MX2012007123A - Uso de cry1da en combinacion con cry1ca para el manejo de inseptos resistentes. - Google Patents

Abstract

La presente invención incluye métodos y plantas para el control de insectos lepidópteros del tipo oruga combatiente de otoño, dichas plantas comprenden una proteína insecticida Cry1Da y una proteína insecticida Cry1Ca, y diversas combinaciones de otras proteínas que comprenden este par de proteínas, a fin de demorar o prevenir el desarrollo de resistencia por los insectos.

Description

USO DE C/vIDa EN COMBINACIÓN CON C/ylCa PARA EL MANEJO DE INSECTOS RESISTENTES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los humanos cultivan el maíz para aplicaciones alimenticias y energéticas. Los humanos también cultivan muchos otros cultivos, entre ellos, soya y algodón. Los insectos comen y dañan plantas, y de ese modo, destruyen los esfuerzos humanos. Se gastan miles de millones de dólares por año en el control de plagas de insectos, y se pierden miles de millones adicionales por el daño que estas infligen. Los insecticidas químicos orgánicos sintéticos han sido las herramientas primarias utilizadas para el control de plagas de insectos, si bien los insecticidas biológicos, tales como las proteínas insecticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt), han cumplido un importante rol en algunas áreas. La capacidad para producir plantas resistentes a insectos a través de la transformación con genes de proteínas insecticidas de Bt ha revolucionado la agricultura moderna, y ha sobresaltado la importancia y el valor de proteínas insecticidas y sus genes.

Se han utilizado varias proteínas de Bt para crear las plantas transgénicas resistentes a insectos que han sido exitosamente registradas y comercializadas, hasta la fecha. Estas incluyen CryIAb, CryIAc, CryI F y Cry3Bb en maíz, CryIAc y Cry2Ab en algodón, y Cfy3A en papa.

Los productos comerciales que expresan estas proteínas expresan una sola proteína, excepto en casos donde se desea el espectro insecticida combinado de dos proteínas (por ejemplo, CrylAb y Cry3Bb, en maíz, combinadas de manera de proporcionar resistencia a plagas de lepidópteros y a la lombriz de las raíces, respectivamente), o donde la acción independiente de las proteínas las hace útiles como una herramienta para demorar el desarrollo de resistencia en poblaciones de insectos sensibles (por ejemplo, CrylAc y Cry2Ab en algodón, combinadas de manera de proporcionar el manejo de la resistencia para la lombriz del brote del tabaco). Ver, además, la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Nro. 2009/0313717, que se refiere a una proteína Cry2 más una Vip3Aa, CryI F, o Cry A, para el control de Helicoverpa zea o armigerain. El documento WO 2009/132850 se refiere a CryI F o CryIA y Vip3Aa para el control de Spodoptera frugiperda. La Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Nro. 2008/0311096 se refiere, en parte, a CrylAb para el control de ECB (sigla en inglés de: perforador del maíz europeo) resistente a Cry1 F.

Esto es, algunas de las cualidades de las plantas transgénicas resistentes a insectos que han llevado a la rápida y diseminada adopción de esta tecnología también dan origen a cuestiones relacionadas con el desarrollo de resistencia de las poblaciones de plagas a las proteínas insecticidas producidas por estas plantas. Se han sugerido varias estrategias para la preservación de la utilidad de rasgos de resistencia de insectos a base de Bt, que incluyen el desplegado de proteínas a alta dosis, en combinación con un refugio, y la alternación o el desplegado conjunto con diferentes toxinas (McGaughey et al. (1998), "B. t. Resistance Management", Nature Biotechnol. 16: 144-146).

Es necesario que las proteínas seleccionadas para el uso en una acumulación para el manejo de resistencia de insectos (IRM, según su sigla en inglés) ejerzan su efecto insecticida de manera independiente, de manera que la resistencia desarrollada a una proteína no confiera resistencia a la segunda proteína (es decir, no hay resistencia cruzada a las proteínas). Por ejemplo, si una población de plagas que es resistente a la "Proteína A" es sensible a la "Proteína B", se concluirá que no hay resistencia cruzada, y que una combinación de Proteína A y Proteína B será eficaz en la demora de la resistencia a la Proteína A sola.

En ausencia de poblaciones de insectos resistentes, pueden efectuarse evaluaciones sobre la base de otras características supuestamente relacionadas con el mecanismo de acción y el potencial de resistencia cruzada. Se ha sugerido la utilidad de la unión mediada por receptor, en la identificación de proteínas insecticidas que probablemente no exhiban resistencia cruzada (van Mellaert et al. 1999). El pronosticador clave de la falta de resistencia cruzada inherente en este enfoque es que las proteínas insecticidas no compiten por receptores en una especie de insecto sensible.

En el caso de que dos toxinas de Bt compitan por el mismo receptor, entonces, si dicho receptor muta en dicho insecto, de modo que una de las toxinas ya no se une a dicho receptor, y en consecuencia, ya no es insecticida contra el insecto, este podría ser el caso de que el insecto también sea resistente a la segunda toxina (que se ha ligado competitivamente al mismo receptor). Es decir, se afirma que el insecto tiene resistencia cruzada a ambas toxinas de Bt. Sin embargo, si dos toxinas se unen a dos receptores diferentes, esta podría ser una indicación de que el insecto no será simultáneamente resistente a dichas dos toxinas.

Por ejemplo, la proteína Cry Fa es útil en el control de muchas especies de plagas de lepidópteros, que incluyen el perforador del maíz europeo (ECB, según su sigla en inglés; Ostrinia nubilalis (Hübner)) y la oruga combatiente del otoño (FAW, según su sigla en inglés; Spodoptera frugiperda), y es activa contra el perforador de la caña de azúcar (SCB, según su sigla en inglés; Diatraea saccharalis). La proteína Cryl Fa, producida en plantas de maíz transgénicas que contienen el evento TC1507, es responsable de un rasgo de resistencia de insectos líder en la industria, para el control de FAW. La proteína Cryl Fa también es desplegada en los productos Herculex®, SmartStax™ y WideStrike™.

Se citan toxinas adicionales de Cry en la página de Internet del comité oficial de nomenclaturas de B. t. (Crickmore et ai; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Actualmente, existen casi 60 grupos principales de toxinas "Cry" (Cry1-Cry59), con toxinas adicionales Cyt y toxinas VIP y similares. Muchos de todos los grupos numéricos tienen subgrupos de letras mayúsculas, y los subgrupos de letras mayúsculas tienen subgrupos de letras minúsculas (Cry1 tiene A-L, y Cry A tiene a-i, por ejemplo).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, en parte, al sorprendente descubrimiento de que CryI Da y CryICa no compiten por sitios de unión en preparaciones de membrana celular del intestino de la oruga combatiente de otoño (FAW; Spodoptera frugiperda). El experto en el arte reconocerá, con el beneficio de esta revelación, que las plantas que producen ambas proteínas (que incluyen porciones insecticidas de las proteínas de longitud completa) pueden demorar o prevenir el desarrollo de resistencia a cualquiera de estas proteínas insecticidas solas.

Por lo tanto, la presente invención se refiere, en parte, al uso de una proteína CryI Da en combinación con una proteína CryI Ca. Las plantas (y las áreas plantadas con dichas plantas) que producen ambas proteínas se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

La presente invención se refiere además, en parte, a acumulaciones o "pirámides" triples de tres (o más) toxinas, donde CryI Da y CryI Ca son el par de base. En algunas modalidades de pirámide preferidas, la combinación de las toxinas seleccionadas proporciona una acción resistente no cruzada contra FAW. Algunas combinaciones piramidales de "tres sitios de acción" preferidas incluyen el par de base de proteínas más CryI Fa, Vip3Ab, CryI Be, o CryI E, como la tercera proteína para la dirección a FAW. Estas acumulaciones triples particulares, de acuerdo con la presente invención, proporcionarán, de manera conveniente y sorprendente, tres sitios de acción contra FAW, lo que puede ayudar a reducir o eliminar el requerimiento de áreas de refugio.

