingrediente pode incluir agentes reológicos, tensoativos, emulsificadores, dispersantes ou polímeros.

Alternativamente, as proteínas TIC807 podem ser preparadas por sistemas de expressão bacteriano nativo ou recombinante in vitro e isoladas para a subsequente aplicação no campo. Tal proteína pode estar tanto em lisados de célula bruta, suspensões, colóides, etc., quanto alternativamente pode ser purificada, refinada, tamponada e/ou processada posteriormente, antes de ser formulada em uma formulação biocida ativa. Igualmente, sob certas circunstâncias, pode ser desejável isolar cristais e/ou esporos de culturas bacterianas que expressam o cristal de proteína e aplicar soluções, suspensões ou preparações coloidais de tais cristais e/ou esporos como a composição bioinseticida ativa.

Sem considerar o método de aplicação, a quantidade do(s) componente(s) ativo(s) é aplicada em uma quantidade inibitória de inseto, que variará na dependência de tais fatores como, por exemplo, os insetos hemípteros, hemópteros ou heterópteros específicos a serem controlados, a planta ou cultura específica a ser tratada, as condições ambientais e o método, a proporção e a quantidade de aplicação da composição inibitória de inseto.

A composição inibitória de inseto descrita pode ser feita pela formulação tanto de uma suspensão de célula bacteriana, cristal e/ou esporo quanto de um componente de proteína com o veículo agricolamente aceitável. As composições podem ser formuladas antes da administração em uma maneira apropriada tal como liofilizada, desidratada ou em um veículo aquoso, meio ou diluente adequado, tal como salina ou outro tampão. As composições formuladas podem estar na forma de um pó ou um material granuloso ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral) ou água ou emulsões óleo/água ou como um pó hidratável ou em combinação com qualquer outro material de transporte para aplicação agrícola. Veículos agrícolas adequados podem ser sólidos ou líquidos e são bem conhecidos na técnica. A expressão veículos agricolamente aceitáveis cobre todos os adjuvantes, por exemplo, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, aglutinantes, ligantes, etc. que são comumente usados na tecnologia de formulação de inseticida; esses são bem conhecidos por aqueles experientes na técnica de formulação de inseticida. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparadas por várias maneiras, por exemplo, pela misturação homogênea, liquefação e/ou trituração da composição inseticida com adjuvantes adequados usando as técnicas de formulação convencionais.

As composições inibitórias de inseto dessa invenção são aplicadas no ambiente do inseto-alvo hemíptero, homóptero ou heteróptero, tipi camente sobre a folhagem da planta ou da cultura a ser protegida, por métodos convencionais, preferivelmente por pulverização. A potência e a duração da aplicação inseticida será ajustada com relação a condições específicas para a(s) praga(s), cultura(s) a ser/serem tratada(s) e condições ambientais em particular. A taxa proporcional de ingrediente ativo para o veículo dependerá naturalmente da natureza química, solubilidade e estabilidade da composição inseticida assim como a formulação em particular considerada.

Outras técnicas de aplicação, por exemplo, pulverização, borrifação, imersão, injeção no solo, cobertura de semente, cobertura de muda, aspersão, aeração, vaporização, atomização e semelhantes, também são possíveis e podem ser necessárias sob certas circunstâncias tais como, por exemplo, insetos que causem infestação da raiz ou do caule, ou para aplicação em vegetação delicada ou plantas ornamentais. Esses procedimentos de aplicação também são bem conhecidos daqueles versados na técnica.

A composição inibitória de inseto da invenção pode ser empregada no método da invenção isoladamente ou em combinação com outros compostos, incluindo mas não limitado a outros pesticidas. O método da invenção também pode ser usado em conjunto com outros tratamentos, tais como tensoativos, detergentes, polímeros ou formulações com liberação programada. As composições inseticidas da presente invenção podem ser formuladas para uso sistêmico ou tópico.

A concentração de agente inibitório de inseto na composição inibitória de inseto que pode ser usada para aplicação ambiental, sistêmica ou foliar, variará amplamente dependendo da natureza da formulação em particular, dos meios de aplicação, das condições ambientais e do grau de atividade inibitória de inseto. Tipicamente, o agente inibitório de inseto na composição estará presente na formulação aplicada na concentração de pelo menos cerca de 1 % do peso e pode ser maior incluindo até cerca de 99% do peso. Formulações secas das composições podem estar entre cerca de 1 % a cerca de 99% ou mais do peso da composição, enquanto que as formulações líquidas podem compreender geralmente entre cerca de 1% a cerca de 99% ou mais do ingrediente ativo por peso. As formulações que compreendem células bacterianas inteiras geralmente conterão entre cerca de 10⁴ a cerca de 10¹² células/mg da composição.

A formulação inibitória de inseto pode ser administrada a uma planta em particular ou uma área-alvo em uma ou mais aplicações, como necessário, com uma taxa típica de aplicação na área por hectare variando na ordem de cerca de 1 g a cerca de 1 kg, 2 kg, 5 kg ou mais do ingrediente ativo.

XI. Produtos de Consumo

Também é considerado que vários produtos de consumo podem ser obtidos com as composições e métodos dessa invenção. Além disso, é considerado especificamente que uma ou mais vantagens podem estar associadas com os produtos de consumo derivados dessa invenção. É esperado que o uso da proteína inibitória de inseto TIC807 e os métodos associados possam fornecer produtos de consumo com níveis residuais de pesticida diminuídos. Em certas ocasiões, os agricultores serão estimulados a usar menos pesticidas tais como organofosfatos, carbamatos, neonicotinóides e inseticidas piretróides. A exposição de indivíduos que plantam, colhem, processam ou entram em contato de outra maneira com os produtos de consumo dessa invenção para esses pesticidas é esperado ser reduzida. O uso reduzido de pesticidas também é esperado fornecer custos reduzidos e efeitos colaterais indesejáveis reduzidos sobre insetos benéficos (não alvos) e sobre a fauna. Também é considerado que o uso dessa invenção fornecerá produtos de consumo com custos de produção menores devido a fatores que incluem, mas não se limitam ao rendimento aumentado e/ou utilização diminuída de pesticida.

XII. Métodos de Utilização de Proteínas Inibitórias de Inseto TIC807 em Combinação com Outros Agentes Inibitórios de Inseto

Vários métodos pelos quais a resistência aumentada a um inseto-praga específico ou a resistência mais ampla a várias classes de insetospraga são considerados por essa invenção. Ambos os métodos envolvem contatar o inseto-praga com uma proteína TIC807 em combinação com um agente inibitório de inseto distinto. Esse agente inibitório de inseto distinto pode inibir o mesmo inseto hemíptero inibido por TIC807 para fornecer uma incidência diminuída de resistência de inseto hemíptero à proteína TIC807 ou ao outro agente inibitório de inseto. Alternativamente, o agente inibitório de inseto distinto pode inibir um inseto que não é inibido por TIC807 para expandir o espectro de inibição de inseto obtido.

O potencial dos insetos para o desenvolvimento de resistência a certos inseticidas está bem documentado. A maioria das estratégias de manuseio da resistência de inseto, que usam culturas geneticamente modificadas que expressam agentes inibitórios de inseto, repousa sobre o uso de áreas de refúgio que são compreendidas por culturas de plantas que carecem do gene inibitório de inseto. Em teoria, o refúgio fornece uma região na qual populações de inseto não resistente que abrigam alelos genéticos não resistentes são mantidas, diminuindo o potencial para desenvolver resistência dentro da população de insetos. Entretanto, a estratégia do refúgio sofre de várias deficiências. Primeiro, os agricultores devem aceitar rendimentos diminuídos sobre a área plantada com o gene inibitório de inseto. Segundo, não está esclarecido se os refúgios controlarão efetivamente alelos de resistência dominantes que podem surgir na população de insetos.

Uma estratégia de manuseio de resistência de inseto alternativa pode empregar culturas transgênicas que expressam dois agentes inibitórios de inseto distintos, que operam através de modos de ação diferentes. Nesse caso, quaisquer insetos com resistência a qualquer um dos agentes inibitórios de inseto serão controlados pelo outro agente inibitório de inseto, reduzindo assim as chances do desenvolvimento de resistência na população de insetos.

Além disso, uma única cultura pode estar sujeita à destruição por várias classes diferentes de insetos-praga ao mesmo tempo no campo. Por exemplo, uma planta de algodão pode ser atacada por pragas Hemípteras, tal como Lygus, e pragas Lepidópteras, tais como Spodoptera exígua (lagarta-de-cartucho da beterraba), Heliothis zea (lagarta da maçã do algodão) e/ou Helicoverpa armigera (lagarta de cartucho) no decorrer de estação de plantio. A expressão de agentes inibitórios distintos que são ativos para cada uma dessas pragas pode fornecer uma proteção maior da planta de algodão e pode aumentar o rendimento por acre devido a uma redução de perdas causadas pelos insetos-praga.

Um primeiro grupo de agentes inibitórios de inseto que podem ser usados em combinação com uma proteína TIG807 para o manuseio da resistência do inseto ou para expandir o espectro inibitório de inseto compreende sequências de ribonucleotideos que funcionam após a ingestão pelo dito inseto-praga para inibir uma função biológica dentro do dito insetopraga. Sequências de nucleotídeos específicas selecionadas a partir de sequências nativas para as células de uma praga em particular que estão envolvidas em uma via biológica essencial podem ser expressas em uma célula de tal maneira que resultam na formação de um RNA de fita dupla ou até de um RNA de fita dupla estabilizado. Pela inibição do produto de gene essencial do inseto-alvo com o ribonucleotídeo, o organismo falha em se desenvolver e eventualmente morre. O uso de tais sequências de ribonucleotídeo para controlar insetos-praga tais como Lygus, está descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. N² 20060021087. Genes de inseto essenciais que fornecem uma função biológica essencial que inclui, mas não se limita a formação de músculo, formação de hormônio juvenil, regulação de hormônio juvenil, regulação e transporte de íon, síntese de enzima digestiva, manutenção de potencial de membrana celular, biossíntese de aminoácidos, degradação de aminoácidos, formação de esperma, síntese de ferormônio, percepção de ferormônio, formação de antenas, formação de asa, formação de membro, desenvolvimento e diferenciação, formação de ovo, maturação larval, formação de enzima digestiva, síntese de hemolinfa, manutenção de hemolinfa, neurotransmissão, divisão celular, metabolismo de energia, respiração e apoptose são alvos para a inibição. Os genes de inseto que podem ser inibidos incluem, mas não são limitados a genes que codificam uma proteína V-ATPase, uma proteína ubiquitina, uma proteína poligalacturonase, uma proteína pectinase, uma proteína transportadora do neurotransmissor GABA, uma proteína EFI alfa, uma proteína mono-oxigenase do citocromo P-450, uma proteína precursora da proteína da cutícula, uma proteína CHD3 e uma proteína do proteossoma 20S. O agente de controle de inseto com base em ribonucleotídeo também pode compreender sequências dirigidas contra genes múltiplos de insetos-alvos. Para o controle de Lygus, ribonucleotídeos inibitórios dirigidos contra a SEQ ID NO:24 até a SEQ ID NO:39 ou combinações de ribonucleotídeos inibitórios dirigidos contra a SEQ ID NO:24 até a SEQ ID NO:39 são especificamente considerados. O uso das SEQ ID NO:24 até a SEQ ID NO:39 no controle de insetos está descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. N² 20060021087. Quando múltiplos genes de inseto são atingidos pela supressão, um elemento de DNA policistrônico pode ser fabricado como ilustrado e descrito por Fillatti, Publicação de Pedido U.S. N² 2004-0029283 A1.

Uma variedade de métodos pode ser usada para produzir ribonucleotídeos inibitórios dirigidos contra uma praga-alvo em uma planta transgênica. Em geral, o dsRNA inibitório e a porção do gene-alvo do inseto partilham pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, ou cerca de 90% de identidade de sequência, ou cerca de 95% de identidade de sequência, ou cerca de 99% de identidade de sequência ou mesmo cerca de 100% de identidade de sequência. Alternativamente, a região dúplice do RNA pode ser definida funcionalmente como uma sequência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar com uma porção do transcrito de gene-alvo. Uma sequência menor do que a extensão completa que exibe uma maior homologia compensa uma sequência homóloga mais extensa. A extensão das sequências de nucleotídeos idênticas pode ser de pelo menos 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ou 1000 bases. Normalmente, uma sequência maior do que 20-100 nucleotídeos deve ser usada, embora uma sequência maior do que 200-300 nucleotídeos seja preferida e uma sequência maior do que 5001000 nucleotídeos seja especialmente preferida dependendo do tamanho do gene-alvo.

Em outra modalidade, o ribonucleotídeo inibitório de inseto pode ser produzido por uma repetição invertida separada por uma sequência espaçadora. A sequência espaçadora pode ser uma região que compreende qualquer sequência de nucleotídeos que facilita a formação da estrutura se cundária entre cada repetição, onde isso é necessário. Em uma modalidade da presente invenção, a sequência espaçadora pode compreender alternativamente qualquer combinação de nucleotídeos ou seus homólogos que são capazes de ser ligados covalentemente a uma molécula de ácido nucleico. A sequência espaçadora pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos cerca de 10-100 nucleotídeos de extensão ou, alternativamente, pelo menos cerca de 100-200 nucleotídeos de extensão, pelo menos cerca de 200-400 nucleotídeos de extensão ou pelo menos cerca de 400500 nucleotídeos de extensão.

Uma sequência de transgene para a produção de dsRNA pode compreender um promotor que está operativamente ligado a uma sequência codificadora de intron e um RNA em forma de grampo derivado de uma sequência no gene-alvo (Miks and Shimamoto, Plant Cell Physiol. Abril de 2004; 45(4):490-495). Alternativamente, uma sequência de transgene para a produção de um siRNA pode compreender um promotor pol III de RNA operativamente ligado a um RNA em forma de grampo (Lu et al., Nucleic Acid Res. 2 de Dezembro de 2004; 32(21 ):e171). O RNA em forma de grampo pode compreender uma sequência 5’ de aproximadamente 19-24 nucleotídeos da sequência da fita de senso do gene-alvo seguida por um espaçador de nucleotídeo com cerca de 8-10 nucleotídeos seguido por aproximadamente 19-24 nucleotídeos da sequência antisenso que é capaz de parear com a sequência da fita de senso precedente. Entretanto, transgenes de planta que expressam RNA em forma de grampo contendo os braços de senso/antisenso variando entre 98 a 853 nucleotídeos também podem ser usados (Wesley et al., Plant J., 2001, 27(6):581-90). Vetores e métodos para a expressão mediada por transgene de RNAs em forma de grampo estão descritos nos Pedidos de Patente U.S. N— 20050164394, 20050160490 e 20040231016.

Um primeiro grupo de agentes inibitórios de inseto que podem ser usados em combinação com uma proteína TIC807 para o manuseio de resistência de inseto ou expansão do espectro inibitório de inseto compreende proteínas inibitórias de inseto diferentes de TIC807. Uma grande varieda de de proteínas inibitórias de inseto derivadas de B. thuringiensis, Photorhabdus sp. e/ou Xenorhabdus sp. pode ser usada.

Para o controle de insetos sugadores/picadores tais como Lygus, várias proteínas inibidoras de inseto diferentes de TIC807 podem ser combinadas com a expressão de TIC807 in planta para o maior controle e/ou manuseio da resistência. Tais moléculas expressas in planta junto com TIC807 podem incluir ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 (PCT US 2006/033867), AXMI-027, AXMI-036, e AXMI-038 (WO 06/107761), AXMI-018, AXMI-020, e AXMI-021 (WO 06/083891), AXMI-010 (WO 05/038032), AXMI-003 (WO 05/021585), AXMI-008 (US

2004/0250311), AXMI-006 (US 2004/0216186), AXMI-007 (US

2004/0210965), AXMI-009 (US 2004/0210964), AXMI-014 (US

2004/0197917), AXMI-004 (US 2004/0197916), AXMI-028 e AXMI-029 (WO 06/119457) e AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-OO9, AXMI-014 e AXMI-004 (WO 04/074462). A combinação de moléculas de proteína inibitória, TIC809 (apresentada como SEQ ID NO:10) e TIC810 (apresentada como SEQ ID NO: 12) foi mostrada ser inibitória para o percevejo castanho do oeste (Western Tarnished Plant Bug, WTPB), Lygus hesperus Kinght em bioensaio (PCT US 2006/033867). As proteínas de fusão de TIC809 e TIC810, TIC127 (apresentada como SEQ ID NO: 14) e TIC128 (apresentada como SEQ ID NO: 16) também podem ser ativas contra Lygus. O polinucleotídeo que codifica TIC127 é constituído pela molécula de ácido nucleico que codifica TIC809 ligada a molécula de ácido nucleico que codifica TIC810 por uma sequência poli-ligante de nucleotídeos (apresentada como SEQ ID NO:17) que codifica o ligante de aminoácidos apresentado como SEQ ID NO:18. O polinucleotídeo que codifica TIC128 é constituído pela molécula de ácido nucleico que codifica TIC810 ligada a molécula de ácido nucleico que codifica TIC809 por uma sequência poliligante de nucleotídeos (apresentada como SEQ ID NO: 17) que codifica o ligante de aminoácidos apresentado como SEQ ID NO: 18. A expressão de TIC807 em combinação com TIC127 ou TIC128 pode fornecer um controle intensificado de Lygus. Plantas dicotiledôneas, tais como o algodão, podem ser transformadas com construtos de expressão em planta contendo as sequências de nucleotídeos otimizadas para dicotiledôneas que codificam TIC807 (apresentada como SEQ ID NO:6) junto com TIC809 (apresentada como SEQ ID NO:9) e TIC810 (apresentada como SEQ ID NO:11) ou TIC127 (apresentada como SEQ ID NO:13) ou TIC128 (apresentada como SEQ ID NO: 15) para fornecer resistência aumentada a Lygus ou inibição de espécies adicionais contidas dentro do gênero, Lygus.

Para o controle de pragas de Lepidópteros, combinações de proteínas TIC807 com proteínas ativas contra Lepidópteros tais como proteínas Cry1A (Patente U.S. N² 5.880.275), Cry1B (Pedido de Patente U.S. N²10/525.318), Cry1C (Patente U.S. N² 6.033.874), Cry1F, quimeras de Cry1A/F (Patentes U.S. N² 7.070.982; 6.962.705; e 6.713.063), e uma proteína Cry2Ab (Patente U.S. N^— 7.064.249) sao específícamente consideradas.

Sequências de DNA que codificam moléculas de proteína TIC807 e outros agentes inibitórios de inseto, tais como moléculas de RNA de fita dupla e/ou proteínas não TIC807, podem ser combinados em uma única planta através tanta da transformação direta, pelo cruzamento ou por uma combinação desses. Unidades de transcrição múltiplas que compreendem um promotor e uma região que codifica um agente inibitório de inseto podem ser introduzidas no mesmo vetor de transformação de planta ou em vetores de transformação de planta diferentes. Quando os dois agentes inibitórios de inseto são proteínas, as regiões codificadoras para cada uma podem ser separadas por um ligante sensível a protease ou mesmo por um sítio de divagem de protease autoprocessado (veja a Patente U.S. N²5.846.767). Quando os agentes inibitórios de inseto são introduzidos, cada um, em plantas transgênicas diferentes, essas plantas podem ser cruzadas para se obter todos os transgenes que codificam o agente inibitório de inseto.

É esperado que a combinação de moléculas de proteína TIC807 e outros agentes inibitórios de inseto, tais como moléculas de RNA de fita dupla e/ou proteínas não TIC807, possa resultar em efeitos inibitórios de inseto sinérgicos inesperados que não são observados nem com a proteína inseticida TIC807 sozinha, nem com o ribonucleotídeo inibitório de inseto sozinho nem com a proteína inibitória de inseto não TIC807 sozinha. Efeitos sinérgicos incluem, mas não são limitados a: i) alterações qualitativas em LC50, EC50, IC50, percentual de mortalidade ou valores percentuais de subdesenvolvimento e ii) alterações qualitativas no espectro de inibição de inseto (isto é, inibição de insetos Hemípteros, Homópteros e Lepidópteros) que não refletem a simples combinação do espectro exibido por cada agente inibitório de inseto sozinho (isto é, a combinação de inibição de inseto Hemíptero fornecida por um agente e a inibição de inseto Lepidóptero fornecida pelo outro agente). Um exemplo não limitante de um efeito quantitativo sinérgico é uma diminuição em qualquer valor de LC₅₀, EC₅₀ e/ou IC₅₀ ou um aumento no percentual de mortalidade ou nos valores percentuais de subdesenvolvimento observados em uma combinação que é mais do que aditivo. Um exemplo não limitante de um efeito sinérgico qualitativo é o controle de um inseto-praga com a combinação de agentes inseticidas que não é observado com cada componente isolado. Nessa circunstância, o novo insetopraga controlado pela combinação pode ser um inseto-praga dentro de uma ordem de insetos (isto é, Hemípteros) onde os agentes inibitórios de inseto apenas inibem outros insetos-praga dentro daquela ordem de insetos quando usados sozinhos.

