JP2003033174A - 窒素固定能を増強した根粒菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 窒素固定能が増強された根粒菌を提供する。 【解決手段】 特定の塩基配列を有するカタラーゼ遺伝
子による形質転換菌であって、この遺伝子の産生するカ
タラーゼによって窒素固定能が増強された根粒菌。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、導入され
たカタラーゼ遺伝子発現によって窒素固定能が増強され
た根粒菌と、この根粒菌を有効成分とするマメ科作物用
製剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ダイズ、アズキ、インゲン等のマメ科作
物は、根粒菌の感染によって共生的に根粒を形成し、こ
の根粒中に形成されたバクテロイドによって空中窒素固
定を行うことにより、窒素含量の低い土壌においても良
好に生育することができる。

【０００３】このため、マメ科作物を栽培する場合に
は、通常の肥料を与えること以外に、予め培養した根粒
菌を作物の種子に塗布することが行われている。そし
て、各種のマメ科作物のさらなる成長促進と収量の増加
を目的として、各マメ科作物に適した根球菌株の探索が
勢力的に行われている。また、遺伝子導入による形質転
換根粒菌の開発も試みられており、例えば、特表2000-5
14663号公報には、トリフォキトキシン遺伝子を導入
し、競合する根粒菌の成長を抑制するように改変された
根粒菌が開示されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】根粒菌は、その窒素固
定能によってマメ科作物の成長や収量に重要な役割を果
たしている。例えば、マメ科作物が窒素を吸収する際の
根粒菌への依存度は30〜65％と極めて高い。従って、窒
素固定能を増強した根粒菌は、様々な土壌におけるマメ
科作物栽培やその収量増加の可能性を大きく拡大するも
のと期待されている。またそのような根粒菌によるマメ
科作物の窒素吸収の効率化は、必然的に硫安等の無機窒
素肥料への依存度を低減することとなり、農業コストの
削減とともに、環境汚染の緩和にも大きく貢献する。

【０００５】しかしながら、自然界からの新たな根粒菌
の探索や、あるいは遺伝子操作による改変根粒菌の作出
によっては、実用化可能な程度に窒素固定能が増強され
た根粒菌は得られていない。

【０００６】一方、カタラーゼは動植物個体に対して有
害に作用する過酸化水素を水と酸素に分解する作用を有
している。この出願の発明者らは、極めて強いカタラー
ゼ活性を有する新菌株Vibrio rumoiensis S-1株を単離
し（J. Ferment. Bioeng. 85:113-116, 1998）、さらに
この菌株のカタラーゼ遺伝子を特定している（特開2000
-316584号公報; Appl. Environ. Microbiol. 65:67-72,
1999；J. Biosci. Bioeng. 90:530-534, 2000）。しか
しながら、カタラーゼ活性によって根粒菌の窒素固定能
が増強されることは従来知られておらず、またカタラー
ゼ遺伝子の導入によって窒素固定能を増強した根粒菌も
全く知られていない。

【０００７】この出願の発明は、以上のとおりの事情に
鑑みてなされたものであって、遺伝子導入によって窒素
固定能が増強された新規根粒菌を提供することを課題と
している。

【０００８】

【課題を解決するための手段】マメ科植物は、根粒菌が
感染した初期に、過酸化水素を生じ、これが細胞毒とな
るため、過酸化水素を分解する酵素（カタラーゼ）を有
している。従って、根粒菌自体も高いカタラーゼ活性を
有していれば、過酸化水素の細胞毒性をさらに抑制し、
マメ科作物の成長促進やマメ収量のさらなる向上が期待
される。事実、この出願の発明者らは、自らが先に発明
したVibrio rumoiensis S-1株由来のカタラーゼ遺伝子
（vktA）を導入した形質転換根粒菌が、強い根粒着生能
と窒素固定能を有することを見出してこの発明を完成さ
せた。

【０００９】すなわち、この出願の発明は、カタラーゼ
遺伝子を導入した形質転換菌であって、この遺伝子の産
生するカタラーゼによって窒素固定能が増強された根粒
菌を提供する。

【００１０】この発明の根粒菌においては、導入したカ
タラーゼ遺伝子が、配列番号１の塩基配列を有するVibr
io rumoiensis S-1株由来のカタラーゼ遺伝子を含むDNA
断片であることを好ましい態様としている。