Pueden agregarse también toxinas o genes adicionales, de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, si se acumulan CryI Fa o CryI Be con el presente par de proteínas (tanto CryI Fa como CryI Be son activas tanto contra FAW como contra el perforador del maíz europeo (ECB)), la adición de dos proteínas adicionales a esta acumulación triple, donde las dos proteínas agregadas se dirigen a ECB, proporcionará tres sitios de acción contra FAW, y tres sitios de acción contra ECB. Estas dos proteínas agregadas (la cuarta y la quinta proteínas) podrían seleccionarse del grupo que consiste en Cry2A, Cryl l, DIG-3, y CryIAb. Esto logrará una acumulación de cinco proteínas, que tiene tres sitios de acción contra dos insectos (ECB y FAW).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra el porcentaje de unión específica de 125l CryI Da (0,5 nM) en BBMV de FAW en comparación con la competición por CryI Da (o) homologa no marcada y CryI Ca heteróloga (¦). La curva de desplazamiento para la competición homologa por CryI Da logra una curva de forma sigmoidea que muestra 50% de desplazamiento del radioligando a aproximadamente 1.5 nM de Cry Da. CryI Ca no desplaza la unión específica de 125l CryI Da en ninguna concentración ensayada, de hasta 1000 nM, o 2000 veces la concentración de 125l Cry1 Da utilizada en el ensayo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, en parte, al sorprendente descubrimiento de que CryI Da y CryI Ca no compiten entre sí por la unión en el intestino de orugas combatientes (FAW; Spodoptera frugiperda). Por lo tanto, una proteína CryI Da puede usarse en combinación con una proteína CryI Ca en maíz transgénico (y otras plantas, por ejemplo, algodón y soya) para demorar o prevenir el desarrollo de resistencia de FAW a cualquiera de estas proteínas solas. El presente par de proteínas puede ser eficaz en la protección de plantas (tales como plantas de maíz y plantas de soya) contra el daño de la oruga combatiente de otoño resistente a Cry. Es decir, un uso de la presente invención consiste en la protección de maíz y otras especies de plantas importantes desde el punto de vista económico, contra el daño y la pérdida de rendimiento causados por poblaciones de orugas combatientes de otoño que podrían desarrollar resistencia a CryI Da o CryI Ca.

La presente invención, en consecuencia, describe una acumulación para el manejo de la resistencia de insectos (IRM) que comprende CryI Da y CryI Ca, a fin de prevenir o mitigar el desarrollo de resistencia de FAW a cualquiera o ambas de estas proteínas.

La presente invención provee composiciones para el control de plagas de lepidópteros que comprenden células que producen una proteína insecticida Cry1 Da y una proteína insecticida Cry1 Ca.

La invención además comprende un huésped transformado para producir tanto una proteína insecticida CryI Da como una proteína insecticida CryI Ca, donde dicho huésped es un microorganismo o una célula de planta. Los presentes polinucleótidos, preferentemente, se presentan en una construcción genética bajo el control de un o más promotores no Bacillus-thuringiensis. Los presentes polinucleótidos pueden comprender el uso de codones, para la mayor expresión en una planta.

Se tiene la intención además de que la invención provea un método para el control de plagas de lepidópteros, que comprende el contacto de dichas plagas o el entorno de dichas plagas, con una cantidad eficaz de una composición que comprende una proteína que contiene toxina núcleo CryI Da y que además comprende una proteína que contiene toxina núcleo CryICa.

Una modalidad de la invención comprende una planta de maíz que comprende un gen de expresión en plantas que codifica una proteína insecticida CryI Ca, y un gen de expresión en plantas que codifica una proteína insecticida CryI Da, y semillas de dicha planta.

Una modalidad adicional de la invención comprende una planta de maíz, donde se ha efectuado, en dicha planta de maíz, la introgresión de un gen de expresión en plantas que codifica una proteína insecticida CryI Ca, y de un gen de expresión en plantas que codifica una proteína insecticida CryI Da, y semillas de dicha planta.

Como se describe en los Ejemplos, los estudios de unión de receptor competitiva usando la proteína CryI Da radiomarcada muestran que la proteína CryI Ca no compite por la unión en tejidos de insectos FAW a los cuales se une CryI Da. Estos resultados además indican que la combinación de las proteínas CryI Da y CryICa puede ser un medio eficaz para mitigar el desarrollo de resistencia en poblaciones de FAW, a cualquiera de estas proteínas. Por lo tanto, sobre la base, en parte, de la información que se describe en esta solicitud, se cree que la producción conjunta (acumulación) de las proteínas CryI Ca y Cry Da puede usarse para la producción de una acumulación IRM de alta dosis para FAW.

Pueden agregarse otras proteínas a este par. Por ejemplo, la presente invención se refiere además, en parte, a acumulaciones o "pirámides" triples de tres (o más) toxinas, donde Cry Da y CryI Ca son el par de base. En algunas modalidades piramidales preferidas, las toxinas seleccionadas tienen tres sitios de acción separados contra FAW. Algunas combinaciones piramidales preferidas de "tres sitios de acción" incluyen el presente par de base de proteínas más CryI Fa, Vip3Ab, CryI Be, o CryI E, como la tercera proteína para la dirección a FAW. La expresión "sitios de acción separados" significa que cualquiera de las proteínas determinadas no causan resistencia cruzada entre sí. Estas acumulaciones triples particulares, de acuerdo con la presente invención, proporcionarán, de manera conveniente y sorprendente, tres sitios de acción contra FAW, lo que puede ayudar a reducir o eliminar el requerimiento de áreas de refugio.

Además, de acuerdo con la presente invención, pueden agregarse toxinas o genes adicionales. Por ejemplo, si se acumulan CryI Fa o CryI Be con el presente par de proteínas (tanto CryI Fa como CryI Be son activas tanto contra FAW como contra el perforador del maíz europeo (ECB)), la adición de dos proteínas adicionales a esta acumulación triple, donde las dos proteínas agregadas se dirigen a ECB, proporcionará tres sitios de acción contra FAW, y tres sitios de acción contra ECB. Estas dos proteínas agregadas (la cuarta y la quinta proteínas) podrían seleccionarse del grupo que consiste en Cry2A, Cryl l, DIG-3 (ver el documento de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Nro. 61/284.278 (presentada el 16 de diciembre de 2009) y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Nro. US 2010 00269223) y CryIAb. Esto logrará una acumulación de cinco proteínas, que tiene tres sitios de acción contra dos insectos (ECB y FAW).

Por lo tanto, una opción de desplegado consiste en el uso del presente par de proteínas, en combinación con una tercera toxina/gen, y el uso de esta acumulación triple para mitigar el desarrollo de resistencia en FAW a cualquiera de estas toxinas. En consecuencia, la presente invención se relaciona también, en parte, a acumulaciones o "pirámides" triples de tres (o más) toxinas. En algunas modalidades piramidales preferidas, las toxinas seleccionadas tienen tres sitios de acción separados contra FAW.

Entre las opciones de desplegado de la presente invención, se incluye el uso de dos, tres o más proteínas de las presentes proteínas, en regiones de cultivo donde FAW pueda desarrollar poblaciones resistentes.

Para el uso de Cryl Fa más CryI C, ver el documento de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Nro. 61/284,281 (presentada el 16 de diciembre de 2009), que muestra que CryI C es activa contra FAW resistente a CryI F. Para el uso de Cryl Fa más CryI D, ver el documento de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Nro. 61/284,252 (presentada el 16 de diciembre de 2009), que muestra que CryI D es activa contra FAW resistente a CryI F. Estas dos solicitudes además muestran que CryI C no compite con CryI F por la unión en preparaciones de membrana de FAW, y que CryI D no compite con CryI F por la unión en preparaciones de membrana de FAW. Debido a que Cryl Fa es activa contra FAW y ECB, CryI Da más CryICa más Cryl Fa, de acuerdo con la presente invención, proporcionará, de manera conveniente y sorprendente, tres sitios de acción contra FAW, lo que puede ayudar a reducir o eliminar el requerimiento de áreas de refugio.

