KR20150060969A - 저항성 가을 거염벌레 곤충의 관리를 위한 조합에서의 Cry1Ea의 사용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가을 거염벌레 인시류 곤충을 방제하기 위한 방법 및 식물을 포함하며, 상기 식물은 곤충에 의한 저항성의 발생을 지연시키거나 또는 방지하기 위해 Cry1Ea 살곤충 단백질, 및 Cry1Ab, Cry1Be, Cry1Ca, Cry1Da 및 Vip3Ab의 군으로부터 선택된 제2 살곤충 단백질을 포함한다.

Description

저항성 가을 거염벌레 곤충의 관리를 위한 조합에서의 Cry1Ea의 사용 {USE OF CRY1EA IN COMBINATIONS FOR MANAGEMENT OF RESISTANT FALL ARMYWORM INSECTS}

상호 참조

본원은 2012년 10월 5일에 출원된 미국 가출원 61/710,154를 우선권 주장한다. 그의 전체 개시내용이 명백하게 본원에 참조로 포함된다.

인간은 식품 및 에너지 활용을 위해 옥수수를 재배한다. 인간은 또한 대두 및 목화를 비롯한, 수많은 다른 작물을 재배한다. 곤충은 식물을 먹고 피해를 입혀 이러한 인간의 노력을 헛되게 한다. 곤충 해충의 방제에 해마다 수십억 달러가 소비되고 있으며 이들이 끼치는 피해로 인해 추가로 수십억의 손해를 입고 있다. 합성 유기 화학적 살곤충제가 곤충 해충의 방제를 위해 사용되는 주요 수단이었으나, 생물학적 살곤충제, 예컨대 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) (Bt)로부터 유래된 살곤충 단백질도 일부 영역에서 중요한 역할을 수행하여 왔다. Bt 살곤충 단백질 유전자로의 형질전환을 통해 곤충-저항성 식물을 생산하는 능력은 현대 농업에 혁신을 가져왔으며 살곤충 단백질 및 그의 유전자의 중요성 및 가치를 높였다.

여러 Bt 단백질이 현재까지 성공적으로 등록되고 상업화된 곤충-저항성 트랜스제닉 식물을 생성하는데 사용되어 왔다. 이들은 옥수수에서의 Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F 및 Cry3Bb, 목화에서의 Cry1Ac 및 Cry2Ab, 및 감자에서의 Cry3A를 포함한다.

이들 단백질을 발현하는 상업적 제품은 2종의 단백질의 조합된 살곤충 범위가 바람직한 경우 (예를 들어, 각각 인시류 해충 및 뿌리벌레에 대한 저항성을 제공하도록 조합된 옥수수에서의 Cry1Ab 및 Cry3Bb) 또는 단백질의 독립적인 작용이 이들을 민감성 곤충 개체군에서의 저항성의 발생을 지연시키는 수단으로서 유용하게 만드는 경우 (예를 들어, 회색담배나방에 대한 저항성 관리를 제공하도록 조합된 목화에서의 Cry1Ac 및 Cry2Ab)를 제외하고는 단일 단백질을 발현한다. 또한, 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea) 또는 아르미게레인(armigerain)의 방제를 위한 Cry2 단백질 플러스 Vip3Aa, Cry1F 또는 Cry1A에 대한, 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0313717을 참조한다. WO 2009/132850은 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)를 방제하기 위한 Cry1F 또는 Cry1A 및 Vip3Aa에 대한 것이다. 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0311096은 부분적으로 Cry1F-저항성 ECB를 방제하기 위한 Cry1Ab에 대한 것이다.

즉, 이러한 기술을 신속하고 광범위하게 채택하도록 하는 곤충-저항성 트랜스제닉 식물의 특징 중 일부는 또한 해충 개체군에서 이들 식물에 의해 생산된 살곤충 단백질에 대한 저항성이 발생할 것이라는 우려를 일으킨다. 은신처와 조합하고, 상이한 독소와 교대로 또는 그와 공동-배치하여 고용량으로 단백질을 배치하는 것을 비롯하여, Bt-기반 내충성 형질의 유용성을 보존하기 위한 여러 전략이 제안되었다 (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16:144-146).

내충성 관리 (IRM) 스택에 사용하기 위해 선택된 단백질은, 하나의 단백질에 대해 발생된 저항성이 제2 단백질에 대한 저항성을 부여하지 않도록 (즉, 단백질에 대한 교차 저항성이 존재하지 않도록) 독립적으로 그의 살곤충 효과를 발휘할 필요가 있다. 예를 들어, "단백질 A"에 대해 저항성인 해충 개체군이 "단백질 B"에 대해 감수성인 경우에, 교차 저항성이 존재하지 않으며, 단백질 A 및 단백질 B의 조합이 단백질 A 단독에 대한 저항성을 지연시키는데 효과적일 것이라는 결론을 내릴 것이다.

저항성 곤충 개체군의 부재 하에, 작용 메카니즘 및 교차-저항성 잠재성과 관련될 것으로 추정되는 다른 특성에 기초하여 평가를 수행할 수 있다. 교차 저항성을 나타내지 않을 가능성이 있는 살곤충 단백질의 동정에서의 수용체-매개 결합의 유용성이 제안되었다 (van Mellaert et al. 1999). 이러한 접근법에서 특유한 교차 저항성 결여의 핵심적 예측변수는 살곤충 단백질이 감수성 곤충 종에서 수용체에 대해 경쟁하지 않는다는 것이다.

2종의 Bt 독소가 동일한 수용체에 대해 경쟁하는 경우에, 그 수용체가 그 곤충에서 독소 중 하나가 그 수용체에 더 이상 결합하지 않도록 돌연변이되고, 이에 따라 더 이상 곤충에 대해 살곤충성이 아니라면, 이는 곤충이 또한 (동일한 수용체에 경쟁적으로 결합된) 제2 독소에 대해 저항성이 되는 사례일 수 있다. 즉, 곤충은 Bt 독소 둘 다에 대해 교차-저항성인 것으로 언급된다. 그러나, 2종의 독소가 2종의 상이한 수용체와 결합한다면, 이는 곤충이 그 2종의 독소에 대한 저항성을 동시에 발생시키지 않을 것이라는 지표일 수 있다.

대표적인 Cry 독소는 공식 Bt 명명 위원회의 웹사이트 (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)에 열거되어 있다. 현재 거의 60개의 주요 그룹의 "Cry" 단백질 (Cry1-Cry59)이 추가의 Cyt 단백질 및 VIP 단백질 등과 함께 존재한다. 각 번호의 그룹 중 다수는 대문자 하위군을 갖고, 대문자 하위군은 소문자 하위-하위군을 갖는다. (예를 들어, Cry1은 A-L을 갖고, Cry1A는 a-i를 가짐).

본 발명은 부분적으로 살곤충 단백질, Cry1Ea가 가을 거염벌레 (FAW; 스포도프테라 프루기페르다) 소화관 세포 막 수용체 제제와의 결합에 대해 Cry1Ab, Cry1Be, Cry1Ca, Cry1Da 또는 VIP3Ab와 경쟁하지 않는다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 통상의 기술자가 본 개시내용의 이익을 인지하게 되는 바와 같이, 서로 경쟁적으로 결합하지 않는 임의의 본 발명의 단백질 쌍 (전장 단백질의 살곤충성 부분 포함)을 생산하는 식물은 임의의 이들 살곤충 단백질 단독에 대한 내성의 발생을 지연시키거나 또는 방지할 수 있다.

따라서, 본 발명은 부분적으로 Cry1Ab, Cry1Be, Cry1Ca, Cry1Da 및/또는 VIP3Ab 단백질과 조합된 Cry1Ea 단백질의 사용에 관한 것이다. 본원에 기재된 다른 단백질 중 적어도 하나와 함께 Cry1Ea를 생산하는 식물 (및 이러한 식물을 심은 에이커 면적)이 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명은 또한 부분적으로 3종의 (또는 그 초과의) 독소의 삼중 스택 또는 "피라미드"에 관한 것이며, 여기서 스택에서의 단백질 중 적어도 하나가 Cry1Ea이다. 일부 바람직한 피라미드 실시양태에서, 선택된 독소의 조합은 FAW에 대한 비-교차-저항성 작용을 생성한다. 일부 바람직한 "3개 작용 부위" 피라미드 조합은 FAW를 표적화하기 위한 단백질 (Cry1Ea 플러스 Cry1Ab, Cry1Ca, Cry1Da, Vip3Ab 또는 Cry1Be) 및 추가의 Bt 단백질의 본 발명의 염기 쌍 중 하나를 포함한다. 이들 특정한 3중 스택은 본 발명에 따라 유리하게 및 놀랍게도 FAW에 대한 3개 작용 부위를 제공한다. 이는 은신처 에이커 면적에 대한 요건의 감소 또는 제거에 도움이 될 수 있다.