XIII. Proteínas TIC807 Isoladas e Equivalentes Biológicos

Também são fornecidas aqui proteínas TIC807 isoladas. Em uma modalidade, as proteínas TIC807 compreendem pelo menos 250 aminoácidos que têm pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5 e apresentam atividade inibitória de inseto. Os peptídeos, polipeptídeos e proteínas equivalentes biologicamente funcionais considerados aqui, devem possuir cerca de 70% ou mais de identidade de sequência, preferivelmente cerca de 85% ou mais de identidade de sequência e o mais preferivelmente cerca de 90 a 95% ou mais de identidade de sequência com a sequência ou uma porção correspondente dentro da sequência de polipeptídeos de TIC807. Em certas modalidades da invenção, peptídeos, polipeptídeos e proteínas equivalentes biologicamente funcionais possuem cerca de cerca de 80% ou mais de identidade de sequência, preferivelmente cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou mais de identidade de sequência e o mais preferivelmente cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a sequência de TIC807 (SEQ ID NO:5).

Os peptídeos, polipeptídeos e proteínas biologicamente funcionais equivalentes a TIC807 incluem, mas não são limitados a sequências de aminoácidos que contêm substituições conservatives de aminoácidos nas sequências de proteína TIC807. Um exemplo de proteínas TIC807 que podem ser substituídas para obter equivalentes biológicos inclui, mas não se limita a sequência de TIC807 (SEQ ID NO:5). Em tais sequências de aminoácidos, um ou mais aminoácidos da sequência são substituídos por outro(s) aminoácido(s), cuja carga e polaridade é similar àquela do aminoácido nativo, isto é, uma substituição conservative de aminoácido, resultando em uma alteração silenciosa.

Substitutos para uma aminoácido dentro da sequência de polipeptídeos de TIC807 podem ser selecionados a partir de outros membros da classe a qual o aminoácido que ocorre naturalmente pertence. Aminoácidos podem ser divididos nos quatro seguintes grupos: (1) aminoácidos ácidos;

(2) aminoácidos básicos; (3) aminoácidos polares neutros; e (4) aminoácidos não polares neutros. Aminoácidos representativos dentro desses vários grupos incluem mas não são limitados a: (1) aminoácidos ácidos (negativamente carregados) tais como ácido aspártico e ácido glutâmico; (2) aminoácidos básicos (positivamente carregados) tais como arginina, histidina e lisina; (3) aminoácidos polares neutros tais como glicina, serina, treonina, cisteína, cistina, tirosina, asparagina e glutamina; (4) aminoácidos não polares neutros (hidrófobos) tais como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina.

Substituições conservatives de aminoácidos dentro da sequência de polipeptídeo de TIC807 podem ser feitas pela substituição de um aminoácido dentro de um desses grupos por outro aminoácido dentro do mesmo grupo. Equivalentes biologicamente funcionais de TIC807 podem ter 10 ou menos alterações conservatives de aminoácidos, mais preferivelmente sete ou menos alterações conservatives de aminoácidos e mais preferivelmente cinco ou menos alterações conservatives de aminoácidos. A sequência de nucleotídeos codificadora (gene, plasmídeo de DNA, cDNA ou DNA sintético) terá então as substituições de bases correspondentes, permitindo-lhe codificar formas equivalentes biologicamente funcionais de TIC807.

Como indicado, modificações e alterações podem ser feitas na estrutura dos peptídeos da presente invenção e nos segmentos de DNA que os codificam e ainda obter uma molécula funcional que codifique uma proteína ou peptídeo com características desejáveis. O que vem a seguir é uma discussão com base nas alterações de aminoácidos de uma proteína para criar um equivalente ou até mesmo uma molécula aperfeiçoada de segunda geração. Em modalidades particulares da invenção, as proteínas TIC807 mutadas são consideradas serem úteis por aumentar a atividade inibitória de inseto da proteína e, consequentemente, por aumentar a atividade inibitória e/ou a expressão do transgene recombinante em uma célula de planta. As alterações de aminoácidos podem ser obtidas pela alteração dos códons da sequência de DNA, de acordo com os códons dados na Tabela 1.

TABELA 1

Aminoácidos	Códigos dos Aminoácidos	Códons
Alanina	Ala (A)	GCA GCC GCG GCU
Cisteina	Cys (C)	UGC UGU
Ácido aspártico	Asp (D)	GAC GAU
Ácido glutâmico	Glu (E)	GAA GAG
Fenilalanina	Phe (F)	UUC UUU
Glicina	Giy (G)	GGA GGC GGG GGU
Histidina	His (H)	CAC CAU
Isoleucina	He (D	AUA AUC AUU
Lisina	Lys(K)	AAA AAG
Leucina	Leu (L)	UUA UUG CUA CUC CUG CUU
Metionina	Met (M)	AUG

Aminoácidos	Códigos dos Aminoácidos	Códons
Asparagina	Asn (N)	AAC AAU
Prolina	Pro (P)	CCA CCC CCG CCU
Glutamina	Gin (Q)	CAA CAG
Arginina	Arg (R)	AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Serina	Ser (S)	AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Treonina	Thr (T)	ACA ACC ACG ACU
Valina	Vai (V)	GUAGUCGUG GUU
Triptofano	Trp (W)	UGG
Tirosina	Tyr (Y)	UAC UAU

Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura de proteína sem perda apreciável de atividade bioquímica ou biológica. Como é a capacidade interativa e a natureza de uma proteína que define a atividade biológica funcional daquela proteína, certas substituições de sequência de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência de uma proteína e, é claro, na sua sequência codificadora de DNA subjacente e, não obstante, obter-se uma proteína com propriedades semelhantes. É considerado pelos inventores que várias alterações podem ser feitas nas sequências de peptídeos das composições descritas ou nas sequências de DNA correspondentes que codificam os ditos peptídeos, sem perda apreciável de sua utilidade ou atividade biológica.

Ao fazer tais alterações, o índice hidropático dos aminoácidos deve ser considerado. A importância do índice hidropático dos aminoácidos em conferir a função biológica interativa de uma proteína é comumente compreendida na técnica (Kyte e Doolittle, J. Mol. Biol. 157(1):105-32, 1982). É aceito que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribua para a estrutura secundária da proteína resultante, que por sua vez define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e semelhantes.

Cada aminoácido foi designado por um índice hidropático com base na sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte e Doolittle, I bid). Esses são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteina/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5).

É conhecido na técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que têm um índice hidropático similar e ainda resultar em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, ainda obter uma proteína funcionalmente equivalente. Ao se fazer tais alterações, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de +2 é preferida, aqueles que estão dentro de +1 são particularmente preferidos e aqueles dentro de +0,5 são até mais particularmente preferidos.

Também é compreendido na técnica, que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita eficazmente com base na hidrofilicidade. A Patente U.S N^e 4.554.101 estabelece que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, como governada pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona com uma propriedade biológica da proteína.

Como detalhado na Patente U.S N^e 4.554.101, os seguintes valores de hidrofilicidade foram determinados para os resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0,+ 0,1); glutamato (+3,0,+ 0,1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (0,4); prolina (-0,5,+ 0,1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteina (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4).

Substituições não conservatives nos polipeptídeos de TIC807.

Reconhece-se ainda que substituições não conservatives nas sequências do polipeptídeo de TIC807 podem ser feitas para se obter polipeptídeos TIC807 que são equivalentes biológicos funcionais dos polipeptídeos de TIC807 aqui descritos. Nessas circunstâncias, as substituições não conservatives podem ser simplesmente testadas quanto a inibição do crescimento de fungos para identificar as substituições não conservatives que fornecem equivalentes biológicos funcionais de um dado polipeptídeo de TIC807.

Fragmentos e Variantes de TIC807

Embora o polipeptídeo inibitório de inseto da presente invenção compreenda, preferivelmente, uma sequência de proteína TIC807, fragmentos e variantes dessa sequência que possuam a mesma ou uma atividade inibitória de inseto similar àquela dessa proteína inibitória de inseto também são abrangidos pela presente invenção. Assim, são previstas por essa invenção sequências contíguas com pelo menos 250 aminoácidos ou mais em uma proteína TIC807 com atividade inibitória de inseto. Fragmentos ou variantes de TIC807 com atividade inibitória de inseto que são previstos por essa invenção também podem compreender substituições, deleções, inserções ou adições de aminoácidos em uma sequência de proteína TIC807.

O polipeptídeo inibitório de inseto da presente invenção compreende, preferivelmente, a sequência da proteína TIC807 (SEQ ID NO:5), fragmentos e variantes dessa sequência que possuam a mesma ou uma atividade inibitória de inseto similar àquela dessa proteína TIC807 particular também são abrangidos pela presente invenção e são previstos por essa invenção. Assim, são previstas por essa invenção sequências contíguas com pelo menos 250 aminoácidos ou mais em uma proteína TIC807 com atividade inibitória de inseto. Fragmentos de TIC807 inibitórios de inseto também podem compreender fragmentos com pelo menos 260, pelo menos 270, pelo menos 280, pelo menos 290 ou pelo menos 300 resíduos de aminoácidos da sequência de 309 aminoácidos de TIC807 de SEQ ID NO:5. Os fragmentos ou variantes de TIC807 com atividade inibitória de inseto que são previstos por essa invenção também podem compreender substituições, deleções, inserções ou adições de aminoácidos na sequência mostrada na SEQ ID NO:5.

Fragmentos da proteína TIC807 madura podem ser formas truncadas nas quais um ou mais aminoácidos são deletados da terminação N, na terminação C, no meio da proteína ou combinações desses com atividade inibitória de inseto também são previstos por essa invenção. Esses fragmen tos podem ser mutantes que ocorrem naturalmente ou sintéticos de TIC807 e retém a atividade inibitória de inseto de TIC807. Uma proteína TIC807 preferida que pode ser usada para se obter derivados truncados com atividade inibitória de inseto é a proteína TIC807 da SEQ ID NO:5.

Variantes de TIC807 incluem as formas nas quais um ou mais aminoácidos foram inseridos na sequência natural. Essas variantes que também podem ocorrer naturalmente ou serem mutantes sintéticas de TIC807 retêm a atividade inibitória de inseto de TIC807.

Combinações das anteriores, isto é, formas do polipeptídeo inibitório de inseto contendo ambas as deleções e adições de aminoácidos, também são abrangidas pela presente invenção. As substituições de aminoácidos também podem estar presentes nelas.

Os fragmentos e variantes de TIC807 abrangidos pela presente invenção devem possuir, preferivelmente, 70-75% ou mais de identidade de sequência, mais preferivelmente cerca de 80%, 85%, 88% ou mais de identidade de sequência e, mais preferivelmente cerca de 90% a 95% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com as regiões correspondentes da proteína TIC807 madura que tem as sequências de aminoácidos correspondentes mostradas na SEQ ID NO:5.

Uso dos Relacionamentos de Função da Estrutura para Desenhar Variantes Inibitórias de Inseto de TIC807.

Essa invenção também considera o uso dos relacionamentos de função da estrutura para desenhar variantes adicionais de proteína inibitória de inseto TIC807. É considerado primeiro que a estrutura pode ser obtida pela análise cristalográfica de cristais de TIC807. Tais estruturas são previstas revelar domínios da proteína TIC807 envolvidos na ligação ao receptor do inseto, formação de poro no intestino do inseto, multimerização com TIC807, sensibilidade a protease e/ou resistência à protease que contribuem para a atividade inibitória de inseto de TIC807.

Ainda é previsto que as comparações entre TIC807 e outras proteínas relacionadas possam permitir a extrapolação de domínios de proteína que contribuem para a atividade inseticida de proteínas TIC807. Com rela ção a isso, observou-se que TIC807 tem alguma similaridade com a família de proteínas semelhantes a MTX. Essa família de proteínas semelhante a Mtx é mencionada após proteínas Mtx2 de Bacillus sphericus (Thanabalu and Porter, Gene. 170(1):85, 1996; NCBI N^s de Acesso 2211294A) e Mtx3 (Liu et al., Appl Environ Microbiol. 62(6):2174, 1996; NCBI N² de Acesso AAB36661) e inclui Cry15Aa (SEQ ID NO:41), Cry33Aa (NCBI N² de Acesso AAL26871), Cry23Aa (NCBI N² de Acesso AAF76375), Cry38Aa (NCBI N²de Acesso AAK64559), CryC35 (NCBI N² de Acesso CAA63374), a proteína de 40KD (NCBI No de Acesso AAA22332), e CryNT32 (NCBI N de Acesso AAL26870). Também acredita-se que TIC807 é remotamente relacionada com a família de proteínas aerolisina que inclui cryET33 (WO 97/17600), e TIC901 (Pedido de Patente U.S. N² 20060191034). Aerolisinas são um grupo de proteínas que multimerizam e formam poros em membranas e que são toxinas conhecidas (Parker et al., Mol. Microbiol. 19(2):205, 1996). Em particular, determinações da estrutura cristalográfica indicam que os domínios da fita beta de aerolisinas estão envolvidos na formação de poros na membrana (Rossjohn et al., J Struct Biol. 121(2):92, 1998). Domínios de proteínas TIC807 podem ser trocados com domínios similares de outras proteínas semelhantes a Mtx ou da família de aerolisina para identificar os domínios envolvidos na ligação ao receptor do inseto, formação de poros no intestino do inseto, multimerização com TIC807, sensibilidade à protease e/ou resistência à protease que contribuem para a atividade inibitória de inseto de TIC807. Dados dos experimentos de troca de domínio podem ser comparados e extrapolados de outra maneira para dados estruturais de membros da família de proteína semelhante a Mtx para elucidar os domínios que fornecem as atividades inseticidas diferentes, atividades inseticidas melhoradas, características de ligação aperfeiçoadas, capacidades de formação de poros aperfeiçoadas.

Tendo identificado certos domínios de proteína das proteínas TIC807 que fornecem propriedades inibitórias de inseto da proteína TIC807 (isto é, ligação ao receptor do inseto, formação de poros no intestino do inseto, multimerização com TIC807, sensibilidade a protease e/ou resistência à protease), é previsto ainda que essas regiões possam ser extensamente mutagenizadas. Uma vez mutagenizada, proteínas variantes de TIC807 podem ser submetidas tanto a ensaios bioquímicos (isto é, ligação ao receptor do inseto, formação de poros no intestino do inseto, multimerização com TIC807, sensibilidade a protease e/ou resistência a protease) quanto biológicos (isto é, ensaios de inibição de inseto) para identificar aquelas variantes que conferem atividades bioquímicas e/ou inibitórias de inseto aperfeiçoadas. Rodadas repetitivas adicionais de mutagênese e ensaio daquelas variantes identificadas também são consideradas. Vários procedimentos de evolução molecular de proteínas isoladas que são conhecidos por aqueles versados na técnica (Stemmer, W., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 10747,1994; Yuan et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69(3):373, 2005) ou que são fornecidos por outros métodos inteiramente diferentes podem ser empregados para gerar variantes da proteína TIC807.

Proteínas TIC807 Isoladas com pelo menos 9 Aminoácidos

Em outras modalidades dessa invenção, proteínas isoladas que compreendem uma sequência de polipeptídeos com pelo menos 9 aminoácidos de extensão, que está contida dentro da SEQ ID NO:5 são fornecidas. Pelo menos, dois usos distintos para sequências de peptídeo de TIC807 com pelo menos 9 aminoácidos são considerados.

Primeiro, é considerado que sequências de peptídeo de TIC807 com pelo menos 9 aminoácidos podem ser substituídas em sequências de proteína distintas para conferir todas ou um subgrupo de atividades inibitórias de inseto de uma proteína TIC807 sobre uma proteína substituída pelo peptídeo de TIC807 resultante. As atividades inibitórias de inseto conferidas pelas sequências de peptídeo de TIC807 podem compreender a inibição de uma praga hemíptera incluindo, mas não limitada a Lygus. Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que sequências de peptídeo de TIC807 com pelo menos 9 aminoácidos podem fornecer: 1) formação de cristal aperfeiçoada, 2) estabilidade aperfeiçoada da proteína ou degradação reduzida por protease, 3) reconhecimento e ligação ao receptor da membrana do inseto aperfeiçoado, 4) oligomerização aperfeiçoada ou formação de canal no endotélio do intestino médio do inseto e 5) atividade inseticida ou especificidade inseticida aperfeiçoada devido a qualquer uma ou a todas as razões estabelecidas acima quando inseridas em outra proteína. Sequências maiores de peptídeo de TIC807 com pelo menos 12, pelo menos 16, pelo menos 32, pelo menos 50 ou pelo menos 100 resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO:5 também podem ser substituídas nas sequências de proteínas distintas para se obter proteínas substituídas com o peptídeo de TIC807 inibitório de inseto.

A proteína substituída com o peptídeo de TIC807 pode ser sintetizada por técnicas que incluem, mas não se limitam a mutagênese específica para o sítio (Kunkel, T. A. et al. Meth. Enzymol. 154: 367, 1987), shuffling de DNA (Stemmer, W., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 10747,1994), PCR® overlap extension (Horton et al., Gene 77: 61, 1989), qualquer um dos métodos de evolução molecular de proteína (Yuan et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69(3):373, 2005), síntese direta, combinações desses métodos ou por outros métodos inteiramente distintos que fornecem proteínas substituídas com o peptídeo de TIC807. Em particular, as proteínas TIC807 substituídas derivadas da inserção ou substituição de sequências de peptídeo de TIC807 com pelo menos 9 aminoácidos nas proteínas inibitórias de inseto derivadas de Bacillus thuringiensis são consideradas. Proteínas exemplares de Bacillus thuríngiensis que podem ser substituídas com polipeptídeos de TIC807 para obter proteínas TIC807 substituídas com atividade inibitória de inseto incluem, mas não são limitadas a Cry15Aa1 (Brown & Whiteley, 1992, J Bacteriol 174 549-557; SEQ ID NO:41), CryET29 (Patente U.S. N° 6.093.695), Cyt1Ba1 (Patente U.S. N° 5.723.440), toxinas Cyt de Bacillus thuríngiensis israelensis (Patente U.S. N° 5.885.963) e cristais de proteínas diferentes de Bacillus thuríngiensis ativos para Lygus AXMI-027, AXMI-036 e AXMI-038 descritas na Publicação do Pedido de Patente U.S. N^e 20060242732. Outras proteínas que podem ser substituídas com polipeptídeos de TIC807 para se obter proteínas TIC807 substituídas com atividade inibitória de inseto incluem, mas não são limitadas a Mtx2 (Thanabalu and Porter, Gene. 170(1):85, 1996; NCBI N^Q de Acesso 2211294A), Mtx3 (Liu et al., Appl Environ Microbi ol. 62(6):2174, 1996; NCBI N° de Acesso AAB36661), Cry15Aa (SEQ ID NO:41), Cry33Aa (NCBI N^s de Acesso AAL26871), Cry23Aa (NCBI N^s de Acesso AAF76375), Cry38Aa (NCBI N~ de Acesso AAK64559), CryC35 (NCBI N² de Acesso CAA63374), a proteína de 40KD (NCBI N- de Acesso AAA22332), CryNT32 (NCBI N- de Acesso AAL26870), cryET33 (WO 97/17600), e TIC901 (Publicação do Pedido de Patente U.S. N²20060191034).

Também é considerado que proteínas TIC807 isoladas com cerca de 250 e cerca de 309 aminoácidos também podem ser usadas para a produção de anticorpo ou inibição de inseto. Essas sequências isoladas de polipeptídeo TIC807 da invenção têm pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeo correspondente contida dentro da SEQ ID NO:5. Essas proteínas TIC807 podem compreender ainda um reagente indicador covalentemente ligado, um espaçador de aminoácidos, um ligante de aminoácidos, uma sequência de sinal, uma sequência de trânsito de peptídeo no cloroplasto, uma sequência de orientação vacuolar ou uma sequência de parada da transferência.

Também é considerado que sequências de peptídeo de TIC807 isoladas com pelo menos 9 aminoácidos da SEQ ID NO:5 possam ser usadas como imunógenos ou epítopos para a preparação de anticorpos que reconhecem as proteínas TIC807. Tais anticorpos são úteis para detectar proteínas TIC807 em plantas transgênicas, em produtos de consumo derivados de plantas transgênicas, em micro-organismos ou em bibliotecas de expressão de DNA recombinante que contêm sequências clonadas de TIC807. Os polipeptídeos de TIC807 podem ter pelo menos 9, pelo menos 12, pelo menos 16 ou pelo menos 32 aminoácidos de extensão. Quando a sequência de peptídeo de TIC807 tem pelo menos 32 aminoácidos de extensão, ela tem pelo menos cerca de 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeos correspondente contida dentro da SEQ ID NO:5. Os peptídeos podem estar ligados a um veículo proteico, tal como KLH ou albumina, para facilitar a produção de anticorpo.

A identificação de epítopos imuno-dominantes da proteína TIC807 e/ou seus equivalentes funcionais, adequados para uso em vacinas, é um assunto relativamente simples. Por exemplo, pode-se empregar os métodos de Hopp, como ensinado na Patente U.S. N² 4.554.101, que ensina a identificação e a preparação de epítopos a partir de sequências de aminoácidos com base na hidrofilicidade. Os métodos descritos em diversos outros documentos e os programas baseados neles também podem ser usados para identificar sequências de núcleo epitópico (veja, por exemplo, Patente U.S. N² 4.554.101). A sequência de aminoácidos dessas sequências de núcleo epitópico também pode ser facilmente incorporada em peptídeos, tanto através da aplicação de síntese de peptídeo quanto pela tecnologia de DNA recombinante.

