KR20120115978A - 곤충 내성 관리를 위한 ｃｒｙ１ｄａ 및 ｃｒｙ１ｃａ의 병용 용도 - Google Patents

곤충 내성 관리를 위한 ｃｒｙ１ｄａ 및 ｃｒｙ１ｃａ의 병용 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 밤나방 인시목 곤충을 방제하기 위한 방법 및 식물을 포함하고, 상기 식물은 Cry1Da 살곤충성 단백질 및 Cry1Ca 살곤충성 단백질, 이 단백질 쌍을 포함하는 다른 단백질의 다양한 조합들을 포함하여 곤충에 의한 내성 발달을 지연 또는 방지한다.

Description

곤충 내성 관리를 위한 ＣＲＹ１ＤＡ 및 ＣＲＹ１ＣＡ의 병용 용도 {USE OF CRY1DA IN COMBINATION WITH CRY1CA FOR MANAGEMENT OF RESISTANT INSECTS}
인간은 식품 및 에너지 활용을 위해 옥수수를 재배한다. 인간은 또한 대두 및 목화를 비롯한, 여러 다양한 작물을 재배한다. 곤충은 식물을 먹고 피해를 입혀 이러한 인간의 수고를 헛되게 한다. 해충 방제에 매년 수십억 달러가 쓰이고 있으며 해충이 주는 피해 때문에 추가로 수십억의 손해를 입고 있다. 합성 유기 화학적 살곤충제가 해충 방제를 위해 사용되는 주요 수단이었지만, 생물학적 살곤충제, 예컨대 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis; Bt)로부터 유래된 살곤충성 단백질도 몇몇 영역에서 중요한 역할을 해왔다. Bt 살곤충성 단백질 유전자를 이용한 형질전환을 통해 곤충 내성 식물을 생산하는 능력은 현대 농업에 혁신을 가져왔고 살곤충성 단백질 및 그의 유전자의 중요성 및 가치를 높였다.
복수의 Bt 단백질이 지금까지 성공적으로 등록되었고 상업화된, 곤충 내성 유전자이식 식물의 개발에 사용되어 왔다. 여기에는 옥수수에서의 Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F 및 Cry3Bb, 목화에서의 Cry1Ac 및 Cry2Ab, 및 감자에서의 Cry3A가 포함된다.
이들 단백질을 발현하는 상품은 단백질 2종의 조합된 살곤충 스펙트럼이 바람직한 경우 (예를 들어, 각각 인시목 해충 및 뿌리벌레에 대한 내성을 제공하도록 조합된 옥수수에서의 Cry1Ab 및 Cry3Bb) 또는 단백질의 독립적인 작용이 단백질을 감수성 곤충 개체군에서의 내성 발달을 지연시키는 수단으로서 유용하게 만드는 경우 (예를 들어, 담배 나방에 대한 내성 관리를 제공하도록 조합된 목화에서의 Cry1Ac 및 Cry2Ab)를 제외하고는 단일 단백질을 발현한다. 헬리코베르파 지아(Helicoverpa zea) 또는 아르미게라인(armigerain)을 방제하기 위한 Cry2 단백질 + Vip3Aa, Cry1F 또는 Cry1A에 관한 것인 미국 특허 출원 공개 제2009/0313717호를 참조한다. WO 2009/132850은 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda)를 방제하기 위한 Cry1F 또는 Cry1A 및 Vip3Aa에 관한 것이다. 미국 특허 출원 공개 제2008/0311096호는 부분적으로 Cry1F 내성 ECB를 방제하기 위한 Cry1Ab에 관한 것이다.
즉, 이러한 기술이 신속하게 널리 채택되도록 한 곤충 내성 유전자이식 식물의 특징 중 어떤 것은 또한 해충 개체군이 이들 식물에 의해 생산된 살곤충성 단백질에 대한 내성을 발달시킬 것이라는 우려를 제기한다. 단백질을 피난처(refuge)와 함께 고농도로 이용하는 것, 및 상이한 독소와의 교호 이용 또는 동시 이용을 포함하는, Bt-기반 곤충 내성 형질의 유용성을 보존하기 위한 복수의 전략이 제안되었다 (문헌 [McGaughey et al., (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16: 144-146]).
곤충 내성 관리(IRM) 스택(stack)에 사용하기 위해 선택되는 단백질은, 한 단백질에 대하여 발달된 내성이 제2의 단백질에 대한 내성을 부여하지 않도록 (즉, 단백질에 대한 교차 내성을 갖지 않도록) 독립적으로 그들의 살곤충 효과를 발휘할 필요가 있다. 예를 들어, "단백질 A"에 대해 내성인 해충 개체군이 "단백질 B"에 대하여 감수성을 갖는다면, 교차 내성이 발달하지 않으며, 또한 단백질 A와 단백질 B의 조합은 단독의 단백질 A에 대한 내성을 지연시키는 데에 효과적일 것이라는 결론에 이를 것이다.
내성 곤충 개체군이 없을 때에는, 작용 메커니즘 및 교차 내성 잠재성과 관련있을 것으로 추정되는 다른 특징을 토대로 평가할 수 있다. 교차 내성을 나타내지 않을 것 같은 살곤충성 단백질의 동정에 수용체 매개성 결합을 이용하는 것이 제안되었다(van Mellaert et al., 1999). 이러한 접근법 특유의 교차 내성 결여에 대한 핵심 예측변수는 살곤충성 단백질이 감수성 곤충 종에서 수용체에 대하여 경쟁하지 않을 것이라는 것이다.
2종의 Bt 독소가 동일한 수용체에 대하여 경쟁하는 경우에, 독소 중의 하나가 그 수용체와 더 이상 결합하지 않아 곤충에 대하여 더 이상 살곤충성이지 않도록 그 수용체가 그 곤충에서 돌연변이된다면, 곤충은 (동일한 수용체에 대하여 경쟁적으로 결합하는) 제2의 독소에 대해서도 내성을 갖게 될 수 있다. 즉, 곤충이 2종의 Bt 독소 모두에 대해서 교차 내성을 갖는다고 할 수 있다. 그러나, 2종의 독소가 2개의 상이한 수용체와 결합한다면, 이는 곤충이 그 2종의 독소에 대하여 동시에 내성을 갖지 않을 것임을 의미하는 것일 수 있다.
예를 들어, Cry1Fa 단백질은 유럽 옥수수 천공충(ECB; 오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis)(Huebner)) 및 밤나방(FAW; 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda))을 비롯한 복수의 인시목 해충종 방제에 유용하고, 사탕수수 천공충(SCB; 디아트리아 사카랄리스(Diatraea saccharalis))에 대하여 활성이다. 이벤트 TC1507을 함유하는 유전자이식 옥수수 식물에서 생산된, Cry1Fa 단백질은 FAW 방제를 위한 업계 선두의 곤충 내성 형질을 갖는다. Cry1Fa는 또한 허큘렉스(Herculex®), 스마트스택스(SmartStax™) 및 와이드스트라이크(WideStrike™) 제품에 이용된다.
추가의 Cry 독소가 공식 B.t. 명명 위원회의 웹사이트 (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)에 일람되어 있다. 현재, 추가의 Cyt 독소 및 VIP 독소 등과 함께, 거의 60개의 "Cry" 독소 주요 그룹 (Cry1-Cry59)이 있다. 복수의, 숫자를 통해 표시되는 그룹은 각각 대문자로 표시되는 하위그룹을 갖고, 대문자로 표시되는 하위그룹은 소문자로 표시되는 하위그룹의 하위그룹을 갖는다 (예를 들면, Cry1에는 A-L이 속해 있고, Cry1A에는 a-i가 속해 있음).
발명의 간단한 요약
본 발명은 부분적으로 Cry1Da 및 Cry1Ca가 밤나방(FAW; 스포도프테라 프루지페르다) 내장(gut) 세포막 제제 내의 결합 부위에 대해서 경쟁하지 않는다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 당업계 보통의 기술자가 본 개시내용의 이점을 이해하는 것처럼, 이들 단백질(전장 단백질의 살곤충성 부분을 포함함) 양쪽 모두를 생산하는 식물은 이들 살곤충성 단백질 중 어느 하나 단독의 살곤충성 단백질에 대한 내성 발달을 지연시키거나 방지할 수 있다.
따라서, 본 발명은 부분적으로 Cry1Ca 단백질과 조합한 Cry1Da 단백질의 용도에 관한 것이다. 이들 단백질 양쪽 모두를 생산하는 식물 (및 이러한 식물이 재식된 경작지)는 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본 발명은 또한 부분적으로, Cry1Da 및 Cry1Ca 독소가 염기 쌍인, 3종 (또는 그 이상)의 독소의 3중 스택 또는 "피라미드"에 관한 것이다. 일부 바람직한 피라미드 실시양태에서, 선택된 독소의 조합은 FAW에 대하여 비-교차 내성을 제공한다. 일부 바람직한 "3개의 작용 부위" 피라미드 조합은 단백질의 염기 쌍 + FAW의 표적화를 위한 제3의 단백질로서 Cry1Fa, Vip3Ab, Cry1Be 또는 Cry1E를 포함한다. 본 발명에 따르면, 이들 특정한 3중 스택은 유리하고 놀랍게도 FAW에 대하여 3개의 작용 부위를 제공할 것이다. 이는 피난처 경작지의 필요성을 줄이거나 제거하는 데에 도움이 될 수 있다.
