BR112020026771A2 - Composições agrícolas que compreendem micróbios de fixação de nitrogênio remodelados - Google Patents

Abstract

a presente revelação fornece micróbios não intergenéricos remodelados que são capazes de fixar nitrogênio atmosférico e liberá-lo às plantas de uma forma direcionada, eficiente e ambientalmente sustentável. a utilização dos produtos microbianos ensinados permitirá que os fazendeiros obtenham rendimentos de colheitas mais produtivos e previsíveis sem a degradação de nutrientes, lixiviação ou escoamento tóxico associados aos fertilizantes derivados sinteticamente de nitrogênio tradicionais. os micróbios remodelados ensinados nesse relatório descritivo são capazes de serem combinados com química agrícola de ponta e germoplasma de elite. além disso, a revelação fornece tratamentos de sementes que compreendem micróbios remodelados.

Description

COMPOSIÇÕES AGRÍCOLAS QUE COMPREENDEM MICRÓBIOS DE FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO REMODELADOS REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pedido Provisório dos EUA Nº 62/690.621, depositado em 27 de junho de 2018 e o Pedido Provisório dos EUA Nº 62/808.693, depositado em 21 de fevereiro de 2019. Esses pedidos são incorporados nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade para todas as finalidades.

DECLARAÇÃO EM RELAÇÃO À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O conteúdo do arquivo de texto submetido eletronicamente com esse relatório descritivo é aqui incorporado por referência em sua totalidade; é fornecida uma cópia em formato legível por computador da Listagem de sequências; nome do arquivo: PIVO_004_02WO_SeqList_ST25.txt, criada em 18 de junho de 2019; tamanho do arquivo ≈ 578 kilobytes.

FUNDAMENTOS DA REVELAÇÃO

[003] Por volta de 2050 a Organização de Alimentos e Agricultura das Nações Unidas projeta que a produção de alimentos total deve aumentar por 70% para atender às necessidades de uma população em crescimento, um desafio que é exacerbado por diversos fatores, incluindo: diminuição dos recursos de água doce, competição crescente por terra arável, preços de energia crescentes, custos de insumos crescentes e a necessidade provável para que os cultivos se adaptem às pressões de um clima global mais seco, mais quente e mais extremo.

[004] As práticas agrícolas atuais não estão bem equipadas para atender a essa demanda crescente pela produção de alimentos equilibrando, simultaneamente, os impactos ambientais que resultam da intensidade agrícola aumentada.

[005] Um dos principais insumos agrícolas necessários para satisfazer a demanda global por alimentos é o fertilizante de nitrogênio. No entanto, o padrão industrial atual utilizado para produzir fertilizante de nitrogênio é um método artificial de fixação de nitrogênio denominado processo de Haber–Bosch, que converte nitrogênio atmosférico (N2) em amônia (NH3) por uma reação com hidrogênio (H2) usando a catalisador de metal sob temperaturas e pressões altas. Esse processo faz uso intensivo de recursos e deletério para o ambiente.

[006] Em contraste com o processo sintético de Haber- Bosch, certos sistemas biológicos se desenvolveram para fixar nitrogênio atmosférico. Esses sistemas utilizam uma enzima denominada nitrogenase que catalisa a reação entre N2 e H2, e resulta em fixação de nitrogênio. Por exemplo, rizóbias são bactérias diazotróficas que fixam nitrogênio após se estabelecerem dentro de nódulos da raiz de legumes. Um objetivo importante da pesquisa sobre fixação de nitrogênio é a extensão desse fenótipo às plantas não- leguminosas, particularmente às gramíneas agronômicas importantes como, por exemplo, trigo, arroz e milho. No entanto, apesar do progresso significante feito na compreensão do desenvolvimento da simbiose de fixação de nitrogênio entre rizóbias e legumes, o caminho para utilizar aquele conhecimento para induzir nódulos de fixação de nitrogênio em plantios de não leguminosas ainda não está claro.

[007] Consequentemente, a grande maioria da agricultura de cultura em fileiras moderna utiliza fertilizante de nitrogênio que é produzido por meio do uso intensivo de recursos e do processo ambientalmente deletério de Haber– Bosch. Por exemplo, o USDA (“United States Department of Agriculture” - Departamento de Agricultura dos Estados Unidos) indica que o fazendeiro de milho médio dos EUA tipicamente aplica entre 58,96 kg (130 lb) e 90,71 kg (200 lb) de nitrogênio por acre (146 a 224 kg/ha). Esse nitrogênio não somente é produzido em um processo sintético com uso intensivo de recursos, mas é aplicado por maquinário pesado que cruza/impacta o solo do campo, queima petróleo e exige horas de trabalho humano.

[008] Além disso, o fertilizante de nitrogênio produzido pelo processo industrial de Haber-Bosch não é bem utilizado pelo cultivo-alvo. Chuva, escoamento, calor, volatilização, e o microbioma do solo degradam o fertilizante químico aplicado. Isso significa não apenas desperdício de dinheiro, mas também se soma poluição aumentada ao invés de aumento do rendimento colhido. Para essa finalidade, as Nações Unidas calcularam que quase 80% dos fertilizantes são perdidos antes que uma cultura possa utilizá-lo. Consequentemente, a produção e liberação de fertilizantes agrícolas modernos não apenas são deletérios para o ambiente, mas também extremamente ineficientes.

[009] A fim de atender às necessidades crescentes de fornecimento de alimentos do mundo – equilibrando, ao mesmo tempo, a utilização de recursos e fornecendo impactos mínimos sobre sistemas ambientais - uma abordagem melhor para a fixação e liberação de nitrogênio às plantas é urgentemente necessária.

SUMÁRIO DA REVELAÇÃO

[0010] Em alguns aspectos, a revelação se destina geralmente a uma composição para tratamento de sementes, que compreende: (a) uma pluralidade bactérias não intergenéricas remodeladas que possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de planta de pelo menos cerca de 1,0 x 104 células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de planta e produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora; e (b) pelo menos um pesticida.

[0011] Em alguns aspectos, o pesticida é um fungicida. Em alguns aspectos, o pesticida é um fungicida selecionado do grupo que consiste em: fludioxonil, metalaxil, mefenoxam, azoxistrobina, tiabendazol, ipconazol, tebuconazol, protioconazol, e combinações destes.

[0012] Em alguns aspectos, o pesticida é um inseticida. Em alguns aspectos, o pesticida é um inseticida neonicotinóide. Em alguns aspectos, o pesticida é um inseticida selecionado do grupo que consiste em: imidacloprida, clotianidina, tiametoxam, clorantraniliprol, e combinações destes.

[0013] Em alguns aspectos, o (pelo menos um) pesticida é um fungicida e uma combinação inseticida. Em alguns aspectos, o pesticida é um nematicida. Em alguns aspectos, o pesticida é um herbicida. Em alguns aspectos, o pesticida é selecionado daqueles na Tabela 13.

[0014] Em alguns aspectos, as bactérias não intergenéricas remodeladas e pesticidas exibem um efeito sinérgico.

[0015] Em alguns aspectos, o tratamento de sementes é disposto sobre uma semente. Em alguns aspectos, o tratamento de sementes é disposto sobre uma semente da família Poaceae. Em alguns aspectos, o tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de cereal. Em alguns aspectos, o tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, milheto, aveia, centeio ou triticale. Em alguns aspectos, o tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho. Em alguns aspectos, o tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho modificada geneticamente.

[0016] Em alguns aspectos, o tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho modificada geneticamente, em que o referido milho compreende um traço de tolerância a herbicidas. Em alguns aspectos, o tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho modificada geneticamente, em que o referido milho compreende um traço de resistência a insetos. Em alguns aspectos, o tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho modificada geneticamente, em que o referido milho compreende um traço de tolerância a herbicidas e um traço de resistência a insetos. Em alguns aspectos, o tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho modificada geneticamente, em que o referido milho compreende um traço listado na Tabela 19.

[0017] Em alguns aspectos, o tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho não modificada geneticamente. Em alguns aspectos, o tratamento de sementes é disposto sobre um milho doce, milho duro, milho de pipoca, milho dentado, milho tunicata ou milho de farinha.

[0018] Em alguns aspectos, as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado em uma planta exposta a elas. Em alguns aspectos, as bactérias não intergenéricas remodeladas são capazes de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

[0019] Em alguns aspectos, cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não codificador, da rede regulatória genética de fixação ou assimilação de nitrogênio. Em alguns aspectos, cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende uma sequência de controle introduzida ligada operacionalmente a pelo menos um gene da rede regulatória genética de fixação ou assimilação de nitrogênio. Em alguns aspectos, cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende um promotor heterólogo ligado operacionalmente a pelo menos um gene da rede regulatória genética de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[0020] Em alguns aspectos, cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em um membro selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, um gene associado à biossíntese de uma enzima nitrogenase, ou combinações destes.

[0021] Em alguns aspectos, cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não codificador, da rede regulatória genética de fixação ou assimilação de nitrogênio que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade diminuída de remoção de adenilil de GlnE; ou atividade diminuída de remoção de uridilil de GlnD.

[0022] Em alguns aspectos, cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL. Em alguns aspectos, cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que não possui um domínio de remoção de adenilil (AR). Em alguns aspectos, cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

[0023] Em alguns aspectos, cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende pelo menos um de: um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL; um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que não possui um domínio de remoção de adenilil (AR); um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB; e combinações destes. Em alguns aspectos, cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que não possui um domínio de remoção de adenilil (AR). Em alguns aspectos, cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que não possui um domínio de remoção de adenilil (AR) e um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

[0024] Em alguns aspectos, as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas estão presentes em uma concentração de cerca de 1 x 105 até cerca de 1 x 107 cfu por semente. Em alguns aspectos, as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem pelo menos duas espécies diferentes de bactérias. Em alguns aspectos, as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem pelo menos duas cepas diferentes da mesma espécie de bactérias.

[0025] Em alguns aspectos, as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias selecionadas de: Rahnella aquatilis, Klebsiella variicola, Achromobacter spiritinus, Achromobacter marplatensis, Microbacterium murale, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Enterobacter sp., Azospirillum lipoferum, Kosakonia sacchari, e combinações destas.

[0026] Em alguns aspectos, as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas.

[0027] Em alguns aspectos, as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias selecionadas de: uma bactéria depositada como NCMA 201701002, uma bactéria depositada como NCMA 201708004, uma bactéria depositada como NCMA 201708003, uma bactéria depositada como NCMA 201708002, uma bactéria depositada como NCMA 201712001, uma bactéria depositada como NCMA 201712002, e combinações destas.

[0028] Em alguns aspectos, as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias com uma sequência de ácidos nucleicos que compartilha pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177- 260, 296-303. Em alguns aspectos, as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias com uma sequência de ácidos nucleicos que compartilha pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência para uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177- 260, 296-303. Em alguns aspectos, as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias com uma sequência de ácidos nucleicos que compartilha pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência para uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177- 260, 296-303. Em alguns aspectos, as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260, 296-303.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0029] FIG. 1A retrata uma visão geral do processo de remodelagem microbiana guiada, de acordo com modalidades; a FIG. 1B retrata uma visão expandida da medição de composição do microbioma como mostrado na FIG. 1A; a FIG. 1C retrata uma abordagem problemática “bioprospecção tradicional”, que possui várias desvantagens comparada com a plataforma de remodelagem microbiana guiada (GMR) ensinada; a FIG. 1D retrata um sistema problemático de “abordagem de campo primeiro para bioprospecção”, que possui várias desvantagens comparado com a plataforma de remodelagem microbiana guiada (GMR) ensinada; a FIG. 1E retrata o período de tempo no ciclo de crescimento do milho, no qual o nitrogênio é mais necessário pela planta; a FIG. 1F retrata uma visão geral de um processo de desenvolvimento no campo para um micróbio remodelado; a FIG. 1G retrata uma visão geral de uma modalidade de plataforma de remodelagem microbiana guiada; a FIG. 1H retrata uma visão geral de a plataforma de remodelagem microbiana computacionalmente guiada; a FIG. 1I retrata o uso de dados de campo combinados com modelagem em aspectos da plataforma de remodelagem microbiana guiada; a FIG. 1J retrata cinco propriedades que podem ser possuídas por micróbios remodelados da presente revelação; a FIG. 1K retrata uma representação esquemática de uma abordagem de remodelagem para um micróbio, PBC6.1; a FIG. 1L retrata expressão desacoplada de nifA da regulação de nitrogênio endógeno em micróbios remodelados; a FIG. 1M retrata assimilação e excreção aumentadas de nitrogênio fixado por micróbios remodelados; a FIG. 1N retrata aumento do rendimento de milho atribuível aos micróbios remodelados; a FIG. 1O ilustra a ineficiência de sistemas de liberação de nitrogênio atuais, que resultam em campos subfertilizados, campos hiperfertilizados e escoamento de nitrogênio ambientalmente deletério; a FIG. 2 ilustra PBC6.1 colonização até quase 21% de abundância da microbiota associada à raiz em raízes de milho.

Os dados de abundância se baseiam em sequenciamento do amplicon 16S da rizosfera e endosfera de plantas de milho inoculadas com PBC6.1 e desenvolvidas em condições de estufa; as FIGS. 3A-3E ilustram micróbios derivados que fixam e excretam nitrogênio in vitro sob condições similares aos solos agrícolas ricos em nitrato.

A FIG. 3A ilustra a rede regulatória que controla a fixação de nitrogênio e assimilação em PBC6.1, incluindo os nós cruciais NifL, NifA, GS, GlnE retratados como a enzima de dois domínios ATase-AR, e AmtB.

A FIG. 3B ilustra o genoma de Kosakonia sacchari isolado PBC6.1. As três pistas que circunscrevem o genoma transmitem os dados de transcrição de PBC6.1, PBC6.38, e a expressão diferencial entre as cepas, respectivamente.

A FIG. 3C ilustra o agrupamento de genes de fixação de nitrogênio e dados de transcrição são expandidos para detalhes mais finos.

A FIG. 3D ilustra atividade de nitrogenase sob concentrações variáveis de nitrogênio exógeno é medida com o ensaio de redução de acetileno.

A cepa do tipo selvagem exibe repressão da atividade de nitrogenase à medida que as concentrações de glutamina aumentam, enquanto cepas derivadas exibem graus variáveis de robustez.

No gráfico de linhas, triângulos representam a cepa PBC6.22; círculos representam a cepa PBC6.1; quadrados representam a cepa PBC6.15; e diamantes representam a cepa PBC6.14. Barras de erro representam erro-padrão da média de pelo menos três réplicas biológicas.

A FIG. 3E ilustra excreção temporal de amônia por cepas derivadas observada em concentrações mM.

Não foi observada excreção pelas cepas do tipo selvagem de nitrogênio fixado, e amônia desprezível se acumula nos meios.

Barras de erro representam erro-padrão da média; a FIG. 4 ilustra taxas de transcrição de nifA em cepas derivadas de PBC6.1 correlacionadas com taxas de redução de acetileno.

Um ensaio de ARA foi realizado como descrito nos Métodos, e depois as culturas tiveram amostras coletadas e foram submetidas à análise por qPCR para determinar níveis de transcrito de nifA.

Barras de erro mostram erro-padrão da média de pelo menos três réplicas biológicas em cada medição; as FIGS. 5A-5C ilustram experimentos em estufa que demonstram fixação microbiana de nitrogênio no milho.

A FIG. 5A ilustra colonização de micróbios seis semanas após inoculação de plantas de milho por cepas derivadas de PBC6.1. Barras de erro mostram erro-padrão da média de pelo menos oito réplicas biológicas.

A FIG. 5B ilustra transcrição in planta de nifH medida por extração de RNA total de raízes e subsequente análise Nanostring.

Somente cepas derivadas exibem transcrição de nifH no ambiente da raiz.

Barras de erro mostram erro-padrão da média de pelo menos três réplicas biológicas.

A FIG. 5C ilustra fixação microbiana de nitrogênio medida pela diluição de traçador isotópico em tecidos de plantas.

Micróbios derivados exibem transferência substancial de nitrogênio fixado para as plantas.

Barras de erro mostram erro-padrão da média de pelo menos dez réplicas biológicas; a FIG. 6 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI006; a FIG. 7 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI019; a FIG. 8 retrata um mapa de calor dos quilogramas de nitrogênio liberados por acre-estação por micróbios da presente revelação registrados em função de micróbios por g- peso fresco por mmol de nitrogênio / micróbio-hora.

Abaixo da linha fina que corta a imagem maior estão os micróbios que liberam menos do que 454 g (uma libra) de nitrogênio por acre-estação, e acima da linha estão os micróbios que liberam mais do que 454 g (uma libra) de nitrogênio por acre-estação.

A tabela abaixo do mapa de calor dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio hora) juntamente com a CFU precisa por grama de peso fresco (CFU/g fw) para cada micróbio mostrado no mapa de calor.

Os micróbios utilizados no mapa de calor foram testados para produção de N no milho.

Para as cepas WT CI006 e CI019, os dados de colonização da raiz de milho foram retirados de um único local de campo.

Para as cepas restantes, a colonização foi pressuposta como sendo a mesma que o nível de campo WT.

A atividade de fixação de N foi determinada usando um ensaio de ARA in vitro a 5 mM de glutamina; a FIG. 9 retrata o rendimento de plantas de plantas que foram expostas à cepa CI006. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde ao tratamento de MRTN particular.

O eixo-x é o valor p e o eixo-

y é a taxa de sucesso; a FIG. 10 retrata o rendimento de plantas de plantas que foram expostas à cepa CM029. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde ao tratamento de MRTN particular.

O eixo-x é o valor p e o eixo- y é a taxa de sucesso; a FIG. 11 retrata o rendimento de plantas de plantas que foram expostas à cepa CM038. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde ao tratamento de MRTN particular.

O eixo-x é o valor p e o eixo- y é a taxa de sucesso; a FIG. 12 retrata o rendimento de plantas de plantas que foram expostas à cepa CI019. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde ao tratamento de MRTN particular.

O eixo-x é o valor p e o eixo- y é a taxa de sucesso; a FIG. 13 retrata o rendimento de plantas de plantas que foram expostas à cepa CM081. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde ao tratamento de MRTN particular.

O eixo-x é o valor p e o eixo- y é a taxa de sucesso; a FIG. 14 retrata o rendimento de plantas de plantas que foram expostas às cepas CM029 e CM081. A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde ao tratamento de MRTN particular.

O eixo-x é o valor p e o eixo-y é a taxa de sucesso; a FIG. 15 retrata o rendimento de plantas de plantas como ganho/perda agregada por alqueire.

A área dos círculos corresponde ao rendimento relativo, enquanto o sombreado corresponde ao tratamento de MRTN particular.

O eixo-x é o valor p e o eixo-y é a taxa de sucesso; a FIG. 16 ilustra resultados de um experimento de testagem de campo no verão de 2017. Os resultados do rendimento obtidos demonstram que os micróbios da revelação podem servir como uma substituição de fertilizante potencial.

Por exemplo, a utilização de um micróbio da revelação (ou seja, 6-403) resultou em um rendimento maior do que a cepa do tipo selvagem (WT) e um rendimento maior do que o controle não tratado (UTC). O tratamento “-11,34 quilogramas (-25 lbs) de N” utiliza 11,34 quilogramas (25 lbs) menos N por acre do que práticas agrícolas-padrão da região.

O tratamento UTC “100% de N” visa retratar práticas agrícolas-padrão da região, nas quais 100% da utilização- padrão de N são distribuídos pelo fazendeiro.

O micróbio “6- 403” foi depositado como NCMA 201708004 e pode ser encontrado na Tabela 1. Este é uma Kosakonia sacchari mutante (também denominada CM037) e é uma cepa mutante da prole de CI006 WT; a FIG. 17 ilustra resultados de um experimento de testagem de campo no verão de 2017. Os resultados do rendimento obtidos demonstram que os micróbios da revelação têm desempenho consistente através de localizações.

Além disso, os resultados do rendimento demonstram que os micróbios da revelação têm bom desempenho tanto em um ambiente com estresse de nitrogênio, quanto em um ambiente que possui fornecimentos suficientes de nitrogênio.

O micróbio “6-881” (também conhecido como CM094, PBC6.94), e que é uma cepa mutante da prole de Kosakonia sacchari de CI006 WT, foi depositado como NCMA 201708002 e pode ser encontrado na Tabela 1. O micróbio “137-1034”, que é uma cepa mutante da prole de Klebsiella variicola de CI137 WT,

foi depositado como NCMA 201712001 e pode ser encontrado na Tabela 1. O micróbio “137-1036”, que é uma cepa mutante da prole de Klebsiella variicola de CI137 WT, foi depositado como NCMA 201712002 e pode ser encontrado na Tabela 1. O micróbio “6-404” (também conhecido como CM38, PBC6.38), e que é uma cepa mutante da prole de Kosakonia sacchari de CI006 WT, foi depositado como NCMA 201708003 e pode ser encontrado na Tabela 1. A condição de “Estresse de Nutrientes” corresponde ao regime de 0% de nitrogênio.

A condição de “Fertilizante Suficiente” corresponde ao regime de 100% de nitrogênio; a FIG. 18 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI006 (também denominada “6”, Kosakonia sacchari WT); a FIG. 19 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI019 (também denominada “19”, Rahnella aquatilis WT); a FIG. 20 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa CI137 (também denominada (“137”, Klebsiella variicola WT); a FIG. 21 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa 1021 (Kosakonia pseudosacchari WT); a FIG. 22 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa 910 (Kluyvera intermedia WT); a FIG. 23 retrata a linhagem de cepas modificadas que foram derivadas da cepa 63 (Rahnella aquatilis WT); a FIG. 24 retrata um mapa de calor dos quilogramas de nitrogênio liberados por acre-estação por micróbios da presente revelação registrados em função de micróbios por g- peso fresco por mmol de nitrogênio / micróbio-hora.

Abaixo da linha fina que corta a imagem maior estão os micróbios que liberam menos do que 454 g (uma libra) de nitrogênio por acre-estação, e acima da linha estão os micróbios que liberam mais do que 454 g (uma libra) de nitrogênio por acre-estação.

A Tabela 28 no Exemplo 5 dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio hora) juntamente com a CFU precisa por grama de peso fresco (CFU/g fw) para cada micróbio mostrado no mapa de calor.

Os dados na FIG. 24 são derivados de cepas microbianas testadas para produção de N no milho em condições de campo.

Cada ponto representa kg de N/acre produzido por um micróbio usando dados de colonização da raiz de milho de um único local de campo.

A atividade de fixação de N foi determinada usando ensaio de ARA in vitro a 5 mM N na forma de glutamina ou fosfato de amônio; a FIG. 25 retrata um mapa de calor dos quilogramas de nitrogênio liberados por acre-estação por micróbios da presente revelação registrados em função de micróbios por g- peso fresco por mmol de nitrogênio / micróbio-hora.

Abaixo da linha fina que corta a imagem maior estão os micróbios que liberam menos do que 454 g (uma libra) de nitrogênio por acre-estação, e acima da linha estão os micróbios que liberam mais do que 454 g (uma libra) de nitrogênio por acre-estação.

A Tabela 29 no Exemplo 5 dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio hora) juntamente com a CFU precisa por grama de peso fresco (CFU/g fw) para cada micróbio mostrado no mapa de calor.

Os dados na FIG. 25 são derivados de cepas microbianas testadas para produção de N no milho em condições de laboratório e de estufa.

Cada ponto representa kg de N/acre produzido por uma única cepa. Pontos brancos representam cepas nas quais dados de colonização da raiz de milho foram reunidos em condições de estufa. Pontos pretos representam cepas mutantes para as quais os níveis de colonização da raiz de milho são derivados de níveis médios de colonização no campo da raiz de milho da cepa parental do tipo selvagem. Pontos hachurados representam as cepas parentais do tipo selvagem em seus níveis médios de colonização no campo da raiz de milho. Em todos os casos, a atividade de fixação de N foi determinada por ensaio de ARA in vitro a 5 mM N na forma de glutamina ou fosfato de amônio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA REVELAÇÃO

[0030] Embora várias modalidades da revelação tenham sido mostradas e descritas nesse relatório descritivo, será óbvio para aqueles versados na técnica que essas modalidades são fornecidas apenas como exemplo. Diversas variações, alterações e substituições podem ocorrer àqueles versados na técnica, sem se afastar da revelação. Deve ser subentendido que várias alternativas às modalidades da revelação descritas nesse relatório descritivo podem ser empregadas.

[0031] A utilização aumentada de fertilizantes traz com ela preocupações ambientais e também provavelmente não é possível para muitas regiões do globo que sofrem economicamente. Além disso, muitos participantes da indústria na arena microbiana estão concentrados na criação de micróbios intergenéricos. No entanto, há uma carga reguladora pesada colocada sobre micróbios modificados geneticamente que sejam caracterizados/classificados como intergenéricos. Esses micróbios intergenéricos enfrentam não apenas uma carga reguladora maior, o que torna a adoção e implementação disseminadas difíceis, mas também enfrentam um grande escrutínio da percepção pública.

[0032] Atualmente, não há micróbios modificados geneticamente no mercado que sejam não intergenéricos e que sejam capazes de aumento da fixação de nitrogênio em plantios de não leguminosas. Essa carência de um micróbio desse tipo é um elemento ausente no auxílio a conduzir para um sistema agrícola do século XXI verdadeiramente ambientalmente amigável e mais sustável.

[0033] A presente revelação soluciona os problemas mencionados anteriormente e fornece um micróbio não intergenérico que foi modificado geneticamente para fixar prontamente nitrogênio em plantios. Esses micróbios não são caracterizados/classificados como micróbios intergenéricos e, dessa forma, não enfrentarão as cargas reguladoras pesadas destes. Além disso, os micróbios não intergenéricos ensinados servirão a ajudar aos fazendeiros do século XXI a serem menos dependentes da utilização de quantidades sempre crescentes de fertilizante de nitrogênio exógeno.

Definições

[0034] O uso dos termos “um” e “uma” e “o” e “uma” e “pelo menos um” e referentes similares no contexto da descrição da revelação (especialmente no contexto das reivindicações seguintes) deve ser considerado como englobando tanto o singular quanto o plural, salvo indicação em contrário nesse relatório descritivo ou claramente contradito pelo contexto. Os termos “que compreendem”, “que possuem”, “que incluem” e “que contêm” devem ser considerados como termos em aberto (ou seja, significando “que incluem, sem limitação”), a menos que observado de forma diferente. A citação de faixas de valores nesse relatório descritivo visa simplesmente servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que cai dentro da faixa, salvo indicação em contrário nesse relatório descritivo, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse citado individualmente nesse relatório descritivo. Por exemplo, se a faixa 10-15 é revelada, então 11, 12, 13 e 14 também são revelados. Todos os métodos descritos nesse relatório descritivo podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma nesse relatório descritivo ou de algum outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, “tais como”) fornecidos nesse relatório descritivo, visa simplesmente melhor iluminar a invenção e não impõe uma limitação sobre o escopo da revelação, a menos que reivindicado de forma diferente. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser considerada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da revelação.

[0035] Os termos “polinucleotídeo”, “nucleotídeo”, “sequência de nucleotídeos”, “ácido nucleico” e “oligonucleotídeo” são usados de forma intercambiável. Eles se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos destes. Polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional, e podem realizar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitantes de polinucleotídeos: regiões codificadoras ou não codificadoras de um gene ou fragmento de gene, loci (lócus) definidos por análise de ligação, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), RNA ribossômico (rRNA), RNA interferente curto (siRNA), RNA de gancho de cabelo(”hairpin”) curto (shRNA), micro-RNA (miRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender um ou mais nucleotídeos modificados, por exemplo, nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presentes, modificações à estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou depois da montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ainda ser modificado após a polimerização, por exemplo, por conjugação com um componente de marcação.

[0036] “Hibridização” se refere a uma reação na qual um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado por meio de ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeo. A ligação de hidrogênio pode ocorrer por pareamento de bases de Watson Crick, ligação de Hoogstein, ou qualquer outra forma sequência-específica de acordo com a complementaridade de bases. O complexo pode compreender duas fitas que formam uma estrutura de duplexo, três ou mais fitas que formam um complexo de múltiplas fitas, uma única fita auto-hibridizante, ou qualquer combinação destes. Uma reação de hibridização pode constituir uma etapa em um processo mais extenso, por exemplo, a iniciação de PCR, ou a clivagem enzimática de um polinucleotídeo por uma endonuclease. Uma segunda sequência que é complementar a uma primeira sequência é denominada o “complemento” da primeira sequência. O termo “hibridizável”, como aplicado a um polinucleotídeo, se refere à habilidade do polinucleotídeo para formar um complexo que é estabilizado por meio de ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeo em uma reação de hibridização.

[0037] “Complementaridade” se refere à habilidade de um ácido nucleico para formar ligação (ou ligações) hidrogênio com outra sequência de ácidos nucleicos por Watson-Crick tradicional ou por tipos não tradicionais. Um percentual de complementaridade indica a percentagem de resíduos em uma molécula de ácido nucleico que pode formar ligações de hidrogênio (por exemplo, pareamento de bases de Watson- Crick) com uma segunda sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 que são 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% complementares, respectivamente). “Perfeitamente complementar” significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos terão uma ligação de hidrogênio com o mesmo número de resíduos contíguos em uma segunda sequência de ácidos nucleicos. O termo “substancialmente complementar”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um grau de complementaridade que é de pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% ao longo de uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ou mais nucleotídeos, ou se refere a dois ácidos nucleicos que hibridizam sob condições rigorosas. A “identidade de sequência”, por exemplo, com o objetivo de avaliar o percentual de complementaridade, pode ser medida por qualquer algoritmo de alinhamento adequado incluindo,

sem limitação, o algoritmo de Needleman-Wunsch (veja, por exemplo, o alinhador “EMBOSS Needle” disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html, opcionalmente com ajustes padronizados), o algoritmo de BLAST (veja, por exemplo, a ferramenta de alinhamento BLAST disponível em blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, opcionalmente com ajustes padronizados), ou o algoritmo de Smith-Waterman (veja, por exemplo, a alinhador “EMBOSS Water” disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html, opcionalmente com ajustes padronizados). O alinhamento ótimo pode ser avaliado usando quaisquer parâmetros adequados de um algoritmo escolhido, incluindo parâmetros padronizados.

[0038] Em geral, “condições rigorosas” para hibridização se referem às condições sob as quais um ácido nucleico que possui complementaridade para uma sequência-alvo hibridiza predominantemente com uma sequência-alvo, e substancialmente não hibridiza para sequências não-alvo. Condições rigorosas são geralmente sequência-dependentes, e variam dependendo de diversos fatores. Em geral, quanto mais longa a sequência, maior a temperatura na qual a sequência hibridiza especificamente para sua sequência-alvo. Exemplos não limitantes de condições rigorosas são descritos em detalhe em Tijssen (1993), “Laboratory Technniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I”, Segundo Capítulo “Overview of Principles of Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Probe Assay”, Elsevier, N.Y.

[0039] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “expressão” se refere ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito a partir de um modelo de DNA (por exemplo, em mRNA ou outro transcrito de RNA) e/ou o processo pelo qual um mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Transcritos e polipeptídeos codificados podem ser coletivamente denominados “produto gênico”. Se o polinucleotídeo é derivado de DNA genômico, “expressão” pode incluir splicing do mRNA em uma célula eucariótica.

[0040] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compreender aminoácidos modificados, e ele pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácido que foi modificado; por exemplo, por formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação, por exemplo, conjugação com um componente de marcação. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “aminoácido” se refere aos aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos incluindo, glicina e os isômeros ópticos tanto D quanto L, e análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.

[0041] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “cerca de” é usado de forma sinônima com o termo “aproximadamente.” Ilustrativamente, o uso do termo “cerca de” com relação a uma quantidade indica que valores ligeiramente fora dos valores citados, por exemplo, mais ou menos 0,1% até 10%.

[0042] O termo “cultura biologicamente pura” ou “cultura substancialmente pura” se refere a uma cultura de uma espécie bacteriana descrita nesse relatório descritivo que não contém nenhuma outra espécie bacteriana em quantidades suficientes para interferir com a replicação da cultura ou ser detectada por técnicas bacteriológicas normais.

[0043] O termo “produtividade de planta” se refere geralmente a qualquer aspecto de crescimento ou desenvolvimento de uma planta que é uma razão pela qual a planta é desenvolvida. Para plantios de alimentos, por exemplo, grãos ou vegetais, “produtividade de planta” pode se referir ao rendimento de grãos ou frutos colhidos de um plantio particular. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “produtividade de planta aumentada” se refere amplamente a aumentos no rendimento de grãos, frutos, flores, ou outras partes de plantas colhidas para várias finalidades, aumentos no crescimento de partes de plantas, incluindo caules, folhas e raízes, promoção de crescimento de plantas, manutenção de alto teor de clorofila em folhas, aumento dos números de frutos ou sementes, aumento do peso unitário de frutos ou sementes, redução da emissão de NO2 em função de utilização reduzida de fertilizante de nitrogênio e aumentos similares do crescimento e desenvolvimento de plantas.

[0044] Micróbios dentro e em torno de plantios de alimentos podem influenciar os traços daqueles plantios. Traços de plantas que podem ser influenciados por micróbios incluem: rendimento (por exemplo, produção de grãos, geração de biomassa, desenvolvimento do fruto, florescimento); nutrição (por exemplo, aquisição de nitrogênio, fósforo, potássio, ferro, micronutrientes); gerenciamento de estresse abiótico (por exemplo, tolerância à seca, tolerância ao sal,

tolerância térmica); e gerenciamento de estresse biótico (por exemplo, pragas, ervas daninhas, insetos, fungos e bactérias). Estratégias para alteração de traços de plantio incluem: aumento das concentrações de metabólitos cruciais; alteração da dinâmica temporal da influência do micróbio sobre metabólitos cruciais; ligação da produção/degradação de metabólitos microbianos a novas pistas ambientais; redução de metabólitos negativos; e aumento do equilíbrio de metabólitos ou proteínas subjacentes.

[0045] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “sequência de controle” se refere a um operador, promotor, silenciador ou terminador.

[0046] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “in planta” se refere a “na planta”, “sobre a planta” ou intimamente associado à planta, dependendo do contexto de uso (por exemplo, associações endofíticas, epifíticas ou rizosféricas). A planta pode compreender partes de plantas, tecido, folhas, raízes, pêlos de raiz, rizomas, caules, semente, óvulos, pólen, flores, frutos etc.

[0047] Em algumas modalidades, sequências de controle nativas ou endógenas de genes da presente revelação são substituídas com uma ou mais sequências de controle intragenéricas.

[0048] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “introduzido” se refere à introdução por meio de biotecnologia moderna, e não uma introdução de ocorrência natural.

[0049] Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação foram modificadas de tal modo que não são bactérias de ocorrência natural.

[0050] Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos 103 cfu, 104 cfu, 105 cfu, 106 cfu, 107 cfu, 108 cfu, 109 cfu, 1010 cfu, 1011 cfu ou 1012 cfu por grama de peso fresco ou seco da planta. Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos cerca de 103 cfu, cerca de 104 cfu, cerca de 105 cfu, cerca de 106 cfu, cerca de 107 cfu, cerca de 108 cfu, cerca de 109 cfu, cerca de 1010 cfu, cerca de 1011 cfu ou cerca de 1012 cfu por grama de peso fresco ou seco da planta. Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos 103 a 109, 103 a 107, 103 a 105, 105 a 109, 105 a 107, 106 a 1010, 106 a 107 cfu por grama de peso fresco ou seco da planta.

[0051] Os fertilizantes e nitrogênio exógeno da presente revelação podem compreender as seguintes moléculas que contêm nitrogênio: amônio, nitrato, nitrito, amônia, glutamina etc. As fontes de nitrogênio da presente revelação podem incluir amônia anidra, sulfato de amônia, ureia, fosfato de diamônio, forma de ureia, fosfato de monoamônio, nitrato de amônio, soluções de nitrogênio, nitrato de cálcio, nitrato de potássio, nitrato de sódio etc.

[0052] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “nitrogênio exógeno” se refere ao nitrogênio não atmosférico facilmente disponível no solo, campo ou meio de crescimento que está presente sob condições não limitantes de nitrogênio, incluindo amônia, amônio, nitrato, nitrito, ureia, ácido úrico, ácidos de amônio etc.

[0053] Como usado nesse relatório descritivo, o termo

“condições não limitantes de nitrogênio” se refere ao nitrogênio não atmosférico disponível no solo, campo, meios em concentrações maiores do que cerca de 4 mM de nitrogênio, como revelado por Kant e cols. (2010. J. Exp. Biol. 62 (4):

1.499-1.509), que é incorporado nesse relatório descritivo por referência.

[0054] Como usado nesse relatório descritivo, um “microrganismo intergenérico” é um microrganismo que é formado pela combinação deliberada de material genético originalmente isolado de organismos de gêneros taxonômicos diferentes. O termo “mutante intergenérico” pode ser usado de forma intercambiável com “microrganismo intergenérico”. Um “microrganismo intergenérico” exemplar inclui um microrganismo que contém um elemento genético móvel que foi primeiro identificado em um microrganismo em um gênero diferente do microrganismo receptor. Explicações adicionais podem ser encontradas, inter alia, em 40 C.F.R. § 725.3.

[0055] Em alguns aspectos, os micróbios ensinados nesse relatório descritivo são “não intergenéricos”, o que significa que os micróbios não são intergenéricos.

[0056] Como usado nesse relatório descritivo, um “microrganismo intragenérico” é um microrganismo que é formado pela combinação deliberada de material genético originalmente isolado de organismos dos mesmos gêneros taxonômicos. O termo “intragenérico mutante” pode ser usado de forma intercambiável com “microrganismo intragenérico”.

[0057] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “material genético introduzido” significa material genético que é adicionado, e permanece como um componente, do genoma do receptor.

[0058] Como usado nesse relatório descritivo, no contexto de microrganismos não intergenéricos, o termo “remodelado” é usado de forma sinônima com o termo “modificado geneticamente”. Consequentemente, um “microrganismo não intergenérico remodelado” possui um significado sinônimo com “microrganismo não intergenérico modificado geneticamente”, e será utilizado de forma intercambiável. Além disso, a revelação pode ser referir a uma “cepa modificada geneticamente” ou “derivado modificado geneticamente” ou “micróbio não intergenérico modificado geneticamente”, esses termos são usados de forma sinônima com “cepa remodelada” ou “derivado remodelado” ou “micróbio não intergenérico remodelado”.

[0059] Em algumas modalidades, a rede genética regulatória de fixação e assimilação de nitrogênio compreende polinucleotídeos que codificam genes e sequências não codificadoras que dirigem, modulam e/ou regulam fixação e/ou assimilação microbiana de nitrogênio e pode compreender sequências de polinucleotídeos do agrupamento nif (por exemplo, nifA, nifB, nifC, ... nifZ), polinucleotídeos que codificam proteína C reguladora de nitrogênio, polinucleotídeos que codificam proteína B reguladora de nitrogênio, sequências de polinucleotídeos do agrupamento gln (por exemplo, glnA e glnD), draT, e transportadores/permeases de amônia. Em alguns casos, o agrupamento Nif pode compreender NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa e NifV. Em alguns casos, o agrupamento Nif pode compreender um subconjunto de NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa e NifV.

[0060] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente revelação compreende pelo menos 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de nitrogênio em peso.

[0061] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente revelação compreende pelo menos cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cerca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, cerca de 25%, cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29%, cerca de 30%, cerca de 31%, cerca de 32%, cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cerca de 36%, cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40%, cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49%, cerca de 50%, cerca de 51%, cerca de 52%, cerca de 53%, cerca de 54%, cerca de 55%, cerca de 56%, cerca de 57%, cerca de 58%, cerca de 59%, cerca de 60%, cerca de 61%, cerca de 62%, cerca de 63%, cerca de 64%, cerca de 65%, cerca de 66%, cerca de 67%, cerca de 68%, cerca de 69%, cerca de 70%, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou cerca de 99% de nitrogênio em peso.

[0062] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente revelação compreende cerca de 5% a 50%, cerca de 5% a 75%, cerca de 10% a 50%, cerca de 10% a 75%, cerca de 15% a 50%, cerca de 15% a 75%, cerca de 20% a 50%, cerca de 20% a 75%, cerca de 25% a 50%, cerca de 25% a 75%, cerca de 30% a 50%, cerca de 30% a 75%, cerca de 35% a 50%, cerca de 35% a 75%, cerca de 40% a 50%, cerca de 40% a 75%, cerca de 45% a 50%, cerca de 45% a 75%, ou cerca de 50% a 75% de nitrogênio por peso.

[0063] Em algumas modalidades, o aumento da fixação de nitrogênio e/ou da produção de 1% ou mais do nitrogênio na planta é medido em relação a plantas de controle, que não foram expostas às bactérias da presente revelação. Todos os aumentos ou diminuições nas bactérias são medidos em relação a bactérias de controle. Todos os aumentos ou diminuições em plantas são medidos em relação a plantas de controle.

[0064] Como usado nesse relatório descritivo, um “promotor constitutivo” é um promotor que é ativo sob a maioria das condições e/ou durante a maioria dos estágios de desenvolvimento. Há várias vantagens com a utilização de promotores constitutivos em vetores de expressão usados em biotecnologia, por exemplo: alto nível de produção de proteínas usadas para selecionar células ou organismos transgênicos; alto nível de expressão de proteínas repórteres ou marcadores pontuáveis, permitindo a fácil detecção e quantificação; alto nível de produção de um fator de transcrição que é parte de um sistema regulador da transcrição; produção de compostos que exigem atividade ubíqua no organismo; e produção de compostos que são necessários durante todos os estágios de desenvolvimento. Promotores constitutivos exemplares não limitantes incluem, promotor de CaMV 35S, promotores de opina, promotor de ubiquitina, promotor de álcool desidrogenase etc.

[0065] Como usado nesse relatório descritivo, um “promotor não constitutivo” é um promotor que é ativo sob certas condições, em certos tipos de células, e/ou durante certos estágios do desenvolvimento. Por exemplo, promotores tecido-específicos, tecido-preferidos, tipo de célula- específicos, tipo de célula-preferidos, promotores induzíveis, e promotores sob controle do desenvolvimento são promotores não constitutivos. Exemplos de promotores sob controle do desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos.

[0066] Como usado nesse relatório descritivo, o termo promotor “induzível” ou “reprimível” é um promotor que está sob controle de fatores químicos ou ambientais. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas, certas substâncias químicas, a presença de luz, condições ácidas ou básicas etc.

[0067] Como usado nesse relatório descritivo, um promotor “tecido-específico” é um promotor que inicia a transcrição apenas em certos tecidos. Diferentemente da expressão constitutiva de genes, a expressão tecido-específica é o resultado de vários níveis de interação de regulação gênica. Dessa forma, na técnica algumas vezes é preferível usar promotores de espécies homólogas ou intimamente relacionadas para obter expressão eficiente e confiável de transgenes em tecidos particulares. Essa é uma das principais razões para a grande quantidade de promotores tecido-específicos isolados de tecidos particulares encontradas tanto na literatura científica quanto de patentes.

[0068] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “ligado operacionalmente” se refere à associação de sequências de ácidos nucleicos em um único fragmento de ácido nucleico, de modo que a função de um seja regulada pelo outro. Por exemplo, um promotor está ligado operacionalmente com uma sequência codificadora quando ele é capaz de regular a expressão daquela sequência codificadora (ou seja, que a sequência codificadora está sob o controle de transcrição do promotor). Sequências codificadoras podem ser ligadas operacionalmente às sequências regulatórias em uma orientação de senso ou anti-senso. Em outro exemplo, as regiões de RNA complementares da revelação podem ser ligadas operacionalmente, diretamente ou indiretamente, 5′ para o mRNA-alvo, ou 3′ para o mRNA-alvo, ou dentro do mRNA-alvo, ou uma primeira região complementar é 5′ e seu complemento é 3′ para o mRNA-alvo.

[0069] Em alguns aspectos, “aplicação à planta de uma pluralidade de bactérias não intergenéricas”, inclui qualquer meio pelo qual a planta (incluindo partes de plantas como, por exemplo, uma semente, raiz, caule, tecido etc.) é colocada em contato (ou seja, exposta) com as referidas bactérias em qualquer estágio do ciclo de vida da planta. Consequentemente, “aplicação à planta de uma pluralidade de bactérias não intergenéricas”, inclui qualquer um dos seguintes meios de exposição da planta (incluindo partes de plantas como, por exemplo, uma semente, raiz, caule, tecido etc.) às referidas bactérias: pulverização na planta, imersão na planta, aplicação como um revestimento de semente, aplicação a um campo que então será plantado com semente, aplicação a um campo já plantado com a semente, aplicação a um campo com plantas adultas etc.

[0070] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “MRTN” é um acrônimo para retorno máximo para nitrogênio e é utilizado como um tratamento experimental nos Exemplos. MRTN foi desenvolvido pela “Iowa State University” e informações podem ser encontradas em: http://cnrc.agron.iastate.edu/. O MRTN é a taxa de nitrogênio na qual o retorno econômico líquido para a aplicação de nitrogênio é maximizado. A abordagem para o cálculo do MRTN é uma abordagem regional para o desenvolvimento de diretrizes para a taxa de nitrogênio do milho em estados individuais. Os dados do experimento da taxa de nitrogênio foram avaliados para Illinois, Iowa, Michigan, Minnesota, Ohio e Wisconsin, onde um número adequado de experimentos de pesquisa estava disponível para plantios de milho após soja e plantios de milho após milho. Os experimentos foram realizados com nitrogênio aplicado no brotamento, em cobertura, ou dividido na pré-semeadura/em cobertura, e os locais não foram irrigados, exceto para aqueles que foram indicados para areias irrigadas em Wisconsin. MRTN foi desenvolvido pela “Iowa State University” em função das diferenças aparentes em métodos para determinação de taxas de nitrogênio sugeridas necessárias à produção de milho, percepções equivocadas em relação às diretrizes da taxa de nitrogênio e preocupações sobre as taxas de aplicação. Pelo cálculo do MRTN, os profissionais podem determinar o seguinte: (1) a taxa de nitrogênio na qual o retorno econômico líquido para a aplicação de nitrogênio é maximizado, (2) a taxa de nitrogênio econômica ótima, que é o ponto em que o último incremento de nitrogênio retorna um aumento de rendimento suficientemente grande para pagar pelo nitrogênio adicional, (3) o aumento do valor de grão de milho atribuído à aplicação de nitrogênio, e o rendimento máximo, que é o rendimento no qual a aplicação de mais nitrogênio não resulta em um aumento do rendimento de milho. Dessa forma, os cálculos de MRTN dão aos profissionais os meios para maximizar as safras de milho em regiões diferentes maximizando, ao mesmo tempo, os ganhos financeiros de aplicações de nitrogênio.

[0071] O termo “mmol” é uma abreviação para milimol, que é um milésimo (10−3) de um mol, abreviado nesse relatório descritivo como mol.

[0072] Como usados nesse relatório descritivo, os termos “microrganismo” ou “micróbio” devem ser considerados de forma ampla. Esses termos, usados de forma intercambiável, incluem, sem limitação, os dois domínios procarióticos, Bactérias e Archaea. O termo também pode englobar fungos e protistas eucarióticos.

[0073] O termo “consórcios microbianos” ou “consórcio microbiano” se refere a um subconjunto de uma comunidade microbiana de espécies microbianas individuais, ou cepas de uma espécie, que podem ser descritas como realizando uma função comum, ou podem ser descritas como participantes, ou que levam ou correlacionadas com um parâmetro reconhecível, por exemplo, um traço fenotípico de interesse.

[0074] O termo “comunidade microbiana” significa um grupo de micróbios que compreende duas ou mais espécies ou cepas. Diferentemente dos consórcios microbianos, uma comunidade microbiana não precisa realizar uma função comum, ou não precisa ter que participar, ou levar ou se correlacionar com um parâmetro reconhecível, por exemplo, um traço fenotípico de interesse.

[0075] Como usado nesse relatório descritivo, os termos “isolado”, “isolado”, “micróbio isolado” e termos semelhantes visam significar que os (um ou mais) microrganismos foram separados de pelo menos um dos materiais com os quais estão associados em um ambiente particular (por exemplo, solo, água, tecido de plantas etc.). Dessa forma, um “micróbio isolado” não existe em seu ambiente de ocorrência natural; ao invés disso, é por meio das várias técnicas descritas nesse relatório descritivo que o micróbio foi removido de seu ambiente natural e colocado em um estado de existência de ocorrência não natural. Dessa forma, a cepa isolada ou o micróbio isolado pode existir como, por exemplo, uma cultura biologicamente pura, ou como esporos (ou outras formas da cepa). Em alguns aspectos, o micróbio isolado pode estar em associação com um carreador aceitável, que pode ser um carreador agronomicamente aceitável.

[0076] Em certos aspectos da revelação, os micróbios isolados existem como “culturas isoladas e biologicamente puras”. Será observado por aqueles versados na técnica que uma cultura isolada e biologicamente pura de um micróbio particular significa que a referida cultura é substancialmente livre de outros organismos vivos e contém somente o micróbio individual em questão. A cultura pode conter concentrações variáveis do referido micróbio. A presente revelação observa que os micróbios isolados e biologicamente puros frequentemente “necessariamente diferem de materiais menos puros ou impuros”. Veja, por exemplo, In re Bergstrom, 427 F.2d 1394, (CCPA 1970)(que discute prostaglandinas purificadas); veja também, In re Bergy, 596 F.2d 952 (CCPA 1979)(que discute micróbios purificados); veja também, Parke-Davis & Co. v. H.K. Mulford & Co., 189 F. 95 (S.D.N.Y. 1911) (“Learned Hand” que discute adrenalina purificada), que fornece, em parte, revisão, em parte, 196 F. 496 (2ª Cir. 1912), cada um deles incorporado nesse relatório descritivo por referência. Além disso, em alguns aspectos, a revelação fornece certas medições quantitativas da concentração, ou limitações de pureza, que devem ser encontradas dentro de uma cultura microbiana isolada e biologicamente pura. A presença desses valores de pureza, em certas modalidades, é um atributo adicional que distingue os micróbios atualmente revelados daqueles micróbios que existem em um estado natural. Veja, por exemplo, Merck & Co. v. Olin Mathieson Chemical Corp., 253 F.2d 156 (4ª Cir. 1958) (que discute limitações de pureza para vitamina B12 produzida por micróbios), incorporado nesse relatório descritivo por referência.

[0077] Como usado nesse relatório descritivo, “isolados individuais” significam uma composição, ou cultura, que compreende uma predominância de um único gênero, espécie ou cepa, de microrganismo, após separação de um ou mais outros microrganismos.

[0078] Os micróbios da presente revelação podem incluir esporos e/ou células vegetativas. Em algumas modalidades, os micróbios da presente revelação incluem micróbios em um estado viável, mas não cultivável (VBNC). Como usados nesse relatório descritivo, os termos “esporo” ou “esporos” se referem às estruturas produzidas por bactérias e fungos que estão adaptadas para sobrevida e dispersão. Esporos são geralmente caracterizados como estruturas adormecidas; no entanto, esporos são capazes de diferenciação por meio do processo de germinação. A germinação é a diferenciação de esporos em células vegetativas que são capazes de atividade metabólica, crescimento e reprodução. A germinação de um único esporo resulta em uma única célula vegetativa fúngica ou bacteriana. Esporos fúngicos são unidades de reprodução assexual e, em alguns casos, são estruturas necessárias em ciclos de vida fúngicos. Esporos bacterianos são estruturas para condições de sobrevivência que podem habitualmente ser não condutivas à sobrevida ou crescimento de células vegetativas.

[0079] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “composição microbiana” se refere a uma composição que compreende um ou mais micróbios da presente revelação. Em algumas modalidades, uma composição microbiana é administrada às plantas (incluindo várias partes de plantas) e/ou em campos agrícolas.

[0080] Como usados nesse relatório descritivo, os termos “carreador”, “carreador aceitável” ou “carreador agronomicamente aceitável” se referem a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o micróbio pode ser administrado, que não afeta prejudicialmente o micróbio.

Regulação da Fixação de Nitrogênio

[0081] Em alguns casos, a via de fixação de nitrogênio pode atuar como um alvo para engenharia genética e otimização. Um traço que pode ser visado for regulação pelos métodos descritos nesse relatório descritivo é a fixação de nitrogênio. O fertilizante de nitrogênio é a maior despesa operacional em uma fazenda e o maior condutor de rendimentos maiores em plantios em fileira como, por exemplo, milho e trigo. São descritos nesse relatório descritivo produtos microbianos que podem liberar formas renováveis de nitrogênio em plantios de não leguminosas. Embora alguns endófitos tenham a genética necessária para a fixação de nitrogênio em cultura pura, o desafio técnico fundamental é que endófitos do tipo selvagem de cereais e gramíneas interrompem a fixação de nitrogênio em campos fertilizados. A aplicação de fertilizantes químicos e os níveis residuais de nitrogênio em solos de campo sinalizam os micróbios para fechar a via bioquímica para fixação de nitrogênio.

[0082] Alterações dos níveis transcricionais e pós- tradução de componentes da rede reguladora da fixação de nitrogênio podem ser benéficas para o desenvolvimento de um micróbio capaz de fixar e transferir nitrogênio ao milho na presença de fertilizante. Para essa finalidade, é descrita nesse relatório descritivo a tecnologia de Evolução de Micróbio-Hospedeiro (HoME) para evoluir precisamente redes reguladoras e despertar novos fenótipos. Também são descritas nesse relatório descritivo bibliotecas proprietárias únicas de endófitos fixadores de nitrogênio isolados de milho, pareadas com dados ômicos extensos que circundam a interação de micróbios e planta hospedeira sob condições ambientais diferentes como, por exemplo, estresse e excesso de nitrogênio. Em algumas modalidades, essa tecnologia permite a evolução da precisão da rede genética regulatória de endófitos para produzir micróbios que fixam ativamente nitrogênio, até mesmo na presença de fertilizante no campo. Também são descritas nesse relatório descritivo avaliações do potencial técnico da evolução de micróbios que colonizam tecidos de raiz de milho e produzem nitrogênio para plantas fertilizadas e avaliações da compatibilidade de endófitos com práticas padronizadas de formulação e solos diversos para determinar a praticabilidade de integração dos micróbios em estratégias modernas de gerenciamento de nitrogênio.

[0083] A fim de utilizar nitrogênio elementar (N) para a síntese química, as formas de vida combinam gás nitrogênio (N2) disponível na atmosfera com hidrogênio em um processo conhecido como fixação de nitrogênio. Por causa da natureza intensiva de energia da fixação de nitrogênio biológica, diazotróficos (bactérias e arquéias que fixam gás nitrogênio atmosférico) desenvolveram uma regulação sofisticada e rígida do agrupamento do gene nif em resposta ao oxigênio ambiental e nitrogênio disponível. Os genes nif codificam enzimas envolvidas na fixação de nitrogênio (por exemplo, o complexo de nitrogenase) e proteínas que regulam a fixação de nitrogênio. Shamseldin (2013. Global J. Biotechnol. Biochem. 8 (4): 84-94) revela descrições detalhadas de genes nif e seus produtos, e é incorporado nesse relatório descritivo por referência. São descritos nesse relatório descritivo métodos de produção de uma planta com um traço aprimorado que compreendem o isolamento de bactérias de uma primeira planta, introdução de uma variação genética em um gene das bactérias isoladas para aumentar fixação de nitrogênio, exposição de uma segunda planta às bactérias variantes, isolamento de bactérias da segunda planta que possui um traço aprimorado em relação à primeira planta, e repetição das etapas com bactérias isoladas da segunda planta.

[0084] Em proteobactérias, a regulação da fixação de nitrogênio é centralizada em torno da proteína de ligação ao intensificador σ54-dependente NifA, o regulador transcricional positivo do agrupamento nif. Os níveis intracelulares de NifA ativa são controlados por dois fatores cruciais: a transcrição do operon de nifLA, e a inibição da atividade de NifA por interação proteína-proteína com NifL. Ambos esses processos são responsivos aos níveis intracelulares de glutamina por meio da cascata de sinalização de proteína PII. Essa cascata é mediada por GlnD, que percebe diretamente glutamina e catalisa a uridilação ou desuridilação de duas proteínas reguladoras PII– GlnB e GlnK – em resposta à ausência ou presença, respectivamente, de glutamina ligada. Sob condições de excesso de nitrogênio, GlnB não modificada sinaliza a desativação do promotor de nifLA. No entanto, sob condições de limitação de nitrogênio, GlnB é modificada pós-tradução, o que inibe sua atividade e leva à transcrição do operon de nifLA. Dessa forma, a transcrição de nifLA é rigorosamente controlada em resposta ao nitrogênio ambiental por meio da cascata de sinalização de proteína PII. No nível pós-tradução da regulação de NifA, GlnK inibe a interação NifL/NifA de forma dependente do nível global de GlnK livre dentro da célula.

[0085] NifA é transcrita pelo operon de nifLA, cujo promotor é ativado por NtrC fosforilada, outro regulador σ54-

dependente. O estado de fosforilação de NtrC é mediado pela histidina quinase NtrB, que interage com GlnB desuridililada, mas não GlnB uridililada. Sob condições de excesso de nitrogênio, um nível intracelular elevado de glutamina leva à desuridilação de GlnB, que então interage com NtrB para desativar sua atividade de fosforilação e ativar sua atividade de fosfatase, resultando em desfosforilação de NtrC e na desativação do promotor de nifLA. No entanto, sob condições de limitação de nitrogênio, um nível baixo de glutamina intracelular resulta em uridilação de GlnB, o que inibe sua interação com NtrB e permite a fosforilação de NtrC e a transcrição do operon de nifLA. Dessa forma, a expressão de nifLA é rigorosamente controlada em resposta ao nitrogênio ambiental por meio da cascata de sinalização de proteína PII. nifA, ntrB, ntrC e glnB, são todos genes que podem ser mutados nos métodos descritos nesse relatório descritivo. Esses processos também podem ser responsivos aos níveis intracelulares ou extracelulares de amônia, ureia ou nitratos.

[0086] A atividade de NifA também é regulada pós-tradução em resposta ao nitrogênio ambiental, mais tipicamente por meio de inibição mediada por NifL da atividade de NifA. Em geral, a interação de NifL e NifA é influenciada pela cascata de sinalização de proteína PII por meio de GlnK, embora a natureza das interações entre GlnK e NifL/NifA varie significantemente entre diazotróficos. Em Klebsiella pneumoniae, ambas as formas de GlnK inibem a interação NifL/NifA, e a interação entre GlnK e NifL/NifA é determinada pelo nível global de GlnK livre dentro da célula. Sob condições de excesso de nitrogênio, GlnK desuridililada interage com o transportador de amônio AmtB, que serve tanto para bloquear a captação de amônio por AmtB quanto para sequestrar GlnK à membrana, permitindo a inibição de NifA por NifL. Por outro lado, em Azotobacter vinelandii, a interação com GlnK desuridililada é necessária para a interação NifL/NifA e inibição de NifA, enquanto a uridilação de GlnK inibe sua interação com NifL. Em diazotróficos desprovidos do gene nifL, há evidências de que a atividade de NifA é inibida diretamente por interação com as formas desuridililadas tanto de GlnK quanto de GlnB sob condições de excesso de nitrogênio. Em algumas bactérias, o agrupamento Nif pode ser regulado por glnR, e ainda em alguns casos isso pode compreender regulação negativa. Independentemente do mecanismo, a inibição pós-tradução de NifA é um regulador importante do agrupamento nif na maioria dos diazotróficos conhecidos. Adicionalmente, nifL, amtB e glnK e glnR são genes que podem ser mutados nos métodos descritos nesse relatório descritivo.

[0087] Além de regular a transcrição do agrupamento do gene nif, muitos diazotróficos desenvolveram um mecanismo para a modificação pós-tradução e inibição diretas da própria enzima nitrogenase, conhecido como interruptor (“shutoff”) de nitrogenase. Isso é mediado por ribosilação do ADP da proteína de Fe (NifH) sob condições de excesso de nitrogênio, o que rompe sua interação com o complexo de proteína MoFe (NifDK) e abole a atividade de nitrogenase. DraT catalisa a ribosilação do ADP da proteína de Fe e do interruptor de nitrogenase, enquanto DraG catalisa a remoção de ADP-ribose e a reativação de nitrogenase. Como ocorre com a transcrição de nifLA e a inibição de NifA, o interruptor de nitrogenase também é regulado por meio da cascata de sinalização de proteína PII. Sob condições de excesso de nitrogênio, GlnB desuridililada interage e ativa DraT, enquanto GlnK desuridililada interage tanto com DraG quanto com AmtB para formar um complexo, sequestrando DraG à membrana. Sob condições de limitação de nitrogênio, as formas uridililadas de GlnB e GlnK não interagem com DraT e DraG, respectivamente, levando à inativação de DraT e à difusão de DraG para a proteína Fe, onde ela remove a ADP-ribose e ativa nitrogenase. Os métodos descritos nesse relatório descritivo também contemplam a introdução da variação genética nos genes nifH, nifD, nifK e draT.

[0088] Embora alguns endófitos possuam a habilidade para fixar nitrogênio in vitro, frequentemente a genética é silenciada no campo por níveis elevados de fertilizantes químicos exógenos. Pode-se desacoplar o sensoriamento de nitrogênio exógeno da expressão da enzima nitrogenase para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo. O aumento da integral da atividade de nitrogenase através do tempo serve para aumentar ainda mais a produção de nitrogênio para utilização pelo plantio. Alvos específicos para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo incluem um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ.

[0089] Um alvo adicional para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo é a proteína

NifA. A proteína NifA é tipicamente o ativador para a expressão de genes de fixação de nitrogênio. O aumento da produção de NifA (constitutivamente ou durante a condição de amônia elevada) contorna a via de sensoriamento de amônia nativa. Além disso, a redução da produção de proteínas NifL, um inibidor de NifA conhecido, também leva a um nível aumentado de NifA livremente ativa. Além disso, o aumento do nível de transcrição do operon de nifAL (constitutivamente ou durante a condição de amônia elevada) também leva a um nível global maior de proteínas NifA. O nível elevado da expressão de nifAL é obtido por alteração do próprio promotor ou por redução da expressão de NtrB (parte da cascata de sinalização de ntrB e ntrC que originalmente resultaria no fechamento do operon de nifAL durante a condição de nitrogênio elevado). O nível elevado de NifA obtido por esses ou quaisquer outros métodos descritos nesse relatório descritivo aumenta a atividade de fixação de nitrogênio dos endófitos.

[0090] Outro alvo para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo é a cascata de sinalização GlnD/GlnB/GlnK PII. O nível intracelular de glutamina é percebido por meio da cascata de sinalização GlnD/GlnB/GlnK PII. Mutações do local ativo em GlnD que abolem a atividade de remoção de uridilil de GlnD rompem a cascata de sensoriamento de nitrogênio. Além disso, a redução da concentração GlnB produz um curto-circuito da cascata de sensoriamento de glutamina. Essas mutações “enganam” as células na percepção do estado de nitrogênio limitado aumentando, dessa forma, a atividade do nível de fixação de nitrogênio. Esses processos também podem ser responsivos aos níveis intracelulares ou extracelulares de amônia, ureia ou nitratos.

[0091] A proteína amtB também é um alvo para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo. A captação de amônia do ambiente pode ser reduzida por diminuição do nível de expressão da proteína amtB. Sem amônia intracelular, o endófito não é capaz de perceber o nível alto de amônia, evitando a infra-regulação de genes de fixação de nitrogênio. Qualquer amônia que tente entrar no compartimento intracelular é convertida em glutamina. O nível de glutamina intracelular é o principal componente do sensoriamento de nitrogênio. A diminuição do nível de glutamina intracelular evita que as células percebam níveis elevados de amônio no ambiente. Esse efeito pode ser obtido por aumento do nível de expressão de glutaminase, uma enzima que converte glutamina em glutamato. Além disso, a glutamina intracelular também pode ser reduzida por diminuição da glutamina sintase (uma enzima que converte amônia em glutamina). Em diazotróficos, a amônia fixada é rapidamente assimilada em glutamina e glutamato para serem usados para processos celulares. Rupturas na assimilação de amônia podem permitir o desvio do nitrogênio fixado a ser exportado da célula como amônia. A amônia fixada é assimilada predominantemente em glutamina pela glutamina sintetase (GS), codificada por glnA, e subsequentemente em glutamina pela glutamina oxoglutarato aminotransferase (GOGAT). Em alguns exemplos, glnS codifica uma glutamina sintetase. GS é regulada pós-tradução por GS adenilil transferase (GlnE),

uma enzima bifuncional codificada por glnE que catalisa tanto a adenililação quanto a desadenililação de GS por meio da atividade de sua adenilil-transferase (AT) e domínios de remoção de adenilil (AR), respectivamente. Sob condições limitantes de nitrogênio, glnA é expressa, e o domínio de AR de GlnE causa da desadenilação GS, permitindo que ela seja ativa. Sob condições de excesso de nitrogênio, a expressão de glnA é desligada, e o domínio de AT de GlnE é ativado alostericamente por glutamina, causando a adenililação e desativação de GS.

[0092] Além disso, o gene draT também pode ser um alvo para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo. Após as enzimas fixadoras de nitrogênio serem produzidas pela célula, o interruptor de nitrogenase representa outro nível no qual a célula infra- regula a atividade de fixação em condição de nitrogênio elevado. Esse interruptor poderia ser removido por diminuição do nível de expressão de DraT.

[0093] Métodos para a transmissão de novos fenótipos microbianos podem ser realizados nos níveis da transcrição, tradução e pós-tradução. O nível de transcrição inclui alterações no promotor (por exemplo, alteração da afinidade do fator sigma ou de locais de ligação para fatores de transcrição, incluindo deleção de todo ou de uma porção do promotor) ou alteração dos terminadores e atenuadores da transcrição. O nível de tradução inclui alterações nos locais de ligação ao ribossomo e alterações de sinais de degradação de mRNA. O nível pós-tradução inclui a mutação de um local ativo da enzima e alteração de interações proteína-proteína.

Essas alterações podem ser obtidas de várias formas. A redução do nível de expressão (ou abolição completa) pode ser obtida por troca do local ou promotor de ligação ao ribossomo (RBS) nativo com outro com potência/eficiência menor. Locais de início ATG podem ser trocados por um códon de início GTG, TTG ou CTG, o que resulta em redução na atividade de tradução da região codificadora. A abolição completa da expressão pode ser feita por nocaute (“knocking out”) (deleção) da região codificadora de um gene. O deslocamento de quadro (“frameshifting”) do quadro de leitura aberto (ORF) provavelmente resultará em um códon de parada prematuro ao longo do ORF criando, dessa forma, um produto truncado não funcional. A inserção de códons de parada em quadro (“in-frame) também irá criar, similarmente, um produto truncado não funcional. A adição de um tag de degradação no terminal N ou C também pode ser feita para reduzir a concentração efetiva de um gene particular.

[0094] Inversamente, o nível de expressão dos genes descritos nesse relatório descritivo pode ser obtido por utilização de um promotor mais forte. Para assegurar uma atividade maior do promotor durante a condição de nível elevado de nitrogênio (ou qualquer outra condição), um perfil de transcrição do genoma inteiro em uma condição de nível elevado de nitrogênio poderia ser obtido, e promotores ativos com um nível desejado de transcrição podem ser escolhidos daquele conjunto de dados para substituir o promotor fraco. Códons de início fracos podem ser removidos com um códon de início ATG para uma melhor eficiência de iniciação da tradução. Locais de ligação ao ribossomo (RBS) fracos também podem ser removidos com um RBS diferente com eficiência de iniciação da tradução maior. Além disso, a mutagênese local- específica também pode ser realizada para alterar a atividade de uma enzima.

[0095] O aumento do nível de fixação de nitrogênio que ocorre em uma planta pode levar a uma redução na quantidade de fertilizante químico necessária para produção de plantio e reduzir as emissões de gás de efeito estufa (por exemplo, óxido nitroso).

Geração de Populações Bacterianas Isolamento de Bactérias

[0096] Micróbios úteis nos métodos e composições revelados nesse relatório descritivo podem ser obtidos por extração de micróbios de superfícies ou tecidos de plantas nativas. Micróbios podem ser obtidos por trituração de sementes para isolar micróbios. Micróbios podem ser obtidos por plantio de sementes em amostras de solo diversas e recuperação de micróbios de tecidos. Adicionalmente, micróbios podem ser obtidos por inoculação de plantas com micróbios exógenos e determinação de quais micróbios aparecem em tecidos de planta. Exemplos não limitantes de tecidos de planta podem incluir uma semente, muda, folha, muda, planta, bulbo ou tubérculo.

[0097] Um método de obtenção de micróbios pode ser por meio do isolamento de bactérias de solos. Bactérias podem ser coletadas de vários tipos de solos. Em alguns exemplos, o solo pode ser caracterizado por traços como, por exemplo, fertilidade alta ou baixa, níveis de umidade, níveis de minerais, e várias práticas de manejo. Por exemplo, o solo pode estar envolvido em uma rotação de plantios, em que cultivos diferentes são plantados no mesmo solo em estações de plantio sucessivas. O crescimento sequencial de diferentes plantios no mesmo solo pode evitar a depleção desproporcional de certos minerais. As bactérias podem ser isoladas das plantas que crescem em solos selecionados. As plantas da muda podem ser colhidas em 2-6 semanas de crescimento. Por exemplo, pelo menos 400 isolados podem ser coletados em uma rodada de colheita. Os tipos de solo e de planta revelam o fenótipo da planta, bem como as condições, permitindo o enriquecimento a jusante de certos fenótipos.

[0098] Micróbios podem ser isolados de tecidos de plantas para avaliar traços microbianos. Os parâmetros para o processamento de amostras de tecido podem ser variados para isolar tipos diferentes de micróbios associativos, por exemplo, bactérias rizosféricas, epífitas ou endófitos. Os isolados podem ser cultivados em meios livres de nitrogênio para enriquecimento de bactérias que realizam fixação de nitrogênio. Alternativamente, micróbios podem ser obtidos de bancos de cepas globais.

[0099] Analíticas in planta são realizadas para avaliar traços microbianos. Em algumas modalidades, o tecido de planta pode ser processado para avaliação por processamento de alto rendimento para DNA e RNA. Adicionalmente, medições não invasivas podem ser usadas para avaliar características da planta, por exemplo, colonização. Medições em micróbios selvagens podem ser obtidas planta-por-planta. As medições em micróbios selvagens também podem ser obtidas no campo usando métodos de rendimento médio. Medições podem ser feitas sucessivamente ao longo do tempo. Um sistema de planta modelo pode ser usado incluindo, mas não limitando a, Setaria.

[00100] Micróbios em um sistema de planta podem ser avaliados por meio de definição de perfil transcricional de um micróbio em um sistema de planta. Exemplos de avaliação através de definição de perfil transcricional são a utilização de métodos de reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR), códigos de barras moleculares para detecção do transcrito, Sequenciamento da Geração Seguinte e marcação de micróbios com marcadores fluorescentes. Fatores de impacto podem ser medidos para avaliar a colonização na estufa incluindo, sem limitação, microbioma, fatores abióticos, condições do solo, oxigênio, umidade, temperatura, condições do inóculo e localização da raiz. A fixação de nitrogênio pode ser avaliada em bactérias por medição de gás 15N/fertilizante (diluição) com IRMS ou NanoSIMS, como descrito nesse relatório descritivo. A NanoSIMS é espectrometria de massa de íon secundário de alta resolução. A técnica de NanoSIMS é uma forma de investigar a atividade química de amostras biológicas. A catálise da redução de reações de oxidação que dirigem o metabolismo de microrganismos pode ser investigada no nível celular, subcelular, molecular e de elementos. NanoSIMS pode fornecer resolução espacial elevada de mais do que 0,1 µm. NanoSIMS pode detectar o uso de traçadores de isótopos como, por exemplo, 13C, 15N e 18O. Portanto, a NanoSIMS pode ser usada para o nitrogênio da atividade química na célula.

[00101] Estufas automatizadas podem ser usadas para analíticas de plantas. A métrica de plantas em resposta à exposição microbiana inclui, sem limitação, biomassa, análise de cloroplasto, câmera CCD, medições de tomografia volumétrica.

[00102] Uma forma de enriquecimento de uma população de micróbios é de acordo com o genótipo. Por exemplo, um ensaio de reação em cadeia de polimerase (PCR) com um iniciador direcionado ou iniciador específico. Iniciadores projetados para o gene de nifH podem ser usados para identificar diazotróficos, pois diazotróficos expressam o gene de nifH no processo de fixação de nitrogênio. Uma população microbiana também pode ser enriquecida por meio de abordagens de cultura de célula única-independente e abordagens de isolamento guiado por quimiotaxia. Alternativamente, o isolamento direcionado de micróbios pode ser realizado por cultivo dos micróbios em meios de seleção. Abordagens premeditadas para o enriquecimento de populações microbianas para traços desejados podem ser guiadas por dados de bioinformática e são descritas nesse relatório descritivo.

Enriquecimento para Micróbios com Capacidades de Fixação de Nitrogênio com o Uso de Bioinformática

[00103] Ferramentas de bioinformática podem ser usadas para identificar e isolar rizobactérias que promovem o crescimento de plantas (PGPRs), que são selecionadas com base em sua habilidade para realizar fixação de nitrogênio. Micróbios com alta habilidade de fixação de nitrogênio podem promover traços favoráveis em plantas. Os modos de análise por bioinformática para a identificação de PGPRs incluem, sem limitação, genômica, metagenômica, isolamento direcionado, sequenciamento gênico, sequenciamento de transcriptoma e modelagem.

[00104] A análise por genômica pode ser usada para identificar PGPRs e confirmar a presença de mutações com métodos de Sequenciamento da Geração Seguinte, como descrito nesse relatório descritivo, e controle da versão de micróbio.

[00105] Metagenômica pode ser usada para identificar e isolar PGPR usando um algoritmo de predição para colonização. Metadados também podem ser usados para identificar a presença de uma cepa modificada geneticamente em amostras ambientais e de estufa.

[00106] O sequenciamento do transcriptoma pode ser usado para prever genótipos que levam aos fenótipos de PGPR. Adicionalmente, dados transcriptômicos são usados para identificar promotores para alteração da expressão gênica. Dados transcriptômicos podem ser analisados em conjunto com a Sequência do Genoma Inteiro (WGS) para gerar modelos de metabolismo e redes reguladoras de genes.

Domesticação de Micróbios

[00107] Micróbios isolados da natureza podem passar por um processo de domesticação no qual os micróbios são convertidos em uma forma que é geneticamente rastreável e identificável. Uma forma para domesticar um micróbio é modificá-lo geneticamente com resistência antibiótica. O processo de criação por engenharia genética de resistência antibiótica pode começar por determinação da sensibilidade antibiótica na cepa microbiana do tipo selvagem. Se as bactérias são sensíveis ao antibiótico, então o antibiótico pode ser um bom candidato à criação por engenharia genética de resistência antibiótica. Subsequentemente, um gene resistente ao antibiótico ou um vetor suicida contra- selecionável pode ser incorporado no genoma de um micróbio usando métodos de recombinação por engenharia genética (“recombineering”). Um vetor suicida contra-selecionável pode consistir em uma deleção do gene de interesse, um marcador selecionável e o marcador contra-selecionável sacB. A contra-seleção pode ser usada para trocar sequências de DNA microbianas nativas com genes resistentes ao antibiótico. Um método de rendimento médio pode ser usado para avaliar vários micróbios simultaneamente, permitindo a domesticação paralela. Métodos alternativos de domesticação incluem o uso de nucleases teleguiadas para evitar que as sequências do vetor suicida saiam ou a obtenção de sequências de vetor intervenientes.

[00108] Vetores de DNA podem ser introduzidos em bactérias por meio de vários métodos, incluindo eletroporação e transformações químicas. Uma biblioteca- padrão de vetores pode ser usada para transformações. Um exemplo de um método de edição gênica é CRISPR precedido por testagem de Cas9 para assegurar a atividade de Cas9 nos micróbios.

Modificação Genética Não Transgênica de Micróbios

[00109] Uma população microbiana com traços favoráveis pode ser obtida por meio de evolução dirigida. Evolução direta é uma abordagem na qual o processo de seleção natural é mimetizado para evoluir proteínas ou ácidos nucleicos em direção a um objetivo definido pelo usuário. Um exemplo de evolução direta é quando mutações aleatórias são introduzidas em uma população microbiana, os micróbios com os traços mais favoráveis são selecionados, e o crescimento dos micróbios selecionados é continuado. Os traços mais favoráveis em rizobactérias promotoras de crescimento (PGPRs) podem estar em fixação de nitrogênio. O método de evolução dirigida pode ser iterativo e adaptivo com base no processo de seleção após cada iteração.

[00110] Podem ser geradas rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (PGPRs) com alta capacidade de fixação de nitrogênio. A evolução de PGPRs pode ser realizada por meio da introdução de variação genética. Variação genética pode ser introduzida por meio de mutagênese por reação em cadeia de polimerase, mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, mutagênese por saturação, mutagênese por embaralhamento de fragmentos, recombinação homóloga, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química, e combinações destas. Essas abordagens podem introduzir mutações aleatórias na população microbiana. Por exemplo, mutantes podem ser gerados usando DNA ou RNA sintético por meio de mutagênese oligonucleotídeo- dirigida. Mutantes podem ser gerados usando ferramentas contidas em plasmídeos, que são posteriormente curados. Genes de interesse podem ser identificados com o uso de bibliotecas de outras espécies com traços aprimorados incluindo, sem limitação, propriedades de PGPR aprimoradas, colonização de cereais aumentadas, sensibilidade ao oxigênio aumentada, fixação de nitrogênio aumentada e excreção de amônia aumentada. Genes intragenéricos podem ser projetados com base nessas bibliotecas usando software como, por exemplo, o software de design Geneious ou Platypus. Mutações podem ser geradas com o auxílio de aprendizado de máquina. Mutações podem ser geradas com o auxílio de um modelo metabólico. O design automatizado da mutação pode ser feito usando ao estilo Platypus e guiará RNAs para mutagênese Cas- dirigida.

[00111] Os genes intragenéricos podem ser transferidos para o micróbio hospedeiro. Adicionalmente, sistemas repórteres também podem ser transferidos para o micróbio. Os sistemas repórteres caracterizam promotores, determinam o sucesso da transformação, avaliam mutantes e atuam como ferramentas de seleção negativas.

[00112] Os micróbios que carregam a mutação podem ser cultivados por meio de passagem serial. Uma colônia microbiana contém uma única variante do micróbio. As colônias microbianas são avaliadas com o auxílio de um coletor de colônias automatizado e um manipulador de líquidos. Mutantes com duplicação de genes e número de cópias aumentado expressam um genótipo superior do traço desejado.

Seleção de micróbios promotores do crescimento de plantas com base na fixação de nitrogênio

[00113] As colônias microbianas podem ser avaliadas usando vários ensaios para avaliar a fixação de nitrogênio. Uma forma para medir a fixação de nitrogênio é por meio de um ensaio fermentativo único, que mede a excreção de nitrogênio. Um método alternativo é o ensaio de redução de acetileno (ARA) com amostragem em linha ao longo do tempo. ARA pode ser realizado em placas de alto rendimento de arranjos de microtubo. ARA pode ser realizado com plantas e tecidos de plantas vivos. A formulação dos meios e a concentração de oxigênio dos meios podem ser variadas em ensaios ARA. Outro método de avaliação de variantes microbianas é por utilização de biossensores. O uso de NanoSIMS e microespectroscopia Raman podem ser usados para investigar a atividade dos micróbios. Em alguns casos, bactérias também podem ser cultivadas e expandidas usando métodos de fermentação em biorreatores. Os biorreatores são projetados para aumentar a robustez do crescimento de bactérias e diminuir a sensibilidade de bactérias ao oxigênio. Microfermentadores baseados em placas de TP média a alta são usados para avaliar a sensibilidade ao oxigênio, necessidades nutricionais, fixação de nitrogênio e excreção de nitrogênio. As bactérias também podem ser cocultivadas com micróbios competitivos ou benéficos para elucidar vias crípticas. Citometria de fluxo pode ser usada para avaliar bactérias que produzem níveis elevados de nitrogênio usando indicadores químicos, colorimétricos ou fluorescentes. As bactérias podem ser cultivadas na presença ou ausência de uma fonte de nitrogênio. Por exemplo, as bactérias podem ser cultivadas com glutamina, amônia, ureia ou nitratos.

Remodelagem Microbiana Guiada – Uma Visão Geral

[00114] A remodelagem microbiana guiada é um método para identificar e aprimorar sistematicamente o papel de espécies dentro do microbioma do plantio. Em alguns aspectos, e de acordo com uma metodologia particular de categorização/agrupamento, o método compreende três etapas: 1) seleção de espécies candidatas por mapeamento de interações planta-micróbio e previsão de redes reguladoras ligadas a um fenótipo particular, 2) aprimoramento pragmático e previsível de fenótipos microbianos por meio do cruzamento intra-espécies de redes reguladoras e grupamentos de genes dentro do genoma de um micróbio, e 3) avaliação e seleção de novos genótipos microbianos que produzem fenótipos de plantio desejados.

[00115] Para avaliar sistematicamente o aprimoramento de cepas, é criado um modelo que liga a dinâmica de colonização da comunidade microbiana à atividade genética por espécies cruciais. O modelo é usado para prever alvos genéticos para remodelagem genética não intergenérica (ou seja, modificação por engenharia genética da arquitetura genética do micróbio de uma forma não-transgenética). Veja a FIG. 1A para uma representação gráfica de uma modalidade do processo.

[00116] Como ilustrado na FIG. 1A, a melhoria racional do microbioma do cultivo pode ser usado para aumentar a biodiversidade do solo, ajustar o impacto de espécies fundamentais e/ou alterar o momento e expressão de vias metabólicas importantes.