Os peptídeos de TIC807 preferidos para uso de acordo com a presente invenção serão, geralmente, da ordem de cerca de 9 a cerca de 20 aminoácidos de extensão e, mais preferivelmente cerca de 9 a cerca de 15 aminoácidos de extensão. É proposto que peptídeos antigênicos curtos derivados de TIC807 fornecerão vantagens em certas circunstancias, por exemplo, na preparação de ensaios de detecção imunológica. Vantagens exemplares incluem a facilidade de preparação e purificação, o custo relativamente baixo e reprodutibilidade de produção aperfeiçoada e biodistribuição vantajosa.

É proposto que as vantagens particulares da presente invenção possam ser alcançadas através da preparação de peptídeos sintéticos que incluem as sequências de núcleo imunogênico/epitópico modificadas e/ou estendidas, que resultam em um peptídeo epitópico universal direcionado para proteínas TIC807 e, em particular, para sequências relacionadas com TIC807. Essas sequências de núcleo epitópico são identificadas aqui em aspectos particulares como regiões hidrofílicas do antígeno de polipeptídeo particular. É proposto que essas regiões representem aquelas que são as mais capazes de promover estimulação de célula T ou célula B e, portanto, desencadear a produção de anticorpo específico.

Uma sequência de núcleo epitópico, como usada aqui, é uma fita relativamente curta de aminoácidos que é complementar e, portanto, se ligará a sítios de ligação antigênica de anticorpos direcionados para TIC807 aqui descrita. Além disso ou alternativamente, uma sequência de núcleo epitópico é aquela que faz surgir anticorpos que são inter-reativos com anticorpos direcionados contra as composições de peptídeo da presente invenção. Assim, certas sequências de núcleo epitópico da presente invenção podem ser operacionalmente definidas em termos de suas habilidades para competir e, talvez, deslocar a ligação do antígeno de proteína desejado com os antissoros direcionados para a proteína correspondente.

Em geral, o tamanho do polipeptídeo antigênico não é considerado ser particularmente crucial, desde que ele seja pelo menos grande o suficiente para carregar a sequência ou sequências de núcleo identificadas. A menor sequência de núcleo útil prevista pela presente descrição pode ser da ordem de cerca de 9 aminoácidos de extensão, com sequências da ordem de 10 a 20 sendo mais preferidas. Assim, esse tamanho geralmente corresponderá aos menores antígenos peptídicos preparados de acordo com a invenção. Entretanto, o tamanho do antígeno pode ser maior quando desejado, desde que ele contenha a sequência de núcleo epitópico básica. XIV. Composições de Anticorpo de TIC807 e Métodos para Fazer Anticorpos

Em modalidades particulares, os inventores consideram o uso de anticorpos, monoclonais ou policlonais, que se ligam as proteínas TIC807 aqui descritas. Meios para preparar e caracterizar anticorpos são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Using Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1999). Os métodos para a geração de anticorpos monoclonais (mAbs) geralmente começam nos mesmos termos como aqueles para a preparação de anticorpos policlonais. Resumidamente, um anticorpo policlonal é preparado pela imunização de um animal com uma composição imunogênica de acordo com a presente invenção e com a coleta de anti-soros do animal imunizado. Uma grande faixa de espécies de animais pode ser usada para a produção de antissoros. Tipicamente, o animal usado para a produção de antissoros é um coelho, um camundongo, um rato, um hamster, um porca da guiné ou uma cabra. Devido ao volume relati vamente grande de sangue de coelhos, um coelho é a escolha preferida para a produção de anticorpos policlonais.

Como é bem conhecido na técnica, uma dada composição pode variar em sua imunogenicidade. Geralmente é necessário, portanto, estimular o sistema imune do hospedeiro, o que pode ser obtido pelo acoplamento de um imunógeno peptídico ou proteico a um veículo. Veículos exemplares e preferidos são a hemociana de keyhole limpet (KLH) e a albumina sérica bovina (BSA). Outras albuminas, tais como a albumina de ovo, a albumina sérica de camundongo ou a albumina sérica de coelho também podem ser usadas como veículos. Meios para conjugar um peptídeo, polipeptídeo ou proteína a uma proteína veiculadora são bem conhecidos na técnica e incluem o uso de glutaraldeído, éster de m-maleimidobenzoil-Nhidroxissuccinimida, carbodiimida e benzidina bis-biazotizada.

Como também é conhecido na técnica, a imunogenicidade de uma composição imunogênica particular pode ser intensificada pelo uso de estimuladores não específicos da resposta imune, conhecidos como adjuvantes. Adjuvantes exemplares e preferidos incluem o adjuvante completo de Freund (um estimulador não específica da resposta imune contendo Mycobacterium tuberculosis morta), adjuvantes incompletos de Freund e adjuvante de hidróxido de alumínio.

A quantidade de composição imunogênica usada na produção de anticorpos policlonais varia com a natureza do imunógeno assim como o animal usado para a imunização. Uma variedade de vias pode ser usada para administrar o imunógeno (subcutânea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). A produção de anticorpos policlonais pode ser monitorizada pela amostragem do sangue do animal imunizado em vários períodos após a imunização. Uma segunda injeção estimuladora também pode ser dada. O processo de estimulação e titulação é repetido até que um título adequado seja obtido. Quando um nível de imunogenicidade desejado é obtido, o animal imunizado pode ser sangrado e o soro isolado e armazenado e/ou o animal pode ser usado para gerar mAbs.

Anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser facilmente prepara dos através do uso de técnicas bem conhecidas, tais como aquelas exemplificadas na Patente U.S. N^a 4.196.265. Tipicamente, essa técnica envolve imunizar um animal adequado com uma composição imunogênica selecionada, por exemplo, uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo antifúngicos purificados ou parcialmente purificados. A composição imunizante é administrada de uma maneira eficaz para estimular as células que produzem anticorpos. Roedores tais como camundongos e ratos são os animais preferidos, entretanto o uso de células de coelho, carneiro ou sapo também é possível. O uso de ratos pode fornecer certas vantagens, mas os camundongos são preferidos, com o camundongo BALB/c sendo o mais preferido já que ele é mais rotineiramente usado e geralmente dá um percentual mais alto de fusões estáveis.

Também são considerados os métodos de imunização genética para se obter anticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam às proteínas TIC807 aqui descritas. Nesses métodos, o gene que codifica a proteína TIC807 é operativamente ligado a um promotor que é ativo em células de mamíferos. O plasmídeo de DNA isolado que compreende o cassete de expressão em célula de mamífero compreendendo a proteína codificada TIC807 é então injetado diretamente no animal para desencadear uma resposta imune à proteína TIC807 codificada. Animais que podem ser usados como hospedeiros para a imunização genética incluem, mas não se limitam a camundongos, ratos, coelhos, cabras, vacas ou cavalos. Embora uma variedade de regimes de injeção possa ser usado, um regime exemplar pode compreender a injeção de um plasmídeo de DNA dissolvido em salina tamponada com fosfato ou outro tampão adequado em uma concentração de aproximadamente 1-2 mg de plasmídeo de DNA/ml e em uma dose de cerca de 100 ug/injeção/animal (isto é, para um camundongo, rato ou coelho). Cerca de 3-4 injeções podem ser feitas em cada animal em intervalos de duas semanas. A imunização genética é descrita em Chambers e Johnston, Nature Biotechnol. (21):1088, 2003. Organizações de pesquisa contratadas também conduzem experimentos de imunização genética para a obtenção de anticorpos (QED Bioscience Inc., San Diego, CA, USA).

Exemplos de cassetes de expressão em mamíferos úteis que podem ser usados para a imunização genética incluem, mas não se limitam ao vetor pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) que fornece um promotor CMV para a expressão de genes operativa mente ligados ou o vetor pRc/RSV (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Nos casos em que os níveis elevados de expressão de antígeno são citotóxicos, um promotor fraco, tal como o promotor SV40, pode ser usado para expressar o antígeno. É previsto que tanto o gene nativo de TIC807 (SEQ ID NO:4) quanto o gene sintético de TIC807 (SEQ ID NO:6) possam ser operativamente ligados a promotores e elementos de poliadenilação que são ativos em células de mamíferos para a obtenção de plasmídeos adequados para a imunização genética. Entretanto, o planejamento e a síntese de outras sequências que codificam TIC807 para a expressão em hospedeiros mamíferos pela tradução retrógrada da sequência de aminoácidos de TIC807 (SEQ ID NO:5) também são considerados. Vetores de expressão em mamíferos que compreendem ainda as sequências de peptídeo de sinal que fornecem a secreção extracelular e/ou a inserção transmembrana de sequências operativamente ligadas que codificam proteínas TIC807 também são considerados.

XV. Rastreamento de Proteína TIC807 e Kits de Detecção

A presente invenção considera métodos e kits para o rastreamento de amostras suspeitas de conter proteínas TIC807 ou polipeptídeos relacionados a proteínas TIC807 ou células que produzem tais polipeptídeos. Nas modalidades particulares aqui consideradas, os métodos e kits detectam a proteína TIC807. Um kit pode conter um ou mais anticorpos da presente invenção e também pode conter reagente(s) para detectar a interação entre uma amostra e um anticorpo da presente invenção. O(s) reagente(s) fornecido(s) pode/podem ser marcado(s) radioespectrofotometricamente, fluorescentemente ou enzimaticamente. Os reagentes fornecidos podem incluir um substrato que é convertido em um produto que pode ser detectado pela espectrofotometria, luminometria ou fluorescência. O kit pode conter um agente radiomarcado conhecido ou um hapteno marcado capaz de se ligar ou interagir com um anticorpo da presente invenção.

O(s) reagente(s) do kit pode/podem ser fornecido(s) como uma solução líquida, acoplado(s) a um suporte sólido ou como um pó seco. Preferivelmente, quando os reagentes são fornecidos em uma solução líquida, a solução líquida é uma solução aquosa. Preferivelmente, quando os reagentes fornecidos estão acoplados a um suporte sólido, o suporte sólido pode ser um meio cromatográfico, uma placa de teste com uma pluralidade de poços ou uma lâmina de microscópio. Quando os reagentes fornecidos são um pó seco, o pó pode ser reconstituído pela adição de um solvente adequado, que pode ser fornecido.

Em modalidades adicionais, a presente invenção refere-se a métodos de imuno-detecção e kits associados. É proposto que as proteínas e peptídeos de TIC807 da presente invenção sejam empregados para detectar anticorpos que têm reatividade com elas ou, alternativamente, anticorpos preparados de acordo com a presente invenção podem ser empregados para detectar proteínas TIC807 ou peptídeos que contêm epítopos relacionados com a proteína TIC807. Em geral, esses métodos incluirão primeiro a obtenção de uma amostra suspeita de conter tal proteína, peptídeo ou anticorpo, contatar a amostra com um anticorpo ou peptídeo de acordo com a presente invenção, conforme o caso, sob condições eficazes para permitir a formação de um complexo imune e depois detectar a presença do complexo imune.

Em geral, a detecção da formação do complexo imune é muito bem conhecida na técnica e pode ser obtida através da aplicação de numerosas abordagens. Por exemplo, a presente invenção considera a aplicação de ELISA, RIA, imunoblot (por exemplo, dot blot), técnicas de imunofluorescência indireta e semelhantes. Geralmente, a formação de complexo imune será detectada através do uso de um marcador, tal como um radiomarcador ou um marcador enzimático (tal como fosfatase alcalina, peroxidase de rábano silvestre ou semelhantes). É claro, podem ser encontradas vantagens adicionais através do uso de um ligante secundário tal como um segundo anticorpo ou um arranjo de ligação de biotina/avidina, como é conhecido na técnica.

Para os propósitos de ensaio, é proposto que virtualmente qualquer amostra suspeita de compreender uma proteína ou peptídeo de TIC807 ou um peptídeo relacionado com a proteína TIC807 ou anticorpo que precise ser detectado, conforme o caso, possa ser empregada. É considerado que tais modalidades possam ter aplicação na titulação de antígenos ou amostras de anticorpo, na seleção de hibridomas e semelhantes. Em modalidades relacionadas, a presente invenção considera a preparação de kits que podem ser empregados para detectar a presença de proteínas TIC807 ou um peptídeos relacionados e/ou anticorpos em uma amostra. As amostras podem incluir células, sobrenadantes celulares, suspensões celulares, extratos celulares, frações enzimáticas, extratos de proteína ou outras composições acelulares suspeitas de conter proteínas ou peptídeos de TIC807. De modo geral, os kits de acordo com a presente invenção incluirão uma proteína TIC807, peptídeo ou um anticorpo direcionado contra tal proteína ou peptídeo, junto com um re agente para imunodetecção de complexos antígeno/anticorpo, instruções para o uso desses materiais e meios para a contenção do anticorpo ou antígeno e reagente. O reagente para imunodetecção tipicamente compreenderá um marcador associado com o anticorpo ou antígeno ou associado com um ligante secundário. Ligantes exemplares podem incluir um anticorpo secundário direcionado contra o primeiro anticorpo ou antígeno ou um ligante de biotina ou avidina (ou estreptavidina) que tem um marcador associado. É claro, como observado acima que numerosos marcadores exemplares são conhecidos na técnica e todos os tais marcadores podem ser empregados em conjunto com a presente invenção.

A embalagem geralmente incluirá um frasco no qual o anticorpo, antígeno ou reagente de detecção pode ser colocado e preferivelmente e adequadamente aliquolado. Os kits da presente invenção também incluirão tipicamente um meio para a contenção dos recipientes do anticorpo, antígeno e reagente em íntimo confinamento para venda comercial. Tais recipientes podem incluir recipientes para injeção ou recipientes de plástico moldado nos quais os frascos desejados estão acondicionados.

Como resultado do precedente, será visto que várias vantagens da invenção são obtidas e realizadas.

As modalidades foram escolhidas e descritas a fim de melhor explicar os princípios da invenção e sua aplicação prática para capacitar dessa maneira outros versados na técnica a melhor utilizar a invenção em várias modalidades e com várias modificações que são adequadas para o uso particular considerado.

EXEMPLOS

As modalidades descritas a seguir são meramente representativas da invenção, que pode ser desenvolvida de várias formas. Assim, os detalhes estruturais e funcionais aqui descritos não são para ser interpretados como limitantes.

Exemplo 1: Identificação da cepa EG2934 de Bacillus thuringiensis

Esse exemplo descreve a cepa EG2934 de Bacillus thuringiensis e os cristais de proteína derivados dessa cepa.

As cepas de Bacillus thuringiensis são bem conhecidas quanto a sua habilidade em produzir cristais parasporais que contêm proteínas com atividades inseticidas diversas contra espécies de insetos Lepidópteros, Coleópteros e Dípteros. Esses cristais parasporais exibem uma variedade de formas geométricas quando observados pelo microscópio de contraste de fase e foram descritos como irregulares, cubóides, em forma de bastão, romboides, bipiramidais, etc. As cepas de B. thuringiensis que exibem atividade tóxica para Lepidópteros parecem ser mais comuns do que as cepas de B. thuringiensis que exibem toxicidade para outras espécies de insetos. Os cristais parasporais que exibem uma forma bipiramidal são frequentemente associados com isolados de B. thuringiensis tóxicos para Lepidópteros.

Esse relacionamento de estrutura-função do cristal bipiramidal com atividade para Lepidópteros fornece uma vantagem quando se rastrear cepas de B. thuringiensis não caracterizadas, permitindo uma rápida seleção de cepas que podem exibir atividade inseticida direcionada para insetos diferentes da espécie lepidóptera. A cepa EG2934 foi selecionada sobre essa base já que, quando vista pela microscopia de contraste de fase, ela parece conter cristais bem definidos que carecem da estrutura bi-piramidal. A fim de estabelecer quais cristais de proteína produzidos por essa cepa possuíam atividade inseticida, os genes que codificam essas proteínas foram clonados e expressos em uma cepa hospedeira bem caracterizada, livre de toxina e acristalífera de B. thuríngiensis. Quatro cristais de proteína, variando em tamanho de aproximadamente 35 quilodáltons (kDa) a aproximadamente 120 kDa, foram identificados nas preparações de cristal produzidos pela cepa EG2934 de B. thuríngiensis. Como procedimento de rotina de rastreamento, essas proteínas foram submetidas a teste quanto a toxicidade contra insetos-praga de planta conhecidos. Uma proteína da cepa EG2934 de B. thuríngiensis, designada como TIC807, foi descoberta ser tóxica para os insetos picadores-sugadores, Lygus hesperus e Lygus lineolarís.

Exemplo 2: Caracterização de cristais de proteína produzidos pela cepa EG2934 de B. thuríngiensis

Esse exemplo ilustra a caracterização de cristais de proteína isolados da cepa EG2934 de B. thuríngiensis e a caracterização inicial subsequente da proteína ativa tóxica para Lygus, TIC807.

A cepa EG2934 de B. thuríngiensis foi cultivada a 25 a 28 graus Celsius em meio de esporulação C2 (Donovan et al., Mol. Gen. Gent. 214:365-372, 1988) por 3 a 4 dias ou até que completamente esporulada e lisada. Os esporos e cristais foram coletados por centrifugação e ressuspensos em tampão de lavagem (Tris-HCI 10 mM, EDTA 0,1 mM, Triton X-100 0,005 por cento, pH 6.8) e coletados novamente por centrifugação. Os péletes de esporo-cristal foram ressuspensos em tampão de lavagem com um décimo do volume original da cultura. Os cristais de proteína nos concentrados por 10 X foram analisados por eletroforese com SDS e gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). As concentrações de proteína foram determinadas por densitometria usando albumina sérica bovina (BSA) como padrão.

A cepa EG2934 de B. thuríngiensis produz cristais de proteína com aproximadamente 120, 110, 65 e 35 quilodáltons (kDa) após a esporulação. As proteínas de EG2934 foram determinadas por SDS-PAGE. Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF (BioRad, Hercules, CA) após procedimentos de western blotting padronizados. Após a transferência, as proteínas ligadas a cada membrana foram submetidas ao sequenciamento N-terminal, usando procedimentos de degradação automatizados padronizados Edman. A sequência de aminoácidos N-terminal de TIC807 é apresentada como SEQ ID NO:1. Pesquisas em bancos de dados públicos disponíveis falharam em identificar uma combinação significativa para essa sequência, sugerindo que a proteína TIC807 pode ser nova. Dois iniciadores de oligonucleotídeo degenerado, designados como djc-pr12 (SEQ ID NO:2) e djc-pr13 (SEQ ID NO:3) foram designados com base na sequência de aminoácidos, SEQ ID NO:1, para servirem como sondas de hibridização para o isolamento de genes de B. thuringiensis que codificam a proteína TIC807 e homólogos de TIC807.

Exemplo 3: Isolamento e caracterização de TIC807 isolada da cepa EG2934 de B. thuringiensis

Esse exemplo ilustra o rastreamento de clones de fago contendo DNA que codifica a proteína TIC807. A clonagem e o sequenciamento do DNA que codifica a proteína TIC807 também é descrito. O método descrito abaixo também pode ser aplicado para recuperar sequências de DNA que codificam homólogos de TIC807 e genes relacionados nas bibliotecas de plasm ideo, cosmídeo ou fago derivadas de outras cepas de B. thuringiensis.

Os iniciadores de oligonucleotídeos descritos no exemplo 2, djcpr12 e djc-pr13 (SEQ ID NO:2 e (SEQ ID NO:3, respectivamente), foram usados como sondas de hibridização para sondar uma biblioteca construída usando o tamanho selecionado do DNA isolado da cepa EG2934 de B. thuringiensis. Nos oligonucleotídeos degenerados de SEQ ID NO:2 (AAYGCDATHA AYTAYTGGGG DCCDAARAAY) e SEQ ID NO:3 (TGGGGDCCDA ARAAYAAYAA YGARATWCAR), os resíduos Y representam uma mistura de resíduos C ou T, os resíduos D representam uma mistura de resíduos A, G ou T, os resíduos H representam uma mistura de resíduos A, C ou T, os resíduos R representam uma mistura de resíduos A ou G e os resíduos W representam uma mistura de resíduos A ou T. O DNA total da cepa EG2934 de B. thuringiensis foi preparado usando um protocolo que emprega uma etapa de extração com CTAB (Current Protocols in Molecular Biology (1997) John Wiley and Sons, Inc.). Esse DNA não foi clivado pela enzima de restrição Sat/3AI, uma clivadora de 4 bases tipicamente usada para preparar bibliotecas genômicas. Surpreendentemente, um isoesquizômero de Sau3M que é sensível a metilação do DNA, Mbo\, digeriu o DNA genômico eficientemente. O DNA digerido foi fracionado por tamanho em gel de agarose 1 % 1X TBE. Os fragmentos de Mbo\ de 7 a 12 kb foram extraídos das lâminas de gel usando protocolos padronizados e ligados em um vetor À-Zap Express digerido com BamHI e empacotados em partículas de fago usando um kit GigaPack III Gold (Stratagene, La Jolla, CA). Após a amplificação do fago, as transfecções foram plaqueadas e as placas de hibridização feitas com membranas de nylon Duralon UV (Stratagene, La Jolla, CA). As membranas foram incubadas a 50 graus Celsius em um tampão padrão de préhibridização/hibridização contendo 5X SSC, N-lauroil sarcosina 0,1%, SDS 0,02%, Reagente de Bloqueio 1% (Roche, Indianapolis, IN, Cat. No. 1585762), 0,1 mg/mL de poly-A, e 4 ug/mL de poly-dA por várias horas. Os oligonucleotídeos foram marcados na terminação 3' com digoxigenina (DIG) usando transferase terminal, DIG-11-dUTP (kit DIG oligonuceotide tailing; Roche, Indianapolis, IN, Cat. N^e 1 417 231) e os protocolos recomendados pelo fabricante. Uma mistura 1:1 dos oligos djc-pr12 e djc-pr13 marcados com DIG foi adicionada e as membranas incubadas durante a noite a 50 graus Celsius. Os filtros foram lavados duas vezes por 15 minutos em temperatura ambiente em 3X SSC, SDS 0,1% e duas vezes por 15 minutos a 50 graus Celsius em 1X SSC, SDS 0,1%. As placas de hibridização foram visualizadas por quimioluminescência usando o tampão e os protocolos Wash and Block (Roche, Indianapolis, IN, Cat. N² 11585762001), fragmentos Fab de fosfatase alcalina anti-DIG (Roche, Indianapolis, IN, Cat. N²11093274910) e o substrato CSPD (Fosfato dissódico de 3-(4-metoxiespiro {1,2-dioxetano-3,2-(5-cloro)triciclo[3.3.1.13,7]decan}-4-il)fenila) (Roche, Indianapolis, IN). Doze clones recombinantes foram retirados das placas primárias, diluídos, plaqueados e ressondados com os oligos marcados com DIG.

