KR102197507B1 - 식물 형질 개선을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

식물 형질 개선을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

비콩과 식물에서 질소 고정을 증가시키는 방법이 본원에서 개시된다. 이 방법은 식물을 다수의 박테리아에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 다수의 박테리아의 각각의 구성원은 박테리아의 질소 고정 또는 동화 유전자 조절 네트워크의 하나 이상의 유전자 또는 비코딩 폴리뉴클레오티드 내에 도입된 하나 이상의 유전자 변이를 포함하여, 박테리아는 외인성 질소의 존재 하에 대기 질소를 고정할 수 있다. 박테리아는 속간 미생물이 아니다. 추가로, 박테리아는 식물에서 고정된 질소의 1% 이상을 식물 내에서 생성한다.

Description

식물 형질 개선을 위한 방법 및 조성물
교차 참조
본원은 2015년 7월 13일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/192,009호 및 2015년 9월 2일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/213,567호에 기초한 우선권을 주장하고, 상기 출원은 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함된다
연방 정부 후원 연구에 관한 설명
본 발명은 미국 국립 과학 재단(National Science Foundation)에 의해 부여된 SBIR 승인 1520545 하에 미국 정부의 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 개시된 주제에 대해 특정 권리를 갖는다.
식물은 공유된 대사체군(metabolome)을 통해 미생물군유전체(microbiome)에 연결된다. 특정 작물 형질과 근원적인 대사체군 사이의 다차원적 관계는 많은 국소 최대치(local maxima)를 갖는 형태(landscape)를 특징으로 한다. 미생물군유전체가 대사체군에 미치는 영향을 변경함으로써 보다 열등한(inferior) 국소 최대치를 더 우수한 형질을 나타내는 또 다른 것으로 최적화하는 것은 작물 최적화와 같은 다양한 이유로 바람직할 수 있다. 농업 및 식량 생산에 대한 경제적으로, 환경적으로, 및 사회적으로 지속 가능한 방법은 점증하는 세계 인구의 요구를 충족할 필요가 있다. 2050년까지 유엔 식량 농업기구(Food and Agriculture Organization)는 증가하는 인구의 요구를 충족하기 위해 총 식량 생산이 70% 증가해야 한다고 추정하고 있고, 이 과제는 담수 자원의 감소, 경작지에 대한 경쟁 심화, 에너지 가격 상승, 투입 비용 증가, 및 더 건조하고 더 뜨겁고 더 극단적인 지구 기후의 압력에 적응할 수 있는 작물에 대한 필요성을 비롯한 많은 요인들로 인해 악화하고 있다.
한 관심 분야는 질소 고정의 개선에 있다. 질소 가스(N2)는 지구 대기의 주성분이다. 또한, 원소 질소(N)는 살아있는 유기체를 구성하는 많은 화합물의 중요한 성분이다. 그러나, 많은 유기체는 성장 및 생식과 같은 생리적 과정에서 사용되는 화학물질을 합성하기 위해 N2를 직접 이용할 수 없다. N2를 이용하기 위해서는, N2가 수소와 결합되어야 한다. 수소와 N2의 결합을 질소 고정(nitrogen fixation)이라고 한다. 질소 고정은 화학적으로 달성되는지 생물학적으로 달성되는지에 상관없이 다량의 에너지의 투입을 필요로 한다. 생물학적 시스템에서, 니트로게나제(nitrogenase)로 알려진 효소가 질소 고정을 초래하는 반응을 촉매화한다. 질소 고정 연구의 중요한 목표는 이 표현형을 비콩과 식물, 특히 밀, 벼, 및 옥수수와 같은 중요한 작물학적 목초로 확장하는 것이다. 근류균(rhizobia)과 콩과 식물 사이의 질소 고정 공생의 발달에 대한 이해의 큰 진전에도 불구하고, 비콩과 작물에 대해 질소 고정 근류(nodule)를 유도하기 위해 그 지식을 사용하는 경로는 여전히 분명하지 않다. 한편, 비료와 같이 질소의 충분한 보충원을 제공하는 문제는 식량 생산 증가의 필요성이 증가함에 따라 계속 증가할 것이다.
상기한 측면에 비추어, 관련 미생물군유전체에 의해 부여된 식물의 형질을 개선할 필요가 있다. 본 개시내용은 이러한 필요성을 다루며, 또한 추가적인 이점을 제공한다. 일부 경우에, 미생물군유전체를 구성하는 종 및 그의 근원적인 유전학 둘 모두가 대사체군에 대한 미생물의 영향을 조절하는 표적이 된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 비콩과 식물에서 질소 고정을 증가시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 식물을 다수의 박테리아에 노출시키는 단계를 포함하고, 상기 다수의 박테리아의 각각의 구성원은 박테리아의 질소 고정 또는 동화 유전자 조절 네트워크의 하나 이상의 유전자 또는 비코딩 폴리뉴클레오티드 내에 도입된 하나 이상의 유전자 변이를 포함하여 외인성 질소의 존재 하에 대기 질소를 고정할 수 있고; 박테리아는 속간(intergeneric) 미생물이 아니고; 박테리아는 식물에서 고정된 질소의 1% 이상을 식물 내에서(in planta) 생성한다.
일부 실시양태에서, 박테리아는 식물에서 고정된 질소의 5% 이상을 식물 내에서 생성한다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 식물에서 고정된 질소의 10% 이상을 식물 내에서 생성한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 변이는 상기 질소 고정 또는 동화 유전자 조절 네트워크의 하나 이상의 유전자에 작동 가능하게 연결된 도입된 조절 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 조절 서열은 프로모터이다. 추가의 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 질소 고정 또는 동화 유전자 조절 네트워크의 유전자에 작동 가능하게 연결된 구성적(constitutive) 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 nif 유전자 클러스터 내의 유전자에 작동 가능하게 연결된 구성적 프로모터를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 박테리아는 질소 고정의 질소 함유 생성물을 식물 내에서 분비한다. 일부 실시양태에서, 식물에 노출된 다수의 박테리아는 외인성 비대기 질소의 흡수 증가를 자극하지 않는다.
일부 실시양태에서, 식물은 에이커당 약 50 파운드의 질소 함유 비료를 시비한 재배지로부터의 토양에서 자라고, 여기서 질소 함유 비료는 적어도 5 중량%의 질소를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 질소 함유 비료는 암모늄 또는 암모늄 함유 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 질소는 글루타민, 암모니아, 암모늄, 우레아, 질산염, 아질산염, 암모늄 함유 분자, 질산염 함유 분자 및 아질산염 함유 분자 중 하나 이상을 포함하는 비료로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 다수의 박테리아는 적어도 2개의 상이한 종의 박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 박테리아는 동일한 종의 박테리아의 적어도 2개의 상이한 균주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 박테리아는 엔테로박터(Enterobacter) 속에 속한다. 일부 실시양태에서, 다수의 박테리아는 식물내생성(endophytic), 식물착생성(epiphytic) 또는 근권성(rhizospheric)이다. 일부 실시양태에서, 다수의 박테리아는 박테리아가 식물의 생중량 1 g당 적어도 105 cfu로 식물에 존재하도록 식물에 콜로니를 형성한다.