[00117] Para essa finalidade, os inventores desenvolveram uma plataforma para identificar e aprimorar o papel de cepas dentro do microbioma do cultivo. Em alguns aspectos, os inventores chamam esse processo reprodução microbiana.

[00118] O processo de “Remodelagem Microbiana Guiada” mencionado anteriormente será adicionalmente elaborado nos Exemplos, por exemplo, no Exemplo 1, intitulado: “Remodelagem Microbiana Guiada – Uma Plataforma para a Melhoria Racional de Espécies Microbianas para Agricultura”.

Passagem Serial

[00119] A produção de bactérias para aprimorar os traços de plantas (por exemplo, fixação de nitrogênio) pode ser obtida por meio de passagem serial. A produção dessas bactérias pode ser feita por seleção de plantas, que possuem um traço aprimorado particular que é influenciado pela flora microbiana, em adição à identificação de bactérias e/ou composições que são capazes de transmitir um ou mais traços aprimorados a uma ou mais plantas. Um método de produção de bactérias para aprimorar um traço de planta inclui as etapas de: (a) isolamento de bactérias de tecido ou solo de uma primeira planta; (b) introdução de uma variação genética em uma ou mais das bactérias para produzir uma ou mais bactérias variantes; (c) exposição de diversas plantas às bactérias variantes; (d) isolamento de bactérias de tecido ou solo de uma das várias plantas, em que a planta da qual as bactérias são isoladas possui um traço aprimorado em relação a outras plantas nas várias plantas; e (e) repetição das etapas (b) a (d) com bactérias isoladas da planta com um traço aprimorado (etapa (d)). As etapas (b) a (d) podem ser repetidas diversas vezes (por exemplo, uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, dez vezes ou mais) até que o traço aprimorado em uma planta alcance um nível desejado. Além disso, as várias plantas podem ser mais do que duas plantas, por exemplo, 10 a 20 plantas, ou 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 300 ou mais, 500 ou mais, ou

1.000 ou mais plantas.

[00120] Além da obtenção de uma planta com um traço aprimorado, uma população bacteriana que compreende bactérias que compreendem uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes (por exemplo, genes que regulam a fixação de nitrogênio) é obtida. Por repetição das etapas descritas acima, pode ser obtida uma população de bactérias que incluem os membros mais apropriados da população que se correlacionam com um traço de planta de interesse. As bactérias nessa população podem ser identificadas e suas propriedades benéficas determinadas, por exemplo, por análise genética e/ou fenotípica. Pode ocorrer uma análise genética de bactérias isoladas na etapa (a). A informação fenotípica e/ou genotípica pode ser obtida usando técnicas que incluem: avaliação de alto rendimento de componentes químicos da origem da planta, técnicas de sequenciamento que incluem sequenciamento de alto rendimento de material genético, técnicas de exibição diferencial (incluindo DDRT-PCR e DD-PCR), técnicas de microarranjo de ácido nucleico, RNA-Seq (“Whole Transcriptome Shotgun Sequencing”), e qRT-PCR (PCR quantitativa em tempo real). A informação obtida pode ser usada para obter informação de definição do perfil da comunidade sobre a identidade e atividade de bactérias presentes, por exemplo, análise filogenética ou avaliação baseada em microarranjo de ácidos nucleicos que codificam componentes de operons de rRNA ou outros loci taxonomicamente informativos. Exemplos de loci taxonomicamente informativos incluem gene de rRNA 16S, gene de rRNA 23S, gene de rRNA 5S, gene de rRNA 5.8S, gene de rRNA 12S, gene de rRNA 18S, gene de rRNA 28S, gene gyrB, gene rpoB, gene fusA, gene recA, gene cox1, gene nifD. Exemplos de processos de definição taxonômica de perfil para determinar a taxa presente em uma população são descritos em US20140155283. A identificação bacteriana pode compreender a caracterização da atividade de um ou mais genes ou uma ou mais vias de sinalização, por exemplo, genes associados com a via de fixação de nitrogênio. Interações sinérgicas (em que dois componentes, em virtude de sua combinação, aumenta um efeito desejado por mais de uma quantidade aditiva) entre espécies bacterianas diferentes também podem estar presentes nas populações bacterianas.

Variação genética – Localizações e Fontes de Alteração Genômica

[00121] A variação genética pode ser um gene selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ.

A variação genética pode ser uma variação em um gene que codifica uma proteína com funcionalidade selecionada do grupo que consiste em: glutamina sintetase, glutaminase, glutamina sintetase adenililtransferase, ativador da transcrição, anti-ativador da transcrição, piruvato flavodoxina oxidorredutase, flavodoxina ou NAD+- dinitrogênio-redutase aDP-D-ribosiltransferase.

A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD.

A introdução de uma variação genética pode compreender inserção e/ou deleção de um ou mais nucleotídeos em um local-alvo, por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, ou mais nucleotídeos.

A variação genética introduzida em uma ou mais bactérias dos métodos revelados nesse relatório descritivo pode ser uma mutação por nocaute (por exemplo, deleção de um promotor, inserção ou deleção para produzir um códon de parada prematuro, deleção de um gene inteiro), ou ela pode ser a eliminação ou abolição da atividade de um domínio de proteína (por exemplo, mutação pontual que afeta um local ativo, ou deleção de uma porção de um gene que codifica a porção relevante do produto de proteína), ou ela pode alterar ou abolir uma sequência regulatória de um gene-alvo.

Uma ou mais sequências regulatórias também podem ser inseridas,

incluindo sequências regulatórias heterólogas e sequências regulatórias encontradas dentro de um genoma de uma espécie ou gênero bacteriano que corresponde às bactérias nas quais a variação genética é introduzida. Além disso, sequências regulatórias podem ser selecionadas com base no nível de expressão de um gene em uma cultura bacteriana ou dentro de um tecido de planta. A variação genética pode ser uma variação genética pré-determinada que é introduzida especificamente em um local-alvo. A variação genética pode ser uma mutação aleatória dentro do local-alvo. A variação genética pode ser uma inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos. Em alguns casos, diversas variações genéticas diferentes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10, ou mais) são introduzidas em uma ou mais das bactérias isoladas antes da exposição das bactérias às plantas para avaliação do aprimoramento do traço. As diversas variações genéticas podem ser de qualquer um dos tipos acima, do mesmo tipo ou de tipos diferentes, e em qualquer combinação. Em alguns casos, diversas variações genéticas diferentes são introduzidas serialmente, introduzindo uma primeira variação genética após uma primeira etapa de isolamento, uma segunda variação genética após uma segunda etapa de isolamento, e assim por diante, de modo a acumular diversas variações genéticas em bactérias, transmitindo traços progressivamente aprimorados nas plantas associadas.

Variação Genética – Métodos de Introdução de Alteração Genômica

[00122] Em geral, o termo “variação genética” se refere a qualquer alteração introduzida em uma sequência de polinucleotídeos em relação a um polinucleotídeo de referência, por exemplo, um genoma de referência ou porção deste, ou gene de referência ou porção deste.

Uma variação genética pode ser denominada uma “mutação”, e uma sequência ou organismo que compreende uma variação genética pode ser denominado uma “variante genética” ou “mutante”. Variações genéticas podem ter qualquer número de efeitos, por exemplo, o aumento ou diminuição de alguma atividade biológica, incluindo expressão gênica, metabolismo e sinalização celular.

Variações genéticas podem ser especificamente introduzidas em um local-alvo, ou introduzidas aleatoriamente.

Diversas ferramentas moleculares e métodos estão disponíveis para introdução de variação genética.

Por exemplo, uma variação genética pode ser introduzida por meio de mutagênese por reação em cadeia de polimerase, mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, mutagênese por saturação, mutagênese por embaralhamento de fragmentos, recombinação homóloga, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química, e combinações destes.

Métodos químicos de introdução de variação genética incluem exposição de DNA a um mutágeno químico, por exemplo, metanossulfonato de etila (EMS), metanossulfonato de metila (MMS), N-nitrosoureia (EN U), N- metil-N-nitro-N′-nitrosoguanidina, N-óxido de 4- nitroquinolina, dietilsulfato, benzopireno, ciclofosfamida, bleomicina, trietilmelamina, monômero de acrilamida, mostarda nitrogenada, vincristina, diepoxialcanos (por exemplo, diepoxibutano), ICR-170, formaldeído, cloridrato de procarbazina, óxido de etileno, dimetilnitrosamina, 7,12- dimetilbenz(a)antraceno, clorambucil, hexametilfosforamida, bissulfan e semelhantes.

Agentes indutores de mutação por radiação incluem radiação ultravioleta, irradiação-γ, raios-

X e bombardeamento rápido de nêutrons. A variação genética também pode ser introduzida em um ácido nucleico usando, por exemplo, trimetilpsoraleno com luz ultravioleta. A inserção aleatória ou direcionada de um elemento de DNA móvel, por exemplo, um elemento reversível, é outro método adequado para a geração de variação genética. Variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucleico durante amplificação em um sistema in vitro livre de células, por exemplo, usando uma técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) como, por exemplo, PCR propenso a erros (“error- prone”). Variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucleico in vitro usando técnicas de embaralhamento de DNA (por exemplo, embaralhamento de éxons, troca de domínio e semelhantes). Variações genéticas também podem ser introduzidas em um ácido nucleico como resultado de uma deficiência em uma enzima de reparo de DNA em uma célula, por exemplo, espera-se que a presença em uma célula de um gene mutante que codifica uma enzima de reparo de DNA mutante gere uma frequência elevada de mutações (ou seja, cerca de 1 mutação/100 genes - 1 mutação/10.000 genes) no genoma da célula. Exemplos de genes que codificam enzimas de reparo de DNA incluem, sem limitação, Mut H, Mut S, Mut L e Mut U, e os homólogos destes em outras espécies (por exemplo, MSH 1 6, PMS 1 2, MLH 1, GTBP, ERCC-1 e semelhantes). Descrições exemplares de vários métodos para a introdução de variações genéticas são fornecidas, por exemplo, em Stemple (2004) Nature 5: 1-7; Chiang e cols. (1993) PCR Methods Appl. 2 (3): 210-217; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:

10.747-10.751; e Patentes dos EUA Nos 6.033.861 e 6.773.900.

[00123] As variações genéticas introduzidas em micróbios podem ser classificadas como transgênicas, cisgênicas, intragenômicas, intragenéricas, intergenéricas, sintéticas, desenvolvidas, rearranjadas ou SNPs.

[00124] A variação genética pode ser introduzida em diversas vias metabólicas dentro de micróbios para provocar aprimoramentos nos traços descritos acima. Vias representativas incluem vias de captação de enxofre, de biossíntese de glicogênio, a via de regulação de glutamina, a via de captação de molibdênio, a via de fixação de nitrogênio, de assimilação de amônia, de excreção ou secreção de amônia, de captação de nitrogênio, de biossíntese de glutamina, anamox, de solubilização de fosfato, de transporte de ácido orgânico, de produção de ácido orgânico, de produção aglutininas, de genes de limpeza de radical reativo ao oxigênio, da biossíntese de ácido indol acético, de biossíntese de trehalose, enzimas ou vias de degradação da parede celular de plantas, de genes de adesão à raiz, de secreção de exopolissacarídeo, via de glutamato sintase, vias de captação de ferro, via de sideróforo, via de quitinase, de ACC desaminase, de biossíntese de glutationa, de genes de sinalização de fósforo, via de extinção de quórum, vias de citocromo, via de hemoglobina, via bacteria semelhante a hemoglobina (“hemoglobin-like”), pequeno rsmZ de RNA, biossíntese de rizobitoxina, proteína de adesão de lapA, via de percepção de quórum de AHL, de biossíntese de fenazina, de biossíntese de lipopeptídeo cíclico e de produção de antibiótico.

[00125] Sistemas CRISPR/Cas9 (repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente espaçadas) / CRISPR-associados (Cas) podem ser usados para introduzir mutações desejadas.

CRISPR/Cas9 fornecem bactérias e arquéias com imunidade adaptiva contra vírus e plasmídeos por utilização de RNAs de CRISPR (crRNAs) para guiar o silenciamento de ácidos nucleicos invasores.

A proteína Cas9 (ou equivalente funcional e/ou variante desta, ou seja, proteína semelhante a Cas9) contém naturalmente atividade de DNA endonuclease que depende da associação da proteína com duas moléculas de RNA de ocorrência natural ou sintéticas denominadas crRNA e tracrRNA (também denominado RNAs-guia). Em alguns casos, as duas moléculas são ligadas covalentemente para formar uma única molécula (também denominada RNA-guia único (“sgRNA”). Dessa forma, as proteínas Cas9 ou semelhante a Cas9 se associam com um RNA de direcionamento de DNA (cujo termo engloba tanto a configuração de RNA-guia de duas moléculas quanto a configuração de RNA-guia de molécula única), que ativa a proteína Cas9 ou semelhante a Cas9 e guia a proteína para uma sequência de ácidos nucleicos-alvo.

Se a proteína Cas9 ou semelhante a Cas9 retém sua função enzimática natural, ela irá clivar DNA-alvo para criar uma quebra de fita dupla, o que pode levar à alteração do genoma (ou seja, edição: deleção, inserção (quando um polinucleotídeo doador está presente), substituição etc.) alterando, dessa forma, a expressão gênica.

Algumas variantes de Cas9 (cujas variantes estão englobadas pelo termo semelhante a Cas9) foram alteradas de tal forma que possuem uma atividade de clivagem de DNA diminuída (em alguns casos, elas clivam uma única fita ao invés de ambas as fitas do DNA-alvo, enquanto, em outros casos, elas foram severamente reduzidas a nenhuma atividade de clivagem de DNA). Descrições exemplares adicionais de sistemas CRISPR para a introdução de variação genética podem ser encontradas, por exemplo, em US8795965.

[00126] Como uma técnica de amplificação cíclica, a mutagênese por reação em cadeia de polimerase (PCR) usa iniciadores mutagênicos para introduzir mutações desejadas. A PCR é realizada por ciclos de desnaturação, anelamento e extensão. Após amplificação por PCR, seleção de DNA mutado e remoção de DNA de plasmídeo parental podem ser obtidas por: 1) substituição de dCTP por dCTP hidroximetilado durante PCR, seguida por digestão com enzimas de restrição para remover apenas DNA parental não hidroximetilado; 2) mutagênese simultânea tanto de um gene de resistência antibiótica quanto do gene estudado, alterando o plasmídeo para resistência antibiótica diferente, a nova resistência antibiótica facilitando a seleção da mutação desejada posteriormente; 3) após introdução de uma mutação desejada, digestão do DNA-modelo metilado parental por enzima de restrição Dpnl que cliva apenas DNA metilado, pela qual as cadeias mutagenizadas não metiladas são recuperadas; ou 4) circularização dos produtos de PCR mutados em uma reação de ligação adicional para aumentar a eficiência de transformação do DNA mutado. Descrição adicional de métodos exemplares pode ser encontrada, por exemplo, em US7132265, US6713285, US6673610, US6391548, US5789166, US5780270, US5354670, US5071743 e US20100267147.

[00127] A mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, também denominada mutagênese local-dirigida, tipicamente utiliza um iniciador de DNA sintético. Esse iniciador sintético contém a mutação desejada e é complementar ao DNA- modelo em tono do local de mutação, de modo que pode hibridizar com o DNA no gene de interesse. A mutação pode ser uma alteração de base única (uma mutação pontual), alterações de múltiplas bases, deleção ou inserção, ou uma combinação dessas. O iniciador de fita simples é então estendido usando uma DNA polimerase, que copia o resto do gene. O gene assim copiado contém o local mutado, e pode então ser introduzido em uma célula hospedeira como um vetor e clonado. Finalmente, mutantes podem ser selecionados por sequenciamento de DNA para verificar que eles contêm a mutação desejada.

[00128] Variações genéticas podem ser introduzidas usando PCR propenso a erros. Nessa técnica, o gene de interesse é amplificado usando uma DNA polimerase sob condições que são deficientes na fidelidade de replicação de sequência. O resultado é que os produtos de amplificação contêm pelo menos um erro na sequência. Quando um gene é amplificado e o(s) produto(s) da reação resultante contém uma ou mais alterações em sequência, quando comparado com a molécula-modelo, os produtos resultantes são mutagenizados, comparados com o modelo. Outro meio de introdução de mutações aleatórias é a exposição de células a um mutágeno químico, por exemplo, nitrosoguanidina ou metanossulfonato de etila (Nestmann, Mutat Res., junho de 1975; 28 (3): 323-30), e o vetor contendo o gene é então isolado do hospedeiro.

[00129] A mutagênese por saturação é outra forma de mutagênese aleatória, na qual tenta-se gerar todas ou quase todas as mutações possíveis em um local específico, ou região estreita de um gene. Em um sentido geral, a mutagênese por saturação é composta pelo mutagênese de um conjunto completo de cassetes mutagênicos (em que cada cassete tem, por exemplo, 1-500 bases de comprimento) em uma sequência de polinucleotídeos definida a ser mutagenizada (em que a sequência a ser mutagenizada tem, por exemplo, de 15 a

100.000 bases de comprimento). Dessa forma, um grupo de mutações (por exemplo, que varia de 1 a 100 mutações) é introduzido em cada cassete a ser mutagenizado. Um agrupamento de mutações a serem introduzidas em um cassete pode ser diferente ou igual a um segundo agrupamento de mutações a serem introduzidas em um segundo cassete durante a aplicação de uma rodada de mutagênese por saturação. Esses agrupamentos são exemplificados por deleções, adições, agrupamentos de códons particulares, e agrupamentos de cassetes de nucleotídeos particulares.

[00130] A mutagênese por embaralhamento de fragmentos, também denominada embaralhamento de DNA, é uma forma de propagar rapidamente mutações benéficas. Em um exemplo de um processo de embaralhamento, DNAse é usada para fragmentar um conjunto de genes parentais em pedaços de, por exemplo, cerca de 50-100 bp de comprimento. Isso é então seguido por uma reação em cadeia de polimerase (PCR) sem iniciadores - fragmentos de DNA com superposição de sequência homóloga suficiente anelarão uns aos outros e são então estendidos por DNA polimerase. Permite-se que ocorram várias rodadas dessa extensão por PCR, após algumas das moléculas de DNA alcançarem o tamanho dos genes parentais. Esses genes podem então ser amplificados com outra PCR, dessa vez com a adição de iniciadores que são projetados para complementar as extremidades das fitas. Os iniciadores podem ter sequências adicionais acrescentadas às suas extremidades 5’, por exemplo, sequências para locais de reconhecimento de enzima de restrição necessários à ligação em um vetor de clonagem. Exemplos adicionais de técnicas de embaralhamento são fornecidos em US20050266541.

[00131] A mutagênese por recombinação homóloga envolve a recombinação entre um fragmento de DNA exógeno e a sequência de polinucleotídeos visada. Após a ocorrência de quebra de fita dupla, seções de DNA em torno das extremidades 5’ da quebra são cortadas em um processo denominado ressecção. Na etapa de invasão de fita que se segue, uma extremidade 3’ protuberante da molécula de DNA quebrada então “invade” uma molécula de DNA similar ou idêntica que não está quebrada. O método pode ser usado para deletar um gene, remover éxons, adicionar um gene e introduzir mutações pontuais. A mutagênese por recombinação homóloga pode ser permanente ou condicional. Tipicamente, um modelo de recombinação também é fornecido. Um modelo de recombinação pode ser um componente de outro vetor, contido em um vetor separado, ou fornecido como um polinucleotídeo separado. Em algumas modalidades, um modelo de recombinação é projetado para servir como um modelo na recombinação homóloga, por exemplo, dentro ou perto de uma sequência-alvo cortada ou clivada por uma nuclease local-específica. Um polinucleotídeo-modelo pode ser de qualquer comprimento adequado, por exemplo, cerca de ou mais do que cerca de 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1.000, ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo-modelo é complementar a uma porção de um polinucleotídeo que compreende a sequência-alvo. Quando otimamente alinhado, um polinucleotídeo-modelo pode se sobrepor com um ou mais nucleotídeos de uma sequências-alvo

(por exemplo, cerca de ou mais do que cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos). Em algumas modalidades, quando uma sequência- modelo e um polinucleotídeo que compreende uma sequência- alvo estão otimamente alinhados, o nucleotídeo mais próximo do polinucleotídeo-modelo está dentro de cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1.000, 5.000,

10.000 ou mais nucleotídeos da sequência-alvo. Exemplos não limitantes de nucleases local-dirigidas úteis nos métodos de recombinação homóloga incluem nucleases de dedo de zinco, CRISPR nucleases, TALE nucleases e meganuclease. Para uma descrição adicional do uso dessas nucleases, veja, por exemplo, US8795965 e US20140301990.

[00132] Mutágenos que criam mutações primariamente pontuais e deleções, inserções, transversões e/ou transições curtas, incluindo mutágenos químicos ou radiação, podem ser usados para criar variações genéticas. Mutágenos incluem, sem limitação, metanossulfonato de etila, metilmetano sulfonato, N-etil-N-nitrosureia, trietilmelamina, N-metil- N-nitrosoureia, procarbazina, clorambucil, ciclofosfamida, sulfato de dietila, monômero de acrilamida, melfalan, mostarda nitrogenada, vincristina, dimetilnitrosamina, N- metil-N’-nitro-Nitrosoguanidina, nitrosoguanidina, 2- aminopurina, 7,12-dimetil-benz(a)antraceno, óxido de etileno, hexametilfosforamida, bissulfan, diepoxialcanos (diepoxioctano, diepoxibutano e semelhantes), dicloridrato de 2-metóxi-6-cloro-9[3-(etil-2-cloro-etil) aminopropilamino]acridina e formaldeído.

[00133] A introdução de variação genética pode ser um processo incompleto, de modo que algumas bactérias em uma população de bactérias tratada carreguem uma mutação desejada, enquanto outras não o fazem.

Em alguns casos, é desejável aplicar uma pressão de seleção de modo a enriquecer para bactérias que carregam uma variação genética desejada.

Tradicionalmente, a seleção para variantes genéticas bem- sucedidas envolvia a seleção por ou contra alguma funcionalidade transmitida ou abolida pela variação genética, por exemplo, no caso de inserção de gene de resistência antibiótica ou de abolição de uma atividade metabólica capaz de converter um composto não letal em um metabólito letal.

Também é possível aplicar uma pressão de seleção com base em uma própria sequência de polinucleotídeos, de modo que somente uma variação genética desejada precise ser introduzida (por exemplo, sem necessitar também de um marcador selecionável). Nesse caso, a pressão de seleção pode compreender a clivagem de genomas desprovidos da variação genética introduzida em um local- alvo, de modo que a seleção seja efetivamente dirigida contra a sequência de referência na qual a variação genética visa ser introduzida.

Tipicamente, a clivagem ocorre dentro de 100 nucleotídeos do local-alvo (por exemplo, dentro de 75, 50, 25, 10, ou menos nucleotídeos do local-alvo, incluindo clivagem no ou dentro do local-alvo). A clivagem pode ser dirigida por uma nuclease local-específica selecionada do grupo que consiste em uma nuclease de Dedo de Zinco, uma CRISPR nuclease, uma TALE nuclease (TALEN) ou uma meganuclease.

Um processo desse tipo é similar aos processos para aumento da recombinação homóloga em um local-alvo, exceto que nenhum modelo para recombinação homóloga é fornecido.

Como resultado, bactérias desprovidas da variação genética desejada têm maior probabilidade de passar por clivagem que, se não reparada, resulta na morte da célula. Bactérias que sobrevivem à seleção podem então ser isoladas para uso na exposição às plantas para avaliação do fornecimento de um traço aprimorado.

[00134] Uma CRISPR nuclease pode ser usada como a nuclease local-específica para dirigir a clivagem a um local- alvo. Uma seleção aprimorada de micróbios mutados pode ser obtida por utilização de Cas9 para matar células não mutadas. As plantas são então inoculadas com os micróbios mutados para reconfirmar a simbiose e criar pressão evolutiva para selecionar simbiontes eficientes. Os micróbios podem então ser isolados novamente de tecidos de planta. Os sistemas de CRISPR nuclease empregados para seleção contra não-variantes podem empregar elementos similares àqueles descritos acima com relação à introdução de variação genética, exceto que nenhum modelo para recombinação homóloga é fornecido. A clivagem dirigida ao local-alvo, dessa forma, aumenta a morte de células afetadas.

[00135] Outras opções para induzir especificamente clivagem em um local-alvo estão disponíveis, por exemplo, nucleases de dedo de zinco, sistemas de TALE nuclease (TALEN) e meganuclease. As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) são DNA endonucleases artificiais geradas por fusão de um domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco a um domínio de clivagem de DNA. ZFNs podem ser modificadas geneticamente para visar sequências de DNA desejadas e isso permite que nucleases de dedo de zinco clivem sequências-alvo únicas. Quando introduzidas em uma célula, ZFNs podem ser usadas para editar DNA-alvo na célula (por exemplo, no genoma da célula) por indução de quebras de fita dupla. As nucleases com efetores do tipo ativador transcricional (TALENs) são DNA endonucleases artificiais geradas por fusão de um domínio de ligação efetor TAL (Pseudo ativador de transcrição) ao DNA a um domínio de clivagem de DNA. TALENS podem ser rapidamente modificadas geneticamente para se ligar a praticamente qualquer sequência de DNA desejada e, quando introduzidas em uma célula, TALENs podem ser usadas para editar DNA-alvo na célula (por exemplo, no genoma da célula) por indução de quebras de fita dupla. Meganucleases (endonucleases teleguiadas) são endo-desoxirribonucleases caracterizadas por um local de reconhecimento grande (sequências de DNA de fita dupla de 12 a 40 pares de bases. Meganucleases podem ser usadas para substituir, eliminar ou modificar sequências de uma forma altamente direcionada. Por modificação de sua sequência de reconhecimento por meio de modificação genética de proteínas, a sequência visada pode ser alterada. Meganucleases podem ser usadas para modificar todos os tipos de genoma, sejam eles bacterianos, de plantas ou animais, e são comumente agrupadas em quatro famílias: a família LAGLIDADG (ID. DE SEQ. Nº: 1), a família GIY-YIG, a família His-Cyst box e a família HNH. Endonucleases teleguiadas exemplares incluem I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII.

Variação genética – Métodos de Identificação

[00136] Os micróbios da presente revelação podem ser identificados por uma ou mais modificações ou alterações genéticas, que foram introduzias no referido micróbio. Um método pelo qual a referida modificação ou alteração genética pode ser identificada é por meio de referência a um Nº DE ID. DE SEQ. que contém uma porção da sequência genômica do micróbio que é suficiente para identificar a modificação ou alteração genética.

[00137] Além disso, no caso de micróbios que não tinham uma modificação ou alteração genética (por exemplo, um do tipo selvagem, WT) introduzida em seus genomas, a revelação pode utilizar sequências de ácidos nucleicos 16S para identificar os referidos micróbios. Uma sequência de ácidos nucleicos 16S é um exemplo de um “marcador molecular” ou “marcador genético”, que se refere a um indicador que é usado em métodos para visualização de diferenças em características de sequências de ácidos nucleicos. Exemplos de outros indicadores desse tipo são marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), mutações de inserção, marcadores microssatélites (SSRs), regiões amplificadas sequência- caracterizadas (SCARs), marcadores ou marcadores de isozima de sequência polimórfica clivada amplificada (CAPS), ou combinações dos marcadores descritos nesse relatório descritivo que definem uma localização genética e cromossômica específica. Marcadores ainda incluem sequências de polinucleotídeos que codificam rRNA 16S ou 18S, e sequências espaçadoras (ITS) internas transcritas, que são sequências encontradas entre genes de rRNA de subunidade pequena e de subunidade grande que se mostraram especialmente úteis na elucidação de relacionamentos ou distinções quando comparadas entre elas. Além disso, a revelação utiliza sequências únicas encontradas em genes de interesse (por exemplo, nif H, D, K, L, A, glnE, amtB etc.) para identificar micróbios revelados nesse relatório descritivo.

[00138] A estrutura primária da subunidade de rRNA 16S principal compreende uma combinação particular de regiões conservadas, variáveis e hipervariáveis que evoluem em taxas diferentes e permitem a resolução tanto de linhagens muito antigas como, por exemplo, domínios, quanto linhagens mais modernas como, por exemplo, gêneros. A estrutura secundária da subunidade 16S inclui aproximadamente 50 hélices que resultam em pareamento de bases de cerca de 67% dos resíduos. Essas características estruturais secundárias altamente conservadas são de grande importância funcional e podem ser usadas para assegura homologia posicional em múltiplos alinhamentos e análise filogenética de sequências. Ao longo das décadas prévias recentes, o gene de rRNA 16S se tornou o marcador taxonômico mais sequenciado e é a pedra angular para a classificação sistemática atual de bactérias e arquéias (Yarza e cols. 2014. Nature Rev. Micro. 12: 635- 45).

[00139] Dessa forma, em certos aspectos, a revelação fornece uma sequência, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para qualquer sequência nas Tabelas 23, 24, 30, 31, e 32.

[00140] Dessa forma, em certos aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%,

75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 62-303. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas nas Tabelas 31 e 32.

[00141] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de ácidos nucleicos 16S, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, 277-283. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 32.

[00142] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de ácidos nucleicos, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 86-95, 97-110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158- 166, 168-176, 263-268, 270-274, 275, 276, 284-295. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 32.

[00143] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de ácidos nucleicos, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ.

Nos: 177-260, 296-303. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 32.

[00144] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende, ou iniciador que compreende, ou sonda que compreende, ou sequência de junção não-nativa que compreende, uma sequência de ácidos nucleicos, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 304-424. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 30.

[00145] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de junção não-nativa que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 372-405. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 30.

[00146] Em alguns aspectos, a revelação fornece um micróbio que compreende uma sequência de aminoácidos, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para os IDS. DE SEQ. Nos: 77, 78, 81, 82 ou 83. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 31.

Variação Genética - Métodos de Detecção: Iniciadores,

Sondas e Ensaios

[00147] A presente revelação ensina iniciadores, sondas e ensaios que são úteis para detecção dos micróbios ensinados nesse relatório descritivo. Em alguns aspectos, a revelação fornece métodos de detecção das cepas WT parentais. Em outros aspectos, a revelação fornece métodos de detecção dos micróbios não intergenéricos modificados geneticamente derivados das cepas WT. Em alguns aspectos, a presente revelação fornece métodos de identificação de alterações genéticas não intergenéricas em um micróbio.

[00148] Em alguns aspectos, os métodos de engenharia genética genômica da presente revelação levam à criação de sequências de “junção” de nucleotídeo não naturais nos micróbios não intergenéricos derivados. Essas junções de nucleotídeo de ocorrência não natural podem ser usadas como um tipo de diagnóstico que é indicativo da presença de uma alteração genética particular em um micróbio ensinado nesse relatório descritivo.

[00149] As presentes técnicas são capazes de detectar essas junções de nucleotídeo de ocorrência não natural por meio da utilização de métodos especializados de PCR quantitativa, incluindo iniciadores e sondas singularmente projetados. Em alguns aspectos, as sondas da revelação se ligam às sequências de junção de nucleotídeo de ocorrência não natural. Em alguns aspectos, é utilizada PCR tradicional. Em outros aspectos, é utilizada PCR em tempo real. Em alguns aspectos, é utilizada PCR quantitativa (qPCR).

[00150] Dessa forma, a revelação pode cobrir a utilização de dois métodos comuns para a detecção de produtos de PCR em tempo real: (1) corantes fluorescentes não específicos que intercalam com qualquer DNA de fita dupla, e (2) sondas de DNA sequência-específicas que consistem em oligonucleotídeos que são marcados com um repórter fluorescente que permite a detecção apenas após hibridização da sonda com sua sequência complementar. Em alguns aspectos, somente a junção de nucleotídeo de ocorrência não natural será amplificada por meio dos iniciadores ensinados e, consequentemente, pode ser detectada por meio de um corante não específico, ou por meio da utilização de uma sonda de hibridização específica. Em outros aspectos, os iniciadores da revelação são escolhidos de modo que os iniciadores flanqueiem ambos os lados de uma sequência de junção, de modo que caso ocorra uma reação de amplificação, então a referida sequência de junção está presente.

[00151] Aspectos da revelação envolvem moléculas de sequência da junção de nucleotídeo de ocorrência não natural per se, juntamente com outras moléculas de nucleotídeos que são capazes de se ligar às referidas sequências de junção de nucleotídeo de ocorrência não natural sob condições de hibridização leves a rigorosas. Em alguns aspectos, as moléculas de nucleotídeos que são capazes de se ligar às referidas sequências de junção de nucleotídeo de ocorrência não natural sob condições de hibridização leves a rigorosas são denominadas “sondas de nucleotídeos”.

[00152] Em aspectos, DNA genômico pode ser extraído de amostras e usado para quantificar a presença de micróbios da revelação por utilização de qPCR. Os iniciadores utilizados na reação de qPCR podem ser iniciadores projetados por Primer Blast

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) para amplificar regiões únicas do genoma do tipo selvagem ou regiões únicas das cepas mutantes não intergenéricas modificadas geneticamente. A reação de qPCR pode ser realizada usando o kit SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Thermo Fisher P/N 11762100), usando somente iniciadores de amplificação diretos e reversos; alternativamente, o kit Kapa Probe Force (Kapa Biosystems P/N KK4301) pode ser usado com iniciadores de amplificação e uma sonda TaqMan que contém um marcador de corante FAM na extremidade 5’, um extintor (“quencher”) interno ZEN, e um aglutinante do sulco menor e extintor fluorescente na extremidade 3’ (Integrated DNA Technologies).

[00153] Alguns iniciadores, sondas e sequências de junção não nativas estão listados na Tabela E. A eficiência da reação de qPCR pode ser medida usando uma curva-padrão gerada a partir de uma quantidade conhecida de gDNA do genoma-alvo. Os dados podem ser normalizados para cópias do genoma por g de peso fresco usando o peso e volume de extração de tecido.

[00154] A reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR) é um método de quantificação, em tempo real, da amplificação de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos. A quantificação em tempo real do ensaio de PCR permite a determinação da quantidade de ácidos nucleicos que está sendo gerada pelas etapas de amplificação por PCR por comparação dos ácidos nucleicos em amplificação de interesse e uma sequência de ácidos nucleicos de controle apropriada, que pode atuar como um padrão de calibração.

[00155] Sondas TaqMan são frequentemente utilizadas em ensaios de qPCR que exigem uma especificidade aumentada para a quantificação de sequências de ácidos nucleicos-alvo. Sondas TaqMan compreendem uma sonda de oligonucleotídeo com um fluoróforo anexado à extremidade 5’ e um extintor anexado à extremidade 3’ da sonda. Quando as sondas TaqMan permanecem dessa forma com as extremidades 5’ e 3 da sonda em contato íntimo estre elas, o extintor evita a transmissão do sinal fluorescente do fluoróforo. Sondas TaqMan são projetadas para anelar dentro de uma região de ácido nucleico amplificada por um conjunto específico de iniciadores. À medida que a Taq polimerase estende o iniciador e sintetiza a fita nascente, a atividade 5’ para 3’ de exonuclease da Taq polimerase degrada a sonda que anelou ao modelo. Essa degradação da sonda libera o fluoróforo quebrando, dessa forma, a proximidade íntima ao extintor e permitindo a fluorescência do fluoróforo. A fluorescência detectada no ensaio de qPCR é diretamente proporcional ao fluoróforo liberado e à quantidade de modelo de DNA presente na reação.

[00156] As características da qPCR permitem que o profissional elimine a etapa de pós-amplificação trabalhosa da preparação de eletroforese em gel, que é geralmente necessária para observação dos produtos amplificados de ensaios de PCR tradicionais. Os benefícios da qPCR em relação à PCR convencional são consideráveis, e incluem velocidade aumentada, facilidade de uso, reprodutividade, e habilidade quantitativa.

Aprimoramento de Traços

[00157] Os métodos da presente revelação podem ser empregados para introduzir ou aprimorar um ou mais de diversos traços desejáveis. Exemplos de traços que podem ser introduzidos ou aprimorados incluem: biomassa da raiz, comprimento da raiz, altura, comprimento do broto, número de folhas, eficiência no uso de água, biomassa global, rendimento, tamanho do fruto, tamanho do grão, taxa de fotossíntese, tolerância à seca, tolerância térmica, tolerância ao sal, resistência ao estresse por nematódeo, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um patógeno bacteriano, resistência a um patógeno viral, nível de um metabólito e expressão do proteoma. Os traços desejáveis, incluindo altura, biomassa global, biomassa da raiz e/ou broto, germinação da semente, sobrevida da muda, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de sementes/frutos, rendimento de grãos ou frutos de plantas, teor de clorofila da folha, taxa fotossintética, comprimento da raiz, ou qualquer combinação destes, podem ser usados para medir o crescimento, e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem os traços aprimorados) desenvolvidas sob condições idênticas.

[00158] Um traço preferido a ser introduzido ou aprimorado é fixação de nitrogênio, como descrito nesse relatório descritivo. Em alguns casos, uma planta resultante dos métodos descritos nesse relatório descritivo exibe uma diferença no traço que é pelo menos cerca de 5% maior, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou maior do que uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições no solo. Em exemplos adicionais, uma planta resultante dos métodos descritos nesse relatório descritivo exibe uma diferença no traço que é pelo menos cerca de 5% maior, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou maior do que uma planta agrícola de referência desenvolvida sob condições similares no solo.

[00159] O traço a ser aprimorado pode ser avaliado sob condições que incluem a aplicação de um ou mais estressores bióticos ou abióticos. Exemplos de estressores incluem estresses abióticos (por exemplo, estresse pelo calor, estresse por sal, estresse por seca, estresse por frio e estresse de poucos nutrientes) e estresses bióticos (por exemplo, estresse por nematódeo, estresse por inseto herbívoro, estresse por patógeno fúngico, estresse por patógeno bacteriano e estresse por patógeno viral).

[00160] O traço aprimorado pelos métodos e composições da presente revelação pode ser fixação de nitrogênio, incluindo em uma planta que não era capaz previamente de fixação de nitrogênio. Em alguns casos, as bactérias isoladas de acordo com um método descrito nesse relatório descritivo produzem 1% ou mais (por exemplo, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, ou mais) do nitrogênio de uma planta, o que pode representar um aumento na capacidade de fixação de nitrogênio de pelo menos 2 vezes (por exemplo, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes,

1.000 vezes, ou mais), comparadas com bactérias isoladas da primeira planta antes da introdução de qualquer variação genética. Em alguns casos, as bactérias produzem 5% ou mais do nitrogênio de uma planta. O nível de fixação de nitrogênio desejado pode ser obtido após repetição das etapas de introdução de variação genética, exposição a diversas plantas e isolamento de bactérias de plantas com um traço aprimorado uma ou mais vezes (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25, ou mais vezes). Em alguns casos, níveis de fixação de nitrogênio aumentados são obtidos na presença de fertilizante suplementado com glutamina, amônia, ou outra fonte química de nitrogênio. Métodos para avaliação do grau de fixação de nitrogênio são conhecidos, cujos exemplos são descritos nesse relatório descritivo.

[00161] O melhoramento de micróbios é um método para identificar e aumentar sistematicamente o papel de espécies dentro do microbioma do plantio. O método compreende três etapas: 1) seleção de espécies candidatas por mapeamento de interações planta-micróbio e previsão de redes reguladoras ligadas a um fenótipo particular, 2) aprimoramento pragmático e previsível de fenótipos microbianos por meio do cruzamento intra-espécies de redes reguladoras e grupamentos do gene, e 3) avaliação e seleção de novos genótipos microbianos que produzem fenótipos de plantio desejados.

Para avaliar sistematicamente o aprimoramento de cepas, é criado um modelo que liga a dinâmica de colonização da comunidade microbiana à atividade genética por espécies cruciais. O modelo é usado para prever o melhoramento de alvos genéticos e aumentar a frequência de seleção de aprimoramentos em traços de relevância agronômica codificados pelo microbioma.

Medição do Nitrogênio Liberado em um Contexto de Campo Agronomicamente Relevante

[00162] No campo, a quantidade de nitrogênio liberada pode ser determinada pela função de colonização multiplicada pela atividade.

[00163] A equação acima exige: (1) a colonização média por unidade de tecido de plantas, e (2) a atividade como a quantidade de nitrogênio fixada ou a quantidade de amônia excretada por cada célula microbiana. Para converter para libras de nitrogênio por acre, a fisiologia do crescimento do milho é rastreada ao longo do tempo, por exemplo, tamanho da planta e sistema de raiz associado ao longo dos estágios da maturidade.

[00164] Os quilos de nitrogênio liberadas a um plantio por acre-estação podem ser calculadas pela seguinte equação:

[00165] Tecido de Planta (t) é o peso fresco de tecido de plantas de milho ao longo do tempo de crescimento (t). Os valores para se fazer razoavelmente o cálculo são descritos em detalhe na publicação intitulada “Roots, Growth and Nutrient Uptake” (Mengel. Dept. of Agronomy Pub.# AGRY-95- 08 (Rev. de maio de 95, páginas 1-8).

[00166] Colonização (t) é a quantidade dos micróbios de interesse encontrada dentro do tecido de plantas, por grama de peso fresco de tecido de plantas, em qualquer tempo particular, t, durante a estação de cultivo. Quando somente um ponto do tempo está disponível, o único ponto do tempo é normalizado como a taxa de colonização de pico ao longo da estação, e a taxa de colonização dos pontos do tempo restantes são ajustados de acordo.

[00167] Atividade (t) é a taxa na qual o N é fixado pelos micróbios de interesse por unidade de tempo, em qualquer tempo particular, t, durante a estação de cultivo. Nas modalidades reveladas nesse relatório descritivo, essa taxa de atividade é aproximada por ensaio in vitro de redução de acetileno (ARA) em meios de ARA na presença de 5 mM de glutamina ou ensaio de excreção de amônio em meios de ARA na presença de 5 mM de íons amônio.

[00168] A quantidade de nitrogênio liberada é então calculada integrando-se numericamente a função acima. Quando os valores das variáveis descritas acima são medidos separadamente em pontos do tempo estabelecidos, os valores entre aqueles pontos do tempo são aproximados por realização de interpolação linear.

Fixação de Nitrogênio

[00169] São descritos nesse relatório descritivo métodos de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta,

que compreendem a exposição das plantas às bactérias que compreendem uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes que regulam a fixação de nitrogênio, em que as bactérias produzem 1% ou mais de nitrogênio na planta (por exemplo, 2%, 5%, 10%, ou mais), o que pode representar uma capacidade de fixação de nitrogênio de pelo menos 2 vezes, quando comparada com a planta na ausência das bactérias.

As bactérias podem produzir o nitrogênio na presença de fertilizante suplementado com glutamina, ureia, nitratos ou amônia.

Variações genéticas podem ser qualquer variação genética descrita nesse relatório descritivo, incluindo exemplos fornecidos acima, em qualquer número e qualquer combinação.

A variação genética pode ser introduzida em um gene selecionado do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ.

A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de nifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de nifL, ntrB, glutamina sintetase, glnB, glnK, draT, amtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD.

A variação genética introduzida em uma ou mais bactérias dos métodos revelados nesse relatório descritivo pode ser uma mutação nocaute ou ela pode abolir uma sequência regulatória de um gene-alvo, ou ela pode compreender a inserção de uma sequência regulatória heteróloga, por exemplo, inserção de uma sequência regulatória encontrada dentro do genoma da mesma espécie ou gênero bacteriano.

A sequência regulatória pode ser escolhida com base no nível de expressão de um gene em uma cultura bacteriana ou dentro de tecido de plantas. A variação genética pode ser produzida por mutagênese química. As plantas desenvolvidas na etapa (c) podem ser expostas a estressores bióticos ou abióticos.

[00170] A quantidade de fixação de nitrogênio que ocorre nas plantas descritas nesse relatório descritivo pode ser medida de várias formas, por exemplo, por um ensaio de redução de acetileno (AR). Um ensaio de redução de acetileno pode ser realizado in vitro ou in vivo. Evidências de que uma bactéria particular está fornecendo nitrogênio fixado a uma planta podem incluir: 1) N total da planta aumenta significantemente mediante inoculação, preferivelmente com um aumento concomitante na concentração de N na planta; 2) os sintomas de deficiência de nitrogênio são aliviados sob condições limitantes de N mediante inoculação (que deve incluir um aumento na matéria seca); 3) a fixação de N2 é documentada por meio do uso de uma abordagem de 15N (que pode ser experimentos de diluição de isótopo, ensaios de redução de 15N2, ou ensaios de abundância natural 15N); 4) N fixado é incorporado em uma proteína ou metabólito de planta; e 5) todos esses efeitos não são observados em plantas não inoculadas ou em plantas inoculadas com um mutante da cepa do inóculo.

[00171] A cascata reguladora da fixação de nitrogênio do tipo selvagem pode ser representada como um circuito lógico digital em que as entradas de O2 e NH4+ passam através de um portão de NOR, cuja saída entra em um portão de AND em adição ao ATP. Em algumas modalidades, os métodos revelados nesse relatório descritivo rompem a influência de NH4+ sobre esse circuito, em vários pontos na cascata reguladora, de modo que os micróbios possam produzir nitrogênio até mesmo em campos fertilizados. No entanto, os métodos revelados nesse relatório descritivo também prevêem a alteração do impacto de ATP ou O2 sobre o conjunto de circuitos, ou a substituição do conjunto de circuitos com outras cascatas reguladoras na célula, ou alteração dos circuitos genéticos diferentes da fixação de nitrogênio. Os agrupamentos gênicos podem ser modificados geneticamente novamente para gerar produtos funcionais sob o controle de um sistema regulador heterólogo. Por eliminação dos elementos reguladores nativos fora e dentro de sequências codificadoras de agrupamentos de genes, e substituindo-os com sistemas reguladores alternativos, os produtos funcionais de operons genéticos complexos e outros agrupamentos de genes podem ser controlados e/ou movidos para células heterólogas, incluindo células de espécies diferentes das espécies das quais os genes nativos foram derivados. Após a nova modificação genética, os agrupamentos de genes sintéticos podem ser controlados por circuitos genéticos ou outros sistemas reguladores induzíveis controlando, dessa forma, a expressão dos produtos, como desejado. Os cassetes de expressão podem ser projetados para atuar como portões lógicos, geradores de pulso, osciladores, interruptores ou dispositivos de memória. O cassete de controle de expressão pode estar ligado a um promotor, de tal forma que o cassete de expressão funcione como um sensor ambiental, por exemplo, um sensor de oxigênio, de temperatura, de toque, de estresse osmótico, estresse de membrana ou sensor redox.

[00172] Como um exemplo, os genes nifL, nifA, nifT e nifX podem ser eliminados do agrupamento do gene nif.

Genes sintéticos podem ser projetados por randomização de códons do DNA que codifica cada sequência de aminoácidos.

A seleção de códons é realizada, especificando que o uso de códons seja o mais divergente possível do uso de códons no gene nativo.

As sequências propostas são escaneadas quanto a quaisquer características indesejadas, por exemplo, locais de reconhecimento de enzima de restrição, locais de reconhecimento de transposon, sequências repetitivas, promotores sigma 54 e sigma 70, locais de ligação ao ribossomo crípticos e terminadores rho independentes.

Locais de ligação ao ribossomo sintéticos são escolhidos para combinar com a potência de cada local de ligação ao ribossomo nativo correspondente, por exemplo, por construção de um plasmídeo-repórter fluorescente no qual as 150 bp que circundam um códon de início do gene (de −60 a +90) estão fundidas a um gene fluorescente.

Essa quimera pode ser expressa sob o controle do promotor Ptac, e a fluorescência medida por meio de citometria de fluxo.

Para gerar locais de ligação ao ribossomo sintéticos, uma biblioteca de plasmídeos repórteres usando 150 bp (−60 a +90) de um cassete de expressão sintético é gerada.

Resumidamente, um cassete de expressão sintético pode consistir em um espaçador de DNA aleatório, uma sequência degenerada que codifica uma biblioteca de RBS, e a sequência codificadora para cada gene sintético.

Múltiplos clones são avaliados para identificar o local de ligação ao ribossomo sintético que melhor combina com o local de ligação ao ribossomo nativo.

Operons sintéticos que consistem nos mesmos genes que os operons nativos são, dessa forma, construídos e testados para complementação funcional. Uma descrição exemplar adicional de operons sintéticos é fornecida em US 20140329326.

Espécies Bacterianas

[00173] Micróbios úteis nos métodos e composições revelados nesse relatório descritivo podem ser obtidos de qualquer fonte. Em alguns casos, micróbios podem ser bactérias, arquéias, protozoários ou fungos. Os micróbios dessa revelação podem ser micróbios fixadores de nitrogênio, por exemplo, uma bactéria fixadora de nitrogênio, arquéia fixadora de nitrogênio, fungos fixadores de nitrogênio, levedura fixadora de nitrogênio ou protozoário fixador de nitrogênio. Micróbios úteis nos métodos e composições revelados nesse relatório descritivo podem ser micróbios formadores de esporos, por exemplo, bactérias formadoras de esporo. Em alguns casos, bactérias úteis nos métodos e composições revelados nesse relatório descritivo podem ser bactérias Gram-positivas ou bactérias Gram-negativas. Em alguns casos, as bactérias podem ser bactérias formadoras de endósporos do filo Firmicute. Em alguns casos, as bactérias podem ser um diazotrófico. Em alguns casos, as bactérias podem não ser um diazotrófico.

[00174] Os métodos e composições dessa revelação podem ser usados com uma arquéia como, por exemplo, Methanothermobacter thermoautotrophicus.

[00175] Em alguns casos, bactérias que podem ser úteis incluem, sem limitação, Agrobacterium radiobacter, Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus agri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus alcalophilus, Bacillus alvei, Bacillus aminoglucosidicus,

Bacillus aminovorans, Bacillus amylolyticus (também conhecido como Paenibacillus amylolyticus) Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aneurinolyticus, Bacillus atrophaeus, Bacillus azotoformans, Bacillus badius, Bacillus cereus (sinônimos: Bacillus endorhythmos, Bacillus medusa), Bacillus chitinosporus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus Bacillus fastidiosus, Bacillus firmus, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus (também conhecido como Brevibacillus laterosporus), Bacillus lautus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus maroccanus, Bacillus megaterium, Bacillus metiens, Bacillus mycoides, Bacillus natto, Bacillus nematocida, Bacillus nigrificans, Bacillus nigrum, Bacillus pantothenticus, Bacillus popillae, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus smithii, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus uniflagellatus, Bradyrhizobium japonicum, Brevibacillus brevis Brevibacillus laterosporus (anteriormente Bacillus laterosporus), Chromobacterium subtsugae, Delftia acidovorans, Lactobacillus acidophilus, Lysobacter antibioticus, Lysobacter enzymogenes, Paenibacillus alvei, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus popilliae (anteriormente Bacillus popilliae), Pantoea agglomerans, Pasteuria penetrans (anteriormente Bacillus penetrans), Pasteuria usgae, Pectobacterium carotovorum (anteriormente Erwinia carotovora), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas cepacia (anteriormente conhecida como Burkholderia cepacia), Pseudomonas clororaphis,

Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas proradix, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Serratia entomophila, Serratia marcescens, Streptomyces colombiensis, Streptomyces galbus, Streptomyces goshikiensis, Streptomyces griseoviridis, Streptomyces lavendulae, Streptomyces prasinus, Streptomyces saraceticus, Streptomyces venezuelae, Xanthomonas campestris, Xenorhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophila, Rhodococcus globerulus AQ719 (NRRL Nº de Acesso B-21663), Bacillus sp. AQ175 (Nº de Acesso ATCC 55608), Bacillus sp. AQ 177 (Nº de Acesso ATCC 55609), Bacillus sp. AQ178 (Nº de Acesso ATCC 53522), e Streptomyces sp. cepa NRRL Nº de Acesso B-30145. Em alguns casos a bactéria pode ser Azotobacter chroococcum, Methanosarcina barkeri, Klesiella pneumoniae, Azotobacter vinelandii, Rhodobacter spharoides, Rhodobacter capsulatus, Rhodobcter palustris, Rhodosporillum rubrum, Rhizobium leguminosarum ou Rhizobium etli.

[00176] Em alguns casos, a bactéria pode ser uma espécie de Clostridium, por exemplo, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium acetobutylicum.

[00177] Em alguns casos, as bactérias usadas com os métodos e composições da presente revelação podem ser cianobactérias. Exemplos de gêneros de cianobactérias incluem Anabaena (por exemplo, Anagaena sp. PCC7120), Nostoc (por exemplo, Nostoc punctiforme) ou Synechocystis (por exemplo, Synechocystis sp. PCC6803).

[00178] Em alguns casos, as bactérias usadas com os métodos e composições da presente revelação podem pertencer ao filo Chlorobi, por exemplo, Chlorobium tepidum.

[00179] Em alguns casos, os micróbios usados com os métodos e composições da presente revelação podem compreender um gene homólogo a um gene de NifH conhecido. Sequências de genes de NifH conhecidos podem ser encontradas, por exemplo, na base de dados “Zehr lab NifH”, (https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, 4 de abril de 2014), ou na base de dados “Buckley lab NifH” (http://www.css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh.htm, e Gaby, John Christian, e Daniel H. Buckley. “A Comprehensive Aligned nifH Gene Database: a Multipurpose Tool for Studies of Nitrogen-Fixing Bacteria”. Base de dados 2014 (2014): bau001.). Em alguns casos, os micróbios usados com os métodos e composições da presente revelação podem compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo com pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% ou mais do que 99% de identidade de sequência para uma sequência da base de dados “Zehr lab NifH”, (https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, 4 de abril de 2014). Em alguns casos, os micróbios usados com os métodos e composições da presente revelação podem compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo com pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% ou mais do que 99% de identidade de sequência para uma sequência da base de dados “Buckley lab NifH”, (Gaby, John Christian, e Daniel H. Buckley. “A Comprehensive Aligned nifH Gene Database: a Multipurpose Tool for Studies of Nitrogen-Fixing Bacteria”. Base de dados 2014 (2014): bau001).

[00180] Micróbios úteis nos métodos e composições revelados nesse relatório descritivo podem ser obtidos por extração de micróbios de superfícies ou tecidos de plantas nativas; trituração de sementes para isolar micróbios; plantio de sementes em amostras de solo diversas e recuperação de micróbios de tecidos; ou inoculação de plantas com micróbios exógenos e determinação de quais micróbios aparecem em tecidos de plantas. Exemplos não limitantes de tecidos de planta incluem uma semente, muda, folha, muda, planta, bulbo, tubérculo, raiz e rizomas. Em alguns casos, as bactérias são isoladas de uma semente. Os parâmetros para o processamento de amostras podem ser variados para isolar diferentes tipos de micróbios associativos, tais como rizosféricos, epífitos ou endófitos. As bactérias também podem ser originadas de um repositório, por exemplo, coleções de cepas ambientais, ao invés de isolar inicialmente uma primeira planta. Os micróbios podem ser genotipados e fenotipados, por meio de sequenciamento dos genomas de micróbios isolados; a definição do perfil da composição de comunidades em plantas; caracterização da funcionalidade transcriptômica de comunidades ou micróbios isolados; ou avaliação das características microbianas usando meios seletivos ou fenotípicos (por exemplo, fenótipos de fixação de nitrogênio ou de solubilização de fosfato). As cepas ou populações candidatas selecionadas podem ser obtidas por meio de dados de sequências; dados de fenótipo; dados de plantas (por exemplo, genoma, dados de fenótipo e/ou de rendimento); dados do solo (por exemplo, pH, teor de N/P/K, e/ou comunidades bióticas do solo a granel); ou qualquer combinação destes.

[00181] As bactérias e métodos de produção de bactérias descritos nesse relatório descritivo podem ser aplicar às bactérias capazes de se autopropagar eficientemente na superfície da folha, na superfície da raiz ou dentro de tecidos de plantas, sem indução de uma reação de defesa que danifique a planta, ou bactérias que são resistentes às respostas de defesa da planta.

As bactérias descritas nesse relatório descritivo podem ser isoladas por cultivo de um extrato de tecido de planta ou de lavagem da superfície da folha em um meio sem nitrogênio adicionado.

No entanto, as bactérias podem ser não cultiváveis, ou seja, não conhecidas por serem cultiváveis ou de cultivo difícil usando métodos-padrão conhecidos na técnica.

As bactérias descritas nesse relatório descritivo podem ser um endófito ou um epífito ou uma bactéria que habita a rizosfera da planta (bactérias rizosféricas). As bactérias obtidas após repetição das etapas de introdução de variação genética, exposição a diversas plantas e isolamento de bactérias de plantas com um traço aprimorado uma ou mais vezes (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25, ou mais vezes) podem ser endofíticas, epifíticas ou rizosféricas.

Endófitos são organismos que penetram no interior de plantas sem causar sintomas de doença ou despertar a formação de estruturas simbióticas, e são de interesse agronômico, pois podem aumentar o crescimento de plantas e aprimorar a nutrição de plantas (por exemplo, por meio da fixação de nitrogênio). As bactérias podem ser um endófito transmitido por semente.

Endófitos transmitidos por semente incluem bactérias associadas ou derivadas da semente de uma gramínea ou planta, por exemplo, como um endófito bacteriano transmitido por semente encontrado em sementes maduras, secas, não danificadas (por exemplo, sem rachaduras, infecção fúngica visível, ou germinadas prematuramente). O endófito bacteriano transmitido por semente pode estar associado ou ser derivado da superfície da semente; alternativamente, ou em adição, ele pode estar associado ou ser derivado do compartimento interno da semente (por exemplo, de uma semente com superfície esterilizada). Em alguns casos, um endófito bacteriano transmitido por semente é capaz de replicar dentro do tecido de planta, por exemplo, no interior da semente. Além disso, em alguns casos, o endófito bacteriano transmitido por semente é capaz de sobreviver à dessecação.

[00182] O isolado bacteriano de acordo com métodos da revelação, ou usado em métodos ou composições da revelação, pode compreender diversos táxons bacterianos diferentes em combinação. Apenas como exemplo, as bactérias podem incluir Proteobacteria (por exemplo, Pseudomonas, Enterobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Rhizobium, Herbaspirillum, Pantoea, Serratia, Rahnella, Azospirillum, Azorhizobium, Azotobacter, Duganella, Delftia, Bradyrhizobiun, Sinorhizobium e Halomonas), Firmicutes (por exemplo, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Mycoplasma e Acetabacterium) e Actinobactérias (por exemplo, Streptomyces, Rhodacoccus, Microbacterium e Curtobacterium). As bactérias usadas em métodos e composições dessa revelação podem incluir consórcios bacterianos fixadores de nitrogênio de duas ou mais espécies. Em alguns casos, uma ou mais espécies bacterianas dos consórcios bacterianos podem ser capazes de fixação de nitrogênio. Em alguns casos, uma ou mais espécies dos consórcios bacterianos podem facilitar ou aumentar a habilidade de outras bactérias para fixar nitrogênio. As bactérias que fixam nitrogênio e as bactérias que aumentam a habilidade de outras bactérias para fixar nitrogênio podem ser as mesmas ou diferentes. Em alguns exemplos, uma cepa bacteriana pode ser capaz de fixar nitrogênio quando em combinação com uma cepa bacteriana diferente, ou em certos consórcios bacterianos, mas pode ser incapaz de fixar nitrogênio em uma monocultura. Exemplos de gêneros bacterianos que podem ser encontrados em consórcios bacterianos fixadores de nitrogênio incluem, sem limitação, Herbaspirillum, Azospirillum, Enterobacter e Bacillus.

[00183] Bactérias que podem ser produzidas pelos métodos revelados nesse relatório descritivo incluem Azotobacter sp., Bradyrhizobium sp., Klebsiella sp. e Sinorhizobium sp. Em alguns casos, as bactérias podem ser selecionadas do grupo que consiste em: Azotobacter vinelandii, Bradyrhizobium japonicum, Klebsiella pneumoniae, e Sinorhizobium meliloti. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero Enterobacter ou Rahnella. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero Frankia, ou Clostridium. Exemplos de bactérias do gênero Clostridium incluem, sem limitação, Clostridium acetobutylicum, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens, e Clostridium tetani. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero Paenibacillus, por exemplo, Paenibacillus azotofixans, Paenibacillus borealis, Paenibacillus durus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus alvei, Paenibacillus amylolyticus, Paenibacillus campinasensis, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus glucanolyticus, Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus larvae subsp. Larvae, Paenibacillus larvae subsp. Pulvifaciens, Paenibacillus lautus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus pabuli, Paenibacillus peoriae ou Paenibacillus polymyxa.

[00184] Em alguns exemplos, as bactérias isoladas de acordo com métodos da revelação podem ser um membro de um ou mais dos seguintes táxons: Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Acidovoraz, Acinetobacter, Actinoplanes, Adlercreutzia, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agromyces, Ancylobacter, Arthrobacter, Atopostipes, Azospirillum, Bacillus, Bdellovibrio, Beijerinckia, Bosea, Bradyrhizobium, Brevibacillus, Brevundimonas, Burkholderia, Candidatus Haloredivivus, Caulobacter, Cellulomonas, Cellvibrio, Chryseobacterium, Citrobacter, Clostridium, Coraliomargarita, Corynebacterium, Cupriavidus, Curtobacterium, Curvibacter, Deinococcus, Delftia, Desemzia, Devosia, Dokdonella, Dyella, Enhydrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Escherichia/Shigella, Exiguobacterium, Ferroglobus, Filimonas, Finegoldia, Flavisolibacter, Flavobacterium, Frigoribacterium, Gluconacetobacter, Hafnia, Halobaculum, Halomonas, Halosimplex, Herbaspirillum, Hymenobacter, Klebsiella, Kocuria, Kosakonia, Lactobacillus, Leclercia, Lentzea, Luteibacter, Luteimonas, Massilia, Mesorhizobium, Metilobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Microvirga, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Oceanibaculum, Ochrobactrum, Okibacterium, Oligotropha, Oryzihumus, Oxalophagus, Paenibacillus, Panteoa, Pantoea, Pelomonas, Perlucidibaca, Plantibacter, Polynucleobacter, Propionibacterium, Propiônicoiclava, Pseudoclavibacter, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoxanthomonas,

Psychrobacter, Rahnella, Ralstonia, Rheinheimera, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Roseateles, Ruminococcus, Sebaldella, Sediminibacillus, Sediminibacterium, Serratia, Shigella, Shinella, Sinorhizobium, Sinosporangium, Sphingobacterium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Sphingosinicella, Staphylococcus, 25 Stenotrophomonas, Strenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Stygiolobus, Sulfurisphaera, Tatumella, Tepidimonas, Thermomonas, Thiobacillus, Variovorax, WPS-2 genera incertae sedis, Xanthomonas e Zimmermannella.

[00185] Em alguns casos, uma espécie bacteriana selecionada de pelo menos um dos seguintes gêneros é utilizada: Enterobacter, Klebsiella, Kosakonia e Rahnella. Em alguns casos, uma combinação de espécies bacterianas dos seguintes gêneros é utilizada: Enterobacter, Klebsiella, Kosakonia e Rahnella. Em alguns casos, a espécie utilizada pode ser uma ou mais de: Enterobacter sacchari, Klebsiella variicola, Kosakonia sacchari e Rahnella aquatilis.

[00186] Em alguns casos, um micróbio Gram-positivo pode ter um sistema de molibdênio-ferro nitrogenase que compreende: nifH, nifD, nifK, nifB, nifE, nifN, nifX, hesA, nifV, nifW, nifU, nifS, nifI1 e nifI2. Em alguns casos, um micróbio Gram-positivo pode ter um sistema de vanádio nitrogenase que compreende: vnfDG, vnfK, vnfE, vnfN, vupC, vupB, vupA, vnfV, vnfR1, vnfH, vnfR2, vnfA (regulador da transcrição). Em alguns casos, um micróbio Gram-positivo pode ter um sistema de nitrogenase só de ferro que compreende: anfK, anfG, anfD, anfH, anfA (regulador da transcrição). Em alguns casos, um micróbio Gram-positivo pode ter um sistema de nitrogenase que compreende glnB e glnK (proteínas de sinalização de nitrogênio). Alguns exemplos de enzimas envolvidas no metabolismo de nitrogênio em micróbios Gram-positivos incluem glnA (glutamina sintetase), gdh (glutamato desidrogenase), bdh (3- hidroxibutirato desidrogenase), glutaminase, gltAB/gltB/gltS (glutamato sintase), asnA/asnB (aspartato- amônia ligase/asparagina sintetase) e ansA/ansZ (asparaginase). Alguns exemplos de proteínas envolvidas no transporte de nitrogênio em micróbios Gram-positivos incluem amtB (transportador de amônio), glnK (regulador do transporte de amônio), glnPHQ/ glnQHMP (transportadores de glutamina/glutamato ATP-dependentes), glnT/alsT/yrbD/yflA (transportadores de simporte de próton semelhante a glutamina) e gltP/gltT/yhcl/nqt (transportadores de simporte de próton semelhante a glutamato).

[00187] Exemplos de micróbios Gram-positivos que podem ser de interesse particular incluem Paenibacillus polymixa, Paenibacillus riograndensis, Paenibacillus sp., Frankia sp., Heliobacterium sp., Heliobacterium chlorum, Heliobacillus sp., Heliophilum sp., Heliorestis sp., Clostridium acetobutylicum, Clostridium sp., Mycobacterium flaum, Mycobacterium sp., Arthrobacter sp., Agromyces sp., Corynebacterium autitrophicum, Corynebacterium sp., Micromonspora sp., Propionibacteria sp., Streptomyces sp. e Microbacterium sp.

[00188] Alguns exemplos de alterações genéticas que podem ser feitas em micróbios Gram-positivos incluem: deleção de glnR para remover a regulação negativa de BNF na presença de nitrogênio ambiental, inserção de promotores diferentes diretamente a montante do agrupamento nif para eliminar a regulação por GlnR em resposta ao nitrogênio ambiental, mutação de glnA para reduzir a taxa de assimilação de amônio pela via de GS-GOGAT, deleção de amtB para reduzir a captação de amônio dos meios, mutação de glnA de modo que seja constitutivamente no estado de inibido por feedback (FBI-GS), para reduzir a assimilação de amônio pela via de GS-GOGAT.

[00189] Em alguns casos, glnR é o regulador principal do metabolismo e fixação de N na espécie Paenibacillus. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnR. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnE ou glnD. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode conter um gene para produzir glnB ou glnK. Por exemplo, Paenibacillus sp. WLY78 não contém um gene para glnB, ou seus homólogos encontrados na arquéia Methanococcus maripaludis, nifI1 e nifI2. Em alguns casos, os genomas de espécies de Paenibacillus podem ser variáveis. Por exemplo, Paenibacillus polimixa E681 não possui glnK e gdh, possui vários transportadores de composto de nitrogênio, mas somente amtB parece ser controlado por GlnR. Em outro exemplo, Paenibacillus sp. JDR2 possui glnK, gdh e a maioria dos outros genes centrais do metabolismo de nitrogênio, possui muito poucos transportadores de composto de nitrogênio, mas possui glnPHQ controlado por GlnR. Paenibacillus riograndensis SBR5 contém um operon-padrão de glnRA, um gene fdx, um operon principal de nif, um operon de nif secundário, e um operon de anf (que codifica nitrogenase só de ferro). Supostos locais glnR/tnrA foram encontrados a montante de cada um desses operons. GlnR pode regular todos os operons acima, exceto o operon de anf. GlnR pode se ligar a cada uma dessas sequências regulatórias como um dímero.

[00190] Cepas de Paenibacillus fixadoras de N podem se enquadrar em dois subgrupos: Subgrupo I, que contém somente um agrupamento mínimo do gene nif e subgrupo II, que contém um agrupamento mínimo, mais um gene não caracterizado entre nifX e hesA, e frequentemente outros agrupamentos que duplicam alguns dos genes nif, por exemplo, nifH, nifHDK, nifBEN, ou agrupamentos que codificam genes de vanádio nitrogenase (vnf) ou nitrogenase só de ferro (anf).

[00191] Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnB ou glnK. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode conter um agrupamento nif mínimo com 9 genes transcritos por um promotor Sigma-70. Em alguns casos, um agrupamento nif de Paenibacillus pode ser regulado negativamente por nitrogênio ou oxigênio. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir Sigma-54. Por exemplo, Paenibacillus sp. WLY78 não contém um gene para Sigma-54. Em alguns casos, um agrupamento nif pode ser regulado por glnR e/ou TnrA. Em alguns casos, a atividade de um agrupamento nif pode ser alterada por alteração da atividade de glnR e/ou TnrA.

[00192] Em bacilos, glutamina sintetase (GS) é inibida por feedback por concentrações elevadas de glutamina intracelular, causando uma mudança na confirmação (referida como FBI-GS). Agrupamentos Nif contêm locais de ligação distintos para os reguladores GlnR e TnrA em várias espécies de bacilos. GlnR se liga e reprime a expressão gênica na presença de excesso de glutamina intracelular e AMP. Um papel de GlnR pode ser evitar o influxo e produção intracelular de glutamina e amônio sob condições de alta disponibilidade de nitrogênio. TnrA pode se ligar e/ou ativar (ou reprimir) a expressão gênica na presença de glutamina intracelular limitante, e/ou na presença de FBI-GS. Em alguns casos, a atividade de um agrupamento nif de bacilo pode ser alterada por alteração da atividade de GlnR.

[00193] A glutamina sintetase inibida por Feedback (FBI-GS) pode se ligar a GlnR e estabilizar a ligação de GlnR às sequências de reconhecimento. Várias espécies bacterianas possuem um local de ligação GlnR/TnrA a montante do agrupamento nif. A alteração da ligação de FBI-GS e GlnR pode alterar a atividade da via de nif.

Fontes de Micróbios

[00194] As bactérias (ou qualquer micróbio de acordo com a revelação) podem ser obtidas de qualquer ambiente terrestre geral, incluindo seus solos, plantas, fungos, animais (incluindo invertebrados) e outra biota, incluindo os sedimentos, água e biota de lagos e rios; do ambiente marinho, sua biota e sedimentos (por exemplo, água do mar, lamas marinhas, plantas marinhas, invertebrados marinhos (por exemplo, esponjas), vertebrados marinhos (por exemplo, peixes)); da geosfera terrestre e marinha (regolito e pedra, por exemplo, pedras subterrâneas trituradas, areia e argilas); da criosfera e suas águas de degelo; da atmosfera (por exemplo, poeiras aéreas filtradas, gotículas de nuvens e chuva); de ambientes urbanos, industriais e outros ambientes feitos pelo homem (por exemplo, matéria orgânica e mineral acumulada no concreto, canais da beira de estradas, superfícies de telhados e superfícies de estradas).

[00195] As plantas das quais as bactérias (ou qualquer micróbio de acordo com a revelação) são obtidas podem ser uma planta que possui um ou mais traços desejáveis, por exemplo, uma planta que naturalmente cresce em um ambiente particular ou sob certas condições de interesse. Apenas como exemplo, certa planta pode crescer naturalmente em solo arenoso ou areia de salinidade elevada, ou sob temperaturas extremas, ou com pouca água, ou ela pode ser resistente a certas pragas ou doenças presentes no ambiente, e pode ser desejável que um plantio comercial cresça nessas condições, particularmente caso sejam, por exemplo, as únicas condições disponíveis em uma localização geográfica particular. Como exemplo adicional, as bactérias podem ser coletadas de plantios comerciais desenvolvidos nesses ambientes ou, mais especificamente, de plantas de plantio individuais que melhor exibem um traço de interesse dentro de um plantio desenvolvido em qualquer ambiente específico: por exemplo, as plantas que crescem mais rápido dentro de um plantio desenvolvido em solos com limitação salina, ou as plantas manos danificadas em plantios expostos a danos severos por insetos ou doença epidêmica, ou plantas que possuem quantidades desejadas de certos metabólitos e outros compostos, incluindo teor de fibras, teor de óleo e semelhantes, ou plantas que exibem cores, sabor ou aroma desejáveis. As bactérias podem ser coletadas de uma planta de interesse ou de qualquer material que ocorra no ambiente de interesse, incluindo fungos e outra biota animal e de plantas, solo, água, sedimentos e outros elementos do ambiente, como citado previamente.

[00196] As bactérias (ou qualquer micróbio de acordo com a revelação) podem ser isoladas de tecido de planta.

Esse isolamento pode ocorrer de qualquer tecido apropriado na planta, incluindo por exemplo, raiz, caule e folhas, e tecidos reprodutivos da planta.

Apenas como exemplo, métodos convencionais para o isolamento de plantas tipicamente incluem a excisão estéril do material de planta de interesse (por exemplo, comprimentos da raiz ou caule, folhas), esterilização de superfície com uma solução apropriada (por exemplo, hipoclorito de sódio 2%), e depois o material de planta é colocado em meio nutriente para crescimento microbiano.

Alternativamente, o material de planta com a superfície esterilizada pode ser triturado em um líquido estéril (normalmente água) e a suspensão líquida, incluindo pequenos pedaços do material de planta triturado, espalhada sobre a superfície de um meio de ágar sólido adequado, ou meios, que pode ou não ser seletivo (por exemplo, conter apenas ácido fítico como uma fonte de fósforo). Essa abordagem é especialmente útil para bactérias que formam colônias isoladas e podem ser retiradas individualmente para separar as placas de meio nutriente, e adicionalmente purificadas até uma única espécie por métodos bem conhecidos.

Alternativamente, a raiz da planta ou amostras de folhagem podem não ser esterilizadas na superfície, mas apenas lavadas gentilmente incluindo, dessa forma, microrganismos epifíticos que habitam a superfície no processo de isolamento, ou os micróbios epifíticos podem ser isolados separadamente, por impressão e retirada de pedaços de raízes, caule ou folhas da planta sobre a superfície de um meio de ágar e depois o isolamento de colônias individuais como acima.

Essa abordagem é especialmente útil para bactérias,

por exemplo. Alternativamente, as raízes podem ser processadas sem a retirada por lavagem de pequenas quantidades de solo anexado às raízes incluindo, dessa forma, micróbios que colonizam a rizosfera da planta. De outro modo, o solo aderido às raízes pode ser removido, diluído e espalhado sobre ágar de meios seletivos e não seletivos adequados para isolar colônias individuais de bactérias rizosféricas.

TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS PARA A FINALIDADE DE PROCEDIMENTOS DE PATENTE

[00197] Os depósitos microbianos da presente revelação foram feitos sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o “Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos Para a Finalidade de Procedimentos de Patente” (Tratado de Budapeste).

[00198] Os requerentes declaram que de acordo com 37 C.F.R. § 1.808(a)(2) “todas as restrições impostas pelo depositante sobre a disponibilidade ao público do material depositado serão irrevogavelmente removidas mediante a concessão da patente”. Essa declaração está submetida ao parágrafo (b) dessa seção (ou seja, 37 C.F.R. § 1.808(b)).

[00199] A Enterobacter sacchari foi agora reclassificada como Kosakonia sacchari, o nome para o organismo pode ser usado de forma intercambiável ao longo do manuscrito.

[00200] Muitos micróbios da presente revelação são derivados de duas cepas do tipo selvagem, como retratado na FIG. 6 e na FIG. 7. A Cepa CI006 é uma espécie bacteriana classificada previamente no gênero Enterobacter (veja a reclassificação mencionada anteriormente em Kosakonia), e a Figura 6 identifica a linhagem dos mutantes que foram derivados de CI006. A cepa CI019 é uma espécie bacteriana classificada no gênero Rahnella, e a Figura 7 identifica a linhagem dos mutantes que foram derivados de CI019. Com relação à Figura 6 e à Figura 7, observa-se que cepas que compreendem CM no nome são mutantes das cepas retratadas imediatamente à esquerda da referida cepa de CM. As informações de depósito para a Kosakonia tipo selvagem (WT) CI006 e Rahnella WT CI019 não encontradas na Tabela 1 abaixo.

[00201] Alguns microrganismos descritos nesse pedido foram depositados em 06 de janeiro de 2017 ou em 11 de agosto de 2017 com o “Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota” (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA. Como mencionado anteriormente, todos os depósitos foram feitos sob os termos do “Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para as Finalidades de Procedimento de Patente”. Os números de acesso e datas de depósito no “Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota” para os depósitos de acordo com o Tratado de Budapeste mencionados anteriormente são fornecidos na Tabela 1.

[00202] Culturas biologicamente puras de Kosakonia sacchari (WT), Rahnella aquatilis (WT) e uma cepa variante de Kosakonia sacchari foram depositadas em 06 de janeiro de 2017 com o “Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota” (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e receberam os números de Designação de Depósito de Patente no NCMA 201701001,

201701003 e 201701002, respectivamente. A informação de depósito aplicável é encontrada abaixo na Tabela 1.

[00203] Culturas biologicamente puras de cepas variantes de Kosakonia sacchari foram depositadas em 11 de agosto de 2017 com o “Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota” (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e receberam os números de Designação de Depósito de Patente no NCMA 201708004, 201708003 e 201708002, respectivamente. A informação de depósito aplicável é encontrada abaixo na Tabela 1.

[00204] Uma cultura biologicamente pura de Klebsiella variicola (WT) foi depositada em 11 de agosto de 2017 com o “Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota” (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e recebeu o número de Designação de Depósito de Patente no NCMA 201708001. Culturas biologicamente puras de duas variantes de Klebsiella variicola foram depositadas em 20 de dezembro de 2017 com o “Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota” (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e receberam os números de Designação de Depósito de Patente no NCMA 201712001 e 201712002, respectivamente. A informação de depósito aplicável é encontrada abaixo na Tabela 1.

Tabela 1: Microrganismos depositados sob o Tratado de Budapeste.

Designação da cepa principal Número de Depósito (algumas cepas Taxonomia Data de depósito acesso possuem várias designações) CI006, PBC6.1, NCMA Kosakonia sacchari (WT) 201701001 06 de janeiro de 2017 6 CI019, NCMA Rahnella aquatilis (WT) 201701003 06 de janeiro de 2017 19 NCMA CM029, 6-412 Kosakonia sacchari 201701002 06 de janeiro de 2017 6-403 NCMA Kosakonia sacchari 201708004 11 de agosto de 2017 CM037 6-404, CM38, NCMA Kosakonia sacchari 201708003 11 de agosto de 2017 PBC6.38 CM094, 6-881, NCMA Kosakonia sacchari 201708002 11 de agosto de 2017 PBC6.94

Designação da cepa principal Número de Depósito (algumas cepas Taxonomia Data de depósito acesso possuem várias designações) CI137, 137, Klebsiella variicola NCMA 201708001 11 de agosto de 2017 PB137 (WT) NCMA 137-1034 Klebsiella variicola 201712001 20 de dezembro de 2017 NCMA 137-1036 Klebsiella variicola 201712002 20 de dezembro de 2017

Microrganismos Isolados e Biologicamente Puros

[00205] A presente revelação, em certas modalidades, fornece microrganismos isolados e biologicamente puros que possuem aplicações, inter alia, em agricultura. Os microrganismos revelados podem ser utilizados em seus estados isolados e biologicamente puros, bem como serem formulados em composições (veja a seção abaixo para descrições de composições exemplares). Além disso, a revelação fornece composições microbianas que contêm pelo menos dois membros dos microrganismos revelados isolados e biologicamente puros, bem como métodos de utilização das referidas composições microbianas. Além disso, a revelação fornece métodos de modulação da fixação de nitrogênio em plantas por meio da utilização dos micróbios isolados e biologicamente puros revelados.

[00206] Em alguns aspectos, os microrganismos isolados e biologicamente puros da revelação são aqueles da Tabela 1. Em outros aspectos, os microrganismos isolados e biologicamente puros da revelação são derivados de um microrganismo da Tabela 1. Por exemplo, uma cepa, jovem, mutante ou derivado de um microrganismo da Tabela 1 são fornecidos neste relatório descritivo. A revelação contempla todas as combinações possíveis de micróbios listados na Tabela 1, as referidas combinações algumas vezes formando um consórcio microbiano. Os micróbios da Tabela 1, individualmente ou em qualquer combinação, podem ser combinados com qualquer planta, ativo (sintético, orgânico etc.), adjuvante, carreador, suplemento ou produto biológico, mencionado na revelação.

[00207] Em alguns aspectos, a revelação fornece composições microbianas que compreendem espécies como agrupadas nas Tabelas 2-8. Em alguns aspectos, essas composições que compreendem várias espécies microbianas são denominadas consórcios ou consórcio microbianos.

[00208] Com relação às Tabelas 2-8, as letras A a I representam uma seleção não-limitante de microrganismos da presente revelação, definida como: A = Micróbio com número de acesso 201701001 identificado na Tabela 1; B = Micróbio com número de acesso 201701003 identificado na Tabela 1; C = Micróbio com número de acesso 201701002 identificado na Tabela 1; D = Micróbio com número de acesso 201708004 identificado na Tabela 1; E = Micróbio com número de acesso 201708003 identificado na Tabela 1; F = Micróbio com número de acesso 201708002 identificado na Tabela 1; G = Micróbio com número de acesso 201708001 identificado na Tabela 1; H = Micróbio com número de acesso 201712001 identificado na Tabela 1; e I = Micróbio com número de acesso 201712002 identificado na Tabela 1.

Tabela 2: Composições de oito e nove cepas.