Apenas duas rodadas de plaqueamento/sondagem foram necessárias para se obter clones puros. Todos os doze clones de fago foram submetidos a reações de excisão rendendo 12 clones de fagomídeo individuais. Esses foram digeridos com Sa/I e Not\ para liberar os insertos clonados. Os produtos da digestão foram determinados em gel de agarose 1% 1X TBE e colocados em uma membrana Nytran® para análise Southern. Os tamanhos dos insertos eram muito menores do que o esperado, variando em tamanho entre 2 a 5 kb. Entretanto, a análise Southern demonstrou a presença de DNAs hibridizados em 9 dos 12 clones.

As reações de amplificação térmica usando combinações dos oligos degenerados, djc-pr12 e djc-pr13, com iniciadores específicos para sequências de vetor que flanqueiam os insertos foram realizadas para mapear a localização da região codificadora de TIC807 nos clones de fagomídeo. Baseado nesses resultados, foi determinado que o gene completo estava presente em quatro clones de fagomídeo diferentes designados como plC17039 até plC17042. O tamanho do inserto e a identificação da linhagem correspondente de cada um desses clones de fagomídeo é mostrada na Tabela 2.

Tabela 2: Cepas de Escherichia coli contendo fagomídeos de TIC807 e o tamanho do inserto associado.

Cepa	Fagomídeo	Tamanho estimado do inserto (quilobases)
SIC8087	plC17039	2,3
SIC8088	plC17040	3,5
SIC8089	plC17041	5,5
SIC8090	plC17042	1,5

O inserto do gene de TIC807 sobre o plasmídeo plC17042 foi sequenciado. A região codificadora deduzida (apresentada como SEQ ID NO:4) codifica uma proteína com 309 aminoácidos e é apresentada como SEQ ID NO:5. Uma pesquisa BlastP (versão 2.2.9) no banco de dados de proteína não redundante revelou que a combinação mais próxima da sequência da proteína TIC807 era com o cristal de proteína Cry15Aa1 (SEQ ID NO:41) de B. thuringiensis. Um alinhamento global de Needleman-Wunsch das duas proteínas demonstrou uma identidade de sequência de 25,5% entre a sequência da proteína TIC807 e a sequência da proteína Cry15Aa1. O alinhamento de TIC807 (SEQ ID NO:5) e Cry15Aa1 (SEQ ID NO:41) está ilustrado na Figura 1. Apesar das proteínas TIC807 e Cry15Aa1 não serem altamente conservadas, regiões localizadas das proteínas exibem a conservação completa da sequência sobre fitas curtas de sequências de aminoácidos contíguos com até sete resíduos de extensão.

A cepa SIC8088 de Escherichia coli que abriga o vetor plC17040 foi depositada em 16 de Março de 2007 no Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL) em Peoria, Illinois e recebeu o N² de Acesso NRRLB-50030.

Exemplo 4: Expressão de TIC807 em uma cepa hospedeira de B. thuringionsis livre de toxins

Esse exemplo ilustra a clonagem da região codificadora de TIC807 em um plasmídeo para expressão em uma cepa hospedeira de B. thuringiensis livre de toxina. Esse exemplo também ilustra um processo pelo qual uma proteína tóxica tal como TIC807 pode ser produzida com pureza para um bioensaio contra pragas de inseto.

Os plasmídeos plC17040 e plC17041 de TIC807 (Tabela 1) foram digeridos com as endonucleases de restrição Not\ e Xma\ e submetidos a eletroforese sobre gel de agarose 1% 1X TBE. Os fragmentos isolados resultantes foram purificados após a eletroforese em gel de agarose usando um kit de purificação de DNA da Qiagen (Valencia, CA) seguindo o protocolo do fabricante. Da mesma maneira, o vetor shuttle pEG854 de E. coliB.thuringiensis (Baum et al. 1990) foi digerido com as endonucleases de restrição Not\ e Xmal e um fragmento de DNA de aproximadamente 4,3 quilobases contendo a origem de replicação ori43 do plasmídeo Bt e um gene de cloranfenicol acetiltransferase (cat), foi purificado após eletroforese em gel de agarose. A ligação dos fragmentos de gene de TIC807 com ori43fragmento do gene cat forneceu plasmídeos capazes de replicação em B. thuringiensis. Os produtos de ligação foram usados para transformar a cepa hospedeira EG10650 de B.thuringiensis acristalífera (Cry-) para resistir a o cloranfenicol por eletroporação, rendendo os isolados recombinantes de

B.thuringiensis SIC8091, SIC8092, SIC8093 e SIC8094 descritos na Tabela

3.

Tabela 3: Cepa de B. thuríngiensis contendo plasmídeos para expressão de TIC807

Cepa	Plasmídeo	Tamanho estimado do inserto (quilobases)
SIC8091	PIC17043	3,5
SIC8092	PIC17044	3,5
SIC8093	PIC17045	5,5
SIC8094	PIC17046	5,5

As cepas recombinantes foram cultivadas a 25-28 graus Celsius em meio C2 por 3-4 dias ou até a esporulação e lise completas. Os esporos e cristais foram coletados por centrifugação (por exemplo, 4000 x g por 30 minutos), ressuspensos em tampão de lavagem (Tris-HCI 10 mM, EDTA 0,1 mM, Triton X-100 0,005%, pH 6.8) e coletados novamente por centrifugação. Os péletes de esporo-cristal foram ressuspensos em tampão de lavagem com 1/10 do volume original da cultura. Os cristais de proteína nos concentrados por 10 X foram analisados por eletroforese com SDS e gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Todas as quatro cepas recombinantes produziram um cristal de proteína com a massa molecular aparente esperada de aproximadamente 35 kDa. As concentrações de proteína foram determinadas por densitometria usando albumina sérica bovina (BSA) como padrão.

Exemplo 5: TIC807 é tóxica para Lygus hesperus e Lygus lineolaris

Esse exemplo ilustra o ensaio de alimentação usado para identificar a molécula da proteína TIC807 como sendo tóxica para o percevejo castanho do oeste (WTPB), Lygus hesperus e o percevejo castanho (TPB) Lygus lineolaris. WTPB e TPB são insetos fitófagos picadores-sugadores que atacam numerosas ervas daninhas e culturas. WTPB e TPB danificam culturas agrícolas, incluindo o algodão, pelo dano alimentar direto. Como WTPB e TPB se alimentam através de picadas e sucção, o ensaio usado para testar proteínas tóxicas para essa classe de insetos deve permitir o comportamento alimentar natural do inseto. O ensaio de alimentação em pregado foi baseado em um formato de 96 poços e um sistema de sache como descrito por Habibi et al., (Archives of Insect Biochem. and Phys. 50: 62-74 (2002)). A dieta artificial foi fornecida por Bio-Serv ® (Bio-Serv ® Diet F9644B, Frenchtown, NJ), cujos componentes estão apresentados na Tabela 4.

Table 4: The Bio-Serv ® F9644B WTPB artificial diet.

Ingredientes da Dieta	Gramas/Litro
Germe de trigo estabilizado	44,60
Colesterol	0,50
RNA	5,00
Mistura de vitaminas, Vanderzant	8,90
Ácido para-aminobenzóico	0,18
Niacina	0,18
Acetato de Vitamina E	0,10
Aureomicina	0,10
Sulfato de Estreptomicina	0,135
Carragena (Irish Moss)	3,00
Feijão de Lima, triturado	45,00
Hidrolisado de caseína	17,90
Mistura de sal, Hesperus	2,90
Sucrose	27,10
Lecitina, Liquido, Soja	0,50
Óleo de açafroa	0,20
Ovos de galinha (4)	Não adicionados

Quinhentos e dezoito mililitros de água fervida, autoclavada foram combinados com 156,3 gramas de Bio-Serv® DietF9644B em um liquidificador com a superfície esterilizada. Quatro ovos de galinha com s superfície esterilizada foram quebrados e os conteúdos foram adicionados ao liquidificador contendo a mistura da dieta. A mistura foi liquidificada até ficar homogênea e ajustada para um litro de volume e deixada esfriar. As amostras de toxina foram preparadas pela mistura da preparação de proteína tóxica TIC807 na concentração desejada com um volume equivalente da dieta li93 quidificada.

Uma folha de Parafilm® (Pechiney Plastic Packing, Chicago, IL) foi colocada sobre uma placa de 96 poços com um sistema a vácuo (Analytical Research Systems, Gainesville, FL), com um vácuo de aproximadamente -20 milímetros de mercúrio, que é suficiente para causar a extrusão do Parafilm® nos poços. Quarenta microlitros da amostra de teste foram adicionados aos poços de Parafilm®. Uma folha de filme Mylar (Clear Lam Packaging, Inc., Elk Grove Village, IL) foi então colocada sobre o Parafilm® e cuidadosamente lacrada com tachas de ferro (Bienfang Sealector II, Hunt Corporation, Filadélfia, PA). Os saches de Parafilm® foram colocados sobre uma placa de 96 poços de fundo chato contendo ovos de Lygus suspensos em agarose. Após a incubação, as ninfas de Lygus se alimentarão picando o sache que esta presente sobre elas. Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que a digestão extra-oral no sache possa levar a proteólise e degradação antes da ingestão pelo inseto. Para assegurar que a proteína intacta fosse oferecida para o inseto em sua dieta, os sachês da dieta foram substituídos a cada dois dias. Esse aperfeiçoamento, em teoria, permite uma oferta prolongada das proteínas tóxicas na dieta do inseto durante o decorrer do ensaio de alimentação. Além disso, concentrações menores da proteína tóxica putativa podem ser testadas já que quantidades maiores de proteína não serão necessárias para compensar os efeitos digestivos extraorais em potencial. Os sachês com a dieta do inseto foram substituídos nos dias dois e quatro. Os escores de subdesenvolvimento e de mortalidade foram determinados no dia 5 e comparados com controles não tratados (UTC).

As Tabelas 5 a 8 ilustram a toxicidade de TIC807 sobre o percevejo castanho do oeste (WTPB), Lygus hesperus e o percevejo castanho (TPB) Lygus lineolaris. A dieta foi menos do que ótima para TPB, reduzindo a taxa de crescimento das ninfas na amostra UTC (controles não tratados) em relação a UTC para WTPB. Entretanto, uma mortalidade e subdesenvolvimento significativos foram demonstrados contra TPB.

Tabela 5: Escores de subdesenvolvimento para o percevejo castanho do oeste (WTPB), Lygus hesperus

T ratamento	Concentração (mg/ml)	N	Subdesenvolvimento médio	Desvio padrão	P>\|t\|
UTC	0,00	12	0,00	0,00
TIC807	1,00	5	1,60	0,55	<0,0001

Tabela 6: Escores de percentual de mortalidade com TIC807 para o percevejo castanho do oeste (WTPB), Lygus hesperus

Tratamento	Concentração (mg/ml)	N	% média de mortalidade	Desvio-padrão	P>\|t\|
UTC	0,00	12	0,00	0,00
TIC807	1,00	5	56,79	15,89	<0,0001

Tabela 7: Escores de subdesenvolvimento para o percevejo castanho (TPB), Lygus lineolaris

T ratamento	Concentração (mg/ml)	N	Subdesenvolvimento médio	Desviopadrão	P>\|t\|
UTC	0,00	6	0,00	0,00
TIC807	1,00	5	1,20	0,20	<0,05

Tabela 8: Escores de percentual de mortalidade com TIC807 para o percevejo castanho (TPB), Lygus lineolaris

Tratamento	Concentração (mg/ml)	N	% médio de mortalidade	Desviopadrão	P>\|t\|
UTC	0,00	6	0,00	0,00
TIC807	1,00	5	45,33	7,65	<0,05

Exemplo 6: Síntese de um gene que codifica um proteína TIC807 que é designado para expressão em plantas

Uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína TIC807 é planejada e sintetizada. Essa região codificadora não nativa planejada para expressão em planta é fornecida aqui como SEQ ID NO:6. A sequência codificadora é caracterizada por um conteúdo de A+T menor do que o da região codificadora de TIC807 que foi derivada de Bacillus thuringiensis, eliminando regiões do gene nativo de TIC807 que são ricas em A+T e substituindo-as por sequências que têm poucos resíduos de A+T.

Exemplo 7: Cassetes de expressão para a expressão de uma proteína TIC807 em células de planta transgênica ou em plantas transgênicas.

Uma variedade de cassetes de expressão em planta foi constru ida com a região codificadora não nativa de TIC807 (SEQ ID NO:6). Tais cassetes de expressão são úteis para a expressão transitória em protoplastos de planta ou calos de planta.

Um primeiro cassete de expressão de TIC807 em planta compreende um promotor intensificado CaMV35S que está operativamente ligado a uma região codificadora que compreende uma sequência codificadora não nativa de TIC807 com uma fusão C-terminal em fase a um epítopo tag da proteína myc (SEQ ID NO:19). Essa região codificadora está operativamente ligada a um sítio de poliadenilação 3' terminal de nopalina sintase (NOS). A sequência desse cassete de expressão 5'-e35S-TIC807-myc-NOS3' não direcionado e marcado é fornecida como SEQ ID NQ:20 e foi clonada em PMON59221. O cassete de expressão 5'-e35S-TIC807-myc-NOS-3' completo está contido sobre um fragmento de restrição de Nott no vetor shuttle pMON59221.

Um segundo cassete de expressão em planta compreende um promotor CaMV35S intensificado que está operativamente ligado a uma região codificadora que compreende a sequência que codifica o peptídeo do cloroplasto N-terminal de Arabidopsis shkG (isto é, CTP2), fundida em fase a uma sequência que codifica a proteína TIC807 não nativa e com uma fusão C-terminal em fase a um epítopo tag da proteína myc (SEQ ID NO:21). Essa região codificadora está operativamente ligada a um sítio de poliadenilação 3' terminal de nopalina sintase (NOS). A sequência desse cassete de expressão e35S-CTP2-TIC807-myc-NQS direcionado e marcado é fornecida como SEQ ID NO:22 e foi clonada em pMON59223. O cassete de expressão e35S-CTP2-TIC807-myc-NOS-3' completo está contido sobre um fragmento de restrição de Notl no vetor shuttle pMON59223.

Um terceiro cassete de expressão em planta compreende um promotor CaMV35S intensificado que está operativa mente ligado a uma região codificadora que compreende uma sequência não nativa de TIC807 (SEQ ID NO:6). Essa região codificadora está operativamente ligada a um sítio de poliadenilação 3' terminal de nopalina sintase (NOS). A sequência desse cassete de expressão não direcionado de TIC807 é fornecida como

SEQ ID NO:40 e foi clonada em pMON59224. O cassete de expressão 5'e35S-TIC807-NQS-3' completo está contido sobre um fragmento de restrição de Noti no vetor shuttle pMON59224.

Um quarto cassete de expressão de TIC807 em planta compreende um promotor CaMV35S intensificado que está operativamente ligado a uma região codificadora que compreende a sequência que codifica o peptídeo do cloroplasto N-terminal de Arabidopsis shkG (isto é, CTP2), fundida em fase a uma sequência não nativa que codifica a proteína TIC807 (SEQ ID NO:7). A sequência de peptídeos da proteína de fusão CTP2-TIC807 codificada por esse construto é fornecida como SEQ ID NO:8. Essa região codificadora está operativamente ligada a um sítio de poliadenilação 3' terminal de nopalina sintase (NOS). A sequência desse cassete de expressão direcionado 5'-e35S-CTP2-TIC897-NOS-3' é fornecida como SEQ ID NO:23 e foi clonada em pMON59222. O cassete de expressão 5'-e35S-CTP2-TIC807NOS-3' completo está contido sobre um fragmento de restrição de Not\ no vetor shuttle pMON59222.

Um quinto cassete de expressão direcionada para o plastídeo compreende um promotor CaMV35S intensificado que está operativamente ligado a uma sequência líder 5' não traduzida derivada do gene HSp17.9 de Glicina max que está operativamente ligado a uma região codificadora que compreende uma sequência N-terminal que codifica o peptídeo de cloroplasto de Arabidopsis shkG (isto é CTP2) fundida em fase com uma sequência não nativa que codifica TIC807 (SEQ ID NO:6). A sequência de peptídeos da proteína de fusão CTP2-TIC807 codificada por esse construto é fornecida como SEQ ID NO:8. Essa região codificadora está operativamente ligada a um sítio de poliadenilação 3' terminal de nopalina sintase (NOS). A sequência desse cassete de expressão direcionado 5'-e35S-Hsp17.9-CTP2TIC897-NOS-3' é fornecida como SEQ ID NO:42.

Um sexto cassete de expressão compreende um promotor CaMV35S intensificado que está operativamente ligado a uma sequência líder 5' não traduzida derivada do gene HSp17.9 de Glicina max que está operativamente ligado a uma região codificadora que compreende uma se quência não nativa que codifica TIC807 (SEQ ID NO:6). A sequência de peptídeos da proteína TIC807 codificada por esse construto é fornecida como SEQ ID NO:5. Essa região codificadora está operativamente ligada a um sítio de poliadenilação 3' terminal de nopalina sintase (NOS). A sequência desse cassete de expressão 5'-e35S-Hsp17.9-TIC807-NOS-3' é fornecida como SEQ ID NO:43.

Exemplo 8: Construção de vetores de transformação mediada por Agrobacterium contendo cassetes de expressão de TIC807 e transferência para Agrobacterium

Para construir vetores de transformação mediada por Agrobacterium, os cassetes de expressão de TIC807 são clonados em vetores adequados entre as sequências de borda de Agrobacterium tal que eles possam ser transferidos para um genoma de uma célula de planta hospedeira pelos hospedeiros de Agrobacterium que contêm os vetores construídos junto com um gene marcador selecionável. Mais especificamente, o fragmento de restrição que contém o cassete de expressão 5'-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807NOS-3' completo (SEQ ID NO:42) é clonado em um vetor de transformação de planta de Agrobacterium. Similarmente, o fragmento de restrição que contém o cassete de expressão completo 5'-e35S-Hsp17.9-TIC807-NOS-3' (SEQ ID NO:43) é clonado em um vetor de transformação de planta de Agrobacteríum. Os vetores que contêm os cassetes de expressão (isto é, o cassete não direcionado de SEQ ID NO:43 e o cassete direcionado de SEQ ID NO:42) são introduzidos em Agrobacterium por eletroporação ou cruzamento tri-parental.

Exemplo 9: Transformação de algodão com vetores de transformação de TIC807 em Agrobacterium

O algodão pode ser transformado com vetores de transformação de TIC807 em Agrobacterium pMON105863 e pMON105864 ou seus equivalentes, usando um procedimento substancialmente similar ao procedimento descrito na Patente U.S. N² 5.159.135.

Para iniciar o processo de transformação e regeneração de plantas de algodão, é necessário primeiro esterilizar as sementes de algodão para prevenir a contaminação inadvertida da cultura resultante. As sementes são deixadas germinar sobre um meio apropriado para germinação contendo um fungicida.

Quatro a seis dias após a germinação, a porção do hipocótilo da planta imatura é removida e seccionada em pequenos segmentos medindo aproximadamente 0,5 centímetro por pedaço. Os explantes de hipocótilo são deixados estabilizar e permanecer viáveis em um líquido ou meio de cultura de tecido de planta com agar.

Uma vez que os segmentos de hipocotila tenham se estabilizado, eles podem ser prontamente inoculados com uma cultura em suspensão de Agrobacterium não oncogênica competente para transformação. Cepas de Agrobacterium tais como LBA4404 podem ser usadas. O processo de inoculação é deixado se desenvolver por três a cinco dias em temperaturas ambientes, isto é, 24 graus C.