추가의 독소/유전자가 또한 본 발명에 따라 첨가될 수 있다. 예를 들어, Cry1Fa 또는 Cry1Be가 해당 단백질 쌍(Cry1Fa 및 Cry1Be 양쪽 모두가 FAW 및 유럽 옥수수 천공충(ECB) 양쪽 모두에 대해 활성임)과 적층되면, 이 삼중 스택에 ECB를 표적화하는 2개의 추가의 단백질을 첨가하는 것은 FAW에 대한 3개의 작용 부위 및 ECB에 대한 3개의 작용 부위를 제공할 것이다. 이들 2개의 첨가된 단백질(제4 및 제5의 단백질)은 Cry2A, Cry1I, DIG-3 및 Cry1Ab로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이것은 2종의 곤충(ECB 및 FAW)에 대해 3개의 작용 부위를 갖는 5-단백질 스택을 초래할 것이다.
도 1은 비표지된 상동성 Cry1Da(○) 및 비상동성 Cry1Ca(■)에 의한 경쟁에 대한 FAW로부터의 BBMV 내 125I Cry1Da(0.5 nM)의 % 특이적 결합을 도시한 것이다.
본 발명은 부분적으로 Cry1Da 및 Cry1Ca가 밤나방(FAW; 스포도프테라 프루지페르다)의 내장 내에서 서로 결합을 위해 경쟁하지 않는다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 따라서, Cry1Da 단백질은 FAW가 이들 단백질 중 어느 하나의 단독의 단백질에 대한 내성을 발달시키는 것을 지연 또는 방지하기 위해 유전자이식 옥수수(및 다른 식물; 예를 들어 목화 및 대두)의 Cry1Ca 단백질과 조합하여 사용될 수 있다. 해당 단백질 쌍은 Cry 내성 밤나방에 의한 충해로부터 식물(예를 들어 메이즈(maize) 식물 및/또는 대두 식물)을 보호하는 데 효과적일 수 있다. 즉, 본 발명의 한 용도는 Cry1Da 또는 Cry1Ca에 대한 내성이 발달될 수 있는 밤나방 개체군에 의해 야기되는 충해 및 수확량 손실로부터 옥수수 및 경제적으로 중요한 다른 식물종을 보호하는 것이다.
따라서, 본 발명은 Cry1Da 및 Cry1Ca를 포함하여 이들 단백질 중 어느 하나 또는 양쪽 모두에 대한 FAW에 의한 내성의 발달을 방지 또는 완화시키는 곤충 내성 관리(IRM) 스택을 교시한다.
본 발명은 Cry1Da 살곤충성 단백질 및 Cry1Ca 살곤충성 단백질을 생산하는 세포를 포함하는, 인시목 해충의 방제 조성물을 제공한다.
본 발명은 Cry1Da 살곤충성 단백질 및 Cry1Ca 살곤충성 단백질 양쪽 모두를 생산하도록 형질전환된 숙주를 더 포함하며, 상기 숙주는 미생물 또는 식물 세포이다. 해당 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 비-바실루스-투린지엔시스 프로모터(들)의 조절 하에 있는 유전자 작제물에 있다. 해당 폴리뉴클레오티드는 식물에서의 발현 증대를 위한 코돈 사용을 포함할 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 인시목 해충 또는 상기 해충의 환경을 Cry1Da 코어 독소-함유 단백질을 함유하고 Cry1Ca 코어 독소-함유 단백질을 추가로 함유하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 인시목 해충의 방제 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 실시양태는 Cry1Ca 살곤충성 단백질을 코딩하는 식물-발현성 유전자 및 Cry1Da 살곤충성 단백질을 코딩하는 식물-발현성 유전자를 포함하는 메이즈 식물, 및 상기 식물의 종자를 포함한다.
본 발명의 추가의 실시양태는 Cry1Ca 살곤충성 단백질을 코딩하는 식물-발현성 유전자 및 Cry1Da 살곤충성 단백질을 코딩하는 식물-발현성 유전자가 유전자이입된 메이즈 식물, 및 상기 식물의 종자를 포함한다.
실시예에서 기재된 바와 같이, 방사성표지된 Cry1Da 단백질을 사용하는 경쟁적 수용체 결합 연구는 Cry1Ca 단백질이 Cry1Da가 결합하는 FAW 조직에 결합하기 위해 경쟁하지 않음을 보여준다. 이러한 결과는 또한 Cry1Da 및 Cry1Ca 단백질의 조합이 이들 단백질에 대한 FAW 개체군에서의 내성 발달을 완화시키는 효과적인 수단일 수 있음을 나타낸다. 따라서, 부분적으로 본원에 기재된 데이터로부터, Cry1Ca 및 Cry1Da 단백질의 동시-생산(스태킹)이 FAW를 위한 고농도의 IRM 스택을 생산하는 데에 사용될 수 있는 것으로 생각된다.
이 쌍에 다른 단백질이 첨가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 또한 부분적으로 Cry1Da 및 Cry1Ca가 염기 쌍인 3종 (또는 그 이상)의 독소의 3중 스택 또는 "피라미드"에 관한 것이다. 일부 바람직한 피라미드 실시양태에서, 선택된 독소는 FAW에 대한 3개의 별도의 작용 부위를 가진다. 일부 바람직한 "3개의 작용 부위" 피라미드 조합은 해당 단백질의 염기 쌍 + FAW의 표적화를 위한 제3의 단백질로서 Cry1Fa, Vip3Ab, Cry1Be 또는 Cry1E를 포함한다. "별도의 작용 부위"란, 주어진 임의의 단백질이 서로 교차 내성을 야기하지 않음을 의미한다. 본 발명에 따르면, 이들 특정한 3중 스택은 유리하고 놀랍게도 FAW에 대해 3개의 작용 부위를 제공한다. 이는 피난처 경작지의 필요성을 줄이거나 또는 제거하는 것을 도울 수 있다.
추가의 독소/유전자가 또한 본 발명에 따라 첨가될 수 있다. 예를 들어, Cry1Fa 또는 Cry1Be가 해당 단백질 쌍(Cry1Fa 및 Cry1Be 양쪽 모두가 FAW 및 유럽 옥수수 천공충(ECB) 양쪽 모두에 대해 활성임)으로 적층되면, ECB를 표적화하는 2종의 추가의 단백질을 이 3중 스택에 첨가하는 것은 FAW에 대해 3개의 작용 부위 및 ECB에 대해 3개의 작용 부위를 제공할 것이다. 이들 2개의 첨가된 단백질(제4 및 제5의 단백질)은 Cry2A, Cry1I, DIG-3(USSN 61/284,278호(2009년 12월 16일 출원) 및 US 2010 00269223 참조) 및 Cry1Ab로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이것은 2종의 곤충(ECB 및 FAW)에 대해 3개의 작용 부위를 갖는 5-단백질 스택을 초래할 것이다.
따라서, 한 이용 옵션은 해당 단백질 쌍을 제3의 독소/유전자와 조합하여 사용하고, 이러한 3중 스택을 사용하여 이들 독소 중 어느 하나에 대한 FAW에서의 내성 발달을 완화시키는 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 부분적으로 3종 (또는 그 이상)의 독소의 3중 스택 또는 "피라미드"에 관한 것이다. 일부 바람직한 피라미드 실시양태에서, 선택된 독소는 FAW에 대하여 3개의 별도의 작용 부위를 갖는다.
FAW가 내성 개체군을 발달시킬 수 있는 작물 재배 영역에서의 해당 단백질의 2종, 3종 또는 그 이상을 사용하는 것은 본 발명의 이용 옵션 중에 포함될 것이다.
Cry1Fa + Cry1C의 용도에 대해서는 Cry1C가 Cry1F 내성 FAW에 대해 활성임을 나타내는 USSN 61/284,281호(2009년 12월 16일 출원)를 참조한다. Cry1Fa + Cry1D의 용도에 대해서는 Cry1D가 Cry1F 내성 FAW에 대해 활성임을 나타내는 USSN 61/284,252호(2009년 12월 16일 출원)를 참조한다. 이들 두 출원은 또한 Cry1C는 FAW 막 제제에 결합하기 위해 Cry1F와 경쟁하지 않고 Cry1D는 FAW 막 제제에 결합하기 위해 Cry1F와 경쟁하지 않음을 나타낸다. Cry1Fa는 FAW 및 ECB에 대해 활성이므로, 본 발명에 따르면 Cry1Da + Cry1Ca + Cry1Fa는 유리하고 놀랍게도 FAW에 대해 3개의 작용 부위를 제공할 것이다. 이는 피난처 경작지의 필요성을 줄이거나 또는 제거하는 것을 도울 수 있다.
Cry1Fa는 허큘렉스, 스마트스택스 및 와이드스트라이크 제품에 사용된다. 해당 유전자 쌍(Cry1Da 및 Cry1Ca)은 예를 들어 허큘렉스, 스마트스택스 및 와이드스트라이크와 같은 Cry1Fa 제품에 조합될 수 있다. 따라서, 해당 단백질 쌍은 이들 및 다른 단백질에 대한 선택압을 줄이는 데에 중요할 수 있다. 따라서, 해당 단백질 쌍은 옥수수 및 다른 식물(예를 들어 목화 및 대두)에 대한 3종의 유전자 조합으로 사용될 수 있다.
상기한 바와 같이, 추가의 독소/유전자가 또한 본 발명에 따라 첨가될 수 있다. (FAW 방제를 위한) Cry1E의 용도에 대해서는 USSN 61/284,278호(2009년 12월 16일 출원)를 참조한다. (ECB 방제를 위한) Cry1Ab의 용도에 대해서는 미국 특허 출원 공개 제2008/0311096호를 참조한다.
임의의 해당 단백질 조합을 생산하는 식물(및 상기 식물이 재식된 경작지)은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 추가의 독소/유전자가 또한 첨가될 수 있지만, 상기한 특정한 스택은 유리하고 놀랍게도 FAW 및/또는 ECB에 대해 다중 작용 부위를 제공한다. 이는 피난처 경작지의 필요성을 줄이거나 또는 제거하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 10 에이커를 초과하여 재식된 경작지는 본 발명 내에 포함된다.