일부 실시양태에서, 박테리아의 질소 고정 또는 동화 유전자 조절 네트워크의 하나 이상의 유전자 또는 비코딩 폴리뉴클레오티드는 nifA, nifL, ntrB, ntrC, 글루타민 합성효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, 글루타미나제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, 및 nifQ로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 변이는 NifA 또는 글루타미나제의 발현 또는 활성의 증가; NifL, NtrB, 글루타민 합성효소, GlnB, GlnK, DraT, AmtB의 발현 또는 활성의 감소; GlnE의 아데닐릴 제거 활성의 감소; 또는 GlnD의 우리딜릴 제거 활성의 감소 중 하나 이상을 유발하는 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 변이는 (A) 낙아웃(knockout) 돌연변이이거나; (B) 표적 유전자의 조절 서열을 변경 또는 무능화하거나; 또는 (C) 이종성 조절 서열의 삽입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 식물은 농작물 식물이다. 추가의 실시양태에서, 농작물 식물은 수수, 카놀라, 토마토, 딸기, 보리, 벼, 옥수수 및 밀로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 식물은 유전적으로 변형된 유기체이다. 추가의 실시양태에서, 식물은 유전적으로 변형된 유기체가 아니다. 일부 실시양태에서, 식물은 효율적인 질소 사용을 위해 유전적으로 조작되거나 육종되었다.
한 측면에서, 본 개시내용은 박테리아의 질소 고정 또는 동화 유전자 조절 네트워크의 하나 이상의 유전자 또는 비코딩 폴리뉴클레오티드에 도입된 하나 이상의 유전자 변이를 포함하여 외인성 질소의 존재 하에 대기 질소를 고정할 수 있는 박테리아를 포함하는 박테리아 군집을 제공하고, 여기서 박테리아는 속간 미생물이 아니고; 박테리아는 박테리아 군집의 존재 하에 성장한 식물에서 고정된 질소의 1% 이상을 식물 내에서 생성한다.
일부 실시양태에서, 박테리아는 식물에서 고정된 질소의 5% 이상을 식물 내에서 생성한다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 식물에서 고정된 질소의 10% 이상을 식물 내에서 생성한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 변이는 상기 질소 고정 또는 동화 유전자 조절 네트워크의 하나 이상의 유전자에 작동 가능하게 연결된 도입된 조절 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 조절 서열은 프로모터이다. 추가의 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 질소 고정 또는 동화 유전자 조절 네트워크의 유전자에 작동 가능하게 연결된 구성적 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 nif 유전자 클러스터 내의 유전자에 작동 가능하게 연결된 구성적 프로모터를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 박테리아는 질소 고정의 질소 함유 생성물을 식물 내에서 분비한다. 일부 실시양태에서, 식물에 노출된 다수의 박테리아는 외인성 비대기 질소의 흡수 증가를 자극하지 않는다. 일부 실시양태에서, 외인성 질소는 글루타민, 암모니아, 암모늄, 우레아, 질산염, 아질산염, 암모늄 함유 분자, 질산염 함유 분자 및 아질산염 함유 분자 중 하나 이상을 포함하는 비료로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 박테리아 군집은 적어도 2개의 상이한 종의 박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 박테리아 군집은 동일한 종의 박테리아의 적어도 2개의 상이한 균주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 박테리아는 엔테로박터 속에 속한다. 일부 실시양태에서, 다수의 박테리아는 식물내생성, 식물착생성 또는 근권성이다. 일부 실시양태에서, 다수의 박테리아는 박테리아가 식물의 생중량 1 g당 적어도 105 cfu로 식물에 존재하도록 식물에 콜로니를 형성한다.
일부 실시양태에서, 박테리아의 질소 고정 또는 동화 유전자 조절 네트워크의 하나 이상의 유전자 또는 비코딩 폴리뉴클레오티드는 nifA, nifL, ntrB, ntrC, 글루타민 합성효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, 글루타미나제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, 및 nifQ로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 변이는 NifA 또는 글루타미나제의 발현 또는 활성의 증가; NifL, NtrB, 글루타민 합성효소, GlnB, GlnK, DraT, AmtB의 발현 또는 활성의 감소; GlnE의 아데닐릴 제거 활성의 감소; 또는 GlnD의 우리딜릴 제거 활성의 감소 중 하나 이상을 유발하는 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 변이는 (A) 낙아웃 돌연변이이거나; (B) 표적 유전자의 조절 서열을 변경 또는 무능화하거나; 또는 (C) 이종성 조절 서열의 삽입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 식물은 농작물 식물이다. 추가의 실시양태에서, 농작물 식물은 수수, 카놀라, 토마토, 딸기, 보리, 벼, 옥수수 및 밀로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 식물은 유전적으로 변형된 유기체이다. 추가의 실시양태에서, 식물은 유전적으로 변형된 유기체가 아니다. 일부 실시양태에서, 식물은 효율적인 질소 사용을 위해 유전적으로 조작되거나 육종되었다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 박테리아 군집을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종자의 표면 상에 코팅된 박테리아 군집을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 액체 또는 분말로서 제제화된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 ATCC 기탁 번호 PTA-122293 또는 PTA-122294로 기탁된 단리된 박테리아를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 박테리아의 질소 고정 또는 동화 유전자 조절 네트워크의 하나 이상의 유전자 또는 비코딩 폴리뉴클레오티드에 도입된 하나 이상의 유전자 변이를 포함하여 외인성 질소의 존재 하에 대기 질소를 고정할 수 있는 비속간 박테리아를 제공한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 변이는 상기 질소 고정 또는 동화 유전자 조절 네트워크의 하나 이상의 유전자에 작동 가능하게 연결된 도입된 조절 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 조절 서열은 프로모터이다. 추가의 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 질소 고정 또는 동화 유전자 조절 네트워크의 유전자에 작동 가능하게 연결된 구성적 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 nif 유전자 클러스터 내의 유전자에 작동 가능하게 연결된 구성적 프로모터를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 박테리아의 질소 고정 또는 동화 유전자 조절 네트워크의 하나 이상의 유전자 또는 비코딩 폴리뉴클레오티드는 nifA, nifL, ntrB, ntrC, 글루타민 합성효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, 글루타미나제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, 및 nifQ로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 변이는 NifA 또는 글루타미나제의 발현 또는 활성의 증가; NifL, NtrB, 글루타민 합성효소, GlnB, GlnK, DraT, AmtB의 발현 또는 활성의 감소; GlnE의 아데닐릴 제거 활성의 감소; 또는 GlnD의 우리딜릴 제거 활성의 감소 중 하나 이상을 유발하는 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 변이는 (A) 낙아웃 돌연변이이거나; (B) 표적 유전자의 조절 서열을 변경 또는 무능화하거나; 또는 (C) 이종성 조절 서열의 삽입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 박테리아는 엔테로박터 속에 속한다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 식물내생성, 식물착생성 또는 근권성이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 박테리아를 생산하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 제1 식물의 조직 또는 토양으로부터 박테리아를 단리하는 단계; (b) 유전자 변이(예를 들어, 하나 이상의 유전자 변이)를 하나 이상의 박테리아에 도입하여 하나 이상의 변이체 박테리아를 생산하는 단계; (c) 다수의 식물을 변이체 박테리아에 노출시키는 단계; (d) 다수의 식물 중 하나의 조직 또는 토양으로부터 박테리아를 단리하는 단계로서, 여기서 박테리아가 단리된 식물은 다수의 식물 내의 다른 식물에 비해 개선된 형질을 갖는 것인 단계; 및 (e) 단계 (d)에서 단리된 박테리아를 사용하여 단계 (b) 내지 (d)를 반복하는 단계를 포함한다. 