A,B,C,D,E,F,G, A,B,C,D,E,F,G, A,B,C,D,E,F,H, A,B,C,D,F,G,H, A,B,C,E,F,G,H, A,B,C,D,E,G,H,I H I I I I A,B,D,E,F,G,H, A,C,D,E,F,G,H, B,C,D,E,F,G,H, A,B,C,D,E,F,G,H,

I I I I Tabela 3: Composições de sete cepas. A,B,C,D,E,F,G A,B,C,D,E,F,H A,B,C,D,E,F,I A,B,C,D,E,G,H A,B,C,D,E,G,I A,B,C,D,E,H,I A,B,C,D,F,G,H A,B,C,D,F,G,I A,B,C,D,F,H,I A,B,C,D,G,H,I A,B,C,E,F,G,H A,B,C,E,F,G,I A,B,C,E,F,H,I A,B,C,E,G,H,I A,B,C,F,G,H,I A,B,D,E,F,G,H A,B,D,E,F,G,I A,B,D,E,F,H,I A,B,D,E,G,H,I A,B,D,F,G,H,I A,B,E,F,G,H,I A,C,D,E,F,G,H A,C,D,E,F,G,I A,C,D,E,F,H,I A,C,D,E,G,H,I A,C,D,F,G,H,I A,C,E,F,G,H,I A,D,E,F,G,H,I B,C,D,E,F,G,H B,C,D,E,F,G,I B,C,D,E,F,H,I B,C,D,E,G,H,I B,C,D,F,G,H,I B,C,E,F,G,H,I B,D,E,F,G,H,I C,D,E,F,G,H,I Tabela 4: Composições de seis cepas. A,B,C,D,E,F A,B,C,D,E,G A,B,C,D,E,H A,B,C,D,E,I A,B,C,D,F,G A,B,C,D,F,H A,B,C,D,F,I A,B,C,D,G,H A,B,C,D,G,I A,B,C,D,H,I A,B,C,E,F,G A,B,C,E,F,H A,B,C,E,F,I A,B,C,E,G,H A,B,C,E,G,I A,B,C,E,H,I A,B,C,F,G,H A,B,C,F,G,I A,B,C,F,H,I A,B,C,G,H,I A,B,D,E,F,G A,B,D,E,F,H A,B,D,E,F,I A,B,D,E,G,H A,B,D,E,G,I A,B,D,E,H,I A,B,D,F,G,H A,B,D,F,G,I D,E,F,G,H,I C,E,F,G,H,I A,B,D,F,H,I A,B,D,G,H,I A,B,E,F,G,H A,B,E,F,G,I A,B,E,F,H,I

A,B,E,G,H,I A,B,F,G,H,I A,C,D,E,F,G A,C,D,E,F,H A,C,D,E,F,I A,C,D,E,G,H A,C,D,E,G,I A,C,D,E,H,I A,C,D,F,G,H A,C,D,F,G,I A,C,D,F,H,I A,C,D,G,H,I A,C,E,F,G,H A,C,E,F,G,I A,C,E,F,H,I A,C,E,G,H,I A,C,F,G,H,I A,D,E,F,G,H A,D,E,F,G,I A,D,E,F,H,I A,D,E,G,H,I A,D,F,G,H,I A,E,F,G,H,I B,C,D,E,F,G B,C,D,E,F,H B,C,D,E,F,I B,C,D,E,G,H B,C,D,E,G,I B,C,D,E,H,I B,C,D,F,G,H B,C,D,F,G,I B,C,D,F,H,I B,C,D,G,H,I B,C,E,F,G,H B,C,E,F,G,I B,C,E,F,H,I B,C,E,G,H,I B,C,F,G,H,I B,D,E,F,G,H B,D,E,F,G,I B,D,E,F,H,I B,D,E,G,H,I B,D,F,G,H,I B,E,F,G,H,I C,D,E,F,G,H C,D,E,F,G,I C,D,E,F,H,I C,D,E,G,H,I C,D,F,G,H,I Tabela 5: Composições de cinco cepas.

A,B,C,D,E A,B,C,D,F A,B,C,D,G A,B,C,D,H A,B,C,D,I A,B,C,E,F A,B,C,E,G A,B,C,E,H A,B,C,F,H A,B,C,F,G A,B,C,F,I A,B,C,G,H A,B,C,G,I A,B,C,H,I A,B,D,E,F A,B,D,E,G A,B,D,E,I A,B,D,F,G A,B,D,F,H A,B,D,F,I A,B,D,G,H A,B,D,G,I A,B,D,H,I A,B,E,F,G A,B,E,F,I A,B,E,G,H A,B,E,G,I A,B,E,H,I A,B,F,G,H A,B,F,G,I A,B,F,H,I A,B,G,H,I A,C,D,E,G A,C,D,E,H A,C,D,E,I A,C,D,F,G A,C,D,F,H A,C,D,F,I A,C,D,G,H A,C,D,G,I A,C,E,F,G A,C,E,F,H A,C,E,F,I A,C,E,G,H A,C,E,G,I A,C,E,H,I A,C,F,G,H A,C,F,G,I A,C,G,H,I A,D,E,F,G A,D,E,F,H A,D,E,F,I A,D,E,G,H A,D,E,G,I A,D,E,H,I A,D,F,G,H A,D,F,H,I A,D,G,H,I A,E,F,G,H A,E,F,G,I A,E,F,H,I A,E,G,H,I A,F,G,H,I B,C,D,E,F B,C,D,E,H B,C,D,E,I B,C,D,F,G B,C,D,F,H B,C,D,F,I B,C,D,G,H B,C,D,G,I B,C,D,H,I B,C,E,F,H B,C,E,F,I B,C,E,G,H B,C,E,G,I B,C,E,H,I B,C,F,G,H B,C,F,G,I B,C,F,H,I

B,D,E,F,G B,D,E,F,H B,D,E,F,I B,D,E,G,H B,D,E,G,I B,D,E,H,I B,D,F,G,H B,D,F,G,I B,D,G,H,I B,E,F,G,H B,E,F,G,I B,E,F,H,I B,E,G,H,I B,F,G,H,I C,D,E,F,G C,D,E,F,H C,D,E,G,H C,D,E,G,I C,D,E,H,I C,D,F,G,H C,D,F,G,I C,D,F,H,I C,D,G,H,I C,E,F,G,H C,E,F,H,I C,E,G,H,I C,F,G,H,I D,E,F,G,H D,E,F,G,I D,E,F,H,I D,E,G,H,I D,F,G,H,I A,B,C,E,I A,B,D,E,H A,B,E,F,H A,C,D,E,F A,C,D,H,I A,C,F,H,I A,D,F,G,I B,C,D,E,G B,C,E,F,G B,C,G,H,I B,D,F,H,I C,D,E,F,I C,E,F,G,I E,F,G,H,I Tabela 6: Composições de quatro cepas.

A,B,C,D A,B,C,E A,B,C,F A,B,C,G A,B,C,H A,B,C,I A,B,D,E A,B,D,F D,G,H,I A,B,D,G A,B,D,H A,B,D,I A,B,E,F A,B,E,G A,B,E,H A,B,E,I A,B,F,G E,F,G,H A,B,F,H A,D,F,H A,D,F,I A,D,G,H A,D,G,I A,D,H,I A,E,F,G A,E,F,H E,F,G,I A,B,F,I A,B,G,H A,B,G,I A,B,H,I A,C,D,E A,C,D,F A,C,D,G A,C,D,H E,F,H,I A,C,D,I A,C,E,F A,C,E,G A,C,E,H A,C,E,I A,C,F,G A,C,F,H A,C,F,I E,G,H,I A,C,G,H A,C,G,I A,C,H,I A,D,E,F A,D,E,G A,D,E,H A,D,E,I A,D,F,G F,G,H,I A,E,F,I A,E,G,H A,E,G,I A,E,H,I A,F,G,H A,F,G,I A,F,H,I A,G,H,I D,E,F,H B,C,D,E B,C,D,F B,C,D,G B,C,D,H B,C,D,I B,C,E,F B,C,E,G B,C,E,H D,E,F,I B,C,E,I B,C,F,G B,C,F,H B,C,F,I B,C,G,H B,C,G,I B,C,H,I B,D,E,F D,E,G,H B,D,E,G B,D,E,H B,D,E,I B,D,F,G B,D,F,H B,D,F,I B,D,G,H B,D,G,I D,E,G,I B,D,H,I B,E,F,G B,E,F,H B,E,F,I B,E,G,H B,E,G,I B,E,H,I B,F,G,H D,E,H,I

B,F,G,I B,F,H,I B,G,H,I C,D,E,F C,D,E,G C,D,E,H C,D,E,I C,D,F,G D,F,G,H C,D,F,H C,D,F,I C,D,G,H C,D,G,I C,D,H,I C,E,F,G C,E,F,H C,E,F,I D,F,G,I C,E,G,H C,E,G,I C,E,H,I C,F,G,H C,F,G,I C,F,H,I C,G,H,I D,E,F,G D,F,H,I Tabela 7: Composições de três cepas.

A,B,C A,B,D A,B,E A,B,F A,B,G A,B,H A,B,I A,C,D A,C,E G,H,I E,F,H A,C,F A,C,G A,C,H A,C,I A,D,E A,D,F A,D,G A,D,H A,D,I F,H,I E,F,G A,E,F A,E,G A,E,H A,E,I A,F,G A,F,H A,F,I A,G,H A,G,I F,G,I D,H,I A,H,I B,C,D B,C,E B,C,F B,C,G B,C,H B,C,I B,D,E B,D,F F,G,H D,G,I B,D,G B,D,H B,D,I B,E,F B,E,G B,E,H B,E,I B,F,G B,F,H E,H,I E,F,I B,F,I B,G,H B,G,I B,H,I C,D,E C,D,F C,D,G C,D,H C,D,I E,G,I D,G,H C,E,F C,E,G C,E,H C,E,I C,F,G C,F,H C,F,I C,G,H C,G,I E,G,H D,F,I C,H,I D,E,F D,E,G D,E,H D,E,I D,F,G D,F,H Tabela 8: Composições de duas cepas.

A,B A,C A,D A,E A,F A,G A,H A,I B,C B,D B,E B,F B,G B,H B,I C,D C,E C,F C,G C,H C,I D,E D,F D,G D,H D,I E,F E,G E,H E,I F,G F,H F,I G,H G,I H,I

[00209] Em algumas modalidades, composições microbianas podem ser selecionadas de qualquer grupo de membros das Tabelas 2-8. Composições Agrícolas

[00210] Composições que compreendem bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com métodos descritos nesse relatório descritivo e/ou que possuem características como descritas nesse relatório descritivo podem estar na forma de um líquido, uma espuma ou um produto seco. Composições que compreendem bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com métodos descritos nesse relatório descritivo e/ou que possuem características como descritas nesse relatório descritivo também podem ser usadas para aprimorar traços de plantas. Em alguns exemplos, uma composição que compreende populações bacterianas pode estar na forma de um pó seco, uma lama de pó e água, ou um tratamento fluido de semente. As composições que compreendem populações bacterianas podem ser revestidas em uma superfície de uma semente, e podem estar em forma líquida.

[00211] A composição pode ser fabricada em biorreatores como, por exemplo, reatores de tanque agitado contínuo, reatores de batelada e na fazenda. Em alguns exemplos, as composições podem ser armazenadas em um recipiente, por exemplo, um jarro ou em pequenos volumes. Em alguns exemplos, as composições podem ser armazenadas dentro de um objeto selecionado do grupo que consiste em uma garrafa, jarro, ampola, pacote, vaso, bolsa, caixa, lata, envelope, caixa de papelão, recipiente, silo, recipiente de envio, caçamba de caminhão, e/ou caixote.

[00212] As composições também podem ser usadas para aprimorar traços de plantas. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas sobre uma semente. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas sobre uma muda. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas sobre uma superfície de uma semente. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas como uma camada acima de uma superfície de uma semente. Em alguns exemplos, uma composição que é revestida sobre uma semente pode estar em forma líquida, em forma de produto seco, em forma de espuma, em forma de uma lama de pó e água, ou em um tratamento fluido de semente. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser aplicadas a uma semente e/ou muda por pulverização, imersão, revestimento, encapsulação e/ou espanamento da semente e/ou muda com as (uma ou mais) composições. Em alguns exemplos, várias bactérias ou populações bacterianas podem ser revestidas sobre uma semente e/ou uma muda da planta. Em alguns exemplos, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais do que dez bactérias de uma combinação bacteriana podem ser selecionadas de um dos seguintes gêneros: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Metilobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibacillus, Sphingomonas e Stenotrophomonas.

[00213] Em alguns exemplos, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, ou mais do que dez bactérias e populações bacterianas de uma combinação endofítica são selecionadas de uma das seguintes famílias: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Metilobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae e Pleosporaceae.

[00214] Em alguns exemplos, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos sais, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais do que dez bactérias e populações bacterianas de uma combinação endofítica são selecionadas de uma das seguintes famílias: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Metilobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae, Pleosporaceae.

[00215] Exemplos de composições podem incluir revestimentos de semente para cultivos agrícolas comercialmente importantes, por exemplo, sorgo, canola, tomate, morango, cevada, arroz, maís e trigo. Exemplos de composições também podem incluir revestimentos de semente para milho, soja, canola, sorgo, batata, arroz, vegetais, cereais e sementes oleaginosas. Sementes como fornecidas neste relatório descritivo podem ser organismos geneticamente modificados (GMO), não-GMO, orgânicas ou convencionais. Em alguns exemplos, as composições podem ser pulverizadas nas partes aéreas da planta, ou aplicadas às raízes por inserção em sulcos nos quais as sementes de planta são plantadas, irrigação do solo, ou imersão das raízes em uma suspensão da composição. Em alguns exemplos, as composições podem ser desidratadas em uma forma adequada que mantém a viabilidade celular e a habilidade para inocular e colonizar artificialmente as plantas hospedeiras. A espécie bacteriana pode estar presente nas composições em uma concentração entre 108 a 1010 CFU/ml. Em alguns exemplos, as composições podem ser suplementadas com íons de metal-traço, por exemplo, íons de molibdênio, íons de ferro, íons de manganês, ou combinações desses íons. A concentração de íons em exemplos de composições como descritos nesse relatório descritivo pode estar entre cerca de 0,1 mM e cerca de 50 mM. Alguns exemplos de composições também podem ser formulados com um carreador, por exemplo, beta-glucano, carboxilmetilcelulose (CMC), substância polimérica extracelular bacteriana (EPS), açúcar, leite animal, ou outros carreadores adequados. Em alguns exemplos, turfa ou materiais de plantio podem ser usados como um carreador, ou biopolímeros nos quais a composição é capturada no biopolímero, podem ser usados como um carreador. As composições que compreendem as populações bacterianas descritas nesse relatório descritivo podem aprimorar traços de plantas, por exemplo, a promoção do crescimento de plantas, a manutenção de um teor elevado de clorofila nas folhas, o aumento dos números de frutos ou sementes, e o aumento do peso unitário de frutos ou sementes.

[00216] As composições que compreendem as populações bacterianas descritas nesse relatório descritivo podem ser revestidas na superfície de uma semente. Dessa forma, as composições que compreendem uma semente revestida com uma ou mais bactérias descritas nesse relatório descritivo também são contempladas. O revestimento de semente pode ser formado por misturação da população bacteriana com um carreador granular poroso, quimicamente inerte. Alternativamente, as composições podem ser inseridas diretamente nos sulcos de arados nos quais a semente é plantada ou pulverizada sobre as folhas da planta ou aplicadas por imersão das raízes em uma suspensão da composição. Uma quantidade eficaz da composição pode ser usada para popular a região abaixo do solo adjacente às raízes da planta com crescimento bacteriano viável, ou popular as folhas da planta com crescimento bacteriano viável. Em geral, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para resultar em plantas com traços aprimorados (por exemplo, um nível desejado de fixação de nitrogênio).

[00217] As composições bacterianas descritas nesse relatório descritivo podem ser formuladas usando um carreador agronomicamente aceitável. A formulação útil para essas modalidades pode incluir pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em um agente colante, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um conservante, um estabilizante, um tensoativo, um agente anti-complexo, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador do crescimento de plantas, um fertilizante, um rodenticida, um dessecante, um bactericida, um nutriente, um hormônio ou qualquer combinação destes. Em alguns exemplos, as composições podem ser estáveis no armazenamento. Por exemplo, qualquer uma das composições descritas nesse relatório descritivo pode incluir um carreador agronomicamente aceitável (por exemplo,

um ou mais de um fertilizante como, por exemplo, um fertilizante de ocorrência não natural, um agente de adesão como, por exemplo, um agente de adesão de ocorrência não natural, e um pesticida como, por exemplo, um pesticida de ocorrência não natural). Um agente de adesão de ocorrência não natural pode ser, por exemplo, um polímero, copolímero ou cera sintética. Por exemplo, qualquer uma das sementes, mudas ou plantas revestidas descritas nesse relatório descritivo pode conter um carreador agronomicamente aceitável desse tipo no revestimento de semente. Em qualquer uma das composições ou métodos descritos nesse relatório descritivo, um carreador agronomicamente aceitável pode ser ou pode incluir um composto de ocorrência não natural (por exemplo, um fertilizante de ocorrência não natural, um agente de adesão de ocorrência não natural como, por exemplo, um polímero, copolímero ou cera sintética, ou um pesticida de ocorrência não natural). Exemplos não limitantes de carreadores agronomicamente aceitáveis são descritos abaixo. Exemplos adicionais de carreadores agronomicamente aceitáveis são conhecidos na técnica.

[00218] Em alguns casos, as bactérias são misturadas com um carreador agronomicamente aceitável. O carreador pode ser um carreador sólido ou um carreador líquido, e em várias formas incluindo microesferas, pós, emulsões e semelhantes. O carreador pode ser qualquer um ou mais de diversos carreadores que conferem diversas propriedades, tais como estabilidade aumentada, umectabilidade ou dispersibilidade. Agentes umidificantes como, por exemplo, tensoativos naturais ou sintéticos, que podem ser tensoativos não iônicos ou iônicos, ou uma combinação destes, podem ser incluídos na composição. Emulsões água-em-óleo também podem ser usadas para formular uma composição que inclui as bactérias isoladas (veja, por exemplo, a Patente dos EUA Nº 7.485.451). Formulações adequadas que podem ser preparadas incluem pós molháveis, grânulos, géis, fitas ou péletes de ágar, espessantes e semelhantes, partículas microencapsuladas e semelhantes, líquidos como, por exemplo, compósitos aquosos de baixa viscosidade, suspensões aquosas, emulsões água-em- óleo etc. A formulação pode incluir grão ou produtos de legumes, por exemplo, grão ou feijões triturados, caldo ou farinha derivada de grãos ou feijões, amido, açúcar ou óleo.

[00219] Em algumas modalidades, o carreador agrícola pode ser solo ou um meio de crescimento de plantas. Outros carreadores agrícolas que podem ser usados incluem água, fertilizantes, óleos à base de plantas, umectantes, ou combinações destes. Alternativamente, o carreador agrícola pode ser um sólido, por exemplo, terra diatomácea, greda, sílica, alginato, argila, bentonita, vermiculita, cascas de sementes, outros produtos de plantas e animais, ou combinações, incluindo grânulos, péletes ou suspensões. Misturas de qualquer um dos ingredientes mencionados anteriormente também são contempladas como carreadores como, por exemplo, sem limitação, pesta (farinha e argila de caulim), ágar ou péletes à base de farinha em greda, areia ou argila etc. As formulações podem incluir fontes de alimentos para as bactérias, por exemplo, cevada, arroz, ou outros materiais biológicos como, por exemplo, sementes, partes de plantas, bagaço de cana de açúcar, cascas ou talos do processamento de grãos, material de planta moído ou restos de madeira de locais de construção, serragem ou pequenas fibras da reciclagem de papel, tecido ou madeira.

[00220] Por exemplo, um fertilizante pode ser usado para ajudar a promover o crescimento ou fornecer nutrientes a uma semente, muda ou planta. Exemplos não limitantes de fertilizantes incluem nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, enxofre, magnésio, boro, cloreto, manganês, ferro, zinco, cobre, molibdênio e selênio (ou um sal destes). Exemplos adicionais de fertilizantes incluem um ou mais aminoácidos, sais, carboidratos, vitaminas, glicose, NaCl, extrato de levedura, NH4H2PO4, (NH4)2SO4, glicerol, valina, L-leucina, ácido lático, ácido propiônico, ácido succínico, ácido málico, ácido cítrico, tartarato de KH, xilose, lixose e lecitina. Em uma modalidade, a formulação pode incluir um agente colante ou aderente (denominado um agente adesivo) para ajudar a ligar outros agentes ativos a uma substância (por exemplo, uma superfície de uma semente). Esses agentes são úteis para combinação das bactérias com carreadores que podem conter outros compostos (por exemplo, agentes de controle que não são biológicos), para gerar uma composição de revestimento. Essas composições ajudam a criar revestimentos em torno da planta ou semente para manter o contato entre o micróbio e outros agentes com a planta ou parte de planta. Em uma modalidade, adesivos são selecionados do grupo que consiste em: alginato, gomas, amidos, lecitinas, formononetina, álcool polivinílico, formononetinato alcalino, hesperetina, acetato de polivinila, cefalinas, Goma Arábica, Goma Xantana, carragenana, Óleo Mineral, Polietileno Glicol (PEG), Polivinil pirrolidona (PVP), Arabinogalactana, Metil Celulose, PEG 400, Quitosana, Poliacrilamida, Poliacrilato, Poliacrilonitrila, Glicerol,

Trietileno glicol, Acetato de Vinila, Goma Gelana, Poliestireno, Polivinil, Carboximetil celulose, Goma Gatti e copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxibutileno.

[00221] Em algumas modalidades, os adesivos podem ser, por exemplo, uma cera como, por exemplo, cera de carnaúba, cera de abelhas, cera chinesa, cera de goma-laca, cera de espermaceti, cera de coroa, cera de mamona, cera de ouricuri e cera de farelo de arroz, um polissacarídeo (por exemplo, amido, dextrinas, maltodextrinas, alginato e quitosanas), uma gordura, óleo, uma proteína (por exemplo, gelatina e zeínas), gomas arábicas e goma-lacas. Agentes adesivos podem ser compostos de ocorrência não natural, por exemplo, polímeros, copolímeros e ceras. Por exemplo, exemplos não limitantes de polímeros que podem ser usados como um agente adesivo incluem: acetatos de polivinila, copolímeros de acetato de polivinila, copolímeros de etileno-acetato de vinila (EVA), álcoois polivinílicos, copolímeros de álcool polivinílico, celuloses (por exemplo, etilceluloses, metilceluloses, hidróxi-metilceluloses, hidroxipropilceluloses, e carboximetilceluloses), polivinilpirrolidonas, cloreto de vinila, copolímeros de cloreto vinilideno, lignossulfonatos de cálcio, copolímeros acrílicos, polivinil-acrilatos, óxido de polietileno, polímeros e copolímeros de acilamida, poliidroxietil acrilato, monômeros de metilacrilamida e policloropreno.

[00222] Em alguns exemplos, um ou mais dos agentes de adesão, agentes antifúngicos, agentes de regulação do crescimento e pesticidas (por exemplo, inseticida) são compostos de ocorrência não natural (por exemplo, em qualquer combinação). Exemplos adicionais de carreadores agronomicamente aceitáveis incluem dispersantes (por exemplo, polivinilpirrolidona/acetato de vinila PVPIVA S- 630), tensoativos, aglutinantes e agentes de enchimento.

[00223] A formulação também pode conter um tensoativo. Exemplos não limitantes de tensoativos incluem mesclas de nitrogênio-tensoativo como, por exemplo, Prefer 28 (Cenex), Surf-N (US), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) e Patrol (Helena); óleos de sementes esterificados incluem Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm) e Mes-100 (Drexel); e tensoativos de organo-silicone incluem Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis) e Century (Precision). Em uma modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração entre 0,01% v/v até 10% v/v. Em outra modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração entre 0,1% v/v até 1% v/v.

[00224] Em certos casos, a formulação inclui um estabilizador microbiano. Um agente desse tipo pode incluir um dessecante, que pode incluir qualquer composto ou mistura de compostos que possa ser classificado como um dessecante, independentemente se o composto ou compostos são usados em concentrações tais que, na verdade, possuam um efeito dessecante sobre o inoculante líquido. Esses dessecantes são idealmente compatíveis com a população bacteriana usada, e devem promover a habilidade da população microbiana para sobreviver à aplicação nas sementes e sobreviver à dessecação. Exemplos de dessecantes adequados incluem um ou mais de trehalose, sacarose, glicerol e metileno glicol. Outros dessecantes adequados incluem, sem limitação, açúcares não redutores e álcoois de açúcar (por exemplo,

manitol ou sorbitol). A quantidade de dessecante introduzida na formulação pode variar de cerca de 5% até cerca de 50% por peso/volume, por exemplo, entre cerca de 10% até cerca de 40%, entre cerca de 15% e cerca de 35%, ou entre cerca de 20% e cerca de 30%. Em alguns casos, é vantajoso que a formulação contenha agentes como, por exemplo, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador do crescimento de plantas, um rodenticida, bactericida ou um nutriente. Em alguns exemplos, os agentes podem incluir protetores que fornecem proteção contra patógenos originários da superfície da semente. Em alguns exemplos, protetores podem fornecer algum nível de controle de patógenos originários do solo. Em alguns exemplos, protetores podem ser eficazes predominantemente na superfície de uma semente.

[00225] Em alguns exemplos, um fungicida pode incluir um composto ou agente, seja químico ou biológico, que pode inibir o crescimento de um fungo ou matar um fungo. Em alguns exemplos, um fungicida pode incluir compostos que podem ser fungistáticos ou fungicidas. Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um protetor, ou agentes que são eficazes predominantemente na superfície da semente, que fornecem proteção contra patógenos originários da superfície da semente e que fornecem algum nível de controle de patógenos originários do solo. Exemplos não limitantes de fungicidas protetores incluem captan, maneb, Tiram ou fludioxonil.

[00226] Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um fungicida sistêmico, que pode ser absorvido na muda emergente e inibir ou matar o fungo dentro de tecidos da planta hospedeira. Fungicidas sistêmicos usados para tratamento de semente incluem, sem limitação, os seguintes: azoxistrobina, carboxina, mefenoxam, metalaxil, tiabendazol, trifloxistrobina, e vários fungicidas de triazol, incluindo difenoconazol, ipconazol, tebuconazol e triticonazol. Mefenoxam e metalaxil são usados primariamente para visar os fungos de bolor de água Pythium e Phytophthora. Alguns fungicidas são preferidos em relação a outros, dependendo da espécie de planta, por causa das diferenças sutis na sensibilidade da espécie fúngica patogênica, ou por causa das diferenças na distribuição ou sensibilidade das plantas ao fungicida. Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um agente de controle biológico, por exemplo, uma bactéria ou um fungo. Esses organismos podem ser parasíticos para os fungos patogênicos, ou secretam toxinas ou outras substâncias que podem matar ou de algum outro modo evitar o crescimento de fungos. Qualquer tipo de fungicida, particularmente aqueles que são comumente usados em plantas, pode ser usado como um agente de controle em uma composição de semente.

[00227] Em alguns exemplos, a composição do revestimento de semente compreende um agente de controle que possui propriedades antibacterianas. Em uma modalidade, o agente de controle com propriedades antibacterianas é selecionado dos compostos descritos nesse relatório descritivo em outra seção. Em outra modalidade, o composto é estreptomicina, oxitetraciclina, ácido oxolínico ou gentamicina. Outros exemplos de compostos antibacterianos que podem ser usados como parte de uma composição do revestimento de semente incluem aqueles baseados em diclorofeno e álcool benzílico hemi formal (Proxel® de ICI ou Acticide® RS de Thor Chemie e Kathon® MK 25 de Rohm & Haas) e derivados de isotiazolinona como, por exemplo, alquilisotiazolinonas e benzisotiazolinonas (Acticide® MBS de Thor Chemie).

[00228] Em alguns exemplos, o regulador do crescimento é selecionado do grupo que consiste em: ácido abscísico, amidoclor, ancimidol, 6-benzilaminopurina, brassinolida, butralina, clormequat (cloreto de clormequat), cloreto de colina, ciclanilida, daminozida, Dikegulac, dimetipin, 2,6-dimetilpuridina, Etefon, flumetralin, flurprimidol, flutiacet, forclorfenuron, ácido giberélico, inabenfida, ácido indol-3-acético, hidrazida maléica, mefluidida, mepiquat (cloreto de mepiquat), ácido naftalenoacético, N-6-benziladenina, paclobutrazol, prohexadiona fosforotritioato, ácido 2,3,5-tri- iodobenzóico, trinexapac-etil e uniconazol. Exemplos não limitantes adicionais de reguladores do crescimento incluem brassinosteróides, citocininas (por exemplo, cinetina e zeatina), auxinas (por exemplo, ácido indolilacético e indolilacetil aspartato), flavonóides e isoflavonóides (por exemplo, formononetina e diosmetina), fitoalexinas (por exemplo, gliceolina) e oligossacarídeos indutores de fitoalexina (por exemplo, pectina, quitina, quitosana, ácido poligalacurônico e ácido oligogalacturônico) e giberelinas. Esses agentes são idealmente compatíveis com a semente ou muda agrícola sobre a qual a formulação é aplicada (por exemplo, ele não deve ser deletério para o crescimento ou para a saúde da planta). Além disso, o agente é idealmente um que não causa preocupações de segurança para uso humano, animal ou industrial (por exemplo, nenhuma questão de segurança, ou o composto é suficientemente lábil que o produto de planta comercial derivado da planta contém quantidades desprezíveis do composto).

[00229] Alguns exemplos de agentes de biocontrole antagonísticos de nematódeos incluem ARF18; 30 Arthrobotrys spp.; Chaetomium spp.; Cylindrocarpon spp.; Exophilia spp.; Fusarium spp.; Gliocladium spp.; Hirsutella spp.; Lecanicillium spp.; Monacrosporium spp.; Myrothecium spp.; Neocosmospora spp.; Paecilomyces spp.; Pochonia spp.; Stagonospora spp.; fungos microrrízicos vesiculares- arbusculares, Burkholderia spp.; Pasteuria spp., Brevibacillus spp.; Pseudomonas spp.; e rizobactérias. Agentes de biocontrole antagonísticos de nematódeos particularmente preferidos incluem ARF18, Arthrobotrys oligospora, Arthrobotrys dactyloides, Chaetomium globosum, Cylindrocarpon heteronema, Exophilia jeanselmei, Exophilia pisciphila, Fusarium aspergilus, Fusarium solani, Gliocladium catenulatum, Gliocladium roseum, Gliocladium vixens, Hirsutella rhossiliensis, Hirsutella minnesotensis, Lecanicillium lecanii, Monacrosporium drechsleri, Monacrosporium gephyropagum, Myrothecium verrucaria, Neocosmospora vasinfecta, Paecilomyces lilacinus, Pochonia chlamydosporia, Stagonospora heteroderae, Stagonospora phaseoli, fungos microrrízicos vesiculares-arbusculares, Burkholderia cepacia, Pasteuria penetrans, Pasteuria thornei, Pasteuria nishizawae, Pasteuria ramosa, Pastrueia usage, Brevibacillus laterosporus cepa G4, Pseudomonas fluorescens e rizobactérias.

[00230] Alguns exemplos de nutrientes podem ser selecionados do grupo que consiste em um fertilizante de nitrogênio incluindo, sem limitação, ureia, nitrato de amônio, sulfato de amônio, soluções de nitrogênio sem pressão, amônia Aqua, amônia anidra, tiossulfato de amônio, ureia revestida com enxofre, ureia-formaldeídos, IBDU, ureia revestida com polímero, nitrato de cálcio, Ureaform e metileno-ureia, fertilizantes de fósforo como, por exemplo, fosfato de diamônio, fosfato de monoamônio, polifosfato de amônio, superfosfato concentrado e superfosfato Triplo, e fertilizantes de potássio como, por exemplo, cloreto de potássio, sulfato de potássio, sulfato de potássio-magnésio, nitrato de potássio. Essas composições podem existir como sais ou íons livres dentro da composição de revestimento de semente. Alternativamente, nutrientes/fertilizantes podem ser complexados ou quelados para fornecer liberação sustentada ao longo do tempo.

[00231] Alguns exemplos de rodenticidas podem ser selecionados do grupo de substâncias que consiste em 2- isovalerilindan- 1,3-diona, 4-(quinoxalin-2-ilamino) benzenossulfonamida, alfa-cloroidrina, fosfeto de alumínio, antu, óxido arsenioso, carbonato de bário, Nisthiosemi, brodifacoum, bromadiolona, brometalina, cianeto de cálcio, cloralose, clorofacinona, colecalciferol, coumaclor, coumafuril, coumatetralil, crimidina, difenacoum, difetialona, difacinona, ergocalciferol, flocoumafen, fluoracetamida, flupropadina, cloridrato de flupropadina, cianeto de hidrogênio, iodometano, lindano, fosfeto de magnésio, brometo de metila, norbormida, fosacetim, fosfino, fósforo, pindona, arsenito de potássio, pirinuron, Scilliroside, arsenito de sódio, cianeto de sódio, fluoracetato de sódio, estricnina, sulfato de tálio,

warfarin e fosfeto de zinco.

[00232] Na forma líquida, por exemplo, soluções ou suspensões, as populações bacterianas podem ser misturadas ou suspensas em água ou em soluções aquosas. Diluentes ou carreadores líquidos adequados incluem água, soluções aquosas, destilados de petróleo, ou outros carreadores líquidos.

[00233] Composições sólidas podem ser preparadas por dispersão das populações bacterianas em e sobre um carreador sólido adequadamente dividido, por exemplo, turfa, trigo, farelo, vermiculita, argila, talco, bentonita, terra diatomácea, terra de Fuller, solo pasteurizado e semelhantes. Quando essas formulações são usadas como pós molháveis, agentes dispersantes biologicamente compatíveis como, por exemplo, agentes dispersantes e emulsificantes não iônicos, aniônicos, anfotéricos ou catiônicos, podem ser usados.

[00234] Os carreadores sólidos usados mediante formulação incluem, por exemplo, carreadores minerais como, por exemplo, argila de caulim, pirofilita, bentonita, montmorilonita, terra diatomácea, solo branco ácido, vermiculita e perlita, e sais inorgânicos como, por exemplo, sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, ureia, cloreto de amônio e carbonato de cálcio. Além disso, pós orgânicos finos como, por exemplo, farinha de trigo, farelo de trigo e farelo de arroz, podem ser usados. Os carreadores líquidos incluem óleos vegetais como, por exemplo, óleo de soja e óleo de semente de algodão, glicerol, etileno glicol, polietileno glicol, propileno glicol, polipropileno glicol etc.

Pragas

[00235] As composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo, são, algumas vezes, combinadas com um ou mais pesticidas.

[00236] Os pesticidas que são combinados com os micróbios da revelação podem visar qualquer uma das pragas mencionadas abaixo.

[00237] O termo “praga” inclui, sem limitação, insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos e semelhantes. Pragas de insetos incluem insetos selecionados das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera Ortóptero, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera etc., particularmente Lepidoptera e Coleoptera.

[00238] Aqueles versados na técnica reconhecerão que nem todos os compostos são igualmente eficazes contra todas as pragas. Compostos que podem ser combinados com micróbios da revelação podem exibir atividade contra pragas de inseto, que podem incluir pragas agronômicas economicamente importantes, de floresta, estufa, viveiros de plantas ornamentais, alimentos e fibras, saúde pública e animal, de estrutura domesticas e comercial, de produtos domésticos e armazenados.

[00239] Como mencionado anteriormente, as composições agrícolas da revelação (que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo) são, em modalidades, combinadas com um ou mais pesticidas. Esses pesticidas podem ser ativos contra qualquer uma das seguintes pragas:

Larvae da ordem Lepidoptera incluem, sem limitação, lagartas-do-cartucho, lagartas-rosca, lagartas falsas- medideiras e heliothines na família Noctuidae Spodoptera frugiperda J E Smith (lagarta-do-cartucho); S. exigua Hubner (lagarta-do-cartucho da beterraba); S. litura Fabricius (lagarta-rosca do tabaco, lagarta cluster); Mamestra configurata Walker (lagarta-do-cartucho bertha); M. brassicae Linnaeus (traça do repolho); Agrotis ipsilon Hufnagel (lagarta-rosca); A. orthogonia Morrison (lagarta- rosca ocidental); A. subterranea Fabricius (lagarta-rosca granulada); Alabama argillacea Hubner (verme da folha do algodão); Trichoplusia ni Hubner (lagarta falsa-medideira do repolho); Pseudoplusia includens Walker (lagarta falsa- medideira da soja); Anticarsia gemmatalis Hubner (lagarta- da-soja); Hypena scabra Fabricius (verme do trevo verde); Heliothis virescens Fabricius (lagarta-das-maçãs do tabaco); Pseudaletia unipuncta Haworth (lagarta-do-cartucho); Athetis mindara Barnes e Mcdunnough (lagarta-rosca de pele áspera); Euxoa messoria Harris (lagarta-rosca darksided); Earias insulana Boisduval (lagarta-rosada espinhosa); E. vittella Fabricius (lagarta-rosada mosqueada); Helicoverpa armigera Hubner (lagarta-rosada americana); H. zea Boddie (lagarta da espiga ou lagarta-rosada do algodão); Melanchra picta Harris (lagarta-zebra); Egira (Xylomyges) curialis Grote (lagarta- rosca dos cítricos); brocas, traças, webworms, coneworms e esqueleletizador da família Piralidae Ostrinia nubilalis Hubner (broca européia do milho); Amyelois transitella Walker (larva laranja naval); Anagasta kuehniella Zeller (traça da farinha do Mediterrâneo); Cadra cautella Walker (traça da amêndoa); Chilo suppressalis Walker (broca do colmo do arroz); C. partellus, (sorgo broca); Corcyra cephalonica Stainton (traça do arroz); Crambus caliginosellus Clemens (webworm da raiz do milho); C. teterrellus Zincken (webworm cabelo-de-cão); Cnaphalocrocis medinalis Guenee (enrolador de folha do arroz); Desmia funeralis Hubner (leaffolder da uva); Diaphania hyalinata Linnaeus (verme do melão); D. nitidalis Stoll (broca-da-haste); Diatraea grandiosella Dyar (broca do milho do sudeste), D. saccharalis Fabricius (broca da cana de açúcar); Eoreuma loftini Dyar (broca do arroz mexicana); Ephestia elutella Hubner (traça do tabaco (cacau)); Galleria mellonella Linnaeus (traça grande da cera); Herpetogramma licarsisalis Walker (sod webworm); Homoeosoma electellum Hulst (traça do girassol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (broca do menor talo de milho); Achroia grisella Fabricius (traça lesser wax); Loxostege sticticalis Linnaeus (webworm da beterraba); Orthaga thyrisalis Walker (traça tea tree web); Maruca testulalis Geyer (broca do feijão-de-vagem); Plodia interpunctella Hubner (traça Indian meal); Scirpophaga incertulas Walker (broca yellow stem); Udea rubigalis Guenee (leaftier do salsão); e lagartas-enroladeiras, lagartas-das- maçãs, vermes de sementes e vermes de frutas na família Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (lagarta-das-maçãs Western blackheaded); A. variana Fernald (lagarta-das-maçãs Eastern blackheaded); Archips argyrospila Walker (lagarta- enroladeira das árvores frutíferas); A. rosana Linnaeus (lagarta-enroladeira européia); e outras espécies de Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rosslerstamm (traça tortrix summer fruit); Cochylis hospes Walsingham (traça do girassol em faixas(“banded”)); Cydia latiferreana Walsingham

(filbertworm); C. pomonella Linnaeus (traça colding); Platynota flavedana Clemens (lagarta-enroladeira variegada); P. stultana Walsingham (lagarta-enroladeira omnívora); Lobesia botrana Denis & Schiffermuller (traça da parreira européia); Spilonota ocellana Denis & Schiffermuller (traça eyespotted bud); Endopiza viteana Clemens (traça da baga da uva); Eupoecilia ambiguella Hubner (traça da videira); Bonagota salubricola Meyrick (lagarta-enroladeira brasileira das maçãs); Grapholita molesta Busck (traça oriental da fruta); Suleima helianthana Riley (traça do broto de girassol); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp.

[00240] Outras pragas agronômicas selecionadas na ordem Lepidoptera incluem, sem limitação, Alsophila pometaria Harris (fall cankerworm); Anarsia lineatella Zeller (broca do galho de pêssego); Anisota senatoria J. E. Smith (orange striped oakworm); Antheraea pernyi Guerin- Meneville (Chinese Oak Tussah Moth); Bombyx mori Linnaeus (bicho-da-seda); Bucculatrix thurberiella Busck (perfurador da folha do algodão); Colias eurytheme Boisduval (lagarta da alfafa); Datana integerrima Grote & Robinson (lagarta da noz); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (traça da seda siberiana), Ennomos subsignaria Hubner (elm spanworm); Erannis tiliaria Harris (lagarta falsa-medideira da tília); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (traça browntail); Harrisina americana Guerin-Meneville (skeletonizer da folha de uva); Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta range); Hyphantria cunea Drury (fall webworm); Keiferia lycopersicella Walsingham (oxiúro do tomate); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (lagarta falsa-medideira Eastern hemlock); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (lagarta falsa-medideira Western hemlock);

Leucoma salicis Linnaeus (traça do cetim); Lymantria dispar Linnaeus (traça cigana); Manduca quinquemaculata Haworth (traça five spotted hawk, hornworm do tomate); M. sexta Haworth (homworm do tomate, homworm do tabaco); Operophtera brumata Linnaeus (traça de inverno); Paleacrita vernata Peck (spring cankerworm); Papilio cresphontes Cramer (giant swallowtail orange dog); Phryganidia californica Packard (California oakworm); Phyllocnistis citrella Stainton (minador-dos-citros); Phyllonorycter blancardella Fabricius (minador spotted tentiform); Pieris brassicae Linnaeus (borboleta branca grande); P. rapae Linnaeus (borboleta branca pequena); P. napi Linnaeus (borboleta branca de veios verdes); Platyptilia carduidactyla Riley (traça da alcachofra); Plutella xylostella Linnaeus (traça diamondback); Pectinophora gossypiella Saunders (lagarta- rosada rosa); Pontia protodice Boisduval e Leconte (Southern cabaggeworm); Sabulodes aegrotata Guenee (lagarta falsa- medideira omnívora); Schizura concinna J. E. Smith (lagarta red humped); Sitotroga cerealella Olivier (traça do grão Angoumois); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (lagarta pine processionary); Tineola bisselliella Hummel (traça de roupas teladas); Tuta absoluta Meyrick (minador do tomate); Yponomeuta padella Linnaeus (traça do arminho); Heliothis subflexa Guenee; Malacosoma spp. e Orgyia spp., Ostrinia nubilalis (broca européia do milho); verme da semente do milho; Agrotis ipsilon (lagarta-rosca).

[00241] Larvas e adultos da ordem Coleoptera incluindo curculionídeos-das-raízes das famílias Anthribidae, Bruchidae e Curculionidae (incluindo, sem limitação: Anthonomus grandis Boheman (curculionídeo-das-

raízes boll); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (curculionídeo-das-raízes da água do arroz); Sitophilus granarius Linnaeus (curculionídeo-das-raízes do celeiro); S. oryzae Linnaeus (curculionídeo-das-raízes do arroz); Hypera punctata Fabricius (curculionídeo-das-raízes da folha de trevo); Cylindrocopturus adspersus LeConte (curculionídeo- das-raízes do caule de girassol); Smicronyx fulvus LeConte (curculionídeo-das-raízes da semente de girassol vermelho); S. sordidus LeConte (curculionídeo-das-raízes da semente de girassol cinza); Sphenophorus maidis Chittenden (bicudo do milho)); besouros-pulga, besouros do pepino, larvas- alfinete, besouros da folha, besouros e minadores da batata na família Chrysomelidae (incluindo, sem limitação: Leptinotarsa decemlineata Say (besouro da batata do Colorado); Diabrotica virgifera virgifera LeConte (vaquinha ocidental); D. barberi Smith e Lawrence (vaquinha do norte); D. undecimpunctata howardi Barber (vaquinha do sul); Chaetocnema pulicaria Melsheimer (besouro-pulga do milho); Phyllotreta cruciferae Goeze (besouro-pulga das crucíferas); Phyllotreta striolata (besouro-pulga stripped); Colaspis brunnea Fabricius (grape colaspis); Oulema melanopus Linnaeus (besouro da folha de cereal); Zygograma exclamationis Fabricius (besouro do girassol)); besouros da família Coccinellidae (incluindo, sem limitação: Epilachna varivestis Mulsant (besouro do feijão mexicano)); chafers e outros besouros da família Scarabaeidae (incluindo, sem limitação: Popillia japonica Newman (besouro japonês); Ciclocephala borealis Arrow (besouro mascarado do norte(” northern masked chafer”), larva branca); C. immaculata Olivier (besouro mascarado do sul, larva branca);

Rhizotrogus majalis Razoumowsky (Besouro Europeu); Phyllophaga crinita Burmeister (larva branca); Ligyrus gibbosus De Geer (besouro da cenoura)); besouros carpet da família Dermestidae; wireworms da família Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; besouros bark da família Scolytidae e besouros da família Tenebrionidae; Cerotoma trifurcate (besouro da folha do feijão); e wireworm.

[00242] Adultos e imaturos da ordem da ordem Diptera, incluindo minadores Agromyza parvicornis Loew (minador das folhas do milho); mosquitos (incluindo, sem limitação: Contarinia sorghicola Coquillett (mosquito do sorgo); Mayetiola destructor Say (Mosca de hessian); Sitodiplosis mosellana Gehin (mosquito do trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosquito da semente de girassol)); moscas da fruta (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas da fruta); vermes (incluindo, sem limitação: Delia platura Meigen (verme da semente do milho); D. coarctata Fallen (mosca do bulbo do trigo) e outras Delia spp., Meromyza americana Fitch (verme da haste do trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas domésticas); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas domésticas menores); Stomoxis calcitrans Linnaeus (moscas estáveis)); moscas da face, moscas do chifre, moscas do sopro, Chrysomya spp.; Phormia spp. e outras pragas de mosca muscóide, moscas do cavalo Tabanus spp.; moscas bot Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; larvas de gado Hypoderma spp.; moscas do veado Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (keds) e outras Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; moscas pretas Prosimulium spp.; Simulium spp.; mosquitos mordedores, moscas da areia, ciáridos, e outros Nematocera.

[00243] Adultos e ninfas das ordens Hemiptera e Homoptera como, por exemplo,, sem limitação, adelgids da família Adelgidae, insetos de planta da família Miridae, cicadas da família Cicadidae, cigarrinhas, Empoasca spp.; da família Cicadellidae, planthoppers das famílias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae e Delphacidae, treehoppers da família Membracidae, psyllids da família Psyllidae, moscas brancas da família Aleyrodidae, afídeos da família Aphididae, phylloxera da família Phylloxeridae, cochonilhas- farinhentas da família Pseudococcidae, cochonilhas das famílias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae Ortheziidae, Phoenicococcidae e Margarodidae, percevejos-de-renda da família Tingidae, percevejos pentatomídeos da família Pentatomidae, percevejos-das-gramíneas, Blissus spp.; e outros insetos de sementes da família Lygaeidae, cigarrinhas-das-pastagens da família Cercopidae insetos do squash da família Coreidae e red bugs e manchadores do algodão da família Pyrrhocoridae.

[00244] Membros agronomicamente importantes da ordem Homoptera ainda incluem, sem limitação: Acyrthisiphon pisum Harris (afídeo da ervilha); Aphis craccivora Koch (afídeo do feijão-fradinho); A. fabae Scopoli (afídeo do feijão-preto); A. gossypii Glover (afídeo do algodão, afídeo do melão); A. maidiradicis Forbes (afídeo da raiz do milho); A. pomi De Geer (afídeo da maçã); A. spiraecola Patch (afídeo da espiréia); Aulacorthum solani Kaltenbach (afídeo da dedaleira); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (afídeo do morango); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (afídeo do trigo russo); Dysaphis plantaginea Paaserini (afídeo da mação rosada); Eriosoma lanigerum Hausmann (afídeo da maçã lanosa); Brevicoryne brassicae Linnaeus (afídeo do repolho); Hyalopterus pruni Geoffroy (afídeo da ameixa farinhenta); Lipaphis erysimi Kaltenbach (afídeo do nabo); Metopolophium dirrhodum Walker (afídeo do cereal); Macrosiphum euphorbiae Thomas (afídeo da batata); Myzus persicae Sulzer (afídeo da batata-pêssego, afídeo do pêssego verde); Nasonovia ribisnigri Mosley (afídeo da alface); Pemphigus spp. (afídeos da raiz e afídeos da galha); Rhopalosiphum maidis Fitch (afídeo da folha de milho); R. padi Linnaeus (afídeo da aveia-cereja); Schizaphis graminum Rondani (percevejo); Sipha flava Forbes (afídeo amarelo da cana de açúcar); Sitobion avenae Fabricius (afídeo de grão inglês); Therioaphis maculata Buckton (afídeo mosqueado da alfafa); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (afídeo preto dos cítricos) e T. citricida Kirkaldy (afídeo marrom dos cítricos); Melanaphis sacchari (afídeo da cana de açúcar); Adelges spp. (adelgids); Phylloxera devastatrix Pergande (phylloxera da noz-pecã); Bemisia tabaci Gennadius (mosca branca do tabaco, mosca branca da batata doce); B. argentifolii Bellows & Perring (mosca branca silverleaf); Dialeurodes citri Ashmead (mosca branca dos cítricos); Trialeurodes abutiloneus (mosca branca bandedwinged) e T. vaporariorum Westwood (mosca branca da estufa); Empoasca fabae Harris (cigarrinha da batata); Laodelphax striatellus Fallen (smaller brown planthopper); Macrolestes quadrilineatus Forbes (cigarrinha de áster); Nephotettix cinticeps Uhler (cigarrinha verde); N. nigropictus Stal (cigarrinha do arroz); Nilaparvata lugens Stal (planthopper marrom); Peregrinus maidis Ashmead (planthopper do milho);

Sogatella furcifera Horvath (white backed planthopper); Sogatodes orizicola Muir (delfacídeo do arroz); Typhlocyba pomaria McAtee (cigarrinha da maçã branca); Erythroneoura spp. (cigarrinhas da uva); Magicicada septendecim Linnaeus (periodical cicada); Icerya purchasi Maskell (cochonilha cottony cushion); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (cochonilha de San Jose); Planococcus citri Risso (cochonilha-farinhenta dos cítricos); Pseudococcus spp. (outro complexo de cochonilha-farinhenta); Cacopsylla pyricola Foerster (psylla da pêra); Trioza diospyri Ashmead (psylla do caqui).

[00245] Espécies da ordem Hemiptera incluem, sem limitação: Acrosternum hilare Say (percevejo pentatomídeo verde); Anasa tristis De Geer (bug do squash); Blissus leucopterus leucopterus Say (chinch bug); Corythuca gossypii Fabricius (percevejo-de-renda do algodão); Cyrtopeltis modesta Distant (bug do tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schaffer (manchador do algodão); Euschistus servus Say (percevejo pentatomídeo marrom); E. variolarius Palisot de Beauvais (um percevejo pentatomídeo mosqueado); Graptostethus spp. (complexo de insetos de sementes); Leptoglossus corculus Say (inseto de sementes leaf footed pine); Lygus lineolaris Palisot de Beauvais (inseto de planta manchado); L. Hesperus Knight (inseto de planta manchado ocidental); L. pratensis Linnaeus (common meadow bug); L. rugulipennis Poppius (inseto de planta manchado europeu); Lygocoris pabulinus Linnaeus (capsídeo verde comum); Nezara viridula Linnaeus (percevejo pentatomídeo verde do sul); Oebalus pugnax Fabricius (percevejo pentatomídeo do arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (large milkweed bug);

Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão).

[00246] Hemiptera como, por exemplo, Calocoris norvegicus Gmelin (insetos do morango); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (capsídeo da maçã); Cyrtopeltis modestus Distant (inseto do tomate); Cyrtopeltis notatus Distant (suckfly); Spanagonicus albofasciatus Reuter (whitemarked fleahopper); Diaphnocoris clorionis Say (inseto de planta de honeylocust); Labopidicola allii Knight (inseto de planta da cebola); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (fleahopper do algodão); Adelphocoris rapidus Say (inseto de planta rápido); Poecilocapsus lineatus Fabricius (inseto de planta four lined); Nysius ericae Schilling (false chinch bug); Nysius raphanus Howard (false chinch bug); Nezara viridula Linnaeus (percevejo pentatomídeo verde do sul); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. e Cimicidae spp.

[00247] Adultos e larvas da ordem Acari (ácaros) como, por exemplo, Aceria tosichella Keifer (ácaro ondulado do trigo); Petrobia latens Muller (ácaro marrom do trigo); ácaros de aranha e ácaros vermelhos na família Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro vermelho europeu); Tetranychus urticae Koch (ácaro-aranha mosqueado); (T. mcdanieli McGregor (ácaro de McDaniel); T. cinnabarinus Boisduval (ácaro-aranha carmim); T. turkestani Ugarov & Nikolski (ácaro-aranha do morango); ácaros planos na família Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano dos cítricos); ácaros rust and bud na família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e ácaros importantes na saúde humana e animal, ou seja, ácaros da poeira na família Epidermoptidae, ácaros do folículo na família Demodicidae,

ácaros de grãos na família Glycyphagidae, carrapatos na ordem Ixodidae. Ixodes scapularis Say (carrapato do veado); I. holocyclus Neumann (carrapato da paralisia australiana); Dermacentor variabilis Say (carrapato do cão americano); Amblyomma americanum Linnaeus (carrapato lone star) e ácaros scab and itch nas famílias Psoroptidae, Pyemotidae e Sarcoptidae.

[00248] Pragas de inseto da ordem Thysanura são de interesse, por exemplo, Lepisma saccharina Linnaeus (silverfish); Thermobia domestica Packard (firebrat).

[00249] Pragas de artrópodes adicionais cobertas incluem: aranhas na ordem Araneae como, por exemplo, Loxosceles reclusa Gertsch e Mulaik (aranha reclusa marrom) e os Latrodectus mactans Fabricius (aranha viúva-negra) e centopéias na ordem Scutigeromorfa como, por exemplo, Scutigera coleoptrata Linnaeus (centopéia doméstica).

[00250] Superfamília de percevejos pentatomídeos e outros insetos relacionados incluindo, sem limitação, espécies que pertencem à família Pentatomidae (Nezara viridula, Halyomorfa halys, Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hilare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus, Acrosternum hilare, Dichelops furcatus, Dichelops melacanthus, e Bagrada hilaris (Bagrada Bug)), à família Plataspidae (Megacopta cribraria-Bean plataspid) e à família Cydnidae (Scaptocoris castanea-percevejo pentatomídeo da raiz) e espécies de Lepidoptera incluindo, sem limitação: traça diamondback, por exemplo, Helicoverpa zea Boddie; lagarta falsa-medideira da soja, por exemplo, Pseudoplusia includens Walker e lagarta-da-soja por exemplo, Anticarsia gemmatalis Hubner.

[00251] Nematódeos incluem nematóides parasíticos como, por exemplo, nematóide das galhas, nematóides de cisto e lesão, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp. e Globodera spp.; particularmente membros dos nematóides de cisto incluindo, sem limitação, Heterodera glycines (nematóide de cisto da soja); Heterodera schachtii (nematóide de cisto da beterraba); Heterodera avenae (nematóide de cisto do cereal) e Globodera rostociensis e Globodera pailida (nematóides de cisto da batata). Nematóides de lesão incluem Pratylenchus spp. Composições Pesticidas que Compreendem um Pesticida e Micróbio da Revelação

[00252] Como mencionado anteriormente, composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo, são, algumas vezes, combinadas com um ou mais pesticidas. Pesticidas podem incluir herbicidas, inseticidas, fungicidas, nematicidas etc.

[00253] Em algumas modalidades as combinações pesticidas/microbianas podem ser aplicadas na forma de composições e podem ser aplicadas à área de plantio ou à planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos podem ser fertilizantes, exterminadores de ervas daninhas, crioprotetores, tensoativos, detergentes, sabonetes pesticidas, óleos dormentes, polímeros, e/ou formulações carreadoras temporizadas ou biodegradáveis que permitem a dosagem de longo prazo de uma área-alvo após uma aplicação única da formulação. Eles também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas,

pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas ou misturas de várias dessas preparações, se desejado, junto com carreadores agronomicamente aceitáveis adicionais, tensoativos ou adjuvantes promotores da aplicação normalmente empregados na técnica de formulação. Carreadores adequados (ou seja, carreadores agronomicamente aceitáveis) e adjuvantes podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias habitualmente empregadas na tecnologia de formulação, por exemplo, natural ou substâncias minerais regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umidificantes, agentes colantes, taquificantes, aglutinantes ou fertilizantes. Da mesma forma as formulações podem ser preparadas em iscas comestíveis ou modeladas em armadilhas para pragas para permitir a alimentação ou ingestão por uma praga-alvo da formulação pesticida.

[00254] Composições químicas exemplares, que podem ser combinadas com os micróbios da revelação, incluem: herbicidas de frutas/vegetais: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzina, Simazina, Trifluralina, Fluazifop, Glufosinato, Halo sulfurom Gowan, Paraquat, Propizamida, Setoxidim, Butafenacil, Halossulfurom, Indaziflam; Inseticidas de frutas/vegetais: Aldicarb, Bacillus thuringiensis, Carbaril, Carbofurano, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Diazinon, Malation, Abamectina, Ciflutrina/betaciflutrina, Esfenvalerato, Lambda-cialotrina, Acequinocil, Bifenazato, Metoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefurano, FluaCripirim, Tolfenpirad, Clotianidin, Espirodiclofeno, Gama-cialotrina, Espiromesifeno, Spinosad, Rinaxipir, Ciazipir, Spinetoram, Triflumuron, Espirotetramat,

Imidacloprida, Flubendiamida, Tiodicarbe, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofeno, Cianopirafeno, Imidacloprida, Clotianidin, Tiametoxam, Spinetoram, Tiodicarbe, Flonicamid, Metiocarbe, Benzoato de emamectina, Indoxacarbe, Fostiazato, Fenamifos, Cadusafos, Piriproxifeno, Óxido de fembutatina, Hextiazox, Metomil, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-on; Fungicidas de Frutas/Vegetais: Carbendazim, Clorotalonil, EBDCs, Enxofre, Tiofanato-metil, Azoxistrobina, Cimoxanil, Fluazinam, Fosetil, Iprodiona, Cresoxim-metil, Metalaxil/mefenoxam, Trifloxistrobina, Etaboxam, Iprovalicarbe, Trifloxistrobina, Fenhexamid, Oxpoconazol fumarato, Ciazofamid, Fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Ciflufenamid, Boscalid; herbicidas de cereais: Isoproturon, Bromoxinil, Ioxinil, Fenóxis, Clorsulfurom, Clodinafop, Diclofop, Diflufenican, Fenoxaprop, Florasulam, Fluorxipir, Metsulfurom, Triassulfurom, Flucarbazona, Iodossulfurom, Propoxicarbazona, Picolinafen, Mesossulfurom, Beflubutamid, Pinoxaden, Amidossulfurom, Tifensulfurom Metil, Tribenuron, Flupirsulfurom, Sulfossulfurom, Pirassulfotol, Piroxsulam, Flufenacet, Tralcoxidim, Piroxassulfon; Fungicidas de cereais: Carbendazim, Clorotalonil, Azoxistrobina, Ciproconazol, Ciprodinil, Fenpropimorf, Epoxiconazol, Cresoxim-metil, Quinoxifeno, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Simeconazol, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Dimoxistrobina, Protioconazol, Fluoxastrobina; Inseticidas de cereais: Dimetoato, Lambda-cialotrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, β-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprida, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid,

Dinetofurano, Clorpirifos, Metamidofos, Oxidemeton metil, Pirimicarbe, Metiocarbe; Herbicidas de milho: Atrazina, Alaclor, Bromoxinil, Acetoclor, Dicamba, Clopiralid, S- Dimetenamid, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, S- Metolaclor, Mesotriona, Nicossulfurom, Primissulfurom, Rimsulfurom, Sulcotriona, Foramsulfurom, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxassulfona; Inseticidas de milho: Carbofurano, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprida, Lambda- Cialotrina, Teflutrina, Terbufos, Tiametoxam, Clotianidin, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarbe, β-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenuron, Triflumuron, Teflutrina, Tebupirinfos, Etiprol, Ciazipir, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurano, Avermectina, Metiocarbe, Espirodiclofeno, Espirotetramat; Fungicidas de milho: Fenitropan, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobina; herbicidas de arroz: Butaclor, Propanil, Azinsulfurom, Bensulfurom, Cialofop, Daimuron, Fentrazamida, Imazossulfurom, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazossulfurom, Piributicarbe, Quinclorac, Tiobencarbe, Indanofan, Flufenacet, Fentrazamida, Halossulfurom, Oxaziclomefona, Benzobiciclom, Piriftalid, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxissulfurom, Pretilaclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimissulfan; Inseticidas de arroz: Diazinon, Fenitrotion, Fenobucarbe, Monocrotofos, Benfuracarbe, Buprofezina, Dinotefurano, Fipronil, Imidacloprida, Isoprocarbe, Tiacloprid, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefurano, Clotianidin, Etiprol, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina,

Acetamiprid, Tiametoxam, Ciazipir, Spinosad, Spinetoram, Emamectina-Benzoato, Cipermetrina, Clorpirifos, Cartap, Metamidofos, Etofenprox, Triazofos, 4-[[(6-Clorpiridin-3- il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, arbofurano, Benfuracarb; Fungicidas de arroz: Tiofanato-metil, Azoxistrobina, Carpropamid, Edifenfos, Ferinzona, Iprobenfos, Isoprotiolano, Pencicuron, Probenazol, Piroquilon, Triciclazol, Trifloxistrobina, Diclocimet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil; herbicidas de algodão: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrin, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butil, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Piritiobac-sódio, Trifloxissulfurom, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazin, Tidiazuron; Inseticidas de algodão: Acefato, Aldicarbe, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Malation, Monocrotofos, Abamectina, Acetamiprid, Emamectina Benzoato, Imidacloprida, Indoxacarbe, Lambda-Cialotrina, Spinosad, Tiodicarbe, Gama- Cialotrina, Espiromesifeno, Piridalil, Flonicamid, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Beta-Ciflutrina, Espirotetramat, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Spinosad, Spinetoram, gama Cialotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il) metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Tiodicarbe, Avermectina, Flonicamid, Piridalil, Espiromesifeno, Sulfoxaflor, Profenofos, Triazofos, Endossulfan; Fungicidas de algodão: Etridiazol, Metalaxil, Quintozeno; herbicidas de soja: Alaclor, Bentazona, Trifluralin, Clorimuron-Etil, Cloransulam-Metil, Fenoxaprop, Fomesafen, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-

)Metolaclor, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Inseticidas de soja: Lambda-cialotrina, Metomil, Paration, Tiocarbe, Imidacloprida, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurano, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Spinosad, Spinetoram, Emamectina-Benzoato, Fipronil, Etiprol, Deltametrina, β- Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3- il)metil] (2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on Espirotetramat, Espirodiclofeno, Triflumuron, Flonicamid, Tiodicarbe, beta-Ciflutrina; Fungicidas de soja: Azoxistrobina, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Protioconazol, Tetraconazol; herbicidas de beterraba: Cloridazon, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedifam, Trialato, Clopiralid, Fluazifop, Lenacil, Metamitron, Quinmerac, Cicloxidim, Triflusulfurom, Tepraloxidim, Quizalofop; inseticidas de beterraba: Imidacloprida, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurano, Deltametrina, β-Ciflutrina, gama/lambda Cialotrina, 4-[[(6- Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)- on, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxyiir, Fipronil, Carbofurano; herbicidas de canola: Clopiralid, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Metazaclor, Trifluralin Etametsulfurom, Quinmerac, Quizalofop, Cletodim, Tepraloxidim; Canola Fungicidas: Azoxistrobina, Carbendazim, Fludioxonil, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolina; Canola Inseticidas: Carbofurano organofosfatos, Piretróides, Tiacloprid, Deltametrina, Imidacloprida, Clotianidin, Tiametoxam, Acetamiprid, Dinetofurano, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, tau-Fluvaleriato, Etiprol, Spinosad, Spinetoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6- Clorpiridin-3-il)metil] (2,2-difluoretil)amino] furan- 2(5H)-on. Composições Inseticidas que Compreendem um Inseticida e Micróbio da Revelação

[00255] Como mencionado anteriormente, as composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo, são, algumas vezes, combinadas com um ou mais inseticidas.

[00256] Em algumas modalidades, composições inseticidas podem ser incluídas nas composições apresentadas nesse relatório descritivo, e podem ser aplicadas a uma planta (ou plantas) ou a uma parte (ou partes) desta simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Inseticidas incluem carbonato de amônio, silicato de potássio aquoso, ácido bórico, sulfato de cobre, enxofre elementar, calda sulfocálcica, ésteres de octanoato de sacarose, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2, 2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, abamectina, notenona, fenazaquina, fenpiroximato, piridabeno, pirimedifeno, tebufenpirad, tolfenpirad, acefato, benzoato de emamectina, lepimectina, milbemectina, hidropreno, quinopreno, metopreno, fenoxicarbe, piriproxifeno, brometo de metila e outros haletos de alquila, fluoreto de fulfurila, cloropicrina, bórax, octaborato dissódico, borato de sódio, sódio metaborato, tártaro emético, dazomet, metam, pimetrozina, pirifluquinazona, clofentezina, diflovidazina, hexitiazox, bifenazato, tiametoxam, imidacloprida, fenpiroximato, azadirachtin, permetrina, esfenvalerato,

acetamiprid, bifentrina, indoxacarbe, azadiractina, piretrina, imidacloprida, beta-ciflutrina, sulfotep, tebupirimfos, temefos, terbufos, tetraclorvinfos, tiometon, triazofos, alanicarbe, aldicarbe, bendiocarbe, benfuracarbe, butocarboxim, butoxicarboxim, carbaril, carbofurano, carbossulfan, etiofencarbe, fenobucarbe, formetanato, furatiocarbe, isoprocarbe, metiocarbe, metimil, metolcarbe, oxamil, primicarbe, propoxur, tiodicarbe, tiofanox, triazamato, trimetacarbe, XMC, xililcarbe, acefato, azametifos, azinfos-etil, azinfos-metil, cadusafos, cloretoxifox, triclorfon, vamidotion, clordano, endossulfano, etiprol, fipronil, acrinatrina, aletrina, bifentrina, bioaletrina, bioaletrina X-ciclopentenil, bioresmetrina, ciclorotrina, ciflutrina, cialotrina, cipermetrina, cifenotrina [(1R)-trans-isômeros], deltametrina, empentrina [(EZ)- (1R)- isômeros], esfenvalerato, etofenprox, fenpropatrina, fenvalerato, flucitrinato, flumetrina, halfenprox, cadatrina, fenotrina [(1R)-trans-isômero] praletrina, piretrinas (piretro), resmetrina, silafluofen, teflutrina, tetrametrina, tetrametrina [(1R)-isômeros], tralometrina, transflutrina, alfa-cipermetrina, beta-ciflutrina, beta-cipermetrina, d- cis-trans aletrina, d-trans aletrina, gama-cialotrina, lambda-cialotrina, tau-fluvalinato, teta-cipermetrina, zeta-cipermetrina, metoxiclor, nicotina, sulfoxaflor, acetamiprid, clotianidina, dinotefurano, imidacloprida, nitenpiram, tiacloprid, tiametoxano, tebuprinfos, beta- ciflutrina, clotianidina, flonicamid, hidrametilnon, amitraz, flubendiamida, blorantraniliprol, cialotrina lambda, spinosad, gama cialotrina, Beauveria bassiana,

extrato de oleorresina de cápsico, óleo gárlico, carbaril, clorpirifos, sulfoxaflor, cialotrina lambda, Clorfenvinfos, Clormefos, Clorpirifos, Clorpirifos-metil, Coumaphos, Cianofos, Demeton-S-metil, Diazinon, Diclorvos/ DDVP, Dicrotofos, Dimetoato, Dimetilvinfos, Dissulfoton, EPN, Etion, Etoprofos, Fanfur, Fenamifos, Fenitrotion, Fention, Fostiazato, Heptenofos, Imiciafos, Isofenfos, Isopropil O- (metoxiaminotio-fosforil) salicilato, Isoxation, Malation, Mecarbam, Metamidofos, Metidation, Mevinfos, Monocrotofos, Naled, Ometoato, Oxidemeton-metil, Paration, Paration-metil, Fentoato, Forato, Fosalona, Fosmet, Fosfamidon, Foxim, Pirimifos-metil, Profenofos, Propetanfos, Protiofos, Piraclofos, Piridafention, Quinalfosfluacripirim, tebufenozida, clorantraniliprol, Bacillus thuringiensis subs.

Kurstaki, terbufos, mineral óleo, fenpropatrina, metaldeído, deltametrina, diazinon, dimetoato, diflubenzuron, piriproxifeno, óleo de alecrim, óleo de hortelã, geraniol, azadiractina, piperonil butóxido, ciantraniliprol, alfa cipermetrina, teflutrina, pimetrozina, malation, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, dicofol, bromopropilato, benzoximato, azadiractina, flonicamid, óleo de soja, Chromobacterium subtsugae cepa PRAA4-1, zeta cipermetrina, fosmet, metoxifenozida, óleo parafínico, espirotetramat, metomil, Metarhizium anisopliae cepa F52, etoprop, tetradifon, propargita, óxido de fembutatina, azociclotina, cihexatina, diafentiuron, Bacillus sphaericus, etoxazol, flupiradifurona, azadiractina, Beauveria bassiana, ciflumetofeno, azadiractina, quinometionato, acefato, Isaria fumosorosea Apopka cepa 97, sódio tetra-borohidreto decahidrato,

benzoato de emamectina, criolita, spinetoram, extrato de Chenopodium ambrosioides, novaluron, dinotefurano, carbaril, acequinocil, flupiradifurona, fosfato de ferro, caulim, buprofezina, ciromazina, cromafenozida, halofenozida, metoxifenozida, tebufenozida, bistrifluron, clorfluazuron, diflubenzuron, flucicloxuron, flufenoxuron, hexaflumuron, lufenuron, nocaluron, noviflumuron, teflubenzuron, triflumuron, bensultap, cloridrato de cartap, tiociclam, tiosultap-sódio, DNOC, clorfenapir, sulfluramida, forato, tolfenpirad, sulfoxaflor, óleo de nim, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis cepa SA-10, ciromazina, Burkholderia spp. morta termicamente, ciantraniliprol, cienopirafeno, ciflumetofeno, cianeto de sódio, cianeto de potássio, cianeto de cálcio, fosfeto de alumínio, fosfeto de cálcio, fosfino, fosfeto de zinco, espirodiclofeno, espiromesifeno, espirotetramat, metaflumizona, flubendiamida, piflubumida, oxamil, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, etoxazol e esfenvalerato.

Tabela 9. Inseticidas exemplares associados com vários modos de ação, que podem ser combinados com os micróbios da revelação.

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas

Inibidores de Carbamatos Alanicarbe, Aldicarbe, Nervo e músculo acetilcolinesterase Bendiocarbe, (AChE) Benfuracarbe, Butocarboxim, Butoxicarboxim, Carbaril, Carbofurano, Carbossulfano, Etiofencarbe, Fenobucarbe, Formetanato, Furatiocarbe, Isoprocarbe, Metiocarbe, Metomil, Metolcarbe, Oxamil, Pirimicarbe, Propoxur, Tiodicarbe,

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas

Tiofanox, Triazamato, Trimetacarbe, XMC, Xililcarbe Inibidores de Organofosfatos Acefato, Azametifos, Nervo e músculo acetilcolinesterase Azinfos-etil, Azinfos- (AChE) metil, Cadusafos, Cloretoxifos, Clorfenvinfos, Clormefos, Clorpirifos, Clorpirifos- metil, Coumaphos, Cianofos, Demeton-S- metil, Diazinon, Diclorvos/ DDVP, Dicrotofos, Dimetoato, Dimetilvinfos, Dissulfoton, EPN, Etion,

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas

Etoprofos, Fanfur, Fenamifos, Fenitrotion, Fention, Fostiazato, Heptenofos, Imiciafos, Isofenfos, Isopropil O- (metoxiaminotio-fosforil) salicilato, Isoxation, Malation, Mecarbam, Metamidofos, Metidation, Mevinfos, Monocrotofos, Naled, Ometoato, Oxidemeton-metil, Paration, Paration-metil, Fentoato, Forato, Fosalona, Fosmet, Fosfamidon, Foxim,

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas

Pirimifos-metil, Profenofos, Propetanfos, Protiofos, Piraclofos, Piridafention, Quinalfos, Sulfotep, Tebupirimfos, Temefos, Terbufos, Tetraclorvinfos, Tiometon, Triazofos, Triclorfon, Vamidotion Bloqueadores do Organoclorados Clordano, Endossulfan Nervo e músculo canal de cloreto de ciclodieno controlado por GABA Bloqueadores do Fenilpirazóis Etiprol, Fipronil Nervo e músculo canal de cloreto (Fiproles) controlado por GABA Moduladores do canal Piretróides, Acrinatrina, Aletrina, Nervo e músculo

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas de sódio piretrinas Bifentrina, Bioaletrina, Bioaletrina S- ciclopentenil, Bioresmetrina, Cicloprotrina, Ciflutrina, Cialotrina, Cipermetrina, Cifenotrina [(1R)-trans- isômeros], Deltametrina, Empentrina [(EZ)- (1R)- isômeros], Esfenvalerato, Etofenprox, Fenpropatrina, Fenvalerato, Flucitrinato, Flumetrina, Halfenprox, Cadatrina,

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas

Fenotrina [(1R)-trans- isômero], Praletrina, Piretrinas (piretro), Resmetrina, Silafluofen, Teflutrina, Tetrametrina, Tetrametrina [(1R)- isômeros], Tralometrina, Transflutrina, alfa- Cipermetrina, beta- Ciflutrina, beta- Cipermetrina, d-cis-trans Aletrina, d-trans Aletrina, gama- Cialotrina, lambda- Cialotrina, tau- Fluvalinato, teta-

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas

Cipermetrina, zeta- Cipermetrina Moduladores do canal DDT, metoxiclor DDT, metoxiclor Nervo e músculo de sódio Moduladores neonicotinóides Acetamiprid, Clotianidin, Nervo e músculo competitivos do Dinotefurano, receptor nicotínico Imidacloprida, de acetilcolina Nitenpiram, Tiacloprid, (nAChR) Tiametoxam Moduladores nicotina nicotina Nervo e músculo competitivos do receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) Moduladores Sulfoximinas Sulfoxaflor Nervo e músculo competitivos do

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) Moduladores Butenolidas Flupiradifurona Nervo e músculo competitivos do receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) Moduladores Espinosinas Spinetoram, Spinosad Nervo e músculo alostéricos do receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) Moduladores Avermectinas, Abamectina, Emamectina Nervo e músculo alostéricos do canal milbemicinas benzoato, Lepimectina, de cloreto Milbemectina

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas controlado por glutamato (GluCl) Mimetiza o hormônio Análogos do Hidropreno, Quinopreno, Crescimento juvenil hormônio juvenil Metopreno Mimetiza o hormônio Fenoxicarbe Fenoxicarbe Crescimento juvenil Mimetiza o hormônio Piriproxifeno Piriproxifeno Crescimento juvenil Inibidores não haletos de Metil brometo e outros Desconhecidas ou não específicos variados alquila haletos de alquila específicas (multilocais) Inibidores não Cloropicrina Cloropicrina Desconhecidas ou não específicos variados específicas (multilocais) Inibidores não Fluoretos Criolita, fluoreto de Desconhecidas ou não específicos variados sulfurila específicas

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas

(multilocais) Inibidores não Boratos Borax, Ácido bórico, Desconhecidas ou não específicos variados Octaborato dissódico, específicas (multilocais) Borato de sódio, Metaborato de sódio Inibidores não Tártaro emético Tártaro emético Desconhecidas ou não específicos variados específicas (multilocais) Inibidores não Geradores de Dazomet, Metam Desconhecidas ou não específicos variados isotiocianato de específicas (multilocais) metila Moduladores de Derivados de Pimetrozina, Nervo e músculo órgãos cordonais piridina Pirifluquinazona azometina Inibidores do Clofentezina, Clofentezina, Crescimento crescimento de Diflovidazina, Diflovidazina, Hexitiazox

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas ácaros Hexitiazox Inibidores do Etoxazol Etoxazol Crescimento crescimento de ácaros Disruptores Bacillus Bt var. aizawai, Bt var.

Intestino médio microbianos de thuringiensis e israelensis, Bt var. membranas do as proteínas kurstaki, Bt var. intestino médio de inseticidas que tenebrionensis insetos produzem Disruptores Bacillus Bacillus sphaericus Intestino médio microbianos de sphaericus membranas do intestino médio de insetos Inibidores de ATP Diafentiuron Diafentiuron Respiração sintase mitocondrial

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas

Inibidores de ATP Miticidas de Azociclotina, Cihexatina, Respiração sintase mitocondrial organotina Óxido de fembutatina Inibidores de ATP Propargita Propargita Respiração sintase mitocondrial Inibidores de ATP Tetradifon Tetradifon Respiração sintase mitocondrial Desacopladores da Clorfenapir, Clorfenapir, DNOC, Respiração fosforilação DNOC, Sulfuramida oxidativa por meio Sulfuramida de ruptura do gradiente de prótons Bloqueadores do Análogos de Bensultap, Cartap Nervo e músculo canal do receptor nereistoxina cloridrato, Tiociclam, nicotínico de Tiosultap-sódio acetilcolina (nAChR) Inibidores da Benzoilureias Bistrifluron, Crescimento

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas biossíntese de Clorfluazuron, quitina, tipo 0 Diflubenzuron, Flucicloxuron, Flufenoxuron, Hexaflumuron, Lufenuron, Novaluron, Noviflumuron, Teflubenzuron, Triflumuron Inibidores da Buprofezina Buprofezina Crescimento biossíntese de quitina, tipo 1 Disruptor de muda, Ciromazina Ciromazina Crescimento Dípteros Agonistas do receptor de ecdisona Diacil- Cromafenozida, Crescimento hidrazinas Halofenozida, Metoxifenozida,

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas

Tebufenozida Agonistas do Amitraz Amitraz Nervo e músculo receptor de octopamina Inibidores do Hidrametilnon Hidrametilnon Respiração complexo de transporte de elétrons mitocondrial III Inibidores do Acequinocil Acequinocil Respiração complexo de transporte de elétrons mitocondrial III Inibidores do Fluacripirim Fluacripirim Respiração complexo de

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas transporte de elétrons mitocondrial III Inibidores do Bifenazato Bifenazato Respiração complexo de transporte de elétrons mitocondrial III Inibidores do Meti acaricidas Fenazaquina, Respiração complexo de e inseticidas Fenpiroximato, transporte de Piridabeno, Pirimidifeno, elétrons Tebufenpirad, Tolfenpirad mitocondrial I Inibidores do Rotenona Rotenona Respiração complexo de transporte de

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas elétrons mitocondrial I Bloqueadores do Oxadiazinas Indoxacarbe Nervo e músculo canal de sódio voltagem-dependente Bloqueadores do Semicarbazonas Metaflumizona Nervo e músculo canal de sódio voltagem-dependente Inibidores de acetil Derivados dos Espirodiclofeno, Crescimento CoA carboxilase ácidos tetrônico Espiromesifeno, e tetrâmico Espirotetramat Inibidores do fosfetos Fosfeto de alumínio, Respiração complexo de fosfeto de cálcio, transporte de Fosfino, fosfeto de zinco elétrons mitocondrial IV

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas

Inibidores do Cianetos Cianeto de cálcio, Respiração complexo de cianeto de potássio, transporte de cianeto de sódio elétrons mitocondrial IV Inibidores do Derivados de Cienopirafeno, Respiração complexo de beta-cetonitrila Ciflumetofeno transporte de elétrons mitocondrial II Inibidores do Carboxanilidas Piflubumida Respiração complexo de transporte de elétrons mitocondrial II Moduladores do diamidas Clorantraniliprol, Nervo e músculo

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas receptor de Ciantraniliprol, rianodina Flubendiamida Moduladores do órgão Flonicamid Flonicamid Nervo e músculo cordotonal–local- alvo indefinido Compostos de modo de Azadiractina Azadiractina Desconhecidas ação desconhecido ou incerto Compostos de modo de Benzoximato Benzoximato Desconhecidas ação desconhecido ou incerto Compostos de modo de Bromopropilato Bromopropilato Desconhecidas ação desconhecido ou incerto Compostos de modo de Quinometionato Quinometionato Desconhecidas ação desconhecido ou

Modo de ação Classe de Inseticidas exemplares Funções fisiológicas composto afetadas incerto Compostos de modo de Dicofol Dicofol Desconhecidas ação desconhecido ou incerto Compostos de modo de Calda Calda sulfocálcica Desconhecidas ação desconhecido ou sulfocálcica incerto Compostos de modo de Piridalil Piridalil Desconhecidas ação desconhecido ou incerto Compostos de modo de Enxofre Enxofre Desconhecidas ação desconhecido ou incerto

Tabela 10. Lista exemplar de pesticidas, que podem ser combinados com micróbios da revelação.