또한, 진뱅크(GENBANK)를 사용하여 본원에 기재되었거나 언급된 임의의 유전자 및 단백질의 서열을 입수할 수 있다. 이하의 부록 A를 참조한다. 관련 서열은 또한 특허에서 입수가능하다. 예를 들어, 미국 특허 제5,188,960호 및 미국 특허 제5,827,514호에 본 발명을 실시할 때에 사용하기에 적합한 Cry1Fa 코어 독소-함유 단백질이 개시되어 있다. 미국 특허 제6,218,188호에 본 발명에서 사용하기에 적합한 Cry1Fa 코어 독소-함유 단백질을 코딩하는 식물-최적화된 DNA 서열이 개시되어 있다.
본원에 기재된 단백질의 조합은 인시목 해충의 방제에 사용될 수 있다. 성충 인시목, 예를 들어 나비 및 나방은 주로 꽃의 꿀을 먹고 성장하며, 수분의 중요한 효과기이다. 거의 모든 인시목 유충, 즉 애벌레는 식물을 먹고 성장하며, 복수가 심각한 해충이다. 애벌레는 식물의 잎 상에서 또는 그 내부에서, 또는 식물의 뿌리 또는 줄기 상에서 식물을 먹고 성장하면서, 식물에게서 영양분을 빼앗고 종종 식물의 물리적 지지 구조체를 붕괴시킨다. 또한, 애벌레는 열매, 직물, 및 저장 곡물 및 곡분을 먹어, 이들 판매용 제품을 황폐시키거나 이들의 가치를 심각하게 저하시킨다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 인시목 해충을 언급할 때는 유충 단계를 포함하는, 여러 발생 단계의 해충을 말한다.
본 발명의 일부 키메라 독소는 Bt 독소의 전장 N-말단 코어 독소 부분을 포함하고, 코어 독소 부분의 말단부를 지나 어느 한 지점에서, 단백질은 이종성 독소전구체 서열로 전이된다. Bt 독소의 N-말단의, 살곤충 활성 독소 부분을 "코어" 독소라 한다. 코어 독소 절편으로부터 이종성 독소전구체 절편으로의 전이는 독소/독소전구체 연결지점 근처에서 발생할 수 있거나, 또는 천연 독소전구체 부분 (코어 독소 부분을 지나 연장함)이 유지되면서, 이종성 독소전구체 부분으로의 전이가 하류에서 발생할 수 있다.
한 예로, 본 발명의 한 키메라 독소는 Cry1Da의 전장 코어 독소 부분(대략 처음 600개의 아미노산) 및/또는 이종성 독소전구체(단백질의 C-말단까지의 나머지 부분)이다. 한 바람직한 실시양태에서, 독소전구체를 포함하는 키메라 독소 부분은 Cry1Ab 단백질 독소로부터 유래된다. 바람직한 실시양태에서, 독소전구체를 포함하는 키메라 독소 부분은 Cry1Ab 단백질 독소로부터 유래된다.
당업계 보통의 기술자라면 Bt 독소가, Cry1Ca와 같은 특정한 부류에 속하더라도, 길이 및 코어 독소 부분으로부터 독소전구체 부분으로의 정확한 전이 위치가 어느 정도는 다를 것임을 알 것이다. 통상적으로, Cry1Ca 독소는 약 1150개 내지 약 1200개의 아미노산 길이이다. 코어 독소 부분으로부터 독소전구체 부분으로의 전이는 통상적으로 전장 독소의 약 50% 내지 약 60%에서 발생할 것이다. 본 발명의 키메라 독소는 이러한 N-말단 코어 독소 부분의 전장 광역부를 포함할 것이다. 따라서, 키메라 독소는 Cry1 Bt 독소 단백질 전장의 약 50% 이상을 포함할 것이다. 이는 통상적으로 약 590개 이상의 아미노산일 것이다. 독소전구체 부분과 관련하여, Cry1Ab 독소전구체 부분의 전장 광역부는 코어 독소 부분의 말단부로부터 분자의 C-말단으로 연장한다.
유전자 및 독소. 본 발명에 따라 유용한 유전자 및 독소에는 기재된 전장 서열뿐만 아니라, 본원에서 구체적으로 예시된 독소의 특징적인 살해충 활성을 보유하는 이들 서열의 단편, 변이체, 돌연변이체 및 융합 단백질이 포함된다. 본원에서 사용된, 용어 유전자의 "변이체" 또는 "변이물"은 동일한 독소를 코딩하거나 또는 살해충 활성을 갖는 등가의 독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 본원에서 사용된, 용어 "등가의 독소"는 표적 해충에 대하여 청구된 독소와 동일한 또는 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 독소를 말한다.
본원에서 사용된, 경계선은 문헌 ["Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins," N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813]에 따라, 대략 95%(Cry1Da 및 Cry1Ca), 78%(Cry1D 및 Cry1C), 및 45%(Cry1)의 서열 유사성을 나타낸다. 이러한 절단값은 또한 단지 코어 독소에만 적용가능하다.
활성 독소를 코딩하는 유전자가 여러 수단을 통해 동정 및 수득가능하다는 사실은 당업계 보통의 기술자에게 자명할 것이다. 본원에서 예시된 특정 유전자 또는 유전자 부분은 배양물 기탁소에 기탁된 단리물로부터 수득할 수 있다. 이들 유전자, 또는 이들의 부분 또는 변이체는 또한, 예를 들어 유전자 합성장치를 사용하여 인공적으로 작제할 수 있다. 유전자의 변이물은 점돌연변이를 일으키는 표준 기법을 사용하여 용이하게 작제할 수 있다. 또한, 이들 유전자의 단편은 표준 절차에 따라서 시판 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 사용하여 만들 수 있다. 예를 들어, Bal31과 같은 효소 또는 부위-지정 돌연변이 유발이 이들 유전자의 말단부로부터 뉴클레오티드를 체계적으로 절단하는 데에 사용될 수 있다. 활성 단편을 코딩하는 유전자는 또한 다양한 제한 효소를 사용하여 수득할 수 있다. 프로테아제를 사용하여 이들 단백질 독소의 활성 단편을 직접적으로 수득할 수 있다.
예시된 독소의 살해충 활성을 보유하는 단편 및 등가물은 본 발명의 범주 내에 있을 것이다. 또한, 유전자 코드의 중복성 때문에, 매우 다양한 DNA 서열이 본원에 기재된 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 동일한 또는 실질적으로 동일한 독소를 코딩하는 이러한 대체 DNA 서열을 생산하는 것은 당업계 보통의 기술자의 기술 내에서 충분히 가능하다. 이들 변이체 DNA 서열은 본 발명의 범주 내에 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 동일한" 서열을 언급할 때는 살해충 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 삽입이 일어난 서열을 말한다. 살해충 활성을 보유하는 단백질을 코딩하는 유전자의 단편 또한 상기 정의에 포함된다.
본 발명에 따라 유용한 독소를 코딩하는 유전자 및 유전자 부분을 동정하는 추가의 방법은 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용을 통해서이다. 이들 프로브는 검출가능한 뉴클레오티드 서열이다. 이들 서열은 적절한 표지에 의해 검출가능하거나, 또는 국제 출원 WO93/16094호에 개시된 바와 같이 고유의 형광을 나타낼 수 있다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 프로브 분자와 핵산 샘플이 두 분자 간의 강력한 결합을 형성함으로써 혼성화된다면, 프로브와 샘플은 실질적인 상동성을 갖는 것으로 합리적으로 추정할 수 있다. 바람직하게는, 혼성화는 엄격한 조건하에, 예를 들어 문헌 [Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170]에 개시된 바와 같이 당업계에 널리 공지된 기법에 의해 수행된다. 염 농도 및 온도 조합의 일부 예는 하기와 같다 (엄격함이 증가하는 순): 실온에서의 2X SSPE 또는 SSC; 42℃에서의 1X SSPE 또는 SSC; 42℃에서의 0.1X SSPE 또는 SSC; 65℃에서의 0.1X SSPE 또는 SSC. 프로브의 검출은 혼성화가 일어났는지를 공지된 방식으로 결정하기 위한 수단을 제공한다. 이러한 프로브 분석은 본 발명의 독소-코딩 유전자의 신속한 동정 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 프로브로서 사용되는 뉴클레오티드 절편은 DNA 합성장치 및 표준 절차를 사용하여 합성할 수 있다. 이들 뉴클레오티드 서열은 또한 본 발명의 유전자를 증폭시키는 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다.
변이체 독소. 본 발명의 특정한 독소는 본원에서 구체적으로 예시되었다. 이들 독소는 단지 본 발명의 독소의 예시일 뿐이므로, 본 발명은 예시된 독소의 동일한 또는 유사한 살해충 활성을 갖는 변이체 또는 등가의 독소 (및 등가의 독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)를 포함함이 자명할 것이다. 등가의 독소는 예시된 독소와 아미노산 상동성을 가질 것이다. 이러한 아미노산 상동성은 통상적으로 75%를 초과, 바람직하게는 90%를 초과, 가장 바람직하게는 95%를 초과할 것이다. 아미노산 상동성은 생물학적 활성을 설명해주거나 또는 궁극적으로 생물학적 활성을 책임지는 3차원 구조의 결정과 관련있는 독소의 주요 영역에서 최고일 것이다. 이와 관련하여, 아미노산 치환이 활성에 중요하지 않는 영역에서 일어나거나 분자의 3차원 구조에 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환이라면 이러한 특정 아미노산 치환은 허용되고 예측될 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 하기 부류에 속할 수 있다: 비극성, 비하전 극성, 염기성 및 산성. 한 부류의 아미노산이 동일한 유형의 또 다른 아미노산으로 대체되는 보존적 치환은, 치환이 화합물의 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않는 한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 각각의 부류에 속하는 아미노산의 예가 하기에 일람되어 있다.