개선된 형질은 박테리아가 단리된 식물에서 및/또는 박테리아에 노출된 식물에서 향상된 질소 고정일 수 있다. 유전자 변이는 nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, 및 nifQ로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 내의 변이일 수 있다. 유전자 변이는 글루타민 합성효소, 글루타미나제, 글루타민 합성효소 아데닐릴트랜스퍼라제, 전사 활성제, 항전사 활성제, 피루베이트 플라보독신 산화환원효소, 플라보독신, 또는 NAD+-이질소-환원효소(dinitrogen-reductase) ADP-D-리보실트랜스퍼라제로 이루어진 군으로부터 선택된 기능성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 내의 변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변이는 NifA 또는 글루타미나제의 발현 또는 활성의 증가; NifL, NtrB, 글루타민 합성효소, GlnB, GlnK, DraT, AmtB의 발현 또는 활성의 감소; GlnE의 아데닐릴 제거 활성의 감소; 또는 GlnD의 우리딜릴 제거 활성의 감소 중 하나 이상을 유발하는 돌연변이이다. 유전자 변이는 낙아웃 돌연변이이고/이거나, 단백질 도메인의 활성을 제거 또는 무능화하고/하거나, 표적 유전자의 조절 서열을 변경 또는 무능화하고/하거나, 이종성 조절 서열의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변이는 유전자 변이가 도입된 박테리아에 대응하는 박테리아 종 또는 속의 게놈 내에서 발견된 조절 서열의 삽입을 포함한다. 조절 서열은 박테리아 배양액 또는 식물 조직 내의 유전자의 발현 수준에 기초하여 선택적으로 선택될 수 있다. 유전자 변이는 무작위 선정 위치에서의 무작위 돌연변이, 표적 부위에서의 무작위 돌연변이, 또는 표적 부위에 특이적으로 도입된 미리 결정된 유전자 변이일 수 있다. 유전자 변이는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 조합의 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 유전자 변이는 화학적 돌연변이 유발에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 생물적 또는 비생물적 스트레스 인자(abiotic stressor)에 식물을 노출시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (b) 내지 단계 (d)를 1회 이상 반복한 후에 단리된 박테리아는 제1 식물과 동일한 유형의 제2 식물에서 또는 그 박테리아에 노출된 식물에서 1% 이상(예를 들어, 적어도 2%, 5%), 10% 이상)의 질소를 생성한다. 이러한 생성은 제2 식물이 글루타민, 암모니아 또는 질소의 다른 화학적 공급원으로 보충된 비료의 존재 하에서 재배될 때 여전히 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 (b) 내지 (d)를 반복한 후에 단리된 박테리아는 제1 식물로부터 단리된 박테리아와 비교하여 질소 고정에서 적어도 2배의 증가(예를 들어, 적어도 5배 증가)를 나타낸다. 제1 식물 또는 다수의 식물 내의 식물은 보리, 벼, 옥수수, 밀, 수수, 단 옥수수(sweet corn), 사탕수수, 양파, 토마토, 딸기 또는 아스파라거스로부터 선택된 식물과 같은 농작물 식물일 수 있다. 제1 식물 또는 다수의 식물 내의 식물은 모델 식물, 예컨대 세타리아(Setaria), 브라키포디움(Brachypodium) 또는 아라비돕시스(Arabidopsis)로부터 선택된 식물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)는 단리된 박테리아의 유전 분석을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)는 유전자 변이를 포함하는 박테리아를 풍부하게 하는 선택 압력을 인가하는 단계, 및 선택적으로, 선택 압력에서 생존하는 박테리아를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 선택 압력은 표적 부위에 도입된 유전자 변이가 결여된 게놈을 절단하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 절단은 표적 부위의 100개 뉴클레오티드 내에서 발생한다. 절단은 징크 핑거(Zinc Finger) 뉴클레아제, CRISPR 뉴클레아제, TALE 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레아제와 같은 부위 특이적 뉴클레아제에 의해 지시될 수 있다. 일부 경우에는, CRISPR 뉴클레아제가 선호될 수 있다. 단계 (b) 내지 (d)를 1회 이상 반복한 후에 단리된 박테리아는 식물내생성, 식물착생성 또는 근권성이다. 박테리아는 식물 조직(예를 들어, 종자)으로부터 단리될 수 있다. 박테리아는 다수의 상이한 박테리아 분류군(taxon)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)에서 박테리아를 단리하는 단계는 제1 식물의 종자로부터 박테리아를 단리하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 식물에서 질소 고정을 증가시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 질소 고정을 조절하는 하나 이상의 유전자에 도입된 하나 이상의 유전자 변이를 포함하는 박테리아에 식물을 노출시키는 단계를 포함하고, 여기서 박테리아는 식물에서 1% 이상(예를 들어, 적어도 2%, 5%, 10% 또는 그 초과)의 질소를 생성한다. 박테리아는 글루타민, 암모니아 또는 보충 질소의 다른 화학적 공급원으로 보충된 비료의 존재 하에 질소를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변이는 nifA, nifL, ntrB, ntrC, 글루타민 합성효소, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, 글루타미나제, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB 및 nifQ로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 내의 변이이다. 유전자 변이는 nifA 또는 글루타미나제의 발현 또는 활성의 증가; nifL, ntrB, 글루타민 합성효소, glnB, glnK, draT, amtB의 발현 또는 활성의 감소; GlnE의 아데닐릴 제거 활성의 감소; 또는 GlnD의 우리딜릴 제거 활성의 감소 중 하나 이상을 유발하는 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 유전자 변이는 (a) 낙아웃 돌연변이이거나; (b) 표적 유전자의 조절 서열을 변경 또는 무능화하거나; 또는 (c) 이종성 조절 서열의 삽입을 포함한다. 박테리아는 식물내생성, 식물착생성 또는 근권성이다. 일부 경우에, 박테리아는 엔테로박터 또는 라넬라(Rahnella) 속에 속한다. 박테리아는 복수의 상이한 박테리아 분류군을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물은 농작물 식물, 예컨대 수수, 카놀라, 토마토, 딸기, 보리, 벼, 옥수수 및 밀로부터 선택되는 식물이다. 식물은 비콩과 식물일 수 있다. 식물은 유전자 변형 유기체(GMO, 예를 들어, 이종성 유전자를 보유하기 위해 변경된 게놈을 갖는 식물), 비유전자 변형 유기체(비GMO)일 수 있거나, 또는 효율적인 질소 사용을 위해 유전적으로 조작되거나 육종되었다.