No final do período de inoculação, é necessário primeiro remover o excesso de Agrobacterium. Depois, o restante dos tecidos tratados pode ser transferido para um segundo meio com agar, que também contém um ou mais antibióticos tóxicos para Agrobacterium, mas não para os tecidos do hipocótilo, em uma concentração suficiente para matar qualquer Agrobacterium remanescente na cultura. Antibióticos adequados para uso em tal meio incluem a carbenicilina e a cefotaxima. Os tecidos são deixados se recuperar do processo de transformação por um período entre um a dez dias e então são mantidos em cultura.

Os tecidos são cultivados agora sobre um meio de cultura de tecido que, além de seus componentes normais, contém um agente de seleção, o agente de seleção sendo um tóxico para células de algodão não transformadas mas não para células de algodão transformadas, que tiveram resistência genética incorporada para o agente de seleção e que estão expressando tal resistência. Um meio de cultura de tecido adequado é o meio MS ao qual é adicionado os fitormônios ácido (2-4,D) 2,4-diclorofenóxiacético,6-furfurilaminopurina e um agente gelificante. Agentes de seleção adequados incluem antibióticos e herbicidas. Características antibióticas a dequadas que podem servir como marcadores dominantes selecionáveis incluem o gene de aminoglicosídeo fosfotransferase-3'-ll (APH-(3')-ll), também referido como o gene de neomicina fosfotransferase II (NPTII), que codifica a resistência ao antibiótico canamicina, e o gene APH-(3')-IV que codifica a resistência à higromicina B. A canamicina, G418 e Higromicina B são aminoglicosídeos que param o crescimento de células de algodão não transformadas, mas esses antibióticos são fosforilados pela enzima apropriada se eles são expressos nas células transformadas. Outro agente de seleção adequado é o herbicida glifosato que pode ser usado para selecionar células de algodão transformadas que contêm o gene EPSPS resistente ao glifosato. Quando se usa pMON105863 e pMON105864, as células de planta transformadas são selecionadas quanto a resistência à canamicina ou outro antibiótico que está intimamente relacionado com a canamicina e que é inativado pelo gene de neomicina fosfotransferase II (NPTII) codificado por esses vetores. Meios tratados com antibiótico ou herbicida permitem apenas que células transformadas continuem a crescer e florescer. Assim, as células ou calos transformados são deixados crescer em meio seletivo. Os tecidos transformados sobreviventes são transferidos para um meio secundário para induzir embriogênese somática. O tecido transformado sobrevivente continuará assim a formar embriões somáticos, que podem então ser regenerados através da técnica de regeneração da presente invenção ou através de quaisquer outros protocolos alternativos de regeneração de planta que usem embriões somáticos de algodão como seu ponto de partida.

O processo de seleção deve continuar por um período de tempo prolongado, isto é, 3-4 meses, devido ao crescimento lento de tecidos transformados sobre o meio com antibiótico. Subculturas são feitas a cada 4-6 semanas para repor nutrientes e antibióticos. Como as células transformadas são selecionadas e amplificadas, linhagens celulares derivadas individualmente são identificáveis e podem ser removidas e separadamente amplificadas.

A técnica de regeneração de acordo com a presente invenção começa com o tecido que resulta do processo de transformação. Esses teci

100 dos são calos transformados putativamente que podem gerar embriões somáticos quando cultivados sobre um meio de indução de embrião apropriado. Uma técnica para regenerar esses embriões somáticos em plantas completas está descrita aqui, mas deve ficar entendido que outras técnicas também são possíveis, uma vez que tecidos embriogênicos transformados são produzidos.

A técnica de regeneração usada pelos requerentes começa então com os tecidos que resultam do processo de transformação. O tecido dos calos de algodão, gerados a partir dos segmentos de hipocótilo das plantas de algodão, e putativamente transformados, são colocados sobre o meio de indução de embrião somático diretamente. Nesse ponto, o agente de seleção antibiótica deve ser removido do meio de cultura, mas por outro lado, o meio deve permanecer constante. Esses calos, cultivados sobre o meio de indução de embrião somático, formarão pequenas estruturas embrionárias que foram denominadas embriões somáticos. Pode levar dois ou três meses para que os embriões somáticos emerjam e amadureçam. Aproximadamente 5 até 20 embriões somáticos emergirão de um único calo em uma formulação de ágar de um meio de indução de embrião somático. Muitos dos embriões somáticos assim produzidos se regenerarão em plantas completas com a técnica aqui descrita.

Quando o desenvolvimento dos embriões somáticos é grande o suficiente, isto é, um tamanho de 4 mm ou mais de comprimento, e se eles parecem ter um bom desenvolvimento embrionário, isto é, geralmente possuindo um cotilédone e uma radícula, eles podem ser transferidos para tubos de ensaio maiores e plantados sobre vermiculita fina. A vermiculita é saturada com o meio de Stewart e Hsu (SH) (Planta 137:113 (1997)) mais os fitormônios ácido indol acético, 6-furfurilaminopurina e ácido giberélico. Pequenas plântulas, tendo duas a três folhas, eventualmente se desenvolverão.

Uma vez que o crescimento da plântula está estabelecido, isto é, no estágio de 2-3 folhas, as plantas podem agora ser removidas para vasos de planta com terra de vermiculita. Elas podem ser molhadas e fertilizadas como necessário. Elas também podem ser fortalecidas antes da exposição à

101 estufa. As plantas podem ser replantadas quando elas tiverem 4 a 6 folhas, após o que elas continuarão a crescer até a maturidade. Amostras das plântulas podem ser ensaiadas para a expressão de TIC807 para identificar plantas transgênicas com atividade inibitória de inseto.

Exemplo 11: Teste in planta de TIC807 em tecido de calo

Esse exemplo ilustra um exemplo não limitante de expressão in planta de TIC807 para bioensaio contra Lygus e outros insetos-praga que picam e/ou sugam os fluidos das células e tecidos de planta.

Células de algodão são transformadas com construtos que contêm genes de interesse que codificam a proteína TIC807. Nesse caso, sequências de ácido nucleico ricas em A+T não nativas que codificam uma proteína TIC807 são expressas em células de algodão usando os cassetes de expressão de TIC807 nos vetores de transformação de TIC807 descritos nos exemplos precedentes. Esses cassetes de expressão fornecem a expressão direcionada de TIC807 para o cloroplasto (isto é, com os cassetes de expressão 5'-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807-NOS-3' ou 5’-e35S-CTP2TIC807-NOS-3') ou a expressão não direcionada (citoplasmática) de TIC807 (isto é, com os cassetes de expressão 5'-e35S-Hsp17.9- TIC807-NOS-3' ou 5'-e35S-TIC807-NOS-3'). Os vetores de transformação fornecem um marcador selecionável, nesse caso para a seleção de resistência à canamicina em tecido de planta transformado. Tanto o vetor pMON105863 quanto outros vetores equivalentes para a expressão de TIC807 em planta que contenham os cassetes de expressão de TIC807 em planta e um marcador selecionável podem ser usados. O tecido do calo é deixado se desenvolver em cultura de tecido após a transformação e seleção em uma placa de Petri. As ninfas de Lygus são então colocadas em uma placa de Petri ou em poços de uma placa de microtitulação contendo o calo que é transformado com um cassete de expressão em planta de TIC807. As ninfas de Lygus são também colocadas em uma placa de Petri ou em poços de uma placa de microtitulação contendo o calo de controle que não foi transformado com um cassete de expressão em planta de TIC807. A tampa segura da placa de Petri ou dos poços da placa de microtitulação previnem a fuga das ninfas de Lygus. Qualquer ma

102 terial que previna a fuga de Lygus, mas que permita a troca gasosa na placa de Petri, por exemplo, Parafilm® pode ser usado para segura a tampa da placa de Petri ou do poço da placa de microtitulação. Um percentual de ninfas de Lygus encontrará o tecido do calo e se alimentará. Os escores de mortalidade e subdesenvolvimento são então calculados levando em consideração as mortes subjacentes que ocorrerão com aqueles insetos que falharam em se alimentar sobre o tecido do calo para se obter um escore ajustado. Os escores ajustados para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido transformado com TIC807 são comparados com os escores ajustados para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido de controle. Os escores de mortalidade e/ou subdesenvolvimento para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido transformado com TIC807 estão significativamente aumentados em relação aos escores para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido de controle.

Exemplo 12: Teste in planta de TIC807 em tecido de folha

Células de alfafa, algodão, canola, soja ou alface são transformadas usando os cassetes de expressão de TIC807 nos vetores de transformação de TIC807 descritos nos exemplos precedentes. Esses cassetes de expressão fornecem a expressão direcionada de TIC807 para o cloroplasto (isto é, com os cassetes de expressão 5'-e35S-Hsp17.9-CTP2TIC807-NOS-3' ou 5'-e35S-CTP2-TIC807-NOS-3') ou a expressão não direcionada (citoplasmática) de TIC807 (isto é, com os cassetes de expressão 5'-e35S-Hsp17.9- TIC807-NOS-3' ou 5'-e35S-TIC807-NOS-3'). Os vetores de transformação fornecem um marcador selecionável, nesse caso para a seleção de resistência à canamicina em tecido de planta transformado. As células transformadas são selecionadas quanto a resistência a canamicina e regeneradas em plantas transgênicas. Insetos-praga tais como ninfas de Lygus são deixados se alimentar quando a planta alcançou um nível de maturidade suficiente, tal como quando as folhas cresceram até um tamanho que permita o uso de uma barreira física para evitar a fuga de Lygus. A barreira para prevenir a fuga das ninfas de Lygus pode ser qualquer dispositivo comercialmente disponível ou feito em casa, que permita o contato das nin

103 fas de Lygus com o tecido da folha e que permita ao inseto sondar e se alimentar do tecido vascular da folha. As gaiolas com clipe similares àquelas descritas por Mowry (1993) (J. Agric. Entomol. 10:181-184) podem ser suficientes para conter as ninfas de Lygus para alimentação. As ninfas de Lygus são então apresentadas ao tecido da folha tanto de plantas transgênicas que expressam a proteína TIC807, quanto ao tecido da folha de controle que não expressa a proteína TIC807. O tecido da folha de controle é fornecido de modo ideal por uma planta transgênica que foi selecionada e regenerada em paralelo, mas que não contém um transgene que codifique TIC. Entretanto, o tecido da folha de outras plantas de origem e idade similares também pode ser usado desde que o tecido não contenha quantidades significativas de proteína TIC807. Os escores de mortalidade e subdesenvolvimento são então determinados com referência à mortalidade precedente que ocorrerá com aqueles insetos que falham em se alimentar do tecido da folha para obter um escore ajustado. Os escores ajustados para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido da folha transformado com TIC807 são comparados com os escores ajustados para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido da folha de controle. Os escores de mortalidade e/ou de subdesenvolvimento das ninfas de Lygus apresentadas ao tecido da folha transformado com TIC807 estão significativamente aumentados em relação aos escores das ninfas de Lygus apresentadas ao tecido da folha de controle.

Exemplo 13: Controle de inseto usando TIC807 em combinação com outros agentes de controle de inseto

Tendo obtido plantas de algodão transgênicas que expressam a proteína TIC807 citoplasmática ou dirigida, também é desejável obter plantas de algodão que expressam outras proteínas inibitórias de inseto em combinação com TIC807. Esse exemplo ilustra vários métodos pelos quais a resistência aumentada para um inseto-praga específico ou a resistência ampliada para verias classes de insetos-praga pode ser obtida para fornecer uma proteção maior contra insetos para uma cultura de planta. Todas as estratégias descritas abaixo podem ser usadas também para intensificar um programa de manuseio de resistência a inseto.

104

I) Combinação de TIC807 com Moléculas de dsRNAi Inibitórias de Inseto em Plantas

A supressão de gene mediada por RNA de fita dupla de uma função biológica dentro de insetos-alvo pode ser combinada com genes que codificam uma proteína TIC807. Genes de inseto que desempenham funções biológicas importantes que podem ser atingidas pelo dsRNAi estão descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. N² 2006/0021087.

Tais moléculas de dsRNAi podem ser orientadas para inibir Lygus, que é o mesmo inseto-alvo que é inibido por TIC807. Por inibir simultaneamente Lygus com uma molécula de dsRNAi e TIC807, a inibição é atingida através de dois modos distintos de ação. A inibição pelos modos de ação distintos é esperada resultar no manuseio aperfeiçoado de resistência o ir*kCoF/*t Doro πληΙγλΙλ Jac> /*Ι<^ΟΜΛΐ « liiociu. i <3i<3 υνιιυυισ νισ L_yCycJO, 11 ivi^lzUiaS UC UORINAI ÔCÍU UCI IVClUCld UC qualquer uma das SEQ ID NO:4 até a SEQ ID NO:39, que corresponde aos genes expressos em Lygus. O uso da SEQ ID NO:24 até a SEQ ID NO:39 no controle de insetos está descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S. N² 20060021087. As moléculas de dsRNAi dirigidas contra qualquer uma das SEQ ID NO:24 até a SEQ ID NO:39 são expressas em plantas transgênicas de algodão com vetores de transformação mediada por Agrobacterium designados para a expressão de moléculas de dsRNAi. A expressão de moléculas de dsRNAi é obtida pela recuperação de plantas transgênicas que compreendem um promotor ativo naquelas plantas, que está operativamente ligado a fragmentos das sequências de Lygus (isto é, SEQ ID NO:24 até a SEQ ID NO:39) com pelo menos 19-24 nucleotídeos de extensão e os complementos reversos daquelas sequências.

Tais moléculas de dsRNAi também podem ser direcionadas para outros insetos picadores sugadores tais como afídeos, gafanhotos ou moscas brancas. Para o controle de afídeos, as moléculas de dsRNAi derivadas ou homólogas a sequências de Toxoptera citricida ou Acyrthosiphon pisum, da Publicação de Pedido de Patente U.S. N² 20060021087, são expressas em plantas transgênicas com vetores de transformação mediada por Agrobacteríum designados para a expressão de moléculas de dsRNAi. Para o

105 controle de gafanhotos, as moléculas de dsRNAi derivadas ou homólogas a sequências de Homalodisca coagulate, da Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 20060021087, são expressas em plantas transgênicas com vetores de transformação mediada por Agrobacterium designados para a expressão de moléculas de dsRNAi. Para o controle de moscas brancas, as moléculas de dsRNAi adequadas podem ser expressas em plantas transgênicas com vetores de transformação mediada por Agrobacterium designados para a expressão de moléculas de dsRNAi. A expressão de moléculas de dsRNAi é obtida pela recuperação de plantas transgênicas que compreendem um promotor ativo naquelas plantas, que está operativamente ligado a fragmentos das respectivas sequências de afídeo, gafanhoto ou mosca branca com pelo menos 19-24 nucleotídeos de extensão e os complementos reversos daquelas sequências.

Tais moléculas de dsRNAi também podem ser dirigidas contra pragas coleópteras. Nesse caso, a expressão da molécula de dsRNAi em conjunto com TIC807 fornece o controle de ambas as pragas de coleóptero e pragas de díptero em uma planta transgênica. Para o controle do bicudo do algodoeiro, Anthonomus grandis Boheman, as moléculas de dsRNAi derivadas de uma sequência ortóloga de V-ATPase A descrita na Publicação de Pedido de Patente U.S. N^Q 20060021087, são expressas em plantas transgênicas com vetores de transformação mediada por Agrobacterium designados para a expressão de moléculas de dsRNAi. A expressão de moléculas de dsRNAi é obtida pela recuperação de plantas transgênicas de algodão, que compreendem um promotor ativo naquelas plantas, que está operativamente ligado a fragmentos das sequências de V-ATPase A de bicudo do algodoeiro com pelo menos 19-24 nucleotídeos de extensão e os complementos reversos daquelas sequências.

Tais moléculas de dsRNAi também podem ser dirigidas contra pragas de lepidópteros. Nesse caso, a expressão da molécula de dsRNAi em conjunto com TIC807 fornece o controle de ambas as pragas de lepidóptero e pragas de díptero em uma planta transgênica. Para o controle da lagarta de cartucho, as moléculas de dsRNAi derivadas de uma sequência

106 expressa no intestino médio da lagarta de cartucho (isto é, sequências de Helicoverpa armigera da Publicação de Pedido de Patente U.S. N²20060021087) são expressas em plantas transgênicas com vetores de transformação mediada por Agrobacterium designados para a expressão de moléculas de dsRNAi. A expressão de moléculas de dsRNAi é obtida pela recuperação de plantas transgênicas que compreendem um promotor ativo naquelas plantas, que está operativamente ligado a fragmentos da sequência de lagarta de cartucho com pelo menos 19-24 nucleotídeos de extensão e os complementos reversos daquelas sequências.

II) Combinação de TIC807 com Outras Proteínas Inibitórias de Inseto Diferentes de TIC807 em Plantas

Para o controle de insetos picadores sugadores tais como afídeos, gafanhotos, Lygus ou moscas brancas, várias moléculas de toxinas podem ser combinadas com a expressão de TIC807 in planta para maior controle. Tais moléculas expressas in planta com TIC807 podem incluir: i) ET29, ET37 ou TIC809 e TIC810, TIC812, TIC127 ou TIC128 (PCT US 2006/033867; Patente U.S. N² 6.093.695); ii) AXMI-027, AXMI-036, e/ou AXMI-038 (WO 06/107761); iii) AXMI-018, AXMI-020, e/ou AXMI-021 (WO 06/083891); iv) AXMI-010 (WO 05/038032); v) AXMI-003 (WO 05/021585) vi) AXMI-008 (US 2004/0250311); vii) AXMI-006 (US 2004/0216186) viii) AXMI007 (US 2004/0210965); ix) AXMI-009 (US 2004/0210964); x) AXMI-014 (US 2004/0197917); xi) AXMI-004 (US 2004/0197916); xii) AXMI-028 e/ou AXMI029 (WO 06/119457) e xiii) AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-OO9, AXMI-014 e AXMI-004 (WO 04/074462). A combinação de moléculas de proteína tóxica TIC809 (apresentada como SEQ ID NO:10) e TIC810 (apresentada como SEQ ID NO: 12) mostrou, anteriormente, ser inibitória do besouro castanho do oeste (WTPB) e de Lygus hesperus Knight em bioensaio (PCT US 2006/033867). As proteínas de fusão de TIC809 e TIC810, TIC127 (apresentada como SEQ ID NO:14) e TIC128 (apresentada como SEQ ID NO: 16) também podem ser ativas contra Lygus. O polinucleotídeo que codifica TIC127 é compreendido pela molécula de ácido nucleico que codifica TIC809 ligada a uma molécula que codifica TIC810 por uma sequência poli

107 ligante de nucleotídeos (apresentada como SEQ ID NO:17) que codifica o ligante de aminoácido apresentado como SEQ ID NO:18. O polinucleotídeo que codifica TIC128 é compreendido pela molécula de ácido nucleico que codifica TIC810 ligada a molécula de ácido nucleico que codifica TIC809 por uma sequência poliligante de nucleotídeos (apresentada como SEQ ID NO:17) que codifica o ligante de aminoácido apresentado como SEQ ID NO: 18. A expressão de TIC807 em combinação com TIC127 ou TIC128 pode fornecer um controle intensificado de Lygus. As plantas dicotiledôneas tais como o algodão, podem ser transformadas com os construtos de expressão em plantas contendo as sequências de nucleotídeos otimizadas para dicotiledôneas que codificam TIC807 (apresentada como SEQ ID NO:6) junto com TIC809 (apresentada como SEQ ID NO:9) e TIC810 (apresentada como SEQ ID NO: 10) ou TIC127 (apresentada como SEQ ID NO: 13) ou TIC128 (apresentada como SEQ ID NO: 15) para fornecer resistência intensificada a Lygus ou ampliar a especificidade para as espécies contidas dentro do gênero Lygus. A expressão ótima das moléculas de toxina pode requerer a expressão direcionada tal como para os cloroplastos das células. Isso pode ser obtido pela adição de uma molécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo de transito, bem conhecido na técnica por dirigir a proteína traduzida para o cloroplasto da célula, na extremidade 5' da molécula de ácido nucleico que codifica as toxinas.

As sequências de DNA que codificam os cassetes de expressão de TIC807 podem ser combinadas com uma ou ambas as sequências de DNA que codificam o RNA de fita dupla inibitório de inseto e/ou as moléculas de proteína inibitória de inseto diferentes de TIC807. Essas moléculas de DNA podem ser combinadas tanto através de transformação direta quanto de cruzamento ou uma combinação desses, para produzir uma elite ou linhagens de plantas híbridas que demonstram resistência intensificada para Lygus.

A combinação de uma proteína ou de proteínas inseticidas com um ou mais RNA de fita dupla, todas independentemente ativas contra uma praga hemíptera tal como Lygus, é preferida já que ela fornece dois modos

108 de ação diferentes (manuseio de resistência) e resulta em efeitos sinérgicos inesperados que não são observados nem com a proteína inseticida sozinha, nem com o RNA de fita dupla sozinho ou com combinações de duas proteínas inseticidas diferentes, ambas ativas contra pragas hemípteras ou com combinações de dsRNAs, ambos ativos contra pragas hemípteras. Além disso, o espectro de resistência da planta cultivada pode ser ampliado para conter resistência para classes adicionais de insetos-praga tais como pragas de coleópteros, lepidópteros ou dípteros além de uma praga hemíptera tal como Lygus usando a expressão de proteínas tóxicas para inseto e as moléculas de RNA de fita dupla dentro da planta.