도 1은 비표지된 상동 Cry1Ea 및 이종 Cry1Ab에 의한 경쟁에 대한 FAW로부터의 BBMV에서의 ¹²⁵I Cry1Ea (0.5 nM)의 % 특이적 결합을 보여준다.
도 2는 FAW 유충으로부터의 BBMV에 대한 ¹²⁵I Cry1Ab의 결합 및 비표지된 Cry1Ab의 농도 증가에 의한 그의 후속 치환을 보여준다.
도 3은 비표지된 상동 Cry1Ea 및 이종 Cry1Ca에 의한 경쟁에 대한 FAW로부터의 BBMV에서의 ¹²⁵I Cry1Ea의 % 특이적 결합을 보여준다.
도 4는 ¹²⁵I Cry1Ea를 FAW 유충으로부터의 BBMV에 결합시키고, Cry1Ea, Cry1Be, Cry1Da 및 VIP3Ab1 리간드를 후속 첨가한 결합 검정의 결과를 보여준다.
서열의 간단한 설명
서열 1은 1148-아미노산 Cry1Ea 단백질 (Cry1Ab 독소전구물질 절편을 가짐)의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 2는 전장 (1155개 아미노산) Cry1Ab 단백질의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 3은 1186-아미노산 Cry1Be 단백질 (Cry1Ab 독소전구물질 절편을 가짐)의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 4는 1164-아미노산 Cry1Ca 단백질 (Cry1Ab 독소전구물질 절편을 가짐)의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 5는 1139-아미노산 Cry1Da 단백질 (Cry1Ab 독소전구물질 절편을 가짐)의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 6은 전장 Vip3Ab 단백질의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 7은 프로테아제-처리된 Cry1Ea 단백질의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 8은 프로테아제-처리된 Cry1Ab 단백질의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 9는 프로테아제-처리된 Cry1Be 단백질의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 10은 프로테아제-처리된 Cry1Ca 단백질의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 11은 프로테아제-처리된 Cry1Da 단백질의 아미노산 서열을 보여준다.

본 발명은 부분적으로 Cry1Ea가 특유하고 독립적인 작용 방식을 가지며, 가을 거염벌레 (FAW; 스포도프테라 프루기페르다)의 소화관에서의 결합 부위에 대해 Cry1Ab, Cry1Be, Cry1Ca, Cry1Da 또는 VIP3Ab1과 경쟁하지 않는다는 놀라운 발견에 대한 것이다. 따라서, Cry1Ea 단백질은 트랜스제닉 옥수수 (및 다른 식물; 예를 들어 목화)에서 Cry1Ab, Cry1Be, Cry1Ca, Cry1Da 및/또는 VIP3Ab1 단백질과 조합하여 사용되어, FAW에서 이들 단백질 단독에 대한 저항성이 발생하는 것을 지연시키거나 또는 방지할 수 있다. 본원에 개시된 다른 Cry 또는 VIP 단백질과 함께 사용되는 본 발명의 단백질은 식물 (예컨대, 옥수수 식물 및/또는 대두 식물)을 Cry-저항성 가을 거염벌레에 의한 손상으로부터 보호하는데 효과적일 수 있다. 즉, 본 발명의 하나의 용도는 옥수수 및 다른 경제적으로 중요한 식물 종을 단일 Cry 또는 VIP 단백질에 대한 저항성이 발생할 수 있는 가을 거염벌레 개체군에 의해 유발되는 손상 및 수확량 손실로부터 보호하는 것이다.

따라서, 본 발명은 그 자체로 사용되는 이들 단백질 중 하나에 대한 저항성이 FAW에 의해 발생하는 것을 방지하거나 또는 완화하기 위한, Cry1Ea, 및 Cry1Ab, Cry1Be, Cry1Ca, Cry1Da 및/또는 VIP3Ab1을 포함하는 곤충 저항성 관리 (IRM) 스택을 교시한다.

본 발명은 FAW를 방제하기 위한 조성물을 포함하며, 여기서 조성물은 Cry1Ea 살곤충 단백질, 및 Cry1Ab, Cry1Be, Cry1Ca, Cry1Da 및/또는 VIP3Ab1 살곤충 단백질을 포함한다. 본 발명의 조성물은 식물 및 식물 세포를 포함한다.

본 발명은 Cry1Ea 살곤충 단백질, 및 Cry1Ab, Cry1Be, Cry1Ca, Cry1Da 또는 VIP3Ab1 살곤충 단백질을 둘 다 생산하도록 형질전환된 숙주를 추가로 포함하며, 여기서 상기 숙주는 미생물 또는 식물 세포이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)는 바람직하게는 비-바실루스-투린기엔시스 프로모터(들)의 제어 하의 유전자 구축물에 있다. 용어 "단리된" 및 "이종"은 폴리펩티드 또는 DNA 분자가 인간의 손을 비롯하여 그의 천연 환경과 상이한 상태에 있음을 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 식물에서의 증진된 발현을 위한 코돈 용법을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 FAW를 방제하는 방법을 포함하며, 여기서 방법은 상기 FAW 또는 상기 FAW의 환경을 본 발명의 Cry1Ea 코어 독소-함유 단백질 쌍을 함유하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 Cry1Ea 살곤충 단백질 쌍을 코딩하는 식물-발현 유전자를 포함하는 식물 (옥수수, 대두 및 목화를 포함할 수 있음) 및 이러한 식물의 종자를 포함한다.

본 발명의 추가 실시양태는 본 발명의 Cry1Ea 살곤충 단백질 쌍을 코딩하는 식물-발현 유전자가 유전자이입된 식물, 및 이러한 식물의 종자를 포함한다.

실시예에 기재된 바와 같이, 방사성표지된 Cry1Ea 단백질 및/또는 방사성표지된 Cry1Ab 단백질을 사용하는 경쟁적 수용체 결합 연구는 Cry1Ab, Cry1Be, Cry1Ca, Cry1Da 및 VIP3Ab1 단백질이 Cry1Ea가 결합하는 FAW 중장 솔가장자리 막 소포에서의 결합에 대해 Cry1Ea와 경쟁하지 않는다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 또한 Cry1Ea 및 이들 다른 단백질의 조합이 FAW 개체군에서의 이들 단백질에 대한 저항성의 발생을 완화시키는데 효과적인 수단일 수 있음을 나타낸다. 따라서, 부분적으로 본원에 기재된 데이터에 기초하여, Cry1Ea 및 Cry1Ab, Cry1Ca, Cry1Be, Cry1Da 및/또는 VIP3Ab1 단백질의 공동-생산 (스태킹)이 FAW의 방제/억제/사멸을 위한 고용량 IRM 스택을 생성하는데 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

다른 단백질이 본 발명의 쌍에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 또한 부분적으로 본 발명의 쌍이 염기 쌍인 3종 (또는 그 초과)의 독소의 삼중 스택 또는 "피라미드"에 관한 것이다. 일부 바람직한 피라미드 실시양태에서, 선택된 독소는 FAW에 대해 3가지 개별 작용 방식을 갖는다. 일부 바람직한 "3가지 작용 방식" 피라미드 조합은 본 발명의 단백질의 염기 쌍 플러스 FAW의 표적화를 위한 제3 단백질을 포함한다. "개별 작용 부위"는 주어진 단백질 중 어느 것도 서로에 대해 교차-저항성을 유발하지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명에 따라, 이들 특정한 삼중 스택은 유리하고 놀랍게도 FAW에 대한 3개 작용 부위를 제공한다. 이는 은신처 에이커 면적의 요건의 감소 또는 제거에 도움이 될 수 있다.

따라서, 하나의 전개 옵션은 본 발명의 단백질 쌍을 제3 독소/유전자와 조합하여 사용하고, 이 3중 스택을 사용하여 FAW에서의 이들 독소 중 임의의 것에 대한 저항성의 발생을 완화시키는 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 부분적으로, 3종 (또는 그 초과)의 독소의 삼중 스택 또는 "피라미드"에 관한 것이다. 일부 바람직한 피라미드 실시양태에서, 선택된 독소는 FAW에 대해 3개 개별 작용 부위를 갖는다.

FAW가 저항성 개체군을 발생시킬 수 있는 작물-재배 영역에서 본 발명의 단백질의 2종, 3종 또는 그 초과의 단백질을 사용하는 것이 본 발명의 전개 옵션 중에 포함될 것이다.

임의의 본 발명의 단백질 조합을 생성하는 식물 (및 이러한 식물을 심은 에이커 면적)이 본 발명의 범위에 포함된다. 추가의 독소/유전자가 또한 부가될 수 있으나, 상기 논의된 특정한 스택은 유리하고 놀랍게도 FAW에 대한 다중 작용 부위를 제공한다. 이는 은신처 에이커 면적의 요건의 감소 또는 제거에 도움이 될 수 있다. 따라서, 10 에이커 초과가 심어진 재배지가 본 발명에 포함된다.

또한, 진뱅크(GENBANK)를 이용하여 본원에 개시되거나 또는 언급된 임의의 유전자 및 단백질의 서열을 입수할 수 있다. 관련 서열은 또한 특허에서 이용가능하다. 대표적인 Cry 독소는 공식 Bt 명명 위원회의 웹사이트 (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/) 상에 열거되어 있다. 현재 약 70개의 주요 그룹의 "Cry" 단백질 (Cry1-Cry70)이 추가의 VIP 단백질 등과 함께 존재한다.