한 측면에서, 본 개시내용은 박테리아 군집을 제공한다. 한 실시양태에서, 박테리아 군집은 질소 고정을 조절하는 하나 이상의 유전자에 도입된 하나 이상의 유전자 변이를 포함하는 박테리아를 포함하고, 여기서 박테리아는 박테리아 군집의 존재 하에 성장한 식물에서 1% 이상(예를 들어, 적어도 2%, 5%, 10% 또는 그 초과)의 질소를 생성한다. 박테리아는 글루타민, 암모니아 또는 보충 질소의 다른 화학적 공급원으로 보충된 비료의 존재 하에 질소를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변이는 nifA, nifL, ntrB, ntrC, 글루타민 합성효소, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, 글루타미나제, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB 및 nifQ로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 내의 변이이다. 유전자 변이는 nifA 또는 글루타미나제의 발현 또는 활성의 증가; nifL, ntrB, 글루타민 합성효소, glnB, glnK, draT, amtB의 발현 또는 활성의 감소; GlnE의 아데닐릴 제거 활성의 감소; 또는 GlnD의 우리딜릴 제거 활성의 감소 중 하나 이상을 유발하는 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 유전자 변이는 (a) 낙아웃 돌연변이이거나; (b) 표적 유전자의 조절 서열을 변경 또는 무능화하거나; 또는 (c) 이종성 조절 서열의 삽입을 포함한다. 박테리아는 식물내생성, 식물착생성 또는 근권성이다. 일부 경우에, 박테리아는 엔테로박터 또는 라넬라 속에 속한다. 박테리아는 복수의 상이한 박테리아 분류군을 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 박테리아 군집, 예컨대 본원에서 설명된 박테리아 군집을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 종자의 표면 상에 코팅된 박테리아 군집을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 액체 또는 분말로서 제제화된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 ATCC 기탁 번호 PTA-122293을 갖는 박테리아를 제공한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 ATCC 기탁 번호 PTA-122294를 갖는 박테리아를 제공한다.
참조로의 통합
본 명세서에서 언급되는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참고로 포함된다고 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 상세하게 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점의 보다 양호한 이해는 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시양태를 제시하는 하기 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 얻어질 것이다.
도 1a-b는 질소 고정 박테리아의 농축 및 단리를 보여준다. (a) Nfb 아가 플레이트가 질소 고정 박테리아의 단일 콜로니를 단리하기 위해 사용되었다. (b) 발치관(Balch tube)에서 캐스팅된 반고체 Nfb 아가. 화살표는 농축된 질소 고정 박테리아의 박막을 가리킨다.
도 2는 대표적인 nifH PCR 스크린을 보여준다. 이 스크린에서 2개의 콜로니에 대해 ~350 bp에서 양성 밴드가 관찰되었다. 하부 밴드는 프라이머-이량체를 나타낸다.
도 3은 CRISPR-Cas-선택된 돌연변이 유발으로부터의 콜로니의 PCR 스크린의 예를 보여준다. CI006 콜로니를 nifL 유전자좌에 특이적인 프라이머로 스크리닝하였다. 야생형 PCR 생성물은 ~2.2 kb에서 예상되는 반면, 돌연변이체는 ~1.1 kb에서 예상된다. 스크리닝된 10개의 콜로니 중 7개가 원하는 결실을 분명하게 나타낸다.
도 4a-d는 다양한 균주의 시험관 내 표현형을 나타낸다. 0 내지 10 mM 글루타민으로 보충된 질소 고정 배지에서 성장한 균주 CI010의 돌연변이체(도 4a) 및 균주 CI006의 돌연변이체(도 4b)의 아세틸렌 환원 검정(ARA) 활성. 추가 균주의 ARA 활성은 도 4c에 제시되고, 두 균주의 시간에 따른 암모늄 배출 프로파일은 도 4d에 도시된다.
도 5는 디아조영양성(diazaotrophic) 질소 고정에 관여하는 균주 CI006에서 9개의 상이한 유전자의 배양 발현 프로파일을 보여준다. 숫자는 각각의 전사체의 수를 나타낸다. 다양한 조건(0, 1, 10 mM 글루타민 및 N2 중 0%, 10%, 20% 대기)이 표시된다.
도 6은 옥수수 뿌리의 CI006 콜로니화를 보여준다. 옥수수 모종에 RFP 발현 플라스미드를 보유하는 CI006을 접종하였다. 적절한 항생제 급수를 통해 성장 및 플라스미드 유지를 2주 동안 실시한 후, 뿌리를 수거하고, 형광 현미경을 통해 영상화하였다. 뿌리 세포간 공간의 콜로니화가 관찰된다.
도 7은 WT(CI050) 및 최적화된(CM002) 균주에서 미생물 수준으로부터 유도된 질소를 나타낸다.
도 8은 마이크로-톰(Micro-Tom) 과일 질량(fruiting mass) 검정을 위한 실험 설정을 보여준다.
도 9는 마이크로-톰 식물 과일 질량의 증가에 대한 10개 균주의 스크린을 보여준다. 6회 반복 실험에 대한 결과가 표시된다. 컬럼 3에서, p = 0.07. 컬럼 7에서, p = 0.05.
도 10a-10c는 0 내지 10 mM 글루타민으로 보충된 질소 고정 배지에서 성장한 후보 미생물 및 대응 후보 돌연변이체의 ARA 활성에 대한 추가의 결과를 나타낸다.
도 11은 자신이 유래된 단일 돌연변이체보다 더 높은 암모니아 배출을 나타내는 이중 돌연변이체를 보여준다.
도 12는 시비한(fertilized) 조건에서 옥수수 식물의 NDFA를 측정하기 위해 15N 가스 흡수 실험(노출된 날을 사용한 역추정)으로부터 얻어진 NDFA를 나타낸다.
도 13은 시비한 조건에서 세타리아 식물의 NDFA를 측정하기 위해 15N 가스 흡수 실험(노출된 날을 사용한 역추정)으로부터 얻어진 NDFA 값을 나타낸다.
도 14a는 15N 가스의 혼입률을 보여준다. 진화 균주를 접종한 식물은 접종되지 않은 식물에 비해 15N 가스의 혼입의 증가를 보였다.
도 14b는 식재 4주 후를 나타내고, 여기서 진화 균주를 접종한 식물에서 7%까지의 질소가 미생물에 의해 고정된 질소에서 유래한다.
도 14c는 접종되지 않은 또는 접종된 야생형 식물과 비교할 때 진화된 균주로 접종된 식물에서 잎 면적(및 다른 바이오매스 측정치, 데이터 미제시)이 증가한 것을 나타낸다.
도 15a는 식물 총전사체 연구(planta transcriptomic study)에 의해 측정된, 뿌리 조직에서 현저히 더 높은 nifH 생산을 보이는 진화된 균주를 나타낸다.