Categoria Compostos Inseticidas Arsenato de cálcio Acetoarsenito de cobre Arsenato de cobre Inseticidas arsenicais Arsenato de chumbo Arsenito de potássio Arsenito de sódio Alicina Anabasina Azadiractina Carvacrol d-Limoneno Matrina Nicotina Nornicotina Oximatrina Piretrinas Inseticidas botânicos Cinerinas Cinerina I Cinerina Ii Jasmolina I Jasmolina Ii Piretrina I Piretrina II Quássia Rodojaponina-III Rotenona

Categoria Compostos Riânia Sabadilla Sanguinarina Triptolida Bendiocarbe Inseticidas de carbamato Carbaril Benfuracarb Carbofurano Inseticidas de benzofuranil Carbossulfano metilcarbamato Decarbofurano Furatiocarbe Dimetano Dimetilano Hiquincarbe Inseticidas de Isolano dimetilcarbamato Pirimicarbe Piramat Pirolano Alanicarbe Aldicarb Aldoxicarbe Butocarboxim Butoxicarboxim Inseticidas de oxima Metomil carbamato Nitrilacarbe Oxamil Tazimcarb Tiocarboxima Tiodicarbe

Categoria Compostos Tiofanox Alixicarbe Aminocarbe Bufencarb Butacarbe Carbanolate Cloetocarbe

CPMC Dicresil Dimetacarbe Dioxacarbe

EMPC Inseticidas de fenil Etiofencarbe metilcarbamato Fenetacarbe Fenobucarbe Isoprocarbe Metiocarbe Metolcarbe Mexacarbato Promacil Promecarbe Propoxur Trimetacarbe

XMC Xililcarbe Broflanilide Clorantraniliprol Inseticidas de diamida Ciantraniliprol Ciclaniliprol

Categoria Compostos Cialodiamida Flubendiamida Tetraniliprol Dinex Dinoprop Inseticidas de dinitrofenol Dinosam

DNOC Hexafluorsilicato de bário Criolita Flursulamid Inseticidas de flúor Fluoreto De Sódio Hexafluorsilicato De Sódio Sulfluramid Amitraz Clordimeform Formetanato Inseticidas de formamidina Formparanato Medimeform Semiamitraz Acrilonitrila Dissulfeto de carbono Tetracloreto de carbono Sulfeto de carbonila Clorofórmio Inseticidas fumigantes Cloropicrina Cianogênio para-Diclorobenzeno 1,2-dicloropropano Ditioéter

Categoria Compostos Formato de etila Dibrometo de etileno Dicloreto de etileno Óxido de etileno Cianeto de hidrogênio Brometo de metila Iodeto de metila Metilclorofórmio Cloreto de metileno Naftaleno Fosfino Tetratiocarbonato de sódio Fluoreto de sulfurila Tetracloroetano Bórax Ácido bórico Polissulfeto de cálcio Oleato de cobre Inseticidas inorgânicos Terra diatomácea Cloreto mercuroso Tiocianato de potássio Sílica gel Tiocianato de sódio Reguladores do crescimento de insetos Inibidores de quitina Buprofezina síntese Ciromazina Inibidores da síntese de Bistrifluron benzoilfenilureia quitina Clorbenzuron

Categoria Compostos Clorfluazuron Diclorbenzuron Diflubenzuron Flucicloxuron Flufenoxuron Hexaflumuron Lufenuron Novaluron Noviflumuron Penfluron Teflubenzuron Triflumuron Dayoutong Epofenonana Fenoxicarbe Hidropreno Mimetiza o hormônio juvenil Quinopreno Metopreno Piriproxifeno Tripreno Hormônio juvenil I Hormônios juvenis Hormônio juvenil II Hormônio juvenil III Cromafenozida Furano Tebufenozida Agonistas do hormônio da Halofenozida muda Metoxifenozida Tebufenozida Yishijing

Categoria Compostos α-Ecdisona Hormônios da muda Ecdisterona Inibidores da muda Diofenolan Precoceno I Precocenos Precoceno II Precoceno III Reguladores do crescimento de insetos não Diciclanil classificados inseticidas de lactona macrocíclica Abamectina Doramectina Emamectina Inseticidas de avermectina Eprinomectina Ivermectina Selamectina Lepimectina Milbemectina Inseticidas de milbemicina Milbemicina Oxima Moxidoctina Espinetoram Inseticidas de espinosina Espinosad Inseticidas neonicotinóides Clotianidina Dinotefurano Inseticidas neonicotinóides Imidacloprida de nitroguanidina Imidaclotiz Tiametoxam

Categoria Compostos Inseticidas neonicotinóides Nitenpiram de nitrometileno Nitiazina Acetamiprid Imidacloprida Inseticidas neonicotinóides Nitenpiram de piridilmetilamina Paichongding Tiacloprid Bensultap Cartap Inseticidas de análogo de Politialano nereistoxina Tiociclam Tiosultap Bromo-DDT Camfeclor

DDT pp′-DDT Etil-DDD Inseticidas organoclorados HCH Gama-HCH Lindano Metoxiclor Pentaclorofenol

TDE Aldrin Bromocicleno Clorbicicleno Inseticidas de ciclodieno Clordano Clordecona Dieldrina

Categoria Compostos Dilor Endossulfan Alfa-endossulfan Endrina

HEOD Heptaclor

HHDN Isobenzan Isodrin Kelevan Mirex Inseticidas de organofósforo Bronfenvinfos Calvinfos Clorfenvinfos Crotoxifos Diclorvos Dicrotofos Dimetilvinfos Inseticidas de Fospirato organofosfato Heptenofos Metocrotofos Mevinfos Monocrotofos Naled Naftalofos Fosfamidon Propafos

Categoria Compostos

TEPP Tetraclorvinfos Dioxabenzofos Inseticidas de Fosmetilan organotiofosfato Fentoato Acetion Acetofos Amiton Cadusafos Cloretoxifos Clormefos Demefion Demefion-O Demefion-S Demeton Demeton-O Inseticidas de Demeton-S organotiofosfato alifático Demeton-Metil Demeton-O-Metil Demeton-S-Metil Demeton-S-Metilsulfon Dissulfoton Etion Etoprofos

IPSP Isotioato Malation Metacrifos Metilacetofos

Categoria Compostos Oxidemeton-metil Oxideprofos Oxidissulfoton Forato Sulfotep Terbufos Tiometon Amidition Ciantoato Dimetoato Etoato-metil alifático amida Formotion organotiofosfato alifático Mecarbam Ometoato Protoato Sofamida Vamidotion Clorphoxim Inseticidas de oxima Foxim organotiofosfato Foxim-Metil Azametifos Colofonato Coumafos Inseticidas de Coumitoato organotiofosfato Dioxation heterocíclico Endotion Menazon Morphotion Fosalona

Categoria Compostos Piraclofos Pirazotion Piridafention Quinotion Inseticidas de Diticrofos benzotiopirano Ticrofos organotiofosfato Inseticidas de benzotriazina Azinfos-etil organotiofosfato Azinfos-metil inseticidas Inseticidas de isoindol Dialifos organotiofosfato Fosmet Inseticidas de isoxazol Isoxation organotiofosfato Zolaprofos Inseticidas de Clorprazofos pirazolopirimidina Pirazofos organotiofosfato Inseticidas de piridina Clorpirifos organotiofosfato Clorpirifos-metil Butatiofos Diazinon Etrimfos Lirimfos Inseticidas de pirimidina Pirimioxifos organotiofosfato Pirimifos-Etil Pirimifos-Metil Primidofos Pirimitato

Categoria Compostos Tebupirimfos Inseticidas de quinoxalina Quinalfos organotiofosfato Quinalfos-metil Atidation Inseticidas de tiadiazol Litidation organotiofosfato Metidation Protidation Inseticidas de triazol Isazofos organotiofosfato Triazofos Azotoato Bromofos Bromofos-Etil Carbofenotion Clortiofos Cianofos Citioato Dicafton Diclofention Inseticidas de fenil Etafos organotiofosfato Fanfur Fenclorfos Fenitrotion Fensulfotion Fention Fention-Etil Heterofos Jodfenfos Mesulfenfos Paration

Categoria Compostos Paration-metil Fenkapton Fosniclor Profenofos Protiofos Sulprofos Temefos Triclormetaphos-3 Trifenofos Xiaochongliulina Butonato Inseticidas de fosfonato Triclorfon Inseticidas de Mecarfon fosfonotioato Inseticidas de fenil Fonofos etilfosfonotioato Tricloronat Cianofenfos Inseticidas de fenil

EPN fenilfosfonotioato Leptofos Crufomato Fenamifos Fostietan Inseticidas de Mefosfolan fosforamidato Fosfolan Fosfolan-Metil Pirimetafos Acefato Inseticidas de cloramina fósforo fosforamidotioato Isocarbofos

Categoria Compostos Isofenfos Isofenfos-metil Metamidofos Fosglicina Propetanfos Dimefox Inseticidas de Mazidox fosforodiamida Mipafox Schradan Inseticidas de oxadiazina Indoxacarb Inseticidas de oxadiazolona Metoxadiazona Dialifos Inseticidas de ftalimida fosmet tetrametrina Inseticidas físicos Maltodextrina Ácido bórico Inseticidas dessecantes Terra diatomácea Sílica gel Clorantraniliprol Ciantraniliprol Ciclaniliprol Dimetilan Inseticidas de pirazol Isolan Tebufenpirad Tetraniliprol Tolfenpirad Acetoprol Inseticidas de fenilpirazol Etiprol Fipronil

Categoria Compostos Flufiprol Piraclofos Pirafluprol Piriprol Pirolan Vaniliprol Inseticidas de piretróide Acrinatrina Aletrina Bioaletrina Esdepaletrina Bartrina Bifentrina Kappa-Bifentrina Bioetanometrina Brofenvalerato Broflutrinato Inseticidas de éster de Brometrina piretróide Butetrina Clorempentrina Cicletrina Cicloprotrina Ciflutrina Beta-Ciflutrina Cialotrina Gama-Cialotrina Lambda-Cialotrina Cipermetrina Alfa-cipermetrina

Categoria Compostos Beta-Cipermetrina Teta-Cipermetrina Zeta-Cipermetrina Cifenotrina Deltametrina Dimeflutrina Dimetrina Empentrina d-fanshiluquebingjuzhi Cloropraletrina Fenflutrina Fenpiritrina Fenpropatrina Fenvalerato Esfenvalerato Flucitrinato Fluvalinato Tau-Fluvalinato Furametrina Furetrina Heptaflutrina Imiprotrina Japotrinas Cadetrina Metotrina Metoflutrina Épsilon-Metoflutrina Monfluortrina Épsilon-monfluortrina

Categoria Compostos Pentmetrina Permetrina Biopermetrina Transpermetrina Fenotrina Praletrina Proflutrina Propartrina Piresmetrina Renoflutrina Meperflutrina Resmetrina Bioresmetrina Cismetrina Teflutrina Kappa-Teflutrina Teraletrina Tetrametrina Tetrametilflutrina Tralocitrina Tralometrina Transflutrina Valerato Etofenprox Flufenprox Inseticidas de éter de Halfenprox piretróide Protrifenbute Silafluofeno Inseticidas de piretróide Sulfoxima

Categoria Compostos oxima Tiofluoximato Inseticidas de Flufenerim pirimidinamina Pirimidifen Inseticidas de pirrol Clorfenapir Inseticidas de amônio Sanguinarina quaternário Inseticidas de sulfoximina Sulfoxaflor Inseticidas de ácido Espirotetramat tetrâmico Inseticidas de ácido Espiromesifeno tetrônico Clotianidina Imidaclotiz Inseticidas de tiazol Tiametoxam Tiapronil Tazimcarb Inseticidas de tiazolidina Tiacloprid Inseticidas de tioureia Diafentiuron Flucofuron Inseticidas de ureia Sulcofuron Inseticidas de Dicloromezotiaz zwitteriônicos Triflumezopirim Afidopiropen Afoxolaner Alosamidina Inseticidas não Closantel classificados Naftenato de cobre Crotamiton

EXD

Categoria Compostos Fenazaflor Fenoxacrim Flometoquina Flonicamid Fluhexafon Flupiradifurona Fluralaner Fluxametamida Hidrametilnon Isoprotiolano Jiahuangchongzong Malonobeno Metaflumizona Nifluridida Plifenato Piridabeno Piridalil Pirifluquinazona Rafoxanida Turingiensina Triarateno Triazamato

ACARICIDAS Carvacrol Acaricidas botânicos Sanguinarina Azobenzeno Acaricidas de difenil em Benzoximato ponte Benzil Benzoato Bromopropilato

Categoria Compostos Clorbensida Clorfenetol Clorfenson Clorfensulphide Clorobenzilato Cloropropilato Ciflumetofeno

DDT Dicofol Difenil Sulfona Dofenapina Fenson Fentrifanil Fluorbensida Genit Hexaclorofeno Fenpróxido Proclonol Tetradifon Tetrasul Benomil Carbanolato Carbaril Carbofurano Acaricidas de carbamato Metiocarbe Metolcarbe Promacil Propoxur Acaricidas de oxima Aldicarb

Categoria Compostos carbamato Butocarboxim Oxamil Tiocarboxima Tiofanox Acaricidas de carbazato Bifenazato Binapacril Dinex Dinobuton Dinocap Dinocap-4 Acaricidas de dinitrofenol Dinocap-6 Dinocton Dinopenton Dinosulfon Dinoterbon

DNOC Amitraz Clordimeform Cloromebuform Acaricidas de formamidina Formetanato Formparanato Medimeform Semiamitraz Acaricidas de lactona Tetranactina macrocíclica Abamectina Doramectina Acaricidas de avermectina Eprinomectina Ivermectina

Categoria Compostos Selamectina Milbemectina Acaricidas de milbemicina Milbemicina Oxima Moxidoctina Clofentezina Ciromazina Diflovidazina Dofenapin Reguladores do crescimento Fluazuron de ácaros Flubenzimina Flucicloxuron Flufenoxuron Hexitiazox Bromocicleno Camfeclor

DDT Acaricidas de organoclorado Dienoclor Endossulfan Lindano Acaricidas de organofósforo Clorfenvinfos Crotoxifos Diclorvos Heptenofos Acaricidas de organofosfato Mevinfos Monocrotofos Naled

TEPP Tetraclorvinfos

Categoria Compostos Amidition Amiton Azinfos-Etil Azinfos-Metil Azotoato Benoxafos Bromofos Bromofos-Etil Carbofenotion Clorpirifos Clortiofos Coumaphos Ciantoato Demeton Acaricidas de Demeton-O organotiofosfato Demeton-S Demeton-Metil Demeton-O-Metil Demeton-S-Metil Demeton-S-Metilsulfon Dialifos Diazinon Dimetoato Dioxation Dissulfoton Endotion Etion Etoato-Metil Formotion

Categoria Compostos Malation Mecarbam Metacrifos Ometoato Oxideprofos Oxidissulfoton Paration Fenkapton Forato Fosalona Fosmet Fostin Foxim Pirimifos-Metil Protidation Protoato Pirimitato Quinalfos Quintiofos Sofamida Sulfotep Tiometon Triazofos Trifenofos Vamidotion Acaricidas de fosfonato Triclorfon Isocarbofos Acaricidas de Metamidofos fosforamidotioato Propetanfos

Categoria Compostos Dimefox Acaricidas de Mipafox fosforodiamida Schradan Azociclotina Cihexatina Acaricidas de organotina Óxido De Fembutatina Fostin Acaricidas de Diclofluanid fenilsulfamida Dialifos Acaricidas de ftalimida Fosmet Cienopirafeno Fenpiroximato Acaricidas de pirazol Piflubumida Tebufenpirad Acetoprol Acaricidas de fenilpirazol Fipronil Vaniliprol Acaricidas de piretróide Acrinatrina Bifentrina Broflutrinato Cialotrina Acaricidas de éster de Cipermetrina piretróide Alfa-Cipermetrina Fenpropatrina Fenvalerato Flucitrinato Flumetrina

Categoria Compostos fluvalinato tau-fluvalinato permetrina Acaricidas de éter de Halfenprox piretróide Acaricidas de Pirimidifeno pirimidinamina Acaricidas de pirrol Clorfenapir Acaricidas de amônio Sanguinarina quaternário Quinometionato Acaricidas de quinoxalina Tioquinox Acaricidas de estrobilurina Bifujunzhi Acaricidas de Fluacripirim metoxiacrilato Flufenoxistrobina estrobilurina Piriminostrobina Acaricidas de éster de Aramita sulfito Propargita Acaricidas de ácido Espirodiclofeno tetrônico Clofentezina Acaricidas de tetrazina Diflovidazina Flubenzimina Acaricidas de tiazolidina Hexitiazox Acaricidas de tiocarbamato Fenotiocarb Clorometiuron Acaricidas de tioureia Diafentiuron Acaricidas não Acequinocil

Categoria Compostos classificados Afoxolaner Amidoflumet Óxido arsenoso Clenpirina Closantel Crotamiton Cicloprato Cimiazol Dissulfiram Etoxazol Fenazaflor Fenazaquina Fluenetil Fluralaner Messulfen

MNAF Nifluridida Nikkomicinas Piridaben Sulfiram Sulfluramid Enxofre Turingiensina Triarateno

QUIMIOESTERILIZANTES Afolato Bisazir Bussulfan Diflubenzuron

Categoria Compostos Dimatif Hemel Hempa Metepa Metiotepa Afolato de metila Morzid Penfluron Tepa Tiohempa Tiotepa Tretamina Uredepa

REPELENTES DE INSETOS Acrep Butopironoxil Canfor d-Canfor Carbóxido Ftalato de dibutila Dietiltoluamida Carbato de dimetila Ftalato de dimetila Succinato de dibutila Etohexadiol Hexamida Icaridin Metoquin-butil Metilneodecanamida

Categoria Compostos 2-(Octiltio)etanol Oxamato Quwenzhi Quyingding Rebemide Zengxiaoan

NEMATICIDAS Nematicidas de avermectina Abamectina Nematicidas botânicos Carvacrol Benomil Carbofurano Nematicidas de carbamato Carbossulfan Cloetocarbe Alanicarbe Aldicarbe Nematicidas de oxima Aldoxicarbe carbamato Oxamil Tirpato Dissulfeto de carbono Cianogênio 1,2-Dicloropropano 1,3-Dicloropropeno Nematicidas fumigantes Ditioéter Brometo de metila Iodeto de metila Tetratiocarbonato de sódio Nematicidas de organofósforo Nematicidas de diamidafos

Categoria Compostos organofosfato Fenamifos Fostietan Fosfamidon Cadusafos Clorpirifos Diclofention Dimetoato Etoprofos Fensulfotion Fostiazato Nematicidas de Heterofos organotiofosfato Isamidofos Isazofos Forato Fosfocarbe Terbufos Tionazina Triazofos Nematicidas de Imiciafos fosfonotioato Mecarfon Acetoprol Benclotiaz Cloropicrina Dazomet Nematicidas não

DBCP classificados

DCIP Fluazaindolizina Fluensulfona Furfural

Categoria Compostos Metam Isotiocianato de metila Tioxazafeno Xilenóis

[00257] Inseticidas também incluem sinergistas ou ativadores que não são, eles próprios, considerados tóxicos ou inseticidas, mas são materiais usados com inseticidas para ter efeito sinérgico ou aumentar a atividade dos inseticidas. Sinergistas ou ativadores incluem butóxido de piperonila. Pesticidas Biorracionais

[00258] Inseticidas podem ser biorracionais, ou também podem ser conhecidos como biopesticidas ou pesticidas biológicos. Biorracionais se referem a qualquer substância de origem natural (ou substâncias feitas pelo Homem que se assemelham àquelas de origem natural) que possui um efeito prejudicial ou letal em praga(s)-alvo específica(s), por exemplo, insetos, ervas daninhas, doenças de plantas (incluindo nematódeos), e pragas de vertebrados, possuem um modo de ação único, são atóxicos para o homem, plantas e animais domésticos, e possuem poucos ou nenhum efeito adverso sobre a vida selvagem e para o ambiente.

[00259] Inseticidas biorracionais (ou biopesticidas ou pesticidas biológicos) podem ser agrupados como: (1) substâncias bioquímicas (hormônios, enzimas, feromônios e agentes naturais, por exemplo, reguladores do crescimento de insetos e plantas), (2) microbianos (vírus, bactérias, fungos, protozoários e nematódeos), ou (3) Protetores Incorporados em Plantas (PIPs) – primariamente plantas transgênicas, por exemplo, milho Bt.

[00260] Biopesticidas, ou pesticidas biológicos, podem incluir amplamente agentes fabricados a partir de microrganismos vivos ou um produto natural e vendidos para o controle de pragas de plantas. Biopesticidas podem ser: microrganismos, substâncias bioquímicas e semioquímicos. Biopesticidas também podem incluir peptídeos, proteínas e ácidos nucleicos como, por exemplo, DNA de fita dupla, DNA de fita simples, RNA de fita dupla, RNA de fita simples e DNA ou RNA de gancho de cabelo.

[00261] Bactérias, fungos, oomicetos, vírus e protozoários são todos usados para o controle biológico de pragas de insetos. O biopesticida microbiano mais amplamente usado é a bactéria patogênicas para insetos Bacillus thuringiensis (Bt), que produz um cristal de proteína (a δ- endotoxina de Bt) durante a formação do esporo bacteriano que é capaz de causar a lise de células do intestino quando consumido por insetos suscetíveis. Biopesticidas microbianos de Bt consistem em esporos bacterianos e cristais de δ- endotoxina produzidos em massa em tanques de fermentação e formulados como um produto pulverizável. A Bt não prejudica vertebrados e é segura para as pessoas, organismos benéficos e para o ambiente. Dessa forma, Sprays de Bt consistem em uma tática crescente para o gerenciamento de pragas em plantios de frutas e de vegetais nos quais seu nível elevado de seletividade e segurança são considerados desejáveis, e nos quais a resistência aos inseticidas químicos sintéticos é um problema. Sprays de Bt também foram usados em cultivos de commodities como, por exemplo, maís, soja e algodão, mas, com o advento da modificação genética de plantas, os fazendeiros estão desenvolvendo cada vez mais variedades de cultivo transgênico de Bt.

[00262] Outros inseticidas microbianos incluem produtos baseados em baculovírus entomopatogênicos. Baculovírus que são patogênicos para artrópodes pertencem à família de vírus e possuem grandes genomas de DNA de fita dupla circulares, fechados covalentemente, e que são embalados em nucleocapsídeos. Mais de 700 baculovírus foram identificados de insetos das ordens Lepidoptera, Hymenoptera e Diptera. Baculovírus são normalmente altamente específicos para seus insetos hospedeiros e, dessa forma, são seguros para o ambiente, humanos, outras plantas, e organismos benéficos. Mais de 50 produtos de baculovírus têm sido usados para controlar diferentes pragas de inseto em todo o mundo. Nos EUA e na Europa, o granulovírus Cydia pomonella (CpGV) é usado como um biopesticida de inundação contra o bichado em maçãs. O estado de Washington, EUA, o maior produtor de maçãs nos EUA, usa CpGV on 13% dos plantio de maçãs. No Brasil, o nucleopoliedrovírus da lagarta da soja Anticarsia gemmatalis foi usado em até 4 milhões de ha (aproximadamente 35%) do plantio de soja no meio dos anos 90. Vírus como Gemstar® (Certis EUA) estão disponíveis para o controle de larvas de espécies de Heliothis e Helicoverpa.

[00263] Pelo menos 170 produtos biopesticidas diferentes baseados em fungos entomopatogênicos foram desenvolvidos para uso contra pelo menos cinco ordens de insetos e acarinos em plantios em estufa, campos de frutas e vegetais, bem como cultivos de commodities. A maioria dos produtos se baseia nos ascomicetos Beauveria bassiana ou Metarhizium anisopliae. M. anisopliae também foi desenvolvido para o controle de pragas de locustas e gafanhotos na África e Austrália e é recomendada pelo Organização de Alimentos e Agricultura das Nações Unidas (FAO) para o gerenciamento de locustas.

[00264] Diversos pesticidas microbianos registrados nos Estados Unidos estão listados na Tabela 16 de Kabaluk e cols. 2010 (Kabaluk, J.T. e cols. (ed.). 2010. “The Use and Regulation of Microbial Pesticides in Representative Jurisdictions Worldwide”. IOBC Global. 99 páginas) e pesticidas microbianos registrados em países selecionados estão listados no Anexo 4 de Hoeschle-Zeledon e cols. 2013 (Hoeschle-Zeledon, I., P. Neuenschwander e L. Kumar. (2013). “Regulatory Challenges for Biologic Control”. “SP-IPM Secretariat, International Institute of Tropical Agricultura” (IITA), Ibadan, Nigéria. 43 páginas), ambos incorporados nesse relatório descritivo em sua totalidade.

[00265] Plantas produzem uma ampla variedade de metabólitos secundários que desestimulam herbívoros a se alimentarem delas. Alguns desses podem ser usados como biopesticidas. Eles incluem, por exemplo, piretrinas, que são compostos inseticidas de ação rápida produzidos por Chrysanthemum cinerariaefolium. Eles possuem baixa toxicidade para mamíferos, mas se degradam rapidamente após aplicação. Essa persistência curta propiciou o desenvolvimento de piretrinas sintéticas (piretróides). O composto botânico mais amplamente usado é o óleo de nim, um inseticida químico extraído de sementes de Azadirachta indica. Dois pesticidas altamente ativos estão disponíveis com base em metabólitos secundários sintetizados por actinomicetos do solo, mas eles foram avaliados por autoridades reguladoras como se fossem pesticidas químicos sintéticos. Spinosad é uma mistura de dois compostos macrolídeos de Saccharopolyspora spinosa. Ele possui toxicidade muito baixa para mamíferos e os resíduos se degradam rapidamente no campo. Fazendeiros e produtores o usavam amplamente após sua introdução em 1997, mas já se desenvolveu resistência em algumas pragas importantes como, por exemplo, tripés de flores ocidentais. Abamectina é um composto macrocíclico de lactona produzido por Streptomyces avermitilis. Ela é ativa contra uma gama de espécies de pragas, mas também se desenvolveu resistência a ela, por exemplo, em ácaros tetraniquídios.

[00266] Foi verificado que peptídeos e proteínas de diversos organismos possuem propriedades pesticidas. Talvez os mais proeminentes sejam peptídeos do veneno da aranha (King, G.F. e Hardy, M.C. (2013) “Spider-Venom Peptides: Structure, Pharmacology, and Potential for Control of Insect Pests”. Annu. Rev. Entomol. 58: 475-496). Um arranjo único de ligações dissulfeto em peptídeos do veneno da aranha os tornam extremamente resistente às proteases. Como resultado, esses peptídeos são altamente estáveis no intestino e hemolinfa do inseto e muitos deles são ativos oralmente. Os peptídeos visam uma ampla gama de receptores e canais de íon no sistema nervoso do inseto. Outros exemplos de peptídeos inseticidas incluem: veneno anêmona do mar que atua sobre canais de Na+ controlados por voltagem (Bosmans, F. e Tytgat, J. (2007) “Sea Anemone Venom as a Source of Insecticidal Peptides Acting on Voltage-Gated Na+ Channels”. Toxicon. 49 (4): 550–560); o peptídeo PA1b (Albumina da Ervilha 1, subunidade b) de sementes de Legumes com atividade letal em várias pragas de inseto, por exemplo, mosquitos, alguns afídeos e gorgulhos de cereais (Eyraud, V. e cols. (2013) “Expression and Biological Activity of the Cystine Knot Bioinsetoicide PA1b (Pea Albumin 1 Subunit b)”. PLoS ONE 8(12): e81619); e um peptídeo interno de 10 kDa gerado por hidrólise enzimática de urease de Canavalia ensiformis (feijão-de-porco) dentro de insetos suscetíveis (Martinelli, A.H.S., e cols. (2014) “Structure–Function Studies on Jaburetox, a Recombinant Insecticidal Peptide Derived from Jack Bean (Canavalia ensiformis) Urease”. Biochimica et Biophysica Acta 1840: 935–944). Exemplos de peptídeos inseticidas disponíveis comercialmente incluem Spear™ - T para o tratamento de tripés em vegetais e ornamentais em estufas, Spear™ - P para o controle do Besouro da Batata do Colorado, e Spear™ - C para a proteção de plantios de pragas de lepidópteros (Vestaron Corporation, Kalamazoo, MI). Uma nova proteína inseticida de Bacillus bombysepticus, denominada toxina cristal paraesporal (PC), mostra oral atividade patogênica e letalidade contra bichos-da-seda e cepas de Helicoverpa armigera resistentes a Cry1Ac (Lin, P. e cols. (2015) “PC, A Novel Oral Insecticidal Toxin from Bacillus bombysepticus Involved in Host Lethality via APN and BtR-175”. Sci. Rep. 5: 11.101).

[00267] Um semioquímico é um sinal químico produzido por um organismo que causa uma alteração comportamental em um indivíduo da mesma espécie ou de uma espécie diferente. Os semioquímicos mais amplamente usados para proteção de plantios são feromônios sexuais de insetos, alguns dos quais podem agora ser sintetizados e são usados para o monitoramento ou controle de pragas por captura em massa,

sistemas atrair-e-matar e ruptura do acasalamento. Em todo o mundo, a ruptura do acasalamento é usada em mais de 660.000 ha e têm sido particularmente útil em plantios de orquídeas.

[00268] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “traço inseticida transgênico” se refere a um traço exibido por uma planta que foi modificado geneticamente para expressar um ácido nucleico ou polipeptídeo que é prejudicial a uma ou mais pragas. Em uma modalidade, as plantas da presente revelação são resistentes à adesão e/ou infestação de qualquer uma ou mais das pragas da presente revelação. Em uma modalidade, o traço compreende a expressão de proteínas inseticidas vegetativas (VIPs) de Bacillus thuringiensis, lectinas e inibidores de proteinase de plantas, terpenóides, colesterol oxidases de Streptomyces spp., quitinases de inseto e enzimas quitinolíticas fúngicas, proteínas inseticidas bacterianas e genes de resistência de reconhecimento precoce. Em outra modalidade, o traço compreende a expressão de uma proteína de Bacillus thuringiensis que é tóxica para uma praga. Em uma modalidade, a proteína Bt é uma proteína Cry (proteína cristal). Cultivos de Bt incluem milho Bt, algodão Bt e soja Bt. Toxinas de Bt podem ser da família Cry (veja, por exemplo, Crickmore e cols., 1998, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 807-812), que são particularmente eficazes contra Lepidoptera, Coleoptera e Diptera.

[00269] As toxinas de Bt Cry e Cyt pertencem a uma classe de toxinas bacterianas conhecidas como toxinas formadoras de poros (PFT) que são secretadas como proteínas hidrossolúveis que passam por alterações conformacionais a fim de se inserirem, ou translocar através de membranas celulares de seu hospedeiro. Há dois grupos principais de PFT: (i) as toxinas α-helicoidais, nas quais regiões da α- hélice formam o poro transmembrana, e (ii) as toxinas de barril-β, que se inserem na membrana por formação de um barril-β formado por ganchos de cabelo de lâmina-β de cada monômero. Veja, Parker M.W., Feil S.C., “Pore-Forming Protein Toxins: From Structure to Function”, Prog. Biophys. Mol. Biol., maio de 2005; 88 (1): 91-142. A primeira classe de PFT inclui toxinas como, por exemplo, as colicinas, exotoxina A, toxina diftérica e também as toxinas Cry de três domínios. Por outro lado, aerolisina, α-hemolisina, antígeno protetor do antraz, toxinas colesterol-dependentes como a perfringolisina O e as toxinas Cyt pertencem às toxinas de barril-β. Id. Em geral, bactérias produtoras de PFT secretam suas toxinas e essas toxinas interagem com receptores específicos localizados na superfície da célula hospedeira. Na maioria dos casos, PFT são ativadas por proteases do hospedeiro após ligação do receptor que induz a formação de uma estrutura oligomérica que é inserção- competente. Finalmente, a inserção na membrana é desencadeada, na maioria dos casos, por uma diminuição no pH que induz um estado de glóbulo fundido da proteína. Id.

[00270] O desenvolvimento de cultivos transgênicos que produzem proteínas Cry de Bt permitiu a substituição de inseticidas químicos por alternativas ambientalmente amigáveis. Em plantas transgênicas, a toxina Cry é produzida continuamente, protegendo a toxina da degradação e tornando- a alcançável pelos insetos mastigadores e roedores. A produção de proteína Cry em plantas foi aumentada por modificação por engenharia genética de genes Cry com um uso de códons com viés para planta, por remoção de supostas sequências sinalizadoras de splicing e deleção da região do terminal carbóxi da pró-toxina. Veja Schuler T.H., e cols., “Insect-Resistant Transgenic Plants”, Trends Biotechnol. 1998; 16: 168–175. O uso de cultivos resistentes a insetos diminuiu consideravelmente o uso de pesticidas químicos em áreas onde esses cultivos transgênicos são plantados. Veja, Qaim M., Zilberman D., “Yield Effects of Genetically Modified Crops in Developing Countries”, Science. 7 de fevereiro de 2003; 299 (5608): 900-902.

[00271] Proteínas Cry conhecidas incluem: δ- endotoxinas incluindo, sem limitação: as classes Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry 51, Cry52, Cry 53, Cry 54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59. Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70 e Cry71 de genes de δ-endotoxina e os genes de cytl e cyt2 citolíticas de B. thuringiensis.

[00272] Membros dessas classes de proteínas inseticidas de B. thuringiensis incluem, sem limitação: CrylAa1 (Nº de Acesso AAA22353); Cry1Aa2 (Nº de Acesso Nº de Acesso AAA22552); Cry1Aa3 (Nº de Acesso BAA00257); Cry1Aa4 (Nº de Acesso CAA31886); Cry1Aa5 (Nº de Acesso BAA04468); Cry1Aa6 (Nº de Acesso AAA86265); Cry1Aa7 (Nº de Acesso AAD46139); Cry1Aa8 (Nº de Acesso 126149); Cry1Aa9 (Nº de Acesso BAA77213); CrylAa10 (Nº de Acesso AAD55382); CrylAa11

(Nº de Acesso CAA70856); Cry1Aa12 (Nº de Acesso AAP80146); Cry1Aa13 (Nº de Acesso AAM44305); Cry1Aa14 (Nº de Acesso AAP40639); Cry1Aa15 (Nº de Acesso AAY66993); Cry1Aa16 (Nº de Acesso HQ439776); Cry1Aa17 (Nº de Acesso HQ439788); Cry1Aa18 (Nº de Acesso HQ439790); Cry1Aa19 (Nº de Acesso HQ685121); Cry1Aa20 (Nº de Acesso JF340156); Cry1Aa21 (Nº de Acesso JN651496); Cry1Aa22 (Nº de Acesso KC158223); Cry1Abl (Nº de Acesso AAA22330); Cry1Ab2 (Nº de Acesso AAA22613); Cry1Ab3 (Nº de Acesso AAA22561); Cry1Ab4 (Nº de Acesso BAA00071); Cry1Ab5 (Nº de Acesso CAA28405); Cry1Ab6 (Nº de Acesso AAA22420); Cry1Ab7 (Nº de Acesso CAA31620); Cry1Ab8 (Nº de Acesso AAA22551); Cry1Ab9 (Nº de Acesso CAA38701); Cry1Ab10 (Nº de Acesso A29125); CrylAb11 (Nº de Acesso Il2419); Cry1Ab12 (Nº de Acesso AAC64003); Cry1Ab13 (Nº de Acesso AAN76494); Cry1Ab14 (Nº de Acesso AAG16877); Cry1Ab15 (Nº de Acesso AA013302); Cry1Ab16 (Nº de Acesso AAK55546); Cry1Ab17 (Nº de Acesso AAT46415); Cry1Ab18 (Nº de Acesso AAQ88259); Cry1Ab19 (Nº de Acesso AAW31761); Cry1Ab20 (Nº de Acesso ABB72460); Cry1Ab21 (Nº de Acesso ABS18384); Cry1Ab22 (Nº de Acesso ABW87320); Cry1Ab23 (Nº de Acesso HQ439777); Cry1Ab24 (Nº de Acesso HQ439778); Cry1Ab25 (Nº de Acesso HQ685122); Cry1Ab26 (Nº de Acesso HQ847729); Cry1Ab27 (Nº de Acesso JN135249); Cry1Ab28 (Nº de Acesso JN135250); Cry1Ab29 (Nº de Acesso JN135251); Cry1Ab30 (Nº de Acesso JN135252); Cry1Ab31 (Nº de Acesso JN135253); Cry1Ab32 (Nº de Acesso JN135254); Cry1Ab33 (Nº de Acesso AAS93798); Cry1Ab34 (Nº de Acesso KC156668); Cry1Ab-like (Nº de Acesso AAK14336); Cry1Ab-like (Nº de Acesso AAK14337); Cry1Ab-like (Nº de Acesso AAK14338); Cry1Ab-like (Nº de Acesso ABG88858); Cry1Ac1 (Nº de Acesso AAA22331); Cry1Ac2 (Nº de Acesso AAA22338); Cry1Ac3 (Nº de

Acesso CAA38098); Cry1Ac4 (Nº de Acesso AAA73077); Cry1Ac5 (Nº de Acesso AAA22339); Cry1Ac6 (Nº de Acesso AAA86266); Cry1Ac7 (Nº de Acesso AAB46989); Cry1Ac8 (Nº de Acesso AAC44841); Cry1Ac9 (Nº de Acesso AAB49768); CrylAc10 (Nº de Acesso CAA05505); CrylAc11 (Nº de Acesso CAA10270); Cry1Ac12 (Nº de Acesso Il2418); Cry1Ac13 (Nº de Acesso AAD38701); Cry1Ac14 (Nº de Acesso AAQ06607); Cry1Ac15 (Nº de Acesso AAN07788); Cry1Ac16 (Nº de Acesso AAU87037); CrylAc17 (Nº de Acesso AAX18704); Cry1Ac18 (Nº de Acesso AAY88347); Cry1Ac19 (Nº de Acesso ABD37053); Cry1Ac20 (Nº de Acesso ABB89046); Cry1Ac21 (Nº de Acesso AAY66992); Cry1Ac22 (Nº de Acesso ABZ01836); Cry1Ac23 (Nº de Acesso CAQ30431); Cry1Ac24 (Nº de Acesso ABL01535); Cry1Ac25 (Nº de Acesso FJ513324); Cry1Ac26 (Nº de Acesso FJ617446); Cry1Ac27 (Nº de Acesso FJ617447); Cry1Ac28 (Nº de Acesso ACM90319); Cry1Ac29 (Nº de Acesso DQ438941); Cry1Ac30 (Nº de Acesso GQ227507); Cry1Ac31 (Nº de Acesso GU446674); Cry1Ac32 (Nº de Acesso HM061081); Cry1Ac33 (Nº de Acesso GQ866913); Cry1Ac34 (Nº de Acesso HQ230364); Cry1Ac35 (Nº de Acesso JF340157); Cry1Ac36 (Nº de Acesso JN387137); Cry1Ac37 (Nº de Acesso JQ317685); CrylAd1 (Nº de Acesso AAA22340); Cry1Ad2 (Nº de Acesso CAA01880); CrylAe1 (Nº de Acesso AAA22410); CrylAf1 (Nº de Acesso AAB82749); CrylAg1 (Nº de Acesso AAD46137); CrylAh1 (Nº de Acesso AAQ14326); Cry1Ah2 (Nº de Acesso ABB76664); Cry1Ah3 (Nº de Acesso HQ439779); CrylAi1 (Nº de Acesso AA039719); Cry1Ai2 (Nº de Acesso HQ439780); Cry1A-like (Nº de Acesso AAK14339); Cry1Bal (Nº de Acesso CAA29898); Cry1Ba2 (Nº de Acesso CAA65003); Cry1Ba3 (Nº de Acesso AAK63251); Cry1Ba4 (Nº de Acesso AAK51084); Cry1Ba5 (Nº de Acesso AB020894); Cry1Ba6 (Nº de Acesso ABL60921); Cry1Ba7 (Nº de Acesso HQ439781);

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Acesso BAF93483); Cry8Eal (Nº de Acesso AAQ73470); Cry8Ea2 (Nº de Acesso EU047597); Cry8Ea3 (Nº de Acesso KC855216); Cry8Fal (Nº de Acesso AAT48690); Cry8Fa2 (Nº de Acesso HQl 74208); Cry8Fa3 (Nº de Acesso AFH78109); Cry8Gal (Nº de Acesso AAT46073); Cry8Ga2 (Nº de Acesso ABC42043); Cry8Ga3 (Nº de Acesso FJ198072); Cry8Hal (Nº de Acesso AAW81032); Cry8Ial (Nº de Acesso EU381044); Cry8Ia2 (Nº de Acesso GU073381); Cry8Ia3 (Nº de Acesso HM044664); Cry8Ia4 (Nº de Acesso KC156674); Cry8Ibl (Nº de Acesso GU325772); Cry8Ib2 (Nº de Acesso KC156677); Cry8Jal (Nº de Acesso EU625348); Cry8Kal (Nº de Acesso FJ422558); Cry8Ka2 (Nº de Acesso ACN87262); Cry8Kbl (Nº de Acesso HM123758); Cry8Kb2 (Nº de Acesso KC156675); Cry8Lal (Nº de Acesso GU325771); Cry8Mal (Nº de Acesso HM044665); Cry8Ma2 (Nº de Acesso EEM86551); Cry8Ma3 (Nº de Acesso HM210574); Cry8Nal (Nº de Acesso HM640939); Cry8Pal (Nº de Acesso HQ388415); Cry8Qal (Nº de Acesso HQ441166); Cry8Qa2 (Nº de Acesso KC152468); Cry8Ral (Nº de Acesso AFP87548); Cry8Sal (Nº de Acesso JQ740599); Cry8Tal (Nº de Acesso KC156673); Cry8-like (Nº de Acesso FJ770571); Cry8-like (Nº de Acesso ABS53003); Cry9Aal (Nº de Acesso CAA41122); Cry9Aa2 (Nº de Acesso CAA41425); Cry9Aa3 (Nº de Acesso GQ249293); Cry9Aa4 (Nº de Acesso GQ249294); Cry9Aa5 (Nº de Acesso JXl 74110); Cry9Aa like (Nº de Acesso AAQ52376); Cry9Bal (Nº de Acesso CAA52927); Cry9Ba2 (Nº de Acesso GU299522); Cry9Bbl (Nº de Acesso AAV28716); Cry9Cal (Nº de Acesso CAA85764); Cry9Ca2 (Nº de Acesso AAQ52375); Cry9Dal (Nº de Acesso BAAl 9948); Cry9Da2 (Nº de Acesso AAB97923); Cry9Da3 (Nº de Acesso GQ249293); Cry9Da4 (Nº de Acesso GQ249297); Cry9Dbl (Nº de Acesso AAX78439); Cry9Dcl (Nº de Acesso KCl 56683); Cry9Eal (Nº de Acesso BAA34908);

Cry9Ea2 (Nº de Acesso AA012908); Cry9Ea3 (Nº de Acesso ABM21765); Cry9Ea4 (Nº de Acesso ACE88267); Cry9Ea5 (Nº de Acesso ACF04743); Cry9Ea6 (Nº de Acesso ACG63872); Cry9Ea7 (Nº de Acesso FJ380927); Cry9Ea8 (Nº de Acesso GQ249292); Cry9Ea9 (Nº de Acesso JN651495); Cry9Ebl (Nº de Acesso CAC50780); Cry9Eb2 (Nº de Acesso GQ249298); Cry9Eb3 (Nº de Acesso KC156646); Cry9Ecl (Nº de Acesso AAC63366); Cry9Edl (Nº de Acesso AAX78440); Cry9Eel (Nº de Acesso GQ249296); Cry9Ee2 (Nº de Acesso KC156664); Cry9Fal (Nº de Acesso KC156692); Cry9Gal (Nº de Acesso KC156699); Cry9-like (Nº de Acesso AAC63366); CrylOAal (Nº de Acesso AAA22614); Cry10Aa2 (Nº de Acesso E00614); Cry10Aa3 (Nº de Acesso CAD30098); Cry10Aa4 (Nº de Acesso AFB18318); CrylOA-like (Nº de Acesso DQ167578); Cryl lAal (Nº de Acesso AAA22352); Cryl 1Aa2 (Nº de Acesso AAA22611); Cry11Aa3 (Nº de Acesso CAD30081); Cry11Aa4 (Nº de Acesso AFB18319); CryllAa-like (Nº de Acesso DQ166531); CryllBal (Nº de Acesso CAA60504); CryllBbl (Nº de Acesso AAC97162); Cry11Bb2 (Nº de Acesso HM068615); Cry12Aal (Nº de Acesso AAA22355); Cry13Aal (Nº de Acesso AAA22356); Cry14Aal (Nº de Acesso AAA21516); Cry14Abl (Nº de Acesso KC156652); Cry15Aal (Nº de Acesso AAA22333); Cryl6Aal (Nº de Acesso CAA63860); Cry17Aal (Nº de Acesso CAA67841); Cry18Aal (Nº de Acesso CAA67506); Cryl8Bal (Nº de Acesso AAF89667); Cry18Cal (Nº de Acesso AAF89668); Cry19Aal (Nº de Acesso CAA68875); Cry19Bal (Nº de Acesso BAA32397); Cry19Cal (Nº de Acesso AFM37572); Cry20Aal (Nº de Acesso AAB93476); Cry20Bal (Nº de Acesso ACS93601); Cry20Ba2 (Nº de Acesso KC156694); Cry20-like (Nº de Acesso GQ144333); Cry21Aal (Nº de Acesso I32932); Cry21Aa2 (Nº de Acesso I66477); Cry21Bal (Nº de Acesso BAC06484); Cry21Cal (Nº de Acesso JF521577); Cry21Ca2

(Nº de Acesso KC156687); Cry21Dal (Nº de Acesso JF521578); Cry22Aal (Nº de Acesso I34547); Cry22Aa2 (Nº de Acesso CAD43579); Cry22Aa3 (Nº de Acesso ACD93211); Cry22Abl (Nº de Acesso AAK50456); Cry22Ab2 (Nº de Acesso CAD43577); Cry22Bal (Nº de Acesso CAD43578); Cry22Bbl (Nº de Acesso KC156672); Cry23Aal (Nº de Acesso AAF76375); Cry24Aal (Nº de Acesso AAC61891); Cry24Bal (Nº de Acesso BAD32657); Cry24Cal (Nº de Acesso CAJ43600); Cry25Aal (Nº de Acesso AAC61892); Cry26Aal (Nº de Acesso AAD25075); Cry27Aal (Nº de Acesso BAA82796); Cry28Aal (Nº de Acesso AAD24189); Cry28Aa2 (Nº de Acesso AAG00235); Cry29Aal (Nº de Acesso CAC80985); Cry30Aal (Nº de Acesso CAC80986); Cry30Bal (Nº de Acesso BAD00052); Cry30Cal (Nº de Acesso BAD67157); Cry30Ca2 (Nº de Acesso ACU24781); Cry30Dal (Nº de Acesso EF095955); Cry30Dbl (Nº de Acesso BAE80088); Cry30Eal (Nº de Acesso ACC95445); Cry30Ea2 (Nº de Acesso FJ499389); Cry30Fal (Nº de Acesso ACI22625); Cry30Gal (Nº de Acesso ACG60020); Cry30Ga2 (Nº de Acesso HQ638217); Cry31Aal (Nº de Acesso BABll 757); Cry31Aa2 (Nº de Acesso AAL87458); Cry31Aa3 (Nº de Acesso BAE79808); Cry31Aa4 (Nº de Acesso BAF32571); Cry31Aa5 (Nº de Acesso BAF32572); Cry31Aa6 (Nº de Acesso BA144026); Cry31Abl (Nº de Acesso BAE79809); Cry31Ab2 (Nº de Acesso BAF32570); Cry31Acl (Nº de Acesso BAF34368); Cry31Ac2 (Nº de Acesso AB731600); Cry31Adl (Nº de Acesso BA144022); Cry32Aal (Nº de Acesso AAG36711); Cry32Aa2 (Nº de Acesso GU063849); Cry32Abl (Nº de Acesso GU063850); Cry32Bal (Nº de Acesso BAB78601); Cry32Cal (Nº de Acesso BAB78602); Cry32Cbl (Nº de Acesso KC156708); Cry32Dal (Nº de Acesso BAB78603); Cry32Eal (Nº de Acesso GU324274); Cry32Ea2 (Nº de Acesso KC156686); Cry32Ebl (Nº de Acesso KC156663); Cry32Fal (Nº de Acesso KC156656); Cry32Gal (Nº de Acesso

KC156657); Cry32Hal (Nº de Acesso KC156661); Cry32Hbl (Nº de Acesso KC156666); Cry32Ial (Nº de Acesso KCl 56667); Cry32Jal (Nº de Acesso KCl 56685); Cry32Kal (Nº de Acesso KCl 56688); Cry32Lal (Nº de Acesso KC156689); Cry32Mal (Nº de Acesso KC156690); Cry32Mbl (Nº de Acesso KC156704); Cry32Nal (Nº de Acesso KC156691); Cry32Oal (Nº de Acesso KC156703); Cry32Pal (Nº de Acesso KC156705); Cry32Qal (Nº de Acesso KC156706); Cry32Ral (Nº de Acesso KC156707); Cry32Sal (Nº de Acesso KC156709); Cry32Tal (Nº de Acesso KC156710); Cry32Ual (Nº de Acesso KC156655); Cry33Aal (Nº de Acesso AAL26871); Cry34Aal (Nº de Acesso AAG50341); Cry34Aa2 (Nº de Acesso AAK64560); Cry34Aa3 (Nº de Acesso AAT29032); Cry34Aa4 (Nº de Acesso AAT29030); Cry34Abl (Nº de Acesso AAG41671); Cry34Acl (Nº de Acesso AAG50118); Cry34Ac2 (Nº de Acesso AAK64562); Cry34Ac3 (Nº de Acesso AAT29029); Cry34Bal (Nº de Acesso AAK64565); Cry34Ba2 (Nº de Acesso AAT29033); Cry34Ba3 (Nº de Acesso AAT29031); Cry35Aal (Nº de Acesso AAG50342); Cry35Aa2 (Nº de Acesso AAK64561); Cry35Aa3 (Nº de Acesso AAT29028); Cry35Aa4 (Nº de Acesso AAT29025); Cry35Abl (Nº de Acesso AAG41672); Cry35Ab2 (Nº de Acesso AAK64563); Cry35Ab3 (Nº de Acesso AY536891); Cry35Acl (Nº de Acesso AAG50117); Cry35Bal (Nº de Acesso AAK64566); Cry35Ba2 (Nº de Acesso AAT29027); Cry35Ba3 (Nº de Acesso AAT29026); Cry36Aal (Nº de Acesso AAK64558); Cry37 Aal (Nº de Acesso AAF76376); Cry38Aal (Nº de Acesso AAK64559); Cry39Aal (Nº de Acesso BAB72016); Cry40Aal (Nº de Acesso BAB72018); Cry40Bal (Nº de Acesso BAC77648); Cry40Cal (Nº de Acesso EU381045); Cry40Dal (Nº de Acesso ACF15199); Cry41Aal (Nº de Acesso BAD35157); Cry41Abl (Nº de Acesso BAD35163); Cry41Bal (Nº de Acesso HM461871); Cry41Ba2 (Nº de Acesso ZP _04099652); Cry42Aal (Nº de Acesso BAD35166);

Cry43Aal (Nº de Acesso BAD15301); Cry43Aa2 (Nº de Acesso BAD95474); Cry43Bal (Nº de Acesso BAD15303); Cry43Cal (Nº de Acesso KC156676); Cry43Cbl (Nº de Acesso KC156695); Cry43Ccl (Nº de Acesso KC156696); Cry43-like (Nº de Acesso BAD15305); Cry44Aa (Nº de Acesso BAD08532); Cry45Aa (Nº de Acesso BAD22577); Cry46Aa (Nº de Acesso BAC79010); Cry46Aa2 (Nº de Acesso BAG68906); Cry46Ab (Nº de Acesso BAD35170); Cry47 Aa (Nº de Acesso AAY24695); Cry48Aa (Nº de Acesso CAJ18351); Cry48Aa2 (Nº de Acesso CAJ86545); Cry48Aa3 (Nº de Acesso CAJ86546); Cry48Ab (Nº de Acesso CAJ86548); Cry48Ab2 (Nº de Acesso CAJ86549); Cry49Aa (Nº de Acesso CAH56541); Cry49Aa2 (Nº de Acesso CAJ86541); Cry49Aa3 (Nº de Acesso CAJ86543); Cry49Aa4 (Nº de Acesso CAJ86544); Cry49Abl (Nº de Acesso CAJ86542); Cry50Aal (Nº de Acesso BAE86999); Cry50Bal (Nº de Acesso GU446675); Cry50Ba2 (Nº de Acesso GU446676); Cry51Aal (Nº de Acesso AB114444); Cry51Aa2 (Nº de Acesso GU570697); Cry52Aal (Nº de Acesso EF613489); Cry52Bal (Nº de Acesso FJ361760); Cry53Aal (Nº de Acesso EF633476); Cry53Abl (Nº de Acesso FJ361759); Cry54Aal (Nº de Acesso ACA52194); Cry54Aa2 (Nº de Acesso GQ140349); Cry54Bal (Nº de Acesso GU446677); Cry55Aal (Nº de Acesso ABW88932); Cry54Abl (Nº de Acesso JQ916908); Cry55Aa2 (Nº de Acesso AAE33526); Cry56Aal (Nº de Acesso ACU57499); Cry56Aa2 (Nº de Acesso GQ483512); Cry56Aa3 (Nº de Acesso JX025567); Cry57Aal (Nº de Acesso ANC87261); Cry58Aal (Nº de Acesso ANC87260); Cry59Bal (Nº de Acesso JN790647); Cry59Aal (Nº de Acesso ACR43758); Cry60Aal (Nº de Acesso ACU24782); Cry60Aa2 (Nº de Acesso EA057254); Cry60Aa3 (Nº de Acesso EEM99278); Cry60Bal (Nº de Acesso GU810818); Cry60Ba2 (Nº de Acesso EA057253); Cry60Ba3 (Nº de Acesso EEM99279); Cry61Aal (Nº de Acesso HM035087); Cry61Aa2 (Nº de

Acesso HM132125); Cry61Aa3 (Nº de Acesso EEM19308); Cry62Aal (Nº de Acesso HM054509); Cry63Aal (Nº de Acesso BA144028); Cry64Aal (Nº de Acesso BAJ05397); Cry65Aal (Nº de Acesso HM461868); Cry65Aa2 (Nº de Acesso ZP_04123838); Cry66Aal (Nº de Acesso HM485581); Cry66Aa2 (Nº de Acesso ZP _04099945); Cry67Aal (Acces-sion #HM485582); Cry67Aa2 (Nº de Acesso ZP_04148882); Cry68Aal (Nº de Acesso HQ113114); Cry69Aal (Nº de Acesso HQ401006); Cry69Aa2 (Nº de Acesso JQ821388); Cry69Abl (Nº de Acesso JN209957); Cry70Aal (Nº de Acesso JN646781); Cry70Bal (Nº de Acesso AD051070); Cry70Bbl (Nº de Acesso EEL67276); Cry71Aal (Nº de Acesso JX025568); Cry72Aal (Nº de Acesso JX025569); Cyt1Aa (Número de Acesso em GenBank X03182); Cyt1Ab (Número de Acesso em GenBank X98793); Cyt1B (Número de Acesso em GenBank U37196); Cyt2A (Número de Acesso em GenBank Z14147); e Cyt2B (Número de Acesso em GenBank U52043).

[00273] Exemplos de δ-endotoxinas também incluem, sem limitação, proteínas Cry1A das Patentes dos EUA Nos

5.880.275, 7.858.849, 8.530.411, 8.575.433 e 8.686.233; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (deleção do terminal-N de variantes de a-hélice 1 e/ou a-hélice 2 de proteínas cry como, por exemplo, Cry1A, Cry3A) das Patentes dos EUA Nos 8.304.604,

8.304.605 e 8.476.226; Cry1B do Pedido de Patente dos EUA Nº de Série 10/525.318; Cry1C da Patente dos EUA Nº 6.033.874; Cry1F das Patentes dos EUA Nos 5.188.960 e 6.218.188; quimeras Cry1A/F das Patentes dos EUA Nos 7.070.982;

6.962.705 e 6.713.063); uma proteína Cry2 como, por exemplo, proteína Cry2Ab da Patente dos EUA Nº 7.064.249); uma proteína Cry3A incluindo, sem limitação, uma proteína inseticida híbrida modificada geneticamente (eHIP) criada por fusão de combinações únicas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes (Publicação do Pedido de Patente dos EUA Número 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma proteína Cry6; proteína Cry8s das Patentes dos EUA Nos

7.329.736, 7.449.552, 7.803.943, 7.476.781, 7.105.332,

7.378.499 e 7.462.760; uma proteína Cry9 como, por exemplo, membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9F incluindo, sem limitação, a proteína Cry9D da Patente dos EUA Nº 8.802.933 e a proteína Cry9B da Patente dos EUA Nº 8.802.934; uma proteína Cry15 de Naimov, e cols., (2008), Applied and Environmental Microbiology, 74: 7.145-7.151; uma proteína Cry22, uma proteína Cry34Abl das Patentes dos EUA Nos 6.127.180. 6.624.145 e 6.340.593; proteínas CryET33 e cryET34 das Patentes dos EUA Nos 6.248.535, 6.326.351,

6.399.330, 6.949.626, 7.385.107 e 7.504.229; uma CryET33 e homólogos de CryET34 da Publicação de Patente dos EUA Número 2006/0191034, 2012/0278954, e Publicação PCT Número WO 2012/139004; a proteína Cry35Abl das Patentes dos EUA Nos

6.083.499, 6.548.291 e 6.340.593; uma proteína Cry46, uma proteína Cry 51, uma toxina binária de Cry; uma TIC901 ou toxina relacionada; TIC807 da Publicação do Pedido de Patente dos EUA Número 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 de PCT US 2006/033867; toxinas TIC853 da Patente dos EUA Nº 8.513.494, AXMI-027, AXMI-036 e AXMI- 038 da Patente dos EUA Nº 8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 da Patente dos EUA Nº 7.923.602; AXMI- 018, AXMI-020 e AXMI-021 de WO 2006/083891; AXMI-010 de WO 2005/038032; AXMI-003 de WO 2005/021585; AXMI-008 da Publicação do Pedido de Patente dos EUA Número 2004/ 0250311;

AXMI-006 da Publicação do Pedido de Patente dos EUA Número 2004/0216186; AXMI-007 da Publicação do Pedido Patente dos EUA Número 2004/0210965; AXMI-009 do Pedido de Patente dos EUA Número 2004/0210964; AXMI-014 da Publicação do Pedido de Patente dos EUA Número 2004/0197917; AXMI-004 da Publicação do Pedido de Patente dos EUA Número 2004/0197916; AXMI-028 e AXMI-029 de WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI- 0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 e AXMI-004 de WO 2004/074462; AXMI-150 da Patente dos EUA Nº 8,084,416; AXMI-205 da Publicação do Pedido de Patente dos EUA Número 2011/0023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 e AXMI-064 da Publicação do Pedido de Patente dos EUA Número 2011/0263488; AXMI-Rl e proteínas relacionadas da Publicação do Pedido de Patente dos EUA Número 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z e AXMI225z de WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 e AXMI231 de WO 2011/103247 e Patente dos EUA Nº 8.759.619; AXMI-115, AXMI- 113, AXMI-005, AXMI-163 e AXMI-184 da Patente dos EUA Nº

8.334.431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 e AXMI-045 da Publicação do Pedido de Patente dos EUA Número 2010/0298211; AXMI-066 e AXMI-076 da Publicação do Pedido de Patente dos EUA Número 2009/0144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182,

AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 da Patente dos EUA Nº 8.318.900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 da Publicação do Pedido de Patente dos EUA Número 2010/0005543, AXMI270 da Publicação do Pedido de Patente dos EUA US20140223598, AXMI279 da Publicação do Pedido de Patente dos EUA US20140223599, proteínas cry como, por exemplo, Cry1A e Cry3A, que possuem locais proteolíticos modificados da Patente dos EUA Nº 8.319.019; uma proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa e Cry1Ca de Bacillus thuringiensis cepa VBTS 2528 da Publicação do Pedido de Patente dos EUA Número 2011/0064710. Outras proteínas Cry são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Veja, N. Crickmore, e cols., “Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, (1998) Vol. 62: 807-813; veja também, N. Crickmore, e cols., “Bacillus thuringiensis Toxin Nomenclature” (2016), em http://www.btnomenclature.info/.

[00274] O uso de proteínas Cry como traços transgênicos de plantas é bem conhecido por aqueles versados na técnica e plantas Cry-transgênicas incluindo, sem limitação, plantas que expressam CrylAc, Cry1Ac+Cry2Ab, CrylAb, CrylA.105, CrylF, Cry1Fa2, CrylF+CrylAc, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bbl, Cry34Abl, Cry35Abl, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-Bt, receberam aprovação reguladora. Veja,

Sanahuja e cols., “Bacillus thuringiensis: a Century of Research, Development and Commercial Applications”, (2011) Plant Biotech. Journal, Abril 9 (3): 283-300 e o “CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment” (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. em cera- gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, que pode ser acessado na Internet usando o prefixo “www”). Mais de uma proteína pesticida bem conhecida por aqueles versados na técnica também pode ser expressa em plantas como, por exemplo, Vip3Ab e CrylFa (US2012/0317682); CrylBE e CrylF (US2012/0311746); CrylCA e CrylAB (US2012/ 0311745); CrylF e CryCa (US2012/0317681); CrylDA& CrylBE (US2012/0331590); CrylDA e CrylFa (US2012/ 0331589); CrylAB e CrylBE (US2012/0324606); CrylFa e Cry2Aa e Cryll e CrylE (US2012/0324605); Cry34Ab/35Ab e Cry6Aa (US20130167269); Cry34Ab/ VCry35Ab e Cry3Aa (US20130167268); CrylAb e CrylF (US20140182018); e Cry3A e CrylAb ou Vip3Aa (US20130116170). Proteínas pesticidas também incluem lipases inseticidas, incluindo lipídeo acil hidrolases da Patente dos EUA Nº

7.491.869, e colesterol oxidases, por exemplo, de Streptomyces (Purcell e cols. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 15: 1.406-1.413).

[00275] Proteínas pesticidas também incluem toxinas VIP (proteínas inseticidas vegetativas). Bactérias entomopatogênicas produzem proteínas inseticidas que se acumulam em corpos de inclusão ou cristais paraesporais (por exemplo, as proteínas Cry e Cyt mencionadas anteriormente), bem como proteínas inseticidas que são secretadas no meio de cultura. Entre as últimas estão as proteínas Vip, que são divididas em quatro famílias de acordo com sua identidade de aminoácido. As proteínas Vip1 e Vip2 atuam como toxinas binárias e são tóxicas para alguns membros dos Coleoptera e Hemiptera. Acredita-se que o componente Vip1 se ligue aos receptores na membrana do intestino médio do inseto, e o componente Vip2 entra na célula, onde exibe sua atividade de ADP-ribosiltransferase contra actina, evitando a formação de microfilamento. Vip3 não possui similaridade de sequência para Vip1 ou Vip2 e é tóxica para uma ampla variedade de membros dos Lepidoptera. Foi demonstrado que seu modo de ação lembra aquele das proteínas Cry em termos de ativação proteolítica, ligação à membrana epitelial do intestino médio, e formação de poro, embora proteínas Vip3A não compartilhem locais de ligação com proteínas Cry. As últimas propriedades as tornam bons candidatas para serem combinadas com proteínas Cry em plantas transgênicas (cultivos tratados com Bacillus thuringiensis [culturas Bt]) para evitar ou retardar a resistência do inseto e para ampliar o espectro inseticida. Há variedades desenvolvidas comercialmente de algodão Bt e milho Bt que expressam a proteína Vip3Aa em combinação com proteínas Cry. Para a família mais recentemente relatada Vip4, “ainda não foi encontrado nenhum inseto-alvo”. Veja, Chakroun e cols., “Bacterial Vegetative Inseticidal Proteins (Vip) from Entomopathogenic Bacteria”, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2 de março de 2016; 80 (2): 329-

350. VIPs podem ser encontradas nas Patentes dos EUA Nos

5.877.012, 6.107.279 6.137.033, 7.244.820, 7.615.686 e

8.237.020 e semelhantes. Outras proteínas VIP são bem conhecidas por aqueles versados na técnica (veja, lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, que pode ser acessado na Internet usando o prefixo “www”).

[00276] Proteínas pesticidas também incluem proteínas do complexo de toxina (TC), que podem ser obtidas de organismos como, por exemplo, Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (veja as Patentes dos EUA Nos 7.491.698 e

8.084.418). Algumas proteínas TC possuem atividade inseticida “autônoma” e outras proteínas TC aumentam a atividade das toxinas autônomas produzidas pelo mesmo organismo. A toxicidade de uma proteína TC “autônoma” (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser aumentada por um ou mais “potencializadores” da proteína TC derivados de um organismo-fonte de um gênero diferente. Há três tipos principais de proteínas TC. Como referidas nesse relatório descritivo, proteínas Classe A (“Proteína A”) são toxinas autônomas. Proteínas Classe B (“Proteína B”) e proteínas Classe C (“Proteína C”) aumentam a toxicidade de proteínas Classe A. Exemplos de proteínas Classe A são TcbA, TcdA, XptA1 e XptA2. Exemplos de proteínas Classe B são TcaC, TcdB, XptB1Xb e XptC1Wi. Exemplos de proteínas Classe C são TccC, XptC1Xb e XptB1Wi. Proteínas pesticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e escorpião. Exemplos de peptídeos de veneno de aranha incluem, sem limitação, peptídeos de licotoxina-1 e mutantes desta (Patente dos EUA Nº 8.334.366).

[00277] Alguns PIPs atualmente registrados estão listados na Tabela 11. Plantas transgênicas também foram modificadas geneticamente para expressar dsRNA dirigido contra genes de inseto (Baum, J.A. e cols. (2007) “Control of Coleopteran Insect Pests Through RNA Interference”. Nature Biotechnology 25: 1.322-1.326; Mao, Y.B. e cols. (2007) “Silencing a Cotton Bollworm P450 Monooxygenase Gene by Plantmediated RNAi Impairs Larval Tolerance of Gossypol”. Nature Biotechnology 25: 1.307-1.313). A interferência de RNA pode ser desencadeada na praga por alimentação de praga na planta transgênica. A alimentação da praga, dessa forma, causa lesão ou morte da praga. Tabela 11. Lista de protetores incorporados em plantas exemplares, que podem ser combinados com micróbios da revelação.

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida Batata Batata Cry3A Batata Código PC Naturemark 524-474 006432 New Leaf Monsanto Cry3A & PLRV Batata Monsanto 524-498 Códigos PC 006432, 006469 New Leaf Plus Milho Cry1Ab Milho Evento 176 Mycogen 68467-1 Código PC 006458 Seeds/Dow Agro 66736-1 Syngenta Seeds Cry1Ab Milho Evento Bt11 EPA Agrisure CB 67979-1 Código PC 006444 (com 65268-1 Identificador Único OECD Yieldgard) SYN-BTØ11-1, Attribute Insect Protected

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida

Sweet Corn Syngenta Seeds

Cry1Ab Milho Evento MON 801 Monsanto 524-492

Cry1Ab Evento de milho MON Monsanto 524-489 810 Código PC 006430 Identificador Único OECD MON-ØØ81Ø-6

Cry1Ac Milho Código PC Dekalb 69575-2 006463 Genetics a/c Monsanto BT-XTRA

Cry1F Evento de milho TC1507 Mycogen 68467-2 Código PC 006481 Seeds/Dow Agro 29964-3 Identificador Único OECD Pioneer Hi- DAS-Ø15Ø7-1 Bred/Dupont moCry1F Evento de milho DAS- Mycogen 68467-4 Ø6275-8 Código PC 006491 Seeds/Dow Agro Identificador Único OECD DAS-Ø6275-8

Cry9C Milho Aventis 264-669

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida

StarLink

Cry3Bb1 Evento de milho Monsanto 524-528 MON863 Código PC 006484 YielGard RW Identificador Único OECD MON-ØØ863-5

Cry3Bb1 Evento de milho MON Monsanto 524-551 88017 Código PC 006498 YieldGrad VT Identificador Único OECD Rootworm MON-88Ø17-3

Cry34Ab1/Cry35Ab1 Evento de Mycogen 68467-5 milho DAS-591227-7 Seeds/Dow Agro 29964-4 Código PC 006490 Pioneer Hi- Identificador Único OECD Bred/Dupont DAS-59122-7 Herculex Rootworm

Cry34Ab1/Cry35Ab1 e Cry1F Pioneer Hi- 29964-17 Evento de milho 4114 Bred/Dupont Códigos PC 006555, 006556 mCry3A Evento de milho MIR Syngenta Seeds 67979-5 604 Agrisure RW Código PC 006509 Identificador Único OECD SYN-IR604-8

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida

Cry1A.105 e Cry2Ab2 Evento Monsanto 524-575 de milho MON 89034 Códigos Genuity VT PC 006515 e 006514 Double Pro

Vip3Aa20 Evento de milho MIR Syngenta Seeds 67979-14 162 Agrisure Código PC 006599 Viptera Identificador Único OECD SYN-IR162-4 eCry3.1Ab milho no Evento Syngenta 67979-22 5307 Código PC 016483 Identificador Único OECD SYN-Æ53Æ7-1

Eventos estaqueados e Milho de Mistura de Sementes

MON863 x MON810 com Cry3Bb1 Monsanto 524-545 + Cry1Ab YieldGard Plus

DAS-59122-7 x TC1507 com Mycogen 68467-6 Cry34Ab1/Cry35Ab1 + Cry1F Seeds/Dow Agro 29964-5 Pioneer Hi- Bred/Dupont Herculex Xtra

MON 88017 x MON 810 com Monsanto 524-552

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida

Cry1AB + Cry3Bb YieldGard VT Triple YieldGard VT Plus

MIR 604 x Bt11 com mCry3A + Syngenta 67979-8 Cry1Ab Agrisure CB/RW Agrisure 3000GT

Mon 89034 x Mon 88017 com Monsanto 524-576 Cry1A.105 + Cry2Ab2 + Genuity VT Cry3Bb1 Triple PRO

Bt11 x MIR 162 com Cry1Ab + Syngenta Seeds 67979-12 Vip3Aa 20 Agrisure 2100

Bt11 x MIR 162 x MIR 604 com Syngenta Seeds 67979-13 Cry1Ab + Vip3Aa20 + mCry3A Agrisure 3100

MON 89034 x TC1507 x MON Monsanto 524-581 88017 x DAS-59122-7 com Company 68467-7 Cry1A.105 + Cry2Ab2 + Cry1F Mycogen + Cry3Bb1 + Seeds/Dow Agro Cry34Ab1/Cry35Ab1 Genuity SmartStax SmartStax

MON 89034 x TC1507 x MON Monsanto 524-595 88017 x DAS-59122-7 Vejad Company 68467-16

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida

Blend Mycogen Seeds/Dow Agro Genuity SmartStax RIB Complete SmartStax Refuge Advanced; Refuge Advanced Powered by SmartStax

Mistura de sementes de Pioneer Hi- 29964-6 Herculex Xtra + Herculex I Bred/Dupont Optimum AcreMax1 Insect Protection

Mistura de sementes de Pioneer Hi- 29964-10 Herculex RW + Não-Bt milho Bred/Dupont Optimum AcreMax RW

(Cry1F x Cry34/35 x Cry1Ab) Pioneer Hi- 29964-11 - mistura de sementes Bred/Dupont Optimum

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida

AcreMax Xtra

(Cry1F x Cry1Ab) - mistura Pioneer Hi- 29964-12 de sementes Bred/Dupont Optimum AcreMax Insect Protection

(Cry1F x mCry3A) Pioneer Hi- 29964-13 Bred/Dupont Optimum Trisect

(Cry1F x Cry34/35 x Cry1Ab x Pioneer Hi- 29964-14 mCry3A) Bred/Dupont Optimum Intrasect Xtreme

59122 x MON 810 x MIR 604 Pioneer Hi- 29964-15 (Cry34/35 x Cry1Ab x mCry3A) Bred/Dupont

Optimum AcreMax Xtreme Pioneer Hi- 29964-16 (Cry1F x Cry34/35 x Cry1Ab x Bred/Dupont mCry3A) - mistura de Optimum sementes AcreMax Xtreme (mistura de sementes)

MON 810 x MIR 604 (Cry1Ab x Pioneer Hi- 29964-18

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida mCry3A) Bred/Dupont

1507 x MON810 x MIR 162 Pioneer Hi- 29964-19 (Cry1F x Cry1Ab x Vip 3Aa20) Bred/Dupont Optimum Intrasect Leptra

1507 x MIR 162 (Cry1F x Pioneer Hi- 29964-20 Vip30Aa20) Bred/Dupont

4114 x MON 810 x MIR 604 Pioneer Hi- 29964-21 (Cry34/35 x Cry1F x Cry1Ab x Bred/Dupont mCry3A) - mistura de sementes

4114 x MON 810 x MIR 604 Pioneer Hi- 29964-22 (Cry34/35 x Cry1F x Cry1Ab x Bred/Dupont mCry3A)

1507 x MON810 x MIR 604 Pioneer Hi- 29964-23 (Cry1F x Cry1Ab x mCry3A) - Bred/Dupont mistura de sementes Optimum AcreMax Trisect

1507 x MON810 x MIR 604 Pioneer Hi- 29964-24 (Cry1F x Cry1Ab x mCry3A) Bred/Dupont Optimum Intrasect

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida

Trisect

4114 x MON 810 (Cry34/35 x Pioneer Hi- 29964-25 Cry1F x Cry1Ab) Bred/Dupont

1507 x MON810 x MIR 162 Pioneer Hi- 29964-26 (Cry1F x Cry1Ab x Vip 3Aa20) Bred/Dupont - mistura de sementes Optimum AcreMax Leptra

Intermediários de SmartStax Monsanto 524-583, (8 produtos) 524-584, 524-586, 524 -587, 524- 588, 524- 589, 524 - 590

MON 89034 x 1507 (Cry1A.105 Monsanto 524-585 x Cry2Ab2 x Cry1F) Genuity PowerCore

MON 89034 (Cry1A.105 x Monsanto 524-597 Cry2Ab2) - mistura de Genuity VT sementes Double PRO RIB Complete

MON 89034 x 88017 RIB Monsanto 524-606 Completo (Cry1A.105 x Genuity VT Cry2Ab2 x Cry3Bb1) - mistura Triple PRO RIB

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida de sementes Complete

MON 89034 x 1507 (Cry1A.105 Monsanto 524-612 x Cry2Ab2 x Cry1F) - mistura Genuity de sementes PowerCore RIB Complete

Bt11 x MIR162 x 1507 (Cry1Ab Syngenta Seeds 67979-15 x Vip3Aa20 x Cry1F) Agrisure Viptera 3220 Refuge Renew

Bt11 x 59122-7 x MIR 604 x Syngenta Seeds 67979-17 1507 (Cry1Ab x Cry34/35 x Agrisure 3122 mCry3A x Cry1F)

Bt11 x MIR162 x TC1507 Syngenta Seeds 67979-19 (Cry1Ab x Vip3Aa20 x Cry1F) Agisure - mistura de sementes Viptera 3220 (E-Z Refuge) (Refuge Advanced)

Bt11 x DAS 59122-7 x MIR604 Syngenta Seeds 67979-20 x TC1507 (Cry1Ab x Cry34/35 Agisure x mCry3A x Cry1F) - mistura Viptera 3122 de sementes (E-Z Refuge) (Refuge Advanced)

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida

Bt11 x MIR 162 x MIR 604 x Syngenta Seeds 67979-23 TC1507 x 5307 (Cry1Ab x Agrisure Vip3Aa20 x mCry3A x Cry1F x Duracade eCry3.1Ab) (Refuge Renew) 5222

Bt11 x MIR 604 x TC1507 x Syngenta Seeds 67979-24 5307 (Cry1Ab x mCry3A x Agrisure Cry1F x eCry3.1Ab) Duracade (Refuge Renew) 5122

Bt11 x MIR 604 x TC1507 x Syngenta Seeds 67979-25 5307 (Cry1Ab x mCry3A x Agisure Cry1F x eCry3.1Ab) - mistura Duracade 5122 de sementes E-Z Refuge

Bt11 x MIR 162 x MIR 604 x Syngenta Seeds 67979-26 TC1507 x 5307 (Cry1Ab x Agisure Vip3Aa20 x mCry3A x Cry1F x Duracade 5222 eCry3.1Ab) - mistura de E-Z Refuge sementes

Bt11 x MIR 162 x MIR 604 x Syngenta Seeds 67979-27 TC1507 x 5307 (Cry1Ab x Agrisure Vip3Aa20 x mCry3A x Cry1F x Duracade eCry3.1Ab) (Refuge Renew) 5022

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida

MIR604 x DAS-59122-7 x Syngenta Seeds 67979-29 TC1507 (mCry3A x Cry34/35 x Cry1F)

Intermediários de SmartStax Mycogen 68467-8, (8 produtos) Seeds/Dow Agro 68467-9, 68467-10, 68467-11, 68467-13, 68467-14, 68467-15

MON 89034 x 1507 (Cry1A.105 Mycogen 68467-12 x Cry2Ab2 x Cry1F) Seeds/Dow Agro PowerCore; PowerCore Enlist

MON 89034 x 1507 (Cry1A.105 Mycogen 68467-21 x Cry2Ab2 x Cry1F) - mistura Seeds/Dow Agro de sementes PowerCore Refuge Advanced; Refuge Advanced Powered by PowerCore

1507 x MON 810 Pioneer Hi- 29964-7

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida

Bred/Dupont Optimum Intrasect

59122 x 1507 x MON 810 Pioneer Hi- 29964-8 Bred/Dupont

59122 x MON 810 Pioneer Hi- 29964-9 Bred/Dupont

Algodão

Cry1Ac Algodão Monsanto 524-478 BollGard

Cry1Ac e Cry2Ab2 no Evento Monsanto 524-522 15985 Algodão Códigos PC BollGard II 006445, 006487

Bt algodão Evento MON531 com Monsanto 524-555 Cry1Ac (uso somente em viveiro de reprodução)

Bt algodão Evento MON15947 Monsanto 524-556 com Cry2Ab2 (uso somente em viveiro de reprodução)

COT102 x MON 15985 (Vip3Aa19 Monsanto 524-613 x Cry1Ac x Cry2Ab2) Bollgard III

Cry1F e Cry1Ac (Events DAS- Mycogen 68467-3 21023-5 x DAS-24236-5) Seeds/Dow Agro

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida

Algodão Códigos PC 006512, Widestrike 006513

Evento 3006-210-23 (Cry1Ac) Mycogen 68467-17 Seeds/Dow Agro

Evento 281-24-236 (Cry1F) Mycogen 68467-18 Seeds/Dow Agro

WideStrike x COT102 (Cry1F x Mycogen 68467-19 Cry1Ac x Vip3Aa19) Seeds/Dow Agro WideStrike 3

Vip3Aa19 e FLCry1Ab (Events Syngenta Seeds 67979-9 Cot102xCot67B) Algodão (Formally Códigos PC 016484, 016486 VipCot) Identificador Único OECD SYN-IR102-7 X SYN-IR67B-1

COT102 (Vip3Aa19) Syngenta Seeds 67979-18

COT67B (FLCry1Ab) Syngenta Seeds 67979-21

T304-40 (Cry1Ab) Bayer 264-1094 CropScience

GHB119 (Cry2Ae) Bayer 264-1095 CropScience

T304-40 x GHB119 (Cry1Ab x Bayer 264-1096 Cry2Ae) CropScience Identificador Único OECD: TwinLink

Protetores incorporados em Empresa e Números de plantas (PIPs) Nomes registro de Comerciais Pesticida BCS-GHØØ4-7 x BCS-GHØØ5-8 Soja Cry1Ac no Evento 87701 Soja Monsanto 524-594 Código PC 006532 Inacta Identificador Único OECD Cry1A.105 e Cry2Ab2 no Monsanto 524-619 Evento 87751 Soja Códigos PC 006614, 006615 Identificador Único OECD MON-87751-7 Cry1Ac x Cry1F no Evento DAS Mycogen 68467-20 81419 Soja Códigos PC Seeds/Dow Agro 006527, 006528 Identificador Único OECD DAS 81419 (Cry1Ac x Cry1F)

[00278] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos pesticidas apresentados nesse relatório descritivo podem ser utilizados com qualquer um ou mais dos micróbios da revelação e podem ser aplicados às plantas ou partes destas, incluindo sementes. Herbicidas

[00279] Como mencionado anteriormente, composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo, são, algumas vezes, combinadas com um ou mais herbicidas.

[00280] Composições que compreendem bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com métodos descritos nesse relatório descritivo e/ou que possuem características como descritas nesse relatório descritivo podem ainda incluir um ou mais herbicidas. Em algumas modalidades, as composições herbicidas são aplicadas às plantas e/ou partes de plantas. Em algumas modalidades, as composições herbicidas podem ser incluídas nas composições apresentadas nesse relatório descritivo, e podem ser aplicadas a uma planta (ou plantas) ou a uma parte (ou partes) desta simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos.

[00281] Herbicidas incluem 2,4-D, 2,4-DB, acetoclor, acifluorfeno, alaclor, ametrina, atrazina, aminopiralid, benefin, bensulfuron, bensulida, bentazona, biciclopirona, bromacil, bromoxinil, butilato, carfentrazona, clorimuron, clorsulfuron, cletodim, clomazona, clopiralid, cloransulam, cicloato, DCPA, desmedifam, dicamba, diclobenil, diclofop, diclosulam, diflufenzopir, dimetenamid, diquat, diuron, DSMA, endotall, EPTC, etalfluralina, etofumesato, fenoxaprop, fluazifop-P, flucarbazona, flufenacet, flumetsulam, flumiclorac, flumioxazina, fluometuron, fluroxipir, fomesafen, foramsulfuron, glufosinato, glifosato, halossulfuron, hexazinona, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazaquina, imazetapir, isoxaflutol, lactofeno, linuron, MCPA, MCPB, mesotriona, metolaclor-s, metribuzina, indaziflam, metsulfuron, molinato, MSMA, napropamida, naptalam, nicossulfuron, norflurazon, oxizalin, oxadiazon, oxifluorfeno, paraquat, ácido pelargônico, pendimetalina, fenmedifam, picloram, primissulfuron, prodiamina, prometrina, pronamida, propanil, prossulfuron,

pirazon, piritioac, quinclorac, quizalofop, rimsulfuron, S- metolaclor, setoxidim, siduron, simazina, sulfentrazona, sulfometuron, sulfosulfuron, tebutiuron, tembotriona, terbacil, tiazopir, tifensulfuron, tiobencarbe, topramezona, tralkoxidim, experimentolato, triassulfuron, tribenuron, triclopir, trifluralina e triflussulfuron.