아미노산의 부류 아미노산의 예
비극성 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
비하전 극성 Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
산성 Asp, Glu
염기성 Lys, Arg, His
일부 예에서, 비보존적 치환 또한 있을 수 있다. 중요한 점은 이들 치환이 독소의 생물학적 활성을 유의하게 손상시켜서는 안 된다는 사실이다.
재조합 숙주. 본 발명의 독소를 코딩하는 유전자는 광범위한 미생물 또는 식물 숙주로 도입될 수 있다. 독소 유전자의 발현은, 직접적으로 또는 간접적으로, 살해충제의 세포내 생산 및 유지를 초래한다. 접합 전달 및 재조합 전달이 본 발명의 두 독소를 모두 발현하는 Bt 균주를 생산하는 데에 사용될 수 있다. 기타 숙주 유기체 또한 독소 유전자 중 하나 또는 둘 모두로 형질전환된 후에 사용되어 상승 효과를 달성할 수 있다. 적합한 미생물 숙주, 예를 들어 슈도모나스(Pseudomonas)에 의해, 미생물은 해충의 위치에 적용될 수 있고, 여기서 이들은 증식하고 섭취될 것이다. 그 결과는 해충의 조절이다. 별법으로, 독소 유전자의 숙주인 미생물은 독소의 활성을 연장시키고 세포를 안정화하는 조건하에서 처리될 수 있다. 그 후에, 독성 활성을 보유하는 처리 세포는 표적 해충의 환경에 적용될 수 있다.
Bt 독소 유전자가 적합한 벡터를 통해 미생물 숙주로 도입되고, 상기 숙주가 생활 환경에 적용되는 경우에, 특정한 숙주 미생물이 사용되는 것이 필수적이다. 하나 이상의 관심 작물의 "식물권(phytosphere)"(엽면, 엽권, 근권 및/또는 근면)에 있는 것으로 알려진 미생물 숙주가 선택된다. 이러한 미생물은 특정한 환경 (작물 및 기타 곤충 서식지)에서 야생형 미생물과 성공적으로 경쟁할 수 있는 것으로 선택되고, 폴리펩티드 살해충제를 발현하는 유전자의 안정한 유지 및 발현을 제공하며, 또한 바람직하게는 환경의 저하 및 불활성화로부터 살해충제의 향상된 보호를 제공한다.
복수의 미생물이 광범위한 중요 작물의 엽면(식물 잎의 표면) 및/또는 근권(식물 뿌리 주변의 토양)에서 서식하는 것으로 알려져 있다. 이러한 미생물에는 박테리아, 조류 및 균류가 포함된다. 특히 미생물, 예컨대 박테리아, 예를 들어 슈도모나스, 에르위니아(Erwinia), 세라티아(Serratia), 클렙시엘라(Klebsiella), 크산토모나스(Xanthomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces), 리조비움(Rhizobium), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 메틸로필리우스(Methylophilius), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아세토박터(Acetobacter), 락토바실루스(Lactobacillus), 아트로박터(Arthrobacter), 아조토박터(Azotobacter), 류코노스톡(Leuconostoc), 및 알칼리제네스(Alcaligenes) 속; 균류, 특히 효모, 예를 들어 사카로미세스(Saccharomyces), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 스포로볼로미세스(Sporobolomyces), 로도토룰라(Rhodotorula), 및 오레오바시디움(Aureobasidium) 속이 흥미롭다. 특히 슈도모나스 시린게(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 아세토박터 크실리눔(Acetobacter xylinum), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 로도슈도모나스 스페로이데스(Rhodopseudomonas spheroides), 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 리조비움 멜리오티(Rhizobium melioti), 알칼리제네스 엔트로푸스(Alcaligenes entrophus), 및 아조토박터 빈란디(Azotobacter vinlandii)와 같은 식물권 박테리아종; 및 로도토룰라 루브라(Rhodotorula rubra), R. 글루티니스(glutinis), R. 마리나(marina), R. 오란티아카(aurantiaca), 크립토코쿠스 알비두스(Cryptococcus albidus), C. 디플루엔스(diffluens), C. 로렌티(laurentii), 사카로미세스 로세이(Saccharomyces rosei), S. 프레토리엔시스(pretoriensis), S. 세레비시애(cerevisiae), 스포로볼로미세스 로세우스(Sporobolomyces roseus), S. 오도루스(odorus), 클루이베로미세스 베로내(Kluyveromyces veronae), 및 오레오바시디움 폴루란스(Aureobasidium pollulans)와 같은 식물권 효모종이 흥미롭다. 특히 유색 미생물이 흥미롭다.
독소를 코딩하는 Bt 유전자를 유전자의 안정한 유지 및 발현을 허용하는 조건하에서 미생물 숙주로 도입하기 위해 다양한 방법이 이용가능하다. 이러한 방법은 당업계 보통의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,135,867호에 개시되어 있다.
세포 처리. 바실루스 투린지엔시스 또는 Bt 독소를 발현하는 재조합 세포는 독소 활성을 연장시키고 세포를 안정화하도록 처리될 수 있다. 형성된 살해충제 마이크로캡슐은 안정화되었고 마이크로캡슐이 표적 해충의 환경에 적용될 때 독소를 보호할 세포 구조체 내에 Bt 독소 또는 독소들을 포함한다. 적합한 숙주 세포는, 포유동물과 같은 고등 유기체에 독성인 물질을 생산하지 않는 세포로 보통 제한되는, 원핵생물 또는 진핵생물을 포함할 수 있다. 그러나, 고등 유기체에 독성인 물질을 생산하는 유기체도 사용될 수 있으며, 이 경우에 독성 물질은 불안정하거나 포유류 숙주에 독성일 가능성을 피할 정도로 충분히 낮은 적용 수준이다. 숙주로서, 특히 원핵생물 및 하등 진핵생물, 예컨대 균류가 흥미로울 것이다.
세포는 보통 온전하고, 처리시에 포자 형태보다는 실질적으로 증식 형태일 것이지만, 일부 경우에는 포자가 사용될 수 있다.
미생물 세포, 예를 들어 B.t. 독소 유전자 또는 유전자들을 함유하는 미생물의 처리는, 기법이 독소의 성질에 불리하게 영향을 미치지 않거나, 독소를 보호하는 세포 능력을 약화시키지 않는 한, 화학적 또는 물리적 수단, 또는 화학적 수단 및/또는 물리적 수단의 조합에 의한 것일 수 있다. 화학 시약의 예에는 할로겐화제, 특히 17-80번 원자 할로겐이 있다. 보다 특히, 요오드를 목적하는 결과를 달성하기에 충분한 시간 동안 온화한 조건하에서 사용할 수 있다. 기타 적합한 기법에는 알데히드, 예컨대 글루타르알데히드; 항감염제, 예컨대 제피란 클로라이드 및 세틸피리디늄 클로라이드; 알콜, 예컨대 이소프로필 및 에탄올; 다양한 조직학적 고정액, 예컨대 루골(Lugol) 요오드, 부앵(Bouin) 고정액, 다양한 산 및 헬리(Helly) 고정액 (참조: 문헌 [Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967]); 또는 세포가 숙주 환경에 투여될 때 세포에서 생산된 독소의 활성을 연장시키고 보존하는 물리적 (열) 및 화학적 작용제의 조합에 의한 처리가 포함된다. 물리적 수단의 예에는 단파장 방사선, 예컨대 감마선 및 X선, 동결, UV 조사, 동결건조 등이 있다. 미생물 세포의 처리 방법은, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제4,695,455호 및 제4,695,462호에 개시되어 있다.
세포는 일반적으로 환경 조건에 대한 내성을 향상시킬 향상된 구조적 안정성을 가질 것이다. 살해충제가 전구형태인 경우에, 세포 처리 방법은 전구형태의 살해충제 성숙 형태로의 프로세싱이 표적 해충 병원체에 의해 억제되지 않도록 선택되어야 한다. 예를 들어, 포름알데히드는 단백질을 가교시킬 것이고 폴리펩티드 살해충제의 전구형태의 프로세싱을 억제할 수 있다. 처리 방법은 독소의 생물학적 이용가능성 또는 생활성의 적어도 실질적인 부분을 유지해야 한다.
생산 목적으로 숙주 세포를 선택할 때에 특히 흥미로운 특징은 B.t. 유전자 또는 유전자들을 숙주로 용이하게 도입하는 것, 발현 시스템의 이용가능성, 발현 효율, 숙주에서의 살해충제의 안정성, 및 보조적인 유전자 능력의 존재를 포함한다. 살해충제 마이크로캡슐로서 사용할 때에 흥미로운 특징은 살해충제를 위한 보호 특징, 예컨대 두꺼운 세포벽, 색소침착, 및 세포내 패키징 또는 봉입체의 형성; 수성 환경에서의 생존; 포유류 독성의 결여; 해충이 섭취하도록 하기 위한 유인성; 독소 손상 없이 용이한 파괴 및 고정 등을 포함한다. 기타 고려사항에는 제형화 및 관리의 용이함, 경제학, 저장 안정성 등이 포함된다.
세포의 성장. B.t. 살곤충 유전자 또는 유전자들을 함유하는 세포성 숙주는 임의의 편리한 영양 배지에서 성장시킬 수 있고, 여기서 DNA 작제물은 실질적으로 모든 또는 모든 세포가 B.t. 유전자를 보유하도록 선택 배지를 제공하는 선택적 이점을 제공한다. 그 후에, 이들 세포를 통상의 방법에 따라 수거할 수 있다. 별법으로, 세포를 처리한 다음에 수거할 수 있다.