【００１１】またこの出願の発明は、前記の根粒菌を有
効成分とするマメ科作物用製剤を提供する。さらにこの
出願の発明は、前記の根粒菌または製剤と接触させたマ
メ科作物種子を栽培することを特徴とするマメ科作物の
栽培方法を提供する。

【００１２】

【発明の実施の形態】この発明の根粒菌は、カタラーゼ
遺伝子を導入した形質転換菌である。カタラーゼ遺伝子
は、各種の生物種が産生するカタラーゼをコードするポ
リヌクレオチド（ゲノムDNAやmRNA、cDNA等）を利用す
ることができる。カタラーゼ遺伝子は、例えば、Legion
ella pneumophilla由来のカタラーゼ遺伝子（J. Bacter
iol. 182:6679-6686, 2000; GenBank AF276752, FEMS M
icrobiol. Lett. 176:339-344,1999; GenBank AB01759
5）、Aspergillus nidulans由来のカタラーゼ遺伝子
（J. Bacteriol. 183:1434-1440, 2001; GenBank AF316
033）、Pseudomonas fluorescence由来のカタラーゼ遺
伝子（FEMS Microbiol. Lett. 200:235-240, 2001; Gen
Bank U72068）、Nicotiana tabacum由来のカタラーゼ遺
伝子（Plant J. 11:993-1005, 1997; GenBank U9324
4）、Straphyrococcus aureus由来のカタラーゼ遺伝子
（Microbiology 146:465-475, 2000; GenBank AJ00047
1, AJ000472）、Xanthomonas campestris pv. phaseoli
由来のカタラーゼ遺伝子（Gene 241:259-265,2000； Ge
nBank AF170449）、Synechoccus Sp.由来のカタラーゼ
遺伝子（Biochimie 82:211-219, 2000; GenBank AF1971
61）等、多くが知られている。従ってこの発明の根粒菌
の範囲には、文献やデータベース等において既知のカタ
ラーゼ遺伝子、あるいは今後同定され得る未知のカタラ
ーゼ遺伝子を用いて作成されたもの全てが含まれる。

【００１３】導入するカタラーゼ遺伝子は、それ本来の
発現制御領域（プロモーター／エンハンサー）を備えた
ものでもよく、あるいは根粒菌で高頻度で発現する遺伝
子の発現制御領域を連結した融合配列であってもよい。

【００１４】さらに、この発明の形質転換根粒菌の一つ
の態様は、配列番号１の塩基配列を有するvktA遺伝子を
含むDNA断片を導入した形質転換菌である。具体的に
は、この根粒菌は実施例にも示したように、配列番号１
の塩基配列からなるvktA遺伝子のコード領域とそのプロ
モーター配列を含むDNA断片（4.9kb）を導入した根粒菌
である。vktA遺伝子は、特開2000-315684号に記載の方
法によってVibrio rumoiensis S-1株から単離して用い
ることができる。あるいは、配列番号１のDNA配列の両
端一部領域に対応する合成オリゴヌクレオチドをプライ
マーとし、S-1株ゲノムを鋳型とするPCR法によっても得
ることができる。さらには、配列番号１の一部配列に基
づいて合成したプローブを用いて、Vibrio rumoiensis
S-1株から調製したゲノムライブラリーをスクリーニン
グすることによって取得することもできる。クローニン
グしたvktA遺伝子は適当なベクターにサブクローニング
し、根粒菌の形質転換に使用することができる。

【００１５】根粒菌は、マメ科作物の根に感染して根粒
を形成するグラム陰性菌であり、マメ科作物に対して生
育促進作用を有する公知の根粒菌株を用いることができ
る。具体的には、Rhizobium属、Bradyrhizobium属、Azo
rhizorium属等に属する微生物であり、さらに具体的に
は、Rhizobium meliloti、Rhizobium trifolii、Rhizob
ium lupini、Rhizobium fredii、Rhizobium loti、Rhiz
obium leguminosarum、Bradyrhizobium japonicum、Azo
rhizorium caulinodans等である。これらの根粒菌は、
その増殖に適した培地（TY培地等）に適量を接種し、25
〜30℃で12〜36時間程度の振盪培養を行って増殖させ、
遠心分離で集菌して形質転換に供することができる。