본원에 기재된 단백질의 조합은 인시류 해충을 방제하는데 사용될 수 있다. 성체 인시류, 예를 들어 나비 및 나방은 주로 꽃의 꿀을 섭취하며, 수분의 유의한 효과인자이다. 거의 모든 인시류 유충, 즉 모충은 식물을 섭취하며, 다수가 심각한 해충이다. 모충은 식물의 잎 또는 잎 내부 또는 뿌리 또는 줄기를 섭취하며, 식물의 영양분을 빼앗고 종종 식물의 물리적 지지 구조를 파괴한다. 추가로, 모충은 과일, 직물 및 저장된 곡물 및 가루를 섭취하며, 이들 판매용 제품을 엉망으로 만들거나 그 가치를 심각하게 감소시킨다. 본원에 사용된 바와 같이, 인시류 해충에 관한 언급은 유충 단계를 포함한 해충의 다양한 생애 단계를 지칭한다.

본 발명의 일부 키메라 단백질은 전체 Bt 단백질 독소의 전체 N-말단 코어 독소 영역을 포함하며, 코어 독소 부분의 말단을 지나 일부 지점에서 단백질은 이종 독소전구물질 서열로의 전이를 갖는다. Bt 단백질 독소의 살충 활성인 N-말단 독소 부분은 "코어" 독소로 지칭된다. 코어 독소에 대해 C-말단인 부분은 "독소전구물질" 절편 또는 부분으로 지칭된다. 코어 독소 절편으로부터 이종 독소전구물질 절편으로의 전이는 대략적으로 코어 독소/독소전구물질 연결부에서 발생할 수 있거나, 또는 대안적으로 천연 독소전구물질의 부분이 하류에서 발생하는 이종 독소전구물질로의 전이와 함께 유지될 수 있다.

예로서, 본 발명의 한 키메라 단백질은 Cry1Ea의 전체 코어 독소 부분 (대략 처음 600개의 아미노산) 및/또는 이종 독소전구물질 (C-말단까지의 나머지 아미노산)이다. 한 바람직한 실시양태에서, 독소전구물질을 포함하는 키메라 단백질의 부분은 Cry1Ab 독소로부터 유래된다. Vip3Ab 이외에도, 본 발명에 따라 사용하기 위한 모든 단백질은 유사한 전장 및 코어 독소 크기 및 구조를 공유한다.

통상의 기술자는 Bt 단백질 독소가, 심지어는 Cry1Ea와 같은 특정 부류 내에서, 길이가 어느 정도 달라질 것이며, 코어 독소로부터 독소전구물질로의 전이의 정확한 위치가 또한 달라질 것임을 이해할 것이다. 전형적으로, Cry1Ea 단백질은 예를 들어 길이가 약 1150 내지 약 1200개 아미노산이다. 코어 독소 부분으로부터 독소전구물질 부분으로의 전이는 전형적으로 전장 독소의 약 50% 내지 약 60%에서 일어날 것이다. 본 발명의 키메라 단백질은 이 N-말단 코어 독소 영역의 전체 확장부를 포함할 것이다. 따라서, 키메라 단백질은 Cry1 Bt 독소 단백질의 전체 길이의 적어도 약 50%를 포함할 것이다. 이는 전형적으로 적어도 약 590개 아미노산일 것이다. 독소전구물질 부분과 관련하여, Cry1Ab 독소전구물질 부분의 전체 확장부는 코어 독소 부분의 말단으로부터 분자의 C-말단까지 연장된다.

유전자 및 독소. 본 발명에 따라 유용한 유전자 및 독소는 개시된 전장 서열 뿐만 아니라 이들 서열, 변이체, 돌연변이체, 및 융합 단백질의 단편 (본원에 구체적으로 예시된 코어 독소의 특징적인 살곤충 활성을 보유함)을 포함한다. 본원에 사용된 용어 유전자의 "변이체" 또는 "변이"는 동일한 독소를 코딩하거나 살충 활성을 갖는 등가의 독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "등가의 독소"는 표적 해충에 대해 청구된 독소와 동일하거나 본질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 독소를 지칭한다.

본원에 사용된 경계는, 문헌 ["Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins," N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813]에 따라 대략 95% (Cry1Ea), 78% (Cry1E), 및 45% (Cry1) 서열 동일성을 나타낸다. 이들 컷 오프는 또한 오직 코어 독소에만 적용될 수 있다.

통상의 기술자에게 활성 독소를 코딩하는 유전자가 몇몇 수단을 통해 확인 및 수득될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 본원에 예시된 특정 유전자 또는 유전자 부분은 배양물 기탁기관에 기탁된 분리물로부터 수득할 수 있다. 이들 유전자, 또는 그의 부분 또는 변이체는 또한, 예를 들어 유전자 합성기를 이용하여 합성에 의해 구축될 수 있다. 유전자 변이는 점 돌연변이를 만들기 위한 표준 기술을 이용하여 용이하게 구축될 수 있다. 또한, 이들 유전자의 단편은 표준 절차에 따라 상업적으로 이용가능한 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 사용하여 만들 수 있다. 예를 들어, 효소, 예컨대 Bal31 또는 부위-지정 돌연변이유발이 이들 유전자의 말단으로부터 뉴클레오티드를 체계적으로 절단하는데 사용될 수 있다. 활성 단편을 코딩하는 유전자는 또한 다양한 제한 효소를 사용하여 수득될 수 있다. 프로테아제를 사용하여 이들 단백질 독소의 활성 단편을 직접 수득할 수 있다.

예시된 독소의 살충 활성을 보유하는 단편 및 등가물은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 또한, 유전자 코드의 축중성으로 인해, 다양한 상이한 DNA 서열이 본원에 개시된 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 동일한, 또는 본질적으로 동일한 독소를 코딩하는 이들 대안적 DNA 서열을 생성하는 것은 관련 기술분야의 숙련자의 기술 범위 내에 널리 포함된다. 이들 변이체 DNA 서열은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본원에 사용된 "본질적으로 동일한" 서열의 언급은 살충 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 삽입을 갖는 서열을 지칭한다. 살충 활성을 보유하는 단백질을 코딩하는 유전자의 단편이 또한 이 정의에 포함된다.

본 발명에 따라 유용한 독소 및 유전자 부분을 코딩하는 유전자를 확인하기 위한 추가의 방법은 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용을 통한 것이다. 이들 프로브는 검출가능한 뉴클레오티드 서열이다. 이들 서열은 적절한 표지에 의해 검출가능할 수 있거나 국제 출원 번호 WO93/16094에 기재된 바와 같이 본질적으로 형광체로 만들어질 수 있다. 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 프로브 분자 및 핵산 샘플이 두 분자 사이의 강한 결합 형성에 의해 혼성화되는 경우에, 프로브 및 샘플은 실질적 상동성을 갖는 것으로 타당하게 가정될 수 있다. 바람직하게는, 혼성화는, 예를 들어 문헌 [Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170]에 기재된 바와 같이 관련 기술분야에 널리 공지된 기술에 의해 엄격한 조건 하에 수행된다. 염 농도 및 온도 조합의 일부 예는 다음과 같다 (엄격성이 증가하는 순서대로): 실온에서 2X SSPE 또는 SSC; 42℃에서 1X SSPE 또는 SSC; 42℃에서 0.1X SSPE 또는 SSC; 65℃에서 0.1X SSPE 또는 SSC. 프로브의 검출은 혼성화가 일어났는지 여부를 공지된 방식으로 결정하는 수단을 제공한다. 이러한 프로브 분석은 본 발명의 독소-코딩 유전자를 확인하는 신속한 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 프로브로 사용되는 뉴클레오티드 절편은 DNA 합성기 및 표준 절차를 이용하여 합성될 수 있다. 이들 뉴클레오티드 서열은 또한 본 발명의 유전자를 증폭하기 위한 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다.

변이체 독소. 본 발명의 특정 독소가 본원에 구체적으로 예시된다. 이들 독소는 단지 본 발명의 독소의 예시이므로, 본 발명이 예시된 독소와 동일한 또는 유사한 살충 활성을 갖는 변이체 또는 등가의 독소 (및 등가의 독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)를 포함한다는 것이 용이하게 명백해질 것이다. 등가의 독소는 예시된 독소와 아미노산 상동성을 가질 것이다. 이 아미노산 상동성은 전형적으로 75% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 95% 초과일 것이다. 아미노산 상동성은 생물학적 활성을 설명하거나 또는 궁극적으로 생물학적 활성을 담당하는 3차원 구조의 결정에 관련된 독소의 임계 영역에서 가장 높을 것이다. 이와 관련하여, 특정 아미노산 치환이 허용가능하고, 이러한 치환이 활성에 중요하지 않은 영역에 있거나 분자의 3차원 구조에 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환인 경우에 예상될 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 하기 부류로 분류될 수 있다: 비극성, 비하전된 극성, 염기성 및 산성. 한 부류의 아미노산이 동일한 유형의 또 다른 아미노산으로 교체되는 보존적 치환은 치환이 화합물의 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 각 부류에 속하는 아미노산의 예를 하기에 나열한다.

일부 경우에, 비-보존적 치환이 또한 만들어질 수 있다. 결정적 요소는 이들 치환이 독소의 생물학적 활성을 유의하게 손상시키지 않아야 한다는 것이다.