본 발명의 독소를 생산하는 B.t. 세포는 표준 기술 배지 및 발효 기법을 사용하여 배양할 수 있다. 발효 사이클이 완료되면, 먼저 당업계에 널리 공지된 수단에 의해 B.t. 포자 및 결정체를 발효조로부터 분리함으로써 박테리아를 수거할 수 있다. 회수한 B.t. 포자 및 결정체는 계면활성제, 분산제, 특이적 활성 담체 및 특정 표적 해충에 대해서 관리 및 적용을 용이하게 하는 기타 성분을 첨가함으로써 수화 분말제, 액상 농축물, 과립제 또는 기타 제형으로 제형화할 수 있다. 이러한 제형화 및 적용 절차는 모두 당업계에 널리 공지되어 있다.
제형. 유인제 및 B.t. 단리물의 포자, 결정체 및 독소를 함유하는 제형화된 유인 과립제, 또는 본원에 기재된 B.t. 단리물로부터 수득가능한 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 토양에 적용할 수 있다. 제형물은 또한 작물 사이클의 후기 단계에서 종자 코팅물 또는 뿌리 처리제 또는 전체 식물 처리제로서 적용될 수 있다. B.t. 세포의 식물 및 토양 처리제는 무기 미네랄 (엽상규산염, 탄산염, 황산염, 인산염 등) 또는 식물성 물질 (분말 옥수숫대, 왕겨, 호두 껍질 등)과 같은 다양한 특이적 활성 물질과 혼합함으로써, 수화 분말제, 과립제 또는 분진제로서 사용될 수 있다. 제형은 고착전착제 아주반트, 안정화제, 기타 살해충 첨가제, 또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 액상 제형은 수성 또는 비수성일 수 있고 포움, 겔, 현탁물, 유화성 농축물 등으로서 사용될 수 있다. 성분은 유동제, 계면활성제, 유화제, 분산제, 또는 폴리머를 포함할 수 있다.
당업계 보통의 기술자가 이해할 것처럼, 살해충 농도는 특정 제형의 특성, 특히 농축물인지 또는 직접 사용될 것인지에 따라 광범위하게 달라질 것이다. 살해충제는 1 중량% 이상 존재할 것이고 100 중량%일 수 있다. 건조 제형은 살해충제를 약 1 내지 95 중량% 가질 것이고, 액상 제형은 일반적으로 액상 중에 고형분을 약 1 내지 60 중량% 가질 것이다. 제형은 일반적으로 약 102개 내지 약 104개 세포/mg을 가질 것이다. 이러한 제형은 헥타르 당 약 50 mg (액상 또는 건조) 내지 1 kg 이상으로 투여될 것이다.
제형은 인시목 해충의 환경, 예를 들어 잎 또는 토양에, 분무법, 살분법, 살수법 등에 의해 적용될 수 있다.
식물 형질전환. 본 발명의 살곤충성 단백질의 생산에 바람직한 재조합 숙주는 형질전환된 식물이다. 본원에 기재된, Bt 독소 단백질을 코딩하는 유전자는 당업계에 널리 공지된 다양한 기법을 사용하여 식물 세포에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 대장균(Escherichia coli)에서의 복제 시스템 및 형질전환된 세포의 선택을 가능하게 하는 마커(marker)를 포함하는 복수의 클로닝 벡터가 고등 식물로의 외래 유전자의 삽입의 준비를 위해 이용가능하다. 벡터는 예를 들어, 특히 pBR322, pUC 시리즈, M13mp 시리즈, pACYC184를 포함한다. 따라서, Bt 독소 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 DNA 단편을 적합한 제한 부위에서 벡터로 삽입할 수 있다. 생산된 플라스미드는 대장균으로의 형질전환을 위해 사용된다. 대장균 세포를 적합한 영양 배지에서 배양한 후에, 수거하고 용해시킨다. 플라스미드를 회수한다. 서열 분석, 제한 분석, 전기영동, 및 기타 생화학-분자 생물학적 방법이 일반적으로 분석 방법으로서 수행된다. 각각의 조작 후에, 사용된 DNA 서열을 절단하고 그 다음 DNA 서열에 연결할 수 있다. 각각의 플라스미드 서열을 동일한 또는 다른 플라스미드에서 클로닝할 수 있다. 목적하는 유전자를 식물로 삽입하는 방법에 따라서, 다른 DNA 서열이 필요할 수 있다. 예를 들어, Ti 또는 Ri 플라스미드가 식물 세포의 형질전환을 위해 사용된다면, Ti 또는 Ri 플라스미드 T-DNA의 적어도 RB(right border), 그러나 종종은 RB 및 LB(left border)는 삽입될 유전자의 플랭킹(flanking) 영역으로서 연결되어야 한다. 식물 세포의 형질전환을 위해 T-DNA를 사용하는 것은 광범위하게 연구되어 왔고 EP 120 516호, 리(Lee) 및 겔빈(Gelvin) (2008), 회케마(Hoekema) (1985), 프랄리(Fraley) 등 (1986), 및 안(An) 등 (1985)에 의해 충분히 개시되었고, 또한 당업계에서 잘 확립되어 있다.
삽입된 DNA가 식물 게놈에서 통합되면, 이것은 비교적 안정하다. 형질전환 벡터는 보통 형질전환된 식물 세포에 살생물제 또는 항생제, 예컨대 특히 비아라포스(Bialaphos), 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 또는 하이그로마이신(Hygromycin)에 대한 내성을 부여하는 선택 마커를 함유한다. 따라서 개별적으로 사용되는 마커는 삽입된 DNA를 함유하지 않는 세포보다는 형질전환된 세포의 선택을 가능하게 해야 한다.
DNA를 식물 숙주 세포로 삽입하기 위한 복수의 기법이 이용가능하다. 이러한 기법에는 형질전환제로서 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)를 사용하는 T-DNA에 의한 형질전환, 융합, 주입, 유전자총(biolistics; 극미립자 충격), 또는 전기천공뿐만 아니라, 기타 가능한 방법이 포함된다. 아그로박테리아가 형질전환을 위해 사용된다면, 삽입되는 DNA는 특별한 플라스미드로, 즉 매개 벡터 또는 2원 벡터로 클로닝되어야 한다. 매개 벡터는 T-DNA에서의 서열과 상동성인 서열 때문에 상동성 재조합에 의해 Ti 또는 Ri 플라스미드로 통합될 수 있다. Ti 또는 Ri 플라스미드는 또한 T-DNA의 전달을 위해 필요한 vir 영역을 포함한다. 매개 벡터는 아그로박테리아에서 그들 자체를 복제할 수 없다. 매개 벡터는 헬퍼 플라스미드에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스로 전달될 수 있다 (접합). 2원 벡터는 대장균 및 아그로박테리아에서 그들 자체를 복제할 수 있다. 이들은 T-DNA RB 및 LB 영역에 의해 경계가 정해지는 링커 또는 폴리링커 및 선택 마커 유전자를 포함한다. 이들은 아그로박테리아로 직접적으로 형질전환될 수 있다 (Holsters et al., 1978). 숙주 세포로서 사용되는 아그로박테리아는 vir 영역을 갖는 플라스미드를 포함하는 것이다. vir 영역은 T-DNA의 식물 세포로의 전달을 위해 필요하다. 추가의 T-DNA가 함유될 수도 있다. 이렇게 형질전환된 박테리아는 식물 세포의 형질전환을 위해 사용된다. 식물 외식편은 DNA의 식물 세포로의 전달을 위해 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조제네스와 함께 배양하는 것이 유리할 수 있다. 그 후에, 선택을 위해 항생제 또는 살생물제를 함유할 수 있는 적합한 배지에서, 감염된 식물 물질 (예를 들어, 잎 조각, 줄기, 뿌리의 절편, 또한 원형질체 또는 현탁 배양된 세포)로부터 전체 식물을 재생시킬 수 있다. 이렇게 수득된 식물을 이어서 삽입된 DNA의 존재 여부에 대해서 시험할 수 있다. 주입 및 전기천공의 경우에는 플라스미드에 대한 특별한 요건이 없다. 보통의 플라스미드, 예를 들어 pUC 유도체를 사용하는 것이 가능하다.
형질전환된 세포를 통상의 방식으로 식물 내부에서 성장시킨다. 이들은 생식 세포를 형성할 수 있고 형질전환된 형질(들)을 자손 식물로 전달할 수 있다. 이러한 식물은 일상적인 방식으로 재배할 수 있고 동일한 형질전환된 유전 요인 또는 다른 유전 요인을 갖는 식물과 교배할 수 있다. 생산된 잡종 개체는 상응하는 표현형 성질을 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 식물은 유전자로 형질전환될 것이고, 여기서 코돈 사용은 식물에 대하여 최적화된다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,380,831호를 참조로 한다. 일부 말단절단된(truncated) 독소가 본원에서 예시되었지만, 130 kDa 타입 (전장) 독소는 코어 독소인 N-말단 절반부 및 독소전구체 "테일(tail)"인 C-말단 절반부를 갖는다는 사실이 Bt 분야에서 널리 공지되어 있다. 따라서, 적절한 "테일"이 본 발명의 말단절단형/코어 독소와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,218,188호 및 미국 특허 제6,673,990호를 참조로 한다. 또한, 식물에 사용하기 위한 합성 Bt 유전자의 생산 방법은 당업계에 공지되어 있다(Stewart and Burgin, 2007). 바람직한 형질전환된 식물의 비제한적 한 예는 Cry1Da 단백질을 코딩하는 식물-발현성 유전자를 포함하고, 또한 Cry1Ca 단백질을 코딩하는 제2의 식물-발현성 유전자를 추가로 포함하는 생식가능한 메이즈 식물이다.