CryI Fa se despliega en los productos Herculex®, SmartStax™ y WidesStrike™. El presente par de genes (CryI Da y CryI Ca) podría combinarse, por ejemplo, en un producto de CryI Fa tal como Herculex®, SmartStax™ y WideStrike™. Por lo tanto, el presente par de proteínas podría ser significativo en la reducción de la presión de selección sobre estas otras proteínas. El presente par de proteínas, en consecuencia, podría usarse como en las combinaciones de tres genes para maíz y otras plantas (por ejemplo, algodón y soya).

Como se describe con anterioridad, pueden agregarse también toxinas o genes adicionales de acuerdo con la presente invención. Para el uso de CryI E (para el control de FAW), ver el documento de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Nro. 61/284,278 (presentado el 16 de diciembre de 2009). Para el uso de CryIAb (para el control de ECB), ver la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Nro. 2008/031 1096.

Las plantas (y las áreas plantadas con dichas plantas) que producen cualquiera de las presentes combinaciones de proteínas se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Puede agregarse también toxinas o genes adicionales, si bien las acumulaciones particulares que se describe anteriormente proporcionarán, de manera conveniente y sorprendente, múltiples sitios de acción contra FAW y ECB. Esto puede ayudar a reducir o eliminar el requerimiento de áreas de refugio. Un campo plantado de este modo de más de 4 ha (10 acres) se incluye, por lo tanto, dentro de la presente invención.

Asimismo, puede emplearse GENBANK a fin de obtener las secuencias para cualquiera de los genes y de las proteínas que se revelan o mencionan en esta solicitud. Ver el Apéndice A, a continuación. Las secuencias pertinentes también pueden obtenerse de patentes. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5,188,960 y la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5,827,514 describen proteínas que contienen toxinas núcleo Cry Fa, adecuadas para el uso a fin de llevar a cabo la presente invención. La Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6,218,188 describe secuencias de ADN optimizadas en plantas que codifican proteínas que contienen toxina núcleo CryI Fa, que son adecuadas para el uso en la presente invención.

Las combinaciones de proteínas descritas en esta solicitud pueden usarse para el control de plagas de lepidópteros. Los lepidópteros adultos, por ejemplo, mariposas y polillas, se alimentan principalmente de néctar de flores, y son un efector significativo de la polinización. Casi todas las larvas de lepidópteros, es decir, las orugas, se alimentan de plantas, y muchas son plagas graves. Las orugas se alimentan sobre el follaje o dentro del follaje, o sobre las raíces o el tallo de una planta, y de ese modo, privan a la planta de nutrientes y, a menudo, destruyen la estructura de soporte físico de la planta. Además, las orugas se alimentan de frutos, géneros y granos y flores almacenados, y arruinan estos productos para la venta, o disminuyen en gran medida su valor. De acuerdo con esta solicitud, la referencia a las plagas de lepidópteros se refiere a diversas etapas del ciclo de vida de las plagas, que incluyen las etapas de larvas.

Algunas toxinas quiméricas de la presente invención comprenden una porción de toxina núcleo N-terminal completa de una toxina de Bt, y, en cierto punto después del final de la porción de toxina núcleo, la proteína tiene una transición a una secuencia de protoxina heteróloga. La porción de toxina N-terminal, insecticidamente activa, de una toxina de Bt se denomina la toxina "núcleo". La transición del segmento de toxina núcleo al segmento de protoxina heteróloga puede producirse aproximadamente en la unión de toxina/protoxina, o en forma alternativa, una porción de la protoxina nativa (que se extiende más allá de la porción de toxina núcleo) puede ser retenida, donde la transición a la porción de protoxina heteróloga se produce corriente descendente.

A modo de ejemplo, una toxina quimérica de la presente invención es una porción de toxina núcleo completa de CryI Da (aproximadamente los primeros 600 aminoácidos) y una protoxina heteróloga (el resto de los aminoácidos al término C). En una modalidad preferida, la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina deriva de una toxina de proteína CryIAb. En una modalidad preferida, la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina deriva de una toxina de proteína CryIAb.

El experto en el arte apreciará que las toxinas de Bt, aun dentro de una cierta clase, tal como Cry Ca, variarán a cierto alcance en la longitud y en la ubicación precisa de la transición desde la porción de toxina núcleo hasta la porción de protoxina. Habitualmente, las toxinas Cryi Ca son de alrededor de 1 150 a alrededor de 1200 aminoácidos de longitud. La transición de la porción de toxina núcleo a la porción de protoxina habitualmente se producirá a entre alrededor de 50% y alrededor de 60% de la toxina de longitud completa. La toxina quimérica de la presente invención incluirá la expansión completa de esta porción de toxina núcleo N-terminal. Por lo tanto, la toxina quimérica comprenderá por lo menos aproximadamente 50% de la longitud completa de la proteína de toxina de Bt Cry1 , que habitualmente, será por lo menos aproximadamente 590 aminoácidos. Con respecto a la porción de protoxina, la expansión completa de la porción de protoxina CryIAb se extiende desde el extremo de la porción de toxina núcleo hasta el término C de la molécula.

Genes y toxinas Los genes y las toxinas útiles de acuerdo con la presente invención incluyen no solo las secuencias de longitud completa reveladas, sino, además, fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes y proteínas de fusión que retienen la actividad pesticida característica de las toxinas que se ejemplifican específicamente en esta solicitud. De acuerdo con esta invención, los términos "variantes" o "variaciones" de genes se refieren a secuencias de nucleótidos que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas equivalentes que tienen actividad pesticida. De acuerdo con esta solicitud, el término "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma o esencialmente la misma actividad biológica contra las plagas blanco, que las toxinas reivindicadas.

De acuerdo con esta solicitud, las limitaciones representan aproximadamente 95% (Cryl Da y CryI Ca), 78% (Cryl D y CryI C) y 45% (Cry1 ) de identidad de secuencia, conforme a "Revisión of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D. R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, y D. H. Dean.: Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Estos cortes también pueden aplicarse solamente a las toxinas núcleo.

Será evidente para el experto en el arte que los genes que codifican toxinas activas pueden identificarse y obtenerse a través de varios medios. Los genes o las porciones de genes específicos ejemplificados en esta solicitud pueden obtenerse a partir de aislados depositados en un depositario de cultivos. Estos genes, o sus porciones o variantes, también pueden construirse en forma sintética, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de genes. Las variaciones de genes pueden construirse sin dificultad empleando técnicas convencionales para las modalidades de mutaciones puntuales. Además, pueden prepararse fragmentos de estos genes usando exonucleasas o endonucleasas comerciales, de acuerdo con procedimientos estándares. Por ejemplo, pueden usarse enzimas tales como Bal31 o la mutagénesis dirigida de sitio a fin de cortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. Los genes que codifican fragmentos activos también pueden obtenerse empleando una diversidad de enzimas de restricción. Pueden usarse proteasas para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas de proteína.

Se encuentran dentro del alcance de la presente invención los fragmentos y equivalentes que retienen la actividad pesticida de las toxinas ejemplificadas. Además, debido a la redundancia del código genético, una diversidad de diferentes secuencias de ADN pueden codificar las secuencias de aminoácidos que se revelan en esta solicitud. Se encuentra dentro del conocimiento del experto en el arte la creación de estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas, o esencialmente las mismas toxinas. Estas secuencias de ADN variantes se encuentran dentro del alcance de la presente invención. De acuerdo con esta solicitud, la referencia a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a secuencias que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que no afectan materialmente la actividad pesticida. Los fragmentos de genes que codifican proteínas que retienen actividad pesticida se incluyen también en esta definición.