재조합 숙주. 본 발명의 독소를 코딩하는 유전자는 광범위한 미생물 또는 식물 숙주로 도입될 수 있다. 독소 유전자의 발현은, 직접적으로 또는 간접적으로, 살충제의 세포내 생성 및 유지를 초래한다. 접합 전달 및 재조합 전달이 본 발명의 독소를 둘 다 발현하는 Bt 균주를 생성하는데 사용될 수 있다. 다른 숙주 유기체가 또한 독소 유전자 중 하나 또는 둘 다로 형질전환된 후에 사용되어 상승작용 효과를 달성할 수 있다. 적합한 미생물 숙주, 예를 들어 슈도모나스(Pseudomonas)를 사용하여, 미생물은 해충이 있는 장소에 적용될 수 있고, 여기서 이들은 증식하고 섭취될 것이다. 그 결과는 해충의 방제이다. 대안적으로, 독소 유전자의 숙주인 미생물은 독소의 활성을 연장시키고 세포를 안정화시키는 조건 하에 처리될 수 있다. 이어서, 독성 활성을 보유하는 처리된 세포는 표적 해충의 환경에 적용될 수 있다.

Bt 독소 유전자가 적합한 벡터를 통해 미생물 숙주로 도입되고, 상기 숙주가 살아있는 상태로 환경에 적용되는 경우에, 특정 숙주 미생물이 사용되는 것이 필수적이다. 하나 이상의 관심 작물의 "식물권(phytosphere)" (엽면, 엽권, 근권 및/또는 근면)을 점유하는 것으로 공지된 미생물 숙주가 선택된다. 이들 미생물은 특정한 환경 (작물 및 다른 곤충 서식지)에서 야생형 미생물과 성공적으로 경쟁할 수 있는 것으로 선택되고, 폴리펩티드 살충제를 발현하는 유전자의 안정한 유지 및 발현을 제공하며, 바람직하게는 환경적 분해 및 불활성화로부터 살충제의 개선된 보호를 제공한다.

다수의 미생물이 광범위한 중요 작물의 엽면 (식물 잎의 표면) 및/또는 근권 (식물 뿌리 주변의 토양)에서 서식하는 것으로 알려져 있다. 이들 미생물은 박테리아, 조류 및 진균을 포함한다. 미생물, 예컨대 박테리아, 예를 들어 속 슈도모나스, 에르위니아(Erwinia), 세라티아(Serratia), 클레브시엘라(Klebsiella), 크산토모나스(Xanthomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces), 리조비움(Rhizobium), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 메틸로필리우스(Methylophilius), 아그로박테눔(Agrobactenum), 아세토박터(Acetobacter), 락토바실루스(Lactobacillus), 아르트로박터(Arthrobacter), 아조토박터(Azotobacter), 류코노스톡(Leuconostoc), 및 알칼리게네스(Alcaligenes); 진균, 특히 효모, 예를 들어 속 사카로미세스(Saccharomyces), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 스포로볼로미세스(Sporobolomyces), 로도토룰라(Rhodotorula), 및 아우레오바시디움(Aureobasidium)이 특히 흥미롭다. 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 아세토박터 크실리늄(Acetobacter xylinum), 아그로박테니움 투메파시엔스(Agrobactenium tumefaciens), 로도슈도모나스 스페로이데스(Rhodopseudomonas spheroides), 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 리조비움 멜리오티(Rhizobium melioti), 알칼리게네스 엔트로푸스(Alcaligenes entrophus), 및 아조토박터 빈란디이(Azotobacter vinlandii)와 같은 식물권 박테리아 종; 및 로도토룰라 루브라(Rhodotorula rubra), 알. 글루티니스(R. glutinis), 알. 마리나(R. marina), 알. 아우란티아카(R. aurantiaca), 크립토코쿠스 알비두스(Cryptococcus albidus), 씨. 디플루엔스(C. diffluens), 씨. 라우렌티이(C. laurentii), 사카로미세스 로세이(Saccharomyces rosei), 에스. 프레토리엔시스(S. pretoriensis), 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae), 스포로볼로미세스 로세우스(Sporobolomyces roseus), 에스. 오도루스(S. odorus), 클루이베로미세스 베로나에(Kluyveromyces veronae), 및 아우레오바시디움 폴루란스(Aureobasidium pollulans)와 같은 식물권 효모 종이 특히 흥미롭다. 유색 미생물이 특히 흥미롭다.

유전자의 안정한 유지 및 발현을 허용하는 조건 하에 독소를 코딩하는 Bt 유전자를 미생물 숙주 내로 도입하기 위한 매우 다양한 방법이 이용가능하다. 이들 방법은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,135,867에 기재되어 있다.

세포 처리. 바실루스 투린기엔시스 또는 Bt 독소를 발현하는 재조합 세포는 독소 활성이 연장되고 세포가 안정화되도록 처리될 수 있다. 형성된 살충제 마이크로캡슐은 안정화된 세포 구조물 내에 Bt 독소 또는 독소들을 포함하며, 마이크로캡슐이 표적 해충의 환경에 적용될 때 독소를 보호할 것이다. 적합한 숙주 세포는, 보통 포유동물과 같은 고등 유기체에게 독성인 물질을 생산하지 않는 세포로 제한되는, 원핵생물 또는 진핵생물을 포함할 수 있다. 그러나, 고등 유기체에게 독성인 물질을 생산하는 유기체도 사용될 수 있으며, 이 경우에 독성 물질은 불안정하거나 적용 수준이 포유동물 숙주에 대한 독성의 어떠한 가능성도 피할 정도로 충분히 낮은 것이다. 숙주로서, 원핵생물 및 하등 진핵생물, 예컨대 진균이 특히 흥미로울 것이다.

세포는 통상적으로 무손상일 것이며, 처리시에 포자 형태보다는 실질적으로 증식 형태일 것이지만, 일부 경우에는 포자가 사용될 수 있다.

미생물 세포, 예를 들어 Bt 독소 유전자 또는 유전자들을 함유하는 미생물의 처리는, 기술이 독소의 특성에 불리하게 영향을 미치지 않거나, 독소를 보호하는 세포 능력을 약화시키지 않는 한, 화학적 또는 물리적 수단, 또는 화학적 수단 및/또는 물리적 수단의 조합에 의한 것일 수 있다. 화학 시약의 예는 할로겐화제, 특히 원자 번호 17-80의 할로겐이다. 보다 특히, 아이오딘을 목적하는 결과를 달성하기에 충분한 시간 동안 온화한 조건 하에 사용할 수 있다. 다른 적합한 기술은 알데히드, 예컨대 글루타르알데히드; 항감염제, 예컨대 제피란 클로라이드 및 세틸피리디늄 클로라이드; 알콜, 예컨대 이소프로필 및 에탄올; 다양한 조직학적 고정제, 예컨대 루골(Lugol) 아이오딘, 보우인(Bouin) 고정제, 다양한 산 및 헬리(Helly) 고정제 (문헌 [Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967] 참조); 또는 세포가 숙주 환경에 투여될 때 세포에서 생산된 독소의 활성을 연장시키고 보존하는 물리적 (열) 및 화학적 작용제의 조합에 의한 처리를 포함한다. 물리적 수단의 예는 단파장 방사선, 예컨대 감마-방사선 및 X-방사선, 동결, UV 조사, 동결건조 등이다. 미생물 세포의 치료 방법은 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 4,695,455 및 4,695,462에 개시되어 있다.

세포는 일반적으로 환경 조건에 대한 저항성을 증진시킬 증진된 구조화 안정성을 가질 것이다. 살충제가 전구형태인 경우에, 세포 처리 방법은 살충제의 전구형태에서 성숙 형태로의 처리가 표적 해충 병원체에 의해 억제되지 않도록 선택되어야 한다. 예를 들어, 포름알데히드는 단백질을 가교시킬 것이고 폴리펩티드 살충제의 전구형태의 처리를 억제할 수 있다. 처리 방법은 독소의 생물학적 이용가능성 또는 생물활성의 적어도 실질적인 부분을 유지해야 한다.

생산 목적을 위해 숙주 세포를 선택할 때에 특히 흥미로운 특징은 Bt 유전자 또는 유전자들을 숙주로 용이하게 도입하는 것, 발현 시스템의 이용가능성, 발현 효율, 숙주에서의 살충제의 안정성, 및 보조적 유전자 능력의 존재를 포함한다. 살충제 마이크로캡슐로서 사용하는 경우에 흥미로운 특징은 살충제를 위한 보호 특징, 예컨대 두꺼운 세포벽, 색소침착, 및 세포내 패키징 또는 봉입체의 형성; 수성 환경에서의 생존; 포유동물 독성의 결여; 해충이 섭취하도록 하기 위한 유인성; 독소에 대한 손상이 없는 사멸 및 고정의 용이성 등을 포함한다. 다른 고려사항은 제제 및 취급의 용이성, 경제성, 저장 안정성 등을 포함한다.