【００１６】vktA遺伝子の根粒菌への導入は、導入遺伝
子を保有する組換えベクターを、電気穿孔法、リン酸カ
ルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公
知の方法によって根粒菌に導入することによって行うこ
とができる。あるいは、実施例に示したように、根粒
菌、組換えベクターを保有する細菌宿主（大腸菌等）お
よびヘルパープラスミドを有する細菌宿主との共培養に
よる接合伝達法によっても形質転換根粒菌を作成するこ
とができる。

【００１７】このようにして作成した形質転換根粒菌
は、実施例に示したように高い窒素固定能を有してお
り、マメ科作物の種子と共存させることによって、良好
に根粒を形成することができる。

【００１８】この発明のマメ科作物用製剤は、前記の形
質転換根粒菌を有効成分としている。具体的には、この
製剤は、根粒菌が生育可能な液体培地（例えばTY培地
等）にこの発明の根粒菌を10⁵〜10⁸個／ml程度に混合し
たものとして調製することができる。あるいは、有機質
または無機質の担体と混合することもできる。具体的に
は、赤玉土、焼成赤玉土、鹿沼土、黒ボク土、バーミキ
ュライト、パーライト、ゼオライト等の無機質担体、ピ
ートモス、木炭、パルプ、藁、バガス、油かす、魚か
す、骨粉、血粉、貝化石、カニがら等の有機質担体であ
る。この発明の根粒菌を担体に担持させるには、根粒菌
の混濁液と担体とを混合することによって行うことがで
きる。その場合の根粒菌の含有量は、担体1 gに対して
根粒菌10⁵〜10 ⁸個程度を混合すればよい。さらに、根粒
菌と担体との混合物には、水を40％以上含有させること
によって根粒菌の安定性を向上させることもできる。ま
たさらに、石炭灰等を担体の一部として配合することに
よって製剤のpHを5.5〜8.0程度に調整することによって
根粒菌の保存安定性を一層向上させることもできる。

【００１９】このようにして調製した製剤は、例えば、
植え付け前の種子と適量を混合したり、あるいは農地へ
の蒔種時に肥料とともに散布することができる。以下、
実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ
具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によっ
て限定されるものではない。