도 15b는 식물 조직에서 발견된 고정 질소의 비율이 특정 식물이 HoME 최적화된 균주에 의해 콜로니화 속도와 상관관계가 있음을 나타낸다.
도 16a는 콜로니화를 위해 시험된 다양한 재배지 토양의 토성 지도(soil texture map)를 나타낸다. 몇 가지 미생물이 본래 채취된 토양은 별로 표시된다.
도 16b는 4개의 상이한 토양 유형(원형)에 걸쳐 시험된 균주 1 및 균주 5의 콜로니화 속도를 보여준다. 두 균주 모두 다양한 토양 유형에 걸쳐 상대적으로 강력한 콜로니화 프로파일을 보였다.
도 16c는 성장기의 기간 동안 현장 시험에서 시험된 균주 1의 콜로니화를 나타낸다. 균주 1은 식재 후 12주까지 옥수수 조직에서 지속되고, 그 후에 콜로니화의 감소를 보이기 시작한다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 교환 가능하게 사용된다. 이들은 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 알려진 또는 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연결 분석으로부터 규정된 유전자좌(들), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 차단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후, 예를 들어 표지 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화된 복합체를 형성하는 반응을 의미한다. 수소 결합은 왓슨 크릭(Watson Crick) 염기쌍 형성, 훅스틴(Hoogstein) 결합 또는 염기 상보성에 따른 임의의 다른 서열 특이적 방법에 의해 발생할 수 있다. 복합체는 이중체 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가 혼성화 가닥 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 PCR의 개시 또는 엔도뉴클레아제에 의한 폴리뉴클레오티드의 효소적 절단과 같은 보다 광범위한 과정에서 한 단계를 구성할 수 있다. 제1 서열에 상보성인 제2 서열은 제1 서열의 "상보체"로 지칭된다. 폴리뉴클레오티드에 적용되는 "혼성화 가능한"이란 용어는 혼성화 반응에서 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화된 복합체를 형성하는 폴리뉴클레오티드의 능력을 의미한다.
"상보성"은 전통적인 왓슨-크릭 또는 다른 비전통적 유형에 의해 또 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 지칭한다. 상보성 비율은 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기쌍)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내의 잔기의 비율을 나타낸다(예를 들어, 10개 중 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보성이다). "완전하게 상보성인"은 핵산 서열의 모든 인접한 잔기가 제2 핵산 서열 내의 동일한 수의 연속 잔기와 수소 결합한다는 것을 의미한다. 본원에 사용되는 "실질적으로 상보성인"이란 용어는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 영역에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 상보성 정도를 지칭하거나, 또는 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 2개의 핵산을 지칭한다. 상보성 비율을 평가하기 위한 목적과 같은 서열 동일성은 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘(예를 들어, 선택적으로 디폴트 설정과 함께 www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html에서 이용가능한 EMBOSS Needle 정렬기 참조), BLAST 알고리즘(예를 들어, 선택적으로 디폴트 설정과 함께 blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi에서 이용가능한 BLAST 정렬 도구 참조) 또는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘(예를 들어, 선택적으로 디폴트 설정과 함께 www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html에서 이용가능한 EMBOSS Water 정렬기 참조)을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 정렬 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 최적 정렬은 디폴트 파라미터를 포함하는, 선택된 알고리즘의 임의의 적합한 파라미터를 사용하여 평가될 수 있다.
일반적으로, 혼성화에 대한 "엄격한 조건"은 표적 서열에 상보성을 갖는 핵산이 표적 서열과 우세하게 혼성화하고 비표적 서열에는 실질적으로 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 일반적으로 서열에 따라 다르며, 많은 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 서열이 길수록, 서열이 그의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 온도가 높아진다. 엄격한 조건의 비제한적인 예는 문헌 [Tijssen (1993), Laboratory Technniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.]에 상세하게 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 전사되는(예컨대, mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 과정 및/또는 전사된 mRNA가 이어서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 코딩되는 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물"로 언급될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱(splicing)을 포함할 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 교환 가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비아미노산에 의해 차단될 수 있다. 상기 용어는 또한 변형된; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작, 예컨대 표지 성분과의 접합을 포함하는 아미노산 중합체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 및 아미노산 유사체 및 펩티드 모방체를 비롯한 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 용어 "대략"과 동의어로 사용된다. 예를 들어, 양에 대한 용어 "약"의 사용은 언급된 값을 약간 벗어나는, 예를 들어 플러스 또는 마이너스 0.1% 내지 10%의 값을 나타낸다.
용어 "생물학적으로 순수한 배양액" 또는 "실질적으로 순수한 배양액"은 배양 물의 복제를 간섭하거나 통상의 박테리아 기술에 의해 검출되기에 충분한 양의 다른 박테리아 종을 함유하지 않는 본원에서 설명되는 박테리아 종의 배양액을 의미하거나 된다.
"식물 생산성"은 일반적으로 식물이 자라는 이유인 식물의 성장 또는 발달의 임의의 측면을 말한다. 곡물 또는 채소와 같은 식량 작물의 경우, "식물 생산성"은 특정 작물에서 수확한 곡물 또는 과일의 생산량을 나타낼 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 개선된 식물 생산성은 곡물, 과일, 꽃 또는 다양한 목적을 위해 수확된 다른 식물 부분의 생산량 개선, 줄기, 잎 및 뿌리를 포함한 식물 부분의 성장 개선, 식물 성장의 촉진, 잎의 높은 엽록소 함량의 유지, 과일 또는 종자 수의 증가 또는 과일 또는 종자 단위 중량의 증가, 질소 비료 사용량의 감소에 의한 NO2 방출의 감소 및 식물의 성장 및 발달의 유사한 개선을 의미한다.
식량 작물 내 및 그 주위의 미생물은 그 작물의 형질에 영향을 미칠 수 있다. 미생물에 의해 영향을 받을 수 있는 식물 형질은 다음을 포함한다: 수확량(예를 들어, 곡물 생산, 바이오매스 생성, 과일 발달, 꽃 집단(flower set)); 영양(예를 들어, 질소, 인, 칼륨, 철, 미량영양분 획득); 비생물적 스트레스 관리(예를 들어, 가뭄 내성, 내염성, 내열성); 및 생물적 스트레스 관리(예를 들어, 해충, 잡초, 곤충, 진균 및 박테리아). 작물 형질을 변경하기 위한 전략은 다음을 포함한다: 주요 대사산물 농도의 증가; 주요 대사산물에 대한 미생물 영향의 시간적 역학(temporal dynamics)의 변화; 새로운 환경 신호에 대한 미생물 대사산물 생산/분해의 연결; 부정적인 대사산물의 감소; 및 대사산물 또는 기본 단백질의 균형 개선.