Un método adicional para la identificación de los genes que codifican las toxinas y las porciones de genes útiles de acuerdo con la presente invención es mediante el uso de sondas de oligonucleótidos. Esas sondas son secuencias de nucleótidos detectables. Estas secuencias pueden ser detectables en virtud de una marca apropiada, o pueden ser inherentemente fluorescentes como se describe en la Solicitud Internacional Nro. WO 93/16094. Como es bien sabido en el arte, si la molécula de sonda y la muestra de ácido nucleico hibridan mediante la formación de un enlace fuerte entre las dos moléculas, puede asumirse razonablemente que la sonda y la muestra tienen homología sustancial. Preferentemente, la hibridación se lleva a cabo en condiciones rigurosas por medio de técnicas bien conocidas en el arte, como lo describen, por ejemplo, Keller, G. H., M. M. Manak (1987): DNA Probes, Stockton Press, New York, N. Y„ pp. 169-170. Algunos ejemplos de concentraciones salinas y combinaciones de temperatura son los siguientes (en orden de rigurosidad creciente): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1X SSPE o SSC a 42°C; 0.1 X SSPE o SSC a 42X; 0.1 X SSPE o SSC a 65°C. La detección de la sonda proporciona un medio para la determinación, de manera conocida, de la producción de hibridación. Dicho análisis de sonda proporciona un rápido método para la identificación de genes que codifican toxinas de la presente invención. Los segmentos de nucleótidos que se usan como sondas de acuerdo con la invención pueden sintetizarse usando un sintetizador de ADN y procedimientos convencionales. Estas secuencias de nucleótidos también pueden usarse como iniciadores de PCR (sigla en inglés de: "reacción en cadena de la polimerasa") a fin de amplificar genes de la presente invención.

Toxinas variantes Ciertas toxinas de la presente invención se han ejemplificado específicamente en esta solicitud. Debido a que estas toxinas son solamente ejemplares de las toxinas de la presente invención, debería ser fácilmente evidente que la presente invención comprende toxinas variantes o equivalentes (y secuencias de nucleótídos que codifican toxinas equivalentes) que tienen la misma o similar actividad pesticida que la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendrán homología de aminoácidos con respecto a una toxina ejemplificada. Esta homología de aminoácidos típicamente será superior al 75%, preferentemente, superior al 90%, y con mayor preferencia, será superior al 95%. La homología de aminoácidos será mayor en regiones críticas de la toxina que representan la actividad biológica o que están involucradas en la determinación de la configuración tridimensional que, en última instancia, es responsable de la actividad biológica. En este sentido, ciertas sustituciones de aminoácidos son aceptables, y pueden esperarse si estas sustituciones se encuentran en regiones que no son críticas para la actividad, o son sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, pueden colocarse aminoácidos en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos y ácidos. Las sustituciones conservadoras, por las cuales un aminoácido de una clase es reemplazado con otro aminoácido del mismo tipo, se encuentran dentro del alcance de la presente invención, siempre que la sustitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. A continuación se presenta un listado de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

En algunos casos, pueden hacerse también sustituciones no conservadoras. El factor decisivo es que estas sustituciones no deben privar significativamente de la actividad biológica de la toxina.

Huéspedes recombinados Los genes que codifican las toxinas de la presente invención pueden introducirse en una amplia variedad de huéspedes de plantas o microbianos. La expresión del gen de toxina logra, directa o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del pesticida. Pueden usarse la transferencia de conjugación y la transferencia recombinada a fin de crear una cepa de Bt que expresa ambas toxinas de la presente invención. Pueden transformarse también otros organismos huéspedes con uno o ambos de los genes de toxina, y luego, usarse para lograr el efecto sinérgico. Con huéspedes microbianos adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios pueden aplicarse al sitio de la plaga, donde proliferarán y serán ingeridos. El resultado es el control de la plaga. Alternativamente, el microbio que alberga el gen de toxina puede tratarse en condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La célula tratada, que retiene la actividad tóxica, puede entonces aplicarse al entorno de la plaga blanco.

Cuando se introduce el gen de toxina Bt por medio de un vector adecuado en un huésped microbiano, y dicho huésped es aplicado al entorno en un estado vivo, es esencial la utilización de ciertos microbios huéspedes. Se seleccionan los huéspedes de microorganismos que se sabe ocupan la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de modo de ser capaces de competir exitosamente en el entorno particular (cultivo y otros hábitats de insectos), con los microorganismos de tipo silvestre; de proporcionar el mantenimiento y la expresión estables del gen que expresa el pesticida de polipéptido; y convenientemente, de proporcionar la mejorada protección del pesticida contra la inactivación y la degradación ambiental.

Se conocen una gran cantidad de microorganismos que habitan el filoplano (la superficie de las hojas de la planta) y/o la rizosfera (el suelo que rodea las raíces de la planta) de una amplia variedad de cultivos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Son de particular interés los microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, de los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, MethylophiUus, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; hongos, en particular, levaduras, por ejemplo, de los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. Son de particular interés las especies bacterianas de la fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus y Azotobacter vinlandii; y especies de levaduras de la fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans. Son de particular interés los microorganismos pigmentados.

Pueden obtenerse una amplia variedad de métodos para la introducción de un gen de Bt que codifica una toxina en un huésped de microorganismo, en condiciones que permiten el mantenimiento y la expresión estables del gen. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en el arte, y se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5,135,867, incorporada en la presente solicitud a modo de referencia.

Tratamiento de células Pueden tratarse células de Bacillus thuringiensis o recombinadas que expresan las toxinas de Bt, a fin de prolongar la actividad de la toxina y estabilizar la célula. La microcápsula pesticida formada comprende una o más de las toxinas de Bt dentro de una estructura celular que ha sido estabilizada y que protegerá la toxina cuando la microcápsula es aplicada al entorno de la plaga blanco. Las células huéspedes adecuadas pueden incluir o bien procariotos o eucariotos, y normalmente, se limitan a aquellas células que no producen sustancias tóxicas para organismos superiores, tales como mamíferos. Sin embargo, podrían usarse organismos que producen sustancias tóxicas para organismos superiores, cuando las sustancias tóxicas sean inestables, o el nivel de aplicación sea suficientemente bajo de modo de evitar cualquier posibilidad de toxicidad a un huésped mamífero. Como huéspedes, serán de particular interés los procariotos y los eucariotos inferiores, tales como hongos.

La célula habitualmente será intacta, y estará sustancialmente en la forma proliferativa cuando es tratada, en lugar de en la forma de espora, si bien, en algunos casos, pueden emplearse esporas.

El tratamiento de la célula microbiana, por ejemplo, un microbio que contiene el gen o los genes de toxina B. t., puede efectuarse por medios químicos o físicos, o mediante una combinación de medios químicos y físicos, siempre que la técnica no afecte de manera nociva las propiedades de la toxina, ni disminuya la capacidad celular para proteger la toxina. Ejemplos de reactivos químicos son agentes halogenantes, en particular, halógenos de número atómico 17-80. Más en particular, puede usarse yodo en condiciones leves y durante un tiempo suficiente para lograr los resultados deseados. Otras técnicas adecuadas incluyen el tratamiento con aldehidos, tales como glutaraldehído; agentes antiinfecciosos, tales como cloruro de zefirano y cloruro de cetilpiridinio; alcoholes, tales como isopropílico y etanol; diversos fijadores histológicos, tales como yodo de Lugol, fijador de Bouin, diversos ácidos y fijador de Helly (ver: Humason, Gretchen L, Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); o una combinación de agentes físicos (calor) y químicos que preservan y prolongan la actividad de la toxina producida en la célula, cuando la célula es administrada al entorno del huésped. Ejemplos de medios físicos son la radiación de longitud de onda corta, como la radiación gamma y la radiación X, el congelamiento, la irradiación de UV, la liofilización y similares. Los métodos de tratamiento de células microbianas se revelan en las Patentes de los Estados Unidos de América Nros. 4,695,455 y 4,695,462, incorporadas en la presente solicitud a modo de referencia.

Las células, en general, tendrán mayor estabilidad estructural, que aumentará la resistencia a las condiciones ambientales. Cuando el pesticida se presenta en una proforma, el método de tratamiento celular debe seleccionarse de modo de no inhibir el procesamiento de la proforma hasta la forma madura del pesticida, por el patógeno de la plaga blanco. Por ejemplo, el formaldehído entrecruzará proteínas y podría inhibir el procesamiento de la proforma de un pesticida de polipéptido. El método de tratamiento debe retener por lo menos una porción sustancial de la biodisponibilidad o bioactividad de la toxina.