Para o controle de pragas de lepidóptero e pragas de hemípteros em uma planta transgênica, as plantas que expressam ambas, a proteína TIC807 e uma ou mais proteínas ativas contra pragas de lepidópteros, podem ser obtidas. Métodos de obtenção de plantas transgênicas em que são expressas proteínas ativas contra lepidópteros tais como as proteínas Cry1A (Patente U.S. N² 5880275), Cry1B (Pedido de Patente U.S. N²10/525318), Cry1C (Patente U.S. N² 6033874), Cry1F, quimeras Cry1A/F (Patente U.S. N² 7070982, 6962705, e 6713063), e uma proteína Cry2Ab (Patente U.S. N² 7064249) são bem caracterizadas. As plantas que expressam uma proteína TIC807 e uma proteína ativa contra Lepidóptero podem ser obtidas pela realização de cruzamentos de plantas transgênicas individuais que expressam TIC807 ou as proteínas para lepidópteros. Alternativamente, vetores de transformação de planta que fornecem a expressão de TIC807 ou de uma ou mais proteínas ativas contra lepidópteros podem ser usados para transformar plantas.

Exemplo 14: Toxicidade de preparações de cristal de esporo purificado de TIC807 para Lygus hesperus

A toxicidade de TIC807 para Lygus hesperus também foi testada usando uma preparação de cristal de esporo. Os cristais parasporais contendo a proteína TIC807 foram parcialmente purificados pelo gradiente de centrifugação com sucrose. Uma preparação de esporo-cristal 10X concentrada da proteína TIC807 foi tratada com Benzonase® (Novagen;10 U/ml de

109 amostra) para reduzir a viscosidade da amostra. A amostra tratada foi deixada repousar por uma noite a 4°C. Os gradientes de sucrose nos tubos Ultraclear® ou Polyclear®, adequados para um rotor SW28 foram preparados; etapas de 10 ml de sacarose a 79%, 70% e 55% em Tris-HCI 10 mM, EDTA 0,1 mM, Triton X-100 0,005% (pH 7). Aproximadamente 6-7 ml de amostra foram carregados por gradiente (tubos preenchidos até 1/4 de polegada do topo). Os gradientes foram corridos a 18K durante a noite (16-18 h) em um rotor SW28 a 4°C. Os cristais foram retirados da interface de 55-70% ou da interface de 70-79%. Os cristais foram diluídos em pelo menos 5 vezes em tampão de gradiente e peletizados por centrifugação (por exemplo, 8K por 20 min a 4°C). Os péletes de cristal foram re-suspensos em tampão e examinados sob um microscópio de contraste de fase para avaliar a contaminação por esporo. Os cristais purificados foram subsequentemente tratados com CAPS-NaOH 50 mM (pH 11) e incubados a 37°C até a suspensão clarear. A proteína solubilizada foi dialisada contra carbonato de sódio 25 mM, NaCI 10 mM (pH 8.0), carregada em uma coluna de Q-Sefarose equilibrada com o mesmo tampão e eluída usando um gradiente linear de NaCI 10 mM500 mM. A proteína eluída foi dialisada contra carbonato de sódio 25 mM (pH 8.5). A proteína foi considerada estar altamente purificada pela análise SDS-PAGE. Essa preparação de proteína TIC807 foi observada causar mortalidade significativa e subdesenvolvimento (redução de massa) de ninfas de Lygus hesperus no ensaio de alimentação quando comparada com o controle não tratado e é apresentada nas Tabelas 9 e 10 abaixo.

Tabela 9: Escores de subdesenvolvimento de TIC807 para o percevejo castanho do oeste (WTPB), Lygus hesperus (retirar sublinhado)

Tratamento	concentração (mg/ml)	N	Subdesenvolvimento médio	Desvio padrão	P>\|t\|
UTC	0	8	0	0
TIC807	0,05	5	2,0	0	<0,0001

110

Tabela 10: Escores de percentual de mortalidade de TIC807 para o percevejo castanho do oeste (WTPB), Lygus hesperus

Tratamento	concentração (mg/ml)	N	% médio de mortalidade	Desvio padrão	P>\|t\|
UTC	0	8	0	0
TIC807	0,05	5	39,0	16,7	0,0003

Resultados similares foram obtidos nos ensaios de alimentação com Lygus lineolaris.

Exemplo 15: Síntese de genes adicionais que codificam uma proteína TIC807 que são designadas para expressão em plantas

Sequências de nucleotídeos adicionais que codificam uma proteína TIC807 foram planejadas e sintetizadas. Essas regiões codificadoras não nativas planejadas para expressão em planta são fornecidas aqui como SEQ ID NO:44 até SEQ ID NO:53. As sequências codificadoras apresentadas como SEQ ID NO:44 até SEQ ID NO:53 são caracterizadas por um conteúdo de A+T menor do que da região codificadora de TIC807 nativa que era derivada de Bacillus thuringiensis, eliminando regiões do gene nativo de TIC807 que são ricas em A+T e substituindo essas por sequências que têm poucos resíduos A+T. A SEQ ID NO:44 é a região codificadora de TIC807 nativa com o códon de partida de Metionina inicial substituído a partir do códon de partida bacteriano de TTG pelo códon de partida de planta ATG.

Exemplo 16: Cassetes de expressão adicionais para expressão de uma proteína TIC807 em células de planta transgênica ou plantas transgênicas

Um sétimo cassete de expressão direcionado para o plastídeo compreende um promotor CaMV35S intensificado que está operativamente ligado a uma sequência 5' não traduzida derivada do gene Hsp17.9 de Glicina max que está operativamente ligado a uma região codificadora que compreende uma sequência que codifica o peptídeo do cloroplasto de Arabidopsis shkG N-terminal (isto é, CTP2) fundida em fase com uma sequência codificadora de TIC807 não nativa (SEQ ID NO:6). A sequência de peptídeo da proteína de fusão CTP2-TIC807 codificada por esse construto é fornecida como SEQ ID NO:8. Essa região codificadora está operativamente ligada a

111 um sítio de poliadenilação 3' terminal de CaMV35S (T-35S). A sequência desse cassete de expressão direcionado 5'-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807-T35S-3' é fornecida como SEQ ID NO:54.

Um oitavo cassete de expressão compreende um promotor CaMV35S intensificado que está operativamente ligado a uma sequência 5' não traduzida derivada do gene Hsp17.9 de Glicina max que está operativamente ligado a uma região codificadora que compreende uma sequência codificadora de TIC807 não nativa (SEQ ID NO:6). A sequência de peptídeo da proteína TIC807 codificada por esse construto é fornecida como SEQ ID NO:5. Essa região codificadora está operativamente ligada a um sítio de poliadenilação 3' terminal de CaMV35S. A sequência desse cassete de expressão 5'-e35S-Hsp17.9-TIC807-T-35S-3' é fornecida como SEQ ID NO:55.

Um nono cassete de expressão direcionado para o plastídeo compreende o promotor Sugarcane Badnavirus (ScBV) (Patente U.S. 5.994.123) que está operativamente ligado a uma região codificadora que compreende uma sequência que codifica o peptídeo do cloroplasto de Arabidopsis shkG N-terminal (isto é CTP2) fundida em fase com uma sequência codificadora de TIC807 não nativa (SEQ ID NO:6). A sequência de peptídeo da proteína de fusão CTP2-TIC807 codificada por esse construto é fornecida como SEQ ID NO:8. Essa região codificadora está operativamente ligada a um sítio de poliadenilação 3' terminal de CaMV35S (T-35S). A sequência desse cassete de expressão direcionado 5'-P-ScBV-Hsp17.9-CTP2-TIC807T-35S-3' é fornecida como SEQ ID NO:56.

Um décimo cassete de expressão compreende um promotor Sugarcane Badnavirus (ScBV) que está operativamente ligado a uma sequência 5' não traduzida derivada do gene Hsp17.9 de Glicina max que está operativamente ligado a uma região codificadora que compreende uma sequência codificadora de TIC807 não nativa (SEQ ID NO:6). A sequência de peptídeo da proteína TIC807 codificada por esse construto é fornecida como SEQ ID NO:5. Essa região codificadora está operativamente ligada a um sítio de poliadenilação 3' terminal de CaMV35S. A sequência desse cassete de expressão 5'-P-ScBV-Hsp17.9-TIC807-T-35S-3' é fornecida como SEQ ID

112

NO:57.

Exemplo 17: Construção de vetores de transformação mediada por Agrobacterium adicionais contendo cassetes de expressão de TIC807 e transferência para Agrobacterium

Para construir vetores de transformação mediada por Agrobacterium, os cassetes de expressão de TIC807 são clonados em vetores adequados entre as sequências de borda de Agrobacterium, tal que eles possam ser transferidos para o genoma de uma célula hospedeira de planta pelas Agrobacterium hospedeiras que contêm os vetores construídos junto com um gene marcador selecionável. Mais especificamente, o fragmento de restrição que contém o cassete de expressão 5'-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807T-35S-3' (SEQ ID NO:54) completo é clonado em um vetor de transformação de planta mediada por Agrobacterium para obter pMON105863 (Figura 2). Similarmente, o fragmento de restrição que contém o cassete de expressão 5'-e35S-Hsp17.9-TIC807-T-35S-3' (SEQ ID NO:55) completo é clonado em um vetor de transformação de planta mediada por Agrobacterium para obter pMON105864 (Figura 3). Para expressão usando um promotor diferente, o fragmento de restrição que contém o cassete de expressão 5'-P-ScBVHsp17.9-CTP2-TIC807-T-35S-3' (SEQ ID NO:56) completo é clonado em um vetor de transformação de planta mediada por Agrobacterium para obter pMON78892 (Figura 4). Similarmente, o fragmento de restrição que contém o cassete de expressão 5'-P-ScBV-Hsp17.9-TIC807-T-35S-3' (SEQ ID NO:57) completo é clonado em um vetor de transformação de planta mediada por Agrobacterium para obter pMON78893 (Figura 5). Os vetores contendo os cassetes de expressão de TIC807 (isto é, o cassete não direcionado de SEQ ID NO:55 e SEQ ID NO:57 e o cassete direcionado de SEQ ID NO:54 e SEQ ID NO:56) são introduzidos na Agrobacterium por eletroporação ou cruzamento triparental.

Os vetores binários de transformação de planta contêm um marcador selecionável (indicado como Marcador Selecionável nas figuras 2 a

5) para a seleção de células de planta transformadas usando o antibiótico canamicina. A seleção com antibiótico usando espectinomicina é usado para

113 seleção bacteriana. Isso é indicado como SPC/STR nas figuras de 2 a 5, que é compreendido de um promotor para Tn7 adeniltransferase, a região codificadora para um gene que codifica 3(9)-0-aminoglicosídeo adeniltransferase (AAD) derivada de Staphylococcus aureus e a região de terminação da transcrição de Tn7 adeniltransferase que confere resistência a espectinomicina e estreptomicina. Duas origens de replicação bacteriana estão incluídas em cada plasmídeo, uma origem de replicação para a replicação de Agrobacterium tumefasciens (indicada como Ec.oriV-RK2 nas figuras 2 a 5) e uma origem para replicação em Escherichia coli (indicada como Ori-322 nas figuras 2 a 5). Uma região codificadora de Escherichia coli que codifica um iniciador repressor usado em conjunto com a origem de replicação de E. coli está indicada como Ec.rop nas figuras 2 a 5. As bordas esquerda e direita usadas para a integração estável do T-DNA no genoma da planta são indicadas como LB e RB, respectivamente, nas figuras 2 a 5. A Figura 5 também mostra um cassete de expressão adicional usado, no qual a proteína tóxica TIC128 (PCT US 2006/033867) é expressa e está assinalado Cassete de Expressão de TIC128 na Figura 5.

Exemplo 18: Teste in planta adicional de TIC807 em Tecido de Calo

Esse exemplo ilustra exemplos não limitantes de uma expressão in planta de TIC807 para bioensaio contra Lygus e outros insetos-praga que picam e/ou sugam os fluidos das células e tecidos de plantas.

Células de alfafa, algodão, canola, soja ou milho são transformadas usando os cassetes de expressão de TIC807 nos vetores de transformação de TIC807 descritos nos exemplos precedentes. Esses cassetes de expressão fornecem o direcionamento de TIC807 para o cloroplasto (isto é, cassetes de expressão 5’-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807-T-35S-3’ ou 5’-PScBV-Hsd17.9-CTP2-TIC807-T-35S-3’1 ou a expressão não direcionada (citoplasmática) de TIC807 (isto é, com os cassetes de expressão 5’-e35SHsd1 7.9-TIC807-T-35S-3’ ou 5’-P-ScBV-Hsd17.9-TIC807-T-35S-3). Os vetores de transformação fornecem um marcador selecionável, nesse caso para a seleção de resistência a canamicina no tecido de planta transformado. As células transformadas são selecionadas para a resistência à canamicina e

114 regeneradas em plantas transgênicas. Pragas de insetos tais como ninfas de Lygus são então deixadas se alimentar quando a planta tiver alcançado um nível de maturidade suficiente, tal como quando as folhas cresceram até um tamanho que permite o uso de uma barreira física para prevenir a fuga de Lygus. A barreira para prevenir a fuga das ninfas de Lygus pode ser qualquer dispositivo comercialmente disponível ou feito em casa que permita o contato das ninfas de Lygus com o tecido da folha e que permita ao inseto sondar e se alimentar do tecido vascular da folha. As gaiolas com clipe similares àquelas descritas por Mowry (1993) (J. Agric. Entomol. 10:181-184) podem ser suficientes para conter as ninfas de Lygus para alimentação. As ninfas de Lygus são então apresentadas ao tecido da folha tanto das plantas transgênicas que expressam a proteína TIC807 quanto ao tecido da folha de controle que não expressa a proteína TIC807. O tecido da folha de controle é fornecido de modo ideal por uma planta transgênica que foi selecionada e regenerada em paralelo, mas que não contém um transgene que codifique TIC. Entretanto, o tecido da folha de outras plantas de origem e idade similares também pode ser usado desde que o tecido não contenha quantidades significativas de proteína TIC807. Os escores de mortalidade e subdesenvolvimento são então calculados levando em consideração as mortes subjacentes que ocorrerão com aqueles insetos que falharam em se alimentar sobre o tecido do calo para se obter um escore ajustado. Os escores ajustados para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido de folha transformado com TIC807 são comparados com os escores ajustados para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido de folha de controle. Os escores de mortalidade e/ou subdesenvolvimento para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido de folha transformado com TIC807 estão significativamente aumentados em relação aos escores para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido de folha de controle.

Exemplo 19: Teste in planta de TIC807 em Tecido de Folha de Alface

As folhas de alface são transformadas usando os cassetes de expressão de TIC807 nos vetores de expressão de TIC807 descritos nos exemplos precedentes. Esses cassetes de expressão fornecem o direcio

115 namento de TIC807 para o cloroplasto (isto é, cassetes de expressão 5’e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807-T-35S-3’ ou 5’-P-ScBV-Hsp17.9-CTP2TIC807-T-35S-3’) ou a expressão não direcionada (citoplasmática) de TIC807 (isto é, com os cassetes de expressão 5’-e35S-Hsp17.9-TIC807-T35S-3’ ou 5’-P-ScBV-Hsp17.9-TIC807-T-35S-3). Os vetores de transformação fornecem um marcador selecionável, nesse caso para a seleção de resistência à canamicina no tecido de planta transformado. As células transformadas são selecionadas para a resistência à canamicina e regeneradas em plantas transgênicas.

Sementes de alface são esterilizadas na superfície por 20 minutos em solução de hipoclorito de sódio 1,2% seguida por 3 lavagens em água esterilizada deionizada. As sementes são deixadas secar durante a noite sobre uma placa de Petri em uma capela de fluxo laminar. As sementes são então plaqueadas sobre 100 ml de 0,5 X sais de Hoagland (veja Tabela 11 abaixo) em phytatrays (Sigma, St. Louis, MO, N² de Catálogo P1552) em uma densidade de 60 sementes/bandeja. As sementes são cultivadas sob luminosidade a 22-23 graus Celsius por 4 a 5 dias com 16 horas de fotoperíodo. Agrobactérias transformadas com o vetor de transformação de planta de interesse são preparadas pela inoculação de 10 ml de meio líquido Manitol-Glutamato/Luria com 100 microlitros de suspensão bacteriana. O meio é compreendido pelos seguintes ingredientes:

Meio LB, Miller(Difco#044-017-3) 12,5 g

Manitol 5,0g

Glutamatomonossódico(ácido glutâmico) 1,16 g

KH2PO4 0,25 g

MgSO47H2O 0,10 g

Biotina 0,001 g

Volume total 1000 ml pH para 7.0 e autoclave

A cultura líquida é incubada em um agitador giratório a 28 graus Celsius por 24 horas. Cinco mililitros das primeiras culturas noturnas são diluídos com 15 mililitros de meio Triptona Extrato de Levedura suplementa116 do com 40 mg/ml de Acetosiringona (5 gramas de triptona, 3 gramas de extrato de levedura e 20 ml de acetosiringona 2mg/ml em um volume total de 1000 ml, pH 5.5 e autoclavagem). Isso é deixado incubar em um agitador giratório a 28 graus Celsius por 24 horas no escuro com 50 mg/l de canamicina e 100 mg/l de espectinomicina. Um ml da cultura noturna é adicionado a 19 mililitros de meio Triptona Extrato de Levedura e a densidade óptica com comprimento de onda de 600 nm da cultura é ajustada para 0,08 a 0,09.

Cotilédones de mudas de alface são cortados tanto na base como no topo e imersos em meio diluído com Agrobacterium por 15 minutos. Os cotilédones são então plaqueados em meio MSO-C sem corante e mantidos a 22-23 graus Celsius com um fotoperíodo de 16 horas. As placas são lacradas com fita micropore. Após 48 horas, os cotilédones são transferidos para meio MSO-I em placas de Petri com 100 mm x 25 mm. Os explantes são subsequentemente subcultivados por 7 a 14 dias em meio MSO-I. Conforme as mudas se desenvolvem elas são cortadas e transferidas para o meio MSO-SE. As mudas são transferidas após o alongamento para phytatrays contendo 100 ml de meio MSO-SE. Após 6 a 8 semanas, ao mudas em desenvolvimento são transferidas para caixas Magenta contendo 100 ml de meio MSO-R. Em 7 a 14 dias de incubação a 23 graus Celsius, as raízes começarão a se desenvolver. As mudas são transferidas para vasos de 7,62 cm(3 polegadas) contendo solo e deixadas se desenvolver. A composição dos meios MSO está mostrada na tabela 11.

Tabela 11: Componentes do meio MSO

Ingredientes	0,5 X sal de Hoagland	MSO-C	MSO-I	MSO-SE	MSO-R
Sais de MSO (sais mínimos)		34,6 g	34,6 g	34,6 g	34,6 g
Sal de Hoagland	0,8 g
Ácido naftalenoacético (1 mg/ml)		0,1 ml	0,1 ml	0,05 ml
Benzil adenina (1 mg/ml)		0,1 ml	0,1 ml	0,01 ml
Acetosiringona (2 mg/ml)		20 ml

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Ingredientes	0,5 X sal de Hoagland	MSO-C	MSO-I	MSO-SE	MSO-R
Canamicina (50 mg/ml)			2 ml	2 ml	2 ml
Carbenicilina (250 mg/ml)			2 ml	2 ml	2 ml
Ágar para tecido de cultura	7,5 g	7,5 g	7,5 g	8g	8g
Volume total	1000 ml	1000ml	1000ml	1000 ml	1000 ml
PH		5,7	5,7	5,7	5,7

As plantas transgênicas são auto-fertilizadas e deixadas desenvolver semente ou são usadas diretamente para o teste. As folhas das plantas de alface transformadas são usadas em um sistema de cultura para teste contra Lygus. Dez mililitros de meio de crescimento estéril de planta (Murashige & Skoog, Gamborg, vitaminas B5, sacarose 3% e ágar 1,5%) são adicionados ainda em estado líquido a tubos cônicos de polipropileno de 50 mililitros. O meio é deixado esfriar e mantido sob condições estéreis. Uma vez ajustado, uma divisão circular estéril de espuma, aproximadamente com o diâmetro do tubo, contendo um pequeno orifício no meio, é colocada sobre o meio de crescimento da planta. Folhas jovens de alface são cortadas com uma navalha estéril e lavadas em água esterilizada deionizada, deixando uma porção do pecíolo acoplado à folha. O pecíolo da folha de alface cortada é inserido através do orifício e deixado fazer contato com o meio. Dez ninfas de Lygus recém-saídas do ovo (<12 horas após a saída do ovo) são adicionadas ao tubo e um tampão de espuma é usado para fechar o tubo para permitir a troca gasosa. O tubo é mantido em uma incubadora ajustada para 25 graus Celsius com um fotoperíodo de 14:10 dia:noite. Os escores de mortalidade e subdesenvolvimento são então calculados levando em consideração as mortes subjacentes que ocorrerão com aqueles insetos que falharam em se alimentar sobre o tecido da folha para se obter um escore ajustado. Os escores ajustados para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido da folha transformado com TIC807 são comparados com os escores ajustados para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido da folha de con

118 trole. Os escores de mortalidade e/ou subdesenvolvimento para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido da folha transformado com TIC807 estão significativamente aumentados em relação aos escores para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido de folha de controle.