본원에서 사용되는 바와 같이, "조절 서열"은 오퍼레이터, 프로모터, 사일렌서(silencer) 또는 종결자를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "식물 내에서"란 식물 내를 의미하며, 잎, 뿌리, 줄기, 종자, 배주, 꽃가루, 꽃, 과일 등을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 유전자의 천연 또는 내인성 조절 서열은 하나 이상의 속내(intrageneric) 조절 서열로 대체된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "도입된"은 현대 생물공학에 의한 도입을 의미하고, 천연 생성 도입은 의미하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 박테리아는 천연 생성 박테리아가 아니도록 변형되었다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 박테리아는 식물의 생중량 또는 건조 중량 1 g당 적어도 103 cfu, 104 cfu, 105 cfu, 106 cfu, 107 cfu, 108 cfu, 109 cfu, 1010 cfu, 1011 cfu 또는 1012 cfu의 양으로 식물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 박테리아는 생중량 또는 건조 중량 1 g당 적어도 약 103 cfu, 약 104 cfu, 약 105 cfu, 약 106 cfu, 약 107 cfu, 약 108 cfu, 약 109 cfu, 약 1010 cfu, 약 1011 cfu 또는 약 1012 cfu의 양으로 식물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 박테리아는 식물의 생중량 또는 건조 중량 1 g당 적어도 103 내지 109, 103 내지 107, 103 내지 105, 105 내지 109, 105 내지 107, 106 내지 1010, 106 내지 107 cfu의 양으로 식물에 존재한다.
본 개시내용의 비료 및 외인성 질소는 다음 질소 함유 분자를 포함할 수 있다: 암모늄, 질산염, 아질산염, 암모니아, 글루타민 등. 본 개시내용의 질소 공급원은 무수 암모니아, 황산암모니아, 우레아, 인산이암모늄, 우레아 형태, 인산일암모늄, 질산암모늄, 질소 용액, 질산칼슘, 질산칼륨, 질산나트륨 등을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "외인성 질소"는 암모니아, 암모늄, 질산염, 아질산염, 우레아, 요산, 암모늄 산 등을 포함하는, 비질소 제한 조건 하에 존재하는 토양, 재배지 또는 성장 배지에서 용이하게 입수할 수 있는 비대기 질소를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비질소 제한 조건"은 본원에 참고로 포함된 문헌 [Kant et al. (2010. J. Exp. Biol. 62(4):1499-1509)]에 개시된 바와 같이, 약 4 mM 초과의 질소 농도에서 토양, 재배지, 배지에서 이용 가능한 비대기 질소를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "속간 미생물"은 상이한 분류학적 속의 유기체로부터 원래 단리된 유전 물질의 의도적인 조합에 의해 형성된 미생물이다. "속간 돌연변이체"는 "속간 미생물"과 교환 가능하게 사용될 수 있다. 예시적인 "속간 미생물"은 수용자 미생물과 상이한 속의 미생물에서 처음으로 동정된 이동성 유전 요소를 함유하는 미생물을 포함한다. 추가의 설명은 특히 40 C.F.R. § 725.3에서 볼 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "속내 미생물"은 동일한 분류학적 속의 유기체로부터 원래 단리된 유전 물질의 의도적인 조합에 의해 형성된 미생물이다. "속내 돌연변이체"는 "속내 미생물"과 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "도입된 유전 물질"은 수여자의 게놈에 첨가되어 그 성분으로서 유지되는 유전 물질을 의미한다.
일부 실시양태에서, 질소 고정 및 동화 유전자 조절 네트워크는 미생물 질소 고정 및/또는 동화를 유도, 조정 및/또는 조절하는 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 비코딩 서열을 포함하고, nif 클러스터(예를 들어, nifA, nifB, nifC,......nifZ)의 폴리뉴클레오티드 서열, 질소 조절 단백질 C를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 질소 조절 단백질 B를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, gln 클러스터(예를 들어, glnA 및 glnD)의 폴리뉴클레오티드 서열, draT 및 암모니아 수송체/투과효소를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비료는 적어도 5중량%, 6중량%, 7중량%, 8중량%, 9중량%, 10중량%, 11중량%, 12중량%, 13중량%, 14중량%, 15중량%, 16중량%, 17중량%, 18중량%, 19중량%, 20중량%, 21중량%, 22중량%, 23중량%, 24중량%, 25중량%, 26중량%, 27중량%, 28중량%, 29중량%, 30중량%, 31중량%, 32중량%, 33중량%, 34중량%, 35중량%, 36중량%, 37중량%, 38중량%, 39중량%, 40중량%, 41중량%, 42중량%, 43중량%, 44중량%, 45중량%, 46중량%, 47중량%, 48중량%, 49중량%, 50중량%, 51중량%, 52중량%, 53중량%, 54중량%, 55중량%, 56중량%, 57중량%, 58중량%, 59중량%, 60중량%, 61중량%, 62중량%, 63중량%, 64중량%, 65중량%, 66중량%, 67중량%, 68중량%, 69중량%, 70중량%, 71중량%, 72중량%, 73중량%, 74중량%, 75중량%, 76중량%, 77중량%, 78중량%, 79중량%, 80중량%, 81중량%, 82중량%, 83중량%, 84중량%, 85중량%, 86중량%, 87중량%, 88중량%, 89중량%, 90중량%, 91중량%, 92중량%, 93중량%, 94중량%, 95중량%, 96중량%, 97중량%, 98중량%, 99중량%의 질소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비료는 적어도 약 5중량%, 약 6중량%, 약 7중량%, 약 8중량%, 약 9중량%, 약 10중량%, 약 11중량%, 약 12중량%, 약 13중량%, 약 14중량%, 약 15중량%, 약 16중량%, 약 17중량%, 약 18중량%, 약 19중량%, 약 20중량%, 약 21중량%, 약 22중량%, 약 23중량%, 약 24중량%, 약 25중량%, 약 26중량%, 약 27중량%, 약 28중량%, 약 29중량%, 약 30중량%, 약 31중량%, 약 32중량%, 약 33중량%, 약 34중량%, 약 35중량%, 약 36중량%, 약 37중량%, 약 38중량%, 약 39중량%, 약 40중량%, 약 41중량%, 약 42중량%, 약 43중량%, 약 44중량%, 약 45중량%, 약 46중량%, 약 47중량%, 약 48중량%, 약 49중량%, 약 50중량%, 약 51중량%, 약 52중량%, 약 53중량%, 약 54중량%, 약 55중량%, 약 56중량%, 약 57중량%, 약 58중량%, 약 59중량%, 