Las características de interés particular en la selección de una célula huésped para los propósitos de producción incluyen la facilidad de introducción de uno o más de los genes de B. t. en el huésped; la disponibilidad de sistemas de expresión; la eficiencia de expresión; la estabilidad del pesticida en el huésped; y la presencia de capacidades genéticas auxiliares. Las características de interés para el uso como una microcápsula de pesticida incluyen las cualidades protectoras para el pesticida, tales como paredes celulares gruesas, pigmentación y empaquetado intracelular o la formación de cuerpos de inclusión; sobrevida en entornos acuosos; falta de toxicidad mamífera; atracción para plagas en términos de ingestión; facilidad de muerte y fijación sin daño a la toxina; y similares. Otras consideraciones abarcan la facilidad de formulación y manipulación, la economía, la capacidad de almacenamiento y similares.

Cultivo de células El huésped celular que contiene uno o más genes insecticidas de B. t. puede cultivarse en cualquier medio nutriente conveniente, donde la construcción de ADN proporcione una ventaja de selección, a fin de proporcionar un medio de selección de modo que sustancialmente la totalidad o la totalidad de las células retienen el gen de B. t.. Estas células entonces pueden ser cosechadas de acuerdo con las formas convencionales. Alternativamente, las células pueden tratarse antes de la cosecha.

Las células de B. t. que producen las toxinas de la invención pueden cultivarse usando medios del arte y técnicas de fermentación convencionales. Al finalizar el ciclo de fermentación, las bacterias pueden ser cosechadas, en primer lugar, mediante la separación de las esporas de B. t. y los cristales del caldo de fermentación, por medios bien conocidos en el arte. Los cristales y las esporas de B. t. recuperados pueden formularse como un polvo para mezclar con agua, un concentrado líquido, como gránulos u otras formulaciones, mediante la adición de tensoactivos, dispersantes, portadores inertes y otros componentes, a fin de facilitar la manipulación y la aplicación para las plagas blanco particulares. Estas formulaciones y estos procedimientos de aplicación son bien conocidos en el arte.

Formulaciones Pueden aplicarse al suelo gránulos de cebo formulados, que contienen un atrayente y esporas, cristales y toxinas de los aislados de B. t., o microbios recombinados que comprenden los genes que se obtienen a partir de los aislados de B. t. que se describen en esta solicitud. El producto formulado también puede aplicarse como un revestimiento de semillas o tratamiento de raíces, o un tratamiento de la planta total, en etapas posteriores del ciclo de cultivo. Los tratamientos de plantas y de suelo de células de B. t. pueden emplearse como polvos para mezclar con agua, gránulos o polvos para espolvoreo, mediante la mezcla con diversos materiales inertes, tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos y similares) o materiales botánicos (mazorcas de maíz en polvo, vainas de arroz, cáscaras de nueces y similares). Las formulaciones pueden incluir coadyuvantes para la diseminación y la adhesión, agentes estabilizadores, otros aditivos pesticidas, o tensoactivos. Las formulaciones líquidas pueden ser de base acuosa o no acuosa, y pueden emplearse como espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsionables, o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, tensoactivos, emulsionantes, dispersantes o polímeros.

Como será apreciado por el experto en el arte, la concentración pesticida variará ampliamente de acuerdo con la naturaleza de la formulación particular, en especial, la forma, a decir, un concentrado, o un producto para su utilización directa. El pesticida se presentará en por lo menos 1 % en peso, y puede presentarse en 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán de alrededor de 1-95% en peso del pesticida, mientras que las formulaciones líquidas, en general, tendrán aproximadamente 1-60% en peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones, en general, tendrán de aproximadamente 02 a aproximadamente 104 células/mg. Estas formulaciones se administrarán en una proporción de aproximadamente 50 mg (líquidos o secos) a 1 kg o más por hectárea.

Las formulaciones pueden aplicarse al entorno de la plaga de lepidópteros, por ejemplo, al follaje o al suelo, mediante la pulverización, el espolvoreo, el rociado, o métodos similares.

Transformación de plantas Un huésped recombinado preferido para la producción de las proteínas insecticidas de la presente invención es una planta transformada.

Los genes que codifican proteínas de toxinas de Bt, como se revelan en esta solicitud, pueden insertarse en células de plantas empleando una diversidad de técnicas bien conocidas en el arte. Por ejemplo, una gran cantidad de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en Escherichia coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas pueden obtenerse para la preparación para la inserción de genes extraños en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, la serie pUC, la serie M13mp, pACYC184, inter alia. En consecuencia, el fragmento de ADN que tiene la secuencia que codifica la proteína de toxina de Bt puede insertarse en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se usa para la transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, luego se cosechan y se lisan. Se recupera el plásmido. Se llevan generalmente a cabo el análisis de secuencia, el análisis de restricción, la electroforesis y otros métodos bioquímicos y de biología molecular, como métodos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN utilizada puede disociarse y unirse a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido puede clonarse en los mismos o diferentes plásmidos. De acuerdo con el método de inserción de los genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Por ejemplo, si se usa el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula de planta, entonces por lo menos el borde derecho, si bien, a menudo, los bordes derecho e izquierdo, del ADN-T de plásmido Ti o Ri deben unirse como la región flanqueante de los genes por ser insertados. El uso de ADN-T para la transformación de células de plantas ha sido investigado extensamente y ha sido descrito suficientemente en la patente EP 120 516, en las referencias de Lee y Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986), y An et al., (1985), y se encuentra bien establecido en el arte.

Una vez que el ADN insertado ha sido integrado en el genoma de la planta, es relativamente estable. El vector de transformación normalmente contiene un marcador de selección que confiere, en las células de plantas transformadas, resistencia a un biocida o un antibiótico, tal como bialafos, kanamicina, G418, bleomicina o higromicina, inter alia. El marcador empleado individualmente, en consecuencia, debe permitir la selección de células transformadas, en lugar de células que no contienen el ADN insertado.

Pueden obtenerse una gran cantidad de técnicas para la inserción de ADN en una célula de planta huésped. Dichas técnicas incluyen la transformación con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación; la fusión, inyección, biolística (bombardeo de micropartículas), o la electroporación, al igual que otros métodos posibles. Si se usan Agrobacterium para la transformación, el ADN por ser insertado debe ser clonado en plásmidos especiales, a decir, o bien en un vector intermediario o en un vector binario. Los vectores intermediarios pueden integrarse en el plásmido Ti o Ri por medio de la recombinación homologa, debido a secuencias que son homologas a secuencias en el ADN-T. El plásmido Ti o Ri además comprende la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermediarios no pueden replicarse a sí mismos en Agrobacterium. El vector intermediario puede transferirse a Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse a sí mismos, tanto en E. coli como en Agrobacterium. Estos vectores comprenden un gen marcador de selección y un conector o policonector, que son enmarcados por las regiones de borde de ADN-T derecho e izquierdo. Pueden ser transferidos directamente a Agrobacterium (Holsters et al., 1978). La Agrobacterium utilizada como célula huésped debe comprender un plásmido que porta una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T en la célula de planta. Puede contener ADN-T adicional. La bacteria transformada de este modo se usa para la transformación de células de plantas. Las explantaciones de plantas pueden cultivarse de modo conveniente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula de planta. Entonces pueden regenerarse plantas enteras a partir del material de planta infectado (por ejemplo, trozos de hoja, segmentos de tallo, raíces, aunque también, protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las plantas obtenidas de esta manera luego pueden ser ensayadas a fin de establecer la presencia del ADN insertado. No hay exigencias especiales de los plásmidos en el caso de la inyección y la electroporación. Es posible el uso de plásmidos comunes, tales como derivados de pUC.

Las células transformadas crecen dentro de las plantas en la manera habitual. Pueden formar células germinales y transmitir los rasgos transformados a plantas de descendencia. Dichas plantas pueden cultivarse de la manera normal y cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las correspondientes propiedades fenotípicas.