Cry1Da- 및 Cry1Ca-결정 형질(들)의 근친교배된 메이즈 계통으로의 전달 (또는 유전자이입)은 반복적인 선발 육종, 예를 들어 여교배에 의해 달성가능하다. 이 경우에, 바람직한 반복친을 먼저 Cry1D- 및 Cry1C-결정 형질을 위한 적절한 유전자(들)를 갖고 있는 공여 근친교배종 (1회친)과 교배한다. 상기 교배의 자손을 다시 반복친과 교배한 후에, 생산된 자손 중에서 1회친으로부터 전달되는 목적하는 형질(들)에 대하여 선택한다. 반복친과의 3세대, 바람직하게는 4세대, 보다 바람직하게는 5세대 이상의 여교배 및 목적하는 형질(들)의 선택 후에, 자손은 전달되는 형질(들)을 조절하는 좌위에 대하여 이형접합성일 것이지만, 대부분의 또는 거의 모든 다른 유전자에 대해서는 반복친과 같을 것이다 (예를 들어, 문헌 [Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175]; [Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376] 참조).
곤충 내성 관리 ( IRM ) 전략. 루쉬(Roush) 등은, 예를 들어 살곤충 유전자이식 작물의 관리를 위한, "피라미딩(pyramiding)" 또는 "스태킹"이라고도 하는 2 독소 전략을 약술하였다 (문헌 [The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786]).
미국 환경 보호청은 그들의 웹사이트 (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)에서, 표적 해충에 대하여 활성인 단일 Bt 단백질을 생산하는 유전자이식 작물과 함께 사용되는 비-유전자이식 (즉, 비-B.t.) 피난처 (비-Bt 작물/옥수수 구역)의 제공에 대한 하기 요건을 발표하였다.
"옥수수 천공충-보호된 Bt (Cry1Ab 또는 Cry1F) 옥수수 제품을 위한 구체적인 구조적 요건은 하기와 같다:
구조적 피난처:
콘 벨트(Corn Belt)에서는 20% 비-인시목 Bt 옥수수 피난처;
코튼 벨트(Cotton Belt)에서는 50% 비-인시목 Bt 피난처
블록
내부 (즉, Bt 경작지 내부)
외부 (즉, 무작위 교배를 최대화하기 위해 Bt 경작지의 ½ 마일 (가능하면 ¼ 마일) 이내의 별도의 경작지)
경작지내 구간
구간은 유충 이동의 영향을 줄이기 위해 4열 이상 (바람직하게는 6열)의 너비를 가져야 한다."
또한, 미국 옥수수 생산자 협회도 그들의 웹사이트 (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)에서, 피난처 요건에 관한 유사한 지침을 제공한다. 예를 들면 하기와 같다.
"옥수수 천공충 IRM 요건:
- 생산자의 옥수수밭의 20% 이상에 피난처 하이브리드를 재식해야 함
- 목화 생산지에서는, 피난처가 50%이어야 함
- 1/2 마일 이내에 피난처 하이브리드를 재식해야 함
- 피난처는 Bt 경작지내의 구간일 수 있고; 피난처 구간은 4열 이상의 너비이어야 함
- 피난처는 표적 해충에 대하여 경제적 한계선에 이르는 경우에만 통상의 살해충제로 처리할 수 있음
- Bt-기반 분무성 살곤충제는 피난처 옥수수에 사용할 수 없음
- Bt 옥수수의 모든 농장에는 적절한 피난처가 있어야 함"
루쉬 등에 의해 명시된 바와 같이 (예를 들어, 제1780면 및 제1784면의 우측 컬럼), 표적 해충에 대하여 각각 효과적이고 교차 내성이 거의 또는 전혀 없는 2종의 상이한 단백질의 스태킹 또는 피라미딩은 보다 축소된 피난처의 사용을 허용할 수 있다. 루쉬는 성공적인 스택의 경우에, 10% 미만의 피난처 규모를 갖는 피난처가 단일 (비-피라미딩) 형질의 약 50%의 피난처에 상응하는 내성 관리를 제공할 수 있음을 설명하였다. 현재 이용가능한 피라미딩 Bt 옥수수 제품의 경우에, 미국 환경 보호청은 단일 형질 제품 (일반적으로 20%)에 대한 것보다 상당히 축소된 (일반적으로 5%) 구조적 피난처에 비-Bt 옥수수를 재식할 것을 요구하고 있다.
경작지에서의 다양한 기하학적 재식 양식 (상기 언급된 바와 같은 것) 및 루쉬 등 (상기)에 의해 추가로 논의되었고 또한 미국 특허 제6,551,962호에서 논의된 바와 같은 자루내(in-bag) 종자 혼합물을 비롯한, 피난처의 IRM 효과를 제공하는 다양한 방법이 있다.
상기 백분율, 또는 유사한 피난처 비율이 해당 2중 또는 3중 스택 또는 피라미드를 위해 사용될 수 있다. 단일 표적 해충에 대한 3개의 작용 부위를 갖는 3중 스택의 경우에는, 0 피난처 (또는 예를 들어 5% 미만의 피난처)를 목표로 할 것이다. 이는 특히, 예를 들어 10 에이커 초과의 상업용 경작지의 경우에 사실이다.
본원에서 언급되었거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 공보는 본 명세서의 명확한 교시내용과 모순되지 않는 정도까지 그 전문이 참고로 포함된다.
구체적으로 명시하거나 시사하지 않는 한, 단수형("a", "an" 및 "the")은 본원에서 사용될 때 "하나 이상"을 의미한다.
하기의 실시예는 본 발명을 실시하는 절차를 설명한다. 이들 실시예는 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 달리 언급하지 않는 한, 모든 백분율은 중량 기준이고 모든 용매 혼합물 분율은 부피 기준이다. 모든 온도는 섭씨 온도이다.
실시예
실시예 1 - Cry 단백질의 125 I 표지
Cry 독소의 요오드화. 정제된 말단절단된 Cry 독소를 요오드-비드(Iodo-Bead) 또는 요오드-겐(Pierce)을 사용하여 요오드화하였다. 간락하게 말하면, 2개의 요오드-비드를 인산염 완충된 염수 500 ㎕(PBS(20 mM 인산나트륨, 0.15 M NaCl, pH 7.5))로 2회 세척하고, 납 보호구(lead shielding) 뒤에서 1.5 ㎖ 원심분리 튜브 내에 두었다. 이것에 100 ㎕의 PBS를 첨가하였다. 후드 내에서 적절한 방사능 취급 기술을 사용함으로써, 0.5 mCi Na125I(17.4 Ci/mg, Lot 0114, Amersham)을 요오드-비드가 있는 PBS 용액에 첨가하였다. 이 성분들을 실온에서 5분 동안 반응시킨 후, 2 내지 25 ㎍의 고순도 말단절단된 Cry 단백질을 이 용액에 첨가하고, 추가 3 내지 5분 동안 반응시켰다. 요오드-비드로부터 용액을 제거하고 이것을 PBS 내에서 평형화된 0.5 ㎖의 탈염화 Zeba spin column(InVitrogen)에 적용함으로써 이 반응을 종결하였다. 요오드-비드를 각각 PBS 10 ㎕로 2회 세척하고, 상기 세척액을 또한 탈염화 칼럼에 적용하였다. 방사성 용액을 1,000 x g에서 2분 동안 원심분리함으로써 탈염화 칼럼을 통해 용출하였다. Cry1Da의 경우에, 방사성표지 절차를 수행하기 위해 요오드-겐 방법을 이용하였다. 이 절차를 이용함으로써, 우선 100 mM 인산염 완충액(pH 8) 내의 cry 독소를 작은 0.5 ㎖ polymyxin column에 수회 통과시킴으로써 리포폴리사카라이드(LPS)를 세정하였다. 요오드-겐 관(Pierce Chem. Co.)에 20 ㎍의 무-LPS Cry1Da 독소를 첨가한 후, 0.5 mCi의 Na125I를 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 15분 동안 흔들었다. 이 용액을 관으로부터 제거하였고, 0.2M 비-방사성표지된 NaI 50 ㎕를 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 완충액을 3번 바꾸면서 PBS에 대해 단백질을 투석하여 임의의 특이적 결합 125I를 제거하였다.
SDS-PAGE, 형광영상화 및 감마 계수에 의해 요오드화된 Cry 단백질의 방사성-순도를 측정하였다. 간략하게 말하면, 2 ㎕의 방사성 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 분리 후, 겔을 바이오라드 겔 건조 장치를 제조자의 지침에 따라 이용하여 건조시켰다. 건조된 겔을 마이라(Mylar) 필름(두께 12 ㎛)으로 랩핑하고 몰리큘러 다이나믹스(Molecular Dynamics) 저장 형광체 스크린(35 cm x 43 cm)에 1시간 동안 노출시킴으로써 영상화하였다. 몰리큘러 다이나믹스 스톰(Molecular Dynamics Storm) 820 형광영상화 장치를 사용하여 플레이트를 현상하였고, 영상을 이미지퀀트(ImageQuant™) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 방사성 밴드를 밴드 바로 위와 아래의 영역을 따라 레이저 블레이드를 사용하여 겔로부터 절단하였고, 감마 계수기에서 계수하였다. Cry 단백질 밴드 및 밴드 아래의 영역 내에서만 방사능을 검출하였다. 밴드 위에서는 방사능이 검출되지 않았고, 이는 모든 방사성 오염물이 말단절단된 Cry 단백질보다 작은 단백질 성분으로 이루어졌음을 나타낸다. 이들 성분은 분해 생성물을 나타낼 가능성이 가장 높다.