세포의 성장. Bt 살곤충 유전자 또는 유전자들을 함유하는 세포성 숙주는 임의의 편리한 영양 배지에서 성장시킬 수 있고, 여기서 DNA 구축물은 실질적으로 모든 또는 모든 세포가 Bt 유전자를 보유하도록 선택 배지를 제공하는 선택적 이점을 제공한다. 이어서, 이들 세포를 종래의 방식에 따라 수거할 수 있다. 대안적으로, 세포를 처리한 후에 수거할 수 있다.

본 발명의 독소를 생산하는 Bt 세포는 표준 기술 배지 및 발효 기술을 이용하여 배양할 수 있다. 발효 주기 완료시에, 먼저 관련 기술분야에 널리 공지된 수단에 의해 Bt 포자 및 결정을 발효 브로쓰로부터 분리함으로써 박테리아를 수거할 수 있다. 회수된 Bt 포자 및 결정은 계면활성제, 분산제, 불활성 담체, 및 특정한 표적 해충에 대한 취급 및 적용을 용이하게 하는 다른 성분을 첨가함으로써 습윤성 분말, 액체 농축물, 과립 또는 다른 제제로 제제화될 수 있다. 이들 제제 및 적용 절차는 모두 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

제제. 유인제, 및 Bt 단리물의 포자, 결정체 및 독소를 함유하는 제제화된 유인제 과립, 또는 본원에 개시된 Bt 단리물로부터 수득가능한 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 토양에 적용할 수 있다. 제제화된 생산물은 또한 작물 주기의 후기 단계에서 종자-코팅 또는 뿌리 처리 또는 전체 식물 처리로서 적용될 수 있다. Bt 세포의 식물 및 토양 처리는 무기 미네랄 (필로실리케이트, 카르보네이트, 술페이트, 포스페이트 등) 또는 식물성 물질 (분말 옥수수자루, 왕겨, 호두 껍질 등)과 같은 다양한 불활성 물질과 혼합함으로써, 습윤성 분말, 과립 또는 분진으로 사용될 수 있다. 제제는 스프레더-스티커 아주반트, 안정화제, 다른 살충 첨가제, 또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 액체 제제는 수성-기반 또는 비-수성일 수 있고, 발포체, 겔, 현탁액, 유화성 농축물 등으로서 사용될 수 있다. 성분은 유동제, 계면활성제, 유화제, 분산제, 또는 중합체를 포함할 수 있다.

통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 살충 농도는 특정한 제제의 특성, 특히 농축물인지 또는 직접 사용될 것인지에 따라 광범위하게 달라질 것이다. 살충제는 적어도 1 중량%로 존재할 것이며, 100 중량%일 수 있다. 건조 제제는 약 1-95 중량%의 살충제를 가질 것이고, 액체 제제는 일반적으로 액체 상 중 고체가 약 1-60 중량%일 것이다. 제제는 일반적으로 약 10²개 내지 약 10⁴개 세포/mg을 가질 것이다. 이들 제제는 헥타르 당 약 50 mg (액체 또는 건조) 내지 1 kg 또는 그 초과로 투여될 것이다.

제제는 인시류 해충의 환경, 예를 들어 잎 또는 토양에, 분무, 살분, 살수 등에 의해 적용될 수 있다.

식물 형질전환. 본 발명의 살곤충 단백질을 발현하는 일부 바람직한 재조합 숙주는 식물이다. 보다 매우 바람직한 숙주는 식품, 사료, 연료 및 오일을 생산하는데 통상적으로 사용되는 작물 식물이다. 보다 매우 바람직한 숙주 작물 식물은 옥수수, 대두, 목화 및 카놀라이다. 옥수수가 매우 바람직한 실시양태이다. 본원에 개시된 Bt 독소 단백질을 코딩하는 유전자는 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 기술을 이용하여 식물 세포에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서의 복제 시스템 및 형질전환된 세포의 선택을 허용하는 마커를 포함하는 다수의 클로닝 벡터가 외래 유전자의 고등 식물로의 삽입을 위한 제제에 이용가능하다. 벡터는 예를 들어, 특히 pBR322, pUC 시리즈, M13mp 시리즈, pACYC184를 포함한다. 따라서, Bt 독소 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 DNA 단편은 적합한 제한 부위에서 벡터에 삽입될 수 있다. 생성된 플라스미드는 이. 콜라이로의 형질전환에 사용된다. 이. 콜라이 세포는 적합한 영양 배지에서 배양된 후에, 수거되고 용해된다. 플라스미드가 회수된다. 서열 분석, 제한 분석, 전기영동, 및 다른 생화학적-분자 생물학적 방법이 일반적으로 분석 방법으로 수행된다. 각각의 조작 후에, 사용된 DNA 서열을 절단하여, 다음 DNA 서열에 연결시킬 수 있다. 각 플라스미드 서열은 동일 또는 다른 플라스미드에 클로닝될 수 있다. 목적하는 유전자를 식물 내로 삽입하는 방법에 따라, 다른 DNA 서열이 필요할 수 있다. 예를 들어, Ti 또는 Ri 플라스미드가 식물 세포의 형질전환에 사용되는 경우에, Ti 또는 Ri 플라스미드 T-DNA의 적어도 우측 경계, 그러나 종종 우측 및 좌측 경계가, 삽입될 유전자의 플랭킹 영역으로서 결합되어야 한다. 식물 세포의 형질전환을 위한 T-DNA의 사용이 광범위하게 연구되어 왔고, EP 120 516, 문헌 [Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986), 및 An et al., (1985)]에 충분히 기재되어 있으며, 관련 기술분야에서 널리 확립되어 있다.

삽입된 DNA가 식물 게놈에서 통합되면, 이는 상대적으로 안정하다. 형질전환 벡터는 보통 형질전환된 식물 세포에 살생물제 또는 항생제, 예컨대 특히 비알라포스(Bialaphos), 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 또는 하이그로마이신(Hygromycin)에 대한 저항성을 부여하는 선택 마커를 함유한다. 따라서 개별적으로 사용된 마커는 삽입된 DNA를 포함하지 않는 세포보다는 형질전환된 세포의 선택을 허용해야 한다.

식물 숙주 세포로 DNA를 삽입하는 다수의 기술이 이용가능하다. 이들 기술은 형질전환 벡터로서 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)를 사용하는 T-DNA로의 형질전환, 융합, 주사, 바이오리스틱스(biolistics) (마이크로입자 충격), 또는 전기천공 뿐만 아니라, 나노입자 형질전환 및 세포 투과 펩티드 매개 형질전환을 포함하는 다른 방법을 포함한다. 예를 들어, WO 2008/148223, WO2009/046384, WO2011/046786, WO2011/126644, WO2012/006439, 및 WO2012/006443을 참조한다. 아그로박테리아가 형질전환에 사용된 경우에, 삽입될 DNA는 특정 플라스미드에, 즉 중간 벡터 또는 이원 벡터에 클로닝되어야 한다. 중간 벡터는 T-DNA에서의 서열에 상동성인 서열로 인한 상동 재조합에 의해 Ti 또는 Ri 플라스미드로 통합될 수 있다. Ti 또는 Ri 플라스미드는 또한 T-DNA의 전달에 필요한 vir 영역을 포함한다. 중간 벡터는 아그로박테리아에서 그 스스로 복제될 수 없다. 중간 벡터는 헬퍼 플라스미드 (접합)에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스로 전달될 수 있다. 이원 벡터는 이. 콜라이 및 아그로박테리아 둘 다에서 그 스스로 복제될 수 있다. 이들은 선택 마커 유전자 및 링커 또는 폴리링커를 포함하며, 이들은 우측 및 좌측 T-DNA 경계 영역에 의해 프레이밍된다. 이들은 아그로박테리아로 직접 형질전환될 수 있다 (Holsters et al., 1978). 숙주 세포로 사용되는 아그로박테리아는 vir 영역을 보유하는 플라스미드를 포함한다. vir 영역은 T-DNA를 식물 세포로 전달하는데 필요하다. 추가의 T-DNA가 함유될 수 있다. 이와 같이 형질전환된 박테리아는 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 식물 체외이식편은 유리하게는 DNA의 식물 세포로의 전달을 위해 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스와 함께 배양될 수 있다. 이어서, 선택을 위한 항생제 또는 살생물제를 함유할 수 있는 적합한 배지에서 감염된 식물 물질 (예를 들어, 잎 조각, 줄기 절편, 뿌리 뿐만 아니라 원형질체 또는 현탁액-배양된 세포)로부터 온전한 식물이 재생될 수 있다. 이어서, 이와 같이 수득한 식물은 삽입된 DNA의 존재에 대해 시험될 수 있다. 주사 및 전기천공의 경우에는 플라스미드에 특정한 요구가 주어지지 않는다. 보편적 플라스미드, 예컨대 예를 들어 pUC 유도체를 사용하는 것이 가능하다.