En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas serán transformadas con genes donde se ha optimizado el uso de codones para plantas. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5,380,831 , incorporada en la presente solicitud a modo de referencia. Si bien en esta solicitud se ejemplifican algunas toxinas truncadas, es bien sabido en el arte de Bt que las toxinas de tipo 130 kDa (longitud completa) tienen una mitad N-terminal que es la toxina núcleo, y una mitad C-terminal que es la "cola" de protoxina. Por lo tanto, las "colas" apropiadas pueden usarse con toxinas truncadas/núcleo de la presente invención. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6,218,188 y la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6,673,990. Además, se conocen en el arte los métodos para la creación de genes sintéticos de Bt para el uso en plantas (Stewart y Burgin, 2007). Un ejemplo no limitativo de una planta transformada preferida es una planta de maíz fértil que comprende un gen de expresión en plantas que codifica una proteína CryI Da, y que además comprende un segundo gen de expresión en plantas que codifica una proteina Cry Ca.

La transferencia (o introgresión) de los rasgos determinados de Cry Da y CryI Ca en líneas de maíz endogámicas puede lograrse mediante el cultivo de selección recurrente, por ejemplo, mediante el retrocruce. En este caso, se cruza en primer lugar un progenitor recurrente deseado con una planta endogámica donante (el progenitor no recurrente) que porta los genes apropiados para los rasgos determinados de CryI D y CryI C. La descendencia de este cruce es luego apareada nuevamente con el progenitor recurrente, y a continuación, se realiza la selección en la descendencia resultante, a fin de establecer los rasgos deseados por ser transferidos desde el progenitor no recurrente. Después de tres, preferentemente, cuatro, más preferentemente, cinco o más generaciones de retrocruces con el progenitor recurrente con la selección de los rasgos deseados, la descendencia será heterocigota con respecto a los loci (lugares) que controlan los rasgos transferidos, aunque será como el progenitor recurrente para la mayoría de, o para casi todos, los otros genes (ver, por ejemplo, la referencia de Poehlman y Sleper (1995): Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987): Principies of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376).

Estrategias de manejo de la resistencia de insectos (IR ) Roush et al., por ejemplo, reseña estrategias de dos toxinas, también denominadas "piramización" o "acumulación", para el manejo de cultivos transgénicos insecticidas (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).

En su página de Internet, la Agencia para la Protección Ambiental de los Estados Unidos de América (United Status Environmental Protection Agency) (epa.gov/oppbppd 1 /biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006. htm) publica los siguientes requisitos para la provisión de refugios no transgénicos (es decir, no B. t.) (una sección de cultivos/maíz no Bt) para el uso con cultivos transgénicos que producen una sola proteína de Bt activa contra plagas blanco.

"Los requisitos estructurados específicos para productos de maíz Bt con protección del perforador de maíz (Cry1 Ab o Cry1 F) son los siguientes: Refugios estructurados: 20% refugio de maíz Bt no lepídóptero en región de maíz; 50% refugio de Bt no lepidóptero en región de algodón.

Bloques: Interno (es decir, dentro del campo de Bt) Externo (es decir, campos separados dentro de los 804.5 m (½ milla) (402.25 m (¼ milla), si es posible) del campo de Bt a fin de maximizar el apareamiento aleatorio).

Franjas dentro del campo: Las franjas deben tener por lo menos 4 filas de ancho (preferentemente, 6 filas) de manera de reducir los efectos del movimiento larval".

Además, la Asociación Nacional de los Estados Unidos de Agricultores del Maíz (National Corn Growers Association), en su página de Internet: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) proporciona asimismo pautas similares con respecto a los requisitos de refugio. Por ejemplo: "Requisitos del IRM del perforador de maíz: -Plantar por lo menos 20% del área de maíz para el refugio de híbridos -En regiones de producción de algodón, el refugio debe ser el 50% -La plantación debe ser dentro de los 804.5 m (1/2 milla) de los híbridos de refugio -El refugio puede plantarse como franjas dentro del campo de Bt; las franjas de refugio deben tener por lo menos 4 filas de ancho -El refugio puede tratarse con pesticidas convencionales solo si se alcanzan los umbrales económicos para insectos blanco -Los insecticidas pulverizables a base de Bt no pueden ser usados en el maíz de refugio -Debe plantarse refugio apropiado en todas las plantaciones con maíz Bt".

Como lo establecen Roush et al. (en las páginas 1780 y 784, columna derecha, por ejemplo), la acumulación o piramización de dos proteínas diferentes, cada una, eficaz contra las plagas blanco y con escasa o nula resistencia cruzada, puede permitir el uso de un refugio menor. Roush sugiere que para una acumulación exitosa, un tamaño de refugio inferior al 10% de refugio puede proporcionar el manejo de la resistencia comparable a aproximadamente un 50% de refugio para un solo rasgo (no piramidal). Para los productos de maíz Bt piramidales actualmente en el mercado, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos requiere un refugio estructurado significativamente menor (en general, del 5%) de maíz no Bt plantado, que para productos de rasgos únicos (en general, del 20%).

Existen diversas formas de proporcionar los efectos de IRM de un refugio, que incluyen diversos patrones geométricos de plantación en los campos (como se menciona anteriormente) y mezclas de semillas en bolsa, como lo describen adicionalmente Roush et al. (supra), y la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6,551 ,96,2.

Los porcentajes anteriores, o relaciones de refugio similares, pueden usarse para las presentes pirámides o acumulaciones dobles o triples. Para las acumulaciones triples con tres sitios de acción contra una sola plaga blanco, una meta sería cero refugio (o menos del 5% de refugio, por ejemplo). Este es el caso particular de las áreas comerciales -por ejemplo, de más de 4 ha (10 acres).

Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisionales y publicaciones referidas o citadas en esta solicitud se incorporan a modo de referencia en su totalidad, al alcance que no sean incoherentes con las descripciones explícitas de esta descripción.

A menos que sea indicado o implicado específicamente, los términos "un", "una" y "el/la" significan "por lo menos uno/a", según se emplea en esta solicitud.

A continuación se presentan ejemplos que ilustran procedimientos para la puesta en práctica de la invención. Estos ejemplos no deben ser interpretados como limitaciones. Todos los porcentajes se expresan en peso, y todas las proporciones de mezclas de solventes se expresan en volumen, a menos que se observe lo contrario. Todas las temperaturas son en grados Celsius.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Marcado de 125l de proteínas Cry.

Yodación de proteínas Se yodaron toxinas Cry truncadas purificadas usando cuentas de yodo (lodo-Beads) o lodo-gen (Pierce). En síntesis, se lavaron dos cuentas de yodo dos veces con 500 µ? de solución salina regulada con fosfato, PBS (fosfato de sodio, 20 mM, NaCI, 0.15 M, pH 7.5), y se colocaron en un tubo centrífugo de 1 ,5 mi, detrás de un escudo de plomo. A estas cuentas se agregaron 100 µ? de PBS. En una capucha, y mediante el uso de técnicas apropiadas de manipulación radiactiva, se agregaron 0.5 mCi de Na 25l (17.4 Ci/mg, Lote 0 4, Amersham) a la solución de PBS con las cuentas de yodo. Los componentes se dejaron reaccionar durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego se agregaron a la solución 2-25 pg de proteína Cry truncada altamente pura y se dejaron reaccionar durante 3-5 minutos adicionales. La reacción se terminó mediante la remoción de la solución de las cuentas de yodo, y su aplicación a una columna giratoria Zeba de desalación de 0.5 mi (InVitrogen) equilibrada con PBS. La cuenta de yodo se lavó dos veces con 10 µ? de PBS cada una, y la solución de lavado se aplicó también a la columna de desalación. La solución radiactiva se eluyó a través de la columna de desalación, mediante la centrifugación a 1000 x g durante 2 min. En el caso de CryI Da, se usó el método de lodo-gen a fin de conducir el procedimiento de radiomarcado. Empleando este procedimiento, en primer lugar, la toxina Cry en regulador de fosfato, 100 mM (pH 8), se limpió para extraer los lipopolisacárido (LPS) mediante su pase a través de una columna pequeña de 0.5 mi de polimixina, múltiples veces. Al tubo de lodo-gen (Pierce Chem. Co.) se agregaron 20 pg de la toxina CryI Da libre de LPS, luego, 0.5 mCi de Na125l. La mezcla de reacción se agitó durante 15 min a 25°C. La solución se extrajo del tubo, y se agregaron 50 µ? de Nal no radiomarcado, 0.2 M, a fin de apagar la reacción. La proteína se dializó contra PBS con tres cambios de regulador, de modo de eliminar cualquier cantidad de 125l no ligado.