실시예 2 - BBMV 제제 프로토콜
가용화된 BBMV 의 제조 및 분획화 . 최종령의 스포도프테라 프루지페르다, 오스트리니아 누빌라리스 또는 헬레오티스 지아 유충을 밤새 금식시키고, 그 후에 얼음 상에서 15분 동안 냉각시킨 후에 아침에 절개하였다. 외피에 연결된 후장은 남겨두면서, 중장 조직을 체강으로부터 적출하였다. 중장을 9X 부피의 빙냉 균질화 완충액(300 mM 만니톨, 5 mM EGTA, 17 mM 트리스 염기, pH 7.5)에 넣고, 프로테아제 억제제 칵테일1(시그마 P-2714)을 보충하고, 공급자에 의해 권장되는 대로 희석하였다. 조직을 유리 조직 균질화기의 15회 스트로크로 균질화하였다. BBMV는 볼퍼스베르게르(Wolfersberger)(1993)의 MgCl2 침강법으로 제조하였다. 간략히 설명하면, 300 mM 만니톨 중의 24 mM MgCl2 용액의 동일한 부피를 중장 균질 현탁물과 혼합하고, 5분 동안 교반한 다음, 얼음 상에 15분 동안 정치해 두었다. 용액을 4℃에서 15분 동안 2,500 x g로 원심분리하였다. 상등액을 보관해 두고 펠릿을 원래 부피의 0.5-X 희석된 균질화 완충액에 현탁시킨 다음 다시 원심분리하였다. 두 상등액을 합쳐서 4℃에서 30분 동안 27,000 x g로 원심분리하여 BBMV 분획을 형성하였다. 펠릿을 10 ㎖의 균질화 완충액에 현탁시켰고, 프로테아제 억제제를 보충하였고, 4℃에서 30분 동안 27,000 x g로 원심분리하여 BBMV를 세척하였다. 생산된 펠릿을 BBMV 저장 완충액(10 mM HEPES, 130 mM KCl, 10% 글리세롤, pH 7.4)으로 약 3 mg/㎖의 단백질 농도까지 현탁시켰다. 단백질 농도를 표준물질로서 소 혈청 알부민(BSA)을 이용하는 브래드포드 방법(1976)을 사용하여 측정하였다. 알칼리성 포스파타제 측정을 제조사의 지침에 따라 시그마 검정(Sigma assay)을 사용하여 수행한 후에 샘플을 동결시켰다. BBMV 분획에서의 이 마커 효소의 특이적 활성(specific activity)은 통상적으로 중장 균질 현탁물 분획에서 측정된 것보다 7배 증가하였다. BBMV는 250 ㎕ 샘플로 분취하고, 액체 N2로 순간 동결시켜, -80℃에서 보관하였다.
(1 칵테일 성분의 최종 농도(μM)는 AEBSF (500), EDTA (250 mM), 베스타틴(Bestatin) (32), E-64 (0.35), 류펩틴(Leupeptin) (0.25) 및 아프로티닌(Aprotinin) (0.075)임.)
실시예 3 - BBMV 단백질에의 125 I Cry 단백질의 결합 측정 방법
BBMV 에의 125 I Cry 단백질의 결합. 포화 곡선을 만들어, 결합 검정에 사용하기 위한 BBMV 단백질의 최적량을 결정하였다. 125I 방사성표지된 Cry 단백질(0.5 nM)을 결합 완충액(8 mM NaHP04, 2 mM KH2PO4, 150 mM NaCl, 0.1% 소 혈청 알부민, pH 7.4) 중에서 0 내지 500 ㎍/㎖의 범위의 다양한 양의 BBMV 단백질과 함께 28℃에서 1시간 동안 배양하였다. 총 부피는 0.5㎖였다. 반응 혼합물 150 ㎕를 삼중으로 1.5 ㎖의 원심분리 튜브로부터 500 ㎕의 원심분리 튜브에 샘플링하여 넣고 샘플을 실온에서 6분 동안 14,000 x g로 원심분리함으로써, 결합된 125I Cry 단백질을 특이적 결합으로부터 분리하였다. 상등액을 부드럽게 제거하고 펠릿을 빙냉 결합 완충액으로 3회 세척하였다. 펠릿을 함유하는 원심분리기의 바닥을 잘라내어 13 x 75 mm 유리 배양 튜브에 넣었다. 샘플을 감마 계수기에서 각각 5분 동안 계수하였다. 샘플 내에 함유된 계수를 배경 계수(어떠한 단백질도 없는 반응)를 빼고, BBMV 단백질 농도에 대하여 플롯팅하였다. 사용되는 단백질의 최적량은 0.15 mg/㎖의 BBMV 단백질인 것으로 결정되었다.
포화 곡선을 만들어 결합 반응 속도론을 결정하였다. 간략하게 말하면, 0.01에서 10 nM까지의 범위로 125I Cry 독소의 농도를 증가시키면서 BBMV(150 ㎍/㎖)을 28℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기한 바와 같이 삼중으로 각 농도의 150 ㎕를 샘플링하고 샘플을 원심분리하고 계수하여 총 결합을 결정하였다. 1,000 nM의 상동 트립신화 비-방사성 Cry 독소를 모든 비-특이적 수용체 결합 부위를 포화시키도록 반응 혼합물에 첨가하면서, 동일한 방식으로 비-특이적 결합을 결정하였다. 특이적 결합을 총 결합과 비-특이적 결합 사이의 차이로서 연산하였다.
BBMV 단백질 150 ㎍/㎖ 및 125I 방사성표지된 Cry 단백질 0.5 nM를 사용하여 상동성 및 비상동성 경쟁 결합 검정을 수행하였다. 0.045에서 1,000 nM까지 범위의 농도의 경쟁적인 비-방사성표지된 Cry 독소를 반응 혼합물에 첨가하였고, 반사성 리간드와 동시에 첨가하여 진정한 결합 경쟁을 보장하였다. 상기한 바와 같이 28℃에서 1시간 동안 배양을 수행하였고, 그의 수용체 독소에 결합된 125I Cry 단백질의 양을 비-특이적 결합을 빼서 결정하였다. 100% 총 결합은 임의의 경쟁자 리간드 없이 측정하였다. 결과를 반대수(semi-logarithmic) 플롯 상에 % 총 특이적 결합 대 첨가된 경쟁 리간드의 농도로서 도시하였다.
실시예 4 - 결과들의 요약
도 1은 비표지된 상동성 Cry1Da(○) 및 비상동성 Cry1Ca(■)에 의한 경쟁에 대한 FAW로부터의 BBMV 내 125I Cry1Da(0.5 nM)의 % 특이적 결합을 도시한 것이다. Cry1Da에 의한 상동성 경쟁의 치환(displacement) 곡선은 약 1.5 nM에서 Cry1Da의 방사성리간드의 50% 치환을 나타내는 S자형의 곡선을 생산한다. Cry1Ca는 시험된 임의의 농도, 즉 최대 1,000 nM 또는 검정에 사용된 125I Cry1Da 농도의 2,000배까지에서 125I Cry1Da의 특이적 결합을 치환하지 않는다.