[00282] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos herbicidas apresentados nesse relatório descritivo podem ser utilizados com qualquer uma ou mais das plantas ou partes destas apresentadas nesse relatório descritivo.

[00283] Produtos herbicidas podem incluir CORVUS, BALANCE FLEXX, CAPRENO, DIFLEXX, LIBERTY, LAUDIS, AUTUMN SUPER e DIFLEXX DUO.

[00284] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos herbicidas apresentados na Tabela 12 abaixo podem ser utilizados com qualquer um ou mais dos micróbios ensinados nesse relatório descritivo, e podem ser aplicados a qualquer uma ou mais das plantas ou partes destas apresentadas nesse relatório descritivo.

Tabela 12. Lista de herbicidas exemplares, que podem ser combinados com micróbios da revelação.

Grupo herbici Local de ação Família química Herbicida da Inibidores de 1 Ciclohexanodionas Setoxidim (Poast, Poast Plus) ACCase Cletodim (Select, Select Max, Arrow) Ariloxifenoxipropion Fluazifop (Fusilade DX, componente atos em Fusion) Fenoxaprop (Puma, componente em Fusion) Quizalofop (Assure II, Targa) Fenilpirazolinas Pinoxaden (Axial XL) Inibidores de ALS 2 Imidazolinonas Imazetapir (Pursuit) Imazamox (Raptor) Sulfonilureias Clorimuron (Classic) Halossulfuron (Permit, Sandea) Iodossulfuron (componente em Autumn Super)

Grupo herbici Local de ação Família química Herbicida da Mesossulfuron (Osprey) Nicossulfuron (Accent Q) Primissulfuron (Beacon) Prossulfuron (Peak) Rimsulfuron (Matrix, Resolve) Tifensulfuron (Harmony) Tribenuron (Express) Triflusulfuron (UpBeet) Triazolopirimidina Flumetsulam (Python) Cloransulam-metil (FirstRate) Piroxsulam (PowerFlex HL) Florasulam (componente em Quelex) Sulfonilaminocarboni Propoxicarbeazona (Olympus) l-triazolinonas Tiencarbazona-metil (componente em Capreno)

Grupo herbici Local de ação Família química Herbicida da Inibidores de 3 Dinitroanilinas Trifluralina (muitos nomes) microtúbulo Etalfluralina (Sonalan) (inibidores de Pendimetalina (Prowl/Prowl H2O) raiz) Benzamida Pronamida (Kerb) Auxinas sintéticas 4 Arilpicolinato Halauxifeno (Elevore, componente em Quelex) Ácidos fenóxi 2,4-D (Enlist One, others) acéticos 2,4-DB (Butirac 200, Butoxona 200)

MCPA Ácidos benzóicos Dicamba (Banvel, Clarity, DiFlexx, Engenia, XtendiMax; componente em Status) Piridinas Clopiralid (Stinger) Fluroxipir (Starane Ultra)

Grupo herbici Local de ação Família química Herbicida da Inibidores do 5 Triazinas Atrazina fotossistema II Simazina (Princep, Sim-Trol) Triazinona Metribuzina (Metribuzin, others) Hexazinona (Velpar) Fenil-carbamatos Desmedifam (Betenex) Fenmedifam (componente em Betamix) Uracis Terbacil (Sinbar) 6 Benzotiadiazóis Bentazona (Basagran, others) Nitrilas Bromoxinil (Buctril, Moxy, others) 7 Fenilureias Linuron (Lorox, Linex)

Inibidor da síntese 8 Tiocarbamatos EPTC (Eptam) de lipídeo

Inibidor de EPSPS 9 Organofósforo Glifosato

Inibidor de 10 Organofósforo Glufosinato (Liberty, Rely) glutamina sintetase

Grupo herbici Local de ação Família química Herbicida da Inibidor da 13 Isoxazolidinona Clomazona (Command) biossíntese de diterpeno (branqueamento)

Inibidores de 14 Difeniléter Acifluorfeno (Ultra Blazer) protoporfirinogênio Fomesafeno (Flexstar, Reflex) oxidase (PPO) Lactofeno (Cobra, Phoenix) N-fenilftalimida Flumiclorac (Resource) Flumioxazina (Valor, Valor EZ, Rowel) Aril triazolinona Sulfentrazona (Authority, Spartan) Carfentrazona (Aim) Flutiacet-metil (Cadet) Pirazóis Piraflufen-etil (Vida) Pirimidinediona Saflufenacil (Sharpen)

Grupo herbici Local de ação Família química Herbicida da Inibidores de ácido 15 Acetamidas Acetoclor (Harness, Surpass NXT, graxo de cadeia Breakfree NXT, Warrant) longa Dimetenamid-P (Outlook) Metolaclor (Parallel) Piroxasulfona (Zidua, Zidua SC) s-metolaclor (Dual Magnum, Dual II Magnum, Cinch) Flufenacet (Define)

Local específico 16 Benzofuranos Etofumesato (Nortron) desconhecido

Inibidor do 19 Semicarbazona Diflufenzopir (componente em Status) transporte de auxina

Inibidores do 22 Bipiridiliums Paraquat (Gramoxone, Parazone) Fotossistema I Diquat (Reglone)

Grupo herbici Local de ação Família química Herbicida da Inibidores de 4– 27 Isoxazol Isoxaflutol (Balance Flexx) HPPD Pirazol Pirasulfotol (componente em Huskie) (branqueamento) Pirazolona Topramezona (Armezon/Impact) Tricetona Biciclopirona (componente em Acuron) Mesotriona (Callisto) Tembotriona (Laudis)

Fungicidas

[00285] Como mencionado anteriormente, composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo, são, algumas vezes, combinadas com um ou mais fungicidas.

[00286] Composições que compreendem bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com métodos descritos nesse relatório descritivo e/ou que possuem características como descritas nesse relatório descritivo podem ainda incluir um ou mais fungicidas. Em algumas modalidades, composições fungicidas podem ser incluídas nas composições apresentadas nesse relatório descritivo, e podem ser aplicadas a uma planta (ou plantas) ou a uma parte (ou partes) desta simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Os fungicidas incluem azoxistrobina, captan, carboxina, etaboxam, fludioxonil, mefenoxam, fludioxonil, tiabendazol, tiabendaz, ipconazol, mancozeb, ciazofamid, zoxamida, metalaxil, PCNB, metaconazol, piraclostrobina, Bacillus subtilis cepa QST 713, sedaxane, tiametoxam, fludioxonil, tiram, tolclofos-metil, trifloxistrobina, Bacillus subtilis cepa MBI 600, piraclostrobina, fluoxastrobina, Bacillus pumilus cepa QST 2808, clorotalonil, cobre, flutriafol, fluxapiroxad, mancozeb, gludioxonil, pentiopirad, triazol, propiconaozol, protioconazol, tebuconazol, fluoxastrobina, piraclostrobina, picoxistrobina, qóis, tetraconazol, trifloxistrobina, ciproconazol, flutriafol, SDHI, EBDCs, sedaxane, MAXIM QUATTRO (gludioxonil, mefenoxam, azoxistrobina e tiabendaz), RAXIL (tebuconazol, protioconazol, metalaxil e alquil aminas etoxiladas de sebo), e benzovindiflupir.

[00287] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos fungicidas apresentados nesse relatório descritivo podem ser utilizados com qualquer uma ou mais das plantas ou partes destas apresentadas nesse relatório descritivo. Hormônios

[00288] Como mencionado anteriormente, composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo, são, algumas vezes, combinadas com um ou mais hormônios.

[00289] Composições que compreendem bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com métodos descritos nesse relatório descritivo e/ou que possuem características como descritas nesse relatório descritivo podem ainda incluir um ou mais hormônios. Em algumas modalidades, composições de hormônio são aplicadas às plantas e/ou partes de plantas. Em algumas modalidades, composições de hormônio podem ser incluídas nas composições apresentadas nesse relatório descritivo, e podem ser aplicadas a uma planta (ou plantas) ou a uma parte (ou partes) desta simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos.

[00290] Hormônios incluem, sem limitação, auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abscísico, etileno, brassinoesteróides, ácido jasmônico, estrigolactonas, e miméticos (“mimics”) químicos de estrigolactona.

[00291] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos hormônios apresentados nesse relatório descritivo podem ser utilizados com qualquer uma ou mais das plantas ou partes destas apresentadas nesse relatório descritivo.

Estrigolactonas

[00292] Como mencionado anteriormente, composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo, são, algumas vezes, combinadas com um ou mais estrigolactona ou miméticos químicos de estrigolactona. Esses compostos são descritos em PCT/US2016/029080, depositado em 23 de abril de 2016, e intitulado: “Methods for Hydraulic Enhancement of Crops”, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência. Eles são adicionalmente descritos na Patente dos EUA Nº

9.994.557, concedida em 12 de junho de 2018, e intitulada: “Strigolactone Formulations and Uses Thereof”, que é incorporada nesse relatório descritivo por referência.

[00293] Em algumas modalidades, a estrigolactona é um composto de Fórmula (I), um sal, solvato, polimorfo, estereoisômero ou isômero deste: em que: a, b e c são um dos seguintes: Fórmula (I) i. a é 0 ou 2, e b e c são, cada um independentemente, 0, 1 ou 2; ii. a é 1, b é 0, e c é 0 ou 2; iii. a é 1, b é 1, e c é 1 ou 2; ou iv. a é 1, b é 2, e c é 0, 1 ou 2; cada A é independentemente O ou S; cada E é independentemente O, S ou –NR18; cada G é independentemente C; R5, R6, R11, R12, R14, R15 e R17 são, cada um independentemente, H, alquil, haloalquil, amino, halo, ou – OR18 ou um par de elétrons único; R1 e R16 são, cada um independentemente, H, alquil, haloalquil, amino, halo, ou –OR18; ou R4 e R13 juntos formam uma ligação direta para fornecer uma ligação dupla; cada R18 é independentemente H, alquil, haloalquil, aril, heteroaril, –C(O)R19 ou e cada R19 é independentemente H, alquil, haloalquil, aril ou heteroaril.

Em algumas modalidades, a estrigolactona é um composto de Fórmula (1), um sal, solvato, ou isômero, deste, em que:

cada E é independentemente O, S ou –NR7; cada G é independentemente C ou N; R1, R4, R5 e R6 são, cada um independentemente, H, amino, halo, alquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído, substituído ou não substituído heteroalquil, arilalquil substituído ou não substituído, heteroaril substituído ou não substituído, heteroarilalquil substituído ou não substituído, cicloalquil substituído ou não substituído, heterocicloalquil substituído ou não substituído, -OR8, -C(O)R8,

ou um par de elétrons único, em que indica uma ligação simples; R2 e R3 são, cada um independentemente, H, amino, halo, alquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído, substituído ou não substituído heteroalquil, arilalquil substituído ou não substituído, heteroaril substituído ou não substituído, heteroarilalquil substituído ou não substituído, cicloalquil substituído ou não substituído ou heterocicloalquil substituído ou não substituído, ou um par de elétrons único; ou R2 e R3 juntos formam uma ligação, ou formam um aril substituído ou não substituído; e R7 e R8 são, cada um independentemente, H, amino, halo, alquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído, substituído ou não substituído heteroalquil, arilalquil substituído ou não substituído, heteroaril substituído ou não substituído, heteroarilalquil substituído ou não substituído, cicloalquil substituído ou não substituído ou heterocicloalquil substituído ou não substituído.

[00294] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos estrigolactonas ou miméticos de estrigolactona apresentados nesse relatório descritivo podem ser utilizados com qualquer uma ou mais das plantas ou partes destas apresentadas nesse relatório descritivo.

[00295] Em algumas modalidades do método, a combinação de composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo, com uma ou mais estrigolactonas ou miméticos químicos de estrigolactona, um rendimento da planta contactada é estendido, quando comparada com uma planta não contactada, uma murchidão da planta contactada é reduzida ou retardada, quando comparada com uma planta não contactada, uma turgidez da planta contactada é prolongada ou mantida, quando comparada com uma planta não contactada, uma perda de uma ou mais pétalas da planta contactada é reduzida ou retardada, quando comparada com uma planta não contactada, um teor de clorofila da planta contactada é mantido, quando comparada com uma planta não contactada, uma perda do teor de clorofila da planta contactada é reduzida ou retardada, quando comparada com uma planta não contactada, um teor de clorofila da planta contactada é aumentado, quando comparada com uma planta não contactada, uma tolerância à salinidade da planta contactada é aumentada, quando comparada com uma planta não contactada, um consumo de água da planta contactada é reduzido, quando comparada com uma planta não contactada, uma tolerância à seca da planta contactada é aumentada, quando comparada com uma planta não contactada, uma resistência a pragas da planta contactada é aumentada,

quando comparada com uma planta não contactada, um consumo de pesticidas da planta contactada é reduzido, quando comparada com uma planta não contactada, ou qualquer combinação destes.

[00296] Em uma modalidade do método, um rendimento da planta contactada é aumentado, quando comparada com uma planta não contactada.

[00297] Em outra modalidade do método, uma vida da planta contactada é estendida, quando comparada com uma planta não contactada.

[00298] Em outra modalidade do método, uma murchidão da planta contactada é reduzida ou retardada, quando comparada com uma planta não contactada.

[00299] Em outra modalidade do método, uma murchidão da planta contactada é reduzida ou retardada, quando comparada com uma planta não contactada.

[00300] Em outra modalidade do método, uma turgidez da planta contactada é prolongada ou mantida, quando comparada com uma planta não contactada.

[00301] Em outra modalidade do método, uma perda de uma ou mais pétalas da planta contactada é reduzida ou retardada, quando comparada com uma planta não contactada.

[00302] Em outra modalidade do método, um teor de clorofila da planta contactada é mantido, quando comparada com uma planta não contactada.

[00303] Em outra modalidade do método, uma perda do teor de clorofila da planta contactada é reduzida ou retardada, quando comparada com uma planta não contactada.

[00304] Em outra modalidade do método, um teor de clorofila da planta contactada é aumentado, quando comparada com uma planta não contactada.

[00305] Em outra modalidade do método, uma tolerância à salinidade da planta contactada é aumentada, quando comparada com uma planta não contactada.

[00306] Em outra modalidade do método, um consumo de água da planta contactada é reduzido, quando comparada com uma planta não contactada.

[00307] Em outra modalidade do método, uma tolerância à seca da planta contactada é aumentada, quando comparada com uma planta não contactada.

[00308] Em outra modalidade do método, uma resistência a pragas da planta contactada é aumentada, quando comparada com uma planta não contactada.

[00309] Em outra modalidade do método, um consumo de pesticidas da planta contactada é reduzido, quando comparada com uma planta não contactada.

[00310] Em outra modalidade, quando uma composição agrícola da revelação, que pode compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo, é combinada com uma ou mais estrigolactonas ou miméticos químicos de estrigolactona, a transpiração da planta é aumentada, quando comparada com uma planta não contactada.

[00311] Em outra modalidade, quando uma composição agrícola da revelação, que pode compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo, é combinada com uma ou mais estrigolactonas ou miméticos químicos de estrigolactona, a temperatura do dossel da planta contactada é diminuída por pelo menos cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0°C, quando comparada com uma planta substancialmente idêntica, mas não contactada.

[00312] Em outra modalidade, quando uma composição agrícola da revelação, que pode compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo, é combinada com uma ou mais estrigolactonas ou miméticos químicos de estrigolactona, a melhoria hidráulica de uma planta é provocada mediante contacto com uma planta na qual um ponto de murcha permanente da planta contactada é diminuído, quando comparada com uma planta substancialmente idêntica, mas, de outro modo, não contactada.

[00313] Em outra modalidade, quando uma composição agrícola da revelação, que pode compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo, é combinada com uma ou mais estrigolactonas ou miméticos químicos de estrigolactona, a transpiração da planta é aumentada, quando comparada com uma planta não contactada. Nematicidas

[00314] Como mencionado anteriormente, composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo, são, algumas vezes, combinadas com um ou mais nematicidas.

[00315] Composições que compreendem bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com métodos descritos nesse relatório descritivo e/ou que possuem características como descritas nesse relatório descritivo podem ainda incluir um ou mais nematicidas. Em algumas modalidades, composições nematicidas podem ser incluídas nas composições apresentadas nesse relatório descritivo, e podem ser aplicadas a uma planta (ou plantas) ou a uma parte (ou partes) desta simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Os nematicidas podem ser selecionados de D-D,

1,3-dicloropropeno, etileno dibrometo, 1,2-dibromo-3- cloropropano, brometo de metila, cloropicrina, metam sódio, dazomet, metilisotiocianato, tetratiocarbonato sódico, aldicarbe, aldoxicarbe, carbofurano, oxamil, etoprop, fenamifos, cadusafos, fostiazato, terbufos, fensulfotion, forato, DiTera, clandosan, sincocin, iodeto de metila, brometo de propargila, 2,5-dihidroximetil-3,4- dihidroxipirrolidina (DMDP), qualquer um ou mais dos avermectinas, azida de sódio, furfural, Bacillus firmus, abamectina, tiametoxam, fludioxonil, clotianidina, ácido salicílico e S-metil éster de ácido benzo-(1,2,3)-tiadiazol- 7-carbotióico.

[00316] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos nematicidas apresentados nesse relatório descritivo podem ser utilizados com qualquer uma ou mais das plantas ou partes destas apresentadas nesse relatório descritivo.

[00317] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos nematicidas, fungicidas, herbicidas, inseticidas e/ou pesticidas apresentados nesse relatório descritivo podem ser utilizados com qualquer uma ou mais das plantas ou partes destas apresentadas nesse relatório descritivo. Fertilizantes, Estabilizadores de Nitrogênio e Inibidores de Urease

[00318] Como mencionado anteriormente, composições agrícolas da revelação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado nesse relatório descritivo, são, algumas vezes, combinadas com um ou mais de um: fertilizante, estabilizador de nitrogênio ou inibidor de urease.

[00319] Em algumas modalidades, fertilizantes são usados em combinação com os métodos e bactérias da presente revelação. Fertilizantes incluem amônia anidra, ureia, nitrato de amônio e composições de ureia-nitrato de amônio (UAN), entre muitos outros. Em algumas modalidades, fertilização pop-up e/ou fertilização inicial (“starter”) é usada em combinação com os métodos e bactérias da presente revelação.

[00320] Em algumas modalidades, estabilizadores de nitrogênio são usados em combinação com os métodos e bactérias da presente revelação. Estabilizadores de nitrogênio incluem nitrapirina, 2-cloro-6-(triclorometil) piridina, N-SERVE 24, INSTINCT, diciandiamida (DCD).

[00321] Em algumas modalidades, inibidores de urease são usados em combinação com os métodos e bactérias da presente revelação. Os inibidores de urease incluem triamida N-(n-butil)-tiofosfórica (NBPT), AGROTAIN, AGROTAIN PLUS e AGROTAIN PLUS SC. Além disso, a revelação contempla a utilização de AGROTAIN ADVANCED 1.0, AGROTAIN DRI-MAXX e AGROTAIN ULTRA.

[00322] Além disso, podem ser usadas formas estabilizadas de fertilizante. Por exemplo, uma forma estabilizada de fertilizante é SUPER U, que contém 46% de nitrogênio em um grânulo à base de ureia, estabilizado, SUPERU contém urease e inibidores da nitrificação para proteger da dentrificação, lixiviação e volatilização. Fertilizantes foliares estabilizados e direcionados como, por exemplo, NITAMIN, também podem ser usados nesse relatório descritivo.

[00323] Fertilizantes pop-up são comumente usados nos campos de milho. A fertilização pop-up compreende a aplicação de poucos quilos de nutrientes com a semente no plantio. A fertilização pop-up é usada para aumentar o vigor da muda.

[00324] Um fertilizante de liberação lenta ou controlada que pode ser usado nesse relatório descritivo engloba: um fertilizante que contém um nutriente de plantas em uma forma que retarda sua disponibilidade para captação e uso pela planta após aplicação, ou que estende sua disponibilidade à planta por um tempo significantemente mais longo do que um ‘fertilizante de nutriente rapidamente disponível’ de referência como, por exemplo, nitrato de amônio ou ureia, fosfato de amônio ou cloreto de potássio. Esse retardo da disponibilidade inicial ou o tempo estendido de disponibilidade continuada pode ocorrer por diversos mecanismos. Estes incluem hidrossolubilidade controlada do material por revestimentos semipermeáveis, oclusão, materiais de proteína, ou outras formas químicas, por hidrólise lenta de compostos hidrossolúveis de baixo peso molecular, ou por outros meios desconhecidos.

[00325] Um fertilizante de nitrogênio estabilizado que pode ser usado nesse relatório descritivo engloba: um fertilizante ao qual um estabilizador de nitrogênio foi adicionado. Um estabilizador de nitrogênio é uma substância adicionada a um fertilizante que estende o tempo em que o componente de nitrogênio do fertilizante permanece no solo na forma de ureia-N ou amoniacal-N.

[00326] Um inibidor da nitrificação que pode ser usado nesse relatório descritivo engloba: uma substância que inibe a oxidação biológica de amoniacal-N em nitrato-N. Alguns exemplos incluem: (1) 2-cloro-6-(triclorometil- piridina), nome comum Nitrapirina, fabricada por Dow Chemical; (2) 4-amino-1,2,4-6-triazol-HCl, nome comum ATC,

fabricado por Ishihada Industries; (3) 2,4-diamino-6- tricloro-metiltriazina, nome comum CI-1580, fabricada por American Cyanamid; (4) Diciandiamida, nome comum DCD, fabricada por Showa Denko; (5) Tioureia, nome comum TU, fabricada por Nitto Ryuso; (6) 1-mercapto-1,2,4-triazol, nome comum MT, fabricado por Nippon; (7) 2-amino-4-cloro-6- metil-piramidina, nome comum AM, fabricada por Mitsui Toatsu; (8) fosfato de 3,4-dimetilpirazol (DMPP), de BASF; (9) 1-amida-2-tioureia (ASU), de Nitto Chemical Ind.; (10) Amôniotiossulfato (ATS); (11) 1H-1,2,4-triazol (HPLC); (12) 5-óxido de etileno-3-tricloro-metil-1,2,4-tiodiazol (Terrazol), de Olin Mathieson; (13) 3-metilpirazol (3-MP); (14) 1-carbamoil-3-metil-pirazol (CMP); (15) Neem; e (16) DMPP.

[00327] O inibidor de urease que pode ser usado nesse relatório descritivo engloba: uma substância que inibe a ação hidrolítica sobre a ureia pela enzima urease. Milhares de produtos químicos foram avaliados como inibidores de urease do solo (Kiss e Simihaian, 2002). No entanto, apenas poucos dos muitos compostos testados atenderam aos requisitos necessários de serem atóxicos, eficazes em concentração baixa, estáveis e compatíveis com ureia (sólidos e soluções), degradáveis no solo e baratos. Eles podem ser classificados de acordo com suas estruturas e sua suposta interação com a enzima urease (Watson, 2000, 2005). Quatro classes principais de inibidores de urease foram propostas: (a) reagentes que interagem com os grupos sulfidrila (reagentes de sulfidrila), (b) hidroxamatos, (c) produtos químicos de proteção de cultivo agrícola, e (d) análogos estruturais de ureia e compostos relacionados.

Triamida N-(n-Butil) tiofosfórica (NBPT), fenilfosforodiamidato (PPD/ PPDA), e hidroquinona são provavelmente os inibidores de urease mais detalhadamente estudados (Kiss e Simihaian, 2002). Pesquisas e testagem prática também foram feitas com triamida de ácido N-(2- nitrofenil)fosfórico (2-NPT) e tiossulfato de amônio (ATS). Os compostos de organofósforo são análogos estruturais de ureia e são alguns dos inibidores mais eficazes da atividade de urease, bloqueando o local ativo da enzima (Watson, 2005). Tratamentos Inseticidas de Sementes (ISTs) para Milho

[00328] Os tratamentos de sementes de milho normalmente visam três espectros de pragas: nematódeos, doenças fúngicas de mudas, e insetos.

[00329] Os tratamentos inseticidas de sementes são normalmente o componente de um pacote de tratamento de sementes. A maioria das sementes de milho disponíveis hoje vem com um pacote-base que inclui um fungicida e inseticida. Em alguns aspectos, as opções de inseticidas para tratamentos de sementes incluem PONCHO (clotianidina), CRUISER/CRUISER EXTREME (tiametoxam) e GAUCHO (Imidacloprida). Todos esses três produtos são químicos de neonicotinóide. CRUISER e PONCHO na taxa de 250 (0,25 mg AI/semente) são algumas das opções de base mais comuns disponíveis para milho. Em alguns aspectos, as opções de inseticidas para tratamentos incluem CRUISER 250 tiametoxam, CRUISER 250 (tiametoxam) mais LUMIVIA (clorantraniliprol), CRUISER 500 (tiametoxam), e PONCHO VOTIVO 1250 (Clotianidina e Bacillus firmus I-1582).

[00330] O pacote de tratamento inseticida de sementes de base de Pioneer consiste em CRUISER 250 com PONCHO/VOTIVO 1250 também disponível. VOTIVO é um agente biológico que protege contra nematódeos.

[00331] Os produtos de Monsanto que incluem milho, sojas e algodão caem sob o guarda-chuva de tratamento ACCELERON. A semente de milho de Dekalb vem como padrão com PONCHO 250. Os produtores também têm a opção de um upgrade para PONCHO/VOTIVO, com PONCHO aplicado na taxa de 500.

[00332] Agrisure, Golden Harvest e Garst possuem um pacote-base com um fungicida e CRUISER 250. Milho completo da AVICTA também está disponível; isso inclui CRUISER 500, fungicida, e proteção contra nematódeos. CRUISER EXTREME é outra opção disponível como um pacote de tratamento de sementes, no entanto; as quantidades de CRUISER são as mesmas que o tratamento de sementes CRUISER convencional, ou seja, 250, 500 ou 1.250.

[00333] Outra opção é comprar o tratamento inseticida mínimo disponível, e depois um fornecedor tratar a semente a jusante.

[00334] Os ISTs disponíveis comercialmente para milho estão listados na Tabela 13 abaixo e podem ser combinados com um ou mais dos micróbios ensinados nesse relatório descritivo. Tabela 13. Lista de tratamentos de sementes exemplares, incluindo ISTs, que podem ser combinados com micróbios da revelação. Tipo de Ingrediente(s Nome comercial do tratamento ) ativo(s) produto Plantio F Azoxistrobina DYNASTY Milho, PROTÉGÉ FL Soja Milho F Bacillus YIELD SHIELD Milho,

Tipo de Ingrediente(s Nome comercial do tratamento ) ativo(s) produto Plantio pumilus Soja F Bacillus HISTICK N/T Soja subtilis VAULT HP Milho, Soja F Captan CAPTAN 400 Milho, CAPTAN 400-C Soja Milho, Soja F Fludioxonil MAXIM 4FS Milho, Soja F Peróxido de OXIDATE Soja hidrogênio STOROX Soja F Ipconazol ACCELERON DC-509 Milho RANCONA 3,8 FS Milho, VORTEX Soja Milho F Mancozeb BONIDE MANCOZEB com Milho concentrado de zinco DITHANE 75DF Milho RAINSHIELD Milho DITHANE DF Milho RAINSHIELD Milho DITHANE F45 Milho RAINSHIELD Milho DITHANE M45 Milho LESCO 4 FLOWABLE Milho

MANCOZEB

Tipo de Ingrediente(s Nome comercial do tratamento ) ativo(s) produto Plantio PENNCOZEB 4FL

FLOWABLE PENNCOZEB 75DF DRY

FLOWABLE PENNCOZEB 80WP F Mefenoxam APRON XL Milho, Soja F Metalaxil ACCELERON DC-309 Milho ACCELERON DX-309 Milho, ACQUIRE Soja AGRI STAR METALAXYL Milho, 265 ST Soja ALLEGIANCE DRY Milho, ALLEGIANCE FL Soja BELMONT 2,7 FS Milho, DYNA-SHIELD Soja METALAXYL Milho, SEBRING 2.65 ST Soja SEBRING 318 FS Milho, SEBRING 480 FS Soja VIREO MEC Milho, Soja Milho, Soja Milho, Soja Milho, Soja

Tipo de Ingrediente(s Nome comercial do tratamento ) ativo(s) produto Plantio Soja F Piraclostrobi ACCELERON DX-109 Soja na STAMINA Milho F Streptomyces MYCOSTOP Milho, griseoviridis Soja F Streptomyces ACTINOGROW ST Milho, lydicus Soja F Tebuconazol AMTIDE TEBU 3.6F Milho SATIVA 309 FS Milho SATIVA 318 FS Milho TEBUSHA 3.6FL Milho TEBUZOL 3.6F Milho F Tiabendazol MERTECT 340-F Soja F Tiram 42-S TIRAM Milho, FLOWSAN Soja SIGNET 480 FS Milho, Soja Milho, Soja F Trichoderma T-22 HC Milho, harzianum Soja Rifai F Trifloxistrob ACCELERON DX-709 Milho ina TRILEX FLOWABLE Milho, soja I Clorpirifos LORSBAN 50W em Milho pacotes hidrossolúveis

Tipo de Ingrediente(s Nome comercial do tratamento ) ativo(s) produto Plantio I Clotianidina ACCELERON IC-609 Milho NIPSIT INSIDE Milho, PONCHO 600 Soja Milho I Imidacloprida ACCELERON IX-409 Milho AGRI STAR MACHO 600 Milho, ST Soja AGRISOLUTIONS NITRO Milho, SHIELD Soja ATTENDANT 600 Milho, AXCESS Soja COURAZE 2F Milho, DYNA-SHIELD Soja IMIDACLOPRID 5 Soja GAUCHO 480 FLOWABLE Milho, GAUCHO 600 FLOWABLE Soja GAUCHO SB FLOWABLE Milho, NUPRID 4.6F PRO Soja SENATOR 600 FS Milho, Soja Milho, Soja Soja Milho, Soja I Tiametoxam CRUISER 5FS Milho, Soja N Abamectina AVICTA 500 FS Milho,

Tipo de Ingrediente(s Nome comercial do tratamento ) ativo(s) produto Plantio Soja N Bacillus VOTIVO FS Soja firmus P Citocinina SOIL X-CITO Soja X-CITE Soja P Proteína de ACCELERON HX-209 Milho, gancho de N-HIBIT GOLD CST Soja cabelo alfa N-HIBIT HX-209 Milho, beta Soja Milho, Soja P Ácido indol KICKSTAND PGR Milho, butírico Soja I, N Tiametoxam, AVICTA DUO MILHO Milho abamectina AVICTA DUO 250 I, F Clotianidina, PONCHO VOTIVO Milho, Bacillus Soja firmus F, F Carboxina, ENHANCE Soja captan I, F Permetrina, KERNEL GUARD Milho, carboxina SUPREME Soja F, F Carboxina, VITAFLO 280 Milho, tiram Soja F, F Mefenoxam, MAXIM XL Milho, fludioxonil WARDEN RTA Soja APRON MAXX RFC Soja APRON MAXX RTA +

Tipo de Ingrediente(s Nome comercial do tratamento ) ativo(s) produto Plantio

MOLY

APRON MAXX RTA I, F Imidacloprida AGRISOLUTIONS Milho , metalaxil CONCUR F, F Metalaxil, RANCONA SUMMIT Soja ipconazol RANCONA XXTRA F, F Tiram, PROTECTOR-L- Soja metalaxil ALLEGIANCE F, F Trifloxistrob TRILEX AL Soja ina, TRILEX 2000 metalaxil P, P, P Citocinina, STIMULATE YIELD Milho, ácido ENHANCER ASCEND Soja giberélico, ácido indol butírico F, F, I Mefenoxam, CRUISERMAXX PLUS Soja fludioxonil, tiametoxam F, F, F Captan, BEAN GUARD/ Soja carboxina, ALLEGIANCE metalaxil F, F, I Captan, ENHANCE AW Soja carboxina, imidacloprida F, F, I Carboxina, LATITUDE Milho, metalaxil, Soja imidacloprida

Tipo de Ingrediente(s Nome comercial do tratamento ) ativo(s) produto Plantio F, F, F Metalaxil, STAMINA F3 HL Milho piraclostrobi na, triticonazol F, F, F, I Azoxistrobina CRUISER EXTREME Milho , fludioxonil, mefenoxam, tiametoxam F, F, F, Azoxistrobina MAXIM QUATTRO Milho F, F , fludioxonil, mefenoxam, tiabendazol I Clorantranili LUMIVIA Milho prol F = Fungicida; I = Inseticida; N = Nematicida; P = Regulador do Crescimento de Plantas Aplicação de Populações Bacterianas em Plantios

[00335] A composição das bactérias ou população bacteriana descrita nesse relatório descritivo pode ser aplicada no sulco, em talco, ou como tratamento de sementes. A composição pode ser aplicada a um pacote de sementes a granel, mini granel, em uma bolsa ou em talco.

[00336] O plantador pode plantar a semente tratada e crescer o plantio de acordo com formas convencionais, linhas duplas, ou de formas que não exijam aragem. As sementes podem ser distribuídas usando uma tremonha de controle ou uma tremonha individual. As sementes também podem ser distribuídas usando ar pressurizado ou manualmente. A colocação da semente pode ser realizada usando tecnologias de taxa variável. Adicionalmente, a aplicação das bactérias ou população bacteriana descritas nesse relatório descritivo pode ser feita usando tecnologias de taxa variável. Em alguns exemplos, as bactérias podem ser aplicadas às sementes de milho, soja, canola, sorgo, batata, arroz, vegetais, cereais, pseudocereais e sementes oleaginosas. Exemplos de cereais podem incluir cevada, painço, aveias, palmer’s grass, centeio, milheto-pérola, sorgo, trigo-vermelho, milho-painço, triticale e trigo. Exemplos de pseudocereais podem incluir fruta-pão, trigo sarraceno, taboa, chia, linhaça, amaranto de grão, hanza, quinoa e gergelim. Em alguns exemplos, as sementes podem ser organismos geneticamente modificados (GMO), não-GMO, orgânicas ou convencionais.

[00337] Aditivos como, por exemplo, microfertilizantes, PGRs, herbicidas, inseticidas e fungicidas, podem ser usados adicionalmente para tratar os plantios. Exemplos de aditivos incluem protetores de cultivos como, por exemplo, inseticidas, nematicidas, fungicida, agentes de aprimoramento como, por exemplo, corantes, polímeros, peletizadores, sensibilizantes e desinfetantes, e outros agentes, tais como inoculantes, PGR, amaciante e micronutrientes. PGRs podem ser hormônios de plantas naturais ou sintéticos que afetam o crescimento da raiz, floração ou alongamento do caule. PGRs podem incluir auxinas, giberelinas, citocininas, etileno e ácido abscísico (ABA).

[00338] A composição pode ser aplicada em sulcos em combinação com fertilizante líquido. Em alguns exemplos, o fertilizante líquido pode ser mantido em tanques. Fertilizantes NPK contêm macronutrientes de sódio, fósforo e potássio.

[00339] A composição pode aprimorar traços de plantas, por exemplo, promoção do crescimento de plantas, manutenção de um teor de clorofila elevado em folhas, aumento dos números de frutos ou sementes e aumento do peso unitário de frutos ou sementes. Os métodos da presente revelação podem ser empregados para introduzir ou aprimorar um ou mais de diversos traços desejáveis. Exemplos de traços que podem ser introduzidos ou aprimorados incluem: biomassa da raiz, comprimento da raiz, altura, comprimento do broto, número de folhas, eficiência no uso de água, biomassa global, rendimento, tamanho do fruto, tamanho do grão, taxa de fotossíntese, tolerância à seca, tolerância térmica, tolerância ao sal, tolerância ao estresse por nitrogênio baixo, eficiência no uso de nitrogênio, resistência ao estresse por nematódeo, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um patógeno bacteriano, resistência a um patógeno viral, nível de um metabólito, modulação no nível de um metabólito e expressão do proteoma. Os traços desejáveis, incluindo altura, biomassa global, biomassa da raiz e/ou broto, germinação da semente, sobrevida da muda, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de sementes/frutos, rendimento de grãos ou frutos de plantas, teor de clorofila da folha, taxa fotossintética, comprimento da raiz, ou qualquer combinação destes, podem ser usados para medir o crescimento, e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem os traços introduzidos e/ou aprimorados) desenvolvidas sob condições idênticas. Em alguns exemplos, os traços desejáveis, incluindo altura, biomassa global, biomassa da raiz e/ou broto, germinação da semente, sobrevida da muda, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de sementes/frutos, rendimento de grãos ou frutos de plantas, teor de clorofila da folha, taxa fotossintética, comprimento da raiz, ou qualquer combinação destes, podem ser usados para medir o crescimento, e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem os traços introduzidos e/ou aprimorados) desenvolvidas sob condições similares.

[00340] Um traço agronômico para uma planta hospedeira pode incluir, sem limitação, os seguintes: teor de óleo alterado, teor de proteína alterado, composição de carboidratos da semente alterada, composição de óleo de sementes alterada, e composição de proteína da semente alterada, tolerância química, tolerância ao frio, senescência retardada, resistência a doenças, tolerância à seca, peso da espiga, aumento do crescimento, aumento da saúde, tolerância térmica, tolerância a herbicidas, resistência a herbívoros, fixação de nitrogênio aumentada, utilização de nitrogênio aprimorada, arquitetura da raiz aprimorada, eficiência no uso de água aumentada, biomassa aumentada, comprimento da raiz aumentado, peso da semente aumentado, comprimento do broto aumentado, rendimento aumentado, rendimento aumentado sob condições de água limitada, massa do caroço, teor de umidade do caroço,

tolerância a metais, número de espigas, número de caroços por espiga, número de vagens, aumento da nutrição, resistência a patógenos, resistência a pragas, aumento da capacidade fotossintética, tolerância à salinidade, efeito verde, aumento do vigor, peso seco aumentado de sementes maduras, peso fresco aumentado de sementes maduras, número aumentado de sementes maduras por planta, teor de clorofila aumentado, número aumentado de vagens por planta, comprimento aumentado de vagens por planta, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas severamente murchas por planta e número aumentado de folhas não murchas por planta, uma modulação detectável no nível de um metabólito, uma modulação detectável no nível de um transcrito e uma modulação detectável no proteoma, comparada com uma planta da mesma linhagem desenvolvida a partir de uma semente sem a referida formulação de tratamento de sementes.

[00341] Em alguns casos, as plantas são inoculadas com bactérias ou populações bacterianas que são isoladas da mesma espécie de planta que o elemento de planta da planta inoculada. Por exemplo, uma bactéria ou população bacteriana que é normalmente em encontrada em uma variedade de Zea mays (milho) está associada com um elemento de planta de uma planta de outra variedade de Zea mays que, em seu estado natural, não possui as referidas bactérias e populações bacterianas. Em uma modalidade, as bactérias e populações bacterianas são derivadas de uma planta de uma espécie de planta relacionada que o elemento de planta da planta inoculada. Por exemplo, uma bactéria e população bacteriana que é normalmente encontrada em Zea diploperennis Iltis e cols. (diploperennial teosinte) é aplicada a uma Zea mays (milho), ou vice-versa. Em alguns casos, as plantas são inoculadas com bactérias e populações bacterianas que são heterólogas ao elemento de planta da planta inoculada. Em uma modalidade, as bactérias e populações bacterianas são derivadas de uma planta de outra espécie. Por exemplo, uma bactéria e população bacteriana que é normalmente encontrada em dicotiledôneas é aplicada a uma planta monocotiledônea (por exemplo, inoculação de milho com uma bactéria e população bacteriana derivada de soja), ou vice-versa. Em outros casos, a bactéria e população bacteriana a ser inoculada sobre uma planta é derivada de uma espécie relacionada da planta que está sendo inoculada. Em uma modalidade, as bactérias e populações bacterianas são derivadas de um táxon relacionado, por exemplo, de uma espécie relacionada. A planta de outra espécie pode ser uma planta agrícola. Em outra modalidade, a bactéria e população bacteriana são parte de uma composição projetada inoculada em qualquer elemento da planta hospedeira.

[00342] Em alguns exemplos, a bactéria ou população bacteriana é exógena, em que as bactérias e população bacteriana são isoladas de uma planta diferente da planta inoculada. Por exemplo, em uma modalidade, a bactéria ou população bacteriana pode ser isolada de uma planta diferente da mesma espécie que a planta inoculada. Em alguns casos, a bactéria ou população bacteriana pode ser isolada de uma espécie relacionada à planta inoculada.

[00343] Em alguns exemplos, as bactérias e populações bacterianas descritas nesse relatório descritivo são capazes de se mover de um tipo de tecido para outro. Por exemplo, a detecção e o isolamento de bactérias e populações bacterianas da presente invenção dentro dos tecidos de plantas maduros após revestimento no exterior de uma semente demonstram sua habilidade para se mover do exterior da semente para dentro dos tecidos vegetativos de uma planta em amadurecimento.

Portanto, em uma modalidade, a população de bactéria e população bacteriana são capazes de se mover do exterior da semente para dentro dos tecidos vegetativos de uma planta.

Em uma modalidade, a bactéria e população bacteriana que são revestidas sobre a semente de uma planta são capazes, após germinação da semente em um estado vegetativo, de se localizar em um tecido da planta diferente.

Por exemplo, bactérias e populações bacterianas podem ser capazes de se localizar em qualquer um dos tecidos na planta, incluindo: na raiz, raiz adventícia, raiz seminal, pêlo da raiz, broto, folha, flor, botão, pendão, meristema, pólen, pistilo, ovários, estame, fruto, estólons, rizoma, nódulo, tubérculo, tricoma, células de guarda, hidatódio, pétala, sépala, colmo, ráquis, câmbio vascular, floema e xilema.

Em uma modalidade, a bactéria e população bacteriana são capazes de se localizar na raiz e/ou no pêlo da raiz da planta.

Em outra modalidade, a bactéria e população bacteriana são capazes de se localizar nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e brotos da planta.

Em outros casos, a bactéria e população bacteriana estão localizadas nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e floema.

Ainda em outra modalidade, a bactéria e população bacteriana são capazes de se localizar nos tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estame, fruto) da planta.

Em outra modalidade, a bactéria e população bacteriana são capazes de se localizar na raiz, brotos, folhas e tecidos reprodutivos da planta. Ainda em outra modalidade, as bactérias e populações bacterianas colonizam um tecido do fruto ou da semente da planta. Ainda em outra modalidade, a bactéria e população bacteriana são capazes de colonizar a planta de modo a estar presente na superfície da planta (ou seja, sua presença está presente de forma detectável no exterior da planta, ou na episfera da planta). Ainda em outras modalidades, a bactéria e população bacteriana são capazes de se localizar em substancialmente todos, ou todos, os tecidos da planta. Em certas modalidades, a bactéria e população bacteriana não estão localizadas na raiz de uma planta. Em outros casos, a bactéria e população bacteriana não estão localizadas nos tecidos fotossintéticos da planta.

[00344] A eficácia das composições também pode ser avaliada por medição da maturidade relativa do plantio ou da unidade térmica do plantio (CHU). Por exemplo, a população bacteriana pode ser aplicada ao milho, e o crescimento do milho pode ser avaliado de acordo com a maturidade relativa do caroço de milho ou com o tempo no qual o caroço de milho está no peso máximo. A unidade térmica do plantio (CHU) também pode ser usada para prever o amadurecimento do plantio de milho. A CHU determina a quantidade de acúmulo de calor por medição das temperaturas máximas diárias no crescimento do plantio.

[00345] Em exemplos, bactérias podem se localizar em qualquer um dos tecidos na planta, incluindo: na raiz, raiz adventícia, raiz seminal, pêlo da raiz, broto, folha, flor, pendão do botão, meristema, pólen, pistilo, ovários, estame, fruto, estólons, rizoma, nódulo, tubérculo, tricoma, células de guarda, hidatódio, pétala, sépala, colmo, ráquis, câmbio vascular, floema e xilema. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de se localizar nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e brotos da planta. Em outros casos, a bactéria e população bacteriana estão localizadas nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e floema. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de se localizar em tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estame ou fruto) da planta. Em outra modalidade, a bactéria e população bacteriana são capazes de se localizar na raiz, brotos, folhas e tecidos reprodutivos da planta. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana coloniza o tecido de um fruto ou semente da planta. Ainda em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de colonizar a planta de modo a estar presente na superfície da planta. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de se localizar em substancialmente todos, ou todos, os tecidos da planta. Em certas modalidades, a bactéria ou população bacteriana não está localizada na raiz de uma planta. Em outros casos, a bactéria e população bacteriana não estão localizadas nos tecidos fotossintéticos da planta.

[00346] A eficácia das composições bacterianas aplicadas aos plantios pode ser avaliada por medição de várias características do crescimento do plantio incluindo, sem limitação, taxa de plantio, vigor da semeadura, força da raiz, tolerância à seca, altura da planta, taxa de secagem e peso de teste.

Espécies de Plantas

[00347] Os métodos e bactérias descritos nesse relatório descritivo são adequados para qualquer uma de diversas plantas, por exemplo, plantas nos gêneros Hordeum, Oryza, Zea e Triticeae. Outros exemplos não limitantes de plantas adequadas incluem musgos, liquens e algas. Em alguns casos, as plantas possuem valor econômico, social e/ou ambiental, por exemplo, plantios de alimentos, plantios de fibras, plantios de óleos, plantas na floresta ou indústrias de polpa e papel, matéria-prima para a produção de biocombustível e/ou plantas ornamentais. Em alguns exemplos, as plantas podem ser usadas para produzir produtos economicamente valiosos como, por exemplo, um grão, uma farinha, um amido, um xarope, um farelo, um óleo, uma película, uma embalagem, um produto nutracêutico, uma polpa, uma ração animal, uma forragem de peixe, um material a granel para produtos químicos industriais, um produto de cereal, um produto alimentar processado para humanos, um açúcar, um álcool e/ou uma proteína. Exemplos não limitantes de plantas de cultivo incluem maís, arroz, trigo, cevada, sorgo, painço, aveias, centeio, triticale, trigo sarraceno, milho-verde, cana de açúcar, cebolas, tomates, morangos e aspargo. Em algumas modalidades, os métodos e bactérias descritas nesse relatório descritivo são adequados para qualquer uma de diversas plantas transgênicas, plantas não transgênicas, e plantas híbridas destas.

[00348] Em alguns exemplos, as plantas que podem ser obtidas ou aprimoradas com o uso dos métodos e composição revelados nesse relatório descritivo podem incluir plantas que são importantes ou interessantes para agricultura, horticultura, biomassa para produção de moléculas de biocombustível e outros produtos químicos e/ou florestais.

Alguns exemplos dessas plantas podem incluir abacaxi, banana, coco, lírio. ervilhas e gramas; e plantas dicotiledôneas como, por exemplo, ervilha, alfafa, tomate de cáscara, melão, grão-de-bico, chicória, cravo-da-índia, couve crespa, lentilhas, soja, tabaco, batata, batata doce, rabanete, repolho, colza, macieiras, uvas, algodão, girassol, agrião, canola, cítricos (incluindo laranja, tangerina, kumquat, limão, lima, toranja, tangerina, tangelo, cidra e pomelo), pimenta, feijão, alface, Panicum virgatum (switch), sorgo bicolor (sorgo, Sudão), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (cana-energia), Populus balsamifera (álamo), Zea mays (milho), Glycine max (soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba), Pennisetum glaucum (painço-pérola), Panicum spp.

Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Secale cereale (centeio), Salix spp. (cânhamo), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (trigo - 25 trigo X centeio), bambu, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (pinhão- manso), Ricinus communis (mamona), Elaeis guineensis (óleo de palma), Phoenix dactylifera (tamareira), Archontophoenix cunninghamiana (palmeira-real), Syagrus romanzoffiana (palma-rainha), Linum usitatissimum (linhaça), Brassica juncea, Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca saliva (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve de Bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao

(cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimentas e pimentões), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (squash), Cucurbita moschata (squash), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (berinjela), Papaver somniferum (papoula do ópio), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis saliva, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Coichicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea 5 spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guayule), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (hortelã), Mentha piperita (hortelã), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsétia), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveia), Hordeum vulgare (cevada), e Lolium spp. (centeio).

[00349] Em alguns exemplos, uma planta monocotiledônea pode ser usada. Plantas monocotiledôneas pertencem às ordens das Alismatales, Arales, Arecales, Bromeliales, Commelinales, Cyclanthales, Cyperales,

Eriocaulales, Hydrocharitales, Juncales, Lilliales, Najadales, Orchidales, Pandanales, Poales, Restionales, Triuridales, Typhales e Zingiberales. Plantas que pertencem à classe das Gymnospermae são Cycadales, Ginkgoales, Gnetales e Pinales. Em alguns exemplos, a planta monocotiledônea pode ser selecionada do grupo que consiste em maís, arroz, trigo, cevada e cana de açúcar.

[00350] Em alguns exemplos, uma planta dicotiledônea pode ser usada, incluindo aquelas que pertencem às ordens das Aristochiales, Asterales, Batales, Campanulales, Capparales, Caryophyllales, Casuarinales, Celastrales, Cornales, Diapensales, Dilleniales, Dipsacales, Ebenales, Ericales, Eucomiales, Euphorbiales, Fabales, Fagales, Gentianales, Geraniales, Haloragales, Hamamelidales, Middles, Juglandales, Lamiales, Laurales, Lecythidales, Leitneriales, Magniolales, Malvales, Myricales, Myrtales, Nymphaeales, Papeverales, Piperales, Plantaginales, Plumb aginales, Podostemales, Polemoniales, Polygalales, Polygonales, Primulales, Proteales, Rafflesiales, Ranunculales, Rhamnales, Rosales, Rubiales, Salicales, Santales, Sapindales, Sarraceniaceae, Scrophulariales, Theales, Trochodendrales, Umbellales, Urticales e Violates. Em alguns exemplos, a planta dicotiledônea pode ser selecionada do grupo que consiste em algodão, soja, pimentão e tomate.

[00351] Em alguns casos, a planta a ser aprimorada não é facilmente receptiva às condições experimentais. Por exemplo, uma planta de plantio pode demorar muito a crescer o bastante para avaliar de forma prática um traço aprimorado serialmente ao longo de várias repetições. Consequentemente,

uma primeira planta da qual as bactérias são inicialmente isoladas, e/ou as várias plantas às quais bactérias geneticamente manipuladas são aplicadas podem ser uma planta-modelo, por exemplo, uma planta mais passível à avaliação sob condições desejadas. Exemplos não limitantes de plantas-modelo incluem Setaria, Brachypodium e Arabidopsis. A habilidade de bactérias isoladas de acordo com um método da revelação usando uma planta-modelo pode então ser aplicada a uma planta de outro tipo (por exemplo, uma planta de plantio) para confirmar a conferência do traço aprimorado.

[00352] Traços que podem ser aprimorados pelos métodos revelados nesse relatório descritivo incluem qualquer característica observável da planta incluindo, por exemplo, taxa de crescimento, altura, peso, cor, sabor, cheiro, alterações na produção de um ou mais compostos pela planta (incluindo, por exemplo, metabólitos, proteínas, fármacos, carboidratos, óleos, e quaisquer outros compostos). A seleção de plantas com base em informação genotípica também é prevista (por exemplo, incluindo o padrão de expressão gênica da planta em resposta às bactérias, ou identificação da presença de marcadores genéticos, por exemplo, aqueles associados com fixação de nitrogênio aumentada). As plantas também podem ser selecionadas com base na ausência, supressão ou inibição de certa característica ou traço (por exemplo, uma característica ou traço indesejável), ao contrário da presença de certa característica ou traço (por exemplo, uma característica ou traço desejável).

Maís Não Modificada Geneticamente

[00353] Os métodos e bactérias descritas nesse relatório descritivo são adequados para qualquer uma de diversas plantas de maís não modificadas geneticamente ou parte destas. E, em alguns aspectos, o milho é orgânico. Além disso, os métodos e bactérias descritas nesse relatório descritivo são adequados para qualquer um dos seguintes híbridos, variedades, linhagens etc. não modificados geneticamente. Em algumas modalidades, as variedades de milho geralmente se enquadram em seis categorias: milho doce, milho duro, milho de pipoca, milho dentado, milho tunicata e milho de farinha.

Milho Doce

[00354] As variedades Yellow su incluem Earlivee, Early Sunglow, Sundance, Early Golden Bantam, Iochief, Merit, Jubilee e Golden Cross Bantam. As variedades White su incluem True Platinum, Country Gentleman, Silver Queen e Stowell’s Evergreen. As variedades Bicolor su incluem Sugar & Gold, Quickie, Double Standard, Butter & Sugar, Sugar Dots Honey & Cream. As variedades Multicolor su incluem Hookers, Triple Play, Painted Hill, Black Mexican/Aztec.

[00355] As variedades Yellow se incluem Buttergold, Precocious, Spring Treat, Sugar Buns, Colorow, Kandy King, Bodacious R/M, Tuxedo, Incredible, Merlin, Miracle e Kandy Korn EH. As variedades White se incluem Spring Snow, Sugar Pearl, Whiteout, Cloud Nine, Alpine, Silver King e Argent. As variedades Bicolor se incluem Sugar Baby, Fleet, Bon Jour, Trinity, Bi-Licious, Temptation, Luscious, Ambrosia, Accord, Brocade, Lancelot, Precious Gem, Peaches e Cream Mid EH e Delectable R/M. as variedades Multicolor se incluem Ruby Queen.

[00356] As variedades Yellow sh2 incluem Extra Early Super Sweet, Takeoff, Early Xtra Sweet, Raveline, Summer Sweet Yellow, Krispy King, Garrison, Illini Gold, Challenger, Passion, Excel, Jubilee SuperSweet, Illini Xtra Sweet e Crisp ‘N Sweet. As xvvariedades incluem Summer Sweet White, Tahoe, Aspen, Treasure, How Sweet It Is e Camelot. As variedades Bicolor sh2 incluem Summer Sweet Bicolor, Radiance, Honey ‘N Pearl, Aloha, Dazzle, Hudson e Fenomenal.

[00357] As variedades Yellow sy incluem Applause, Inferno, Honeytreat e Honey Select. As variedades White sy incluem Silver Duchess, Cinderella, Mattapoisett, Avalon e Captivate. As variedades Bicolor sy incluem Pay Dirt, Revelation, Renaissance, Charisma, Synergy, Montauk, Kristine, Serendipity/Providence e Cameo.

[00358] As variedades Yellow superdoces aumentadas incluem Xtra-Tender 1ddA, Xtra-Tender 11dd, Mirai 131Y, Mirai 130Y, Vision, e Mirai 002. As variedades White superdoces aumentadas incluem Xtra-Tender 3dda, Xtra-Tender 31dd, Mirai 421W, XTH 3673 e Devotion. As variedades Bicolor superdoces aumentadas incluem Xtra-Tender 2dda, Xtra-Tender 21dd, Kickoff XR, Mirai 308BC, Anthem XR, Mirai 336BC, Fantastic XR, Triumph, Mirai 301BC, Stellar, American Dream, Mirai 350BC e Obsession.

Milho Duro

[00359] As variedades de milho duro incluem Bronze- Orange, Candy Red Flint, Floriani Red Flint, Glass Gem, Indian Ornamental (Rainbow), Mandan Red Flour, Painted Mountain, Petmecky, Cherokee White Flour.

Milho de Pipoca

[00360] As variedades de milho de pipoca incluem Monarch Butterfly, Yellow Butterfly, Midnight Blue, Ruby Red, Mixed Baby Rice, Queen Mauve, Mushroom Flake, Japanese Hull-less, Strawberry, Blue Shaman, Miniature Colored, Miniature Pink, Pennsylvania Dutch Butter Flavor e Red Strawberry.

Milho Dentado

[00361] As variedades de milho dentado incluem Bloody Butcher, Blue Clarage, Ohio Blue Clarage, Cherokee White Eagle, Hickory Cane, Hickory King, Jellicorse Twin, Kentucky Rainbow, Daymon Morgan’s Knt. Butcher, Leaming, Leaming’s Yellow, McCormack’s Blue Giant, Neal Paymaster, Pungo Creek Butcher, Reid’s Yellow Dent, Rotten Clarage e Tennessee Red Cob.

[00362] Em algumas modalidades, as variedades de milho incluem P1618W, P1306W, P1345, P1151, P1197, P0574, P0589 e P0157. W = milho branco.

[00363] Em algumas modalidades, os métodos e bactérias descritas nesse relatório descritivo são adequados para qualquer híbrido das variedades de maís apresentadas nesse relatório descritivo.

Maís Modificado Geneticamente

[00364] Os métodos e bactérias descritas nesse relatório descritivo são adequados para qualquer um de um híbrido, variedade, linhagem etc. de plantas de maís modificadas geneticamente ou parte destas.

[00365] Além disso, os métodos e bactérias descritas nesse relatório descritivo são adequados para qualquer um dos seguintes eventos de maís modificado geneticamente, que foram aprovados em um ou mais países: 32138 (32138 SPT Maintainer), 3272 (ENOGEN), 3272 x Bt11, 3272 x bt11 x GA21, 3272 x Bt11 x MIR604, 3272 x Bt11 x MIR604 x GA21, 3272 x Bt11 x MIR604 x TC1507 x 5307 x GA21, 3272 x GA21, 3272 x MIR604, 3272 x MIR604 x GA21, 4114, 5307 (AGRISURE Duracade), 5307 x GA21, 5307 x MIR604 x Bt11 x TC1507 x GA21 (AGRISURE Duracade 5122), 5307 x MIR604 x Bt11 x TC1507 x GA21 x MIR162 (AGRISURE Duracade 5222), 59122 (HERCULEX RW), 59122 x DAS40278, 59122 x GA21, 59122 x MIR604, 59122 x MIR604 x GA21, 59122 x MIR604 x TC1507, 59122 x MIR604 x TC1507 x GA21, 59122 x MON810, 59122 x MON810 x MIR604, 59122 x MON810 x NK603, 59122 x MON810 x NK603 x MIR604, 59122 x MON88017, 59122 x MON88017 x DAS40278, 59122 x NK603 (Herculex RW ROUNDUP READY 2), 59122 x NK603 x MIR604, 59122 x TC1507 x GA21, 676, 678, 680, 3751 IR, 98140, 98140 x 59122, 98140 x TC1507, 98140 x TC1507 x 59122, Bt10 (Bt10), Bt11 [X4334CBR, X4734CBR] (AGRISURE CB/lL), Bt11 x 5307, Bt11 x 5307 x GA21, Bt11 x 59122 x MIR604, Br11 x 59122 x MIR604 x GA21, Bt11 x 59122 x MIR604 x TC1507, M53, M56, DAS-59122-7, Bt11 x 59122 x MIR604 x TC1507 x GA21, Bt11 x 59122 x TC1507, TC1507 x DAS-59122-7, Bt11 x 59122 x TC1507 x GA21, Bt11 x GA21 (AGRISURE GT/CB/lL), Bt11 x MIR162 (AGRISURE Viptera 2100), BT11 x MIR162 x 5307, Bt11 x MIR162 x 5307 x GA21, Bt11 x MIR162 x GA21 (AGRISURE Viptera 3110), Bt11 x MIR162 x MIR604 (AGRISURE Viptera 3100), Bt11 x MIR162 x MIR604 x 5307, Bt11 x MIR162 x MIR604 x 5307 x GA21, Bt11 x MIR162 x MIR604 x GA21 (AGRISURE Viptera 3111 / AGRISURE Viptera 4), Bt11, MIR162 x MIR604 x MON89034 x 5307 x GA21, Bt11 x MIR162 x MIR604 x TC1507, Bt11 x MIR162 x MIR604 x TC1507 x 5307, Bt11 x MIR162 x MIR604 x TC1507 x GA21, Bt11 x MIR162 x

MON89034, Bt11 x MIR162 x MON89034 x GA21, Bt11 x MIR162 x TC1507, Bt11 x MIR162 x TC1507 x 5307, Bt11 x MIR162 x TC1507 x 5307 x GA21, Bt11 x MR162 x TC1507 x GA21 (AGRISURE Viptera 3220), BT11 x MIR604 (Agrisure BC/lL/RW), Bt11 x MIR604 x 5307, Bt11 x MIR604 x 5307 x GA21, Bt11 x MIR604 x GA21, Bt11 x MIR604 x TC1507, Bt11 x MIR604 x TC1507 x 5307, Bt11 x MIR604 x TC1507 x GA21, Bt11 x MON89Ø34 x GA21, Bt11 x TC1507, Bt11 x TC1507 x 5307, Bt11 x TC1507 x GA21, Bt176

[176] (NaturGard KnockOut / Maximizer), BVLA430101, CBH-351 (STARLINK Maize), DAS40278 (ENLIST Maize), DAS40278 x NK603, DBT418 (Bt Xtra Maize), DLL25 [B16], GA21 (ROUNDUP READY Maize / AGRISURE GT), GA21 x MON810 (ROUNDUP READY Yieldgard Maize), GA21 x T25, HCEM485, LY038 (MAVERA Maize), LY038 x MON810 (MAVERA Yieldgard Maize), MIR162 (AGRISURE Viptera), MIR162 x 5307, MIR162 x 5307 x GA21, MIR162 x GA21, MIR162 x MIR604, MIR162 x MIR604 x 5307, MIR162 x MIR604 x 5307 x GA21, MIR162 x MIR604 x GA21, MIR162 x MIR604 x TC1507 x 5307, MIR162 x MIR604 x TC1507 x 5307 x GA21, MIR162 x MIR604 x TC1507 x GA21, MIR162 x MON89Ø34, MIR162 x NK603, MIR162 x TC1507, MIR162 x TC1507 x 5307, MIR162 x TC1507 x 5307 x GA21, MIR162 x TC1507 x GA21, MIR604 (AGRISURE RW), MIR604 x 5307, MIR604 x 5307 x GA21, MIR604 x GA21 (AGRISURE GT/RW), MIR604 x NK603, MIR604 x TC1507, MIR604 x TC1507 x 5307, MIR604 x TC1507 x 5307 xGA21, MIR604 x TC1507 x GA21, MON801 [MON80100], MON802, MON809, MON810 (YIELDGARD, MAIZEGARD), MON810 x MIR162, MON810 x MIR162 x NK603, MON810 x MIR604, MON810 x MON88017 (YIELDGARD VT Triple), MON810 x NK603 x MIR604, MON832 (ROUNDUP READY Maize), MON863 (YIELDGARD Rootworm RW, MAXGARD), MON863 x MON810 (YIELDGARD Plus), MON863 x MON810 x NK603 (YIELDGARD Plus com RR), MON863 x

NK603 (YIELDGARD RW + RR), MON87403, MON87411, MON87419, MON87427 (ROUNDUP READY Maize), MON87427 x 59122, MON87427 x MON88017, MON87427 x MON88017 x 59122, MON87427 x MON89034, MON87427 x MON89034 x 59122, MON87427 x MON89034 x MIR162 x MON87411, MON87427 x MON89034 x MON88017, MON87427 x MON89034 x MON88017 x 59122, MON87427 x MON89034 x NK603, MON87427 x MON89034 x TC1507, MON87427 x MON89034 x TC1507 x 59122, MON87427 x MON89034 x TC1507 x MON87411 x 59122, MON87427 x MON89034 x TC1507 x MON87411 x 59122 x DAS40278, MON87427 x MON89034 x TC1507 x MON88017, MON87427 x MON89Ø34 x MIR162 x NK603, MON87427 x MON89Ø34 x TC15Ø7 x MON88Ø17 x 59122, MON87427 x TC1507, MON87427 x TC1507 x 59122, MON87427 x TC1507 x MON88017, MON87427 x TC1507 x MON88017 x 59122, MON87460 (GENUITY DROUGHTGARD), MON87460 x MON88017, MON87460 x MON89034 x MON88017, MON87460 x MON89034 x NK603, MON87460 x NK603, MON88017, MON88017 x DAS40278, MON89034, MON89034 x 59122, MON89034 x 59122 x DAS40278, MON89034 x 59122 x MON88017, MON89034 x 59122 x MON88017 x DAS40278, MON89034 x DAS40278, MON89034 x MON87460, MON89034 x MON88017 (GENUITY VT Triple Pro), MON89034 x MON88017 x DAS40278, MON89034 x NK603 (GENUITY VT Double Pro), MON89034 x NK603 x DAS40278, MON89034 x TC1507, MON89034 x TC1507 x 59122, MON89034 x TC1507 x 59122 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x MON88017, MON89034 x TC1507 x MON88017 x 59122 (GENUITY SMARTSTAX), MON89034 x TC1507 x MON88017 x 59122 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x MON88017 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x NK603 (POWER CORE), MON89034 x TC1507 x NK603 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x NK603 x MIR162, MON89034 x TC1507 x NK603 x MIR162 x DAS40278, MON89Ø34 x GA21, MS3 (INVIGOR Maize), MS6 (INVIGOR Maize),

MZHG0JG, MZIR098, NK603 (ROUNDUP READY 2 Maize), NK603 x MON810 x 4114 x MIR604, NK603 x MON810 (YIELDGARD CB + RR), NK603 x T25 (ROUNDUP READY LIBERTY LINK Maize), T14 (LIBERTY LINK Maize), T25 (LIBERTY LINK Maize), T25 x MON810 (LIBERTY LINK YIELDGARD Maize), TC1507 (HERCULEX I, HERCULEX CB), TC1507 x 59122 x MON810 x MIR604 x NK603 (OPTIMUM INTRASECT XTREME), TC1507 x MON810 x MIR604 x NK603, TC1507 x 5307, TC1507 x 5307 x GA21, TC1507 x 59122 (HERCULEX XTRA), TC1507 x 59122 x DAS40278, TC1507 x 59122 x MON810, TC1507 x 59122 x MON810 x MIR604, TC1507 x 59122 x MON810 x NK603 (OPTIMUM INTRASECT XTRA), TC1507 x 59122 x MON88017, TC1507 x 59122 x MON88017 x DAS40278, TC1507 x 59122 x NK603 (HERCULEX XTRA RR), TC1507 x 59122 x NK603 x MIR604, TC1507 x DAS40278, TC1507 x GA21, TC1507 x MIR162 x NK603, TC1507 x MIR604 x NK603 (OPTIMUM TRISECT), TC1507 x MON810, TC1507 x MON810 x MIR162, TC1507 x MON810 x MIR162 x NK603, TC1507 x MON810 x MIR604, TC1507 x MON810 x NK603 (OPTIMUM INTRASECT), TC1507 x MON810 x NK603 x MIR604, TC1507 x MON88017, TC1507 x MON88017 x DAS40278, TC1507 x NK603 (HERCULEX I RR), TC1507 x NK603 x DAS40278, TC6275 e VCO-01981-5.

Plantas Modificadas Geneticamente Adicionais

[00366] Os métodos e bactérias descritas nesse relatório descritivo são adequados para qualquer um de uma variedade de plantas modificadas geneticamente ou parte destas.

[00367] Além disso, os métodos e bactérias descritas nesse relatório descritivo são adequados para qualquer um dos seguintes eventos de plantas modificadas geneticamentes que foram aprovados em um ou mais países.

Tabela 14 – Traços de arroz, que podem ser combinados com micróbios da revelação.

Arroz Oryza sativa Evento Empresa Descrição CL121, CL141, BASF Inc. Tolerância ao CFX51 herbicida de imidazolinona, imazetapir, induzida por mutagênese química da enzima acetolactato sintase (ALS) usando metanossulfonato de etila (EMS).

IMINTA-1, BASF Inc. Tolerância aos IMINTA-4 herbicidas de imidazolinona induzida por mutagênese química da enzima acetolactato sintase (ALS) usando azida de sódio.

LLRICE06, Aventis Arroz tolerante ao LLRICE62 CropScience herbicida de glufosinato amônio produzido por inserção de um gene que codifica fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificado da bactéria do solo Streptomyces hygroscopicus).

LLRICE601 Bayer CropScience Arroz tolerante ao (Aventis herbicida de CropScience glufosinato amônio (AgrEvo)) produzido por inserção de um gene que codifica fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificado da bactéria do solo Streptomyces hygroscopicus).

PWC16 BASF Inc. Tolerância ao herbicida de imidazolinona, imazetapir, induzida por mutagênese química da enzima acetolactato sintase (ALS) usando metanossulfonato de etila (EMS).

Tabela 15 – Traços de alfafa, que podem ser combinados com micróbios da revelação.

Alfafa Medicago sativa Evento Empresa Descrição J101, J163 Monsanto Company Alfafa tolerante ao e Forage Genetics herbicida glifosato International (luzerna) produzida por inserção de um gene que codifica a enzima 5- enolpiruvilchiquimato- 3-fosfato sintase (EPSPS) da cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens.

Tabela 16 – Traços de trigo, que podem ser combinados com micróbios da revelação.

Trigo Triticum aestivum Evento Empresa Descrição

AP205CL BASF Inc. Seleção para uma versão mutagenizada da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS), também conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvato-liase.

AP602CL BASF Inc. Seleção para uma versão mutagenizada da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS), também conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvato-liase.

BW255-2, BW238- BASF Inc. Seleção para uma versão 3 mutagenizada da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS), também conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvato-liase.

BW7 BASF Inc. Tolerância aos herbicidas de imidazolinona induzida por mutagênese química do gene de acetohidroxiácido sintase (AHAS) usando azida de sódio.

MON71800 Monsanto Variedade de trigo Company tolerante ao glifosato produzida por inserção de um gene que codifica 5- enolpiruvilchiquimato- 3- fosfato sintase (EPSPS) modificado da bactéria do solo Agrobacterium tumefaciens, cepa CP4.

SWP965001 Cyanamid Crop Seleção para uma versão Protection mutagenizada da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS), também conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvato-liase.

Teal 11A BASF Inc. Seleção para uma versão mutagenizada da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS), também conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvato-liase.

Tabela 17 –Traços de girassol, que podem ser combinados com micróbios da revelação.

Girassol Helianthus annuus Evento Empresa Descrição X81359 BASF Inc. Tolerância aos herbicidas de imidazolinona por seleção de um mutante de ocorrência natural.

Tabela 18 – Traços de soja, que podem ser combinados com micróbios da revelação.

Soja Glycine max L.

Evento Empresa Descrição A2704-12, Bayer Soja tolerante ao A2704-21, CropScience herbicida de A5547-35 (Aventis glufosinato amônio CropScience produzida por inserção (AgrEvo)) de um gene que codifica fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificado da bactéria do solo Streptomyces viridochromogenes.

A5547-127 Bayer Soja tolerante ao CropScience herbicida de (Aventis glufosinato amônio CropScience produzida por inserção (AgrEvo)) de um gene que codifica fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificado da bactéria do solo Streptomyces viridochromogenes.

BPS-CV127-9 BASF Inc. O gene csr1-2 introduzido de Arabidopsis thaliana codifica uma proteína acetohidroxiácido sintase que confere tolerância aos herbicidas de imidazolinona em função de uma mutação pontual que resulta em uma substituição de aminoácido único na qual o resíduo de serina na posição 653 é substituído por asparagina (S653N).

DP-305423 Pioneer Hi-Bred Soja rica em ácido International oléico produzida por Inc. inserção de cópias adicionais de uma porção do gene que codifica ômega 6 desaturase, gm-fad2-1, resultando no silenciamento do gene endógeno de ômega-6 desaturase (FAD2-1).

DP356043 Pioneer Hi-Bred Evento de soja com dois International genes de tolerância a Inc. herbicidas: glifosato N-acetiltransferase, que detoxifica glifosato, e um gene de acetolactato sintase (ALS) modificado que é tolerante aos herbicidas que inibem ALS.

G94-1, G94-19, DuPont Canada Soja rica em ácido G168 Agricultural oléico produzida por

Products inserção de uma segunda cópia do gene que codifica ácido graxo desaturase (Gm Fad2-1) de soja, que resultou no “silenciamento” do gene endógeno do hospedeiro.

GTS 40-3-2 Monsanto Company Variedade de soja tolerante ao glifosato produzida por inserção de um gene que codifica 5- enolpiruvilchiquimato- 3- fosfato sintase (EPSPS) modificado da bactéria do solo Agrobacterium tumefaciens.

GU262 Bayer Soja tolerante ao CropScience herbicida de (Aventis glufosinato amônio CropScience produzida por inserção (AgrEvo)) de um gene que codifica fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificado da bactéria do solo Streptomyces viridochromogenes.

MON87701 Monsanto Company Resistência a pragas de Lepidópteros de soja, incluindo lagarta-da- soja (Anticarsia gemmatalis) e lagarta falsa-medideira da soja (Pseudoplusia includens).

MON87701 x Monsanto Company Tolerância aos MON89788 herbicidas de glifosato por meio da expressão do gene que codifica EPSPS de A. tumefaciens cepa CP4, e resistência a pragas de Lepidópteros de soja, incluindo lagarta-da- soja (Anticarsia gemmatalis) e lagarta falsa-medideira da soja (Pseudoplusia includens) por meio da expressão do gene que codifica Cry1Ac de B. thuringiensis.

MON89788 Monsanto Company Soja tolerante ao glifosato produzida por inserção de um gene modificado de 5- enolpiruvilchiquimato- 3-fosfato sintase (EPSPS) que codifica aroA (EPSPS) de Agrobacterium tumefaciens CP4.

OT96-15 Agriculture & Soja com baixo teor de Agri-Food Canada ácido linolênico produzida por meio de reprodução cruzada tradicional para incorporar o novel traço de um gene mutante fan1 de ocorrência natural que foi selecionado para baixo teor de ácido linolênico.

W62, W98 Bayer Soja tolerante ao CropScience herbicida de (Aventis glufosinato amônio CropScience produzida por inserção (AgrEvo)) de um gene que codifica fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificado da bactéria do solo Streptomyces hygroscopicus.

Tabela 19 – Traços de milho, que podem ser combinados com micróbios da revelação.

Maís Zea mays L.

Evento Empresa Descrição 176 Syngenta Seeds, Maís resistente a Inc. insetos produzida por inserção do gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. A modificação genética gera resistência ao ataque pela broca do milho européia (ECB).

3751 IR Pioneer Hi-Bred Seleção de variantes 676, 678, 680 International somaclonais por cultura Inc. de embriões em meios que Pioneer Hi-Bred contêm imidazolinona. International Maís com esterilidade Inc. masculina e tolerante ao herbicida de glufosinato amônio produzida por inserção de genes que codificam DNA adenina metilase e fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Escherichia coli e Streptomyces viridochromogenes, respectivamente.

B16 (DLL25) Dekalb Genetics Maís tolerante ao Corporation herbicida de glufosinato amônio produzida por inserção do gene que codifica fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Streptomyces hygroscopicus.

BT11 Syngenta Seeds, Maís resistente a (X4334CBR, Inc. insetos e tolerante a X4734CBR) herbicidas produzida por inserção do gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, e do gene que codifica fosfinotricina N-acetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes.

BT11 x GA21 Syngenta Seeds, Maís estaqueado Inc. resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por reprodução cruzada convencional de linhagens parentais BT11 (Identificador único em OECD: SYN-BTO11-1) e GA21 (Identificador único em OECD: MON- OOO21-9).

BT11 x MIR162 Syngenta Seeds, Resistência a pragas de x MIR604 x Inc. Coleópteros, GA21 particularmente pragas de larva-alfinete do milho (Diabrotica spp.) e várias pragas de Lepidópteros do milho, incluindo broca do milho européia (ECB, Ostrinia nubilalis), lagarta-da- espiga do milho (CEW, Helicoverpa zea), lagarta-do-cartucho do milho (FAW, Spodoptera frugiperda) e lagarta- rosca (BCW, Agrotis ipsilon); tolerância aos herbicidas que contêm glifosato e glufosinato- amônio.

BT11 x MIR162 Syngenta Seeds, Maís estaqueado Inc. resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por reprodução cruzada convencional de linhagens parentais BT11 (Identificador único em OECD: SYN-BTO11-1) e MIR162 (Identificador único em OECD: SYN- 1R162-4). Resistência à broca do milho européia e tolerância ao herbicida de glufosinato amônio (Liberty) é derivada de BT11, que contém o gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, e o gene que codifica fosfinotricina N- acetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes.

Resistência a outras pragas de Lepidópteros, incluindo H. zea, S. frugiperda, A. ipsilon, e S. albicosta, é derivada de MIR162, que contém o gene vip3Aa de Bacillus thuringiensis cepa AB88.

BT11 x MIR162 Syngenta Seeds, Proteína delta- x MIR604 Inc. endotoxina de Cry1Ab de Bacillus thuringiensis e o material genético necessário para sua produção (por meio de elementos do vetor pZO1502) no Evento de milho Bt11 (Identificador Único OECD: SYNBTO11-1) x proteína inseticida Vip3Aa20 de Bacillus thuringiensis e o material genético necessário para sua produção (por meio de elementos do vetor pNOV1300) no Evento de maís MIR162 (Identificador Único OECD: SYN-IR162-4) x proteína Cry3A modificada e o material genético necessário para sua produção (por meio de elementos do vetor pZM26) no Evento de milho MIR604 (Identificador Único OECD: SYN-1R604-5).

CBH-351 Aventis Maís resistente a CropScience insetos e tolerante ao herbicida de glufosinato amônio desenvolvida por inserção de genes que codificam a proteína Cry9C de Bacillus thuringiensis subsp tolworthi e fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Streptomyces hygroscopicus.

DAS-06275-8 DOW AgroSciences Variedade de maís LLC resistente a insetos Lepidópteros e tolerante ao herbicida de glufosinato amônio produzida por inserção do gene Cry1F de Bacillus thuringiensis var aizawai e do de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Streptomyces hygroscopicus.

BT11 x MIR604 Syngenta Seeds, Maís estaqueado Inc. resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por reprodução cruzada convencional de linhagens parentais BT11 (Identificador único em OECD: SYN-BTO11-1) e MIR604 (Identificador único em OECD: SYN- 1R6O5-5). Resistência à broca do milho européia e tolerância ao herbicida de glufosinato amônio (Liberty) é derivada de BT11, que contém o gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, e o gene que codifica fosfinotricina N- acetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes. larva-alfinete do milho -resistência é derivada de MIR604 que contém o gene mCry3A de Bacillus thuringiensis.

BT11 x MIR604 Syngenta Seeds, Maís estaqueado x GA21 Inc. resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por reprodução cruzada convencional de linhagens parentais BT11 (Identificador único em OECD: SYN-BTO11-1), MIR604 (Identificador único em OECD: SYN- 1R6O5-5) e GA21 (Identificador único em OECD: MON-OOO21-9). Resistência à broca do milho européia e tolerância ao herbicida de glufosinato amônio (Liberty) é derivada de BT11, que contém o gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, e o gene que codifica fosfinotricina N-acetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes. Resistência à larva-

alfinete do milho é derivada de MIR604 que contém o gene mCry3A de Bacillus thuringiensis. Tolerância ao herbicida de glifosato é derivada de GA21 que contém um gene EPSPS de maís modificado.

DAS-59122-7 DOW AgroSciences Maís resistente à larva- LLC e Pioneer alfinete do milho Hi-Bred produzida por inserção International dos genes Cry34Ab1 e Inc. Cry35Ab1 de Bacillus thuringiensis cepa PS149B1. O gene que codifica PAT de Streptomyces viridochromogenes foi introduzido como um marcador selecionável.

DAS-59122-7 x DOW AgroSciences Maís estaqueado TC1507 x LLC e Pioneer resistente a insetos e NK603 Hi-Bred tolerante a herbicidas International produzido por reprodução Inc. cruzada convencional de linhagens parentais DAS- 59122-7 (Identificador único em OECD: DAS- 59122-7) e TC1507 (Identificador único em OECD: DAS-01507-1) com NK603 (Identificador único em OECD: MON- 00603-6). Resistência à larva-alfinete do milho é derivada de DAS-59122- 7 que contém os genes Cry34Abl e Cry35Abl de Bacillus thuringiensis cepa P5149B1. Resistência a Lepidópteros e tolerância ao herbicida de glufosinato amônio são derivadas de TC1507. Tolerância ao herbicida de glifosato é derivada de NK603.

DBT418 Dekalb Genetics Maís resistente a Corporation insetos e tolerante ao herbicida de glufosinato amônio desenvolvida por inserção de genes que codificam proteína Cry1AC de Bacillus thuringiensis subsp kurstaki e fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Streptomyces hygroscopicus.

MIR604 x GA21 Syngenta Seeds, Maís estaqueado Inc. resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por reprodução cruzada convencional de linhagens parentais MIR604 (Identificador único em OECD: SYN- 1R605-5) e GA21 (Identificador único em OECD: MON-00021-9). Resistência à larva- alfinete do milho é derivada de MIR604 que contém o gene mCry3A de Bacillus thuringiensis. Tolerância ao herbicida de glifosato é derivada de GA21.

MON80100 Monsanto Company Maís resistente a insetos produzida por inserção do gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. A modificação genética gera resistência ao ataque pela broca do milho européia (ECB).

MON802 Monsanto Company Maís resistente a insetos e tolerante a herbicidas de glifosato produzida por inserção dos genes que codificam a proteína Cry1Ab de Bacillus thuringiensis e a 5- enolpiruvilchiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) de A. tumefaciens cepa CP4.

MON809 Pioneer Hi-Bred Resistência à broca do International milho européia (Ostrinia Inc. nubilalis) por introdução de um gene Cry1Ab sintético. Glifosato resistência por meio da introdução da versão bacteriana de uma enzima de planta, 5-enolpiruvilchiquimato-

3-fosfato sintase (EPSPS).

MON810 Monsanto Company Maís resistente a insetos produzida por inserção de uma forma truncada do gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1. A modificação genética gera resistência ao ataque pela broca do milho européia (ECB).

MON810 x Monsanto Company Maís estaqueado LY038 resistente a insetos e com teor de lisina aumentado derivada de reprodução cruzada convencional das linhagens parentais MON810 (Identificador em OECD: MON-OO81O-6) e LY038 (Identificador em OECD: REN-OOO38-3).