약 60중량%, 약 61중량%, 약 62중량%, 약 63중량%, 약 64중량%, 약 65중량%, 약 66중량%, 약 67중량%, 약 68중량%, 약 69중량%, 약 70중량%, 약 71중량%, 약 72중량%, 약 73중량%, 약 74중량%, 약 75중량%, 약 76중량%, 약 77중량%, 약 78중량%, 약 79중량%, 약 80중량%, 약 81중량%, 약 82중량%, 약 83중량%, 약 84중량%, 약 85중량%, 약 86중량%, 약 87중량%, 약 88중량%, 약 89중량%, 약 90중량%, 약 91중량%, 약 92중량%, 약 93중량%, 약 94중량%, 약 95중량%, 약 96중량%, 약 97중량%, 약 98중량%, 또는 약 99%의 질소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비료는 약 5% 내지 50중량%, 약 5% 내지 75중량%, 약 10% 내지 50중량%, 약 10% 내지 75중량%, 약 15% 내지 50중량%, 약 15% 내지 75중량%, 약 20% 내지 50중량%, 약 20% 내지 75중량%, 약 25% 내지 50중량%, 약 25% 내지 75중량%, 약 30% 내지 50중량%, 약 30% 내지 75중량%, 약 35% 내지 약 50중량%, 약 35% 내지 75중량%, 약 40% 내지 50중량%, 약 40% 내지 75중량%, 약 45% 내지 50중량%, 약 45% 내지 75% 또는 약 50% 내지 75%의 질소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 질소 고정의 증가 및/또는 식물에서 질소의 1% 이상의 생산은 본 개시내용의 박테리아에 노출되지 않은 대조군 식물과 비교하여 측정된다. 박테리아의 모든 증가 또는 감소는 대조군 박테리아와 비교하여 측정된다. 식물의 모든 증가 또는 감소는 대조군 식물과 비교하여 측정된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "구성적 프로모터"는 대부분의 조건 하에서 및/또는 대부분의 발달 단계에서 활성인 프로모터이다. 생명공학에서 사용되는 발현 벡터에서 구성적 프로모터를 사용하는 것은 예를 들어 다음과 같은 몇 가지 이점이 존재한다: 트랜스제닉(transgenic) 세포 또는 유기체를 선택하기 위해 사용되는 단백질의 높은 생산 수준; 리포터 단백질 또는 평가가능 마커의 높은 발현 수준, 및 이에 의한 용이한 검출 및 정량화; 조절 전사 시스템의 일부인 전사 인자의 높은 생산 수준; 유기체에서 유비쿼터스(ubiquitous) 활성을 필요로 하는 화합물의 생산; 및 모든 발달 단계 동안 필요로 하는 화합물의 생산. 비제한적인 예시적인 구성적 프로모터는 CaMV 35S 프로모터, 오파인(opine) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 알콜 데히드로게나제 프로모터 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비구성적 프로모터"는 특정 조건 하에서, 특정 유형의 세포에서, 및/또는 특정 발달 단계 동안 활성인 프로모터이다. 예를 들어, 조직 특이적, 조직 선호적, 세포 유형 특이적, 세포 유형 선호적, 유도성 프로모터 및 발달 제어 하에 있는 프로모터는 비구성적 프로모터이다. 발달 제어 하에 있는 프로모터의 예는 특정 조직에서 우선적으로 전사를 개시하는 프로모터를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유도성" 또는 "억제성" 프로모터는 화학적 또는 환경적 요인 제어 하에 있는 프로모터이다. 유도성 프로모터에 의해 전사에 영향을 줄 수 있는 환경 조건의 예는 혐기성 조건, 특정 화학물질, 빛의 존재, 산성 또는 염기성 조건 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "조직 특이적" 프로모터는 특정 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터이다. 유전자의 구성적 발현과 달리, 조직 특이적 발현은 유전자 조절의 여러 상호작용 수준의 결과이다. 따라서, 관련 기술 분야에서는 때때로 특정 조직에서 트랜스진(transgene)의 효율적이고 신뢰성 있는 발현을 달성하기 위해 상동성 또는 밀접하게 관련된 종으로부터의 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 이것은 학술 및 특허 문헌 둘 모두에서 발견된 다량의 조직 특이적 프로모터가 특정 조직으로부터 단리된 주된 이유 중 하나이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의해 조절되도록 하는, 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 회합을 말한다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 서열의 발현을 조절할 수 있는 경우(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절하에 있음) 코딩 서열과 작동 가능하게 연결된 것이다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 또 다른 예에서, 본 개시내용의 상보성 RNA 영역은 직접 또는 간접적으로, 표적 mRNA의 5' 또는 표적 mRNA의 3'에 또는 표적 mRNA 내에서 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 또는 제1 상보성 영역은 표적 mRNA의 5'에 존재하고, 그의 보체는 표적 mRNA의 3'에 존재한다.
본원에서 설명되는 방법에 의한 조절의 표적이 될 수 있는 하나의 형질은 질소 고정이다. 질소 비료는 농장에서 가장 큰 운영 비용이며, 옥수수 및 밀과 같이 줄을 맞추어 심는 작물에서 보다 높은 수확량을 가져오는 가장 큰 원동력이다. 본원에는 비콩과 작물에서 재생 가능한 형태의 질소를 전달할 수 있는 미생물 생성물이 기재되어 있다. 일부 식물내생체(endophyte)는 순수한 배양액에서 질소를 고정하는데 필요한 유전학을 가지고 있지만, 근본적인 기술적 도전은 곡류(cereal) 및 목초의 야생형 식물내생체가 시비한 재배지에서 질소 고정을 중단한다는 것이다. 재배지에서 화학 비료 및 잔류 질소 수준의 적용은 미생물에게 질소 고정을 위한 생화학적 경로를 차단하라는 신호를 주게 된다.
질소 고정 조절 네트워크의 전사 및 번역후 수준에 대한 변화는 비료의 존재 하에서 질소를 고정하여 옥수수에 전달할 수 있는 미생물을 개발하기 위해 필요하다. 이를 위해, 조절 네트워크를 정확하게 진화시키고 새로운 표현형을 유도하기 위한 숙주-미생물 진화(HoME: Host-Microbe Evolution) 기술이 본원에서 설명된다. 또한, 질소 스트레스 및 과량과 같은 상이한 환경 조건 하에서 미생물 및 숙주 식물의 상호작용을 둘러싼 광범위한 체학(omics) 데이터와 쌍을 이루는, 옥수수로부터 단리된 질소 고정 식물내생체의 특유한 독점적인 라이브러리도 본원에서 설명된다. 이것은 재배지에서 비료가 존재하는 경우에도 적극적으로 질소를 고정하는 미생물을 생산하기 위해 식물내생체의 유전자 조절 네트워크의 정밀한 진화를 가능하게 한다. 또한, 옥수수 뿌리 조직을 콜로니화하고 시비된 식물에 대한 질소를 생산하는 미생물 개발의 기술 잠재력에 대한 평가 및 현재의 질소 관리 전략에 미생물을 통합할 타당성을 결정하기 위한 표준 제제 기법 및 다양한 토양과 식물내생체의 적합성 평가가 본원에서 설명된다.