【００２０】

【実施例】1. 組換えベクターの構築 配列番号１の塩基配列からなるvktA遺伝子（プロモータ
ー配列とカタラーゼコード領域を含む）を広宿主域ベク
ター（pBBR1MCS-2: Gene 166:175-176, 1995）に挿入
し、vktA遺伝子を保有する組換えベクターpBBR1MCS-2:v
ktAを構築した。 2. 形質転換菌の構築 2.1 使用菌株：形質転換する根粒菌（受容菌）とし
て、Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli 2676（イ
ンゲンマメ菌）およびRhizobium fredii USDA 191（ダ
イズ菌）を使用した。供与菌としては、組換えベクター
pBBR1MCS-2:vktAによる形質転換大腸菌E. coli JM109を
使用した。ヘルパープラスミド保有菌としては、pRK201
3を保有する大腸菌E. coli MM294を使用した。 2.2 接合伝達による遺伝子導入：受容菌、供与菌およ
びヘルパープラスミド保有菌のそれぞれを5 mlのTY培地
にて30℃で振盪培養（100ストローク／分）し、対数増
殖後期まで増殖させた。無菌的に２種の大腸菌培養物そ
れぞれ40μlと根粒菌培養物100μlを1.5 ml容マイクロ
チューブに混合し、10,000rpmで１分間遠心し、集菌し
た。上澄みを除いた後、菌体を100μlの滅菌水に懸濁
し、10,000rpmで１分間遠心して菌体を洗浄した。菌を1
00μlの滅菌蒸留水に懸濁し、TY寒天培地上に置かれた
ミリポアフィルターに50μlの混合菌液を乗せ、30℃で
一晩メーティングさせた。そして、菌体が付着したフィ
ルター部分を切り出し、1.5ml容マイクロチューブに入
れ、滅菌蒸留水1 mlを加えてよく懸濁した。フィルター
を除いた後、10,000rpmで１分間遠心し、集菌し、さら
に滅菌蒸留水1 mlに菌を懸濁した。次いで、滅菌蒸留水
で10⁵倍まで希釈調製した希釈菌液を選択寒天培地（Sod
ium succinate 1.35g, Sodium glutamate 1.1g, K₂HPO₄
220mg, MgSO₄ 100mg, FeCl₂ 440mg, CaCl₂ 440mg,Biot
in 0.2mg/L distilled water(pH7.0)）に100μlづつ塗
布し、30℃で４〜５日培養して、vktAによる根粒菌の形
質転換株をスクリーニングした。 3. カタラーゼ活性の測定 3.1 培養条件：TY液体培地（5ml）にて30℃、往復振盪
培養（100ストローク／分）を行った対数増殖後期の菌
液（前培養培地）を本培養TY培地（200ml）に移し、30
℃で対数増殖後期から定常期初期まで培養した。 3.2 無細胞抽出液の調製：培養菌液を9,000rpmで10分
間、４℃で遠心し、集菌した。その後、50mM K-phospha
te buffer（KPB: 50mM KH₂PO₄ 8.5ml, 50mM K₂HPO₄ 91.
5ml, pH7.8）を用いて２回洗浄した。洗浄後、1mlのKPB
に懸濁し、超音波処理（200W, 2分×8）により菌体を粉
砕し、この試料を19,000rpm、10分間、４℃で遠心し
た。得られた上清液を無細胞抽出液として測定に用い
た。 3.3 カタラーゼ活性の測定：H₂O₂を基質としてH₂O 2.6
45ml、0.5M KPB(pH6.9) 0.3ml、30% H₂O₂ 5μlを石英セ
ル中で混合し、25℃、３分間インキュベートして温度平
衡させた後、無細胞抽出液50μlを混合し、240nmでの吸
光値の変化により酵素活性を測定した。H₂O₂のモル吸光
係数、0.0436M^-1cm^-1を用いた。 3.4 タンパク量の測定：BradfoardのCoomassie brilli
ant blue（CBB）を用いる方法に基づき、CBB溶液5mlに
無細胞抽出液100μlを混合し、595nmの吸光値から測定
した。標準タンパク質としてウシ血清アルブミンを用い
た。 3.5 結果：vktA遺伝子で形質転換したRhizobium legum
inosarum bv. phaseoli 2676およびRhizobium fredii U
SDA 191のカタラーゼ活性は、それぞれ7,500 U/mg prot
einおよび6,100 U/mg proteinであり、それぞれの親株
のカタラーゼ活性（3.4および2.9 U/mg protein）に比
較して有意に高い酵素活性を示した。 4. マメ科作物への形質転換根粒菌の接種 4.1 宿主作物：ダイズ（品種名：キタムスメ）および
インゲンマメ（品種名：ユキテボウ）を使用した。それ
ぞれの種子を70%エタノール中に２分間浸した後、滅菌
蒸留水で３回洗浄し、さらに10%次亜塩素酸ナトリウム
で表面殺菌し、滅菌蒸留水で６回洗浄した。また、各作
物の栽培にはジードバック（15×16cm）を用いた。無窒
素栽培液（Norris-Date氏液）を30ml注ぎ、アルミホイ
ルで全体を包んでオートクレーブ滅菌した。 4.2 接種菌：vktA遺伝子で形質転換したRhizobium leg
uminosarum bv. phaseoli 2676（インゲンマメ菌）およ
びRhizobium fredii USDA 191（ダイズ菌）、ならびに
それぞれの親株を使用した。各菌株は、TY培地（バクト
トリプトン5g、酵母エキス3g、塩化カルシウム６水和1.
3g/L）5ml中にて30℃、往復振盪（100ストローク／分）
条件で対数増殖後期（OD660nmの吸光値で1.0以上、10⁹c
ells/ml）まで増殖させた。これを滅菌したリン酸緩衝
化生理食塩水（phosphate buffered saline: PBS）[0.7
g KH₂PO₄, 6.8g NaCl, 2.4g Na₂HPO₄・12H₂O/L distill
ed water (pH7.0)]にて1,000倍希釈して菌濃度を10⁶cel
ls/mlに調製した接種菌液とした。 4.3 根粒菌の宿主作物への接種：シーバック１枚につ
き２個の種子を置き、種子１個につき1mlの接種用菌液
を種子にかけた。全体をアルミホイルで覆い、これらを
明期14時間（22℃）、暗期10時間（18℃）の条件下に静
置した。６日後にアルミホイルを外した。栽培中は20日
目までは滅菌蒸留水を加え、20目以降はNorris-Date氏
液を適宜補充した。 4.4 窒素固定活性の測定：根粒菌の接種後、40日後
（インゲンマメ）または50日後（ダイズ）に測定を行っ
た。1,000ml容ガラスポットに植物体を入れ、ゴム栓に
て密封した。ゴム栓からシリンジを用いて各ポット内か
ら100ml（ポット内空気量の10%）の空気を抜いた後、同
僚のアセチレンを充填した。30℃で１時間インキュベー
トした後、ポット内から1mlをシリンジで抜き取り、ガ
スクロマトグラフィー（日立K53、検出器：FID、カラ
ム：PORAPAK N50〜80 mesh、カラム温度：50℃、インジ
ェクション温度：150℃、流速：30ml/分）で生成された
エチレン量を測定した。 4.5 根粒重の測定：窒素固定活性の測定後、植物体を
ポットから取り出し、根粒を分離してデシケーターで一
晩乾燥させ、重量（乾重量）を測定した。 4.6 結果 表１は、vktA遺伝子で形質転換した根粒菌Rhizobium fr
edii USDA 191またはその親株を接種したダイズにおけ
る各栽培日ごとの根粒数、根粒重量、およびニトロギナ
ーゼ活性（ARA）の比較である。また表２は、vktA遺伝
子で形質転換したRhizobium leguminosarum bv. phaseo
li 2676またはその親株を接種したインゲンマメにおけ
る同様の比較である。