MON810 x Monsanto Company Maís estaqueado MON88017 resistente a insetos e tolerante ao glifosato derivada de reprodução cruzada convencional das linhagens parentais MON810 (Identificador em OECD: MON-OO81O-6) e MON88017 (Identificador em OECD: MON-88017-3). Resistência à broca do milho européia (ECB) é derivada de uma forma truncada do gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 presente em MON810. Resistência à larva-alfinete do milho é derivada do gene Cry3Bbl de Bacillus thuringiensis subespécie kumamotoensis cepa EG4691 presente em MON88017. Tolerância ao glifosato é derivada de um gene que codifica 5- enolpiruvilchiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) de Agrobacterium tumefaciens cepa CP4 presente em MON88017.

MON832 Monsanto Company Introdução, por bombardeamento de partículas, de glifosato oxidase (GOX) e uma 5- enolpiruvilchiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) modificada, uma enzima envolvida na via bioquímica de chiquimato para a produção dos aminoácidos aromáticos.

MON863 Monsanto Company Maís resistente à larva- alfinete do milho produzida por inserção do gene Cry3Bbl de Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis.

MON863 x Monsanto Company Milho híbrido resistente MON810 a insetos derivado de reprodução cruzada convencional das linhagens parentais MON863 (Identificador em OECD: MON-00863-5) e MON810 (Identificador em OECD: MON-00810-6) MON863 x Monsanto Company Milho híbrido estaqueado MON810 x resistente a insetos e Monsanto tolerante a herbicidas

NK603 derivado de reprodução cruzada convencional do híbrido estaqueado MON- 00863-5 x MON-00810-6 e NK603 (Identificador em OECD: MON-00603-6).

MON863 x Monsanto Company Milho híbrido estaqueado NK603 resistente a insetos e tolerante a herbicidas derivado de reprodução cruzada convencional das linhagens parentais MON863 (Identificador em OECD: MON-OO863-5) e NK603 (Identificador em OECD: MON-OO6O3-6).

MON87460 Monsanto Company MON 87460 foi desenvolvido para fornecer perda de rendimento reduzida sob condições de água limitada, comparado com maís convencional. A eficácia em MON 87460 é derivada por expressão das proteína de choque térmico B de Bacillus subtilis inserida

(CspB).

MON88017 Monsanto Company Maís resistente à larva- alfinete do milho produzida por inserção do gene Cry3Bbl de Bacillus thuringiensis subespécie kumamotoensis cepa EG4691. Tolerância ao glifosato derivada por inserção de um gene que codifica 5- enolpiruvilchiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) de Agrobacterium tumefaciens cepa CP4.

MON89034 Monsanto Company Evento de maís que expressa duas proteínas inseticidas diferentes de Bacillus thuringiensis fornecendo resistência a diversas pragas de Lepidópteros.

MON89034 x Monsanto Company Maís estaqueado MON88017 resistente a insetos e tolerante ao glifosato derivada de reprodução cruzada convencional das linhagens parentais

MON89034 (Identificador em OECD: MON-89O34-3) e MON88017 (Identificador em OECD: MON-88O17-3). Resistência a insetos Lepidópteros é derivada de dois genes Cry presentes em MON89043. Resistência à larva- alfinete do milho é derivada de um único gene Cry e tolerância ao glifosato é derivada do gene que codifica 5- enolpiruvilchiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) de Agrobacterium tumefaciens presente em MON88017.

MON89034 x Monsanto Company Maís estaqueado NK603 resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por reprodução cruzada convencional de linhagens parentais MON89034 (Identificador em OECD: MON-89034-3) com NK603 (Identificador único em OECD: MON-

00603-6). Resistência a insetos Lepidópteros é derivada de dois genes Cry presentes em MON89043. Tolerância ao herbicida de glifosato é derivada de NK603.

NK603 x Monsanto Company Milho híbrido estaqueado MON810 resistente a insetos e tolerante a herbicidas derivado de reprodução cruzada convencional das linhagens parentais NK603 (Identificador em OECD: MON-00603-6) e MON810 (Identificador em OECD: MON-00810-6).

MON89034 x Monsanto Company Maís estaqueado TC1507 x e Mycogen Seeds resistente a insetos e MON88017 x a/c Dow tolerante a herbicidas DAS-59122-7 AgroSciences LLC produzido por reprodução cruzada convencional de linhagens parentais: MON89034, TC1507, MON88017 e DAS-59 122. Resistência às pragas de inseto acima do solo e abaixo do solo e tolerância ao glifosato e herbicidas que contêm glufosinato-amônio.

M53 Bayer Esterilidade masculina CropScience causada por expressão do (Aventis gene de barnase CropScience ribonuclease de Bacillus (AgrEvo)) amiloliquefaciens; resistência a PPT era por meio de PPT- acetiltransferase (PAT).

M56 Bayer Esterilidade masculina CropScience causada por expressão do (Aventis gene de barnase CropScience ribonuclease de Bacillus (AgrEvo) amiloliquefaciens; resistência a PPT era por meio de PPT- acetiltransferase (PAT).

NK603 Monsanto Company Introdução, por bombardeamento de partículas, de uma 5- enolpiruvilchiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) modificada, uma enzima envolvida na via bioquímica de chiquimato para a produção dos aminoácidos aromáticos.

NK603 x T25 Monsanto Company Maís híbrido estaqueado tolerante aos herbicidas de glufosinato amônio e de glifosato derivado de reprodução cruzada convencional das linhagens parentais NK603 (Identificador em OECD: MON-00603-6) e T25 (Identificador em OECD: ACS-ZM003-2).

T25 x MON810 Bayer Milho híbrido estaqueado CropScience resistente a insetos e (Aventis tolerante a herbicidas CropScience derivado de reprodução (AgrEvo)) cruzada convencional das linhagens parentais T25 (Identificador em OECD: ACS-ZMOO3-2) e MON810 (Identificador em OECD: MON-OO81O-6).

TC1507 Mycogen (a/c Dow Maís resistente a AgroSciences); insetos e tolerante ao Pioneer (a/c herbicida de glufosinato DuPont) amônio produzida por inserção do gene Cry1F de Bacillus thuringiensis var. aizawai e do gene que codifica fosfinotricina N-acetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes.

TC1507 x DOW AgroSciences Milho híbrido estaqueado NK603 LLC resistente a insetos e tolerante a herbicidas derivado de reprodução cruzada convencional das linhagens parentais 1507 (Identificador em OECD: DAS-O15O7-1) e NK603 (Identificador em OECD: MON-OO6O3-6).

TC1507 x DAS- DOW AgroSciences Maís estaqueado 59122-7 LLC e Pioneer resistente a insetos e Hi-Bred tolerante a herbicidas International produzido por reprodução Inc. cruzada convencional de linhagens parentais TC1507 (Identificador único em OECD: DAS- O15O7-1) com DAS-59122-7 (Identificador único em OECD: DAS-59122-7). Resistência a insetos

Lepidópteros é derivada de TC1507 em função da presença do gene Cry1F de Bacillus thuringiensis var. aizawai. Resistência à larva-alfinete do milho é derivada de DAS-59122- 7 que contém o gene de Cry34Ab1 e Cry35Ab1 de Bacillus thuringiensis cepa P5149B1. Tolerância ao herbicida de glufosinato amônio é derivada de TC1507 do gene que codifica fosfinotricina N- acetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes.

Evento Empresa Descrição Família do híbrido P0157 Dupont Pioneer P0157 P0157AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0157 P0157AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0157

P0157R Dupont Pioneer RR2 P0157

P0339AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0339

P0339AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0339

P0306AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0306

P0589 Dupont Pioneer P0589

P0589AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0589

P0589AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0589

P0589R Dupont Pioneer RR2 P0589

P0574 Dupont Pioneer P0574

P0574AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0574

P0574AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0574

P0533EXR Dupont Pioneer HXX LL RR2 P0533

P0506AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0566

P0760AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0760

P0707AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0707

P0707AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0707

P0825AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0825

P0825AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0825

P0969AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0969

P0969AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0969

P0937AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0937

P0919AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0919

P0905EXR Dupont Pioneer HXX LL RR2 P0905

P1197 Dupont Pioneer P1197

P1197AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1197

P1197AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P1197

P1197R Dupont Pioneer RR2 P1197

P1151 Dupont Pioneer P1151

P1151AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1151

P1151R Dupont Pioneer RR2 P1151

P1138AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1138

P1366AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1366

P1366AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P1366

P1365AMX Dupont Pioneer AMX LL RR2 P1365

P1353AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1353

P1345 Dupont Pioneer P1345

P1311AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P1311

P1498EHR Dupont Pioneer HX1 LL RR2 P1498

P1498R Dupont Pioneer RR2 P1498 P1443AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1443 P1555CHR Dupont Pioneer RW HX1 LL P1555 RR2 P1751AMT Dupont Pioneer AMT LL RR2 P1751 P2089AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P2089 QROME Dupont Pioneer Q LL RR2

[00368] A seguir, serão apresentadas as definições para as abreviações que ocorrem na Tabela 19. Sistema de Proteção Contra Insetos AM - OPTIMUM ACREMAX com YGCB, HX1, LL, RR2. Sistema de Proteção Contra Insetos AMT - OPTIMUM ACREMAX TRISECT com RW, YGCB, HX1, LL, RR2. AMXT - (OPTIMUM ACREMAX XTreme). HXX - HERCULEX XTRA contém os genes RW Herculex I e Herculex. HX1 - Contém o gene de Proteção Contra Insetos HERCULEX I que fornece proteção contra broca do milho européia, broca do milho do sudoeste, lagarta-rosca, lagarta-do-cartucho do milho, lagarta-da-espiga de milho, broca-do-colo do milho, broca da espiga de milho do sul, e broca da cana de açúcar; e suprime lagarta-da-espiga do milho. LL - Contém o gene LIBERTYLINK para resistência ao herbicida LIBERTY. RR2 - Contém o traço de Milho 2 ROUNDUP READY que fornece segurança ao plantio para aplicações over- the-top de herbicidas de glifosato rotulados quando aplicados de acordo com as instruções do rótulo. YGCB – contém o gene da Broca do Milho YIELDGARD oferece um nível elevado de resistência à broca do milho européia, broca do milho do sudoeste, e broca da espiga de milho do sul;

resistência moderada à lagarta-da-espiga do milho e broca do talo comum; e resistência acima da média à lagarta-do- cartucho do milho. RW – contém o traço de resistência à vaquinha AGRISURE. Q – fornece proteção ou supressão contra broca do milho européia, broca do milho do sudoeste, lagarta- rosca, lagarta-do-cartucho do milho, broca-do-colo do milho, broca da espiga de milho do sul, broca do talo, broca da cana de açúcar e lagarta-da-espiga do milho; e também fornece proteção de lesão larval causada por larva-alfinete ocidental do milho, larva-alfinete do norte do milho, e larva-alfinete mexicana do milho; contém (1) genes de Proteção Contra Insetos HERCULEX XTRA que produzem proteínas Cry1F e Cry34ab1 e Cry35ab1, (2) traço AGRISURE RW que inclui um gene que produz proteína mCry3A, e (3) gene da Broca do Milho YIELDGARD que produz proteína Cry1Ab. Concentrações e Taxas de Aplicação de Composições Agrícolas

[00369] Como mencionado anteriormente, as composições agrícolas da presente revelação, que compreendem um micróbio ensinado, podem ser aplicadas às plantas de várias formas. Em dois aspectos particulares, a revelação contempla um tratamento nos sulcos de arado ou um tratamento de sementes.

[00370] Para as modalidades de tratamento de semente, os micróbios da revelação podem estar presentes na semente em diversas concentrações. Por exemplo, os micróbios podem ser encontrados em um tratamento de semente em uma concentração de cfu, por semente de: 1 x 101, 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, ou mais. Em aspectos particulares, as composições para tratamento de sementes compreendem cerca de 1 x 104 até cerca de 1 x 108 cfu por semente. Em outros aspectos particulares, as composições para tratamento de sementes compreendem cerca de 1 x 105 até cerca de 1 x 107 cfu por semente. Em outros aspectos, as composições para tratamento de sementes compreendem cerca de 1 x 106 cfu por semente.

[00371] Nos Estados Unidos, cerca de 10% dos acres de milho são plantados em uma densidade de sementes acima de cerca de 36.000 sementes por acre; 1/3 dos acres de milho é plantado em uma densidade de sementes entre cerca de 33.000 até 36.000 sementes por acre; 1/3 dos acres de milho é plantado em uma densidade de sementes entre cerca de 30.000 até 33.000 sementes por acre, e o restante dos acres é variável. Veja, “Corn Seeding Rate Considerations”, escrito por Steve Butzen, disponível em: https://www.pioneer.com/home/site/us/agronomy/library/corn- seeding-rate-considerations/.

[00372] A Tabela 20 abaixo utiliza várias concentrações de cfu por semente em uma modalidade contemplada de tratamento de semente (fileiras) e várias densidades de plantio de acres de sementes (1ª coluna: 15K- 41K) para calcular a quantidade total de cfu por acre, que seria utilizada em vários cenários agrícolas (ou seja, concentração de tratamento de semente por semente x densidade de sementes plantadas por acre). Dessa forma, se fossemos utilizar um tratamento de semente com 1 x 106 cfu por semente e plantar 30.000 sementes por acre, então o teor de cfu total por acre seria 3 x 1010 (ou seja, 30K * 1 x 106).

Tabela 20: Cálculo de CFU total por acre para modalidades de tratamento de sementes. População de milho (ou 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1,00E+09 seja, sementes por acre)

15.000 1,50E+06 1,50E+07 1,50E+08 1,50E+09 1,50E+10 1,50E+11 1,50E+12 1,50E+13

16.000 1,60E+06 1,60E+07 1,60E+08 1,60E+09 1,60E+10 1,60E+11 1,60E+12 1,60E+13

17.000 1,70E+06 1,70E+07 1,70E+08 1,70E+09 1,70E+10 1,70E+11 1,70E+12 1,70E+13

18.000 1,80E+06 1,80E+07 1,80E+08 1,80E+09 1,80E+10 1,80E+11 1,80E+12 1,80E+13

19.000 1,90E+06 1,90E+07 1,90E+08 1,90E+09 1,90E+10 1,90E+11 1,90E+12 1,90E+13

20.000 2,00E+06 2,00E+07 2,00E+08 2,00E+09 2,00E+10 2,00E+11 2,00E+12 2,00E+13

21.000 2,10E+06 2,10E+07 2,10E+08 2,10E+09 2,10E+10 2,10E+11 2,10E+12 2,10E+13

22.000 2,20E+06 2,20E+07 2,20E+08 2,20E+09 2,20E+10 2,20E+11 2,20E+12 2,20E+13

23.000 2,30E+06 2,30E+07 2,30E+08 2,30E+09 2,30E+10 2,30E+11 2,30E+12 2,30E+13

24.000 2,40E+06 2,40E+07 2,40E+08 2,40E+09 2,40E+10 2,40E+11 2,40E+12 2,40E+13

25.000 2,50E+06 2,50E+07 2,50E+08 2,50E+09 2,50E+10 2,50E+11 2,50E+12 2,50E+13

26.000 2,60E+06 2,60E+07 2,60E+08 2,60E+09 2,60E+10 2,60E+11 2,60E+12 2,60E+13

27.000 2,70E+06 2,70E+07 2,70E+08 2,70E+09 2,70E+10 2,70E+11 2,70E+12 2,70E+13

População de milho (ou 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1,00E+09 seja, sementes por acre)

28.000 2,80E+06 2,80E+07 2,80E+08 2,80E+09 2,80E+10 2,80E+11 2,80E+12 2,80E+13

29.000 2,90E+06 2,90E+07 2,90E+08 2,90E+09 2,90E+10 2,90E+11 2,90E+12 2,90E+13

30.000 3,00E+06 3,00E+07 3,00E+08 3,00E+09 3,00E+10 3,00E+11 3,00E+12 3,00E+13

31.000 3,10E+06 3,10E+07 3,10E+08 3,10E+09 3,10E+10 3,10E+11 3,10E+12 3,10E+13

32.000 3,20E+06 3,20E+07 3,20E+08 3,20E+09 3,20E+10 3,20E+11 3,20E+12 3,20E+13

33.000 3,30E+06 3,30E+07 3,30E+08 3,30E+09 3,30E+10 3,30E+11 3,30E+12 3,30E+13

34.000 3,40E+06 3,40E+07 3,40E+08 3,40E+09 3,40E+10 3,40E+11 3,40E+12 3,40E+13

35.000 3,50E+06 3,50E+07 3,50E+08 3,50E+09 3,50E+10 3,50E+11 3,50E+12 3,50E+13

36.000 3,60E+06 3,60E+07 3,60E+08 3,60E+09 3,60E+10 3,60E+11 3,60E+12 3,60E+13

37.000 3,70E+06 3,70E+07 3,70E+08 3,70E+09 3,70E+10 3,70E+11 3,70E+12 3,70E+13

38.000 3,80E+06 3,80E+07 3,80E+08 3,80E+09 3,80E+10 3,80E+11 3,80E+12 3,80E+13

39.000 3,90E+06 3,90E+07 3,90E+08 3,90E+09 3,90E+10 3,90E+11 3,90E+12 3,90E+13

40.000 4,00E+06 4,00E+07 4,00E+08 4,00E+09 4,00E+10 4,00E+11 4,00E+12 4,00E+13

41.000 4,10E+06 4,10E+07 4,10E+08 4,10E+09 4,10E+10 4,10E+11 4,10E+12 4,10E+13

[00373] Para modalidades no sulco, os micróbios da revelação podem ser aplicados em uma concentração de cfu por acre de: 1 x 106, 3,20 x 1010, 1,60 x 1011, 3,20 x 1011, 8,0 x 1011, 1,6 x 1012, 3,20 x 1012, ou mais. Portanto, em alguns aspectos, as composições líquidas no sulco podem ser aplicadas em uma concentração entre cerca de 1 x 106 até cerca de 3 x 1012 cfu por acre.

[00374] Em alguns aspectos, as composições no sulco estão contidas em uma formulação líquida. Nas modalidades no sulco líquidas, os micróbios podem estar presentes em uma concentração de cfu por mililitro de: 1 x 101, 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, ou mais. Em certos aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios em uma concentração de cerca de 1 x 106 até cerca de 1 x 1011 cfu por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios em uma concentração de cerca de 1 x 107 até cerca de 1 x 1010 cfu por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios em uma concentração de cerca de 1 x 108 até cerca de 1 x 109 cfu por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas no sulco compreendem micróbios em uma concentração de até cerca de 1 x 1013 cfu por mililitro. Definição do Perfil Transcriptômico de Micróbios Candidatos

[00375] Trabalho prévio pelos inventores consistiu na definição do perfil transcriptômico da cepa CI010 para identificar promotores que são ativos na presença de nitrogênio ambiental. A Cepa CI010 foi cultivada em meios definidos livres de nitrogênio suplementados com 10 mM de glutamina. RNA total foi extraído dessas culturas (kit RNeasy de QIAGEN) e submetido ao sequenciamento RNAseq por meio de HiSeq de Illumina (SeqMatic, Fremont CA). As leituras de sequenciamento foram mapeadas para os dados de genoma de CI010 usando Geneious, e os genes altamente expressos sob o controle de promotores da transcrição proximais foram identificados.

[00376] As Tabelas 21-23 listam genes e seu nível de expressão relativo, como medido por meio de sequenciamento RNASeq de RNA total. Sequências dos promotores proximais foram registradas para uso na mutagênese de vias de nif, vias relacionadas à utilização de nitrogênio, ou outros genes com um nível de expressão desejado.

Tabela 21 Nome Mínimo Máximo Comprimento Direção Lipoproteína mureína CDS 2.929.898 2.930.134 237 direta Proteína da membrana CDS 5.217.517 5.217.843 327 direta Proteína de ligação ao zinco/cádmio - CDS 3.479.979 3.480.626 648 direta Proteína carreadora de acil CDS 4.563.344 4.563.580 237 reversa ompX CDS 4.251.002 4.251.514 513 direta Proteína de ligação ao DNA HU-beta CDS 375.156 375.428 273 direta sspA CDS 629.998 630.636 639 reversa tatE CDS 3.199.435 3.199.638 204 reversa Repressor de LexA CDS 1.850.457 1.851.065 609 direta hisS CDS <3999979 4.001.223 >1245 direta Tabela 22

Nome Confiança Proporção RNASeq_ RNASeq_ RNASeq_WT - RNASeq_WT - absoluta da diferencial nifL - nifL - Contagem de Contagem expressão de Contagem de Contagem leitura bruta de diferencial expressão leitura bruta de bruta transcrito bruta transcrito Lipoproteína 1000 -1,8 12950,5 10078,9 5151,5 4106,8 mureína CDS Proteína da 1000 -1,3 9522,5 5371,3 5400 3120 membrana CDS Proteína de ligação ao 3,3 1,1 6461 1839,1 5318 1550,6 zinco/cádmio

CDS Proteína carreadora de 25,6 1,6 1230,5 957,6 1473,5 1174,7 acil CDS ompX CDS 1,7 1,1 2042 734,2 1687,5 621,5 Proteína de 6,9 -1,3 1305 881,7 725 501,8

Nome Confiança Proporção RNASeq_ RNASeq_ RNASeq_WT - RNASeq_WT - absoluta da diferencial nifL - nifL - Contagem de Contagem expressão de Contagem de Contagem leitura bruta de diferencial expressão leitura bruta de bruta transcrito bruta transcrito ligação ao DNA HU-beta CDS sspA CDS 0,2 1 654 188,8 504,5 149,2 tatE CDS 1,4 1,3 131 118,4 125 115,8 Repressor de 0,1 -1,1 248 75,1 164 50,9 LexA CDS hisS CDS 0 -1,1 467 69,2 325 49,3

Tabela 23 Prm Iniciador (na Sequência expressa Sequência vizinha Name direção direta, ID.

DE SEQ.

Nº: ID.

DE SEQ.

Nº: região -250 a +10) ID.

DE SEQ.

Nº: Lipoproteína ID.

DE SEQ.

Nº: 3 ID.

DE SEQ.

Nº: 13 ID.

DE SEQ.

Nº: 23 mureína CDS Proteína da ID.

DE SEQ.

Nº: 4 ID.

DE SEQ.

Nº: 14 ID.

DE SEQ.

Nº: 24 membrana CDS Proteína de ligação ID.

DE SEQ.

Nº: 5 ID.

DE SEQ.

Nº: 15 ID.

DE SEQ.

Nº: 25 ao zinco/cádmio CDS Proteína carreadora ID.

DE SEQ.

Nº: 6 ID.

DE SEQ.

Nº: 16 ID.

DE SEQ.

Nº: 26 de acil CDS ompX CDS ID.

DE SEQ.

Nº: 7 ID.

DE SEQ.

Nº: 17 ID.

DE SEQ.

Nº: 27 Proteína de ligação ID.

DE SEQ.

Nº: 8 ID.

DE SEQ.

Nº: 18 ID.

DE SEQ.

Nº: 28 ao DNA HU-beta CDS sspA CDS ID.

DE SEQ.

Nº: 9 ID.

DE SEQ.

Nº: 19 ID.

DE SEQ.

Nº: 29

Prm Iniciador (na Sequência expressa Sequência vizinha Name direção direta, ID. DE SEQ. Nº: ID. DE SEQ. Nº: região -250 a +10) ID. DE SEQ. Nº: tatE CDS ID. DE SEQ. Nº: 10 ID. DE SEQ. Nº: 20 ID. DE SEQ. Nº: 30 Repressor de LexA ID. DE SEQ. Nº: 11 ID. DE SEQ. Nº: 21 ID. DE SEQ. Nº: 31

CDS hisS CDS ID. DE SEQ. Nº: 12 ID. DE SEQ. Nº: 22 ID. DE SEQ. Nº: 32 Tabela 24 – Tabela de cepas. Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 Cepa isolada dos gêneros CI006 Enterobacter Nenhum WT (agora Kosakonia)

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 Cepa isolada CI008 dos gêneros Nenhum WT Burkholderia Cepa isolada CI010 dos gêneros Nenhum WT Klebsiella Cepa isolada CI019 dos gêneros Nenhum WT Rahnella Cepa isolada CI028 dos gêneros Nenhum WT Enterobacter Cepa isolada CI050 dos gêneros Nenhum WT Klebsiella

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à Mutante de ID.

DE SEQ.

CM002 canamicina (KanR) que ΔnifL::KanR CI050 Nº: 33 codifica o gene de aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de Mutante de ID.

DE SEQ.

CM011 resistência à ΔnifL::SpecR CI019 Nº: 34 espectinomicina (SpecR) que codifica o gene de

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 estreptomicina 3’’-O- adenilil-transferase aadA inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à Mutante de ID.

DE SEQ.

CM013 canamicina (KanR) que ΔnifL::KanR CI006 Nº: 35 codifica o gene de aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido.

Ruptura do gene amtB Mutante de com um cassete de ID.

DE SEQ.

CM004 ΔamtB::KanR CI010 expressão de Nº: 36 resistência à

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 canamicina (KanR) que codifica o gene de aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à Mutante de ID.

DE SEQ.

CM005 canamicina (KanR) que ΔnifL::KanR CI010 Nº: 37 codifica o gene de aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido.

Mutante de Ruptura do gene nifL ID.

DE SEQ.

CM015 ΔnifL::Prm5 CI006 com um fragmento da Nº: 38

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 região a montante do gene ompX inserido (Prm5). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante de Mutante de ID.

DE SEQ.

CM021 um gene não anotado e ΔnifL::Prm2 CI006 Nº: 39 os primeiros 73 bp daquele gene inserido (Prm2). Ruptura do gene nifL com um fragmento da Mutante de região a montante do ID.

DE SEQ.

CM023 ΔnifL::Prm4 CI006 gene acpP e os Nº: 40 primeiros 121 bp do gene acpP inserido

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 (Prm4).

Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante o Mutante de ID. DE SEQ. CM014 gene lpp e os ΔnifL::Prm1 CI006 Nº: 41 primeiros 29 bp do gene lpp inserido (Prm1). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do Mutante de ID. DE SEQ. CM016 gene lexA 3 e os ΔnifL::Prm9 CI006 Nº: 42 primeiros 21 bp do gene lexA 3 inserido (Prm9).

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do Mutante de ID.

DE SEQ.

CM022 gene mntP 1 e os ΔnifL::Prm3 CI006 Nº: 43 primeiros 53 bp do gene mntP 1 inserido (Prm3). Ruptura do gene nifL com um fragmento da Mutante de ID.

DE SEQ.

CM024 região a montante do ΔnifL::Prm7 CI006 Nº: 44 gene sspA inserido (Prm7). Ruptura do gene nifL Mutante de com um fragmento da ID.

DE SEQ.

CM025 ΔnifL::Prm10 CI006 região a montante do Nº: 45 gene hisS e os

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 primeiros 52 bp do gene hisS inserido (Prm10). Ruptura do gene glnB com um cassete de expressão de resistência à Mutante de ID.

DE SEQ.

CM006 canamicina (KanR) que ΔglnB::KanR CI010 Nº: 46 codifica o gene de aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido.

Ruptura do gene nifL Mutante de com um cassete de ID.

DE SEQ.

CM017 ΔnifL::KanR CI028 expressão de Nº: 47 resistência à

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 canamicina (KanR) que codifica o gene de aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à Mutante de espectinomicina ID.

DE SEQ.

CM011 ΔnifL::SpecR CI019 (SpecR) que codifica Nº: 48 o gene de estreptomicina 3’’-O- adenililtransferase aadA inserido.

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à Mutante de ID.

DE SEQ.

CM013 canamicina (KanR) que ΔnifL::KanR CI006 Nº: 49 codifica o gene de aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de Mutante de ID.

DE SEQ.

CM005 resistência à ΔnifL::KanR CI010 Nº: 50 canamicina (KanR) que codifica o gene de aminoglicosídeo O-

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 fosfotransferase aph1 inserido.

Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante o Mutante de ID. DE SEQ. CM014 gene lpp e as ΔnifL::Prm1 CI006 Nº: 51 primeiras 29 bp do gene lpp inserido (Prm1). Ruptura do gene nifL com um fragmento da Mutante de ID. DE SEQ. CM015 região a montante do ΔnifL::Prm5 CI006 Nº: 52 gene ompX inserido (Prm5). Mutante de Ruptura do gene nifL ID. DE SEQ. CM023 ΔnifL::Prm4 CI006 com um fragmento da Nº: 53

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 região a montante do gene acpP e as primeiras 121 bp do gene acpP inseridas (Prm4). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene ompX inserido (Prm5) e deleção das Mutante de ΔnifL::Prm5 ID.

DE SEQ. ID. DE SEQ.

CM029 1.287 bp depois do CI006 ΔglnE-AR_KO1 Nº: 54 Nº: 61 códon de início do gene glnE contendo a remoção do domínio de adenilil de glutamato-amônia-

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 ligase adenililtransferase (ΔglnE-AR_KO1). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante o Mutante de ID.

DE SEQ.

CM014 gene lpp e as ΔnifL::Prm1 CI006 Nº: 55 primeiras 29 bp do gene lpp inserido (Prm1). Ruptura do gene nifL com um cassete de Mutante de expressão de ID.

DE SEQ.

CM011 ΔnifL::SpecR CI019 resistência à Nº: 56 espectinomicina (SpecR) que codifica

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 o gene de estreptomicina 3’’-O- adenililtransferase aadA inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à Mutante de espectinomicina ID.

DE SEQ.

CM011 ΔnifL::SpecR CI019 (SpecR) que codifica Nº: 57 o gene de estreptomicina 3’’-O- adenililtransferase aadA inserido.

Mutante de Ruptura do gene nifL ID.

DE SEQ.

CM013 ΔnifL::KanR CI006 com um cassete de Nº: 58

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 expressão de resistência à canamicina (KanR) que codifica o gene de aminoglicosídeo O- fosfotransferase aph1 inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à Mutante de ID.

DE SEQ.

CM011 espectinomicina ΔnifL::SpecR CI019 Nº: 59 (SpecR) que codifica o gene de estreptomicina 3’’-O- adenililtransferase

Nome Linhagem Descrição do DNA Genótipo Mutação do Mutação do mutagênico gene 1 gene 2 aadA inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à Mutante de espectinomicina ID. DE SEQ. CM011 ΔnifL::SpecR CI019 (SpecR) que codifica Nº: 60 o gene de estreptomicina 3’’-O- adenililtransferase aadA inserido.

EXEMPLOS

[00377] Os exemplos seguintes são apresentados com o objetivo de ilustrar várias modalidades da revelação e não visam limitar a presente revelação de modo algum. Alterações nestes e outros usos que estão englobados dentro do espírito da revelação, como definido pelo escopo das reivindicações, serão reconhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplo 1: Remodelagem Microbiana Guiada – Uma Plataforma para a Melhoria Racional de Espécies Microbianas para Agricultura

[00378] Uma visão geral exemplar de uma modalidade da plataforma de Remodelagem Microbiana Guiada (GMR) pode ser resumida na representação esquemática da FIG. 1A.

[00379] A FIG. 1A ilustra que a composição do microbioma pode primeiro ser caracterizada e uma espécie de interesse é identificada (por exemplo, para encontrar um micróbio com as características de colonização apropriadas).

[00380] O metabolismo das espécies de interesse pode ser mapeado e ligado à genética. Por exemplo, a via de fixação de nitrogênio do micróbio pode ser caracterizada. A via que está sendo caracterizada pode ser examinada sob uma gama de condições ambientais. Por exemplo, a habilidade do micróbio para fixar nitrogênio atmosférico na presença de vários níveis de nitrogênio exógeno em seu ambiente pode ser examinada. O metabolismo de nitrogênio pode envolver a entrada de amônia (NH4+) da rizosfera para dentro do citosol das bactérias por meio do transportador de AmtB. Amônia e L- glutamato (L-Glu) são catalisados por glutamina sintetase e ATP em glutamina. Glutamina pode levar à formação de biomassa bacteriana e ela também pode inibir a expressão do operon nif, ou seja, ela pode ser uma força competitiva quando se deseja que o micróbio fixe nitrogênio atmosférico e excrete amônia. A via de fixação de nitrogênio é caracterizada em mais detalhe nas seções anteriores do relatório descritivo.

[00381] A seguir, uma alteração genômica não intergenérica direcionada pode ser introduzida ao genoma do micróbio, usando métodos que incluem, sem limitação: conjugação e recombinação, mutagênese química, evolução adaptiva e edição gênica. A alteração genômica não intergenérica direcionada pode incluir uma inserção, ruptura, deleção, alteração, perturbação, modificação etc. do genoma.

[00382] Micróbios remodelados derivados, que compreendem o fenótipo desejado que resulta do genótipo remodelado subjacente, são então usados para inocular plantios.

[00383] A presente revelação fornece, em certas modalidades, micróbios não intergenéricos remodelados que são capazes de fixar nitrogênio atmosférico e fornecer esse nitrogênio a uma planta. Em aspectos, esses micróbios não intergenéricos remodelados são capazes de fixar nitrogênio atmosférico, até mesmo na presença de nitrogênio exógeno.

[00384] A FIG. 1B retrata uma visão expandida da medição da etapa do microbioma. Em algumas modalidades, a presente revelação encontra espécies microbianas que possuem características de colonização desejadas, e depois utiliza aquelas espécies no processo de remodelagem subsequente.

[00385] A plataforma de Remodelagem Microbiana Guiada (GMR) mencionada anteriormente será agora descrita com mais especificidade.

[00386] Em aspectos, a plataforma de GMR compreende as seguintes etapas: A. Isolamento – Obter micróbios do solo, rizosfera, superfície etc. de uma planta de cultivo de interesse; B. Caracterização – Envolve a caracterização dos micróbios isolados para genótipos/fenótipos de interesse (por exemplo, sequência do genoma, habilidade de colonização, atividade de fixação de nitrogênio, habilidade de solubilização de P, excreção de um metabólito de interesse, excreção de um composto promotor de planta etc); C. Domesticação – Desenvolvimento de um protocolo molecular para modificação genética não intergenérica do micróbio; D. Campanha e Otimização de Modificação Genética não Intergenérica - Geração de cepas microbianas não intergenéricas derivadas com modificações genéticas em vias cruciais (por exemplo, genes associados à colonização, genes de fixação/assimilação de nitrogênio, genes de solubilização de P); E. Analítica – Avaliação de cepas derivadas não intergenéricas for fenótipos de interesse para in vitro (por exemplo, ensaios de ARA) e in planta (por exemplo, ensaios de colonização); F. Campanha/Analítica de Modificação Genética Repetida – Repetição das etapas D e E para aprimoramento adicional da cepa microbiana.

[00387] Cada uma das etapas do processo de plataforma de GMR será agora elaborada abaixo. A. Isolamento de Micróbios

1.Obter uma amostra do solo

[00388] Os micróbios serão isolados do solo e/ou raízes de uma planta. Em um exemplo, as plantas serão desenvolvidas em um laboratório ou em uma estufa em pequenos potes. Amostras do solo serão coletadas de várias áreas agrícolas. Por exemplo, solos com diversas características de textura podem ser coletados, incluindo greda (por exemplo, greda de argila turfosa, greda arenosa), solo de argila (por exemplo, argila pesada, argila siltosa), solo arenoso, solo siltoso, solo turfoso, solo calcário e semelhantes.

2. Crescimento de plantas-iscas

[00389] Sementes de uma planta-isca (uma planta de interesse) (por exemplo, milho, trigo, arroz, sorgo, milheto, soja, vegetais, frutas etc.) serão plantadas em cada tipo de solo. Em um exemplo, diferentes variedades de uma planta-isca serão plantadas em vários tipos de solo. Por exemplo, se a planta de interesse é milho, sementes de diferentes variedades do milho como, por exemplo, milho do campo, milho doce, milho-herança etc. serão plantadas em vários tipos de solo descritos acima.

3. Colher amostras do solo e/ou raiz e plaquear em meio apropriado

[00390] As plantas serão colhidas por seu desenraizamento após poucas semanas (por exemplo, 2-4 semanas) de crescimento. Como alternativa ao crescimento das plantas em um laboratório/estufa, solo e/ou raízes da planta de interesse podem ser coletados diretamente dos campos com diferentes tipos de solo.

[00391] Para isolar micróbios da rizosfera e epífitas, as plantas serão removidas gentilmente por saturação do solo com água destilada ou gentilmente por desprendimento do solo com as mãos para evitar danos às raízes. Caso partículas maiores de solo estejam presentes, essas partículas serão removidas por submersão das raízes em uma piscina parada de água destilada e/ou agitando-se gentilmente as raízes. A raiz será cortada e uma lama do solo que gruda nas raizes será preparada por colocação da raiz em uma placa ou tubo com uma pequena quantidade de água destilada e agitando-se gentilmente a placa/tubo em uma agitadora ou centrifugação do tubo em velocidade baixa. Essa lama será processada como descrito abaixo.

[00392] Para isolar endófitos, solo em excesso em superfícies da raiz serão removidas com água deionizada. Após remoção do solo, as plantas serão esterilizadas na superfície e enxaguadas vigorosamente em água estéril. Um corte de raiz de 1 cm, limpo, será excisado da planta e colocado em uma solução salina tamponada com fosfato contendo 3 mm glóbulos de aço. Uma lama será gerada por agitação vigorosa da solução com um Qiagen TissueLyser II.

[00393] A lama de solo e/ou raiz pode ser processada em várias formas, dependendo do traço benéfico para plantas desejado de micróbios a ser isolado. Por exemplo, a lama de solo e raiz pode ser diluída e inoculada sobre vários tipos de meios de seleção para isolar micróbios rizosféricos, endofíticos, epifíticos, e outros micróbios associados a plantas. Por exemplo, se o traço benéfico para plantas desejado é fixação de nitrogênio, então a lama de solo/raiz será plaqueada em um meio livre de nitrogênio (por exemplo, meio de ágar Nfb) para isolar micróbios fixadores de nitrogênio. Similarmente, para isolar bactérias solubilizadoras de fosfato (PSB), meios que contêm fosfato de cálcio como a única fonte de fósforo podem ser usados. PSB podem solubilizar fosfato de cálcio e assimilar e liberar fósforo em quantidades maiores. Essa reação é manifestada como um halo ou uma zona transparente na placa e pode ser usada como uma etapa inicial para o isolamento de PSB.

4. Escolher colônias, purificar culturas e pesquisar a presença de genes de interesse

[00394] Populações de micróbios obtidos na etapa A3 são repicadas para obter colônias únicas (culturas puras). Uma parte da cultura pura é ressuspensa em um meio adequado (por exemplo, uma mistura de R2A e glicerol) e submetida à análise por PCR para pesquisar a presença de um ou mais genes de interesse. Por exemplo, para identificar bactérias fixadoras de nitrogênio (diazotróficas), culturas purificadas de micróbios isolados podem ser submetidas a uma análise por PCR para detectar a presença de genes nif que codificam enzimas envolvidas na fixação de nitrogênio atmosférico em uma forma de nitrogênio disponível aos organismos vivos.

5. Criar um banco de culturas purificadas

[00395] Culturas purificadas de cepas isoladas serão armazenadas, por exemplo, a -80°C, para referência e análise futuras. B. Caracterização de Micróbios Isolados

1.Caracterização Filogenética e Sequenciamento do Genoma Completo

[00396] Os micróbios isolados serão analisados para caracterização filogenética (atribuição de gênero e espécie) e o genoma completo dos micróbios será sequenciado.

[00397] Para caracterização filogenética, rDNA 16S do micróbio isolado será sequenciado usando iniciadores degenerados de rDNA 16S para gerar a identidade filogenética. As leituras da sequência de rDNA 16S serão mapeadas em um banco de dados para designar o gênero, espécie e nome da cepa para os micróbios isolados. O sequenciamento do genoma completo é usado como a etapa final para atribuir gênero/gênero/espécie filogenética aos micróbios.

[00398] O genoma completo dos micróbios isolados será sequenciado para identificar vias cruciais. Para o sequenciamento do genoma completo, o DNA genômico será isolado usando um kit de isolamento de DNA genômico (por exemplo, mini kit QIAmp DNA de QIAGEN) e uma biblioteca de DNA total será preparada usando os métodos conhecidos na técnica. O genoma completo será sequenciado usando métodos de sequenciamento de alto rendimento (também denominados Sequenciamento de Próxima Geração) conhecidos na técnica. Por exemplo, Illumina, Inc., Roche, e Pacific Biosciences fornecem ferramentas de sequenciamento do genoma completo que podem ser usadas para preparar bibliotecas de DNA total e realizar sequenciamento do genoma completo.

[00399] A sequência do genoma completo para cada cepa isolada será montada; genes de interesse serão identificados; anotados; e observados como alvos potenciais para remodelagem. As sequências do genoma completo serão armazenadas em um banco de dados.

2. Testar o micróbio para colonização de uma planta hospedeira em uma estufa

[00400] Os micróbios isolados serão caracterizados quanto à colonização de plantas hospedeiras em uma estufa. Para isso, sementes da planta hospedeira desejada (por exemplo, milho, trigo, arroz, sorgo, soja) serão inoculadas com culturas de micróbios isolados individualmente ou em combinação e plantadas em solo. Alternativamente, as culturas de micróbios isolados, individualmente ou em combinação, podem ser aplicadas às raízes da planta hospedeira por inoculação do solo diretamente sobre as raízes. A colonização potencial dos micróbios será testada, por exemplo, usando um método de PCR quantitativa (qPCR) descrito em mais detalhe abaixo.

3. Testar o micróbio para colonização da planta hospedeira em experimentos de campo em pequena escala e RNA isolado de amostras de raiz colonizada (Experimentos CAT)

[00401] Os micróbios isolados serão avaliados quanto à colonização da planta hospedeira desejada em experimentos de campo em pequena escala. Adicionalmente, RNA será isolado de amostras de raiz colonizada para obter dados do transcriptoma para a cepa em um ambiente de campo. Esses experimentos de campo em pequena escala são referidos nesse relatório descritivo como experimentos CAT (Colonização e Transcrito), na medida em que esses experimentos fornecem dados de Colonização e Transcrito para a cepa em um ambiente de campo.

[00402] Para esses experimentos, sementes da planta hospedeira (por exemplo, milho, trigo, arroz, sorgo, soja) serão inoculadas usando culturas de micróbios isolados individualmente ou em combinação e plantadas no solo. Alternativamente, culturas de micróbios isolados, individualmente ou em combinação, podem ser aplicadas às raízes da planta hospedeira por inoculação do solo diretamente sobre as raízes. Os experimentos CAT podem ser realizados em diversos solos e/ou sob várias condições de temperatura e/ou de umidade para avaliar a colonização potencial e obter perfil de transcriptoma do micróbio em vários tipos de solo e condições ambientais.

[00403] A colonização de raízes da planta hospedeira pelo(s) micróbio(s) inoculado(s) será avaliada, por exemplo, usando um método de qPCR como descrito abaixo.

[00404] Em um protocolo, a colonização potencial de micróbios isolados foi avaliada da seguinte forma. Um dia após o plantio de sementes de milho, 1 ml de cultura microbiana de um dia para o outro (meio SOB) foi encharcado exatamente no ponto onde a semente estava localizada. Um ml dessa cultura de um dia para o outro era aproximadamente equivalente a cerca de 10^9 cfu, variando dentro de 3 vezes entre elas, dependendo de qual cepa estiver sendo usada. Cada muda foi fertilizada 3x por semana com 50 ml de solução de Hoagland modificada suplementada com 2,5 mM ou 0,25 mM de nitrato de amônio. Em quatro semanas após o plantio, amostras de raiz foram coletadas para extração de DNA. Restos de solo foram removidos por lavagem usando spray de água pressurizada. Essas amostras de tecido foram então homogeneizadas usando QIAGEN Tissuelyzer e o DNA foi então extraído usando o Mini Kit QIAmp DNA (QIAGEN) de acordo com o protocolo recomendado. O ensaio de qPCR foi realizado usando Mx3005P RT-PCR Stratagene nesses extratos de DNA usando iniciadores que foram projetados (usando Primer BLAST de NCBI) para serem específicos para um lócus no genoma de cada um dos micróbios.

[00405] A presença das cópias do genoma do micróbio foi quantificada, que refletia a colonização potencial do micróbio. A identidade das espécies microbianas foi confirmada por sequenciamento dos produtos de amplificação por PCR.

[00406] Adicionalmente, RNA será isolado de amostras de raiz e/ou do solo colonizado e sequenciado.

[00407] Diferentemente do perfil de DNA, um perfil de RNA varia dependendo das condições ambientais. Portanto, o sequenciamento de RNA isolado de raízes e/ou solo colonizados refletirá a atividade transcricional de genes in planta na rizosfera.

[00408] RNA pode ser isolado de amostras de raiz e/ou do solo colonizado em diferentes pontos do tempo para analisar as alterações no perfil de RNA do micróbio colonizado nesses pontos do tempo.

[00409] Por exemplo, RNA pode ser isolado de amostras de raiz e/ou do solo colonizado logo após a fertilização do campo e poucas semanas após a fertilização do campo e sequenciado para gerar um perfil transcricional correspondente.

[00410] Similarmente, o sequenciamento de RNA pode ser realizado sob condições de fosfato alto e de fosfato baixo para compreender quais genes está transcricionalmente ativos ou reprimidos sob essas condições.

[00411] Métodos para sequenciamento transcriptômico/de RNA são conhecidos na técnica. Resumidamente, o RNA total será isolado da cultura purificada do micróbio isolado; o cDNA será preparado usando transcriptase reversa; e o cDNA será sequenciado usando as ferramentas de sequenciamento de alto rendimento descritas acima.

[00412] As leituras de sequenciamento da análise do transcriptoma podem ser mapeadas para a sequência genômica e promotores transcricionais para os genes de interesse podem ser identificados.

4. Testar a atividade benéfica para plantas de micróbios isolados

[00413] A atividade benéfica para plantas de micróbios isolados será avaliada.

[00414] Por exemplo, micróbios fixadores de nitrogênio será testada for atividade de fixação de nitrogênio usando um ensaio de redução de acetileno (ARA) ou micróbios solubilizadores de fosfato será testada para solubilização de fosfato. Qualquer parâmetro de interesse pode ser utilizado e um ensaio apropriado desenvolvido para esse fum. Por exemplo, os ensaios poderiam incluir curvas de crescimento para métrica de colonização e ensaios para a produção de fitormônios como ácido indol acético (IAA) ou giberelinas. Um ensaio para qualquer atividade benéfica para plantas que seja de interesse pode ser desenvolvido.

[00415] Essa etapa confirmará o fenótipo de interesse e eliminará quaisquer falso-positivos.

5. Seleção de candidatos potenciais de micróbios isolados

[00416] Os dados gerados nas etapas acima serão usados para selecionar micróbios para desenvolvimento adicional. Por exemplo, micróbios que exibem uma combinação desejada de colonização potencial, atividade benéfica para plantas e/ou perfil de DNA e RNA relevante será selecionada para domesticação e remodelagem. C. Domesticação de Micróbios Selecionados

[00417] Os micróbios selecionados serão domesticados; em que, os micróbios serão convertidos em uma forma que é geneticamente tratável e identificável.

1. Teste para sensibilidade antibiótica

[00418] Uma forma para domesticar os micróbios é modificá-los geneticamente com resistência antibiótica. Para isso, a cepa microbiana do tipo selvagem será testada quanto à sensibilidade a vários antibióticos. Se a cepa é sensível ao antibiótico, então o antibiótico pode ser um bom candidato para uso em ferramentas/vetores genéticos para remodelagem da cepa.

2. Desenhar e construir um vetor

[00419] Vetores que são condicionais para sua replicação (por exemplo, um plasmídeo suicida) serão construídos para domesticar os micróbios selecionados (micróbios hospedeiros). Por exemplo, um plasmídeo suicida que contém um marcador de resistência antibiótica apropriado, um contra-marcador selecionável, uma origem de replicação para manutenção em um micróbio doador (por exemplo, E. coli), um gene que codifica uma proteína fluorescente (GFP, RFP, YFP, CFP e semelhantes) para avaliar a inserção por meio de fluorescência, uma origem de transferência para conjugação no micróbio hospedeiro, e uma sequência de polinucleotídeos que compreende braços de homologia para o genoma do hospedeiro com uma variação genética desejada será construída. O vetor pode compreender um local SceI e outros elementos adicionais.

[00420] Marcadores de resistência antibiótica exemplares incluem marcador de resistência à ampicilina, marcador de resistência à canamicina, marcador de resistência à tetraciclina, marcador de resistência ao cloranfenicol marcador de resistência, marcador de resistência à eritromicina, marcador de resistência à estreptomicina, marcador de resistência à espectinomicina etc. Contra-marcadores selecionáveis exemplares incluem sacB, rpsL, tetAR, pheS, thyA, lacY, gata-1, ccdB etc.

3. Geração de micróbios doadores

[00421] Em um protocolo, um plasmídeo suicida que contém um marcador de resistência antibiótica apropriado, um contra-marcador selecionável, a origem de replicação λpir para manutenção em E. coli ST18 contendo o gene iniciador de replicação pir, um gene que codifica proteína fluorescente verde (GFP) para avaliar a inserção por meio de fluorescência, uma origem de transferência para conjugação no micróbio hospedeiro, e uma sequência de polinucleotídeos que compreende braços de homologia para o genoma do hospedeiro com uma variação genética desejada (por exemplo, um promotor de dentro do próprio genoma do micróbio para inserção em uma localização heteróloga) será transformado em E. coli ST18 (um auxotrófico para ácido aminolevulínico, ALA) para gerar micróbios doadores.

4. Misturar micróbios doadores com micróbios hospedeiros

[00422] Os micróbios doadores serão misturados com micróbios hospedeiros (micróbios candidatos selecionados da etapa B5) para permitir a integração conjugativa do plasmídeo no genoma do hospedeiro. A mistura de micróbios doadores e hospedeiros será plaqueada em um meio que contém o antibiótico e que não contém ALA. O plasmídeo suicida é capaz de replicar em micróbios doadores (E. coli ST18), mas não no hospedeiro. Portanto, quando a mistura contendo micróbios doadores e hospedeiros é plaqueada em um meio que contém o antibiótico e que não contém ALA, somente células hospedeiras que integraram o plasmídeo em seu genoma serão capazes de crescer e formar colônias no meio. Os micróbios doadores não crescerão em função da ausência de ALA.

5. Confirmar a integração do vetor

[00423] Uma integração adequada do plasmídeo suicida que contém o marcador de proteína fluorescente, o marcador de resistência antibiótica, o contra-marcador selecionável etc no lócus desejado do micróbio hospedeiro será confirmada por meio de fluorescência de colônias na placa e usando PCR da colônia.

6. Confirmar por repique a colônia de integração

[00424] Uma segunda rodada de recombinação homóloga nos micróbios hospedeiros removerá o arcabouço do plasmídeo deixando a variação genética desejada (por exemplo, um promotor de dentro do próprio genoma do micróbio para inserção em uma localização heteróloga) integrada no genoma do hospedeiro de certa percentagem de micróbios hospedeiros revertendo, ao mesmo tempo, certa percentagem de volta ao tipo selvagem.

[00425] Colônias de micróbios hospedeiros que tiveram o arcabouço do plasmídeo removido (e, portanto, tiveram o contra-marcador selecionável removido) podem ser selecionadas por seu crescimento em um meio apropriado.

[00426] Por exemplo, se sacB é usado como um contra- marcador selecionável, a perda desse marcador em função da perda do arcabouço do plasmídeo será testada por crescimento das colônias em um meio contendo sacarose (sacB confere sensibilidade à sacarose). Colônias que crescem nesse meio teriam perdido o marcador de sacB e o arcabouço do plasmídeo e conteriam a variação genética desejada ou seriam revertidas ao tipo selvagem. Além disso, essas colônias não apresentarão fluorescência na placa em função da perda do marcador de proteína fluorescente.

[00427] Em alguns isolados, o sacB ou outros contra- marcadores selecionáveis não conferem sensibilidade plena à sacarose ou a outros mecanismos de contra-seleção, o que necessita de avaliação de números grandes de colônias para isolar uma remoção bem-sucedida. Naqueles casos, a remoção pode ser ajudada pelo uso de um “plasmídeo auxiliar” que se replica independentemente na célula hospedeira e expressa uma endonuclease de restrição, por exemplo, SceI, que reconhece um local no arcabouço do plasmídeo suicida integrado. A cepa com o plasmídeo suicida integrado é transformada com o plasmídeo auxiliar contendo um marcador de resistência antibiótica, uma origem de replicação compatível com a cepa hospedeira, e um gene que codifica uma endonuclease de restrição controlado por um promotor constitutivo ou induzível. A quebra de fita dupla induzida no arcabouço do plasmídeo integrado pela endonuclease de restrição promove recombinação homóloga para remoção do plasmídeo suicida. Isso aumenta o número de colônias removidas (“looped-out”) na placa de contra-seleção e diminui o número de colônias que precisam ser avaliadas para encontrar uma colônia que contenha a mutação desejada. O plasmídeo auxiliar é então removido da cepa por cultura e passagem serial na ausência de seleção antibiótica para o plasmídeo. As culturas passadas são repicadas para colônias únicas, as colônias são escolhidas e avaliadas quanto à sensibilidade ao antibiótico usado para seleção do plasmídeo auxiliar, bem como a ausência do plasmídeo confirmada por PCR da colônia. Finalmente, o genoma é sequenciado e a ausência de DNA do plasmídeo auxiliar é confirmada como descrito em D6.

7. Confirmar a integração da variação genética por meio de PCR da colônia

[00428] As colônias que cresceram melhor no meio que contém sacarose (ou outros meios apropriados, dependendo do contra-marcador selecionável usado) serão escolhidas e a presença da variação genética no lócus desejado será confirmada por avaliação das colônias usando PCR da colônia.

[00429] Embora esse exemplo descreva um protocolo para domesticação do micróbio e introdução de variação genética no micróbio, aqueles versados na técnica compreenderão que a variação genética pode ser introduzida nos micróbios selecionados usando várias outras metodologias conhecidas na técnica como, por exemplo, : reação em cadeia de polimerase mutagênese, mutagênese oligonucleotídeo- dirigida, mutagênese por saturação, mutagênese por embaralhamento de fragmentos, recombinação homóloga, ZFN, TALENS, sistemas CRISPR (Cas9, Cpf1 etc.), mutagênese química, e combinações destas.

8. Repetir as etapas C2-C7

[00430] Se qualquer uma das etapas C2-C7 falhar fornecer o desfecho desejado, as etapas serão repetidas para o design de um vetor alternativo que possa compreender elementos diferentes para facilitação da incorporação de variações genéticas desejadas e marcadores no micróbio hospedeiro.

9. Desenvolver um procedimento operacional padrão (SOP)

[00431] Após as etapas C2-C7 puderem ser reproduzidas consistentemente para certa cepa, as etapas serão usadas para desenvolver um procedimento operacional padrão (SOP) para aquela cepa e vetor. Esse SOP pode ser usado para aprimorar outros traços benéficos para plantas do micróbio. D. Campanha e Otimização de Modificação Genética Não intergenérica

1.Identificar alvos gênicos para otimização

[00432] Os micróbios selecionados serão modificados geneticamente/remodelados para aumentar o desempenho da atividade benéfica para plantas. Para isso, alvos gênicos para aumento da atividade benéfica para plantas serão identificados.

[00433] Alvos gênicos podem ser identificados de várias formas. Por exemplo, genes de interesse podem ser identificados enquanto se anota os genes do sequenciamento do genoma completo de micróbios isolados. Eles podem ser identificados por meio de uma pesquisa na literatura. Por exemplo, genes envolvidos na fixação de nitrogênio são conhecidos na literatura. Esses genes conhecidos podem ser usados como alvos para a introdução de variações genéticas. Alvos gênicos também podem ser identificados com base nos dados de sequenciamento de RNA obtidos na etapa B3 (experimentos de campo em pequena escala para colonização) ou por realização do sequenciamento de RNA descrito na etapa abaixo.

2. Selecionar promotores para trocas de promotores

[00434] Uma variação genética desejada para o aumento da atividade benéfica para plantas pode compreender a troca de promotores, na qual o promotor nativo para um gene-alvo é substituído com um promotor mais forte ou mais fraco (quando comparado com o promotor nativo) de dentro do genoma do micróbio, ou um promotor regulado diferentemente (por exemplo, um N-independente). Se a expressão de um gene-alvo aumenta a atividade benéfica para plantas (por exemplo, nifA, cuja expressão aumenta a fixação de nitrogênio em micróbios), o promotor desejado para troca de promotores é um promotor mais forte (comparado com o promotor nativo do gene-alvo) que aumentaria ainda mais o nível de expressão do gene-alvo, comparado com o promotor nativo. Se a expressão de um gene- alvo diminui a atividade benéfica para plantas (por exemplo, nifL, que infra-regula a fixação de nitrogênio), o promotor desejado para troca de promotores é um promotor fraco (comparado com o promotor nativo do gene-alvo) que diminuiria substancialmente o nível de expressão do gene-alvo, comparado com o promotor nativo. Promotores podem ser inseridos em genes para o “nocaute” da expressão de um gene, enquanto, ao mesmo tempo, supra-regulam a expressão de um gene a jusante.

[00435] Promotores para troca de promotores podem ser selecionados com base nos dados de sequenciamento de RNA. Por exemplo, os dados de sequenciamento de RNA podem ser usados para identificar promotores fortes e fracos, ou promotores constitutivamente ativos vs. induzíveis.

[00436] Por exemplo, para identificar promotores fortes e fracos, ou promotores constitutivamente ativos vs. induzíveis, na via de fixação de nitrogênio, micróbios selecionados serão cultivados in vitro sob condições depletadas de nitrogênio e repletas de nitrogênio; o RNA do micróbio será isolado dessas culturas; e sequenciado.

[00437] Em um protocolo, o perfil de RNA do micróbio sob condições depletadas de nitrogênio e repletas de nitrogênio será comparado, e promotores ativos com um nível de transcrição desejado serão identificados. Esses promotores podem ser selecionados para a troca de um promotor fraco.

[00438] Promotores também podem ser selecionados usando os dados de sequenciamento de RNA obtidos na etapa B3 que reflete o perfil de RNA do micróbio in planta na rizosfera da planta hospedeira.

[00439] O sequenciamento de RNA sob várias condições permite a seleção de promotores que: a) são ativos na rizosfera durante o ciclo de crescimento da planta hospedeira em condições de campo fertilizado, e b) também são ativos em condições relevantes in vitro, de modo que eles possam ser rapidamente avaliados.

[00440] Em um protocolo exemplar, os dados de sequenciamento de RNA in planta de ensaios de colonização (por exemplo, etapa B3) são usados para medir os níveis de expressão de genes em micróbios isolados. Em uma modalidade, o nível de expressão gênica é calculado como leituras por quilobase por milhão de leituras mapeadas (RPKM). O nível de expressão de vários genes é comparado com o nível de expressão de um gene-alvo e pelo menos os 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou 70 promotores principais, associados com os vários genes, que mostram o maior ou menor nível de expressão comparados com o gene-alvo são selecionados como possíveis candidatos para troca de promotores. Dessa forma, buscam-se níveis de expressão de vários genes em relação a um gene-

alvo e depois são selecionados os genes que demonstram expressão aumentada em relação a um gene-alvo (ou padrão) e depois se encontram os promotores associados aos referidos genes.

[00441] Por exemplo, se o gene-alvo é supra-regulação de nifA, os primeiros 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 promotores para os genes que mostram o maior nível de expressão comparados com nifA são selecionados como possíveis candidatos para troca de promotores.

[00442] Essa lista de candidatos pode ser adicionalmente reduzida com base em dados de sequenciamento de RNA in vitro. Por exemplo, para nifA como o gene-alvo, possíveis candidatos a promotor selecionados com base nos dados de sequenciamento de RNA in planta são adicionalmente selecionados por escolha dos promotores com níveis de expressão similares ou aumentados do gene, comparados com nifA sob condições in vitro depletadas de nitrogênio vs. repletas de nitrogênio.

[00443] O conjunto de promotores selecionado nessa etapa é usado para a troca do promotor nativo do gene-alvo (por exemplo, nifA). Cepas remodeladas com promotores trocados são testadas em ensaios in vitro; cepas com atividade menor do que a esperada são eliminadas; e cepas com atividade esperada ou maior do que a esperada são testadas em campo. O ciclo de seleção de promotor pode ser repetido em cepas remodeladas para aumentar ainda mais sua atividade benéfica para plantas.

[00444] É descrito nesse relatório descritivo um experimento de troca de promotores exemplar que foi realizado com base em dados de sequenciamento de RNA in planta e in vitro da cepa de Klebsiella variicola CI137 para aprimorar o traço de fixação de nitrogênio.

CI137 foi analisada em ensaios de ARA a 0 mM e 5 mM de concentração de glutamina e o RNA foi extraído dessas amostras de ARA.

O RNA foi sequenciado por meio de NextSeq e um subconjunto de leituras de uma amostra foi mapeado para o genoma de CI137 (dados de sequenciamento de RNA in vitro). O RNA foi extraído das raízes de plantas de milho em estágio V5 no ensaio de colonização e atividade (por exemplo, etapa B3) para CI137. Amostras de seis plantas foram combinadas (“pooled”); o RNA da amostra combinada foi sequenciado usando NextSeq, e as leituras foram mapeadas para o genoma de CI137 (dados de sequenciamento de RNA in planta). Das 2 x 108 leituras totais, 7 x 104 leituras mapearam para CI137. Os dados de sequenciamento de RNA in planta foram usados para classificar os genes em ordem de níveis de expressão in planta e os níveis de expressão foram comparados com o nível de expressão de nifA nativo.

Os primeiros 40 promotores que mostraram o maior nível de expressão (com base na expressão gênica) comparado com o nível de expressão de nifA nativo foram selecionados.

A lista desses 40 promotores foi ainda mais reduzida com base nos dados de sequenciamento de RNA in vitro, em que promotores com níveis de expressão in vitro aumentados ou similares comparados com nifA foram selecionados.

A lista de promotores final incluiu 17 promotores e duas versões de maioria dos promotores foram usadas para gerar mutantes de troca de promotores; dessa forma, um total de 30 promotores foi testado.

A geração de uma suíte de mutantes de CI137 nos quais nifL estava deletado parcialmente ou completamente e nos 30 promotores inseridos

(ΔnifL::Prm) foi tentada. 28 dos 30 mutantes foram gerados com sucesso. Os mutantes ΔnifL::Prm foram analisados em ensaios de ARA a 0 mM e 5 mM de concentração de glutamina e o RNA foi extraído dessas amostras de ARA. Vários mutantes mostraram atividade de ARA menor do que esperado ou diminuída comparados com a cepa CI137 WT. Poucos mutantes mostraram atividade de ARA maior do que a esperada.

[00445] Aqueles versados na técnica observariam a partir do exemplo acima que, embora dados de sequenciamento de RNA in planta e/ou in vitro possam ser usados para selecionar promotores para troca de promotores, a etapa de seleção de promotor é altamente imprevisível e envolve muitos desafios.

[00446] Por exemplo, o sequenciamento de RNA in planta revela principalmente os genes que são altamente expressos; no entanto, é difícil detectar diferenças finas na expressão gênica e/ou genes com níveis baixos de expressão. Por exemplo, em alguns dos experimentos de sequenciamento de RNA in planta, somente cerca de 40 dos cerca de 5.000 genes de um genoma microbiano foram detectados. Dessa forma, a técnica de sequenciamento de RNA in planta é útil para identificar genes abundantemente expressos e seus promotores correspondentes; no entanto, a técnica possui dificuldade na identificação de genes de expressão baixa e promotores correspondentes e pequenas diferenças entre expressão gênica.

[00447] Além disso, o perfil de RNA in planta reflete o estado dos genes no momento quando os micróbios foram isolados; no entanto, uma ligeira alteração nas condições de campo pode alterar substancialmente o perfil de RNA de micróbios da rizosfera/epifíticos/endofíticos. Portanto, é difícil prever antecipadamente se os promotores selecionados com base em dados de um experimento de campo de sequenciamento de RNA forneceriam níveis de expressão desejáveis do gene-alvo quando cepas remodeladas são testadas in vitro e em campo.

[00448] Adicionalmente, a avaliação in planta consome muito tempo e recursos; portanto, experimentos in planta não podem ser realizados frequentemente e/ou repetidos rapidamente ou facilmente. Por outro lado, enquanto o sequenciamento de RNA in vitro pode ser realizado relativamente rapidamente e facilmente, as condições in vitro não simulam as condições de campo e promotores que possam exibir atividade alta in vitro podem não exibir atividade comparável in planta.

[00449] Além disso, promotores frequentemente não se comportam como previsto em um novo contexto. Portanto, os dados de sequenciamento de RNA in planta e in vitro podem, na melhor das hipóteses, servir como um ponto de partida na etapa de seleção de promotor; no entanto, a chegada em qualquer promotor particular que pudesse fornecer níveis de expressão desejáveis do gene-alvo no campo é, em alguns casos, imprevisível.

[00450] Outra limitação na etapa de seleção de promotor é o número de promotores disponíveis. Como um dos objetivos da presente invenção é fornecer micróbios não- transgênicos, os promotores para troca de promotores precisam ser selecionados de dentro do genoma do micróbio, ou gênero. Dessa forma, diferentemente de uma abordagem transgênica, o presente processo não pode simplesmente buscar na literatura e encontrar/usar um promotor transgênico bem caracterizado de um organismo hospedeiro diferente.

[00451] Outro conceito é que o promotor deve ser ativo in planta durante uma fase do crescimento desejada. Por exemplo, a maior necessidade de nitrogênio em plantas é geralmente tardiamente na estação de crescimento, por exemplo, em fases vegetativas tardias e reprodutivas iniciais. Por exemplo, no milho, a maior captação de nitrogênio ocorre durante os estágios V6 (seis folhas) até R1 (estágio reprodutivo 1). Portanto, para aumentar a disponibilidade de nitrogênio durante os estágios V6 a R1 do milho, os micróbios remodelados devem exibir a maior atividade de fixação de nitrogênio durante esses estágios do ciclo de vida do milho. Consequentemente, promotores que são ativos in planta durante os estágios vegetativos tardios e reprodutivos iniciais do milho precisam ser selecionados. Esse conceito não apenas reduz o número de promotores que podem ser testados na troca de promotores, mas também torna a etapa de seleção de promotor imprevisível. Como discutido acima, a imprevisibilidade surge, em parte, porque, embora os dados de sequenciamento de RNA de experimentos de campo em pequena escala (por exemplo, etapa B3) possam ser usados para identificar promotores que são ativos in planta durante um estágio do crescimento desejado, os dados de RNA se baseiam nas condições de campo (por exemplo, tipo de solo, nível de água no solo, nível de nitrogênio disponível etc.) no momento da coleta da amostra. Como aqueles versados na técnica saberiam, as condições de campo podem se alterar al longo do período de tempo dentro do mesmo campo e também se alteram substancialmente através de vários campos. Dessa forma, os promotores selecionados sob uma condição de campo podem não se comportar como esperado sob outras condições de campo. Similarmente, os promotores selecionados podem não se comportar como esperado após a troca. Portanto, é difícil prever antecipadamente se os promotores selecionados seriam ativos in planta durante uma fase do crescimento desejada de uma planta de interesse.

3. Design de variações genéticas não intergenéricas

[00452] Com base nas etapas D1 (identificação de alvos gênicos) e D2 (identificação de promotores para trocas de promotores), serão projetadas variações genéticas não intergenéricas.

[00453] O termo “não intergenérica” indica que a variação genética a ser introduzida no hospedeiro não contém uma sequência de ácidos nucleicos de fora do gênero do hospedeiro (ou seja, nenhum DNA transgênico). Embora vetores e/ou outras ferramentas genéticas serão usadas para introduzir a variação genética no micróbio hospedeiro, os métodos da presente revelação incluem etapas para remover (“loop-out”) as sequências do vetor de arcabouço ou outras ferramentas genéticas introduzidas no micróbio hospedeiro deixando somente a variação genética desejada no genoma do hospedeiro. Dessa forma, o micróbio resultante é não- transgênico.

[00454] Variações genéticas não intergenéricas exemplares incluem uma mutação no gene de interesse que pode aumentar a função da proteína codificada pelo gene; um promotor constitucionalmente ativo que pode substituir o promotor endógeno do gene de interesse para aumentar a expressão do gene; uma mutação que irá inativar o gene de interesse; a inserção de um promotor de dentro do genoma do hospedeiro em uma localização heteróloga, por exemplo, a inserção do promotor em um gene que resulta em inativação do referido gene e supra-regulação de a um gene a jusante; e semelhantes. As mutações podem ser mutações, inserções e/ou deleções pontuais (deleção completa ou parcial do gene). Por exemplo, em um protocolo, para aumentar a atividade de fixação de nitrogênio do micróbio hospedeiro, uma variação genética desejada pode compreender uma mutação de inativação do gene nifL (regulador negativo da via de fixação de nitrogênio) e/ou compreender a substituição do promotor endógeno do gene nifH (nitrogenase ferro proteína que catalisa uma reação crucial para fixar nitrogênio atmosférico) com um promotor ativo constitucionalmente que irá dirigir a expressão do gene nifH constitutivamente.

4. Gerar cepas derivadas não intergenéricas

[00455] Após o design das variações genéticas não intergenéricas, as etapas C2-C7 serão realizadas para gerar cepas derivadas não intergenéricas (ou seja, micróbios remodelados).

5. Criar um banco de cultura purificada do micróbio remodelado

[00456] Uma cultura purificada do micróbio remodelado será preservada em um banco, de modo que o gDNA possa ser extraído para o sequenciamento do genoma completo descrito abaixo.

6. Confirmar a presença da variação genética desejada

[00457] O DNA genômico do micróbio remodelado será extraído e o sequenciamento do genoma completo será realizado no DNA genômico usando métodos descritos previamente. As leituras resultantes serão mapeadas para as leituras previamente armazenadas em LIMS para confirmar: a) presença da variação genética desejada, e b) ausência completa de leitura que mapeiam para sequências do vetor (por exemplo, sequência do arcabouço do plasmídeo ou plasmídeo auxiliar) que foram usadas para gerar o micróbio remodelado.

[00458] Essa etapa permite a detecção sensível de DNA que não é do gênero do hospedeiro (DNA transgênico) que pode permanecer na cepa após o método de remoção do arcabouço do vetor (por exemplo, plasmídeo suicida) e forneceria um controle para inserção fora do alvo acidental da variação genética etc. E. Analítica de Micróbios Remodelados

1. Análise da atividade benéfica para plantas

[00459] A atividade benéfica para plantas e a cinética de crescimento dos micróbios remodelados serão avaliadas in vitro.

[00460] Por exemplo, cepas remodeladas para melhora da função de fixação de nitrogênio serão avaliadas quanto à atividade aptidão para fixação de nitrogênio por meio de ensaios de redução de acetileno, ensaios de excreção de amônio etc.

[00461] As cepas remodeladas para solubilização aumentada de fosfato serão avaliadas quanto à atividade de solubilização de fosfato.

[00462] Essa etapa permite a avaliação rápida, de rendimento médio a alto, de cepas remodeladas para os fenótipos de interesse.

2. Análise da colonização e transcrição dos genes alterados

[00463] As cepas remodeladas serão avaliadas para colonização da planta hospedeira na estufa ou no campo usando as etapas descritas em B3. Adicionalmente, RNA será isolado de amostras de raiz e/ou do solo colonizado e sequenciado para analisar a atividade transcricional de genes-alvo. Genes-alvo compreendem os genes que contêm a variação genética introduzida e também podem compreender outros genes que desempenham um papel no traço benéfico para planta do micróbio.

[00464] Por exemplo, um agrupamento de genes, os genes nif, controla a atividade de fixação de nitrogênio de micróbios. Com o uso do protocolo descrito acima, uma variação genética pode ser introduzida em um dos genes nif (por exemplo, uma inserção de promotor), enquanto os outros genes no agrupamento nif estão em sua forma endógena (ou seja, sua sequência gênica e/ou sua região promotora não é alterada). Os dados de sequenciamento de RNA serão analisados quanto à atividade transcricional do gene nif que contém a variação genética e também podem ser analisados para outros genes nif que não são alterados diretamente pela alteração genética inserida, mas, apesar disso, podem ser influenciados pela alteração genética introduzida.

[00465] Essa etapa permite a determinação da capacidade das cepas com os melhores desempenhos principais in vitro na rizosfera e permite a medição da atividade transcricional de genes alterados in planta. F. Repetir a campanha/analítica da modificação genética

[00466] Os dados da analítica in vitro e in planta (etapas E1 e E2) serão usados para empilhar repetitivamente mutações benéficas.

[00467] Além disso, as etapas A-E descritas acima podem ser repetidas para um ajuste fino dos traços benéficos para plantas dos micróbios. Por exemplo, as plantas serão inoculadas usando cepas microbianas remodeladas na primeira rodada; colhidas após poucas semanas de crescimento; e micróbios do solo e/ou raízes das plantas serão isolados. A atividade funcional (traço benéfico para plantas e colonização potencial) e o perfil de DNA e RNA de micróbios isolados serão caracterizados, a fim de selecionar micróbios com atividade benéfica para plantas e colonização potencial aumentadas. Os micróbios selecionados serão remodelados para aumentar ainda mais a atividade benéfica para plantas. Os micróbios remodelados serão avaliados quanto à atividade funcional (traço benéfico para plantas e colonização potencial) e perfil de RNA in vitro e in planta e as cepas com os principais desempenhos serão selecionadas. Se desejado, as etapas A-E podem ser repetidas para aumentar ainda mais a atividade benéfica para plantas dos micróbios remodelados da segunda rodada. O processo pode ser repetido por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais rodadas.

[00468] As etapas exemplares descritas acima estão resumidas na Tabela A abaixo.

Tabela A – Uma Visão Geral de uma Modalidade da Plataforma de Remodelagem Microbiana Guiada.

Etapas Contribuição Formas alternativas A Isolamento Fornece micróbios WT do 1 Obter uma amostra do solo solo a serem isolados Crescer “plantas-iscas” Permite a seleção de Trigo, sorgo, arroz, 2 de milho na amostra do micróbios benéficos para milheto, soja etc. solo plantas por rizosfera Colher, limpar e extrair Restringir a seleção de Outros meios livres de amostra de raiz e placa micróbios do solo àqueles nitrogênio, outros meios 3 em meios livres de que: a) colonizam a raiz seletivos ou de seleção nitrogênio e b) fixam nitrogênio (por exemplo, para (especificamente NfB) atmosférico solubilização de fosfato) Escolher colônias, Restringir a seleção Iniciadores degenerados purificar as culturas e micróbios àqueles que para outros genes de 4 avaliar quanto à presença contêm o gene nifH interesse, por exemplo, de nifH usando (eliminar falso-positivos ipdC (biossíntese de iniciadores degenerados da avaliação dos meios) fitormônio)

Etapas Contribuição Formas alternativas Criar um banco de 5 culturas purificadas da cepa B Caracterização Sequenciar e montar o genoma da cepa usando a Caracterizar genoma para 1 plataforma Illumina e/ou vias cruciais PacBio Trigo, sorgo, arroz, Testar o micróbio para milheto, soja etc., Restringir a seleção para colonização de raízes de outros métodos para 2 micróbios que colonizam milho na estufa (método à testagem de colonização bem a planta base de qPCR) (por exemplo, plaqueamento) Testar o micróbio para Conhecidos internamente Experimentos de campo 3 colonização de raízes de como experimentos “CAT”, maiores, outros cultivos, milho em experimentos de esses fornecem dados de outros métodos para

Etapas Contribuição Formas alternativas campo em pequena escala Colonização e Transcrito testagem de colonização (método à base de qPCR) e para a cepa em um (por exemplo, RNA isolado de amostras ambiente de campo plaqueamento) de raiz colonizada Testar o micróbio para atividade de fixação de Confirmar o fenótipo de 4 nitrogênio em um ensaio fixação de N da cepa de redução de acetileno (ARA) Usar os dados acima para selecionar micróbio Permite a seleção dos 5 candidato para principais candidatos domesticação e otimização potenciais adicionais C Domesticação Testar micróbios quanto à Determinar quais 1 sensibilidade a vários marcadores de seleção

Etapas Contribuição Formas alternativas antibióticos antibiótica podem ser usados para transformar ferramentas genéticas Desenhar e construir um plasmídeo suicida que contém um marcador de resistência antibiótica O plasmídeo poderia apropriado, contra- Estas são as “partes” conter um local SceI ou marcador selecionável de necessárias para manter o outros contra-marcador sacB, origem de plasmídeo e realizar 2 selecionável, repórteres replicação para conjugação, inserção e fluorescentes manutenção em E. coli, “remoção” do genoma do alternativos, elementos GFP para pesquisar a hospedeiro adicionais inserção por meio de fluorescência, origem de transferência para conjugação no hospedeiro,

Etapas Contribuição Formas alternativas braços de homologia para o genoma do hospedeiro e a mutação desejada.

Transformar o plasmídeo Poderia usar uma cepa de suicida em E. coli ST18 Preparação para doadora de E. coli (um auxotrófico para 3 conjugação no hospedeiro; diferente ou outros ácido aminolevulínico, manutenção do plasmídeo micróbio; marcador ALA) para gerar células auxotrófico diferente doadoras Misturar as células O plasmídeo suicida é doadoras com células capaz de replicar em E.

Poderia usar uma cepa hospedeiras receptoras coli, mas não no doadora de E. coli para conjugar, e plaquear hospedeiro.

Portanto, o 4 diferente ou outro em meios de seleção para plaqueamento da mistura micróbio; marcador o marcador de resistência nessas placas significa auxotrófico diferente antibiótica e que NÃO que somente células contém ALA hospedeiras que receberam

Etapas Contribuição Formas alternativas o plasmídeo e apresentam integração do plasmídeo no cromossomo serão capazes de crescer e formar colônias.

A E. coli ST18 é incapaz de crescer em função da ausência de ALA.

Confirma a integração Confirmar integração do adequada do arcabouço do plasmídeo por meio de plasmídeo suicida fluorescência de GFP, e 5 contendo GFP, do cassete integração no lócus de resistência desejado por meio de PCR antibiótica, do marcador da colônia de sacB etc.

Repique confirmou a O marcador de sacB Contra-marcador 6 colônia de integração em confere sensibilidade à selecionável diferente,

Etapas Contribuição Formas alternativas uma placa contendo sacarose; colônias que remoção mediada por SceI sacarose e pesquisar passaram por uma segunda etc. colônias não- rodada de recombinação fluorescentes homóloga e “remoção” do plasmídeo crescerão melhor e não apresentam fluorescência na placa.

Após o segundo evento de Avaliar colônias recombinação homóloga removidas quanto à somente 50% das colônias 7 mutação desejada usando removidas devem conter a PCR da colônia mutação, os outros 50% serão WT Se qualquer uma das Permite a solução etapas 2-7 falham, voltar repetida de problemas de 8 para a etapa 2 e plasmídeo suicida para redesenhar com partes desenvolver um protocolo

Etapas Contribuição Formas alternativas alternativas do plasmídeo funcionante Após as etapas 2-7 puderem ser realizadas de forma confiável, 9 desenvolver um SOP para aquela cepa/plasmídeo a ser usado para Otimização Campanha e otimização de D modificação genética não intergenérica Identificar alvos gênicos para otimização de uma 1 via, por exemplo, genes nif, por meio de pesquisa na literatura Selecionar promotores Permite a seleção de Cultivos alternativos; 2 para trocas de promotores promotores que: a) são condições alternativas de

Etapas Contribuição Formas alternativas usando dados de RNAseq ativos na rizosfera dados de RNAseq (estufa, coletados tanto in vitro durante o ciclo de campo, in vitro, sempre quanto em condições crescimento do milho em que relevante para o depletadas de N repletas condições de campo fenótipo visado) de N, e in planta da fertilizado b) também são rizosfera do milho ativos em condições (coletada na etapa B3) repletas de N in vitro, de modo que eles possam ser rapidamente avaliados.

Design de mutações não intergenéricas em genes Nenhum DNA de fora do Alterar sequências cruciais: deleções (gene cromossomo do hospedeiro reguladoras (por exemplo, 3 total ou parcial), trocas é adicionado e, portanto, RBS), RNAs não- de promotores, ou o micróbio resultante é codificadores etc. alterações únicas de não-transgênico pares de bases; armazenar

Etapas Contribuição Formas alternativas esses designs em nosso

LIMS Usando o protocolo Realizamos isso em estabelecido, realizar as rendimento maior do que a 4 etapas C2-7 para gerar etapa de domesticação – cepas derivadas não até 20 ou mais cepas em intergenéricas (mutantes) uma vez por pessoa. Criar um banco de culturas purificadas da 5 cepa, extrair gDNA e realizar WGS por meio de Illumina Mapear as leituras Permite detecção muito A remoção do plasmídeo resultantes para os sensível de DNA não suicida é bastante 6 designs armazenados em intergenérico que pode confiável; no entanto, o LIMS para confirmar: a) a permanecer na cepa após o uso de outros plasmídeos presença da mutação método de plasmídeo estáveis em métodos

Etapas Contribuição Formas alternativas desejada e b) ausência suicida; confirma a alternativos necessita completa de leitura que ausência de DNA essa etapa extra para mapeiam para qualquer transgênico, controla a assegurar confiança plasmídeo suicida ou inserção fora do alvo completa de que nenhum outras sequências de acidental do plasmídeo DNA transgênico que foi plasmídeo usadas para suicida etc. previamente transformado gerar as cepas permanece na cepa.

E Analítica Analisar as cepas para atividade de fixação de Permite a avaliação Qualquer outro ensaio in nitrogênio in vitro e rápida, de rendimento vitro, por exemplo, 1 capacidade por meio de médio a alto, de mutantes solubilização de fosfato, ARA, ensaios de excreção para fenótipos de qPCR para a transcrição de amônio e curvas de interesse de genes específicos etc. crescimento Analisar as cepas para Mede a capacidade das 2 colonização (qPCR) e cepas na rizosfera com o

Etapas Contribuição Formas alternativas transcrição de genes-alvo melhor desempenho in e com promotor trocado vitro; mede a transcrição (Nanostring) na planta de genes com promotor (estufa ou campo) trocado em plantas Campanha/analítica F repetida de modificação genética Usar os dados de analítica in vitro e in 1 planta para empilhar repetitivamente mutações benéficas.