참고문헌
Figure pct00001
부록 A
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
SEQUENCE LISTING <110> Dow AGROSCIENCES LLC <120> COMBINED USE OF CRY1CA AND CRY1DA FOR MANAGEMENT OF RESISTANT INSECTS <130> DAS-P0197-US <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 619 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cry1Ca <400> 1 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly 20 25 30 Asn Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Val Ser 35 40 45 Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val 50 55 60 Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala 85 90 95 Ile Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu 100 105 110 Ala Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Lys Asn Pro Ala Thr Arg Thr 115 120 125 Arg Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp 130 135 140 Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val 165 170 175 Ile Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn 180 185 190 Tyr Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala 195 200 205 Asn Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln 210 215 220 Asp Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 Ile Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu 260 265 270 Ile Asn Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe 275 280 285 Asn Val Met Glu Asn Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile 290 295 300 Leu Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn 305 310 315 320 Phe Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gly Gly 325 330 335 Asn Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro 340 345 350 Arg Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro 355 360 365 Thr Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu 370 375 380 Arg Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr 385 390 395 400 Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu 405 410 415 Asp Asn Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His 420 425 430 Ala Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val 435 440 445 Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp 450 455 460 Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp 465 470 475 480 Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile 485 490 495 Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Asn Ile 500 505 510 Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser 515 520 525 Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Gly 530 535 540 Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys Thr Met Glu 545 550 555 560 Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser 565 570 575 Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly Ile Ser Glu 580 585 590 Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile 595 600 605 Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr 610 615 <210> 2 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cry1Da <400> 2 Met Glu Ile Asn Asn Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Lys Glu Ile Ile Leu Gly Glu Glu Arg Leu Glu Thr Gly Asn 20 25 30 Thr Val Ala Asp Ile Ser Leu Gly Leu Ile Asn Phe Leu Tyr Ser Asn 35 40 45 Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Val Gly Leu Leu Glu Leu Ile Trp 50 55 60 Gly Phe Ile Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ile Phe Leu Ala Gln Ile Glu 65 70 75 80 Gln Leu Ile Ser Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Lys Val Tyr Val Arg Ala 100 105 110 Phe Ser Asp Trp Glu Lys Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu 115 120 125 Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Ile Thr Ala Ile 130 135 140 Pro Leu Phe Arg Val Gln Asn Tyr Glu Val Ala Leu Leu Ser Val Tyr 145 150 155 160 Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Ile Leu Arg Asp Val Ser Val 165 170 175 Phe Gly Glu Arg Trp Gly Tyr Asp Thr Ala Thr Ile Asn Asn Arg Tyr 180 185 190 Ser Asp Leu Thr Ser Leu Ile His Val Tyr Thr Asn His Cys Val Asp 195 200 205 Thr Tyr Asn Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Gly Arg Phe Leu Ser Asp 210 215 220 Trp Ile Val Tyr Asn Arg Phe Arg Arg Gln Leu Thr Ile Ser Val Leu 225 230 235 240 Asp Ile Val Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Ile Arg Thr Tyr Pro Ile 245 250 255 Gln Thr Ala Thr Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Leu Asp Leu Pro Phe 260 265 270 Ile Asn Glu Asn Leu Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Phe Ser Ala 275 280 285 Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe Leu Asn 290 295 300 Ser Phe Thr Ile Tyr Thr Asp Ser Leu Ala Arg Tyr Ala Tyr Trp Gly 305 310 315 320 Gly His Leu Val Asn Ser Phe Arg Thr Gly Thr Thr Thr Asn Leu Ile 325 330 335 Arg Ser Pro Leu Tyr Gly Arg Glu Gly Asn Thr Glu Arg Pro Val Thr 340 345 350 Ile Thr Ala Ser Pro Ser Val Pro Ile Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Ile 355 360 365 Thr Gly Leu Asp Asn Ser Asn Pro Val Ala Gly Ile Glu Gly Val Glu 370 375 380 Phe Gln Asn Thr Ile Ser Arg Ser Ile Tyr Arg Lys Ser Gly Pro Ile 385 390 395 400 Asp Ser Phe Ser Glu Leu Pro Pro Gln Asp Ala Ser Val Ser Pro Ala 405 410 415 Ile Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Leu Glu Arg Ile 420 425 430 Ser Gly Pro Arg Ile Ala Gly Thr Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser 435 440 445 Ala Ser Pro Thr Asn Glu Val Ser Pro Ser Arg Ile Thr Gln Ile Pro 450 455 460 Trp Val Lys Ala His Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Val Ile Lys Gly 465 470 475 480 Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Thr Arg Asn Ser Met Gly Glu 485 490 495 Leu Gly Thr Leu Arg Val Thr Phe Thr Gly Arg Leu Pro Gln Ser Tyr 500 505 510 Tyr Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Val Ala Asn Arg Ser Gly Thr Phe 515 520 525 Arg Tyr Ser Gln Pro Pro Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Pro Lys Thr Met 530 535 540 Asp Ala Gly Glu Pro Leu Thr Ser Arg Ser Phe Ala His Thr Thr Leu 545 550 555 560 Phe Thr Pro Ile Thr Phe Ser Arg Ala Gln Glu Glu Phe Asp Leu Tyr 565 570 575 Ile Gln Ser Gly Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Thr 580 585 590 Ala Thr

Claims (23)

  1. Cry1Da 살곤충성 단백질을 코딩하는 DNA 및 Cry1Ca 살곤충성 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 유전자이식 식물.
  2. 제1항에 있어서, 제3의 살곤충성 단백질을 코딩하는 DNA를 더 포함하고, 상기 제3의 단백질은 Cry1Fa, Vip3Ab, Cry1Be 및 Cry1E로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자이식 식물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제3의 단백질이 Cry1Fa 및 Cry1Be로 이루어진 군으로부터 선택되고, 식물이 Cry2A, Cry1I, DIG-3 및 Cry1Ab로 이루어진 군으로부터 선택되는 제4 및 제5의 살곤충성 단백질을 코딩하는 DNA를 더 포함하는 유전자이식 식물.
  4. 상기 DNA를 포함하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 식물의 종자.
  5. 비-Bt 피난처(refuge) 식물이 경작지에서의 전체 작물 식물의 40% 미만을 차지하는, 비-Bt 피난처 식물 및 복수의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 식물을 포함하는 식물 경작지.
  6. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 상기 경작지에서의 전체 작물 식물의 30% 미만을 차지하는 식물 경작지.
  7. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 상기 경작지에서의 전체 작물 식물의 20% 미만을 차지하는 식물 경작지.
  8. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 상기 경작지에서의 전체 작물 식물의 10% 미만을 차지하는 식물 경작지.
  9. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 상기 경작지에서의 전체 작물 식물의 5% 미만을 차지하는 식물 경작지.
  10. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 블록 또는 구간(strip)으로 재식된 식물 경작지.
  11. 비-Bt 피난처 식물로부터의 피난처 종자가 혼합물 중의 전체 종자의 40% 미만을 차지하는, 비-Bt 피난처 식물로부터의 피난처 종자 및 복수의 제4항의 종자를 포함하는 종자 혼합물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 피난처 종자가 혼합물 중의 전체 종자의 30% 미만을 차지하는 종자 혼합물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 피난처 종자가 혼합물 중의 전체 종자의 20% 미만을 차지하는 종자 혼합물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 피난처 종자가 혼합물 중의 전체 종자의 10% 미만을 차지하는 종자 혼합물.
  15. 제11항에 있어서, 상기 피난처 종자가 혼합물 중의 전체 종자의 5% 미만을 차지하는 종자 혼합물.
  16. 종자를 제5항의 식물 경작지가 형성되도록 재식하는 것을 포함하는, 곤충에 의한 Cry 단백질에 대한 내성 발달의 관리 방법.
  17. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 10 에이커를 초과하여 차지하는 경작지.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 옥수수, 대두 및 목화로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물.
  19. 제18항에 있어서, 메이즈(maize) 식물인 식물.
  20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 식물의 식물 세포로서, 상기 Cry1Ca 살곤충성 단백질을 코딩하는 상기 DNA 및 상기 Cry1Da 살곤충성 단백질을 코딩하는 상기 DNA를 포함하며, 상기 Cry1Ca 살곤충성 단백질은 서열 1과 99% 이상 유사하고, 상기 Cry1Da 살곤충성 단백질은 서열 2와 99% 이상의 유사한 식물 세포.
  21. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cry1Ca 살곤충성 단백질이 서열 1을 포함하고, 상기 Cry1Da 살곤충성 단백질이 서열 2를 포함하는 것인 식물.
  22. 제20항의 식물 세포를 생산하는 방법.
  23. 밤나방 곤충(fall armyworm)을 Cry1Ca 살곤충성 단백질 및 Cry1Da 살곤충성 단백질과 접촉시킴으로써 밤나방 곤충을 방제하는 방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060342B (zh) * 2012-11-05 2014-05-21 福建农林大学 对水稻褐飞虱高毒力的Bt毒素 Cry1Ab-loop2-P2S和工程菌
UA124407C2 (uk) * 2013-06-14 2021-09-15 Монсанто Текнолоджі Елелсі Рекомбінантна молекула днк, яка надає рослині стійкості до лускокрилої комахи-шкідника, і спосіб її виявлення та використання
AR099800A1 (es) * 2014-03-21 2016-08-17 Agrigenetics Inc Cry1d para controlar el gusano de la mazorca del maíz
CN114213511A (zh) * 2014-12-30 2022-03-22 美国陶氏益农公司 可用于控制昆虫害虫的修饰的Cry1Ca毒素
EP3522698A4 (en) 2016-10-10 2020-07-29 Monsanto Technology LLC NEW INSECTICIDE PROTEINS
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CR20210046A (es) * 2018-07-30 2021-06-10 Monsanto Technology Llc Evento transgénico de maíz mon 95379 y métodos para su detección y usos
WO2022015619A2 (en) 2020-07-14 2022-01-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2935596A1 (de) 1979-09-04 1981-03-19 Ibm Deutschland Gmbh, 7000 Stuttgart Verfahren und anordnung zur steuerung einer aufzeichnungseinheit
EP0400246A1 (en) * 1989-05-31 1990-12-05 Plant Genetic Systems, N.V. Prevention of Bt resistance development
US5188960A (en) 1989-06-27 1993-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
US5273746A (en) 1992-01-29 1993-12-28 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates active against phthiraptera pests
GB9318207D0 (en) * 1993-09-02 1993-10-20 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US6603063B1 (en) * 1999-05-07 2003-08-05 Mycogen Corp. Plants and cells transformed with a nucleic acid from Bacillus thuringiensis strain KB59A4-6 encoding a novel SUP toxin
US5942664A (en) 1996-11-27 1999-08-24 Ecogen, Inc. Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants
AU6702300A (en) * 1999-08-19 2001-03-19 Syngenta Participations Ag Hybrid insecticidal toxins and nucleic acid sequences coding therefor
US7355099B2 (en) * 2003-02-20 2008-04-08 Athenix Corporation AXMI-004, a delta-endotoxin gene and methods for its use
MXPA05002541A (es) 2004-03-05 2006-04-27 Agrigenetics Inc Combinaciones de cry1fa como una herramienta para el control de la resistencia de los insectos.
PL1999141T3 (pl) 2006-03-21 2011-10-31 Bayer Cropscience Nv Nowe geny kodujące białka owadobójcze
MX2010011925A (es) 2008-05-01 2010-11-30 Bayer Bioscience Nv Manejo en plantas transgenicas de la resistencia de la oruga militar tardia.
BRPI1015333A2 (pt) * 2009-04-17 2016-05-24 Dow Agrosciences Llc "toxinas cry inseticidas dig-3"
PT2512225T (pt) 2009-12-16 2017-11-10 Dow Agrosciences Llc Utilização de vip3ab em combinação com cry1ca para a gestão de insetos resistentes
MX358710B (es) 2009-12-16 2018-08-31 Dow Agrosciences Llc Uso combinado de proteínas cry1da y cry1fa para el control de la resistencia de los insectos.
CN102821596B (zh) 2009-12-16 2015-09-16 陶氏益农公司 CRY1Ca和CRY1Fa蛋白在昆虫抗性管理中的组合应用
AU2010339919B2 (en) 2009-12-16 2016-01-21 Dow Agrosciences Llc Use of Cry1Da in combination with Cry1Be for management of resistant insects

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