【００２１】表１に示したように、形質転換菌株を接種
したダイズは、植物個体当たりの根粒数が親株接種に比
べて有意に増加し、またニトロゲナーゼ活性の増加も観
察された。一方、表２に示したように、形質転換菌株を
接種したインゲンマメは、根粒数は増加しないものの、
ニトロゲナーゼ活性の有意な増加が確認された。

【００２２】

【表１】

【００２３】

【表２】

【００２４】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、カタラーゼ遺伝子の導入によって形質転
換された窒素固定能の優れた根粒菌が提供される。これ
によって、マメ科作物の成長促進とマメ収量の増加が可
能となる。また窒素肥料の削減による農業コストと低減
化と環境汚染の緩和も図られる。

【００２５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technoligy Corporation <120> Root nodule bacteria having an enhanced ability for nitrogen fixation <130> NP01272-YS <140> <141> <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2354 <212> DNA <213> Vibrio sp. <220> <221> gene <222> (703)..(2232) <220> <221> CDS <222> (703)..(2232) <300> <308> GenBank/AB030821 <309> 2000-09-02 <300> <310> JP2000-316584A <311> 1999-05-14 <312> 2000-11-21 <400> 1 gtcgacgatg caatgaacgt ccaattcagc cggcacggcc ttgtcgatct cgcgcaggaa 60 cgacaggaat tcctgatggc gatgacgcgg cttgcaagcg gccagcaccg cgccgttgag 120 cacattcagg gccgcgaaca gcgtggttgt gccgtggcgc ttgtaatcgt gagtgacgcc 180 ttcgacgtag cccaggccca tgggcaacat cggctgcgtc cgctccagcg cctggcattg 240 actcttctca tccacgcaca gcaccagtgc gttctcgggc gggctcagat acaggcccac 300 cacgtcgcgc agtttctcca cgaagaacgg gtcgttggac agcttgaagc tctcggtgcg 360 atgcggctga agcccaaaga gctggaagta gcgctgcacg ctgctcttgg agatgccagt 420 ctcagcggcc accgatcgca cgctccagtg cgtcgcgccg tcggccggct tggtgtgcag 480 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atctggtcag atcaatgtcg ac 2354

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:41） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 2B022 AA01 AB20 4B024 AA07 BA08 CA03 DA05 EA04 GA11 4B065 AA01X AA55Y AB01 AC14 BA02 CA28 CA60

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カタラーゼ遺伝子を導入した形質転換菌
   であって、この遺伝子の産生するカタラーゼによって窒
   素固定能が増強された根粒菌。
2. 【請求項２】 導入したカタラーゼ遺伝子が、配列番号
   １の塩基配列を有するVibrio rumoiensis S-1株由来の
   カタラーゼ遺伝子を含むDNA断片である請求項１の根粒
   菌。
3. 【請求項３】 請求項１または２の根粒菌を有効成分と
   するマメ科作物用製剤。
4. 【請求項４】 請求項１または２の根粒菌、もしくは請
   求項３の製剤と接触させたマメ科作物種子を栽培するこ
   とを特徴とするマメ科作物の栽培方法。