형질전환된 세포는 온전한 생식가능한 식물에서 일반적인 방식으로 성장하고 분화될 수 있다. 이들은 배세포를 형성하고 형질전환된 형질(들)을 자손 식물에 물려줄 수 있다. 이러한 식물은 보통의 방식으로 성장하고 동일한 형질전환된 유전성 요인 또는 다른 유전성 요인을 갖는 식물과 교배될 수 있다. 생성된 잡종 개체는 대응하는 표현형 특성을 갖는다. 본 발명의 식물 세포는 또한 비-전능일 수 있고 / 온전한 식물로 재생될 수 없을 수 있다. 이러한 세포는 예를 들어 잎 세포를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 또한 본 발명의 종자로부터의 세포를 포함하며, 이는 온전한 식물로 재생될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 식물은 유전자로 형질전환될 것이고, 여기서 코돈 용법은 식물에 대해 최적화된다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,380,831을 참조한다. 일부 말단절단된 독소가 본원에 예시되어 있으나, 130 kDa-유형 (전장) 독소가 코어 독소인 N-말단 절반부, 및 독소전구물질 "꼬리"인 C-말단 절반부를 갖는다는 것이 Bt 기술분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 적절한 "꼬리"가 본 발명의 말단절단된 / 코어 독소와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,218,188 및 미국 특허 번호 6,673,990을 참조한다. 또한, 식물에서 사용하기 위한 합성 Bt 유전자를 생성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (Stewart and Burgin, 2007). 바람직한 형질전환된 식물의 한 비제한적 예는 Cry1Ea 단백질을 코딩하는 식물 발현 유전자를 포함하고, Cry1Ab, Cry1Be, Cry1Ca, Cry1Da 또는 VIP3Ab 단백질을 코딩하는 제2 식물 발현 유전자를 추가로 포함하는 생식가능한 식물이다.

Cry1Ea-쌍 형질의 근교계로의 전달 (또는 유전자이입)은 반복적 선택 육종, 예를 들어 역교배에 의해 달성될 수 있다. 이 경우에, 바람직한 반복친을 우선 Cry1Ea-쌍 형질에 적절한 유전자(들)를 보유하는 공여자 근친교배종 (비-반복친)과 교배한다. 이 교배의 자손을 이어서 반복친과 다시 교배한 후에, 생성된 자손 중에서 비-반복친으로부터 전달되는 바람직한 형질(들)을 선택한다. 반복친과의 3세대, 바람직하게는 4세대, 보다 바람직하게는 5세대 또는 그 초과의 역교배와 바람직한 형질(들)의 선택 후에, 자손은 전달되는 형질(들)을 조절하는 유전자좌에 대해 이형접합성일 것이나, 대부분의 또는 거의 모든 다른 유전자의 경우에는 반복친과 같을 것이다 (예를 들어, 문헌 [Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376] 참조).

내충성 관리 ( IRM ) 전략. 루쉬(Roush) 등은, 예를 들어 살곤충 트랜스제닉 작물의 관리를 위한, "피라미딩" 또는 "스태킹"이라고도 지칭되는, 2-독소 전략을 개략한다 (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).

미국 환경 보호국은 그의 웹사이트 (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) 상에 표적 해충에 대해 활성인 단일 Bt 단백질을 생산하는 트랜스제닉 작물과 사용하기 위한 비-트랜스제닉 (즉, 비-Bt ) 은신처 (비-Bt 작물 / 옥수수의 구역)에 대한 하기 요건을 공개하였다.

"옥수수 천공충-보호된 Bt (Cry1Ab 또는 Cry1F) 옥수수 제품에 대한 구체적인 구조화 요건은 다음과 같다:

구조화 은신처: 옥수수 지대에서의 20% 비-인시류 Bt 옥수수 은신처;

옥수수 지대에서의 50% 비-인시류 Bt 은신처

블럭

내부 (즉, Bt 재배지내)

외부 (즉, 무작위 교배를 최대화하기 위한, Bt 재배지의 ½ 마일 (가능한 경우에 ¼ 마일) 내의 별도의 재배지)

재배지내 스트립

스트립은 유충 이동의 영향을 감소시키기 위해 적어도 4열 (바람직하게는 6열)의 너비여야 함"

또한, 미국 옥수수 재배자 협회는 그의 웹사이트: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) 상에 또한 은신처 요건에 대해 유사한 가이드라인을 제공한다. 예를 들어:

"옥수수 천공충 IRM 요건:

- 생산자의 옥수수 에이커 면적의 적어도 20%에 은신처 잡종을 심어야 함

- 목화 생산 영역에서, 은신처는 50%이어야 함

- 은신처 잡종의 1/2 마일 내에 심어야 함

- 은신처는 Bt 재배지 내에서 스트립으로 심어질 수 있고; 은신처 스트립은 적어도 4열의 너비이어야 함

- 은신처는 오직 경제적 한계가 표적 해충에 대해 도달한 경우에만 종래의 살충제로 처리될 수 있음

- Bt-기반 분무가능한 살곤충제는 은신처 옥수수에 사용될 수 없음

- 적절한 은신처는 모든 농장에서 Bt 옥수수가 심어져야 함"

유사한 구조화 은신처 가이드라인은 본 발명의 FAW-보호된 Bt 작물에 사용될 수 있다.

루쉬 등에 의해 언급된 바와 같이 (예를 들어, 1780 및 1784 페이지의 우측 칼럼), 표적 해충에 대해 각각 효과적이고 교차-저항성이 거의 없거나 또는 전혀 없는 2종의 상이한 단백질의 스태킹 또는 피라미딩은 보다 작은 은신처의 사용을 허용할 수 있다. 루쉬는 성공적인 스택을 위해, 10% 미만 은신처의 은신처 크기가 단일 (비-피라미딩됨) 형질에서의 약 50% 은신처와 대등한 저항성 관리를 제공할 수 있음을 제안한다. 현재 이용가능한 피라미딩된 Bt 옥수수 제품의 경우에, 미국 환경 보호국은 단일 형질 제품 (일반적으로 20%)에 대한 것보다 유의하게 적은 (일반적으로 5%) 구조화 은신처에 비-Bt 옥수수를 심을 것을 요구하고 있다.

재배지에서의 다양한 기하학적 재식 패턴 (상기 언급된 바와 같음) 및 문헌 [Roush et al. (상기 문헌)] 및 미국 특허 번호 6,551,962에 의해 추가로 논의된 바와 같은 자루내 종자 혼합물을 비롯한, 은신처의 IRM 효과를 제공하는 다양한 방식이 존재한다.

상기 백분율, 또는 유사한 은신처 비가 본 발명의 2중 또는 3중 스택 또는 피라미드에 사용될 수 있다. 단일 표적 해충에 대한 3개 작용 부위를 갖는 3중 스택의 경우에, 0개의 은신처 (또는 예를 들어 5% 미만의 은신처)를 목표로 할 것이다. 이는 특히, 예를 들어 10 에이커 초과의 상업적 에이커 면적에서 사실이다.

본원에서 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 공보는 본 명세서의 명백한 교시와 상반되지 않는 정도로 그 전체내용이 참조로 포함된다.

구체적으로 나타내거나 시사하지 않는 한, 단수 용어는 본원에 사용된 바와 같은 "적어도 하나"를 의미한다.

다음은 본 발명의 실시를 위한 절차을 도시하는 실시예이다. 이 실시예들은 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다. 모든 백분율은 중량 기준이고 모든 용매 혼합물 비율은 달리 나타내지 않는 한 부피 기준이다. 모든 온도는 섭씨 온도이다.

실시예

실시예 1 - Cry1Ea 및 Cry1Ab 단백질의 ¹²⁵ I 표지

Cry 독소의 아이오딘화. 전장 Cry1Ea 및 Cry1Ab 단백질 (서열 1 및 2)을 트립신에 의해 절단하여 활성화된 살곤충 형태 (서열 7 및 8에 의해 나타내어진 바와 같음)를 생산하였다. 정제된 말단절단된 Cry 독소를 아이오도-비드(Iodo-Bead) 또는 아이오도-겐(Iodo-gen) (피어스(Pierce))을 사용하여 아이오딘화시켰다. 간략하게, 2개의 아이오도-비드를 포스페이트 완충 염수, PBS (20 mM 인산나트륨, 0.15 M NaCl, pH 7.5) 500 μl로 2회 세척하고, 납 차폐된 1.5 ml 원심분리 튜브에 넣었다. 여기에 PBS 100 μl를 첨가하였다. 후드에서 및 적절한 방사성 취급 기술의 이용을 통해, 0.5 mCi Na¹²⁵I (17.4 Ci/mg, Lot 0114, 아머샴(Amersham))를 아이오도-비드가 있는 PBS 용액에 첨가하였다. 이 성분들을 5분 동안 실온에서 반응시킨 후에, 용액에 2-25 μg의 고순도 말단절단된 Cry 단백질을 첨가하고, 추가 3-5분 동안 반응시켰다. 이 반응은 아이오도-비드로부터 용액을 제거하고 이를 PBS에서 평형화된 0.5 ml 탈염 제바(Zeba) 스핀 칼럼 (인비트로젠(InVitrogen))에 적용시킴으로써 종결되었다. 아이오도-비드를 각각 PBS 10 μl로 2회 세척하고, 또한 세척 용액을 탈염 칼럼에 적용하였다. 방사성 용액을 2분 동안 1,000 x g에서의 원심분리에 의해 탈염 칼럼을 통해 용리시켰다.