Abordagens Tradicionais para a Criação de Produtos Biológicos para Agricultura Sofrem de Desvantagens Inerentes em sua Metodologia

[00469] Diferentemente da bioprospecção pura de micróbios do tipo selvagem (WT) ou abordagens transgênicas, GMR permite a otimização genética não intergenérica de redes regulatórias cruciais dentro do micróbio, o que aprimora os fenótipos benéficos para plantas em relação aos micróbios WT, mas não possui os riscos associados às abordagens transgênicas (por exemplo, função gênica imprevisível, preocupações públicas e reguladoras). Veja a FIG. 1C para uma ilustração de uma abordagem de “bioprospecção tradicional” problemática, que possui várias desvantagens, comparada com a plataforma de GMR ensinada.

[00470] Outros métodos para o desenvolvimento de microbianos para agricultura são concentrados em desenvolvimento laboratorial intenso, que frequentemente fracassa na escala de campo, ou testagem intensa em estufa ou “campo primeiro”, sem uma compreensão dos mecanismos/interações planta-micróbio subjacentes. Veja a FIG. 1D para uma ilustração de um sistema problemático de “abordagem de campo primeiro para bioprospecção”, que possui várias desvantagens, comparado com a plataforma de GMR ensinada. A Plataforma de GMR Soluciona Esses Problemas de Várias Formas

[00471] Uma força da plataforma de GMR é a identificação de promotores ativos, que são ativos em momentos cruciais fisiologicamente importantes para um cultivo-alvo, e que também estão ativos sob condições ambientais particulares, agronomicamente relevantes.

[00472] Como foi explicado, dentro do contexto de fixação de nitrogênio, a plataforma de GMR é capaz de identificar sequências promotoras microbianas, que estão ativas sob condições ambientais de nitrogênio exógeno elevado que, dessa forma, permitem que o micróbio remodelado fixe nitrogênio atmosférico e o libere a uma planta de cultivo-alvo, sob condições agrícolas modernas de cultura em fileiras, e em um momento quando uma planta mais precisa do nitrogênio fixado. Veja a FIG. 1E para uma ilustração do período de tempo no ciclo de crescimento do milho, no qual o nitrogênio é mais necessário pela planta. A plataforma de GMR ensinada é capaz de criar micróbios remodelados que fornecem nitrogênio a uma planta de milho no período de tempo no qual o nitrogênio é necessário, e também liberam esse nitrogênio até mesmo na presença de nitrogênio exógeno no solo ambiente.

[00473] Esses promotores podem ser identificados por sequenciamento de RNA da rizosfera e mapeamento de leituras para as sequências do genoma do micróbio, e vias cruciais podem ser “reprogramadas” para serem ligadas ou desligadas durante estágios cruciais do ciclo de crescimento da planta. Adicionalmente, por meio do sequenciamento do genoma completo de micróbios otimizados e mapeamento para sequências previamente transformadas, o método possui a habilidade para assegurar que nenhuma sequência transgênica seja acidentalmente liberada no campo por meio de inserção fora do alvo de DNA de plasmídeo, retenção em nível baixo de plasmídeos não detectados por meio de PCR ou resistência antibiótica etc.

[00474] A plataforma de GMR combina essas abordagens por avaliação de micróbios repetitivamente no ambiente laboratorial e de plantas, levando a micróbios que são robustos em estufa e condições de campo, ao invés de somente em condições laboratoriais.

[00475] Vários aspectos e modalidades da plataforma de GMR ensinada podem ser encontrados nas FIGS. 1F-1I. A plataforma de GMR culmina na derivação/criação/produção de micróbios remodelados que possuem uma propriedade benéfica para plantas, por exemplo, fixação de nitrogênio.

[00476] Os métodos de bioprospecção tradicionais não são capazes de produzir micróbios que possuem as propriedades mencionadas anteriormente. Propriedades de um Micróbio Remodelado para Fixação de Nitrogênio

[00477] No contexto de remodelagem micróbios para fixação de nitrogênio, há várias propriedades que o micróbio remodelado pode possuir. Por exemplo, a FIG. 1J retrata cinco propriedades que podem ser possuídas por micróbios remodelados da presente revelação.

[00478] Além disso, como pode ser observado no Exemplo 2, os presentes inventores utilizaram a plataforma de GMR para produzir bactérias não intergenéricas remodeladas (ou seja, Kosakonia sacchari) capazes de fixação de nitrogênio atmosférico e de liberação do referido nitrogênio a uma planta de milho, até mesmo sob condições nas quais nitrogênio exógeno está presente no ambiente. Veja as FIG. 1K-M, que ilustram que o processo de remodelagem com sucesso: (1) desacoplou a expressão de nifA da regulação de nitrogênio endógeno; e (2) aumentou a assimilação e excreção de nitrogênio fixado.

[00479] Esses micróbios remodelados, em última análise, resultam em aumento do rendimento de milho, quando aplicados aos plantios de milho. Veja a FIG. 1N. A plataforma de GMR Fornece uma Abordagem à Fixação e Liberação de Nitrogênio que Soluciona Preocupações Ambientais Prementes

[00480] Como explicado previamente, o fertilizante de nitrogênio produzido pelo processo industrial de Haber-Bosch não é bem utilizado pelo cultivo-alvo. Chuva, escoamento, calor, volatilização e o microbioma do solo degradam o fertilizante químico aplicado. Isso significa não apenas desperdício de dinheiro, mas também se soma poluição aumentada ao invés de aumento do rendimento colhido. Para essa finalidade, as Nações Unidas calcularam que quase 80% dos fertilizante são perdidos antes que uma cultura possa utilizá-lo. Consequentemente, a produção e liberação de fertilizantes agrícolas modernos não apenas são deletérios para o ambiente, mas também extremamente ineficientes. Veja a FIG. 1O, que ilustra a ineficiência de sistemas de liberação de nitrogênio atuais, que resultam em campos subfertilizados, campos hiperfertilizados e escoamento de nitrogênio ambientalmente deletério.

[00481] A plataforma de GMR atual, e os micróbios remodelados resultantes, fornecem uma abordagem melhor para fixação e liberação de nitrogênio às plantas. Como será observado nos Exemplos abaixo, os micróbios não intergenéricos remodelados da revelação são capazes de colonizar as raízes de uma planta de milho e alimentar as referidas plantas de milho com nitrogênio atmosférico fixado, até mesmo na presença de nitrogênio exógeno. Esse sistema de fixação e liberação de nitrogênio – capacitado pela plataforma de GMR ensinada – ajudará a transformar o sistema agrícola moderno em um sistema ambientalmente mais sustentável. Exemplo 2: Remodelagem Microbiana Guiada – Uma Modalidade de Exemplo para a Melhoria Racional de fixação de nitrogênio

[00482] Uma diversidade de bactérias fixadoras de nitrogênio pode ser encontrada na natureza, incluindo em solos agrícolas. No entanto, o potencial de um micróbio para fornecer nitrogênio suficiente aos plantios para permitir uso diminuído de fertilizante pode ser limitado por repressão de genes de nitrogenase em solos fertilizados, bem como abundância baixa em associação íntima com raízes de cultivos. A identificação, isolamento e reprodução de micróbios que se associam intimamente com cultivos comerciais cruciais podem romper e aprimorar as redes regulatórias que ligam o sensoriamento de nitrogênio e fixação de nitrogênio e destravar contribuições significantes de nitrogênio por micróbios associados a cultivos. Para essa finalidade, micróbios fixadores de nitrogênio que se associam e colonizam o sistema de raízes do milho foram identificados. Essa etapa corresponde à “Medida da Composição do Microbioma” retratada na FIG. 1A e na FIG. 1B.

[00483] Amostras de raiz de plantas de milho desenvolvidas em solos agronomicamente relevantes foram coletadas, e populações microbianas extraídas da rizosfera e endosfera. O DNA genômico dessas amostras foi extraído, seguido por sequenciamento do amplicon 16S para definir o perfil da composição da comunidade.

[00484] Um micróbio Kosakonia sacchari (cepa PBC6.1) foi isolado e classificado por meio de rRNA de 16S e sequenciamento do genoma completo. Este é um fixador de nitrogênio particularmente interessante capaz de colonizar até quase 21% de abundância da microbiota associada à raiz (FIG. 2). Para avaliar a sensibilidade da cepa ao nitrogênio exógeno, taxas de fixação de nitrogênio em cultura pura foram medidas com o ensaio de redução de acetileno (ARA) clássico e níveis variáveis de suplementação de glutamina. A espécie exibiu um nível elevado de atividade de fixação de nitrogênio em meios livres de nitrogênio, embora o nitrogênio exógeno fixado reprimisse a expressão do gene nif e a atividade de nitrogenase (Cepa PBC6.1, FIG. 3C, FIG. 3D). Adicionalmente, quando amônia liberada foi medida no sobrenadante de PBC6.1 desenvolvida em condições de fixação de nitrogênio, muito pouca liberação de nitrogênio fixado podia ser detectada (FIG. 3E).

[00485] Formulamos a hipótese de que PBC6.1 poderia ser um contribuinte significante de nitrogênio fixado em campos fertilizados se redes regulatórias que controlam o metabolismo de nitrogênio fossem remodeladas para permitir a expressão de nitrogenase e liberação de amônia ótimas na presença de nitrogênio fixado.

[00486] Uma diversidade genética suficiente deve existir dentro do genoma de PBC6.1 para permitir remodelagem fenotípica ampla (como um resultado de remodelagem da arquitetura genética subjacente de uma forma não intergenérica) sem a inserção de transgenes ou elementos reguladores sintéticos. A cepa isolada possui um genoma de pelo menos 5,4 Mbp e um agrupamento de genes de fixação de nitrogênio canônico. As vias do metabolismo de nitrogênio relacionadas em PBC6.1 são similares àquelas do organismo- modelo para fixação de nitrogênio, Klebsiella oxytoca m5al.

[00487] Foram identificados vários nós da rede regulatória de genes que podem aumentar a fixação de nitrogênio e a transferência subsequente para uma planta hospedeira, particularmente em concentrações exógenas elevadas de nitrogênio fixado (FIG. 3A). O operon nifLA regula diretamente o resto do agrupamento nif por meio de ativação transcricional por NifA e repressão nitrogênio- e oxigênio-dependente de NifA por NifL. A ruptura de nifL pode abolir a inibição de NifA e aumentar a expressão de nif na presença tanto de oxigênio quanto de nitrogênio exógeno fixado. Além disso, a expressão de nifA sob o controle de um promotor independente de nitrogênio pode desacoplar a biossíntese de nitrogenase da regulação pelo complexo de sensoriamento de nitrogênio NtrB/NtrC.

[00488] A assimilação de nitrogênio fixado pelo micróbio em glutamina por glutamina sintetase (GS) é regulada reversivelmente pela enzima de dois domínios adenililtransferase (ATase) GlnE por meio da adenililação e desadenililação de GS para atenuar e restaurar a atividade, respectivamente. O truncamento da proteína GlnE para deletar seu domínio de remoção de adenilil (AR) pode levar à glutamina sintetase constitutivamente adenililada, limitação de assimilação de amônia pelo micróbio e aumento da amônia intra- e extracelular.

[00489] Finalmente, a redução da expressão de AmtB, o transportador responsável por captação de amônia, poderia levar ao aumento da amônia extracelular.

[00490] Para gerar fenótipos microbianos racionalmente projetados sem o uso de transgenes, foram empregadas duas abordagens para remodelar a arquitetura genética subjacente do micróbio: (1) a criação de deleções sem marcador de sequências genômicas que codificam domínios de proteína ou genes inteiros, e (2) remontagem de redes regulatórias por rearranjo do promotor intragenômico.

[00491] Por meio de um processo de remodelagem repetitivo, várias cepas não-transgênicas derivadas de PBC6.1 foram geradas (Tabela 25). Tabela 25. Lista de cepas de K. sacchari isoladas e derivadas usadas nesse trabalho. Prm, sequência promotora derivada do genoma de PBC6.1; ΔglnEAR1 e ΔglnEAR2, versões truncadas diferentes do gene glnE que remove a sequência do domínio de remoção de adenilil.

ID. da Genótipo Cepa PBC6.1 WT PBC6.14 ΔnifL::Prm1 PBC6.15 ΔnifL::Prm5 PBC6.22 ΔnifL::Prm3 PBC6.37 ΔnifL::Prm1 ΔglnE AR2 PBC6.38 ΔnifL::Prm1 ΔglnEAR1 PBC6.93 ΔnifL::Prm1 ΔglnE AR2 ΔamtB PBC6.94 ΔnifL::Prm1 ΔglnE AR1 ΔamtB

[00492] Vários ensaios in vitro foram realizados para caracterizar fenótipos específicos das cepas derivadas. O ARA foi usado para avaliar a sensibilidade da cepa ao nitrogênio exógeno, no qual PBC6.1 exibiu repressão da atividade de nitrogenase em concentrações elevadas de glutamina (FIG. 3D). Em contraste, a maioria das cepas derivadas mostrou um fenótipo desreprimido com níveis variáveis de redução de acetileno observados em concentrações elevadas de glutamina. As taxas transcricionais de nifA em amostras analisadas por qPCR se correlacionavam bem com taxas de redução de acetileno (FIG. 4), dando suporte à hipótese de que a ruptura de nifL e a inserção de um promotor independente de nitrogênio para dirigir nifA podem levar à desrepressão do agrupamento nif.

[00493] Cepas com atividade alterada de GlnE ou AmtB mostraram taxas de excreção de amônio acentuadamente aumentadas comparadas com cepas do tipo selvagem ou derivadas sem essas mutações (FIG. 3E), o que ilustra o efeito desses genótipos sobre a assimilação e recaptação de amônia.

[00494] Dois experimentos foram realizados para estudar a interação de derivados de PBC6.1 (micróbios remodelados) com plantas de milho e quantificar a incorporação de nitrogênio fixado em tecidos de plantas. Primeiro, as taxas de fixação microbiana de nitrogênio foram quantificadas em uma estufa estudo usando traçadores isotópicos. Resumidamente, as plantas são desenvolvidas com fertilizante marcado com 15N, e concentrações diluídas de 15N em tecidos de plantas indicam contribuições de nitrogênio fixado de micróbios. Mudas de milho foram inoculadas com cepas microbianas selecionadas, e as plantas foram desenvolvidas até o estágio V6 do crescimento.

As plantas foram subsequentemente desconstruídas para permitir a medição de colonização e expressão gênica microbianas, bem como medição de proporções de 15N/14N em tecidos de plantas por espectrometria de massa de proporção de isótopo (IRMS). A análise do tecido aéreo mostrou uma contribuição pequena, insignificante, por PBC6.38 para os níveis de nitrogênio da planta, e uma contribuição significante por PBC6.94 (p = 0,011). Aproximadamente 20% do nitrogênio encontrado em folhas de milho acima do solo foram produzidos por PBC6.94, com o restante vindo da semente, com a fixação da mistura de envasamento ou “de fundo” por outros micróbios oriundos do solo (FIG. 5C). Isso ilustra que nosso sistema de reprodução microbiana e remodelagem pode gerar cepas remodeladas capazes de produzir contribuições de nitrogênio significantes às plantas na presença de fertilizante de nitrogênio.

A transcrição microbiana dentro de tecidos de plantas foi medida, e expressão do agrupamento do gene nif foi observada em cepas remodeladas derivadas, mas não na cepa do tipo selvagem (FIG. 5B), mostrando a importância da desrepressão de nif par a contribuição de BNF aos cultivos em condições fertilizadas.

A colonização da raiz medida por qPCR demonstrou que a densidade de colonização é diferente para cada uma das cepas testadas (FIG. 5A). foi observada uma diferença de 50 vezes na colonização entre PBC6.38 e PBC6.94. Essa diferença poderia ser uma indicação de que PBC6.94 possui capacidade na rizosfera reduzida em relação à PBC6.38 como resultado de níveis elevados de fixação e excreção.

Métodos

Meios

[00495] Meio mínimo contém (por litro) 25 g de Na2HPO4, 0,1 g de CaCl2-2H2O, 3 g de KH2PO4, 0,25 g de MgSO4·7H2O, 1 g de NaCl, 2,9 mg de FeCl3, 0,25 mg de Na2MoO4·2H2O e 20 g de sacarose. Meio de crescimento é definido como meio mínimo suplementado com 50 ml de 200 mM de glutamina por litro. Isolamento de Diazotróficos

[00496] Mudas de milho foram desenvolvidas a partir de semente (DKC 66-40, DeKalb, IL) por duas semanas em um ambiente de estufa controlado de 22°C (noite) a 26°C (dia) e expostas a ciclos de luz de 16 horas em solo coletado de San Joaquin County, CA. As raízes foram colhidas e lavadas com água deionizada estéril para remover restos de solo. Os tecidos de raiz foram homogeneizados com glóbulos de aço inoxidável de 2 mm em um dispositivo de lise de tecido (TissueLyser II, Qiagen P/N 85300) por três minutos no ajuste 30, e as amostras foram centrifugadas por 1 minuto a 13.000 rpm para separar tecido de bactérias associadas à raiz. Os sobrenadantes foram divididos em duas frações, e uma foi usada para caracterizar o microbioma por meio de sequenciamento de amplicon de rRNA de 16S e a fração restante foi diluída e plaqueada em meio Caldo Livre de Nitrogênio (NfB) suplementado com ágar 1,5%. As placas foram incubadas a 30°C por 5-7 dias. As colônias que emergiram foram testadas quanto à presença do gene nifH por PCR da colônia com iniciadores Ueda19f e Ueda406r. DNA genômico de cepas com um PCR da colônia positivo para nifH foi isolado (QIAamp DNA Mini Kit, Nº de Catálogo 51306, QIAGEN, Alemanha) e sequenciado (Illumina MiSeq v3, SeqMatic, Fremont, CA). Após montagem e anotação de sequência, os isolados que contêm agrupamentos de genes de fixação de nitrogênio foram utilizados em pesquisa posterior. Definição de Perfil do Microbioma de Mudas do Isolamento

[00497] DNA genômico foi isolado de bactérias associadas à raiz usando o Kit de DNA genômico I ZR-96 (Zymo Research, P/N D3011), e amplicons de rRNA de 16S foram gerados usando iniciadores Nextera-Barcoded que visam 799f e 1114r. As bibliotecas de amplicons foram purificadas e sequenciadas com a plataforma Illumina MiSeq v3 (SeqMatic, Fremont, CA). As leituras foram classificadas taxonomicamente usando Kraken usando o banco de dados Minikraken (FIG. 2). Ensaio de Redução de Acetileno (ARA)

[00498] Uma versão modificada do ensaio de redução de acetileno foi usada para medir a atividade de nitrogenase em condições de cultura puras. As cepas foram propagadas a partir de colônia única em SOB (RPI, P/N S25040-1000) a 30°C com agitação a 200 RPM por 24 horas e depois subcultivadas 1:25 em meio de crescimento e desenvolvidas aerobicamente por 24 horas (30°C, 200 RPM). Um ml da cultura em meio mínimo foi então adicionado a 4 ml de meio mínimo suplementado com 0 a 10 mM de glutamina em tubos Hungate hermeticamente fechados e desenvolvidas anaerobicamente por 4 horas (30°C, 200 RPM). Dez por cento do espaço vazio foram removidos e depois substituídos por um volume igual de acetileno por injeção, e a incubação continuou por 1 hora. Subsequentemente, 2 ml de espaço vazio foram removidos por meio de uma seringa hermética a gás para quantificação de produção de etileno usando um cromatógrafo a gás Agilent

6850 equipado com um detector de ionização de chama (FID). Ensaio de Excreção de Amônio

[00499] A excreção de nitrogênio fixado na forma de amônia foi medida usando fermentação em batelada em biorreatores anaeróbicos. As cepas foram propagadas a partir de colônia única em 1 ml/poço de SOB em uma placa de 96 poços DeepWell. A placa foi incubada a 30°C com agitação a 200 RPM por 24 horas e depois diluída 1:25 em uma placa fresca contendo 1 ml/poço de meio de crescimento. As células foram incubadas por 24 horas (30°C, 200 RPM) e depois diluídas 1:10 em uma placa fresca contendo meio mínimo. A placa foi transferida para uma câmara anaeróbica com uma mistura de gás de > 98,5% de nitrogênio, 1,2-1,5% de hidrogênio e <30 PPM de oxigênio e incubada a 1350 RPM, em temperatura ambiente por 66-70 horas. A biomassa da cultura inicial foi comparada com a biomassa final por medição da densidade óptica a 590 nm. As células foram então separadas por centrifugação, e o sobrenadante do caldo do reator foi testado para amônia livre usando o kit de Ensaio de Amônia Megazyme (P/N K-AMIAR) normalizada para biomassa em cada ponto do tempo. Extração de Microbioma Associado à Raiz

[00500] As raízes foram agitadas gentilmente para remover partículas perdidas, e os sistemas de raiz foram separados e embebidos em uma solução de estabilização de RNA (Thermo Fisher P/N AM7021) por 30 minutos. As raízes foram então brevemente enxaguadas com água deionizada estéril. As amostras foram homogeneizadas usando glóbulos pulsantes com bolas de aço inoxidável de 1,27 cm (1/2 polegada) em um dispositivo de lise de tecido (TissueLyser II, Qiagen P/N

85300) em 2 ml de tampão de lise (Qiagen P/N 79216). A extração de DNA genômico foi realizada com o kit ZR-96 Quick- gDNA (Zymo Research P/N D3010), e a extração de RNA usando o kit RNeasy (Qiagen P/N 74104). Ensaio de Colonização da Raiz

[00501] Quatro dias após o plantio, 1 ml de uma cultura bacteriana de um dia para o outro (aproximadamente 109 cfu) foi aplicado ao solo acima da semente plantada. As mudas foram fertilizadas três vezes por semana com 25 ml de solução de Hoagland modificada suplementada com 0,5 mM de nitrato de amônio. Quatro semanas após o plantio, as amostras de raiz foram coletadas e o DNA genômico total (gDNA) foi extraído. A colonização da raiz foi quantificada usando qPCR com iniciadores projetados para amplificar regiões únicas do genoma da cepa do tipo selvagem ou derivada. A eficiência da reação de QPCR foi medida usando uma curva-padrão gerada a partir de uma quantidade conhecida de gDNA do genoma-alvo. Os dados foram normalizados para cópias do genoma por g de peso fresco usando o peso do tecido e o volume de extração. Para cada experimento, os números de colonização foram comparados com mudas não tratadas de controle. Transcriptômica in Planta

[00502] A definição do perfil transcricional de micróbios associados à raiz foi medida em mudas desenvolvidas e processadas como descrito no Ensaio de Colonização da Raiz. O RNA purificado foi sequenciado usando a plataforma Illumina NextSeq (SeqMatic, Fremont, CA). As leituras foram mapeadas para o genoma da cepa inoculada usando bowtie2 usando parâmetros ‘--very-sensitive-local’ e uma pontuação de alinhamento mínima de 30. A cobertura através do genoma foi calculada usando Samtools. A cobertura diferencial foi normalizada para expressão gênica interna e visualizada através do genoma usando Circos e através do agrupamento do gene nif usando DNAplotlib. Adicionalmente, o perfil transcricional in planta foi quantificado por meio de análise dirigida Nanostring. O RNA purificado foi processado em um nCounter Sprint (Core Diagnostics, Hayward, CA). Estudo em Estufa de Diluição de 15N

[00503] Um experimento de diluição de fertilizante de 15N foi realizado para avaliar a atividade da cepa otimizada in planta. Um meio de plantio contendo N em nível de fundo mínimo foi preparado usando uma mistura de vermiculita e areia lavada (5 enxágues em H2O DI). A mistura de areia foi autoclavada por 1 hora a 122°C e aproximadamente 600 g medidos e retirados para potes de 655,48 mililitros (40 polegadas cúbicas), que foram saturados com H2O DI estéril e foi permitido que drenasse 24 horas antes do plantio. As sementes de milho (DKC 66-40) foram esterilizadas na superfície em hipoclorito de sódio 0,625% por 10 minutos, e depois enxaguadas cinco vezes em água destilada estéril e plantadas a 1 cm de profundidade. As plantas foram mantidas sum lâmpadas fluorescentes por quatro semanas com duração do dia de 16 horas em temperaturas ambientes que variam de 22°C (noite) a 26°C (dia).

[00504] Cinco dias após o plantio, as mudas foram inoculadas com uma suspensão de 1 ml de células encharcado diretamente sobre o coleóptilo emergente. O inóculo foi preparado a partir de culturas de 5 ml de um dia para o outro em SOB, que foram centrifugadas e ressuspensas duas vezes em 5 ml de PBS para remover SOB residual antes da diluição final até OD de 1,0 (aproximadamente 109 CFU/ml). Plantas de controle foram tratadas com PBS estéril, e cada tratamento foi aplicado a dez réplicas de plantas.

[00505] As plantas foram fertilizadas com 25 ml de solução fertilizante contendo 2 mM de KNO3 enriquecido em 15N 2% em 5, 9, 14 e 19 dias após o plantio, e a mesma solução sem KNO3 em 7, 12, 16 e 18 dias após o plantio. A solução fertilizante continha (por litro) 3 mmol de CaCl2, 0,5 mmol de KH2PO4, 2 mmol de MgSO4, 17,9 µmol de FeSO4, 2,86 mg de H3BO3, 1,81 mg de MnCl2•4H2O, 0,22 mg de ZnSO4•7H2O, 51 µg de CuSO4•5H2O, 0,12 mg de Na2MoO4•2H2O e 0,14 nmol de NiCl2. Todos os potes foram irrigados com H2O DI estéril como necessário para manter a umidade do solo consistente sem escoamento.

[00506] Em quatro semanas, as plantas foram colhidas e separadas no nó mais baixo em amostras para extração de gDNA e RNA da raiz e tecido aéreo para IRMS. Os tecidos aéreos foram limpos como necessário para remover areia, colocados inteiros em bolsas de papel e secos por pelo menos 72 horas a 60°C. Depois de estar completamente seco, o tecido aéreo total foi homogeneizado por agitação com glóbulos e amostras de 5-7 mg foram analisadas por espectrometria de massa de proporção de isótopo (IRMS) para δ15N pelo “MBL Stable Isotope Laboratory” (The Ecosystems Center, Woods Hole, MA). O percentual de NDFA foi calculado usando a seguinte fórmula: %NDFA = (δ15N da média de UTC - δ15N de amostra) / (δ15N da média de UTC) x 100. Exemplo 3: Experimentos de Campos com Micróbios Remodelados da Revelação – Verão de 2016

[00507] A fim de avaliar a eficácia de cepas remodeladas da presente revelação sobre o crescimento e produtividade do milho sob regimes variáveis de nitrogênio, foram realizados experimentos de campo.

[00508] Os experimentos foram realizados com (1) sete tratamentos de subparcela de seis cepas mais o controle – quatro parcelas principais compreendiam 0, 15, 85 e 100% de retorno máximo em nitrogênio (MRTN) com verificação local. O controle (somente UTC) foi realizado com 10 de MRTN 100% mais, 2,26, 4,53 ou 6,80 quilogramas (5,10 ou 15 libras). Os tratamentos tiveram quatro réplicas.

[00509] Parcelas do milho (mínimas) tinham 4 fileiras de 9,14 metros (30 pés) de comprimento, com 124 parcelas por localização. Todas as observações foram feitas das duas fileiras centrais das parcelas, e toda a amostragem destrutiva foi retirada das fileiras externas. As amostras de semente foram refrigeradas até 1,5 a 2 horas antes do uso.

[00510] Prática agrícola local: A semente era um milho comercial sem tratamento fungicida e inseticida convencional. Todos os tratamentos de sementes foram aplicados por um único especialista em tratamento de sementes para assegurar uniformidade. A data do plantio, taxa de semeadura, gerenciamento de ervas daninhas/insetos etc. foram deixados para práticas agrícolas locais. Com a exceção de aplicações de fungicida, práticas de gerenciamento padronizadas foram seguidas.

[00511] Caracterização do solo: A textura do solo e a fertilidade do solo foram avaliadas. As amostras de solo foram pré-plantadas para cada réplica para assegurar níveis residuais de nitrato menores do que 22,68 kg/Ac (50 lbs/Ac).

Núcleos de solo foram retirados de 0 cm a 30 cm. O solo foi ainda caracterizado quanto ao pH, CEC, K e P totais.

[00512] Avaliações: A população de plantas inicial foi avaliada 14 dias após o plantio (DAP)/acre, e foi ainda avaliada para: (1) vigor (escala de 1 a 10, com 10 = excelente) 14 DAP & V10; (2) registro de classificações de doença em qualquer momento quando sintomas estivessem evidentes nas parcelas; (3) registro de quaisquer diferenças no acamamento, caso ocorra acamamento nas parcelas; (4) rendimento (Bu/acre), ajustado para percentagem de umidade- padrão; (5) peso de teste; e (6) percentagem de umidade do grão.

[00513] Requisitos da amostragem: O solo teve amostras coletadas em três pontos do tempo (antes do início do experimento, V10-VT, 1 semana pós-colheita). Todas as seis localizações e todas as parcelas tiveram amostras coletadas a 10 gramas por amostra (124 parcelas X 3 pontos do tempo X 6 localizações).

[00514] Amostragem de colonização: Amostras de colonização foram coletadas em dois pontos do tempo (V10 e VT) para cinco localizações e seis pontos do tempo (V4, V8, V10, VT, R5 e Pós-Colheita). As amostras foram coletadas da seguinte forma: (1) de MRTN 0% e 100%, 60 parcelas por localização; (2) 4 plantas por parcela selecionadas aleatoriamente das fileiras externas; (3) 5 gramas de raiz, 20,32 cm (8 polegadas) de caule, e três folhas superiores - cada uma embalada e identificada separadamente – 12/bolsas por parcela; (4) cinco localizações (60 parcelas X 2 pontos do tempo X 12 bolsas/parcela); e uma localização (60 parcelas X 6 pontos do tempo X 12 bolsas/parcela.

[00515] A determinação do índice de vegetação por diferença normalizada (NDVI) foi feita usando um instrumento Greenseeker em dois pontos do tempo (V4 – V6 e VT). Cada parcela avaliada em todas as seis localizações (124 parcelas X 2 pontos do tempo X 6 localizações).

[00516] A análise da raiz foi realizada com WinRhizo de uma localização que melhor ilustrasse a diferenciação de tratamento. Dez plantas por parcela tiveram amostras coletadas aleatoriamente (5 adjacentes de cada fileira externa; foram preferidas plantas em estágio V3-V4) e gentilmente lavadas para remover o máximo de sujeira possível. Dez raízes foram colocadas em uma bolsa plástica e rotuladas. Foram analisadas com Análise de Raiz WinRhizo.

[00517] As características do caule foram medidas em todas as seis localizações entre R2 e R5. O diâmetro do caule de dez plantas por parcela na altura de 15,24 cm (6”) foi registrado, bem como o comprimento do primeiro internódio acima da marca de 15,24 cm(6”). Dez plantas foram monitoradas; cinco plantas consecutivas do centro das duas fileiras de internas. Seis localizações foram avaliadas (124 parcelas X 2 medições X 6 localizações).

[00518] Os nitratos do tecido foram analisados de todas as parcelas e todas as localizações. Um segmento de 20,32 cm de caule começando 15,24 cm (6”) acima do solo quando o milho está entre uma e três semanas após formação da camada preta; as bainhas das folhas foram removidas. Todas as localizações e parcelas foram avaliadas (6 localizações X 124 parcelas).

[00519] Os dados climáticos seguintes foram registrados para todas as localizações do plantio à colheita:

temperaturas diárias máximas e mínimas, temperatura do solo na semeadura, chuvas diárias mais irrigação (se aplicável), e quaisquer eventos climáticos incomuns como, por exemplo, chuva, vento, frio ou calor excessivos.

[00520] Os dados de rendimento através de todas as seis localizações são apresentados na Tabela 26. A taxa de nitrogênio teve um impacto significante sobre o rendimento, mas cepas através de taxas de nitrogênio não tiveram. No entanto, na menor taxa de nitrogênio, as cepas CI006, CM029, e CI019 numericamente superaram em termos de rendimento o UTC por 4 a 6 bu/acre. O rendimento também estava numericamente aumentado 2 a 4 bu/acre para as cepas CM029, CI019 e CM081 em MRTN 15%.

Tabela 26: Dados de rendimento através de todas as seis localizações.

Diâmetro Comprimento REND.

Vigor Vigor do Caule do Internódio NDVI NDVI MRTN% (bu) _E _L (mm) (cm) _Veg _Rep 0 143,9 7,0 5,7 18,87 18,237 64,0 70,6 15 165,9 7,2 6,3 19,27 18,49 65,8 72,5 85 196,6 7,1 7,1 20,00 18,56 67,1 74,3 100 197,3 7,2 7,2 20,23 18,72 66,3 72,4

Diâmetro Comprimento REND.

Vigor Vigor NDVI NDVI Cepa do Caule do internódio (bu) _E _L _Veg _Rep (mm) (cm) CI006 (1) 176,6 7,2 6,6 19,56 47,70 66,1 72,3 CM029 (2) 176,5 7,1 6,5 19,54 47,26 65,4 71,9 CM038 (3) 175,5 7,2 6,5 19,58 47,47 65,7 72,8 CI019 (4) 176,0 7,1 6,6 19,51 47,47 65,5 72,9 CM081 (5) 176,2 7,1 6,6 19,57 47,47 65,8 73,1 CM029/CM081 (6) 174,3 7,1 6,6 19,83 47,72 66,2 72,5 UTC (7) 176,4 7,1 6,6 19,54 47,52 65,9 71,7

Diâmetro Comprimento REND.

Vigor Vigor NDVI NDVI MRTN / Cepa do Caule do Internódio (bu) _E _L _Veg _Rep (mm) (cm) 0 1 145,6 7,0 5,6 19,07 18,08 63,5 70,3 0 2 147,0 7,0 5,5 18,74 18,18 64,4 70,4 0 3 143,9 7,0 5,5 18,83 18,72 64,6 70,5 0 4 146,0 6,9 5,7 18,86 18,16 63,4 70,7 0 5 141,7 7,0 5,8 18,82 17,90 63,6 70,9 0 6 142,2 7,2 5,8 19,12 18,00 64,7 69,9 0 7 141,2 7,0 5,8 18,64 18,59 64,0 71,4

15 1 164,2 7,3 6,1 19,09 18,31 66,1 71,5 15 2 167,3 7,2 6,3 19,32 18,51 65,5 72,7 15 3 165,6 7,3 6,3 19,36 18,36 64,8 72,5 15 4 167,9 7,3 6,4 19,31 19,07 66,1 72,3 15 5 169,3 7,2 6,2 19,05 18,59 66,0 72,8 15 6 161,9 7,1 6,3 19,45 18,28 66,2 72,2

15 7 165,1 7,3 6,4 19,30 18,237 66,0 73,3

85 1 199,4 7,3 7,2 19,70 18,59 67,2 74,0 85 2 195,1 7,1 7,2 19,99 18,00 66,5 74,4 85 3 195,0 7,0 7,0 20,05 18,44 67,3 74,6 85 4 195,6 7,2 7,1 20,04 18,51 66,4 74,4 85 5 196,4 7,2 7,0 19,87 18,77 67,3 74,5 85 6 195,1 7,0 6,9 20,35 18,64 67,4 74,4 85 7 199,5 6,9 7,2 19,97 18,99 67,4 74,1

100 1 197,1 7,2 7,3 20,38 19,50 67,5 73,4 100 2 196,5 7,0 7,1 20,11 18,31 65,3 70,2 100 3 197,6 7,5 7,3 20,08 18,84 66,3 73,4 100 4 194,6 7,1 7,1 19,83 18,79 66,1 74,1 100 5 197,4 7,2 7,3 20,53 18,69 66,2 74,3 100 6 198,1 7,2 7,4 20,40 18,18 66,6 73,6 100 7 199,9 7,2 7,2 20,26 18,59 66,2 68,1

[00521] Outra abordagem de análise é apresentada na Tabela 27. A tabela compreende as quatro localizações onde a resposta ao nitrogênio foi a maior, o que sugere que nitrogênio residual disponível era o menor.

Essa abordagem n]ao altera a avaliação de que a taxa de nitrogênio impactou significantemente o rendimento, cujas cepas não o fizeram quando ponderado através de todas as taxas de nitrogênio.

No entanto, a vantagem de rendimento numérico na menor taxa de N é mais pronunciada para todas as cepas, particularmente CI006, CM029 e CM029/CM081, nas quais os rendimentos foram aumentados de 8 para 10 bu/acre.

Em MRTN 15%, a cepa CM081 superou o rendimento de UTC por 5 bu.

Tabela 27: Dados de rendimento através de quatro localizações Média de 4 localizações - SGS, AgIdea, Bennett, RFR REND.

Vigor Vigor Diâmetro do Comprimento do MRTN% (bu) _E _L Caule (mm) Internódio (cm) 0 137,8 7,3 5,84 18,10 13,61 15 162,1 7,5 6,63 18,75 13,71 85 199,2 7,4 7,93 19,58 14,27 100 203,5 7,5 8,14 19,83 14,35

REND.

Vigor Vigor Diâmetro do Comprimento do Cepa (bu) _E _L Caule (mm) Internódio (cm) CI006 (1) 175,4 7,5 7,08 19,03 14,19 CM029 (2) 176,1 7,4 7,08 19,09 13,69 CM038 (3) 175,3 7,5 7,05 19,01 14,19 CI019 (4) 174,8 7,5 7,16 19,02 13,84 CM081 (5) 176,7 7,4 7,16 19,00 14,04 CM029/CM081 (6) 175,1 7,4 7,17 19,33 13,86 UTC (7) 176,0 7,3 7,27 18,98 14,09

MRTN / Cepa REND.

Vigor Vigor Diâmetro do Comprimento do

(bu) _E _L Caule (mm) Internódio (cm) 0 1 140,0 7,3 5,69 18,32 13,41 0 2 140,7 7,4 5,69 18,19 13,28 0 3 135,5 7,3 5,63 17,95 13,97 0 4 138,8 7,3 5,81 17,99 13,61 0 5 136,3 7,3 6,06 18,05 13,56 0 6 141,4 7,5 6,00 18,43 13,46 0 7 131,9 7,3 6,00 17,75 13,91

15 1 158,0 7,6 6,44 18,53 13,56 15 2 164,1 7,5 6,56 19,13 13,76 15 3 164,3 7,6 6,63 18,68 13,99 15 4 163,5 7,6 6,81 18,84 13,56 15 5 166,8 7,5 6,63 18,60 13,69 15 6 156,6 7,4 6,56 18,86 13,74 15 7 161,3 7,5 6,81 18,62 13,76

85 1 199,4 7,6 8,00 19,15 14,3 85 2 199,0 7,4 8,09 19,49 13,86 85 3 198,2 7,4 7,75 19,88 14,45

85 4 196,8 7,4 8,00 19,65 14,22 85 5 199,5 7,4 7,75 19,26 14,47 85 6 198,7 7,3 7,81 19,99 14,24 85 7 202,8 7,2 8,13 19,66 14,35

100 1 204,3 7,4 8,19 20,11 15,49 100 2 200,6 7,3 8,00 19,53 13,86 100 3 203,3 7,7 8,19 19,55 14,40 100 4 200,2 7,6 8,00 19,59 13,94 100 5 203,9 7,4 8,19 20,08 14,42 100 6 203,8 7,5 8,31 20,05 14,02 100 7 208,1 7,4 8,13 19,90 14,3

[00522] Os resultados do experimento de campo também estão ilustrados nas FIGS 9-15. Os resultados indicam que os micróbios da revelação são capazes de aumentar o rendimento de plantas, o que aponta para a habilidade dos micróbios ensinados para aumentar fixação de nitrogênio em um cultivo agrícola importante, ou seja, milho.

[00523] Os resultados baseados no campo validam ainda mais os métodos revelados de modificação de forma não intergenérica do genoma de cepas microbianas selecionadas, a fim de produzir resultados agronomicamente relevantes em um cenário de campo quando as referidas cepas modificadas geneticamente são aplicadas a um plantio.

[00524] A FIG. 6 retrata a linhagem de cepas modificadas remodeladas que foram derivadas da cepa CI006 (WT Kosakonia sacchari). Os dados de campo demonstram que um derivado modificado geneticamente da cepa CI006 WT, ou seja, CM029, é capaz de produzir resultados numericamente relevantes em um cenário de campo. Por exemplo, a Tabela 26 ilustra que em MRTN 0% CM029 gerou 147,0 bu/acre, comparada com o controle não tratado a 141,2 bu/acre (um aumento de 5,8 bu/acre). A Tabela 26 também ilustra que em MRTN 15% CM029 gerou 167,3 bu/acre, comparada com o controle não tratado a 165,1 bu/acre (um aumento de 2,2 bu/acre). A Tabela 27 dá suporte a essas conclusões e ilustra que em MRTN 0% CM029 gerou 140,7 bu/acre, comparada com o controle não tratado a 131,9 bu/acre (um aumento de 8,8 bu/acre). A Tabela 27 também ilustra que em MRTN 15% CM029 gerou 164,1 bu/acre, comparada com o controle não tratado a 161,3 bu/acre (um aumento de 2,8 bu/acre).

[00525] A FIG. 7 retrata a linhagem de cepas modificadas remodeladas que foram derivadas da cepa CI019 (WT Rahnella aquatilis). Os dados de campo demonstram que um derivado modificado geneticamente da cepa CI019 WT, ou seja, CM081, é capaz de produzir resultados numericamente relevantes em um cenário de campo. Por exemplo, a Tabela 26 ilustra que em MRTN 15% CM081 gerou 169,3 bu/acre, comparada com o controle não tratado a 165,1 bu/acre (um aumento de 4,2 bu/acre). A Tabela 27 dá suporte a essas conclusões e ilustra que em MRTN 0% CM081 gerou 136,3 bu/acre, comparada com o controle não tratado a 131,9 bu/acre (um aumento de 4,4 bu/acre). Tabela 27 também ilustra que em MRTN 15% CM081 gerou 166,8 bu/acre, comparada com o controle não tratado a 161,3 bu/acre (um aumento de 5,5 bu/acre).

[00526] Além disso, pode ser observado na Tabela 27 que a combinação de CM029/CM081 em MRTN 0% gerou 141,4 bu/acre, comparada com o controle não tratado a 131,9 bu/acre (um aumento de 9,5 bu/acre). Exemplo 4: Experimentos de Campos com Micróbios Remodelados da Revelação – Verão de 2017

[00527] A fim de avaliar a eficácia de cepas remodeladas da presente revelação sobre o crescimento e produtividade do milho sob regimes variáveis de nitrogênio, foram realizados experimentos de campo. Os dados de campo abaixo demonstram que os micróbios não intergenéricos da revelação são capazes de fixar o nitrogênio atmosférico e liberar o referido nitrogênio a uma planta – resultando em rendimentos aumentados – tanto em um ambiente com limitação de nitrogênio, quanto em um ambiente sem limitação de nitrogênio.

[00528] Os experimentos foram realizados em sete localizações através dos Estados Unidos com seis localizações do meio oeste geograficamente diversas. Cinco regimes de nitrogênio foram usados para tratamentos com fertilizante: 100% de prática agrícola-padrão do local/região, 100% menos 11,34 quilogramas (25 libras), 100% menos 22,68 quilogramas (50 libras), 100% menos 34,01 quilogramas (75 libras), e 0%; tudo por acre. Os quilogramas de nitrogênio por acre para o regime de 100% dependiam das práticas agrícolas-padrão do local/região. Os regimes de nitrogênio mencionados anteriormente variaram de cerca de 69,4 quilogramas (153 libras) por acre até cerca de 81,64 quilogramas (180 libras) por acre, com uma média de cerca de 74,38 quilogramas (164 libras) de nitrogênio por acre.

[00529] Dentro de cada regime de fertilizante havia 14 tratamentos. Cada regime tinha seis réplicas, e um design de parcela dividida foi utilizado. Os 14 tratamentos incluíram: 12 micróbios diferentes, 1 UTC com a mesma taxa de fertilizante que a parcela principal, e 1 UTC com 100% de nitrogênio. No regime de 100% de nitrogênio, o 2º UTC é 100 mais 11,34 quilogramas (25 libras).

[00530] As parcelas do milho, no mínimo, tinham 4 fileiras de 9,14 metros (30 pés) de comprimento (76,2 cm (30 polegadas) entre fileiras) com 420 parcelas por localização. Todas as observações, salvo observação em contrário, foram feitas das duas fileiras centrais das plantas, e toda a amostragem destrutiva foi retirada das fileiras externas. As amostras de semente foram refrigeradas até 1,5 a 2 horas antes do uso.

[00531] Prática agrícola local: A semente era um milho comercial aplicado com um tratamento de sementes comercial sem coaplicação biológica. A taxa de semeadura, data do plantio, gerenciamento de ervas daninhas/insetos, tempos de colheita e outras práticas de gerenciamento padronizadas foram deixados para as normas de práticas agrícolas locais para as regiões, com a exceção da aplicação de fungicida (se necessária).

[00532] Aplicação de micróbios: Os micróbios foram aplicados à semente em um tratamento de sementes sobre sementes que já haviam recebido um tratamento químico normal. As sementes foram revestidas com caldo de fermentação que compreende os micróbios.

[00533] Caracterização do solo: A textura do solo e a fertilidade do solo foram avaliadas. Foram utilizados procedimentos padronizados de amostragem do solo, que incluíram núcleos de solo de profundidades de 0-30 cm e 30- 60 cm. A amostragem-padrão do solo incluiu a determinação de nitrogênio de nitrato, nitrogênio de amônio, nitrogênio total, matéria orgânica e CEC. A amostragem-padrão do solo ainda incluiu a determinação do pH, potássio total e fósforo total. Para determinar os níveis de fertilizante de nitrogênio, amostras do solo pré-planta de cada localização foram retiradas para assegurar que as 0-30,48 cm (0-12”) e potencialmente as regiões de solo de 30,48 cm (12”) até 60,96 cm (24”) para nitrogênio de nitrato.

[00534] Antes do plantio e fertilização, foram coletadas amostras do solo de 2 ml de 0 a 15,24-30,48 cm (6- 12”) do UTC. Uma amostra por réplica por região de nitrogênio foi coletada usando o meio da fileira. (5 regimes de fertilizante x 6 réplicas = trinta amostras do solo).

[00535] Pós-plantio (V4-V6), foram coletadas amostras do solo de 2 ml de 0 a 15,24-30,48 cm (6-12”) do UTC. Uma amostra por réplica por região de nitrogênio foi coletada usando o meio da fileira. (5 regimes de fertilizante x 6 réplicas = trinta amostras do solo).

[00536] Pós-colheita (V4-V6), foram coletadas amostras do solo de 2 ml de 0 a 15,24-30,48 cm (6-12”) do UTC. Uma amostra por réplica por região de nitrogênio foi coletada usando o meio da fileira. Uma amostra do solo pós- colheita adicional coletada a 0-30,48 cm (0-12”) do UTC e potencialmente 30,48-60,96 cm (12-24”) do UTC (5 regimes de fertilizante x 6 réplicas = trinta amostras do solo).

[00537] Uma amostra do solo V6-V10 de cada regime de fertilizante (excluindo o tratamento de 100% e 100% + 11,34 kg (25 lbs) [no bloco de 100%] para todos os regimes de fertilizante a 0-30,48 cm (0-12”) e 30,48-60,96 cm (12-24”). (5 regimes de fertilizante x 2 profundidades = 10 amostras por localização).

[00538] Uma amostra do solo pós-colheita de cada regime de fertilizante (excluindo o tratamento de 100% e 100% + 11,34 kg (25 lbs) ( [no bloco de 100%] para todos os regimes de fertilizante a 0-30,48 cm (0-12”) e 30,48-60,96 cm (12-24”). (5 regimes de fertilizante x 2 profundidades = 10 amostras por localização).

[00539] Avaliações: A população de plantas inicial foi avaliada em UTC de aproximadamente 50% e a população de plantas final foi avaliada antes da colheita. A avaliação incluiu (1) potencialmente temperatura (sonda de temperatura); (2) vigor (escala de 1-10 com 10 = excelente) em V4 e V8-V10; (3) altura da planta em V8-V10 e V14; (4) rendimento (alqueires/acre) ajustado para percentagem de umidade-padrão; (5) peso de teste; (6) percentagem de umidade do grão; (7) testes de nitrato do caule na camada preta (420 parcelas x 7 localizações); (8) colonização com 1 planta por parcela em bolsa zip lock a 0% e 100% de fertilizante em V4- V6 (1 planta x 14 tratamentos x 6 réplicas x 2 regimes de fertilizante = 168 plantas); (9) transcriptômica com 1 planta por parcela em bolsa zip lock a 0% e 100% de fertilizante em V4-V6 (1 planta x 14 tratamentos x 6 réplicas x 2 regimes de fertilizante = 168 plantas); (10) Determinação do índice de vegetação por diferença normalizada (NDVI) ou borda vermelha da diferença normalizada (NDRE) usando um instrumento Greenseeker em dois pontos do tempo (V4-V6 e VT) para avaliar cada parcela em todas as 7 localizações (420 parcelas x 2 pontos do tempo x 7 localizações = 5.880 pontos de dados); (11) características do caule medidas em todas as 7 localizações entre R2 e R5 por registro do diâmetro do caule de 10 plantas/parcela na altura de 15,24 cm (6”), registro do comprimento do primeiro internódio acima da marca de 15,24 cm (6”), 10 plantas monitoradas (5 plantas consecutivas do centro de duas fileiras de internas) (420 parcelas x 10 plantas x 7 localizações = 29.400 pontos de dados).

[00540] Esquema de monitoramento: Os profissionais visitaram todos os experimentos em estágio V3-V4 para avaliar a resposta no início da estação aos tratamentos e durante estágio de crescimento reprodutivo para monitorar a maturidade. Um colaborador local visitou o experimento de pesquisa continuamente.

[00541] Informação climática: Dados climáticos que vão do plantio à colheita foram coletados e consistiram em temperaturas diárias mínimas e máximas, temperatura do solo na semeadura, chuvas diárias mais irrigação (se aplicável), e eventos climáticos incomuns como, por exemplo, vento, chuva, frio e calor excessivos.

[00542] Relatório dos dados: Incluindo os dados indicados acima, os pontos de dados gerados nos experimentos de campo, incluindo texturas do solo; espaçamento das fileiras; tamanhos de parcelas; irrigação; lavoura; cultivo prévios; taxa de semeadura; população de plantas; entradas de fertilizantes sazonais, incluindo fonte, taxa, momento e colocação; dimensões da área de colheita, método de colheita, por exemplo, manual ou por máquina e ferramentas de medição usadas (escalas, monitor de rendimento etc.).

[00543] Resultados: Resultados selecionados do experimento de campo mencionado anteriormente estão relatados na FIG. 16 e na FIG. 17.

[00544] Na FIG. 16, pode ser observado que um micróbio remodelado da revelação (ou seja, 6-403) resultou em um rendimento maior do que a cepa do tipo selvagem (WT) e um rendimento maior do que o controle não tratado (UTC). O tratamento “-11,34 kg(-25 lbs) de N” utiliza 11,34 kg(25 lbs) menos N por acre do que práticas agrícolas-padrão da região. O tratamento UTC “100% de N” visa retratar práticas agrícolas-padrão da região, nas quais 100% da utilização- padrão de N são distribuídos pelo fazendeiro. O micróbio “6- 403” foi depositado como NCMA 201708004 e pode ser encontrado na Tabela 1. Este é uma mutante Kosakonia sacchari (também denominada CM037) e é uma cepa mutante da prole de CI006 WT.

[00545] Na FIG. 17, os resultados do rendimento obtidos demonstram que os micróbios remodelados da revelação têm desempenho consistente através de localizações. Além disso, os resultados do rendimento demonstram que os micróbios da revelação têm bom desempenho tanto em um ambiente com estresse de nitrogênio (ou seja, um ambiente com limitação de nitrogênio), quanto em um ambiente que possui fornecimentos suficientes de nitrogênio (ou seja, a condição sem limitação de nitrogênio). O micróbio “6-881” (também conhecido como CM094, PBC6.94), e que é uma cepa mutante da prole de Kosakonia sacchari de CI006 WT, foi depositado como NCMA 201708002 e pode ser encontrado na Tabela 1. O micróbio “137-1034”, que é uma cepa mutante da prole de Klebsiella variicola de CI137 WT, foi depositado como NCMA 201712001 e pode ser encontrado na Tabela 1. O micróbio “137-1036”, que é uma cepa mutante da prole de Klebsiella variicola de CI137 WT, foi depositado como NCMA 201712002 e pode ser encontrado na Tabela 1. O micróbio “6- 404” (também conhecido como CM38, PBC6.38), e que é uma prole mutante Kosakonia sacchari cepa de CI006 WT, foi depositado como NCMA 201708003 e pode ser encontrado na Tabela 1. Exemplo 5: Gênero de Micróbios Não-Remodelados Benéficos para Sistemas Agrícolas

[00546] Os micróbios remodelados da presente revelação foram avaliados e comparados uns com os outros para a produção de nitrogênio produzido em um acre através de uma estação. Veja a FIG. 8, a FIG. 24 e a FIG. 25.

[00547] Foi formulada pelos inventores a hipótese de que, para que uma população de micróbios não intergenéricos modificados geneticamente seja benéfica em um sistema agrícola moderno de cultura em fileiras, então a população de micróbios precisa produzir pelo menos 454 g (uma libra) ou mais de nitrogênio por acre por estação.

[00548] Para aquela finalidade, os inventores descobriram surpreendentemente um gênero funcional de micróbios que são capazes de contribuir, inter alia, para: rendimentos crescentes em plantios de não leguminosas; e/ou reduzir a dependência de um fazendeiro da aplicação de nitrogênio exógeno; e/ou a habilidade para produzir pelo menos 454 g (uma libra) de nitrogênio por acre por estação, até mesmo em ambientes sem limitação de nitrogênio, o referido gênero sendo definido pelo produto de habilidade de colonização x mmol de N produzido por micróbio por hora (ou seja, a linha que divide as FIGS. 8, 24 e 25).

[00549] Com relação às FIGS. 8, 24 e 25, certos dados que utilizam micróbios da revelação foram agregados, a fim de retratar um mapa de calor dos quilogramas de nitrogênio liberados por acre-estação por micróbios da revelação, que são registrados em função de micróbios por g-peso fresco por mmol de nitrogênio / micróbio-hora. Abaixo da linha fina que corta as imagens maiores estão os micróbios que liberam menos do que 454 g (uma libra) de nitrogênio por acre-estação, e acima da linha estão os micróbios que liberam mais do que 454 g (uma libra) de nitrogênio por acre-estação.

[00550] Dados de campo e mapa de calor de colonização do tipo selvagem: Os micróbios utilizados no mapa de calor da FIG. 8 foram testados para produção de N no milho. Para as cepas WT CI006 e CI019, os dados de colonização da raiz de milho foram retirados de um único local de campo. Para as cepas restantes, a colonização foi pressuposta como sendo a mesma que o nível de campo WT. A atividade de fixação de N foi determinada usando um ensaio de ARA in vitro a 5 mM de glutamina. A tabela abaixo do mapa de calor na FIG. 8 dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio hora), juntamente com a CFU precisa por grama de peso fresco (CFU/g fw) para cada micróbio mostrado no mapa de calor.

[00551] Mapa de calor dos dados de campo: Os dados utilizados no mapa de calor da FIG. 24 são derivados de cepas microbianas testadas para produção de N no milho em condições de campo. Cada ponto representa kg de N/acre produzido por um micróbio usando dados de colonização da raiz de milho de um único local de campo. A atividade de fixação de N foi determinada usando ensaio de ARA in vitro a 5 mM N na forma de glutamina ou fosfato de amônio. A Tabela 28 abaixo dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio hora) juntamente com a CFU precisa por grama de peso fresco (CFU/g fw) para cada micróbio mostrado no mapa de calor da FIG. 24.

[00552] Mapa de calor de dados em estufa e em laboratório: Os dados utilizados no mapa de calor da FIG. 25 são derivados de cepas microbianas testadas para produção de N no milho em condições de laboratório e de estufa. Cada ponto representa kg de N/acre produzido por uma única cepa. Pontos brancos representam cepas nas quais dados de colonização da raiz de milho foram reunidos em condições de estufa. Pontos pretos representam cepas mutantes para as quais os níveis de colonização da raiz de milho são derivados de níveis médios de colonização no campo da raiz de milho da cepa parental do tipo selvagem. Pontos hachurados representam as cepas parentais do tipo selvagem em seus níveis médios de colonização no campo da raiz de milho. Em todos os casos, a atividade de fixação de N foi determinada por ensaio de ARA in vitro a 5 mM N na forma de glutamina ou fosfato de amônio.

A Tabela 29 abaixo dá o valor preciso de mmol de N produzido por micróbio por hora (mmol de N/Micróbio hora) juntamente com a CFU precisa por grama de peso fresco (CFU/g fw) para cada micróbio mostrado no mapa de calor da Fig. 25.

Tabela 28: FIG. 24 – Mapa de calor dos dados de campo.

Atividade Colonização de Nome da (mmol de N / Pico N produzido / Cepa Micróbio hora) (CFU / g fw) acre estação Designação Taxonômica CI006 3,88E-16 1,50E+07 0,24 Kosakonia sacchari 6-404 1,61E-13 3,50E+05 2,28 Kosakonia sacchari 6-848 1,80E-13 2,70E+05 1,97 Kosakonia sacchari 6-881 1,58E-13 5,00E+05 3,20 Kosakonia sacchari 6-412 4,80E-14 1,30E+06 2,53 Kosakonia sacchari 6-403 1,90E-13 1,30E+06 10,00 Kosakonia sacchari CI019 5,33E-17 2,40E+06 0,01 Rahnella aquatilis 19-806 6,65E-14 2,90E+06 7,80 Rahnella aquatilis 19-750 8,90E-14 2,60E+05 0,94 Rahnella aquatilis 19-804 1,72E-14 4,10E+05 0,29 Rahnella aquatilis CI137 3,24E-15 6,50E+06 0,85 Klebsiella variicola 137-1034 1,16E-14 6,30E+06 2,96 Klebsiella variicola 137-1036 3,47E-13 1,30E+07 182,56 Klebsiella variicola 137-1314 1,70E-13 1,99E+04 0,14 Klebsiella variicola

Atividade Colonização de Nome da (mmol de N / Pico N produzido / Cepa Micróbio hora) (CFU / g fw) acre estação Designação Taxonômica 137-1329 1,65E-13 7,25E+04 0,48 Klebsiella variicola 63 3,60E-17 3,11E+05 0,00 Rahnella aquatilis 63-1146 1,90E-14 5,10E+05 0,39 Rahnella aquatilis 1021 1,77E-14 2,69E+07 19,25 Kosakonia pseudosacchari 728 5,56E-14 1445240,09 3,25 Klebsiella variicola Tabela 29: FIG. 25 – Mapa de calor de dados em estufa e em laboratório.

Atividade Nome da (mmol de N / Colonização de N produzido / cepa Micróbio hora) Pico (CFU / g fw) acre estação Designação taxonômica CI006 3,88E-16 1,50E+07 0,24 Kosakonia sacchari 6-400 2,72E-13 1,79E+05 1,97 Kosakonia sacchari 6-397 1,14E-14 1,79E+05 0,08 Kosakonia sacchari CI137 3,24E-15 6,50E+06 0,85 Klebsiella variicola 137-1586 1,10E-13 1,82E+06 8,10 Klebsiella variicola 137-1382 4,81E-12 1,82E+06 354,60 Klebsiella variicola

Atividade Nome da (mmol de N / Colonização de N produzido / cepa Micróbio hora) Pico (CFU / g fw) acre estação Designação taxonômica 1021 1,77E-14 2,69E+07 19,25 Kosakonia pseudosacchari 1021-1615 1,20E-13 2,69E+07 130,75 Kosakonia pseudosacchari 1021-1619 3,93E-14 2,69E+07 42,86 Kosakonia pseudosacchari 1021-1612 1,20E-13 2,69E+07 130,75 Kosakonia pseudosacchari 1021-1623 4,73E-17 2,69E+07 0,05 Kosakonia pseudosacchari 1293 5,44E-17 8,70E+08 1,92 Azospirillum lipoferum 1116 1,05E-14 1,37E+07 5,79 Enterobacter sp. 1113 8,05E-15 4,13E+07 13,45 Enterobacter sp. 910 1,19E-13 1,34E+06 6,46 Kluyvera intermedia 910-1246 2,16E-13 1,34E+06 11,69 Kluyvera intermedia 850 7,2301E-16 1,17E+06 0,03 Acromobacter spiritinus 852 5,96E-16 1,07E+06 0,03 Acromobacter marplatensis 853 6,42E-16 2,55E+06 0,07 Microbacterium murale

[00553] Conclusões: Os dados nas FIGS. 8, 24, 25, e nas Tabelas 28 e 29, ilustram mais do que uma dúzia de membros representativos do gênero descrito (ou seja, micróbios à direita da linha nas figuras). Além disso, esse vários membros representativos vêm de um arranjo diverso de gêneros taxonômicos, que podem ser encontrados nas Tabelas 28 e 29 acima. Além disso, os inventores descobriram numerosos atributos genéticos que retratam um relacionamento estrutura/função que é encontrado em muitos dos micróbios. Esses relacionamentos genéticos podem ser encontrados nas numeras tabelas da revelação que apresentam as modificações genéticas introduzidas pelos inventores, que incluem a introdução de pelo menos uma variação genética em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não codificador, da rede regulatória genética de fixação ou assimilação de nitrogênio.

[00554] Consequentemente, o gênero recém descoberto é suportado por: (1) um conjunto de dados robusto, (2) mais de uma dúzia de membros representativos, (3) membros de gêneros taxonômicos diversos, e (4) classes de modificações genéticas que definem um relacionamento estrutura/função, na arquitetura genética subjacente dos membros do gênero. Exemplo 6: Ensaios em Câmara de Crescimento para Clotianidina e Micróbios Não-Intergênicos Remodelados Combinados no Milho

[00555] Será realizado um experimento que utiliza um ou mais dos nove micróbios depositados descritos na Tabela 1 (6 micróbios não-intergênicos remodelados e 3 micróbios WT), em combinação com um inseticida, clotianidina. A combinação de micróbios e clotianidina é usada para tratar a semente de milho em experimentos em câmara de crescimento.

[00556] São realizados experimentos em câmara de crescimento, nos quais é permitido que as sementes de milho germinem sob condições de crescimento controladas padronizadas. O experimento inclui: (a) semente de milho não tratada, (b) semente de milho tratada com clotianidina, (c) semente de milho tratada com um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1, e (d) semente de milho tratada com uma combinação de clotianidina e um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1. Haverá aproximadamente 100 sementes por tratamento.

[00557] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e clotianidina exiba: (1) números maiores de sementes que germinam, (2) tempos de germinação mais rápidos, e (3) chegada ao estágio vegetativo de terceiro colar da folha mais rápido; comparada com todos os outros grupos de tratamento.

[00558] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e clotianidina revele um efeito sinérgico, comparada com os outros grupos de tratamento. Exemplo 7: Ensaios em Câmara de Crescimento para Tiametoxam e Micróbios Não-Intergênicos Remodelados Combinados no Milho

[00559] Será realizado um experimento que utiliza um ou mais dos nove micróbios depositados descritos na Tabela 1 (6 micróbios não-intergênicos remodelados e 3 micróbios WT), em combinação com um inseticida, tiametoxam. A combinação de micróbio e tiametoxam é usada para tratar a semente de milho em experimentos em câmara de crescimento.

[00560] São realizados experimentos em câmara de crescimento, nos quais é permitido que as sementes de milho germinem sob condições de crescimento controladas padronizadas. O experimento inclui: (a) semente de milho não tratada, (b) semente de milho tratada com tiametoxam, (c) semente de milho tratada com um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1, e (d) semente de milho tratada com uma combinação de tiametoxam e um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1. Haverá aproximadamente 100 sementes por tratamento.

[00561] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e tiametoxam exiba: (1) números maiores de sementes que germinam, (2) tempos de germinação mais rápidos, e (3) chegada ao estágio vegetativo de terceiro colar da folha mais rápido; comparada com todos os outros grupos de tratamento.

[00562] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e tiametoxam revele um efeito sinérgico, comparada com os outros grupos de tratamento. Exemplo 8: Ensaios em Câmara de Crescimento para Clorantraniliprol e Micróbios Não-Intergênicos Remodelados Combinados no Milho

[00563] Será realizado um experimento que utiliza um ou mais dos nove micróbios depositados descritos na Tabela 1 (6 micróbios não-intergênicos remodelados e 3 micróbios WT), em combinação com um inseticida, clorantraniliprol. A combinação de micróbio e clorantraniliprol é usada para tratar a semente de milho em experimentos em câmara de crescimento.

[00564] São realizados experimentos em câmara de crescimento, nos quais é permitido que as sementes de milho germinem sob condições de crescimento controladas padronizadas. O experimento inclui: (a) semente de milho não tratada, (b) semente de milho tratada com clorantraniliprol, (c) semente de milho tratada com um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1, e (d) semente de milho tratada com uma combinação de clorantraniliprol e um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1. Haverá aproximadamente 100 sementes por tratamento.

[00565] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e clorantraniliprol exiba: (1) números maiores de sementes que germinam, (2) tempos de germinação mais rápidos, e (3) chegada ao estágio vegetativo de terceiro colar da folha mais rápido; comparada com todos os outros grupos de tratamento.

[00566] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e clorantraniliprol revele um efeito sinérgico, comparada com os outros grupos de tratamento. Exemplo 9: Ensaios em Câmara de Crescimento para Imidacloprida e Micróbios Não-Intergênicos Remodelados Combinados no Milho

[00567] Será realizado um experimento que utiliza um ou mais dos nove micróbios depositados descritos na Tabela 1 (6 micróbios não-intergênicos remodelados e 3 micróbios WT), em combinação com um inseticida, imidacloprida. A combinação de micróbio e imidacloprida é usada para tratar a semente de milho em experimentos em câmara de crescimento.

[00568] São realizados experimentos em câmara de crescimento, nos quais é permitido que as sementes de milho germinem sob condições de crescimento controladas padronizadas. O experimento inclui: (a) semente de milho não tratada, (b) semente de milho tratada com imidacloprida, (c) semente de milho tratada com um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1, e (d) semente de milho tratada com uma combinação de imidacloprida e um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1. Haverá aproximadamente 100 sementes por tratamento.

[00569] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e imidacloprida exiba: (1) números maiores de sementes que germinam, (2) tempos de germinação mais rápidos, e (3) chegada ao estágio vegetativo de terceiro colar da folha mais rápido; comparada com todos os outros grupos de tratamento.

[00570] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e imidacloprida revele um efeito sinérgico, comparada com os outros grupos de tratamento. Exemplo 10: Ensaios em Câmara de Crescimento para MAXIM QUATTRO e Micróbios Não-Intergênicos Remodelados Combinados no Milho

[00571] Será realizado um experimento que utiliza um ou mais dos nove micróbios depositados descritos na Tabela 1 (6 micróbios não-intergênicos remodelados e 3 micróbios WT), em combinação com um fungicida, MAXIM QUATTRO (4 ativos

– fludioxonil + mefenoxam (também denominado metalaxil) + azoxistrobina + tiabendazol). A combinação de micróbio e MAXIM QUATTRO é usada para tratar a semente de milho em experimentos em câmara de crescimento.

[00572] São realizados experimentos em câmara de crescimento, nos quais é permitido que as sementes de milho germinem sob condições de crescimento controladas padronizadas. O experimento inclui: (a) semente de milho não tratada, (b) semente de milho tratada com MAXIM QUATTRO, (c) semente de milho tratada com um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1, e (d) semente de milho tratada com uma combinação de MAXIM QUATTRO e um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1. Haverá aproximadamente 100 sementes por tratamento.

[00573] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e MAXIM QUATTRO exiba: (1) números maiores de sementes que germinam, (2) tempos de germinação mais rápidos, e (3) chegada ao estágio vegetativo de terceiro colar da folha mais rápido; comparada com todos os outros grupos de tratamento.

[00574] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e MAXIM QUATTRO revele um efeito sinérgico, comparada com os outros grupos de tratamento. Exemplo 11: Ensaios em Câmara de Crescimento para Metalaxil e Micróbios Não-Intergênicos Remodelados Combinados no Milho

[00575] Será realizado um experimento que utiliza um ou mais dos nove micróbios depositados descritos na Tabela

1 (6 micróbios não-intergênicos remodelados e 3 micróbios WT), em combinação com um fungicida, metalaxil. A combinação de micróbio e metalaxil é usada para tratar a semente de milho em experimentos em câmara de crescimento.

[00576] São realizados experimentos em câmara de crescimento, nos quais é permitido que as sementes de milho germinem sob condições de crescimento controladas padronizadas. O experimento inclui: (a) semente de milho não tratada, (b) semente de milho tratada com metalaxil, (c) semente de milho tratada com um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1, e (d) semente de milho tratada com uma combinação de metalaxil e um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1. Haverá aproximadamente 100 sementes por tratamento.

[00577] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e metalaxil exiba: (1) números maiores de sementes que germinam, (2) tempos de germinação mais rápidos, e (3) chegada ao estágio vegetativo de terceiro colar da folha mais rápido; comparada com todos os outros grupos de tratamento.

[00578] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e metalaxil revele um efeito sinérgico, comparada com os outros grupos de tratamento. Exemplo 12: Ensaios em Câmara de Crescimento para Ipconazol e Micróbios Não-Intergênicos Remodelados Combinados no Milho

[00579] Será realizado um experimento que utiliza um ou mais dos nove micróbios depositados descritos na Tabela

1 (6 micróbios não-intergênicos remodelados e 3 micróbios WT), em combinação com um fungicida, ipconazol. A combinação de micróbio e ipconazol é usada para tratar a semente de milho em experimentos em câmara de crescimento.

[00580] São realizados experimentos em câmara de crescimento, nos quais é permitido que as sementes de milho germinem sob condições de crescimento controladas padronizadas. O experimento inclui: (a) semente de milho não tratada, (b) semente de milho tratada com ipconazol, (c) semente de milho tratada com um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1, e (d) semente de milho tratada com uma combinação de ipconazol e um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1. Haverá aproximadamente 100 sementes por tratamento.

[00581] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e ipconazol exiba: (1) números maiores de sementes que germinam, (2) tempos de germinação mais rápidos, e (3) chegada ao estágio vegetativo de terceiro colar da folha mais rápido; comparada com todos os outros grupos de tratamento.

[00582] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e ipconazol revele um efeito sinérgico, comparada com os outros grupos de tratamento. Exemplo 13: Ensaios em Câmara de Crescimento para RAXIL PRO MD e Micróbios Não-Intergênicos Remodelados Combinados no Milho

[00583] Será realizado um experimento que utiliza um ou mais dos nove micróbios depositados descritos na Tabela

1 (6 micróbios não-intergênicos remodelados e 3 micróbios WT), em combinação com um fungicida, RAXIL PRO MD (3 ativos – tebuconazol + protioconazol + Metalaxil, e alquil aminas etoxiladas de sebo como tensoativo). A combinação de micróbio e RAXIL PRO MD é usada para tratar a semente de milho em experimentos em câmara de crescimento.

[00584] São realizados experimentos em câmara de crescimento, nos quais é permitido que as sementes de milho germinem sob condições de crescimento controladas padronizadas. O experimento inclui: (a) semente de milho não tratada, (b) semente de milho tratada com RAXIL PRO MD, (c) semente de milho tratada com um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1, e (d) semente de milho tratada com uma combinação de RAXIL PRO MD e um ou mais dos micróbios descritos na Tabela 1. Haverá aproximadamente 100 sementes por tratamento.

[00585] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e RAXIL PRO MD exiba: (1) números maiores de sementes que germinam, (2) tempos de germinação mais rápidos, e (3) chegada ao estágio vegetativo de terceiro colar da folha mais rápido; comparada com todos os outros grupos de tratamento.

[00586] Espera-se que a semente de milho tratada com a combinação de um ou mais dos 6 micróbios não-intergênicos remodelados da Tabela 1 e RAXIL PRO MD revele um efeito sinérgico, comparada com os outros grupos de tratamento. Exemplo 14: Métodos e Ensaios para a Detecção de Micróbios Não-Intergênicos Remodelados

[00587] A presente revelação ensina iniciadores,

sondas e ensaios que são úteis para detecção dos micróbios utilizados nos vários Exemplos mencionados anteriormente. Os ensaios são capazes de detectar as sequências da “junção” de nucleotídeos não-natural nos micróbios não intergenéricos remodelados derivados/mutantes. Essas junções de nucleotídeos de ocorrência não natural podem ser usadas como um tipo de diagnóstico que é indicativo da presença de uma alteração genética particular em um micróbio.

[00588] As presentes técnicas são capazes de detectar essas junções de nucleotídeos de ocorrência não natural por meio da utilização de métodos especializados de PCR quantitativa, incluindo iniciadores e sondas especificamente desenhados. As sondas podem se ligar às sequências da junção de nucleotídeos de ocorrência não natural. Ou seja, podem ser usadas sondas de DNA sequência-específicas que consistem em oligonucleotídeos que são marcados com um repórter fluorescente, o que permite a detecção somente após hibridização da soda com sua sequência complementar. Os métodos quantitativos podem assegurar que apenas a junção de nucleotídeos de ocorrência não natural será amplificada por meio dos iniciadores ensinados e, consequentemente, pode ser detectada por meio de um corante não-específico, ou por meio da utilização de uma sonda de hibridização específica. Outro aspecto do método é a escolha de iniciadores de tal modo que os iniciadores flanqueiem um dos lados de uma sequência de junção, de tal forma que, caso ocorra uma reação de amplificação, então a referida sequência da junção está presente.

[00589] Consequentemente, DNA genômico pode ser extraído de amostras e usado para quantificar a presença de micróbios da revelação por utilização de qPCR. Os iniciadores utilizados na reação de qPCR podem ser iniciadores desenhados por Primer Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) para amplificar regiões únicas do genoma do tipo selvagem ou regiões únicas das cepas modificadas geneticamente não intergenéricas mutantes. A reação de qPCR pode ser realizada usando o kit “SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal” (Thermo Fisher P/N 11762100), usando somente iniciadores de amplificação diretos e reversos; alternativamente, o kit “Kapa Probe Force” (Kapa Biosystems P/N KK4301) pode ser usado com iniciadores de amplificação e uma sonda TaqMan contendo um marcador de corante FAM na extremidade-5’, um extintor ZEN interno, e um aglutinante do sulco menor e extintor fluorescente na extremidade-3’ (Integrated DNA Technologies).

[00590] Certas sequências de iniciadores, sondas e de junção não-nativa – que podem ser usadas nos métodos de qPCR – estão listadas na Tabela 30 abaixo. Especificamente, as sequências de junção não-nativa podem ser encontradas nos IDS. DE SEQ. Nos: 372-405.

Tabela 30: Detecção microbiana. SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 1021 ds1131 a 304 TGGTGTCC 338 TTCTTGGT 372 5'- gene N/A N/A N/A montante GGGCGAAC TCTCTGGA TGGTGTCCG nifL / GTCGCCAG GCGCTTTA GGCGAACGT PinfC GTGGCACA TCGGCATC CGCCAGGTG rompido

AATTGTCA CTGACTGA GCACAAATT GAACTACG AGAATTTG GTCAGAACT ACACGACT CAGGCTTC ACGACACGA AACCGACC TTCCCAAC CTAACCGAC GCAGGAGT CTGGCTTG CGCAGGAGT GTGCGATG CACCCGTG GTGCGATGA ACCCTGAA CAGGTAGT CCCTGAATA TATGATGA TGTGATGA TGATGATGG

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a TGGA ACAT A /

TTCTTGGTT CTCTGGAGC GCTTTATCG GCATCCTGA CTGAAGAAT TTGCAGGCT TCTTCCCAA CCTGGCTTG CACCCGTGC AGGTAGTTG

TGATGAACA T-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 1021 ds1131 a 305 CGGAAAAC 339 GCGATAGA 373 5'- gene N/A N/A N/A jusante GAGTTCAA ACTCACTT CGGAAAACG PinfC / ACGGCGCG CACGCCCC AGTTCAAAC nifL TCCCAATC GAAGGGGG GGCGCGTCC rompido

GTATTAAT AAGCTGCC CAATCGTAT GGCGAGAT TGACCCTA TAATGGCGA TCGCGCCA CGATTCCC GATTCGCGC CGGAAGTT GCTATTTC CACGGAAGT CGCTTAAC ATTCACTG TCGCTTAAC AGGTCTGG ACCGGAGG AGGTCTGGA AAGGCGAG TTCAAAAT AGGCGAGCA CAGCTTGG GACCCAGC GCTTGGTAT TATT GAAC T /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

GCGATAGAA CTCACTTCA CGCCCCGAA GGGGGAAGC TGCCTGACC CTACGATTC CCGCTATTT CATTCACTG ACCGGAGGT TCAAAATGA

CCCAGCGAA C-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 1021 ds1133 N/A 306 CGCCAGAG 340 TCCCTGTG 374 5'- 5' UTR e N/A N/A N/A AGTTGAAA CGCCGCGT CGCCAGAGA ATG / TCGAACAT CGCCGATG GTTGAAATC gene TTCCGTAA GTGGCCAG GAACATTTC glnE TACCGCCA CCAACTGG CGTAATACC truncado

TTACCCAG CGCGCTAC GCCATTACC GAGCCGTT CCGATCCT CAGGAGCCG CTGGTTGC GCTCGATG TTCTGGTTG ACAGCGGA AACTGCTC CACAGCGGA AAACGTTA GACCCGAA AAACGTTAA ACGAAAGG CACGCTCT CGAAAGGAT ATATTTCG ATCAACCG ATTTCGCAT CATG ACGG G /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

TCCCTGTGC GCCGCGTCG CCGATGGTG GCCAGCCAA CTGGCGCGC TACCCGATC CTGCTCGAT GAACTGCTC GACCCGAAC ACGCTCTAT

CAACCGACG G-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 1021 ds1145 a 307 CGGGCGAA 341 CGTTCTGT 375 5'- gene N/A N/A N/A montante CGTCGCCA AATAATAA CGGGCGAAC nifL / GGTGGCAC CCGGACAA GTCGCCAGG Prm1 AAATTGTC TTCGGACT TGGCACAAA rompido

AGAACTAC GATTAAAA TTGTCAGAA GACACGAC AAGCGCCC CTACGACAC TAACCGAC TCGCGGCG GACTAACCG CGCAGGAG CTTTTTTT ACCGCAGGA TGTGCGAT ATATTCTC GTGTGCGAT GACCCTGA GACTCCAT GACCCTGAA ATATGATG TTAAAATA TATGATGAT ATGGATGC AAAAATCC GGATGCCAG CAGC AATC C /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

CGTTCTGTA ATAATAACC GGACAATTC GGACTGATT AAAAAAGCG CCCTCGCGG CGCTTTTTT TATATTCTC GACTCCATT TAAAATAAA

AAATCCAAT C-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 1021 ds1145 a 308 TCAACCTA 342 AACTCACT 376 5'- gene N/A N/A N/A jusante AAAAAGTT TCACGCCC TCAACCTAA Prm1 / TGTGTAAT CGAAGGGG AAAAGTTTG nifL ACTTGTAA GAAGCTGC TGTAATACT rompido

CGCTACAT CTGACCCT TGTAACGCT GGAGATTA ACGATTCC ACATGGAGA ACTCAATC CGCTATTT TTAACTCAA TAGAGGGT CATTCACT TCTAGAGGG ATTAATAA GACCGGAG TATTAATAA TGAATCGT GTTCAAAA TGAATCGTA ACTAAACT TGACCCAG CTAAACTGG GGTACTGG CGAACCGA TACTGGGCG GCGC GTCG C /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

AACTCACTT CACGCCCCG AAGGGGGAA GCTGCCTGA CCCTACGAT TCCCGCTAT TTCATTCAC TGACCGGAG GTTCAAAAT GACCCAGCG

AACCGAGTC G-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 1021 ds1148 a 309 CGGGCGAA 343 CGCGTCAG 377 5'- gene N/A N/A N/A montante CGTCGCCA GTTGAACG CGGGCGAAC nifL / GGTGGCAC TAAAAAAG GTCGCCAGG Prm7 AAATTGTC TCGGTCTG TGGCACAAA rompido

AGAACTAC CGCAAAGC TTGTCAGAA GACACGAC ACGTCGTC CTACGACAC TAACCGAC GTCCGCAG GACTAACCG CGCAGGAG TTCTCCAA ACCGCAGGA TGTGCGAT ACGTTAAT GTGTGCGAT GACCCTGA TGGTTTCT GACCCTGAA ATATGATG GCTTCGGC TATGATGAT ATGGATGC AGAACGAT GGATGCCAG CAGC TGGC C /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

CGCGTCAGG TTGAACGTA AAAAAGTCG GTCTGCGCA AAGCACGTC GTCGTCCGC AGTTCTCCA AACGTTAAT TGGTTTCTG CTTCGGCAG

AACGATTGG C-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 1021 ds1148 a 310 AATTTTCT 344 AACTCACT 378 5'- gene N/A N/A N/A jusante GCCCAAAT TCACGCCC AATTTTCTG Prm4 / GGCTGGGA CGAAGGGG CCCAAATGG nifL TTGTTCAT GAAGCTGC CTGGGATTG rompido

TTTTTGTT CTGACCCT TTCATTTTT TGCCTTAC ACGATTCC TGTTTGCCT AACGAGAG CGCTATTT TACAACGAG TGACAGTA CATTCACT AGTGACAGT CGCGCGGG GACCGGAG ACGCGCGGG TAGTTAAC GTTCAAAA TAGTTAACT TCAACATC TGACCCAG CAACATCTG TGACCGGT CGAACCGA ACCGGTCGA CGAT GTCG T /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

AACTCACTT CACGCCCCG AAGGGGGAA GCTGCCTGA CCCTACGAT TCCCGCTAT TTCATTCAC TGACCGGAG GTTCAAAAT GACCCAGCG

AACCGAGTC G-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a CI00 ds126 N/A 311 GTAACCAA 345 CCGATCCC 379 5'- 5' UTR N/A N/A N/A 6 TAAAGGCC CATCACTG GTAACCAAT até ATG- ACCACGCC TGTGTCTT AAAGGCCAC 4 bp do AGACCACA GTATTACA CACGCCAGA gene CGATAGTG GTGCCGCT CCACACGAT amtB / ATGGCAAC TCGTCGGC AGTGATGGC gene ACTTTCCA TTCGCCGG AACACTTTC amtB GCTGCACC TACGAATA CAGCTGCAC rompido

AGCACCTG CGAATGAC CAGCACCTG ATGGCCCA GCGTTGCA ATGGCCCAT TGGTCACA GCTCAGCA GGTCACACC CCTTCAGC ACGAAAAT TTCAGCGAA GAAA TTTG A /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

CCGATCCCC ATCACTGTG TGTCTTGTA TTACAGTGC CGCTTCGTC GGCTTCGCC GGTACGAAT ACGAATGAC GCGTTGCAG CTCAGCAAC

GAAAATTTT G-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a CI01 ds172 a 312 TGGTATTG 346 CCGTCTCT 380 5'- gene ID. ID. N/A 9 jusante TCAGTCTG GAAGCTCT TGGTATTGT Prm1.2 / DE DE AATGAAGC CGGTGAAC CAGTCTGAA nifL SEQ. SEQ.