Exemplo 20: Expressão de TIC807 em Alface transgênica e demonstração de toxicidade in planta

Esse exemplo demonstra a toxicidade para Lygus hesperus da proteína TIC807 quando expressa em plantas de alface. As plantas de alface foram transformadas com o vetor de transformação de planta, pMON105863, que contém o cassete de expressão de TIC807, 5’-e35S-Hsp17.9-CTP2TIC807-T-35S-3’ (SEQ ID NO:54) pelo método descrito no Exemplo 18. Uma linhagem de controle de alface foi transformada usando um vetor de controle, no qual apenas o cassete de seleção para transformação estava contido. A semente F1 foi produzida a partir de plantas transformadas. As plantas foram cultivadas a partir da semente F1 e amostradas para a expressão da proteína TIC807. Os níveis de expressão da proteína foram determinados para a progênie de F1 usando métodos ELISA padronizados e o anticorpo policlonal para TIC807. As plantas foram selecionadas para teste com Lygus hesperus baseado nos níveis de expressão da proteína TIC807. As folhas foram amostradas a partir da progênie F1 selecionada e testadas quanto a toxicidade para Lygus hesperus usando o método de ensaio descrito no Exemplo 18. Os dados das linhagens transgênicas de alface selecionadas estão apresentados na Tabela 12. As linhagens A028 e A055 se apresentaram significativamente melhor do que o controle (isto é, a linhagem de alface não transformada SVR3606). A análise global das linhagens que expressam a proteína TIC807 demonstrou uma mortalidade relativa significativa em relação as plantas de controle transformadas.

119

Tabela 12: Média ± desvio padrão do percentual de mortalidade de Lygus hesperus em folhas de alface transformadas com TIC807 de 15 ninfas tenerais infestadas (n = 16) seis dias após a infestação.

Evento	Concentração de TIC807 (ppm)	Percentual de Mortalidade
A028	43,22	67,71 ± 5,55 P> 0,05
A055	41,62	62,08 ± 5,83 P> 0,05
A035	30,77	51,04 ±2,73
A002	33,02	50,00 ± 5,51
A059	42,90	48,96 ± 2,83
Controle	0,00	28,33 ±2,15

Exemplo 21: TIC807 é tóxica para o Besouro da Batata do Colorado

Esse exemplo ilustra a toxicidade de moléculas de toxina para inseto TIC807 para o coleóptero, besouro da batata do Colorado (CPB), Leptinotarsa decemlineata. Os bioensaios com CPB foram conduzidos usando uma dieta artificial que consiste em ágar 13,2 g/l (Serva 11393), pré-mistura Bio-Serve 140,3 g/l (Bio-Serve, Frenchtown, NJ, N² de Catálogo F9380B), hidróxido de potássio 5 ml/l (18,3% peso/peso) e 12,5 ml/l de formalina (37%). A dieta foi vertida em alíquotas de 200 microlitros nos poços de uma placa de 96 poços e seca rapidamente antes da aplicação da amostra. Vinte microlitros de amostra de teste foram aplicadas por poço, com água estéril servindo como o controle não tratado (UTC). As placas foram deixadas secar antes da adição das larvas de inseto. Uma larva recém-nascida de CPB foi adicionada por poço com um pincel fino. As placas foram seladas com Mylar e ventiladas usando um alfinete para inseto. Quarenta larvas foram testadas por tratamento. As placas de bioensaio foram incubadas a 27 graus Celsius com umidade relativa de 60% em escuridão completa por 10 a 2 dias. As placas foram classificadas quanto a mortalidade das larvas. Os dados foram analisados usando o programa estatístico JMP® 4 (SAS Institute, Cary, NC). TIC807 demonstrou mortalidade quando fornecida para CPB. Os percentuais médios de mortalidade para TIC807 são mostrados na Tabela 13.

Assim, considerou-se que as proteínas TIC807 da invenção po

120 dem ser usadas para controlar insetos coleópteros. Os insetos coleópteros controlados pelas proteínas TIC807 da invenção incluem, mas não são limitados ao besouro da batata do Colorado, elaterídeos e bicudo do algodoeiro. Tabela 13: Escores de percentuais de mortalidade de TIC807 para o besouro da batata do Colorado (CPB), Leptinotarsa decemlineata.

Tratamento	concentração (mg/ml)	N	% médio de mortalidade	Desvio padrão	P>\|t\|
UTC	0	3	13,10	1,03
TIC807	0,5	3	68,45	23,03	0,0142

Exemplo 22: Transformação de Algodão com TIC807 e toxinas de teste usando plantas de algodão completas

As células de algodão são transformadas com construtos que contêm um gene que codifica uma proteína TIC807 de interesse. Nesse caso, o códon redesenhado das sequências de ácido nucleico que codificam a proteína TIC807 são expressos em células de algodão usando cassetes de expressão de TIC807 nos vetores de transformação descritos nos exemplos precedentes. Esses cassetes de expressão fornecem o direcionamento de TIC807 para o cloroplasto (isto é, cassetes de expressão 5’-e35S-Hsp17.9CTP2-TIC807-T-35S-3’ encontrado em pMON105863 ou 5’-P-ScBVHsp17.9-CTP2-TIC807-T-35S-3’ encontrado em pMON78892) ou a expressão não direcionada (citoplasmática) de TIC807 (isto é, com os cassetes de expressão 5’-e35S-Hsp17.9-TIC807-T-35S-3’ encontrado em pMON105864 ou 5’-P-ScBV-Hsp17.9-TIC807-T-35S-3' encontrado em pMON78893). Os vetores de transformação fornecem um marcador selecionável, nesse caso para a seleção de resistência a canamicina em tecido de planta transformada. Tanto o vetor pMON105863 (Figura 2), o vetor pMON105864 (Figura 3) quanto o vetor pMON78892 (Figura 4) ou o vetor pMON78893 (Figura 5) ou outros vetores equivalentes de expressão em planta de TIC807 que contenham cassetes de expressão de TIC807 em planta e um marcador selecionável podem ser usados.

O bioensaio de plantas que expressam a molécula da toxina TIC807 pode ser realizado usando um ensaio fechado de ramo de algodão.

121

As plantas de algodão são cultivadas até um estágio de florescência precoce onde vários ramos frutíferos contendo botões florais (isto é, flores de algodão imaturas) estão disponíveis. Capuzes são preparadas usando folhas de plástico que permitem a respiração (Vilutis and Co. Inc., Frankfort, IL). Os capuzes são feitos usando uma fotografia padronizada ou papel afixado com grampos para criar uma bainha que produz um saco com uma dimensão aproximada de 12,7 cm (5 polegadas) X 12,7 cm (5 polegadas) X 30,48 cm (12 polegadas) de comprimento. Os ramos terminais incluindo pelo menos um botão floral e uma folha terminal não dobrada são inseridos na extremidade aberta do capuz. Alternativamente, os sacos podem ser feitos para encerrar cápsulas ou outros tecidos se desejado. O saco é fechado em volta do ramo com um elástico. As folhas e os botões florais abaixo do tecido desejado recoberto podem ser removidos para facilitar a fechamento seguro com o elástico. A outra extremidade do capuz é deixada aberta para facilitar a infestação pelo inseto. As ninfas de Lygus são coletadas com um aspirador e 4 ninfas são colocadas em um frasco em concha de 2 dram. A massa inicial das ninfas é registrada em cada frasco que contêm as ninfas. O tubo é agitado cuidadosamente para assegurar que as ninfas estão no fundo do tubo e a tampa do tubo é removida. O tubo é colocado dentro do capuz expondo as ninfas ao tecido da planta de algodão. A extremidade aberta do capuz e então fechada usando um elástico. Os insetos são deixados permanecer dentro dos capuzes e se alimentarem do material de planta de algodão por um número de dias especificado. Após o tempo especificado, os ramos de algodão são removidos. Os capuzes são cuidadosamente abertos para contar as ninfas sobreviventes. Todas as ninfas são coletadas e pesadas. Os escores de mortalidade e subdesenvolvimento são então determinados com relação a plantas de controle não transformadas. Os escores ajustados para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido de algodão transformado com TIC807 são comparados com os escores ajustados para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido de algodão que carece da proteína TIC807. Os escores de mortalidade e/ou subdesenvolvimento para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido de algodão transformado com TIC807 estão significativa

122 mente aumentados em relação aos escores para as ninfas de Lygus apresentadas ao tecido de algodão de controle.

Exemplo 23: Combinando toxina TIC807 com algodão sem nectário

Esse exemplo ilustra o uso do fenótipo sem nectário de algodão em combinação com a expressão de proteína TIC807, para fornecer um maior controle de uma praga de inseto. A ausência de nectários foi identificada como originada da homozigose para mutações recessivas em dois loci duplicados em Gossypium tomentosum (Meyer e Meyer, 1961, Crop Science, 1:167-169). Os cruzamentos de Gossypium hirsutum com Gossypium tomentosum demonstraram uma redução significativa de traças das crucíferas e vermes da folha do algodão em experimentos fechados relativos a variedades comuns de algodão nas quais nectários florais estão presentes (Lukefar e Rhyne, 1960, Econ. Entomol, 53:242-244). Esse é, presumivelmente, o resultado direto de linhagens de algodão sem nectário sendo menos palatáveis para os insetos-praga assim como a ausência de sustentação fornecida pelos nectários. Múltiplos mecanismos de resistência podem ser particularmente cruciais em espécies de Gossypieae por que nectários extraflorais podem atrair diretamente algumas espécies herbívoras. Os nectários extraflorais no algodão cultivado podem aumentar a abundancia ou o dano por várias pragas de cultura incluindo lepidópteros e insetos de planta (Trelease, 1879, Nectar; what it is, and some of its uses. In J. H. Comstock [ed.], Report upon cotton insects, 319-343. U.S. Department of Agriculture Publication, U.S. Government Publication Office, Washington, D.C., USA. Lukefahr and Rhyne, 1960; Lukefahr et al., 1960, Journal of Econ Entom 53: 516518; Benschoter and Leal, 1974, Journal of Econ Entom 67: 217-218; Schuster et al., 1976, Journal of Econ Entom 69: 400-402; Wilson and Wilson, 1976, Journal of Econ Entom 69: 623-624; Henneberry et al., 1977, Journal of Econ Entom 70: 797-799; Adjei-Maafo et al., 1983, Environ Entom 12: 353-358; Beach et aL, 1985, Journal of Entomological Science 20: 233-236; Smith, 1992, Advances in Agronomy 48: 251-296; Summy and King, 1992, Crop Protection 11: 307-319), principalmente por que os adultos desses táxons consomem o nectar extrafloral.

123

As linhagens produzidas por cruzamentos de G. hirsutum com G. tomentosum são selecionadas quanto a presença do fenótipo sem nectário e características agronômicas favoráveis. Em outras modalidades, as linhagens obtidas do germeplasma comercial Stoneville 825 podem ser usadas como uma fonte de germeplasma que compreende o fenótipo sem nectário. Em uma modalidade do método, as linhagens sem nectário selecionadas são então transformadas com um cassete de expressão que codifica tanto uma proteína TIC807, as proteínas TIC809/TIC810, a proteína TIC128 ou suas combinações, quanto qualquer outra molécula de toxina direcionada para uma praga do algodão, no qual a presença de nectários atua como um atrativo para o inseto-praga. Em outra modalidade do método, insertos de transgenes que compreendem um cassete de expressão que codifica tanto uma proteína TIC807, as proteínas TIC809/TIC810, a proteína TIC128 ou suas combinações, quanto qualquer outra molécula de toxina direcionada para uma praga do algodão, no qual a presença de nectários atua como um atrativo para o inseto-praga, são obtidos em qualquer germeplasma de algodão adequado e então introduzidos nas linhagens produzidas pelos cruzamentos de G. hirsutum com G. tomentosum, que foram selecionados quanto a presença do fenótipo sem nectário e características agronômicas favoráveis. Através de métodos de cruzamento conhecidos por aqueles versados na técnica, as linhagens transformantes que expressam fenótipos sem nectários são selecionadas e mantidas nas gerações subseqüentes para conter ambos, o fenótipo sem nectário e a molécula de toxina para inseto.

Exemplo 24: Comparação das proteínas TIC807 e Cry51Aa

Para identificar regiões conservadas e não conservadas de TIC807 (SEQ ID NO:5) e Cry51Aa (SEQ ID NO:59), um alinhamento das duas proteínas foi criado usando ClustaIW. A proteína Cry51Aa foi isolada de Bt cepa F14-1, tem uma identidade descrita de 22% com cry15Aa e tem uma atividade descrita contra Bombyx mori, um inseto lepidóptero (Huang et al., J. Invertebr. Pathol. 95(3), 175-180, 2007). Uma sequência do gene cry51Aa1 (SEQ ID NO:58) e a proteína codificada Cry51Aa1 (SEQ ID NO:59) estão depositadas no NCBI GeneBank N° de Acesso DQ836184. A

124 comparação com ClustalW de TIC807 (SEQ ID NO:5) e Cry51Aa1 demonstrou que as duas proteínas têm uma identidade de sequência total de cerca de 97,4% sobre uma extensão de 301 aminoácidos (veja Figura 6 e Tabela

14). O N^s de Acesso DQ836184 do GeneBank descreve uma terminação N deduzida para Cry51Aa1 que corresponde ao uso de um códon de partida ATG putativo, que podería resultar em um produto de tradução primário com 309 aminoácidos. Ao contrário, a proteína TIC807 tem uma terminação amino distinta baseada em uma sequência de peptídeo N-terminal de proteína TIC807 isolada que foi determinada pela degradação de Edman (veja o Exemplo 2 e a SEQ ID NO:1). Um códon iniciador de metionina TTG de SEQ ID NO:4 é aparentemente usado para gerar a proteína TIC807 de SEQ ID NO:5. Consequentemente, a proteína Cry51Aa1 descrita compreende um adicional de três aminoácidos na sua terminação Ν o que não ocorre em TIC807 (SEQ ID NO:5). Em Cry51Aa1, o resíduo de aminoácido que corresponde à fenilalanina 46 de TIC807 é substituído por um resíduo de serina, o resíduo de aminoácido que corresponde à tirosina 54 de TIC807 é substituído por um resíduo de histidina, o resíduo de aminoácido que corresponde a serina 167 de TIC807 é substituído por um resíduo de arginina, os três (3) resíduos de aminoácido que correspondem à histidina 199 a serina 201 de TIC807 são deletados e o resíduo de aminoácido que corresponde à serina 217 de TIC807 é substituído por um resíduo de asparagina. Essa comparação das proteínas TIC807 e Cry51 Aa1 é mostrada na Figura 6.

Tabela 14:

N°	Sequencia	1	2
1	TIC807 (SEQ ID NO: 5)	-	97,4 (301)
2	Cry51Aa1 (SEQ ID NO:59)	97,4 (301)	-

Apesar da proteína TIC807 partilhar identidade de sequência significativa com a proteína Cry51Aa1, a proteína TIC807 surpreendentemente não exibiu um nível significativo de atividade quando fornecida para certos insetos lepidópteros. A proteína TIC807 foi testada contra a Broca do

125

Milho Europeu (ECB; Ostrinia nubilalis) e a traça do tabaco (TBW; Heliothis virescens) e não teve atividade contra nenhum desses insetos lepidópteros. A mesma amostra de proteína TIC807 exibiu atividade contra o Besouro da Batata do Colorado (CPB) mas não contra o Verme da Raiz do Milho (CRW; Diabroticus). Portanto, a ausência de atividade da proteína TIC807 purificada contra ECB e TBW não é devida a inatividade da proteína TIC807 purificada.

A presente invenção considera então proteínas TIC807 que são ativas contra insetos hemípteros e coleópteros, mas que são inativas contra insetos lepidópteros. Em certas modalidades, as proteínas TIC807 da invenção podem compreender proteína TIC807 nas quais o resíduo 54 correspondente da proteína TIC807 não é histidina, nas quais o resíduo 167 correspondente da proteína TIC807 não é arginina, nas quais os três (3) resíduos de aminoácido que correspondem à histidina 199 a serina 201 de TIC807 estão presentes e/ou nas quais o resíduo 217 correspondente da proteína TIC807 não é um resíduo de asparagina. Em outras modalidades, a proteína TIC807 da invenção pode compreender uma proteína que tem pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade sobre uma extensão de 301 aminoácidos que corresponde aos resíduos 2 a 309 de SEQ ID NO:5.

Várias patentes e publicações de não patente são citadas aqui, cujas descrições são, a medida do necessário, incorporadas por referência em suas totalidades. Os documentos citados aqui como estando disponíveis na Rede Mundial de Computadores em certos endereços da internet, também estão incorporados aqui por referência em suas totalidades. Certas sequências biológicas mencionadas aqui pelos seus Números de Acesso da NCBI podem ser acessadas através do National Center of Biotechnology Information, no site da web ncbi.nlm.nih.gov.

Como várias modificações podem ser feitas nas construções e métodos aqui descritos e ilustrados sem se afastar do escopo da invenção, pretende-se que todo o material na descrição precedente ou mostrado nas figuras que o acompanham seja interpretado como ilustrativo ao invés de limitante. Assim, a amplitude e o escopo da presente invenção não devem ficar limitados as modalidades exemplares acima descritas, mas devem ser

126 definidos apenas de acordo com as seguintes reivindicações anexas e seus equivalentes.

127

Número de referência de arquivo da requerente ou agente:38-21 (54839)A/PCT

International application N°

INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICRO-ORGANISMO DEPOSITADO OU OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO (PCT Rule 130/s)

A. As indicações feitas abaixo referem-se ao micro-organismo mencionado no relatório descritivo na página. 6 _ ,linha 21-25_________;___________________________________

B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO__________Outros depósitos estão identificados em uma folha adiciona__

Nome da instituição depositária

Agricultural Research Culture Collection (NRRL)______________________________

Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) 1815 N. University Street

Peoria Illinois 61604 U.S.A.

Data de depósito Número de acesso de março de 2007 NRRL B-50030

C. Indicações Adicionais (deixar em branco se não for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional □

D. Estados designados para os quais as indicações são feitas:

E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)_______

As indicações listadas adiante serão submetidas ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito)

Para uso apenas da repartição receptora

Para uso apenas do Escritório Internacional __ Essa folha foi recebida com o pedido internacional______________________________

Responsável autorizado:

Essa folha foi recebida pelo escritório internacional__________________________________

Responsável autorizado:

128

TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES

FORMATO INTERNACIONAL | DESTINATÁRIO:

Depto. de Patentes

Monsanto Co.

700 Chesterfield Parkway North Chesterfield, MO 63017 | NOME E ENDEREÇO DO DEPOSITANTE l RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO

ORIGINAL, emitido por força da regra 7.1 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada

I abaixo

I. IDENTIFICAÇÃO DO MICRO-ORGANISMO___________________________

Referência de identificação fornecida Número de acesso fornecido pela pelo DEPOSITANTE: AUTORIDADE INTERNACIONAL DE

DEPÓSITO:

Escherichia coli NRRL B-50030 __________ SIC 8088_______________________________________________

II. DESCRIÇÃO CIENTIFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONOMICA PROPOSTA__________

O micro-organismo identificado acima (I) foi acompanhado por:

( ) uma descrição científica (x) designação taxonômica proposta (marca com um X quando aplicável)__________________________________________

III. RECIBO E ACEITAÇAO_____________________________________________

A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (I), o qual foi recebido em 16-03-2007 (data do depósito original)¹_________________

IV. RECIBO DE REQUERIMENTO PARA CONVERSÃO___________________

O micro-organismo identificado acima (I) foi recebido pela presente Autoridade Internacional de Depósito em (data do depósito original) e o requerimento para a conversão do depósito original em um depósito conforme

tratado de Budapeste foi recebido em mento para conversão)	(data do recibo do requeri-
V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO
Nome: Agricultural Research Culture Collection (NRRL) International Depositary Authority Endereço: 1815 N. University Street Peoria, Illinois 61604 U.S.A.	Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representação da Autoridade Internacional de Depósito ou de oficial(is) responsável(is): Data: 09-03-2007

Marcar com um x a opção aplicável.

Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Internacional de depó- sito foi obtido.

129

TRATADO DE BUDAPESTE

SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES

FORMATO INTERNACIONAL

PARA DEPARTAMENTO DE PATENTE: Monsanto Co.