아이오딘화 Cry 단백질의 방사성-순도를 SDS-PAGE, 인광체영상화 및 감마 계수에 의해 결정하였다. 간략하게, 2 μl의 방사성 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 분리 후에, 제조업체의 지침에 따라 바이오라드(BioRad) 겔 건조 장치를 이용하여 겔을 건조시켰다. 건조된 겔을 마일라(Mylar) 필름 (12 μm 두께)으로 랩핑하고 1시간 동안 분자 동역학 저장 인광체 스크린(Molecular Dynamics storage phosphor screen) (35 cm x 43 cm) 하에 노출시켜 건조된 겔을 영상화하였다. 분자 동역학 스톰(Storm) 820 인광체영상화기를 이용하여 플레이트를 현상하고, 이미지퀀트(ImageQuant)™ 소프트웨어를 이용하여 영상을 분석하였다. 방사성 밴드를 겔로부터 면도날을 사용하여 밴드 바로 위 및 아래의 영역과 함께 절제하고, 감마 계수기에서 계수하였다. 방사성은 오직 Cry 단백질 밴드 및 밴드 아래의 영역에서만 검출되었다. 밴드 위에서는 방사성이 검출되지 않았는데, 이는 모든 방사성 오염물이 말단절단된 Cry 단백질보다 작은 단백질 성분으로 이루어졌음을 나타낸다. 이러한 성분은 분해 산물을 나타낼 가능성이 가장 클 것이다.

실시예 2 - BBMV 제조 프로토콜

가용화된 BBMV의 제조 및 분획화. 종령 스포도프테라 프루기페르다 유충을 밤새 금식시키고, 이어서 오전에 15분 동안 얼음 상에서 냉각시킨 후에 해부하였다. 외피에 부착된 후장은 남겨두고 중장 조직을 체강으로부터 분리하였다. 중장을 9X 부피의 빙냉 균질화 완충제 (300 mM 만니톨, 5 mM EGTA, 17 mM 트리스 염기, pH 7.5)에 넣고, 공급업체에 의해 권장되는 바와 같이 희석된 프로테아제 억제제 칵테일¹ (시그마 P-2714)을 보충하였다. 조직을 15 스트로크의 유리 조직 균질화기로 균질화시켰다. 울퍼스버거(Wolfersberger) (1993)의 MgCl₂ 제조 방법에 의해 BBMV를 제조하였다. 간략하게, 300 mM 만니톨 중 24 mM MgCl₂ 용액의 동일한 부피를 중장 균질물과 혼합하고, 5분 동안 교반하고 15분 동안 얼음 상에 두었다. 용액을 4℃에서 15분 동안 2,500 x g에서 원심분리하였다. 상청액을 보관하고, 펠릿을 본래 부피의 0.5-X 희석된 균질화 완충제에 현탁시키고 다시 원심분리하였다. 2가지 상청액을 합하고 4℃에서 30분 동안 27,000 x g에서 원심분리하여 BBMV 분획을 형성하였다. 펠릿을 10 ml의 균질화 완충제에 현탁시키고, 프로테아제 억제제를 보충하고, 4℃에서 30분 동안 27,000 x g에서 다시 원심분리하여 BBMV를 세척하였다. 생성된 펠릿을 BBMV 저장 완충제 (10 mM HEPES, 130 mM KCl, 10% 글리세롤, pH 7.4)에 약 3 mg/ml 단백질의 농도로 현탁시켰다. 단백질 농도를 표준으로 소 혈청 알부민 (BSA)을 사용하는 브래드포드(Bradford) 방법(1976)을 이용하여 결정하였다. 제조업체의 지침에 따라 시그마 검정을 사용하여, 샘플을 냉동시키기 전에 알칼리성 포스파타제 결정을 수행하였다. BBMV 분획 중 이 마커 효소의 특이적 활성은 전형적으로 중장 균질물 분획에서 발견되는 것에 비해 7배 증가하였다. BBMV를 250 μl 샘플로 분취하고, 액체 N₂에서 급속 냉동시키고, -80℃에 저장하였다.

¹ 칵테일 성분의 최종 농도 (μM)는 AEBSF (500), EDTA (250 mM), 베스타틴 (32), E-64 (0.35), 류펩틴 (0.25), 및 아프로티닌 (0.075)이다.

실시예 3 - BBMV 단백질에 대한 ¹²⁵ I Cry 단백질의 결합을 측정하는 방법

BBMV에 대한 ¹²⁵ I Cry 단백질의 결합. 결합 검정에 사용하기 위한 BBMV 단백질의 최적량을 결정하기 위해, 포화 곡선을 생성하였다. ¹²⁵I 방사성표지된 Cry 단백질(0.5 nM)을 결합 완충제 (8 mM NaHPO_{4 ,} 2 mM KH₂PO_{4 ,} 150 mM NaCl, 0.1 % 소 혈청 알부민, pH 7.4) 중 0-500 μg/ml 범위의 다양한 양의 BBMV 단백질을 이용하여 28℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 총 부피는 0.5 ml였다. 150 μl의 반응 혼합물을 1.5 ml 원심분리 튜브로부터 500 μl 원심분리 튜브로 삼중으로 샘플링하고, 샘플을 실온에서 6분 동안 14,000 x g에서 원심분리하여, 결합된 ¹²⁵I Cry 단백질을 결합되지 않은 것으로부터 분리하였다. 상청액을 부드럽게 제거하고, 펠릿을 빙냉 결합 완충제로 3회 부드럽게 세척하였다. 펠릿을 함유한 원심분리기의 하부물질을 분리하여 13 x 75-mm 유리 배양 튜브에 넣었다. 샘플을 감마 계수기에서 각각 5분 동안 계수하였다. 백그라운드 카운트(어떠한 단백질도 없는 반응)로부터 샘플에 함유된 카운트를 빼고, BBMV 단백질 농도에 대해 플롯팅하였다. 사용하기에 최적인 단백질의 양이 BBMV 단백질 0.15 mg/ml인 것으로 결정되었다.

결합 동역학을 결정하기 위해, 포화 곡선을 생성하였다. 간략하게, 0.01에서 10 nM의 범위로 ¹²⁵I Cry 독소의 농도를 증가시키면서 BBMV (150 μg/ml)를 28℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 기재한 바와 같이 150 μl의 각각의 농축액을 삼중으로 샘플링하고 샘플을 원심분리하고 카운팅하여 전체 결합을 결정하였다. 1,000 nM의 상동 트립신처리된 비-방사성 Cry 독소 (서열 7-11에 의해 나타내어짐, 및 비-트립신처리된 것은 서열 6에 의해 나타내어짐)를 반응 혼합물에 첨가하여 모든 비-특이적 수용체 결합 부위를 포화시키면서, 비-특이적 결합을 동일한 방식으로 결정하였다. 특이적 결합을 전체 결합 및 비-특이적 결합 사이의 차이로 계산하였다.

150 μg/ml BBMV 단백질 및 0.5 nM의 ¹²⁵I 방사성표지된 Cry 단백질을 사용하여 상동 및 이종 경쟁 결합 검정을 수행하였다. 반응 혼합물에 첨가된 경쟁적 비-방사성표지된 Cry 독소의 농도는 0.045 내지 1,000 nM이며, 이는 방사성 리간드와 동시에 첨가되어 진정한 결합 경쟁을 보장한다. 28℃에서 1시간 동안 인큐베이션을 수행하고, 그의 수용체 독소에 결합된 ¹²⁵I Cry 단백질의 양을 상기 기재된 바와 같이 비-특이적 결합을 빼서 측정하였다. 100% 전체 결합이 임의의 경쟁 리간드의 부재 하에 결정되었다. 결과를 첨가된 경쟁 리간드의 농도에 대한 % 전체 특이적 결합으로서 반-로그 플롯 상에 플롯팅하였다.

실시예 4 - 결과 개요

도 1은 비표지된 상동 Cry1Ea (●) 및 이종 Cry1Ab (■)에 의한 결합에 대한 FAW로부터의 BBMV에서의 ¹²⁵I Cry1Ea (0.5 nM)의 % 특이적 결합을 보여준다. Cry1Ea에 의한 상동 경쟁에 대한 치환 곡선은 약 1 nM의 비-표지된 Cry1Ea에서 방사성리간드의 50% 치환을 보여주는 곡선을 생성한다. Cry1Ab는 1,000 nM까지 임의의 시험된 농도, 또는 검정된 사용된 ¹²⁵I Cry1Ea의 농도의 2,000배 농도에서 ¹²⁵I Cry1Ea의 특이적 결합을 치환하지 않는다.

도 2는 FAW 유충으로부터의 BBMV에 대한 ¹²⁵I Cry1Ab의 결합 및 비표지된 Cry1Ab의 농도 증가에 의한 그의 후속 치환을 보여준다. 비표지된 Cry1Ab는 약 0.3 NM의 농도에서 방사성표지된 Cry1Ab의 결합을 50% 치환한다. FAW BBMV에 대한 I Cry1Ab의 결합은 Cry1Ea에 의해 치환되지 않는다. 따라서, 이들 2종의 Cry 독소는 FAW 곤충의 소화관에서의 별도의 부위에서 결합한다.