Se determinó la radiopureza de las proteínas Cry yodadas por SDS-PAGE (sigla en inglés de: "electroforesis de dodecil sulfato sódico-gel de poliacrilamida"), imagen de fósforo y recuento gamma. En síntesis, se separaron 2 µ? de la proteína radiactiva por SDS-PAGE. Luego de la separación, los geles se secaron usando un aparato de secado de gel BioRad siguiendo las instrucciones del fabricante. Se tomaron muestras de los geles secados mediante su envoltura en película Mylar (12 µ?t? de espesor), y su exposición bajo una pantalla de fósforo de almacenamiento Molecular Dynamics (35 cm x 43 cm), durante 1 hora. Las placas se desarrollaron usando un instrumento de toma de imágenes Molecular Dynamics Storm 820, y las imágenes se analizaron usando el programa informático ImageQuant™. La banda radiactiva junto con las áreas inmediatamente superiores e inferiores a la banda se cortaron del gel usando una hoja de afeitar, y se sometieron a recuento en un contador gamma. La radiactividad solo fue detectada en la banda de proteína Cry y en las áreas debajo de la banda. No se detectó radiactividad sobre la banda, lo que indicó que todos los contaminantes radiactivos consistieron en componentes de proteínas menores que la proteína Cry truncada. Estos componentes, muy probablemente, representan productos de degradación.

EJEMPLO 2 Protocolo de preparación de BBMV.

Preparación y fraccionado de BBMV solubilizadas Se sometió al ayuno de una noche a larvas de la última crisálida de Spodoptera frugiperda, Ostrinia nubilalis, o Heleothis. zea, y luego, se disecaron las larvas a la mañana, después del enfriamiento en hielo durante 15 minutos. Se extrajo el tejido de la zona embrionaria del tubo digestivo de la cavidad corporal, dejando atrás la parte posterior del canal alimenticio adjunto al integumento. La zona embrionaria del tubo digestivo se colocó en un volumen 9 X de regulador helado de homogeneización (manitol, 300 mM, EGTA, 5 mM, base Tris, 17 mM, pH 7.5), suplementado con cóctel de inhibidor de proteasa1 (Sigma P-2714) diluido según lo recomendado por el proveedor. El tejido se homogenizó con 15 golpes de un homogeneizador de tejido de vidrio. Se prepararon BBMV por el método de precipitación de MgCI2 de Wolfersberger (1993). En resumen, se mezcló un volumen equivalente de una solución, 24 mM, de MgC en manitol, 300 mM, con el homogenado de la zona embrionaria del tubo digestivo, y la mezcla se agitó durante 5 minutos y luego se dejó reposar en hielo durante un período de 15 min. La solución se centrifugó a 2500 x g un lapso de tiempo de 15 min a 4°C. Se reservó el sobrenadante, y la miniesfera se suspendió en el volumen original de 1 Las concentraciones finales de los componentes del cóctel (en µ?) son AEBSF (500), EDTA (250 mM), Bestatin (32), E-64 (0.35), Leupeptina (0.25) y aprotinina (0.075). regulador de homogeneización diluido 0.5 X y se centrifugó nuevamente. Los dos sobrenadantes se combinaron y se centrifugaron a 27,000 x g durante 30 min a 4°C, a fin de formar la fracción de BBMV. La miniesfera se suspendió en 10 mi de regulador de homogeneización, se suplemento con inhibidores de proteasa y se centrifugó nuevamente a 27,000 x g durante 30 min a 4°C a fin de lavar las BBMV. La miniesfera resultante se suspendió en regulador de almacenamiento de BBMV (HEPES, 10 mM, KCI, 130 mM, glicerol al 10%, pH 7.4) hasta una concentración de aproximadamente 3 mg/ml de proteína. La concentración de proteína se determinó usando el método Bradford (1976) con albúmina sérica bovina (BSA) como la guía. La determinación de fosfatasa alcalina se efectuó antes del congelamiento de las muestras usando el ensayo Sigma siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad específica de esta enzima de marcador en la fracción de BBMV aumentó típicamente 7 veces en comparación con aquella hallada en la fracción de homogenado de la zona embrionaria del tubo digestivo. Las BBMV se dividieron en alícuotas de muestras de 250 µ?, se congelaron instantáneamente en N2 líquido y se almacenaron a -80°C.

EJEMPLO 3 Método para la medición de la unión de proteínas Cry 125l a proteínas BBMV Unión de proteínas Cry 25l a BBMV A fin de determinar la cantidad óptima de proteína BBMV para el uso en los ensayos de unión, se generó una curva de saturación. Se incubó proteína Cry radiomarcada con 125l (0.5 nM) durante 1 h a 28°C, con diversas cantidades de proteína BBMV, que variaron de 0-500 pg/ml en regulador de unión (NaHP04, 8 mM, KH2P04, 2 mM; NaCI, 150 mM, 0.1 % de albúmina sérica bovina, pH 7.4). El volumen total fue de 0.5 mi. La proteína Cry 125l ligada se separó de la no ligada mediante la toma de muestras de 150 µ? de la mezcla de reacción, por triplicado, de un tubo centrífugo de 1 .5 mi, a un tubo centrífugo de 500 µ?, y la centrifugación de las muestras a 14,000 x g durante 6 minutos, a temperatura ambiente. El sobrenadante se removió suavemente, y la miniesfera se lavó suavemente tres veces con regulador de unión helado. La base de la centrífuga que contenía la miniesfera se separó mediante el corte y se colocó en un tubo de cultivo de vidrio de 13 x 75 mm. Las muestras se sometieron a recuento durante 5 minutos cada vez, en el contador gamma. Los recuentos contenidos en la muestra se sustrajeron de los recuentos de fondo (reacción sin ninguna proteína) y se trazaron en función de la concentración de proteína BBMV. Se determinó que la cantidad óptima de proteína por utilizar era de 0.15 mg/ml de proteína BBMV.

A fin de determinar la cinética de unión, se generó una curva de saturación. En síntesis, se incubaron BBMV (150 pg/ml) durante 1 h a 28°C, con concentraciones crecientes de toxina Cry 125l, que variaron de 0.01 a 10 nM. La unión total se determinó mediante la toma de muestras de 50 µ? de cada concentración por triplicado, la centrifugación de la muestra, y el recuento como se describe anteriormente. La unión no específica se determinó de la misma manera, con la adición de 1000 nM de la toxina Cry no radiactiva homologa tripsinada agregada a la mezcla de reacción a fin de saturar todos los sitios de unión de receptor no específicos. La unión específica se calculó como la diferencia entre la unión total y la unión no específica.

Se llevaron a cabo ensayos de unión de competición homólogos y heterologos usando 150 pg/ml de proteína BBMV y 0.5 nM de la proteína Cry radiomarcada con 125l. La concentración de la toxina Cry no radiomarcada competitiva agregada a la mezcla de reacción varió de 0.045 a 1000 nM, y se agregó al mismo tiempo que el ligando radiactivo, a fin de garantizar la competición de unión genuina. Las incubaciones se llevaron a cabo durante 1 h a 28°C, y la cantidad de proteína Cry 125l ligada a su toxina de receptor se midió como se describe anteriormente, con la unión no específica sustraída. Se determinó cien por ciento de unión total en ausencia de cualquier ligando competidor. Los resultados se trazaron en un gráfico semilogarítmico como el porcentaje de unión específica total en comparación con la concentración de ligando competitivo agregado.

EJEMPLO 4 Síntesis de los resultados La Figura 1 muestra el porcentaje de unión específica de 125l Cryl Da (0,5 nM) en BBMV de FAW en comparación con la competición por Cryl Da (o) homóloga no marcada y CryI Ca heteróloga (¦). La curva de desplazamiento para la competición homóloga por CrylDa logra una curva de forma sigmoidea que muestra 50% de desplazamiento del radioligando a aproximadamente 1 ,5 nM de Cryl Da. CryI Ca no desplaza la unión específica de 125l Cryl Da en ninguna concentración ensayada, de hasta 1000 nM, o 2000 veces la concentración de 125l Cryl Da utilizada en el ensayo.