700 Chesterfield Parkway North

Chesterfield, MO 63017

DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE:

Emitido por força da regra 10.2 pela

AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo

NOME E ENDEREÇO DA PARTE DE QUEM A DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE É EMITIDA

I. DEPOSITANTE	II. IDENTIFICAÇÃO DO MICRO-ORGANISMO
Nome: Dr. Rachel Krieb Monsanto Co. Endereço: 700 Chesterfield Parkway North Chesterfield, MO 63017	Número de acesso e identificação classificatória fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO Escherichia coli NRRL B-50030 Data de: 16 de março de 2007 (X)² Depósito Original ( )² Depósito Inicial; ( j² Renovação do Depósito Original.
III. (a) DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE
Depósito foi achado: Nessa data, o referido micro-organismo foi (X)² viável ( )³ inviável em 17 de março de 2007 (data) A preparação foi viável em 23-03-2007 (Data)³ pela Autoridade Internacional de Depósito.
III. (b) DECLARAÇÃO DE EQUIVALÊNCIA DOS DEPOSITANTES
O Depositante determinado pela Autoridade Internacional de Depósito foi: (X) ²Equivalente ( ) ²Não equivalente para o depósito em (data) Assinatura do Depositante:
IV. CONDIÇÕES SOB AS QUAIS O TESTE DE VIABILIDADE FOI CONDUZIDA (Depositantes/Depositários)⁴

V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO
Nome: Agricultural Research Culture Collection (NRRL) Autoridade Internacional de Depósito Endereço: 1815 N. University Street Peoria, Illinois 61604, U.S.A.	Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representação da autoridade Internacional de Depósito ou de oficial(is) responsável(is) Data: 05-03-2007

¹ Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito foi feito;

² Marcar com um X o campo aplicável;

² Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referem-se ao teste de viabilidade mais recente;

⁴ Preencher se a informação foi requerida.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína inibitória de inseto TIC807 ou um fragmento de proteína inibitória de inseto dela derivado, em que a dita proteína inibitória de inseto ou fragmento de proteína compreendem uma sequência de polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeo correspondente contida dentro da SEQ ID NO: 5.
2. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de polipeptídeo tem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, preferencialmente pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência, mais preferencialmente 95% de identidade de sequência, e ainda mais preferencialmente 100% de identidade de sequência com a dita sequência de polipeptídeo correspondente contida dentro da SEQ ID NO: 5.
3. Polinucleotídeo isolado de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita proteína inibitória de inseto TIC807 ou fragmento de proteína inibitória de inseto dela derivado inibem um inseto Hemíptero, um inseto Heteróptero, um inseto Leptinotarsa sp. ou um inseto Homóptero, preferencialmente (i) o dito inseto Hemíptero é Lygus.

(ii) o dito inseto Homóptero é um afídeo, um gafanhoto ou uma mosca branca.
4. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita proteína inibitória de inseto TIC807 ou fragmento de proteína inibitória de inseto dela derivado inibem Lygus em uma concentração de pelo menos cerca de 5 ppm na dieta de Lygus da dita proteína TIC807 ou fragmento de proteína na dita dieta, preferencialmente a dita proteína inibitória de inseto TIC807 ou fragmento de proteína inibitória de inseto dela derivado inibem Lygus em uma concentração de pelo menos cerca de 50 ppm na dieta de Lygus da dita proteína TIC807 ou fragmento de proteína na dita dieta, mais preferencialmente a dita proteína inibitória de inseto TIC807 ou fragmento de proteína inibitória de inseto dela derivado inibem Lygus em uma concentração de pelo menos cerca de 250 ppm na dieta de Lygus da dita proteína TIC807 ou fragmento de proteína na dita dieta, ainda mais preferencialmente a dita proteína inibitória de inseto TIC807 ou fragmento de proteína inibitória de inseto dela derivado inibem Lygus em uma concentração de pelo menos cerca de 500 ppm na dieta de Lygus da dita proteína TIC807 ou fragmento de proteína na dita dieta.
5. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito fragmento de proteína compreende uma sequência de peptídeo de pelo menos 250 resíduos de aminoácidos.
6. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (i) o dito polinucleotídeo hibridiza sob condições de alta estringência com a SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6; ou (ii) a dita sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, e SEQ ID NO: 53; ou (iii) a dita sequência de polinucleotídeo foi planejada para expressão em plantas.
7. Célula hospedeira transformada, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína inibitória de inseto TIC807 ou um fragmento de proteína inibitória de inseto dela derivado, em que a dita proteína inibitória de inseto ou fragmento de proteína compreendem uma sequência de polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeo correspondente contida dentro da SEQ ID NO: 5.
8. Célula hospedeira transformada de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira é uma célula bacteriana ou uma célula de planta, preferencialmente (i) a dita célula de planta é selecionada do grupo que consiste em células de planta de cevada, milho, aveia, arroz, centeio, sorgo, grama, cana de açúcar, trigo, alfafa, banana, brócolis, feijão, repolho, canola, cenoura, abóbora, couve-flor, aipo, um cítrico, algodão, pepino, eucalipto, linheiro, alho, uva, cebola, alface, ervilha, pimenta, batata, álamo, pinheiro, girassol, açafrão, soja, morango, beterraba, batata-doce, tabaco, tomate, planta ornamental, arbusto, noz, grão-de-bico, guandu, painço, lúpulo e grama de pastagem, mais preferencialmente a dita célula de planta é uma célula de planta de algodão; ou (ii) a dita célula bacteriana é selecionada do grupo que consiste de uma célula bacteriana de Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas e Rhizobium, mais preferencialmente a dita célula bacteriana é uma célula de Bacillus thuringiensis.
9. Método para controlar Lygus, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) fornecer uma quantidade inibitória a Lygus de uma proteína inibitória de inseto TIC807 ou um fragmento de proteína inibitória de inseto dela derivado, em que a dita proteína inibitória de inseto ou fragmento de proteína compreendem uma sequência de polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeo correspondente contida dentro da SEQ ID NO: 5; e (b) contatar o dito Lygus com a dita quantidade inibitória da dita sequência de polipeptídeo, controlando dessa maneira um inseto Lygus.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que (i) a dita sequência de polipeptídeo tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a dita sequência de polipeptídeo inibidor de Lygus correspondente contida dentro da SEQ ID NO: 5, preferencialmente a dita sequência de polipeptídeo tem 100% de identidade de sequência com a dita sequência de polipeptídeo correspondente contida dentro da SEQ ID NO: 5; ou (ii) a dita quantidade inibitória a Lygus da dita sequência de polipeptídeo é fornecida em uma dieta para Lygus na etapa (a) e o dito Lygus é contatado na etapa (b) pela permissão ao dito Lygus se alimentar com a dita dieta, preferencialmente a dita dieta de Lygus é uma planta transgênica, mais preferencialmente a dita quantidade inibitória para Lygus da dita sequência de polipeptídeo é pelo menos cerca de 5 microgramas por grama de peso de tecido fresco da dita planta transgênica, mais preferencialmente a dita quantidade inibitória para Lygus da dita sequência de polipeptídeo é pelo menos cerca de 50 microgramas por grama de peso de tecido fresco da dita planta transgênica, ainda mais preferencialmente a dita quantidade inibitória para Lygus da dita sequência de polipeptídeo é pelo menos cerca de 250 microgramas por grama de peso de tecido fresco da dita planta transgênica; ou (iii) a dita quantidade inibitória para Lygus da dita sequência de polipeptídeo é fornecida na etapa (a) pela pulverização de uma composição que compreende o dito polipeptídeo sobre uma planta, preferencialmente a dita composição compreende células bacterianas ou esporos bacterianos que expressam o dito polipeptídeo, mais preferencialmente as ditas células bacterianas ou esporos bacterianos são células de Bacillus ou esporos de Bacillus, ainda mais preferencialmente a dita composição compreende um cristal parasporal contendo o dito polipeptídeo, mais preferencialmente de todos a dita planta está infestada por um Lygus.
11. Kit para detecção de uma sequência de polinucleotídeo de TIC807 em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo que hibridiza especificamente com uma sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, ou SEQ ID NO: 53 ou seus complementos e um polinucleotídeo de controle que hibridiza com o dito oligonucleotídeo.
12. Método para detectar ou isolar um polinucleotídeo que codifica uma proteína TIC807 ou uma proteína relacionada à TIC807 em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) selecionar um par de iniciadores de oligonucleotídeo degenerado capazes de produzir um amplicon, em que as sequências dos ditos iniciadores de oligonucleotídeo degenerado são derivadas de uma sequência de polipeptídeo de TIC807 de SEQ ID N:5;

(b) produzir um amplicon a partir da dita sequência de polinucleotídeo na dita amostra; e (c) detectar ou isolar o dito amplicon, detectando ou isolando dessa maneira um polinucleotídeo que codifica uma proteína TIC807 ou uma proteína relacionada à TIC807 em uma amostra.
13. Método para identificar ou isolar um polinucleotídeo que codifique uma proteína TIC807 em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) selecionar um oligonucleotídeo degenerado ou uma coleção de oligonucleotídeos degenerados, em que as ditas sequências de nucleotídeos dos iniciadores de oligonucleotídeo degenerado são derivadas de uma sequência de polipeptídeos de TIC807 de SEQ ID NO: 5;

(b) hibridizar o dito oligonucleotídeo degenerado ou a coleção de oligonucleotídeos degenerados da dita amostra;

(c) detectar a hibridização na dita amostra a um polinucleotídeo, detectando dessa maneira um polinucleotídeo que codifique uma proteína TIC807 em uma amostra; e (d) isolar o polinucleotídeo detectado pela hibridização na etapa (c).
14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotídeo detectado ou isolado codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 45% de identidade de sequência com TIC807 (SEQ ID NO: 5), preferencialmente o dito polinucleotídeo detectado ou isolado codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com TIC807 (SEQ ID NO: 5), mais preferencialmente o dito polinucleotídeo detectado ou isolado codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com TIC807 (SEQ ID NO: 5).
15. Método para expressar uma proteína TIC807 em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) inserir em um genoma de célula de planta uma sequência de ácido nucleico compreendendo, na direção 5' para a direção 3', uma molécu la de DNA de fita dupla, operativamente ligada recombinante, em que a molécula de DNA de fita dupla, recombinante compreende:

i. um promotor que funcione em uma célula de planta;

ii. uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende uma proteína inibitória de inseto TIC807 ou um fragmento de proteína inibitória de inseto dela derivado, em que a dita proteína inibitória de inseto ou fragmento de proteína compreendem uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeos correspondente contida dentro de SEQ ID NO: 5;

iii. uma sequência de nucleotídeos 3' não traduzida que funcione nas células da planta para induzir a terminação da transcrição e poliadenilação, em que o dito promotor, a dita sequência de polinucleotídeos e a dita sequência de nucleotídeos não traduzida estão operativamente ligadas;

(b) obter uma célula de planta transformada contendo a sequência de ácido nucleico da etapa (a); e (c) regenerar, a partir da dita célula de planta transformada, uma planta transformada que expresse a dita proteína TIC807, expressando dessa maneira uma proteína TIC807 em uma planta.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de polinucleotídeos da etapa (a) codifique uma proteína TIC807 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5, preferencialmente a dita sequência de polinucleotídeos da etapa (a) codifique a SEQ ID NO: 5, ainda mais preferencialmente a dita sequência de polinucleotídeos da etapa (a) que codifica uma proteína TIC807 está operativamente ligada a uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo de direcionamento ao plastídeo, mais preferencialmente de todos a dita sequência de polinucleotídeos da etapa (a) codifique um polipeptídeo de SEQ ID NO: 8.
17. Vetor de DNA recombinante para expressar uma proteína TIC807 em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende, na direção 5' para 3':

i. um promotor que funcione em uma célula de planta;

ii. uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende uma proteína inibitória de inseto TIC807 ou um fragmento de proteína inibitória de inseto dela derivado, em que a dita proteína inibitória de inseto ou fragmento de proteína compreendem uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeos correspondente contida dentro de SEQ ID NO: 5; e iii. uma sequência de nucleotídeos 3' não traduzida que funcione nas células da planta para induzir a poliadenilação, em que o dito promotor, a dita sequência de polinucleotídeos e a dita sequência de nucleotídeos 3' não traduzida estão operativamente ligadas.
18. Vetor de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que (i) a dita sequência de polinucleotídeos codifica uma proteína TIC807 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N:5, preferencialmente a dita sequência de polinucleotídeos codifica a proteína TIC807 de SEQ ID N:5, mais preferencialmente a dita sequência de polinucleotídeos compreende as SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, ou SEQ ID NO: 53; ou (ii) a dita sequência de polinucleotídeos que codifica uma proteína TIC807 está operativamente ligada a uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo de direcionmento ao plastídeo, preferencialmente a dita sequência de polinucleotídeos codifique o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8, mais preferencialmente a dita sequência de polinucleotídeos é a SEQ ID NO: 7, ou o dito vetor compreendendo ainda um polinucleotídeo que codifique um gene marcador selecionável, ainda mais preferencialmente o dito gene marcador selecionável confere resistência a AMPA, atrazine, bromoxinil, dalapon, dicamba, glifosato, higromicina, metotrexate, neomicina, fosfotricina, uma sulfoniluréia ou 2,4-D e suas combinações.
19. Produto de consumo, caracterizado pelo fato de ser produzi do a partir de uma planta ou semente em que o dito produto contém uma quantidade detectável de uma proteína TIC807 ou de um polinucleotídeo que codifique uma proteína TIC807.
20. Produto de consumo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a dita planta ou semente é uma planta de algodão ou uma semente de planta de algodão, preferencialmente o produto de consumo é algodão, óleo, cereal ou cascas.
21. Método para controlar pelo menos um inseto-praga, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) fornecer pelo menos dois agentes inibitórios de inseto-praga diferentes em uma composição, a dita composição compreendendo:

i. uma quantidade inibitória de inseto de uma proteína TIC807 e, ii. uma quantidade inibitória de inseto de pelo menos uma sequência de ribonucleotídeos que funcione após a ingestão pelo dito insetopraga para inibir uma função biológica dentro do dito inseto-praga, e/ou iii. uma quantidade inibitória de inseto de pelo menos uma proteína diferente da proteína TIC807, e (b) contatar o dito pelo menos um inseto-praga com uma quantidade inibitória da dita composição, controlando dessa maneira o dito pelo menos um inseto-praga.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que (i) o dito pelo menos um inseto-praga é um inseto Hemíptero, um inseto Heteróptero, um inseto Leptinotarsa sp. ou um inseto Homóptero, preferencialmente o dito inseto Hemíptero é um inseto Lygus, mais preferencialmente o dito inseto Homóptero é um afídeo, um gafanhoto ou uma mosca branca; ou (ii) a dita função biológica dentro do dito inseto-praga em (a) ii. é uma função biológica essencial, preferencialmente a dita função biológica essencial é fornecida por uma proteína essencial ou ácido ribonucléico do sito inseto-praga, a função predita dos quais é selecionada do grupo que consiste em formação de músculo, formação de hormônio juvenil, regulação de hormônio juvenil, regulação e transporte de íon, síntese de enzima digestiva, manutenção de potencial de membrana celular, biossíntese de aminoácidos, degradação de aminoácidos, formação de esperma, síntese de ferormônio, percepção de ferormônio, formação de antenas, formação de asa, formação de membro, desenvolvimento e diferenciação, formação de ovo, maturação larval, formação de enzima digestiva, síntese de hemolinfa, manutenção de hemolinfa, neurotransmissão, divisão celular, metabolismo de energia, respiração, e apoptose ou a dita função biológica essencial é inibida por uma sequência de ribonucleotídeos que compreende entre cerca de 21 a cerca de 5000 nucleotídeos contíguos que exibe entre cerca de 80 a cerca de 100% de identidade de sequência com uma sequência que codifique um nucleotídeo selecionado do grupo que consiste de SEQ ID NO: 24 até SEQ ID NO: 39, ou (iii) a dita proteína inibitória de inseto diferente da proteína TIC807 é derivada de Bacillus thuringiensis, preferencialmente a dita proteína inibitória de inseto é selecionada do grupo que consiste de AXMI-027, AXMI-036, AXMI-038, AXMI-018, AXMI-020, AXMI-021, AXMI-010, AXMI003, AXMI-008, AXMI-006, AXMI-007, AXMI-009, AXMI-014, ET29, ET37, AXMI-004, AXMI-028, AXMI-029, AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-OO9, AXMI-014, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127 e TIC128; ou (iv) a dita composição compreende duas proteínas inibitórias de inseto diferentes de TIC807 e em que as duas ditas proteínas inibitórias de inseto são TIC809 e TIC810; ou (v) um segundo inseto-praga é controlado pela dita composição, preferencialmente o dito segundo inseto-praga é inibido tanto pela dita sequência de ribonucleotídeos de ii. quanto pela dita proteína diferente de uma proteína TIC807 de iii. ou o dito segundo inseto-praga é um inseto-praga Lepidóptero, mais preferencialmente o dito segundo inseto-praga é inibido por uma proteína selecionada do grupo que consiste em uma proteína Cry1A, uma proteína Cry1B, uma Cry1C, uma proteína quimérica Cry1A/Cry1F e uma proteína Cry2Ab; ou (vi) a dita composição fornece um efeito sinérgico inibitório de inseto; ou (vii) a dita composição fornece um efeito aditivo inibitório de inseto; ou (viii) a dita composição é uma planta transgênica.
23. Método para proteger uma planta da infestação por Lygus, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: expressar uma quantidade inibitória de Lygus de pelo menos dois agentes inibitórios diferentes de Lygus na dita planta, em que os ditos agentes inibitórios de Lygus compreendam:

i. uma quantidade inibitória a Lygus de uma proteína TIC807;

ii. uma quantidade inibitória de Lygus de pelo menos uma proteína inibitória de Lygus diferente de uma proteína TIC807; e/ou iii. uma quantidade inibitória de Lygus de pelo menos uma sequência de ribonucleotídeos que funcione após a ingestão pelo dito Lygus para inibir uma função biológica dentro do dito Lygus, protegendo dessa maneira a dita planta da infestação por Lygus.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a dita função biológica dentro do dito Lygus em ii. é uma função biológica essencial, preferencialmente a dita função biológica essencial é fornecida por uma proteína essencial ou ácido ribonucléico do sito insetopraga, a função predita dos quais é selecionada do grupo que consiste em formação de músculo, formação de hormônio juvenil, regulação de hormônio juvenil, regulação e transporte de íon, síntese de enzima digestiva, manutenção de potencial de membrana celular, biossíntese de aminoácidos, degradação de aminoácidos, formação de esperma, síntese de ferormônio, percepção de ferormônio, formação de antenas, formação de asa, formação de membro, desenvolvimento e diferenciação, formação de ovo, maturação larval, formação de enzima digestiva, síntese de hemolinfa, manutenção de hemolinfa, neurotransmissão, divisão celular, metabolismo de energia, respiração e apoptose, mais preferencialmente a dita função biológica essencial é inibida por uma sequência de ribonucleotídeos que compreende entre cerca de 21 a cerca de 5000 nucleotídeos contíguos que exibe entre cerca de 80 a cerca de 100% de identidade de sequência com uma sequência que codifique um nucleotídeo selecionado do grupo que consiste de SEQ ID NO: 24 até SEQ ID NO: 39; ou (ii) a dita proteína inibitória de Lygus diferente da proteína TIC807 é derivada de Bacillus thuringiensis, preferencialmente a dita proteína inibitória de Lygus é selecionada do grupo que consiste de AXMI-027, AXMI-036, AXMI-038, AXMI-018, AXMI-020, AXMI-021, AXMI-010, AXMI003, AXMI-008, AXMI-006, AXMI-007, AXMI-009, AXMI-014, ET29, ET37, AXMI-004, AXMI-028, AXMI-029, AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-OO9, AXMI-014, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127 e TIC128; ou (iii) duas proteínas inibitórias de Lygus diferentes de TIC807 são expressas na dita planta, as duas ditas proteínas inibitórias de Lygus compreendendo TIC809 e TIC810; ou (iv) a dita expressão de agentes inibitórios de Lygus fornece um efeito sinérgico inibitório de Lygus; ou (v) a dita expressão de agentes inibitórios de Lygus fornece um efeito aditivo inibitório de Lygus; ou (vi) o dito Lygus é Lygus hesperus ou Lygus lineolaris.
25. Proteína isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de polipeptídeos com pelo menos 9 aminoácidos de extensão que está contida dentro da SEQ ID NO: 5.
26. Proteína isolada de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que (i) a dita sequência de polipeptídeos tem pelo menos 12 aminoácidos de extensão, preferencialmente a dita sequência de polipeptídeos tem pelo menos 16 ou pelo menos 32 aminoácidos de extensão, mais preferencialmente a dita sequência de polipeptídeos tem pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeos correspondente contida dentro da SEQ ID NO: 5, mais preferencialmente ainda a dita proteína tem a

SEQ ID NO: 5; ou (ii) a dita proteína compreende ainda um transportador de proteína, preferencialmente o dito transportador de proteína é uma albumina ou uma proteína KLH; ou (iii) a dita proteína compreende ainda uma modificação covalente selecionada do grupo que consiste de um reagente indicador, um espaçador de aminoácido, um ligante de aminoácido, uma sequência de sinal, uma sequência de peptídeo de transito de cloroplasto, uma sequência direcional vacuolar, uma sequência de parada de transferência, um domínio transmembrana, um ligante de purificação de proteína ou suas combinações.
27. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a uma proteína TIC807 ou epítopo peptídico dela derivado, a dita proteína ou epítopo compreendendo pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 5.
28. Kit para detecção de uma proteína TIC807 em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende:

a) um anticorpo que se ligue especificamente a uma proteína TIC807 ou epítopo peptídico dela derivado, a dita proteína ou epítopo compreendendo pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 5; e

b) uma proteína TIC807 de controle ou epítopo peptídico dela derivado, a dita proteína ou epítopo compreendendo pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 5.
29. Cepa SIC8088 de Escherichia coli isolada, caracterizada pelo fato de que abriga o vetor plC17040 e que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifique um fragmento inseticida de TIC807, depositada em 16 de Março de 2007 na Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL) e que tem o N° de Acesso NRRLB-50030.