도 3은 비표지된 상동 Cry1Ea (●) 및 이종 Cry1Ca (▲)에 의한 경쟁에 대한 FAW로부터의 BBMV에서의 ¹²⁵I Cry1Ea의 % 특이적 결합을 보여준다. Cry1Ea에 의한 상동 경쟁에 대한 치환 곡선은 약 1 nM의 비-표지된 Cry1Ea에서의 방사성리간드의 50% 치환을 보여주는 곡선을 생성한다. Cry1Ca는 ¹²⁵I Cry1Ea의 결합을 치환할 수 없었다.

도 4는 ¹²⁵I Cry1Ea를 FAW 유충으로부터의 BBMV에 결합시키고, Cry1Ea, Cry1Be, Cry1Da 및 VIP3Ab1 리간드를 후속 첨가한 결합 검정의 결과를 보여준다. Cry1Be, Cry1Da 및 VIP3Ab1은, 1,000 nM 농도, 또는 검정에 사용된 ¹²⁵I Cry1Ea의 농도의 2,000배 농도에서의 Cry1Da에 의한 대략 40% 치환을 제외하고는, ¹²⁵I Cry1Ea의 결합을 치환할 수 없었다.

참고문헌 목록

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Thr Val Gly Gly Ser Thr Thr 530 535 540 Phe Asp Gln Gly Phe Pro Ser Thr Met Ser Ala Asn Glu Ser Leu Thr 545 550 555 560 Ser Gln Ser Phe Arg Phe Ala Glu Phe Pro Val Gly Ile Ser Ala Ser 565 570 575 Gly Ser Gln Thr Ala Gly Ile Ser Ile Ser Asn Asn Ala Gly Arg Gln 580 585 590 Thr Phe His Phe Asp Lys Ile Glu Phe Ile Pro Ile Thr Ala Thr Leu 595 600 605 Glu Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg 610 615 <210> 10 <211> 600 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Truncated Cry1Ca Protein <400> 10 Ile Ser Thr Gly Asn Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln 1 5 10 15 Phe Leu Val Ser Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu 20 25 30 Ile Asp Phe Val Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe 35 40 45 Leu Val Gln Ile Glu Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala 50 55 60 Arg Asn Ala Ala Ile Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn 65 70 75 80 Ile Tyr Val Glu Ala Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Lys Asn Pro 85 90 95 Ala Thr Arg Thr Arg Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu 100 105 110 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Thr Met Glu Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr 530 535 540 Thr Asp Phe Ser Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile 545 550 555 560 Gly Ile Ser Glu Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly 565 570 575 Glu Leu Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Leu 580 585 590 Glu Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg 595 600 <210> 11 <211> 576 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Truncated Cry1Da Protein <400> 11 Leu Glu Thr Gly Asn Thr Val Ala Asp Ile Ser Leu Gly Leu Ile Asn 1 5 10 15 Phe Leu Tyr Ser Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Val Gly Leu 20 25 30 Leu Glu Leu Ile Trp Gly Phe Ile Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ile Phe 35 40 45 Leu Ala Gln Ile Glu Gln Leu Ile Ser Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala 50 55 60 Arg Asn Gln Ala Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Lys 65 70 75 80 Val Tyr Val Arg Ala Phe Ser Asp Trp Glu Lys Asp Pro Thr Asn Pro 85 90 95 Ala Leu Arg Glu Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala 100 105 110 Leu Ile Thr Ala Ile Pro Leu Phe Arg Val Gln 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Arg Ala Gln Glu 530 535 540 Glu Phe Asp Leu Tyr Ile Gln Ser Gly Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu 545 550 555 560 Phe Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg 565 570 575

Claims (36)

1. Cry1Ea 살곤충 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 제2 살곤충 단백질을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 제2 살곤충 단백질은 Cry1Ab, Cry1Be, Cry1Ca, Cry1Da 및 Vip3Ab로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 트랜스제닉 식물.
2. 제1항에 있어서, 제3 살곤충 단백질을 코딩하는 DNA를 추가로 포함하는 트랜스제닉 식물.
3. 상기 이종 폴리뉴클레오티드들을 포함하는, 제1항에 따른 식물의 종자.
4. 제3항에 있어서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 식물의 종자.
5. 비-Bt 은신처 식물 및 다수의 제1항에 따른 식물을 포함하는 식물의 재배지이며, 여기서 상기 은신처 식물은 상기 재배지에서 전체 작물 식물의 40% 미만으로 포함되는 것인 식물의 재배지.
6. 제5항에 있어서, 상기 은신처 식물이 상기 재배지에서 전체 작물 식물의 30% 미만으로 포함되는 것인 식물의 재배지.
7. 제5항에 있어서, 상기 은신처 식물이 상기 재배지에서 전체 작물 식물의 20% 미만으로 포함되는 것인 식물의 재배지.
8. 제5항에 있어서, 상기 은신처 식물이 상기 재배지에서 전체 작물 식물의 10% 미만으로 포함되는 것인 식물의 재배지.
9. 제5항에 있어서, 상기 은신처 식물이 상기 재배지에서 전체 작물 식물의 5% 미만으로 포함되는 것인 식물의 재배지.
10. 제5항에 있어서, 상기 은신처 식물이 블럭 또는 스트립에 있는 것인 식물의 재배지.
11. 비-Bt 은신처 식물로부터의 은신처 종자, 및 다수의 제3항의 종자를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 은신처 종자는 조성물에서 전체 종자의 40% 미만으로 포함되는 것인 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 은신처 종자가 조성물에서 전체 종자의 30% 미만으로 포함되는 것인 조성물.
13. 제11항에 있어서, 상기 은신처 종자가 조성물에서 전체 종자의 20% 미만으로 포함되는 것인 조성물.
14. 제11항에 있어서, 상기 은신처 종자가 조성물에서 전체 종자의 10% 미만으로 포함되는 것인 조성물.
15. 제11항에 있어서, 상기 은신처 종자가 조성물에서 전체 종자의 5% 미만으로 포함되는 것인 조성물.
16. 종자를 심어 제5항의 식물의 재배지를 생성하는 것을 포함하는, 곤충에 의한 Cry 단백질에 대한 저항성의 발생을 관리하는 방법.
17. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물들이 10 에이커 초과를 점유하는 것인 재배지.
18. 제1항에 있어서, 옥수수, 대두, 목화, 카놀라 및 해바라기로 이루어진 군으로부터 선택된 식물.
19. 상기 Cry1Ea 살곤충 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 Cry1Ea 살곤충 단백질은 서열 7과 적어도 95% 동일한 것인, 제1항의 식물의 식물 세포.
20. 제1항에 있어서, 상기 Cry1Ea 살곤충 단백질이 서열 7을 포함하는 것인 식물.
21. 제19항의 식물 세포의 폴리뉴클레오티드를 다수의 상기 세포에서 재생시키는 것을 포함하는, 상기 폴리뉴클레오티드를 생산하는 방법.
22. 가을 거염벌레 곤충에게 경구 섭취를 위한 Cry1Ea 살곤충 단백질 및 제2 살곤충 단백질을 제공하는 것을 포함하며, 상기 제2 살곤충 단백질은 Cry1Ab, Cry1Be, Cry1Ca, Cry1Da 및 Vip3Ab로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 가을 거염벌레 곤충을 방제하는 방법.
23. 상기 제2 폴리뉴클레오티드가 Cry1Ab 살곤충 단백질을 코딩하며, 여기서 상기 Cry1Ab 살곤충 단백질은 서열 8과 적어도 95% 동일한 것인, 제1항의 식물의 식물 세포.
24. 제1항에 있어서, 상기 Cry1Ab 살곤충 단백질이 서열 8을 포함하는 것인 식물.
25. Cry1Be 살곤충 단백질을 코딩하는 상기 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 Cry1Be 살곤충 단백질은 서열 9와 적어도 95% 동일한 것인, 제1항의 식물의 식물 세포.
26. 제1항에 있어서, 상기 Cry1Be 살곤충 단백질이 서열 9를 포함하는 것인 식물.
27. 상기 Cry1Ca 살곤충 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 Cry1Ca 살곤충 단백질은 서열 10과 적어도 95% 동일한 것인, 제1항의 식물의 식물 세포.
28. 제1항에 있어서, 상기 Cry1Ca 살곤충 단백질이 서열 10을 포함하는 것인 식물.
29. 상기 Cry1Da 살곤충 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 Cry1Da 살곤충 단백질은 서열 11과 적어도 95% 동일한 것인, 제1항의 식물의 식물 세포.
30. 제1항에 있어서, 상기 Cry1Da 살곤충 단백질이 서열 11을 포함하는 것인 식물.
31. 상기 Vip3Ab 살곤충 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 Vip3Ab 살곤충 단백질은 서열 6과 적어도 95% 동일한 것인, 제1항의 식물의 식물 세포.
32. 제1항에 있어서, 상기 Vip3Ab 살곤충 단백질이 서열 6을 포함하는 것인 식물.
33. 제22항에 있어서, 제3 살곤충 단백질을 상기 곤충에게 제공하는 것을 포함하는 방법.
34. 제1항의 식물의 식물 세포.
35. 제2항의 식물의 식물 세포.
36. 제18항의 식물의 식물 세포.

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