TCTTGAAA ATTGTTGC TGAAGCTCT rompido Nº: Nº: AAGCTGAG GAGGCAGG TGAAAAAGC 406 407

GAAGCGGG ATGCGAGC TGAGGAAGC CAAGA TGCCT CGTCGATT TGGTTGTG GGGCGTCGA AGTTC CGCAA TAGTAGAA TTTTGACA TTTAGTAGA GCCTC CAATG ATCAGTCC TTACCGAT AATCAGTCC ACAGG TTCAC GAATGCCG AATGTGCC GAATGCCGA AGCCGCCA GCGTGAAC GCCGCCAGT GTTTGTCG GGGTGCGT TTGTCGAAT AATC TATG C /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

CCGTCTCTG AAGCTCTCG GTGAACATT GTTGCGAGG CAGGATGCG AGCTGGTTG TGTTTTGAC ATTACCGAT AATGTGCCG CGTGAACGG

GTGCGTTAT G-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a CI01 ds172 a 313 ACCGATCC 347 TGAACATC 381 5'- gene N/A N/A N/A 9 montante GCAGGCGC ACTGATGC ACCGATCCG nifL / GCATTTGT ACAAGCTA CAGGCGCGC Prm1.2 TATGCCAA CCTATGTC ATTTGTTAT rompido

TCCGGCAT GAAGAATT GCCAATCCG TCTGCCGC AACTAAAA GCATTCTGC CAGACGGG AACTGCAA CGCCAGACG TTTTGCAC GATGCAGG GGTTTTGCA TTGAGACA CATTCGCG CTTGAGACA CTTTTGGG TTAAAGCC CTTTTGGGC CGAGAACC GACTTGAG GAGAACCAC ACCGTCTG AAATGAGA CGTCTGCTG CTGG AGAT G /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

TGAACATCA CTGATGCAC AAGCTACCT ATGTCGAAG AATTAACTA AAAAACTGC AAGATGCAG GCATTCGCG TTAAAGCCG ACTTGAGAA

ATGAGAAGA T-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a CI01 ds175 a 314 CGGGAACC 348 CCGTCTCT 382 5'- gene ID. ID. ID.

9 jusante GGTGTTAT GAAGCTCT CGGGAACCG Prm3.1 / DE DE DE AATGCCGC CGGTGAAC GTGTTATAA nifL SEQ. SEQ. SEQ.

GCCCTCAT ATTGTTGC TGCCGCGCC rompido Nº: Nº: Nº: ATTGTGGG GAGGCAGG CTCATATTG 408 409 410 GATTTCTT ATGCGAGC TGGGGATTT CGCCC GGCAT /56- AATGACCT TGGTTGTG CTTAATGAC TCATA AACGC FAM/

ATCCTGGG TTTTGACA CTATCCTGG TTGTG ACCCG TA TCCTAAAG TTACCGAT GTCCTAAAG GGGAT TTCA ACC TTGTAGTT AATGTGCC TTGTAGTTG CGT GACATTAG GCGTGAAC ACATTAGCG C/ZE CGGAGCAC GGGTGCGT GAGCACTAA N/T TAAC TATG C / CTG

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

CCGTCTCTG AAG AAGCTCTCG CTC

GTGAACATT TCG GTTGCGAGG GT/3 CAGGATGCG IABk AGCTGGTTG FQ/

TGTTTTGAC ATTACCGAT AATGTGCCG CGTGAACGG

GTGCGTTAT G-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a CI01 ds175 a 315 ACCGATCC 349 TACAGTAG 383 5'- gene N/A N/A N/A 9 montante GCAGGCGC CGCCTCTC ACCGATCCG nifL / GCATTTGT AAAAATAG CAGGCGCGC Prm3.1 TATGCCAA ATAAACGG ATTTGTTAT rompido

TCCGGCAT CTCATGTA GCCAATCCG TCTGCCGC CGTGGGCC GCATTCTGC CAGACGGG GTTTATTT CGCCAGACG TTTTGCAC TTTCTACC GGTTTTGCA TTGAGACA CATAATCG CTTGAGACA CTTTTGGG GGAACCGG CTTTTGGGC CGAGAACC TGTTATAA GAGAACCAC ACCGTCTG TGCCGCGC CGTCTGCTG CTGG CCTC G /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

TACAGTAGC GCCTCTCAA AAATAGATA AACGGCTCA TGTACGTGG GCCGTTTAT TTTTTCTAC CCATAATCG GGAACCGGT GTTATAATG

CCGCGCCCT C-3' CI00 ds20 a 316 TCAACCTA 350 AACTCACT 384 5'- gene ID. ID. ID.

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 6 jusante AAAAAGTT TCACACCC TCAACCTAA Prm1 / DE DE DE TGTGTAAT CGAAGGGG AAAAGTTTG nifL SEQ. SEQ. SEQ.

ACTTGTAA GAAGTTGC TGTAATACT rompido Nº: Nº: Nº: CGCTACAT CTGACCCT TGTAACGCT 411 412 413 GGAGATTA ACGATTCC ACATGGAGA TAAAC CAAAT /56- ACTCAATC CGCTATTT TTAACTCAA TGGTA CGAAG FAM/

TAGAGGGT CATTCACT TCTAGAGGG CTGGG CGCCA AAGT ATTAATAA GACCGGAG TATTAATAA CGCAA GACGG TGCC TGAATCGT GTTCAAAA TGAATCGTA CT TAT T/ZE ACTAAACT TGACCCAG CTAAACTGG N/GA GGTACTGG CGAACCGA TACTGGGCG CCCT GCGC GTCG C / ACGA AACTCACTT TTCC

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a CACACCCCG C/3I AAGGGGGAA ABkF GTTGCCTGA Q/

CCCTACGAT TCCCGCTAT TTCATTCAC TGACCGGAG GTTCAAAAT GACCCAGCG

AACCGAGTC G-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a CI00 ds20 a 317 GGGCGACA 351 CGTCCTGT 385 5'- gene N/A N/A N/A 6 montante AACGGCCT AATAATAA GGGCGACAA nifL / GGTGGCAC CCGGACAA ACGGCCTGG Prm1 AAATTGTC TTCGGACT TGGCACAAA rompido

AGAACTAC GATTAAAA TTGTCAGAA GACACGAC AAGCGCCC CTACGACAC TAACTGAC TTGTGGCG GACTAACTG CGCAGGAG CTTTTTTT ACCGCAGGA TGTGCGAT ATATTCCC GTGTGCGAT GACCCTGA GCCTCCAT GACCCTGAA ATATGATG TTAAAATA TATGATGAT ATGGATGC AAAAATCC GGATGCCGG CGGC AATC C /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

CGTCCTGTA ATAATAACC GGACAATTC GGACTGATT AAAAAAGCG CCCTTGTGG CGCTTTTTT TATATTCCC GCCTCCATT TAAAATAAA

AAATCCAAT C-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a CI00 ds24 a 318 GGGCGACA 352 GGACATCA 386 5'- gene ID. ID. ID.

6 montante AACGGCCT TCGCGACA GGGCGACAA nifL / DE DE DE GGTGGCAC AACAATAT ACGGCCTGG Prm5 SEQ. SEQ. SEQ.

AAATTGTC TAATACCG TGGCACAAA rompido Nº: Nº: Nº: AGAACTAC GCAACCAC TTGTCAGAA 414 415 416 GACACGAC ACCGGCAA CTACGACAC GGTGC GCGCA /56- TAACTGAC TTTACGAG GACTAACTG ACTCT GTCTC FAM/

CGCAGGAG ACTGCGCA ACCGCAGGA TTGCA GTAAA CA TGTGCGAT GGCATCCT GTGTGCGAT TGGTT TTGCC GGA GACCCTGA TTCTCCCG GACCCTGAA GTG ATATGATG TCAATTTC TATGATGAT T/ZE ATGGATGC TGTCAAAT GGATGCCGG N/G CGGC AAAG C / CGA

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

GGACATCAT TGA CGCGACAAA CCC

CAATATTAA TGA TACCGGCAA AT/3 CCACACCGG IABk

CAATTTACG FQ AGACTGCGC AGGCATCCT TTCTCCCGT CAATTTCTG

TCAAATAAA G-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a CI00 ds24 a 319 TAAGAATT 353 AACTCACT 387 5'- gene N/A N/A N/A 6 jusante ATCTGGAT TCACACCC TAAGAATTA Prm5 / GAATGTGC CGAAGGGG TCTGGATGA nifL CATTAAAT GAAGTTGC ATGTGCCAT rompido

GCGCAGCA CTGACCCT TAAATGCGC TAATGGTG ACGATTCC AGCATAATG CGTTGTGC CGCTATTT GTGCGTTGT GGGAAAAC CATTCACT GCGGGAAAA TGCTTTTT GACCGGAG CTGCTTTTT TTTGAAAG GTTCAAAA TTTGAAAGG GGTTGGTC TGACCCAG GTTGGTCAG AGTAGCGG CGAACCGA TAGCGGAAA AAAC GTCG C /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

AACTCACTT CACACCCCG AAGGGGGAA GTTGCCTGA CCCTACGAT TCCCGCTAT TTCATTCAC TGACCGGAG GTTCAAAAT GACCCAGCG

AACCGAGTC G-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a CI00 ds30 N/A 320 CGCCAGAG 354 TTTAACGA 388 5'- 5' UTR e N/A N/A N/A 6 AGTCGAAA TCTGATTG CGCCAGAGA ATG / TCGAACAT GCGATGAT GTCGAAATC gene TTCCGTAA GAAACGGA GAACATTTC glnE TACCGCGA TTCGCCGG CGTAATACC truncado

TTACCCAG AAGATGCG GCGATTACC GAGCCGTT CTTTCTGA CAGGAGCCG CTGGTTGC GAGCTGGC TTCTGGTTG ACAGCGGA GCGAATTG CACAGCGGA AAACGTTA TGGCAGGA AAACGTTAA ACGAAAGG TGCGTTGC CGAAAGGAT ATATTTCG AGGAGGAG ATTTCGCAT CATG GATT G /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

TTTAACGAT CTGATTGGC GATGATGAA ACGGATTCG CCGGAAGAT GCGCTTTCT GAGAGCTGG CGCGAATTG TGGCAGGAT GCGTTGCAG

GAGGAGGAT T-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a CI00 ds31 N/A 321 CGCCAGAG 355 GCACTGAA 389 5'- 5' UTR e N/A N/A N/A 6 AGTCGAAA ACACCTCA CGCCAGAGA ATG / TCGAACAT TTTCCCTG GTCGAAATC gene TTCCGTAA TGTGCCGC GAACATTTC glnE TACCGCGA GTCGCCGA CGTAATACC truncado

TTACCCAG TGGTTGCC GCGATTACC GAGCCGTT AGTCAGCT CAGGAGCCG CTGGTTGC GGCGCGCT TTCTGGTTG ACAGCGGA ACCCGATC CACAGCGGA AAACGTTA CTGCTTGA AAACGTTAA ACGAAAGG TGAATTGC CGAAAGGAT ATATTTCG TCGACCCG ATTTCGCAT CATG AATA G /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

GCACTGAAA CACCTCATT TCCCTGTGT GCCGCGTCG CCGATGGTT GCCAGTCAG CTGGCGCGC TACCCGATC CTGCTTGAT GAATTGCTC

GACCCGAAT A-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a CI01 ds34 N/A 322 GATGATGG 356 GCGCTCAA 390 5'- 5' UTR e N/A N/A N/A 9 ATGCTTTC ACAGTTAA GATGATGGA ATG / TGGTTAAA TCCGTCTG TGCTTTCTG gene CGGGCAAC TGTGCCGC GTTAAACGG glnE CTCGTTAA CTCGCCGA GCAACCTCG truncado

CTGACTGA TGGTCGCG TTAACTGAC CTAGCCTG ACACAACT TGACTAGCC GGCAAACT TGCACGTC TGGGCAAAC GCCCGGGC ATCCTTTA TGCCCGGGC TTTTTTTT TTGCTCGA TTTTTTTTG GCAAGGAA TGAACTGC CAAGGAATC TCTGATTT TCGACCCG TGATTTCAT CATG CGCA G /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

GCGCTCAAA CAGTTAATC CGTCTGTGT GCCGCCTCG CCGATGGTC GCGACACAA CTTGCACGT CATCCTTTA TTGCTCGAT GAACTGCTC

GACCCGCGC A-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a CI01 ds70 a 323 ACCGATCC 357 AGTCTGAA 391 5'- gene N/A N/A N/A 9 montante GCAGGCGC CTCATCCT ACCGATCCG nifL / GCATTTGT GCGGCAGT CAGGCGCGC Prm4 TATGCCAA CGGTGAGA ATTTGTTAT rompido

TCCGGCAT CGTATTTT GCCAATCCG TCTGCCGC TGACCAAA GCATTCTGC CAGACGGG GAGTGATC CGCCAGACG TTTTGCAC TACATCAC GGTTTTGCA TTGAGACA GGAATTTT CTTGAGACA CTTTTGGG GTGGTTGT CTTTTGGGC CGAGAACC TGCTGCTT GAGAACCAC ACCGTCTG AAAAGGGC CGTCTGCTG CTGG AAAT G /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

AGTCTGAAC TCATCCTGC GGCAGTCGG TGAGACGTA TTTTTGACC AAAGAGTGA TCTACATCA CGGAATTTT GTGGTTGTT GCTGCTTAA

AAGGGCAAA T-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a CI01 ds70 a 324 CATCGGAC 358 CCGTCTCT 392 5'- gene N/A N/A N/A 9 jusante ACCACCAG GAAGCTCT CATCGGACA Prm4 / CTTACAAA CGGTGAAC CCACCAGCT nifL TTGCCTGA ATTGTTGC TACAAATTG rompido

TTGCGGCC GAGGCAGG CCTGATTGC CCGATGGC ATGCGAGC GGCCCCGAT CGGTATCA TGGTTGTG GGCCGGTAT CTGACCGA TTTTGACA CACTGACCG CCATTTCG TTACCGAT ACCATTTCG TGCCTTAT AATGTGCC TGCCTTATG GTCATGCG GCGTGAAC TCATGCGAT ATGGGGGC GGGTGCGT GGGGGCTGG TGGG TATG G /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

CCGTCTCTG AAGCTCTCG GTGAACATT GTTGCGAGG CAGGATGCG AGCTGGTTG TGTTTTGAC ATTACCGAT AATGTGCCG CGTGAACGG

GTGCGTTAT G-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 137 ds799 a 325 TCTTCAAC 359 GCCATTGA 393 5'- gene ID. ID. ID.

jusante AACTGGAG GCTGGCTT TCTTCAACA PinfC / DE DE DE GAATAAGG CCCGACCG ACTGGAGGA nifL SEQ. SEQ. SEQ.

TATTAAAG CAGGGCGG ATAAGGTAT rompido Nº: Nº: Nº: GCGGAAAA CACCTGCC TAAAGGCGG 417 418 419 CGAGTTCA TGACCCTG AAAACGAGT CTCGG AGGGT /56- AACGGCAC CGTTTCCC TCAAACGGC CAGCA GTTAA FAM/

GTCCGAAT GCTGTTTA ACGTCCGAA TGGAC ACAGC AA CGTATCAA ACACCCTG TCGTATCAA GTAA GGGAA CGG TGGCGAGA ACCGGAGG TGGCGAGAT A CAC TTCGCGCC TGAAGCAT TCGCGCCCT G/ZE CTGGAAGT GATCCCTG GGAAGTTCG N/T TCGC AATC C / CCG

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

GCCATTGAG AAT CTGGCTTCC CGT

CGACCGCAG ATC GGCGGCACC AA/3 TGCCTGACC IABk CTGCGTTTC FQ/

CCGCTGTTT AACACCCTG ACCGGAGGT GAAGCATGA

TCCCTGAAT C-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 137 ds799 a 326 TCCGGGTT 360 AGCGTCAG 394 5'- gene N/A N/A N/A montante CGGCTTAC GTACCGGT TCCGGGTTC nifL / CCCGCCGC CATGATTC GGCTTACCC PinfC GTTTTGCG ACCGTGCG CGCCGCGTT rompido

CACGGTGT ATTCTCGG TTGCGCACG CGGACAAT TTCCCTGG GTGTCGGAC TTGTCATA AGCGCTTC AATTTGTCA ACTGCGAC ATTGGCAT TAACTGCGA ACAGGAGT CCTGACCG CACAGGAGT TTGCGATG AAGAGTTC TTGCGATGA ACCCTGAA GCTGGCTT CCCTGAATA TATGATGC CTTCCCAA TGATGCTCG TCGA CCTG A /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

AGCGTCAGG TACCGGTCA TGATTCACC GTGCGATTC TCGGTTCCC TGGAGCGCT TCATTGGCA TCCTGACCG AAGAGTTCG CTGGCTTCT

TCCCAACCT G-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 137 ds809 N/A 327 ATCGCAGC 361 GCGCTGAA 395 5'- 5' UTR e ID. ID. ID.

GTCTTTGA GCACCTGA ATCGCAGCG ATG / DE DE DE ATATTTCC TCACGCTC TCTTTGAAT gene SEQ. SEQ. SEQ.

GTCGCCAG TGCGCGGC ATTTCCGTC glnE Nº: Nº: Nº: GCGCTGGC GTCGCCGA GCCAGGCGC truncado 420 421 422 TGCCGAGC TGGTCGCC TGGCTGCCG GAGCC GCCGT /56- CGTTCTGG AGCCAGCT AGCCGTTCT GTTCT CGGCT FAM/

CTGCATAG GGCGCGCC GGCTGCATA GGCTG GATAG TTAT TGGAAAAC ACCCGCTG GTGGAAAAC CATAG AGG GGCG GATAATTT CTGCTGGA GATAATTTC C/ZE CAGGCCAG TGAGCTGC AGGCCAGGG N/TG GGAGCCCT TGGATCCC AGCCCTTAT AAGC TATG AACA G / ACCT

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

GCGCTGAAG GATC CACCTGATC A/3I ACGCTCTGC ABkF GCGGCGTCG Q/

CCGATGGTC GCCAGCCAG CTGGCGCGC CACCCGCTG CTGCTGGAT GAGCTGCTG

GATCCCAAC A-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 137 ds843 a 328 TCCGGGTT 362 GCCCGCTG 396 5'- gene N/A N/A N/A montante CGGCTTAC ACCGACCA TCCGGGTTC nifL / CCCGCCGC GAACTTCC GGCTTACCC Prm1.2 GTTTTGCG ACCTTGGA CGCCGCGTT rompido

CACGGTGT CTCGGCTA TTGCGCACG CGGACAAT TACCCTTG GTGTCGGAC TTGTCATA GCGTGACG AATTTGTCA ACTGCGAC GCGCGCGA TAACTGCGA ACAGGAGT TAACTGGG CACAGGAGT TTGCGATG ACTACATC TTGCGATGA ACCCTGAA CCCATTCC CCCTGAATA TATGATGC GGTGATCT TGATGCTCG TCGA TACC A /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

GCCCGCTGA CCGACCAGA ACTTCCACC TTGGACTCG GCTATACCC TTGGCGTGA CGGCGCGCG ATAACTGGG ACTACATCC CCATTCCGG

TGATCTTAC C-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 137 ds843 a 329 TCACTTTT 363 GCCATTGA 397 5'- gene N/A N/A N/A jusante TAGCAAAG GCTGGCTT TCACTTTTT Prm1.2 / TTGCACTG CCCGACCG AGCAAAGTT nifL GACAAAAG CAGGGCGG GCACTGGAC rompido

GTACCACA CACCTGCC AAAAGGTAC ATTGGTGT TGACCCTG CACAATTGG ACTGATAC CGTTTCCC TGTACTGAT TCGACACA GCTGTTTA ACTCGACAC GCATTAGT ACACCCTG AGCATTAGT GTCGATTT ACCGGAGG GTCGATTTT TTCATATA TGAAGCAT TCATATAAA AAGGTAAT GATCCCTG GGTAATTTT TTTG AATC G /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

GCCATTGAG CTGGCTTCC CGACCGCAG GGCGGCACC TGCCTGACC CTGCGTTTC CCGCTGTTT AACACCCTG ACCGGAGGT GAAGCATGA

TCCCTGAAT C-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 137 ds853 a 330 TCCGGGTT 364 GCTAAAGT 398 5'- gene N/A N/A N/A montante CGGCTTAC TCTCGGCT TCCGGGTTC nifL / CCCGCCGC AATCGCTG GGCTTACCC Prm6.2 GTTTTGCG ATAACATT CGCCGCGTT rompido

CACGGTGT TGACGCAA TTGCGCACG CGGACAAT TGCGCAAT GTGTCGGAC TTGTCATA AAAAGGGC AATTTGTCA ACTGCGAC ATCATTTG TAACTGCGA ACAGGAGT ATGCCCTT CACAGGAGT TTGCGATG TTTGCACG TTGCGATGA ACCCTGAA CTTTCATA CCCTGAATA TATGATGC CCAGAACC TGATGCTCG TCGA TGGC A /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

GCTAAAGTT CTCGGCTAA TCGCTGATA ACATTTGAC GCAATGCGC AATAAAAGG GCATCATTT GATGCCCTT TTTGCACGC TTTCATACC

AGAACCTGG C-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 137 ds853 a 331 GTTCTCCT 365 GCCATTGA 399 5'- Prm6.2 / N/A N/A N/A jusante TTGCAATA GCTGGCTT GTTCTCCTT gene GCAGGGAA CCCGACCG TGCAATAGC rompido GAGGCGCC CAGGGCGG AGGGAAGAG nifL

AGAACCGC CACCTGCC GCGCCAGAA CAGCGTTG TGACCCTG CCGCCAGCG AAGCAGTT CGTTTCCC TTGAAGCAG TGAACGCG GCTGTTTA TTTGAACGC TTCAGTGT ACACCCTG GTTCAGTGT ATAATCCG ACCGGAGG ATAATCCGA AAACTTAA TGAAGCAT AACTTAATT TTTCGGTT GATCCCTG TCGGTTTGG TGGA AATC A /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

GCCATTGAG CTGGCTTCC CGACCGCAG GGCGGCACC TGCCTGACC CTGCGTTTC CCGCTGTTT AACACCCTG ACCGGAGGT GAAGCATGA

TCCCTGAAT C-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 137 ds857 a 332 TCCGGGTT 366 CGCCGTCC 400 5'- gene N/A N/A N/A montante CGGCTTAC TCGCAGTA TCCGGGTTC nifL / CCCGCCGC CCATTGCA GGCTTACCC Prm8.2 GTTTTGCG ACCGACTT CGCCGCGTT rompido

CACGGTGT TACAGCAA TTGCGCACG CGGACAAT GAAGTGAT GTGTCGGAC TTGTCATA TCTGGCAC AATTTGTCA ACTGCGAC GCATGGAA TAACTGCGA ACAGGAGT CAAATTCT CACAGGAGT TTGCGATG TGCCAGTC TTGCGATGA ACCCTGAA GGGCTTTA CCCTGAATA TATGATGC TCCGATGA TGATGCTCG TCGA CGAA A /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

CGCCGTCCT CGCAGTACC ATTGCAACC GACTTTACA GCAAGAAGT GATTCTGGC ACGCATGGA ACAAATTCT TGCCAGTCG GGCTTTATC

CGATGACGA A-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 137 ds857 a 333 GATATGCC 367 GCCATTGA 401 5'- Prm8.2 / N/A N/A N/A jusante TGAAGTAT GCTGGCTT GATATGCCT gene TCAATTAC CCCGACCG GAAGTATTC rompido TTAGGCAT CAGGGCGG AATTACTTA nifL

TTACTTAA CACCTGCC GGCATTTAC CGCAGGCA TGACCCTG TTAACGCAG GGCAATTT CGTTTCCC GCAGGCAAT TGATGCTG GCTGTTTA TTTGATGCT CCTATGAA ACACCCTG GCCTATGAA GCGTTTGA ACCGGAGG GCGTTTGAT TTCTGTAC TGAAGCAT TCTGTACTT TTGAGCTT GATCCCTG GAGCTTGAT GATC AATC C /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

GCCATTGAG CTGGCTTCC CGACCGCAG GGCGGCACC TGCCTGACC CTGCGTTTC CCGCTGTTT AACACCCTG ACCGGAGGT GAAGCATGA

TCCCTGAAT C-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 63 ds908 a 334 TGGTATTG 368 TCTTTAGA 402 5'- gene ID. ID. N/A jusante TCAGTCTG TCTCTCGG TGGTATTGT PinfC / DE DE AATGAAGC TCCGCCCT CAGTCTGAA nifL SEQ. SEQ.

TCTTGAAA GATGGCGG TGAAGCTCT rompido Nº: Nº: AAGCTGAG CACCTTGC TGAAAAAGC 423 424

GAAGCGGG TGACGTTA TGAGGAAGC GGAAA GGGCG CGTCGATT CGCCTGCC GGGCGTCGA ACGAG GACCG TAGTAGAA GGTACAGC TTTAGTAGA TTCAA AGAGA ATCAGTCC AGGTTATC AATCAGTCC CCGGC TCTAA GAATGCCG ACCGGAGG GAATGCCGA AGCCGCCA CTTAAAAT GCCGCCAGT GTTTGTCG GACCCAGT TTGTCGAAT AATC TACC C /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

TCTTTAGAT CTCTCGGTC CGCCCTGAT GGCGGCACC TTGCTGACG TTACGCCTG CCGGTACAG CAGGTTATC ACCGGAGGC TTAAAATGA

CCCAGTTAC C-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 63 ds908 a 335 TGCAAATT 369 TGAATATC 403 5'- gene N/A N/A N/A montante GCACGGTT ACTGACTC TGCAAATTG nifL / ATTCCGGG ACAAGCTA CACGGTTAT PinfC TGAGTATA CCTATGTC TCCGGGTGA rompido

TGTGTGAT GAAGAATT GTATATGTG TTGGGTTC AACTAAAA TGATTTGGG CGGCATTG AACTGCAA TTCCGGCAT CGCAATAA GATGCAGG TGCGCAATA AGGGGAGA CATTCGCG AAGGGGAGA AAGACATG TTAAAGCC AAGACATGA AGCATCAC GACTTGAG GCATCACGG GGCGTTAT AAATGAGA CGTTATCAG CAGC AGAT C /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

TGAATATCA CTGACTCAC AAGCTACCT ATGTCGAAG AATTAACTA AAAAACTGC AAGATGCAG GCATTCGCG TTAAAGCCG ACTTGAGAA

ATGAGAAGA T-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 910 ds960 a 336 TCAGGGCT 370 CTGGGGTC 404 5'- gene N/A N/A N/A montante GCGGATGT ACTGGAGC TCAGGGCTG nifL / CGGGCGTT GCTTTATC CGGATGTCG PinfC TCACAACA GGCATCCT GGCGTTTCA rompido

CAAAATGT GACCGAAG CAACACAAA TGTAAATG AATTTGCC ATGTTGTAA CGACACAG GGTTTCTT ATGCGACAC CCGGGCCT CCCGACCT AGCCGGGCC GAAACCAG GGCTGGCC TGAAACCAG GAGCGTGT CCTGTTCA GAGCGTGTG GATGACCT GGTTGTGG ATGACCTTT TTAATATG TGATGAAT AATATGATG ATGC ATCA C /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

CTGGGGTCA CTGGAGCGC TTTATCGGC ATCCTGACC GAAGAATTT GCCGGTTTC TTCCCGACC TGGCTGGCC CCTGTTCAG GTTGTGGTG

ATGAATATC A-3'

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a 910 ds960 a 337 CGGAAAAC 371 GCAATAGA 405 5'- gene N/A N/A N/A jusante GAGTTCAA ACTAACTA CGGAAAACG PinfC / ACGGCACG CCCGCCCT AGTTCAAAC nifL TCCGAATC GAAGGCGG GGCACGTCC rompido

GTATCAAT TACCTGCC GAATCGTAT GGCGAGAT TGACCCTG CAATGGCGA TCGCGCCC CGATTCCC GATTCGCGC AGGAAGTT GTTATTTC CCAGGAAGT CGCTTAAC ATTCACTG TCGCTTAAC TGGTCTGG ACCGGAGG TGGTCTGGA AAGGTGAG CCCACGAT AGGTGAGCA CAGCTGGG GACCCAGC GCTGGGTAT TATT GACC T /

SEQ. da Junção a ID. 100 bp a ID. 100 bp a ID. junção SEQ SEQ SEQ CI Nome montante DE montante DE jusante DE “/” do do da de da / SEQ. da SEQ. da SEQ. indicando Des. da inic. inic. Sond base Junção jusante Nº junção Nº junção Nº junção junção F R a

GCAATAGAA CTAACTACC CGCCCTGAA GGCGGTACC TGCCTGACC CTGCGATTC CCGTTATTT CATTCACTG ACCGGAGGC CCACGATGA

CCCAGCGAC C-3'

Tabela 31: Micróbios não intergenéricos remodelados.

Nome da Genótipo ID.

DE SEQ.

Nº Cepa CI006 rDNA 16S - contig 5 62 CI006 rDNA 16S - contig 8 63 CI019 rDNA 16S 64 CI006 nifH 65 CI006 nifD 66 CI006 nifK 67 CI006 nifL 68 CI006 nifA 69 CI019 nifH 70 CI019 nifD 71 CI019 nifK 72 CI019 nifL 73 CI019 nifA 74 CI006 Prm5 com regiões 75 flanqueadoras de 500 bp CI006 operon de nifLA - 76 região intergênica a montante mais CDSs de nifL e nifA CI006 nifL (aminoácido) 77 CI006 nifA (aminoácido) 78 CI006 glnE 79 CI006 glnE_KO1 80 CI006 glnE (aminoácido) 81 CI006 glnE_KO1 82

Nome da Genótipo ID.

DE SEQ.

Nº Cepa (aminoácido) CI006 GlnE ATase domínio 83 (aminoácido) CM029 Prm5 inserido na 84 região de nifL

Tabela 32: Micróbios não intergenéricos remodelados.

Nova junção ID. da ID. DE SEQ. Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável CI63; ID. DE SEQ. 63 16S N/A N/A CI063 Nº 85 CI63; ID. DE SEQ. 63 nifH N/A N/A CI063 Nº 86 1 de 2 genes únicos CI63; ID. DE SEQ. 63 nifD1 anotados como nifD no N/A CI063 Nº 87 genoma de 63 2 de 2 genes únicos CI63; ID. DE SEQ. 63 nifD2 anotados como nifD no N/A CI063 Nº 88 genoma de 63 1 de 2 genes únicos CI63; ID. DE SEQ. 63 nifK1 anotados como nifK no N/A CI063 Nº 89 genoma de 63

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

2 de 2 genes únicos CI63; ID.

DE SEQ. 63 nifK2 anotados como nifK no N/A CI063 Nº 90 genoma de 63 CI63; ID.

DE SEQ. 63 nifL N/A N/A CI063 Nº 91 CI63; ID.

DE SEQ. 63 nifA N/A N/A CI063 Nº 92 CI63; ID.

DE SEQ. 63 glnE N/A N/A CI063 Nº 93 CI63; ID.

DE SEQ. 63 amtB N/A N/A CI063 Nº 94 500 bp imediatamente a CI63; ID.

DE SEQ. 63 PinfC montante do códon de N/A CI063 Nº 95 início ATG do gene

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável infC ID.

DE SEQ.

CI137 137 16S N/A N/A Nº 96 1 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ.

CI137 137 nifH1 anotados como nifH no N/A Nº 97 genoma de 137 2 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ.

CI137 137 nifH2 anotados como nifH no N/A Nº 98 genoma de 137 1 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ.

CI137 137 nifD1 anotados como nifD no N/A Nº 99 genoma de 137 ID.

DE SEQ. 2 de 2 genes únicos CI137 137 nifD2 N/A Nº 100 anotados como nifD no

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável genoma de 137 1 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ.

CI137 137 nifK1 anotados como nifK no N/A Nº 101 genoma de 137 2 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ.

CI137 137 nifK2 anotados como nifK no N/A Nº 102 genoma de 137 ID.

DE SEQ.

CI137 137 nifL N/A N/A Nº 103 ID.

DE SEQ.

CI137 137 nifA N/A N/A Nº 104 ID.

DE SEQ.

CI137 137 glnE N/A N/A Nº 105 CI137 137 ID.

DE SEQ.

PinfC 500 bp imediatamente a N/A

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

Nº 106 montante do códon de início TTG de infC ID.

DE SEQ.

CI137 137 amtB N/A N/A Nº 107 promotor interno localizado no gene ID.

DE SEQ.

CI137 137 Prm8.2 nlpI; 299 bp começando N/A Nº 108 a 81 bp após o A do ATG do gene nlpI 300 bp a montante do ID.

DE SEQ. gene secE começando a CI137 137 Prm6.2 N/A Nº 109 57 bp a montante do A do ATG de secE CI137 137 ID.

DE SEQ.

Prm1.2 400 bp imediatamente a N/A

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

Nº 110 montante do ATG do gene cspE ID.

DE SEQ. nenhuma 728 16S N/A N/A Nº 111 ID.

DE SEQ. nenhuma 728 nifH N/A N/A Nº 112 1 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 728 nifD1 anotados como nifD no N/A Nº 113 genoma de 728 2 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 728 nifD2 anotados como nifD no N/A Nº 114 genoma de 728 ID.

DE SEQ. 1 de 2 genes únicos nenhuma 728 nifK1 N/A Nº 115 anotados como nifK no

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável genoma de 728 2 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 728 nifK2 anotados como nifK no N/A Nº 116 genoma de 728 ID.

DE SEQ. nenhuma 728 nifL N/A N/A Nº 117 ID.

DE SEQ. nenhuma 728 nifA N/A N/A Nº 118 ID.

DE SEQ. nenhuma 728 glnE N/A N/A Nº 119 ID.

DE SEQ. nenhuma 728 amtB N/A N/A Nº 120 ID.

DE SEQ. nenhuma 850 16S N/A N/A Nº 121

Nova junção ID. da ID. DE SEQ. Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável ID. DE SEQ. nenhuma 852 16S N/A N/A Nº 122 ID. DE SEQ. nenhuma 853 16S N/A N/A Nº 123 ID. DE SEQ. nenhuma 910 16S N/A N/A Nº 124 ID. DE SEQ. nenhuma 910 nifH N/A N/A Nº 125 Co-fator de dinitrogenase ID. DE SEQ. nenhuma 910 ferro- N/A N/A Nº 126 molibdênio

CDS nenhuma 910 ID. DE SEQ. nifD1 N/A N/A

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

Nº 127 ID.

DE SEQ. nenhuma 910 nifD2 N/A N/A Nº 128 ID.

DE SEQ. nenhuma 910 nifK1 N/A N/A Nº 129 ID.

DE SEQ. nenhuma 910 nifK2 N/A N/A Nº 130 ID.

DE SEQ. nenhuma 910 nifL N/A N/A Nº 131 ID.

DE SEQ. nenhuma 910 nifA N/A N/A Nº 132 ID.

DE SEQ. nenhuma 910 glnE N/A N/A Nº 133 nenhuma 910 ID.

DE SEQ. amtB N/A N/A

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

Nº 134 498 bp imediatamente a ID.

DE SEQ. nenhuma 910 PinfC montante do ATG do N/A Nº 135 gene infC ID.

DE SEQ. nenhuma 1021 16S N/A N/A Nº 136 ID.

DE SEQ. nenhuma 1021 nifH N/A N/A Nº 137 1 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 1021 nifD1 anotados como nifD no N/A Nº 138 genoma de 910 2 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 1021 nifD2 anotados como nifD no N/A Nº 139 genoma de 910

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

1 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 1021 nifK1 anotados como nifK no N/A Nº 140 genoma de 910 2 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 1021 nifK2 anotados como nifK no N/A Nº 141 genoma de 910 ID.

DE SEQ. nenhuma 1021 nifL N/A N/A Nº 142 ID.

DE SEQ. nenhuma 1021 nifA N/A N/A Nº 143 ID.

DE SEQ. nenhuma 1021 glnE N/A N/A Nº 144 ID.

DE SEQ. nenhuma 1021 amtB N/A N/A Nº 145

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

500 bp imediatamente a ID.

DE SEQ. montante do códon de nenhuma 1021 PinfC N/A Nº 146 início ATG do gene infC 348 bp inclui os 319 bp imediatamente a ID.

DE SEQ. montante do códon de nenhuma 1021 Prm1 N/A Nº 147 início ATG do gene lpp e os primeiros 29 bp do gene lpp 339 bp a montante do ID.

DE SEQ. gene sspA, terminando nenhuma 1021 Prm7 N/A Nº 148 a 46 bp a montante do ATG do gene sspA

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

ID.

DE SEQ. nenhuma 1113 16S N/A N/A Nº 149 ID.

DE SEQ. nenhuma 1113 nifH N/A N/A Nº 150 1 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 1113 nifD1 anotados como nifD no N/A Nº 151 genoma de 1113 2 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 1113 nifD2 anotados como nifD no N/A Nº 152 genoma de 1113 ID.

DE SEQ. nenhuma 1113 nifK N/A N/A Nº 153 ID.

DE SEQ. nenhuma 1113 nifL N/A N/A Nº 154

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável em função de uma lacuna na montagem da ID.

DE SEQ. gene nifA sequência, só podemos nenhuma 1113 N/A Nº 155 parcial identificar um gene parcial do genoma de 1113 ID.

DE SEQ. nenhuma 1113 glnE N/A N/A Nº 156 ID.

DE SEQ. nenhuma 1116 16S N/A Nº 157 ID.

DE SEQ. nenhuma 1116 nifH N/A Nº 158 ID.

DE SEQ. 1 de 2 genes únicos nenhuma 1116 nifD1 N/A Nº 159 anotados como nifD no

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável genoma de 1116 2 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 1116 nifD2 anotados como nifD no N/A Nº 160 genoma de 1116 1 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 1116 nifK1 anotados como nifK no N/A Nº 161 genoma de 1116 2 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 1116 nifK2 anotados como nifK no N/A Nº 162 genoma de 1116 ID.

DE SEQ. nenhuma 1116 nifL N/A N/A Nº 163 ID.

DE SEQ. nenhuma 1116 nifA N/A N/A Nº 164

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

ID.

DE SEQ. nenhuma 1116 glnE N/A N/A Nº 165 ID.

DE SEQ. nenhuma 1116 amtB N/A N/A Nº 166 ID.

DE SEQ. nenhuma 1293 16S N/A N/A Nº 167 ID.

DE SEQ. nenhuma 1293 nifH N/A N/A Nº 168 1 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 1293 nifD1 anotados como nifD no N/A Nº 169 genoma de 1293 2 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 1293 nifD2 anotados como nifD no N/A Nº 170 genoma de 1293

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

1 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 1293 nifK anotados como nifK no N/A Nº 171 genoma de 1293 2 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 1293 nifK1 anotados como nifK no N/A Nº 172 genoma de 1293 ID.

DE SEQ. nenhuma 1293 nifA N/A N/A Nº 173 ID.

DE SEQ. nenhuma 1293 glnE N/A N/A Nº 174 1 de 2 genes únicos ID.

DE SEQ. nenhuma 1293 amtB1 anotados como amtB no N/A Nº 175 genoma de 1293 nenhuma 1293 ID.

DE SEQ. amtB2 2 de 2 genes únicos N/A

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

Nº 176 anotados como amtB no genoma de 1293 começando a 24 bp após o A do códon de início ATG, 1375 bp de nifL ID.

DE SEQ. nenhuma 1021-1612 ΔnifL::PinfC foram deletados e ds1131 Nº 177 substituídos com a sequência promotora de PinfC de 1021 começando a 24 bp após ΔnifL::PinfC o A do códon de início ID.

DE SEQ. nenhuma 1021-1612 com flanco de ATG, 1375 bp de nifL ds1131 Nº 178 500 bp foram deletados e substituídos com a

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável sequência promotora de PinfC de 1021; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1673 bp imediatamente a jusante do códon de ID.

DE SEQ. início ATG deletados, nenhuma 1021-1612 glnEΔAR-2 ds1133 Nº 179 resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável adenilil (AR) gene glnE com 1673 bp imediatamente a jusante do códon de início ATG deletados, resultando em uma glnEΔAR-2 com proteína glnE truncada ID.

DE SEQ. nenhuma 1021-1612 flanco de 500 que não possui o ds1133 Nº 180 bp domínio de remoção de adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável começando a 24 bp após o A do códon de início ATG, 1375 bp de nifL ID.

DE SEQ. nenhuma 1021-1615 ΔnifL::Prm1 foram deletados e ds1145 Nº 181 substituídos com a sequência promotora de Prm1 de 1021 começando a 24 bp após o A do códon de início ΔnifL::Prm1 ATG, 1375 bp de nifL ID.

DE SEQ. nenhuma 1021-1615 com flanco de foram deletados e ds1145 Nº 182 500 bp substituídos com a sequência promotora de rm1 de 1021; 500 bp

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1673 bp imediatamente a jusante do códon de início ATG deletados, ID.

DE SEQ. nenhuma 1021-1615 glnEΔAR-2 resultando em uma ds1133 Nº 183 proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR) nenhuma 1021-1615 ID.

DE SEQ. glnEΔAR-2 com gene glnE com 1673 bp ds1133

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

Nº 184 flanco de 500 imediatamente a bp jusante do códon de início ATG deletados, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos ID.

DE SEQ. começando a 24 bp após nenhuma 1021-1619 ΔnifL::Prm1 ds1145 Nº 185 o A do códon de início

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

ATG, 1375 bp de nifL foram deletados e substituídos com a sequência promotora de Prm1 de 1021 começando a 24 bp após o A do códon de início ATG, 1375 bp de nifL ΔnifL::Prm1 foram deletados e ID.

DE SEQ. nenhuma 1021-1619 com flanco de substituídos com a ds1145 Nº 186 500 bp sequência promotora de rm1 de 1021; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável jusante estão incluídos gene glnE com 1673 bp imediatamente a jusante do códon de início ATG deletados, ID.

DE SEQ. nenhuma 1021-1623 glnEΔAR-2 resultando em uma ds1133 Nº 187 proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR) glnEΔAR-2 com gene glnE com 1673 bp ID.

DE SEQ. nenhuma 1021-1623 flanco de 500 imediatamente a ds1133 Nº 188 bp jusante do códon de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável início ATG deletados, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando a 24 bp após ID.

DE SEQ. o A do códon de início nenhuma 1021-1623 ΔnifL::Prm7 ds1148 Nº 189 ATG, 1375 bp de nifL foram deletados e

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável substituídos com a sequência promotora de Prm7 de 1021 começando a 24 bp após o A do códon de início ATG, 1375 bp de nifL foram deletados e ΔnifL::Prm7 substituídos com a ID.

DE SEQ. nenhuma 1021-1623 com flanco de sequência promotora de ds1148 Nº 190 500 bp rm7 de 1021; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável gene glnE com 1290 bp imediatamente a jusante do códon de início ATG deletados, ID.

DE SEQ. nenhuma 137-1034 glnEΔAR-2 resultando em uma ds809 Nº 191 proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR) gene glnE com 1290 bp glnEΔAR-2 com imediatamente a ID.

DE SEQ. nenhuma 137-1034 flanco de 500 jusante do códon de ds809 Nº 192 bp início ATG deletados, resultando em uma

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando a 24 bp após o A do códon de início ID.

DE SEQ.

ATG, 1372 bp de nifL nenhuma 137-1036 ΔnifL::PinfC ds799 Nº 193 foram deletados e substituídos com a sequência promotora de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

PinfC de 137 começando a 24 bp após o A do códon de início ATG, 1372 bp de nifL foram deletados e ΔnifL::PinfC substituídos com a ID.

DE SEQ. nenhuma 137-1036 com flanco de sequência promotora de ds799 Nº 194 500 bp PinfC de 137; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos ID.

DE SEQ. glnEΔAR-2 gene glnE com 1290 bp nenhuma 137-1314 nenhuma Nº 195 deleção de 36 imediatamente a

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável bp jusante do códon de início ATG deletados E 36 bp deletados, começando a 1472 bp a jusante do códon de início, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR) glnEΔAR-2 gene glnE com 1290 bp ID.

DE SEQ. nenhuma 137-1314 deleção de 36 imediatamente a nenhuma Nº 196 bp jusante do códon de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável início ATG deletados E 36 bp deletados, começando a 1472 bp a jusante do códon de início, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos nenhuma 137-1314 ID.

DE SEQ.

ΔnifL::Prm8.2 começando a 24 bp após ds857

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

Nº 197 o A do códon de início ATG, 1372 bp de nifL foram deletados e substituídos com a sequência promotora de Prm8.2 de 137 começando a 24 bp após o A do códon de início ATG, 1372 bp de nifL ΔnifL::Prm8.2 ID.

DE SEQ. foram deletados e nenhuma 137-1314 com flanco de ds857 Nº 198 substituídos com a 500 bp sequência promotora de Prm8.2 de 137; 500 bp que flanqueiam o gene

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1290 bp imediatamente a jusante do códon de início ATG deletados E glnEΔAR-2 36 bp deletados, ID.

DE SEQ. nenhuma 137-1329 deleção de 36 começando a 1472 bp a nenhuma Nº 199 bp jusante do códon de início, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável remoção de adenilil (AR) gene glnE com 1290 bp imediatamente a jusante do códon de início ATG deletados E 36 bp deletados, glnEΔAR-2 ID.

DE SEQ. começando a 1472 bp a nenhuma 137-1329 deleção de 36 nenhuma Nº 200 jusante do códon de bp início, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

(AR); 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando a 24 bp após o A do códon de início ATG, 1372 bp de nifL ID.

DE SEQ. nenhuma 137-1329 ΔnifL::Prm6.2 foram deletados e ds853 Nº 201 substituídos com a sequência promotora de Prm6.2 de 137 ΔnifL::Prm6.2 começando a 24 bp após ID.

DE SEQ. nenhuma 137-1329 com flanco de o A do códon de início ds853 Nº 202 500 bp ATG, 1372 bp de nifL

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável foram deletados e substituídos com a sequência promotora de Prm6.2 de 137; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando a 24 bp após o A do códon de início ID.

DE SEQ.

ATG, 1372 bp de nifL nenhuma 137-1382 ΔnifL::Prm1.2 ds843 Nº 203 foram deletados e substituídos com a sequência promotora de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

Prm1.2 de 137 começando a 24 bp após o A do códon de início ATG, 1372 bp de nifL foram deletados e ΔnifL::Prm1.2 substituídos com a ID.

DE SEQ. nenhuma 137-1382 com flanco de sequência promotora de ds843 Nº 204 500 bp Prm1.2 de 137; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos ID.

DE SEQ. glnEΔAR-2 gene glnE com 1290 bp nenhuma 137-1382 nenhuma Nº 205 deleção de 36 imediatamente a

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável bp jusante do códon de início ATG deletados E 36 bp deletados, começando a 1472 bp a jusante do códon de início, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR) glnEΔAR-2 gene glnE com 1290 bp ID.

DE SEQ. nenhuma 137-1382 deleção de 36 imediatamente a nenhuma Nº 206 bp jusante do códon de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável início ATG deletados E 36 bp deletados, começando a 1472 bp a jusante do códon de início, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos nenhuma 137-1586 ID.

DE SEQ.

ΔnifL::PinfC começando a 24 bp após ds799

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

Nº 207 o A do códon de início ATG, 1372 bp de nifL foram deletados e substituídos com a sequência promotora de PinfC de 137 começando a 24 bp após o A do códon de início ATG, 1372 bp de nifL ΔnifL::PinfC ID.

DE SEQ. foram deletados e nenhuma 137-1586 com flanco de ds799 Nº 208 substituídos com a 500 bp sequência promotora de PinfC de 137; 500 bp que flanqueiam o gene

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1290 bp imediatamente a jusante do códon de início ATG deletados, ID.

DE SEQ. nenhuma 137-1586 glnEΔAR-2 resultando em uma ds809 Nº 209 proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR) ID.

DE SEQ. glnEΔAR-2 com gene glnE com 1290 bp nenhuma 137-1586 ds809 Nº 210 flanco de 500 imediatamente a

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável bp jusante do códon de início ATG deletados, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1650 bp ID.

DE SEQ. nenhuma 19-594 glnEΔAR-2 imediatamente a ds34 Nº 211 jusante do códon de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável início ATG deletados, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR) gene glnE com 1650 bp imediatamente a jusante do códon de glnEΔAR-2 com ID.

DE SEQ. início ATG deletados, nenhuma 19-594 flanco de 500 ds34 Nº 212 resultando em uma bp proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando a 221 bp após o A do códon de início ATG, 845 bp de ID.

DE SEQ. nenhuma 19-594 ΔnifL::Prm6.1 nifL foram deletados e ds180 Nº 213 substituídos com a sequência promotora de Prm6.1 de CI019 ID.

DE SEQ.

ΔnifL::Prm6.1 começando a 221 bp nenhuma 19-594 ds180 Nº 214 com flanco de após o A do códon de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

500 bp início ATG, 845 bp de nifL foram deletados e substituídos com a sequência promotora de Prm6.1 de CI019; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando a 221 bp após o A do códon de ID.

DE SEQ. nenhuma 19-714 ΔnifL::Prm6.1 início ATG, 845 bp de ds180 Nº 215 nifL foram deletados e substituídos com a

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável sequência promotora de Prm6.1 de CI019 começando a 221 bp após o A do códon de início ATG, 845 bp de nifL foram deletados e ΔnifL::Prm6.1 substituídos com a ID.

DE SEQ. nenhuma 19-714 com flanco de sequência promotora de ds180 Nº 216 500 bp Prm6.1 de CI019; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos nenhuma 19-715 ID.

DE SEQ.

ΔnifL::Prm7.1 começando a 221 bp ds181

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

Nº 217 após o A do códon de início ATG, 845 bp de nifL foram deletados e substituídos com a sequência promotora de Prm7.1 de CI019 começando a 221 bp após o A do códon de início ATG, 845 bp de ΔnifL::Prm7.1 ID.

DE SEQ. nifL foram deletados e nenhuma 19-715 com flanco de ds181 Nº 218 substituídos com a 500 bp sequência promotora de Prm76.1 de CI019; 500 bp que flanqueiam o

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando a 221 bp após o A do códon de início ATG, 845 bp de ID.

DE SEQ. 19-713 19-750 ΔnifL::Prm1.2 nifL foram deletados e ds172 Nº 219 substituídos com a sequência promotora de Prm1.2 de CI019 começando a 221 bp ΔnifL::Prm1.2 ID.

DE SEQ. após o A do códon de 19-713 19-750 com flanco de ds172 Nº 220 início ATG, 845 bp de 500 bp nifL foram deletados e

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável substituídos com a sequência promotora de Prm1.2 de CI019; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando a 221 bp após o A do códon de início ATG, 845 bp de ID.

DE SEQ. 17-724 19-804 ΔnifL::Prm1.2 nifL foram deletados e ds172 Nº 221 substituídos com a sequência promotora de Prm1.2 de CI019

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável começando a 221 bp após o A do códon de início ATG, 845 bp de nifL foram deletados e ΔnifL::Prm1.2 substituídos com a ID.

DE SEQ. 17-724 19-804 com flanco de sequência promotora de ds172 Nº 222 500 bp Prm1.2 de CI019; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1650 bp ID.

DE SEQ. 17-724 19-804 glnEΔAR-2 imediatamente a ds34 Nº 223 jusante do códon de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável início ATG deletados, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR) gene glnE com 1650 bp imediatamente a jusante do códon de glnEΔAR-2 com ID.

DE SEQ. início ATG deletados, 17-724 19-804 flanco de 500 ds34 Nº 224 resultando em uma bp proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando a 221 bp após o A do códon de início ATG, 845 bp de ID.

DE SEQ. 19-590 19-806 ΔnifL::Prm3.1 nifL foram deletados e ds175 Nº 225 substituídos com a sequência promotora de Prm3.1 de CI019 ID.

DE SEQ.

ΔnifL::Prm3.1 começando a 221 bp 19-590 19-806 ds175 Nº 226 com flanco de após o A do códon de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

500 bp ATG de início, 845 bp de nifL foram deletados e substituídos com a sequência promotora de Prm3.1 de CI019; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1650 bp ID.

DE SEQ. imediatamente a 19-590 19-806 glnEΔAR-2 ds34 Nº 227 jusante do códon de início ATG deletados,

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR) gene glnE com 1650 bp imediatamente a jusante do códon de glnEΔAR-2 com início ATG deletados, ID.

DE SEQ. 19-590 19-806 flanco de 500 resultando em uma ds34 Nº 228 bp proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR); 500 bp

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável que flanqueiam o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando a 24 bp após o A do códon de início ATG, 1375 bp de nifL ID.

DE SEQ. nenhuma 63-1146 ΔnifL::PinfC foram deletados e ds908 Nº 229 substituídos com a sequência promotora de PinfC de 63 ΔnifL::PinfC começando a 24 bp após ID.

DE SEQ. nenhuma 63-1146 com flanco de o A do códon de início ds908 Nº 230 500 bp ATG, 1375 bp de nifL

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável foram deletados e substituídos com a sequência promotora de PinfC de 63; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando a 31 bp após o A do códon de início CM015; ID.

DE SEQ.

ATG, 1375 bp de nifL 6-397 ΔnifL::Prm5 ds24 PBC6.15 Nº 231 foram deletados e substituídos com a sequência promotora de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

Prm5 de CI006 começando a 31 bp após o A do códon de início ATG, 1375 bp de nifL foram deletados e ΔnifL::Prm5 substituídos com a CM015; ID.

DE SEQ. 6-397 com flanco de sequência promotora de ds24 PBC6.15 Nº 232 500 bp Prm5 de CI006; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos ID.

DE SEQ. começando a 31 bp após CM014 6-400 ΔnifL::Prm1 ds20 Nº 233 o A do códon de início

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

ATG, 1375 bp de nifL foram deletados e substituídos com a sequência promotora de Prm1 de CI006 começando a 31 bp após o A do códon de início ATG, 1375 bp de nifL ΔnifL::Prm1 foram deletados e ID.

DE SEQ.

CM014 6-400 com flanco de substituídos com a ds20 Nº 234 500 bp sequência promotora de Prm1 de CI006; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável jusante estão incluídos começando a 31 bp após o A do códon de início ATG, 1375 bp de nifL CM037; ID.

DE SEQ. 6-403 ΔnifL::Prm1 foram deletados e ds20 PBC6.37 Nº 235 substituídos com a sequência promotora de Prm1 de CI006 começando a 31 bp após ΔnifL::Prm1 o A do códon de início CM037; ID.

DE SEQ. 6-403 com flanco de ATG, 1375 bp de nifL ds20 PBC6.38 Nº 236 500 bp foram deletados e substituídos com a

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável sequência promotora de Prm1 de CI006; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1644 bp imediatamente a jusante do códon de CM037; ID.

DE SEQ. início ATG deletados, 6-403 glnEΔAR-2 ds31 PBC6.39 Nº 237 resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável adenilil (AR) gene glnE com 1644 bp imediatamente a jusante do códon de início ATG deletados, resultando em uma glnEΔAR-2 com proteína glnE truncada CM037; ID.

DE SEQ. 6-403 flanco de 500 que não possui o ds31 PBC6.40 Nº 238 bp domínio de remoção de adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável gene glnE com 1287 bp imediatamente a jusante do códon de início ATG deletados, CM038; ID.

DE SEQ. 6-404 glnEΔAR-1 resultando em uma ds30 PBC6.38 Nº 239 proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR) começando a 31 bp após o A do códon de início CM038; ID.

DE SEQ. 6-404 ΔnifL::Prm1 ATG, 1375 bp de nifL ds20 PBC6.38 Nº 240 foram deletados e substituídos com a

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável sequência promotora de Prm1 de CI006 começando a 31 bp após o A do códon de início ATG, 1375 bp de nifL foram deletados e ΔnifL::Prm1 substituídos com a CM038; ID.

DE SEQ. 6-404 com flanco de sequência promotora de ds20 PBC6.38 Nº 241 500 bp Prm1 de CI006; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos CM038; 6-404 ID.

DE SEQ. glnEΔAR-1 com gene glnE com 1287 bp ds30

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

PBC6.38 Nº 242 flanco de 500 imediatamente a bp jusante do códon de início ATG deletados, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos CM029; ID.

DE SEQ. gene glnE com 1287 bp 6-412 glnEΔAR-1 ds30 PBC6.29 Nº 243 imediatamente a

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável jusante do códon de início ATG deletados, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR) gene glnE com 1287 bp imediatamente a glnEΔAR-1 com jusante do códon de CM029; ID.

DE SEQ. 6-412 flanco de 500 início ATG deletados, ds30 PBC6.29 Nº 244 bp resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável domínio de remoção de adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando a 31 bp após o A do códon de início ATG, 1375 bp de nifL CM029; ID.

DE SEQ. 6-412 ΔnifL::Prm5 foram deletados e ds24 PBC6.29 Nº 245 substituídos com a sequência promotora de Prm5 de CI006 CM029; 6-412 ID.

DE SEQ.

ΔnifL::Prm5 começando a 31 bp após ds24

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

PBC6.29 Nº 246 com flanco de o A do códon de início 500 bp ATG, 1375 bp de nifL foram deletados e substituídos com a sequência promotora de Prm5 de CI006; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando a 31 bp após CM093; ID.

DE SEQ. o A do códon de início 6-848 ΔnifL::Prm1 ds20 PBC6.93 Nº 247 ATG, 1375 bp de nifL foram deletados e

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável substituídos com a sequência promotora de Prm1 de CI006 começando a 31 bp após o A do códon de início ATG, 1375 bp de nifL foram deletados e ΔnifL::Prm1 substituídos com a CM093; ID.

DE SEQ. 6-848 com flanco de sequência promotora de ds20 PBC6.93 Nº 248 500 bp Prm1 de CI006; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável gene glnE com 1644 bp imediatamente a jusante do códon de início ATG deletados, CM093; ID.

DE SEQ. 6-848 glnEΔAR-2 resultando em uma ds31 PBC6.93 Nº 249 proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR) gene glnE com 1644 bp glnEΔAR-2 com imediatamente a CM093; ID.

DE SEQ. 6-848 flanco de 500 jusante do códon de ds31 PBC6.93 Nº 250 bp início ATG deletados, resultando em uma

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos Primeiros 1088 bp do gene amtB e 4 bp a CM093; ID.

DE SEQ. montante do códon de 6-848 ΔamtB ds126 PBC6.93 Nº 251 início deletados; 199 bp do gene restantes não possuem um códon

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável de início; nenhuma proteína amtB é traduzida Primeiros 1088 bp do gene amtB e 4 bp a montante do códon de ΔamtB com início deletados; 199 CM093; ID.

DE SEQ. 6-848 flanco de 500 bp do gene restantes ds126 PBC6.93 Nº 252 bp não possuem um códon de início; nenhuma proteína amtB é traduzida CM094; ID.

DE SEQ. gene glnE com 1287 bp 6-881 glnEΔAR-1 ds30 PBC6.94 Nº 253 imediatamente a

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável jusante do códon de início ATG deletados, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR) gene glnE com 1287 bp imediatamente a glnEΔAR-1 com jusante do códon de CM094; ID.

DE SEQ. 6-881 flanco de 500 início ATG deletados, ds30 PBC6.94 Nº 254 bp resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável domínio de remoção de adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando a 31 bp após o A do códon de início ATG, 1375 bp de nifL CM094; ID.

DE SEQ. 6-881 ΔnifL::Prm1 foram deletados e ds20 PBC6.94 Nº 255 substituídos com a sequência promotora de Prm1 de CI006 CM094; 6-881 ID.

DE SEQ.

ΔnifL::Prm1 começando a 31 bp após ds20

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

PBC6.94 Nº 256 com flanco de o A do códon de início 500 bp ATG, 1375 bp de nifL foram deletados e substituídos com a sequência promotora de Prm1 de CI006; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos Primeiros 1088 bp do CM094; ID.

DE SEQ. gene amtB e 4 bp a 6-881 ΔamtB ds126 PBC6.94 Nº 257 montante do códon de início deletados; 199

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável bp do gene restantes não possuem um códon de início; nenhuma proteína amtB é traduzida Primeiros 1088 bp do gene amtB e 4 bp a montante do códon de ΔamtB com início deletados; 199 CM094; ID.

DE SEQ. 6-881 flanco de 500 bp do gene restantes ds126 PBC6.94 Nº 258 bp não possuem um códon de início; nenhuma proteína amtB é traduzida

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável começando a 20 bp após o A do códon de início ATG, 1379 bp de nifL ID.

DE SEQ. nenhuma 910-1246 ΔnifL::PinfC foram deletados e ds960 Nº 259 substituídos com a sequência promotora de PinfC de 910 começando a 20 bp após o A do códon de início ΔnifL::PinfC ATG, 1379 bp de nifL ID.

DE SEQ. nenhuma 910-1246 com flanco de foram deletados e ds960 Nº 260 500 bp substituídos com a sequência promotora de PinfC de 910; 500 bp

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos 1 de 3 genes de rDNA PBC6.1, ID.

DE SEQ.

CI006 16S-1 16S únicos no genoma N/A 6, CI6 Nº 261 de CI006 2 de 3 genes de rDNA PBC6.1, ID.

DE SEQ.

CI006 16S-2 16S únicos no genoma N/A 6, CI6 Nº 262 de CI006 PBC6.1, ID.

DE SEQ.

CI006 nifH N/A N/A 6, CI6 Nº 263 PBC6.1, ID.

DE SEQ. 2 de 2 genes únicos CI006 nifD2 N/A 6, CI6 Nº 264 anotados como nifD no

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável genoma de CI006 2 de 2 genes únicos PBC6.1, ID.

DE SEQ.

CI006 nifK2 anotados como nifK no N/A 6, CI6 Nº 265 genoma de CI006 PBC6.1, ID.

DE SEQ.

CI006 nifL N/A N/A 6, CI6 Nº 266 PBC6.1, ID.

DE SEQ.

CI006 nifA N/A N/A 6, CI6 Nº 267 PBC6.1, ID.

DE SEQ.

CI006 glnE N/A N/A 6, CI6 Nº 268 3 de 3 genes de rDNA PBC6.1, ID.

DE SEQ.

CI006 16S-3 16S únicos no genoma N/A 6, CI6 Nº 269 de CI006 PBC6.1, CI006 ID.

DE SEQ. nifD1 1 de 2 genes únicos N/A

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

6, CI6 Nº 270 anotados como nifD no genoma de CI006 1 de 2 genes únicos PBC6.1, ID.

DE SEQ.

CI006 nifK1 anotados como nifK no N/A 6, CI6 Nº 271 genoma de CI006 PBC6.1, ID.

DE SEQ.

CI006 amtB N/A N/A 6, CI6 Nº 272 348 bp inclui os 319 bp imediatamente a PBC6.1, ID.

DE SEQ. montante do códon de CI006 Prm1 N/A 6, CI6 Nº 273 início ATG do gene lpp e os primeiros 29 bp do gene lpp PBC6.1, CI006 ID.

DE SEQ.

Prm5 313 bp começando a 432 N/A

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

6, CI6 Nº 274 bp a montante do códon de início ATG do gene ompX e terminando 119 bp a montante do códon de início ATG do gene ompX 19, ID.

DE SEQ.

CI019 nifL N/A N/A CI19 Nº 275 19, ID.

DE SEQ.

CI019 nifA N/A N/A CI19 Nº 276 1 de 7 genes de rDNA 19, ID.

DE SEQ.

CI019 16S-1 16S únicos no genoma N/A CI19 Nº 277 de CI019 19, CI019 ID.

DE SEQ. 16S-2 2 de 7 genes de rDNA N/A

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

CI19 Nº 278 16S únicos no genoma de CI019 3 de 7 genes de rDNA 19, ID.

DE SEQ.

CI019 16S-3 16S únicos no genoma N/A CI19 Nº 279 de CI019 4 de 7 genes de rDNA 19, ID.

DE SEQ.

CI019 16S-4 16S únicos no genoma N/A CI19 Nº 280 de CI019 5 de 7 genes de rDNA 19, ID.

DE SEQ.

CI019 16S-5 16S únicos no genoma N/A CI19 Nº 281 de CI019 6 de 7 genes de rDNA 19, ID.

DE SEQ.

CI019 16S-6 16S únicos no genoma N/A CI19 Nº 282 de CI019

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

7 de 7 genes de rDNA 19, ID.

DE SEQ.

CI019 16S-7 16S únicos no genoma N/A CI19 Nº 283 de CI019 1 de 2 genes únicos 19, ID.

DE SEQ.

CI019 nifH1 anotados como nifH no N/A CI19 Nº 284 genoma de CI019 2 de 2 genes únicos 19, ID.

DE SEQ.

CI019 nifH2 anotados como nifH no N/A CI19 Nº 285 genoma de CI019 1 de 2 genes únicos 19, ID.

DE SEQ.

CI019 nifD1 anotados como nifD no N/A CI19 Nº 286 genoma de CI019 19, ID.

DE SEQ. 2 de 2 genes únicos CI019 nifD2 N/A CI19 Nº 287 anotados como nifD no

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável genoma de CI019 1 de 2 genes únicos 19, ID.

DE SEQ.

CI019 nifK1 anotados como nifK no N/A CI19 Nº 288 genoma de CI019 2 de 2 genes únicos 19, ID.

DE SEQ.

CI019 nifK2 anotados como nifK no N/A CI19 Nº 289 genoma de CI019 19, ID.

DE SEQ.

CI019 glnE N/A N/A CI19 Nº 290 449 bp imediatamente a 19, ID.

DE SEQ.

CI019 Prm4 montante do ATG do N/A CI19 Nº 291 gene dscC 2 19, ID.

DE SEQ. 500 bp imediatamente a CI019 Prm1.2 N/A CI19 Nº 292 montante do códon de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável início TTG do gene infC 170 bp imediatamente a 19, ID.

DE SEQ. montante do códon de CI019 Prm3.1 N/A CI19 Nº 293 início ATG do gene rplN 142 bp imediatamente a montante do ATG de uma proteína hipotética 19, ID.

DE SEQ.

CI020 Prm6.1 altamente expressa N/A CI20 Nº 294 (anotada como PROKKA_00662 na montagem de CI019 82) 19, CI021 ID.

DE SEQ.

Prm7.1 293 bp imediatamente a N/A

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

CI21 Nº 295 montante do ATG do gene lpp gene glnE com 1650 bp imediatamente a jusante do códon de 19-375, início ATG deletados, ID.

DE SEQ. 19-417, CM67 glnEΔAR-2 resultando em uma ds34 Nº 296 CM067 proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR) 19-375, glnEΔAR-2 com gene glnE com 1650 bp ID.

DE SEQ. 19-417, CM67 flanco de 500 imediatamente a ds34 Nº 297 CM067 bp jusante do códon de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável início ATG deletados, resultando em uma proteína glnE truncada que não possui o domínio de remoção de adenilil (AR); 500 bp que flanqueiam o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando a 221 bp 19-375, ID.

DE SEQ.

ΔnifL::null- após o A do códon de 19-417, CM67 nenhuma Nº 298 v1 início ATG, 845 bp de CM067 nifL foram deletados e

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável substituídos com uma sequência de 31 bp “GGAGTCTGAACTCATCCTGCG ATGGGGGCTG” começando a 221 bp após o A do códon de início ATG, 845 bp de nifL foram deletados e 19-375, ΔnifL::null- ID.

DE SEQ. substituídos com uma 19-417, CM67 v1 com flanco nenhuma Nº 299 sequência de 31 bp CM067 de 500 bp “GGAGTCTGAACTCATCCTGCG ATGGGGGCTG”; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável jusante estão incluídos começando a 221 bp após o A do códon de início ATG, 845 bp de 19-377, ID.

DE SEQ.

ΔnifL::null- CM69 nifL foram deletados e nenhuma CM069 Nº 300 v2 substituídos com uma sequência de 5 bp “TTAAA” começando a 221 bp ΔnifL::null- após o A do códon de 19-377, ID.

DE SEQ.

CM69 v2 com flanco início ATG, 845 bp de nenhuma CM069 Nº 301 de 500 bp nifL foram deletados e substituídos com uma

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável sequência de 5 bp “TTAAA”; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando a 221 bp após o A do códon de 19-389, início ATG, 845 bp de ID.

DE SEQ. 19-418, CM81 ΔnifL::Prm4 nifL foram deletados e ds70 Nº 302 CM081 substituídos com a sequência de Prm4 de CI19 19-389, ID.

DE SEQ.

ΔnifL::Prm4 começando a 221 bp CM81 ds70 19-418, Nº 303 com flanco de após o A do códon de

Nova junção ID. da ID.

DE SEQ.

Cepa Genótipo Descrição Associada, se Cepa Nº Aplicável

CM081 500 bp início ATG, 845 bp de nifL foram deletados e substituídos com a sequência de Prm4 de CI19; 500 bp que flanqueiam o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos

MODALIDADES NUMERADAS DA REVELAÇÃO

[00591] Apesar das reivindicações em anexo, a revelação apresenta as seguintes modalidades numeradas:

1. Uma composição para tratamento de sementes, que compreende: a. uma pluralidade de bactérias não intergenéricas remodeladas que possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de planta de pelo menos cerca de 1,0 x 104 células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de planta e produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora; e b. pelo menos um pesticida.

2. A composição para tratamento de sementes, de acordo com a modalidade 1, em que o referido pesticida é um fungicida.

3. A composição para tratamento de sementes, de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que o referido pesticida é um fungicida selecionado do grupo que consiste em: fludioxonil, metalaxil, mefenoxam, azoxistrobina, tiabendazol, ipconazol, tebuconazol, protioconazol, e combinações destes.

4. A composição para tratamento de sementes, de acordo com a modalidade 1, em que o referido pesticida é um inseticida.

5. A composição para tratamento de sementes, de acordo com a modalidade 1 ou 4, em que o referido pesticida é um inseticida neonicotinóide.

6. A composição para tratamento de sementes, de acordo com a modalidade 1 ou 4, em que o referido pesticida é um inseticida selecionado do grupo que consiste em:

imidacloprida, clotianidina, tiametoxam, clorantraniliprol, e combinações destes.

7. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-6, em que o referido (pelo menos um) pesticida é um fungicida e uma combinação inseticida.

8. A composição para tratamento de sementes, de acordo com a modalidade 1, em que o referido pesticida é um nematicida.

9. A composição para tratamento de sementes, de acordo com a modalidade 1, em que o referido pesticida é um herbicida.

10. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-9, em que o referido pesticida é selecionado daqueles na Tabela 13.

11. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-10, em que as bactérias não intergenéricas remodeladas e pesticidas exibem um efeito sinérgico.

12. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que o referido tratamento de sementes é disposto sobre uma semente.

13. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-12, em que o referido tratamento de sementes é disposto sobre uma semente da família Poaceae.

14. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-13, em que o referido tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de cereal.

15. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-14, em que o referido tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, milheto, aveia, centeio ou triticale.

16. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-15, em que o referido tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho.

17. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o referido tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho modificada geneticamente.

18. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-17, em que o referido tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho modificada geneticamente, em que o referido milho compreende um traço de tolerância a herbicidas.

19. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-18, em que o referido tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho modificada geneticamente, em que o referido milho compreende um traço de resistência a insetos.

20. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-19, em que o referido tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho modificada geneticamente, em que o referido milho compreende um traço de tolerância a herbicidas e também um traço de resistência a insetos.

21. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-20, em que o referido tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho modificada geneticamente, em que o referido milho compreende um traço listado na Tabela 19.

22. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o referido tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho não modificada geneticamente.

23. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-23, em que o referido tratamento de sementes é disposto sobre milho doce, milho duro, milho de pipoca, milho dentado, milho tunicata ou milho de farinha.

24. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-23, em que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado em uma planta exposta a elas.

25. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-24, em que as bactérias não intergenéricas remodeladas são capazes de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

26. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-25, em que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não codificador, da rede regulatória genética de fixação ou assimilação de nitrogênio.

27. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-26, em que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende uma sequência de controle introduzida ligada operacionalmente a pelo menos um gene da rede regulatória genética de fixação ou assimilação de nitrogênio.

28. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-27, em que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende um promotor heterólogo ligado operacionalmente a pelo menos um gene da rede regulatória genética de fixação ou assimilação de nitrogênio.

29. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-28, em que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em um membro selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, um gene associado à biossíntese de uma enzima nitrogenase, ou combinações destes.

30. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-29, em que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não codificador, da rede regulatória genética de fixação ou assimilação de nitrogênio que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade diminuída de remoção de adenilil de GlnE; ou atividade diminuída de remoção de uridilil de GlnD.

31. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-30, em que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL.

32. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-31, em que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que não possui um domínio de remoção de adenilil (AR).

33. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-32, em que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

34. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-33, em que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende pelo menos um de: um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL; um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que não possui um domínio de remoção de adenilil (AR); um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB; e combinações destes.

35. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-34, em que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que não possui um domínio de remoção de adenilil (AR).

36. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35, em que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que não possui um domínio de remoção de adenilil (AR) e um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB.

37. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-36, em que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas estão presentes em uma concentração de cerca de 1 x 105 até cerca de 1 x 107 cfu por semente.

38. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-37, em que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem pelo menos duas espécies diferentes de bactérias.

39. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-38, em que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem pelo menos duas cepas diferentes da mesma espécie de bactérias.

40. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-39, em que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias selecionadas de: Rahnella aquatilis, Klebsiella variicola, Acromobacter spiritinus, Acromobacter marplatensis, Microbacterium murale, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Enterobacter sp., Azospirillum lipoferum, Kosakonia sacchari, e combinações destas.

41. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-40, em que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas.

42. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-41, em que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias selecionadas de: uma bactéria depositada como NCMA 201701002, uma bactéria depositada como NCMA 201708004, uma bactéria depositada como NCMA 201708003, uma bactéria depositada como NCMA 201708002, uma bactéria depositada como NCMA 201712001, uma bactéria depositada como NCMA 201712002, e combinações destas.

43. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-42, em que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias com uma sequência de ácidos nucleicos que compartilha pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260, 296-303.

44. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-43, em que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias com uma sequência de ácidos nucleicos que compartilha pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência para uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260, 296-303.

45. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-44, em que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias com uma sequência de ácidos nucleicos que compartilha pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência para uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260, 296-303.

46. A composição para tratamento de sementes, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-45, em que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260, 296-303.

[00592] Embora modalidades preferidas da presente revelação tenham sido mostradas e descritas nesse relatório descritivo, será óbvio para aqueles versados na técnica que essas modalidades são fornecidas apenas como exemplo. Diversas variações, alterações e substituições ocorrerão agora àqueles versados na técnica sem se afastar da revelação. Deve ser subentendido que várias alternativas às modalidades da revelação descritas nesse relatório descritivo podem ser empregadas na prática da revelação. Deseja-se que as Reivindicações seguintes definam o escopo da revelação e que os métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam por elas englobados.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[00593] Todas as referências, artigos, publicações,

patentes, publicações de patente e pedidos de patente citados nesse relatório descritivo são incorporados por referência em suas totalidades para todas as finalidades.

No entanto, menção a qualquer referência, artigo, publicação, patente, publicação de patente e pedido de patente citado nesse relatório descritivo não é, e não deve ser considerada como, um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que constitua técnica estabelecida prévia válida ou forme parte do conhecimento geral comum em qualquer país no mundo.

Além disso, a Patente dos EUA Nº 9.975.817, concedida em 22 de maio de 2018, e intitulada: “Methods and Compositions for Improving Plant Traits”, é incorporada nesse relatório descritivo por referência.

Além disso, PCT/US2018/013671, depositado em 12 de janeiro de 2018, e intitulado: “Methods and Composition for Improving Plant Traits”, é incorporada nesse relatório descritivo por referência.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES EMENDADAS

1. Composição para tratamento de sementes, caracterizada por compreender: a. uma pluralidade de bactérias não intergenéricas remodeladas que possuem uma habilidade de colonização média por unidade de tecido de raiz de planta de pelo menos cerca de 1,0 x 104 células bacterianas por grama de peso fresco de tecido de raiz de planta e produzem N fixado de pelo menos cerca de 1 x 10-17 mmol de N por célula bacteriana por hora; e b. pelo menos um pesticida.

2. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido pesticida é selecionado do grupo que consiste em um fungicida, um inseticida, um inseticida neonicotinoide, um nematicida, um herbicida e um fungicida e um combinação inseticida.

3. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido pesticida é um fungicida selecionado do grupo que consiste em: fludioxonil, metalaxil, mefenoxam, azoxistrobina, tiabendazol, ipconazol, tebuconazol, protioconazol, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, clorantraniliprol, azoxistrobina, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, captan, peróxido de hidrogênio, mancozeb, piraclostrobina, Streptomyces griseoviridis, Streptomyces lydicus, tiram, Trichoderma harzianum Rifai, trifloxistrobina, clorpirifos, abamectina, Bacillus firmus, citocinina, proteína hairpin alfa-beta, ácido indol butírico, carboxina, permetrina, trifloxistrobina, ácido giberélico, imidacloprid, piraclostrobina, triticonazol, clorantraniliprol, e combinações destes.

4. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as bactérias não intergenéricas remodeladas e pesticidas exibem um efeito sinérgico.

5. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido tratamento de sementes é disposto sobre uma semente.

6. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida semente é selecionada do grupo que consiste em uma semente da família Poaceae uma semente de cereal, uma semente de milho, uma semente de arroz, uma semente de trigo, uma semente de cevada, uma semente de sorgo, uma semente de milheto, uma semente de aveia, uma semente de centeio, uma semente de triticale, uma semente de milho modificada geneticamente, uma semente de milho não modificada geneticamente, milho doce, milho duro, milho de pipoca, milho dentado, milho tunicata, e milho de farinha.

7. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido tratamento de sementes é disposto sobre uma semente de milho modificada geneticamente.

8. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida semente de milho modificada geneticamente compreende um traço selecionado do grupo que consiste em um traço de tolerância a herbicidas, um traço de resistência a insetos, e combinações destes.

9. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado em uma planta exposta a elas.

10. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as bactérias não intergenéricas remodeladas são capazes de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

11. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não codificador, da rede regulatória genética de fixação ou assimilação de nitrogênio.

12. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende uma sequência de controle introduzida ligada operacionalmente a pelo menos um gene da rede regulatória genética de fixação ou assimilação de nitrogênio.

13. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende um promotor heterólogo ligado operacionalmente a pelo menos um gene da rede regulatória genética de fixação ou assimilação de nitrogênio.

14. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em um membro selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, um gene associado à biossíntese de uma enzima nitrogenase, ou combinações destes.

15. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não codificador, da rede regulatória genética de fixação ou assimilação de nitrogênio que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade diminuída de remoção de adenilil de GlnE; ou atividade diminuída de remoção de uridilil de GlnD.

16. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada membro das diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreende pelo menos um de: um gene nifL mutado que foi alterado para compreender um promotor heterólogo inserido no referido gene nifL; um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que não possui um domínio de remoção de adenilil (AR); um gene amtB mutado que resulta na ausência de expressão do referido gene amtB; e combinações destes.

17. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas estão presentes em uma concentração de cerca de 1 x 105 até cerca de 1 x 107 cfu por semente.

18. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem pelo menos duas espécies diferentes de bactérias.

19. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem pelo menos duas cepas diferentes da mesma espécie de bactérias.

20. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias selecionadas de: Rahnella aquatilis, Klebsiella variicola, Achromobacter spiritinus, Achromobacter marplatensis, Microbacterium murale, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Enterobacter sp., Azospirillum lipoferum, Kosakonia sacchari, e combinações destas.

21. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas.

22. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias selecionadas de: uma bactéria depositada como NCMA 201701002, uma bactéria depositada como NCMA 201708004, uma bactéria depositada como NCMA 201708003, uma bactéria depositada como NCMA 201708002, uma bactéria depositada como NCMA 201712001, uma bactéria depositada como NCMA 201712002, e combinações destas.

23. Composição para tratamento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as diversas bactérias não intergenéricas remodeladas compreendem bactérias que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos que compartilha pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 177-260, 296-303.