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APÉNDICE A Listado de delta-endotoxinas - de la página de Internet de Crickmore ef al. (citada en la solicitud).

El Número de Acceso es a la entrada del NCBI (Centro Nacional de Información sobre Biotecnología de los Estados Unidos).

Estruch PNAS 93.

Vip3Aa1 Vip3Aa AAC37036 1996 AB88 et al 5389-5394 Estruch PNAS 93.

Vip3Aa2 Vip3Ab AAC37037 1996 AB424 et al 5389-5394 EUA Estruch V¡p3Aa3 Vip3Ac 2000 6137033 et al i ¡Oct 2000 Vip3Aa4 WÓ9818 EUA 932(A2,A PS81 F Feitelson V¡p3Aa5 AAR81080 1998 6656908 Bt 3) 7 Sup et al PS81 F °' ' Dic 2003 mayo 1998 W09818 Vip3Aa6 !Bt no Vip3Aa7 Vip83 ÍAAK95326 Cai et al ¡2001 YBT- publicada 833 Loguercio Vip3Aa8 Vip3A AAK97481 no jBt 2001 et al publicada 'HD125 Selvapan no Vip3Aa9 VipS CAA76665 diyan et 2001 Bt A13 publicada al Protein Vip3Aa10 Vip3V AAN60738 Doss et al :2002 Expr. Purif. Bt 26. 82-88 no Vip3Aa1 1 Vip3A AAR36859 Liu et al 2003 Bt C9 publicada Vip3A- Vip3Aa12 AAM22456 no Bt WB5 GuUar 28 publicada Sheng Wu .Gong Chen et Cheng Xue !Bt Vip3Aa13 Vip3A ;AAL69542 2002 al Bao 18, S184 687-692 Bt Vip3Aa14 Vip AAQ 12340 Polumetla 2003 n° . tolwort et al publicada Vip3Aa15 Vip3A AAP51 131 Wu et al -2004 n° . : publicada WB50 AAW6513 Mesrati Pt FEMS Micro Vip3Aa16 Vip3LB ^Wbt>^ ^esrati et 2005 Lett 244, Bt 353-358 EUA W099572 Vip3Aa17 Jav90 ^f'30" 1999 6603063 ^l,n 82(A2,A3) et al ——— ^nn„ 1990 11 Nov agosto 2003 i ggg Vip3Aa18 AAX49395 ai and ¡2005™ r ? „ ^ Xiao publicada 9816C Vip3Aa 9 Vip3ALD DQ241674 Liu et al 2006 n° . Bt AL publicada Vip3Aa19 V¡p3A-1 DQ539887 Hart et al ;2006 ?° . . publicada Vip3Aa20 Vip3A-2 DQ539888 Hart et al '2006 n° ,. . , publicada Vip3Aa21 Vip ABD84410 Panban9r 2006 n° ,. Bt : ed publicada laizawai Vip3Aa22 ???43?" AAY41427 Lu et al 2005 no. .. . Bt LS1 LS1 publicada no Vip3Aa23 ^ IAAY41 28 Lu et al 2005 ¡Bt LS8 publicada Song et no Bt WZ-Vip3Aa24 Bl 880913 2007 al publicada 7 Hsieh et no Vip3Aa25 :EF608501 2007 al publicada Shen and no Vip3Aa26 EU294496 2007 Bt TF9 Guo publicada Shen and no Vip3Aa27 EU332167 2007 Bt 16 Guo publicada Xiumei no Bt V¡p3Aa28 FJ494817 2008 Yu publicada JF23-8 Xieumei no Bt Vip3Aa29 FJ626674 2009 et al publicada JF21-1 Xieumei no V¡p3Aa30 FJ626675 2009 MD2-1 et al publicada Xieumei ino V¡p3Aa31 FJ626676 2009 JF21-1 et al publicada Xieumei no Vip3Aa32 FJ626677 2009 MD2-1 et al publicada W09957 EUA Bt V¡p3Ab1 Vip3B AAR40284 Feit®lson 1999 6603063 KB59A 282(A2,A agosto 2003 ¡4-6 nov 1999 Vip3Ab2 Vip3D AAY88247 ^ and 2006 ¡¡¡°b|¡cada Bt Shen Solicitud Narva et EUA Vip3Ac1 PS49C al 2004012871 Solicitud PS158C Narva et EUA Vip3Ad1 al 2004012871 6 Van Rie no Vip3Ad2 ISP3B CAI43276 2005 Bt et al publicada VipSAel ISP3C ;CAI43277 R¡e "2005 ~bHcada Bt ViP3Af1 ISP3A |CAI432Z5 ^an Rie 2005 no^^ Bt WO Vip3Af2 V¡p3C ADN08753 Syngenta 03/075655 Vip3Ag1 Vip3B ADN08758 Vip3Ag2 FJ556803 A,Udth° et ?008 al Vip3Ah1 Vip3S DQ832323 and ¡2006 ?° .. .

Shen I publicada Vip3Ba1 AAV70653 R,ang et ¡2004 no. .. . al ; publicada WO Vip3Bb1 V¡p3Z ADN08760 Syngenta ]. ¿3/075655 Vip3Bb2 EF439819 Akhurst ¡2007 et al

Claims (23)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 .- Una planta transgénica que comprende ADN' que codifica una proteína insecticida CryI Da y ADN que codifica una proteína insecticida Cry Ca.

2. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha planta además comprende ADN que codifica una tercera proteína insecticida, en donde dicha tercera proteína se selecciona del grupo que consiste en CryI Fa, Vip3Ab, CryI Be y CryI E.

3. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha tercera proteína se selecciona del grupo que consiste en CryI Fa y CryI Be, en donde la planta además comprende ADN que codifica una cuarta y quinta proteínas insecticidas seleccionadas del grupo que consiste en Cry2A, Cry.1 l, DIG-3 y CryIAb.

4. - Una semilla de una planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichas semilla comprende dicho ADN.

5. - Un campo de plantas que comprende plantas de refugio no Bt y una pluralidad de plantas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichas plantas de refugio representan menos de 40% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

6. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio representan menos de 30% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

7. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio representan menos de 20% de todas las plantas dé cultivo en dicho campo.

8. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio representan menos de 10% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

9. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio representan menos de 5% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

10. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio están en bloques o franjas.

1 1.- Una mezcla de semillas que comprende semillas de refugio de plantas de refugio no Bt, y una pluralidad de semillas de conformidad con la reivindicación 4, en donde dichas semillas de refugio representan menos de 40% de todas las semillas en la mezcla.

12. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio representan menos de 30% de todas las semillas en la mezcla.

13. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio representan menos de 20% de todas las semillas en la mezcla.

14.- La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio representan menos de 10% de todas las semillas en la mezcla.

15.- La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio representan menos de 5% de todas las semillas en la mezcla.

16. - Un método para el manejo del desarrollo de resistencia por un insecto a una proteína Cry, en donde dicho método comprende la plantación de semillas para producir un campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5.

17. - Un campo de conformidad con cualquiera de las reivindicación 5 a 10, en donde dichas plantas ocupan más de 10 acres (4.04 ha)

18 - Una planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, soya y algodón.

19.- La planta de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque dicha planta es una planta de maíz.

20.- Una célula de planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha célula de planta comprende dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida CryICa y dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida Cryl Da, en donde dicha proteína insecticidad CryI Ca es al menos idéntica en 99% con la SEQ ID NO:1 y dicha proteína insecticida CryI Da es al menos idéntica en 99% con la SEQ ID NO:2.

21. - Una planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha proteína insecticida CryICa comprende SEQ ID NO:1 y dicha proteína insecticida Cry1 Da comprende SEQ ID NO:2.

22. - Un método para producir la célula de planta de la reivindicación 20.

23. - Un método para controlar un insecto oruga combatiente del otoño al poner en contacto a dicho insecto con una proteína insecticida CryICa y con una proteína insecticida CryI Da.