화학적 합성을 위해 원소 질소(N)를 이용하기 위해서, 생명체는 대기에서 이용 가능한 질소 가스(N2)를 질소 고정으로 알려진 과정에서 수소와 조합한다. 생물학적 질소 고정의 에너지 집약적 특성 때문에, 디아조 영양 생물(diazotroph)(대기 질소 가스를 고정하는 박테리아 및 고세균)은 환경 산소 및 가용 질소에 대한 반응으로 정교하고 엄격한 nif 유전자 클러스터의 조절을 진화시켰다. nif 유전자는 질소 고정에 관여하는 효소(예컨대, 니트로게나제 복합체) 및 질소 고정을 조절하는 단백질을 코딩한다. 문헌 [Shamseldin (2013. Global J. Biotechnol. Biochem. 8(4):84-94)]은 nif 유전자 및 그의 생성물에 대한 상세한 설명을 개시하고 있고, 본원에 참고로 포함된다. 제1 식물로부터 박테리아를 단리하는 단계, 단리된 박테리아의 nif 유전자에 유전자 변이를 도입하는 단계, 제2 식물을 변이체 박테리아에 노출시키는 단계, 제1 식물에 비해 개선된 형질을 갖는 제2 식물로부터 박테리아를 단리하는 단계, 및 제2 식물로부터 단리된 박테리아를 사용하여 단계를 반복하는 단계를 포함하는, 개선된 형질을 갖는 식물을 생성하는 방법이 본원에서 설명된다.
프로테오박테리아(Proteobacteria)에서, 질소 고정의 조절은 nif 클러스터의 양성 전사 조절제인 σ54-의존성 인핸서 결합 단백질 NifA 주위에 집중된다. 활성 NifA의 세포내 수준은 nifLA 오페론의 전사 및 NifL과의 단백질-단백질 상호작용에 의한 NifA 활성의 억제라는 두 가지 주요 인자에 의해 제어된다. 이 두 과정은 모두 PII 단백질 신호전달 캐스케이드를 통해 세포내 글루타민 수준에 반응한다. 이 캐스케이드는 글루타민을 직접 감지하고 결합된 글루타민의 부재 또는 존재 각각에 대한 반응으로 2개의 PII 조절 단백질, 즉 GlnB 및 GlnK의 우리딜릴화 또는 탈우리딜릴화를 촉매화한다. 질소 과잉의 조건 하에서, 변형되지 않은 GlnB는 nifLA 프로모터의 불활성화의 신호를 전달한다. 그러나, 질소 제한 조건 하에서, GlnB는 번역 후 변형되어, 그의 활성을 억제하고 nifLA 오페론의 전사를 유도한다. 이 방식에서, nifLA 전사는 PII 단백질 신호전달 캐스케이드를 통해 환경 질소에 반응하여 긴밀하게 제어된다. NifA 조절의 번역 후 수준에서, GlnK는 세포 내에서 자유 GlnK의 전체 수준에 의존하는 방식으로 NifL/NifA 상호작용을 억제한다.
NifA는 nifLA 오페론으로부터 전사되고, 그의 프로모터는 또 다른 σ54-의존성 조절제인 인산화된 NtrC에 의해 활성화된다. NtrC의 인산화 상태는 탈우리딜릴화된 GlnB와 상호작용하지만 우리딜릴화된 GlnB와는 상호작용하지 않는 히스티딘 키나제 NtrB에 의해 매개된다. 질소 과잉의 조건 하에서, 글루타민의 높은 세포내 수준은 GlnB의 탈우리딜릴화를 유도하고, 이것은 이어서 NtrB와 상호작용하여 그의 인산화 활성을 불활성화하고 그의 포스파타제 활성을 활성화하여 NtrC의 탈인산화 및 nifLA 프로모터의 불활성화를 초래한다. 그러나, 질소 제한 조건 하에서, 낮은 수준의 세포내 글루타민은 GlnB의 우리딜릴화를 유도하고, 이것은 그의 NtrB와의 상호작용을 억제하고 NtrC의 인산화 및 nifLA 오페론의 전사를 허용한다. 이러한 방식으로, nifLA 발현은 PII 단백질 신호전달 캐스케이드를 통해 환경 질소에 반응하여 긴밀하게 제어된다. nifA , ntrB, ntrC , 및 glnB는 본원에서 설명되는 방법으로 돌연변이될 수 있는 모든 유전자이다.
NifA의 활성은 또한 환경 질소에 반응하여 번역 후에, 가장 전형적으로는 NifA 활성의 NifL 매개 억제를 통해 조절된다. 일반적으로, GlnK와 NifL/NifA 사이의 상호작용의 특성이 디아조 영양 생물 사이에서 유의하게 다르지만, NifL과 NifA의 상호작용은 GlnK를 통한 PII 단백질 신호전달 캐스케이드의 영향을 받는다. 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)에서, GlnK의 두 형태는 모두 NifL/NifA 상호작용을 억제하고, GlnK와 NifL/NifA 사이의 상호작용은 세포 내의 자유 GlnK의 전체 수준에 의해 결정된다. 질소 과잉 조건 하에서, 탈우리딜릴화된 GlnK는 암모늄 수송체 AmtB와 상호작용하여 AmtB에 의한 암모늄 흡수를 차단하고 GlnK를 막에 격리시켜 NifL에 의한 NifA의 억제를 허용한다. 다른 한편으로, 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii)에서는, 탈우리딜릴화된 GlnK와의 상호작용은 NifL/NifA 상호작용 및 NifA 억제 둘 모두에 필요한 반면, GlnK의 우리딜릴화는 그의 NifL과의 상호작용을 억제한다. nifL 유전자가 결여된 디아조 영양 생물에서, NifA 활성이 질소 과잉 조건 하에서 GlnK와 GlnB 둘 모두의 탈우리딜릴화된 형태와의 상호작용에 의해 직접 억제된다는 증거가 있다. 메커니즘에 관계없이, NifA의 번역 후 억제는 대부분의 알려진 디아조 영양 생물에서 nif 클러스터의 중요한 조절제이다. 추가로, nifL , amtB , 및 glnK는 본원에서 설명되는 방법에서 돌연변이될 수 있는 유전자이다.
nif 유전자 클러스터의 전사를 조절하는 것 이외에, 많은 디아조 영양 생물은 니트로게나제 차단(shutoff)으로 알려진 니트로게나제 효소 자체의 직접적인 번역 후 변형 및 억제를 위한 메카니즘을 진화시켰다. 이것은 질소 과잉 조건 하에서 Fe 단백질(NifH)의 ADP-리보실화에 의해 매개되며, 이는 그의 MoFe 단백질 복합체(NifDK)와의 상호작용을 붕괴시키고 니트로게나제 활성을 없앤다. DraG는 Fe 단백질의 ADP-리보실화 및 니트로게나제의 차단을 촉매화하는 반면, DraG는 ADP-리보스의 제거 및 니트로게나제의 재활성화를 촉매화한다. nifLA 전사 및 NifA 억제와 마찬가지로, 니트로게나제 차단 또한 PII 단백질 신호전달 캐스케이드를 통해 조절된다. 질소 과잉 조건 하에서, 탈우리딜릴화된 GlnB는 DraT와 상호작용하고 이를 활성화하는 반면, 탈우리딜릴화된 GlnK는 DraG 및 AmtB 둘 모두와 상호작용하여 복합체를 형성하고, DraG를 막에 격리시킨다. 질소 제한 조건 하에서, GlnB 및 GlnK의 우리딜릴화된 형태는 각각 DraT 및 DraG와 상호작용하지 않으며, DraT의 불활성화 및 DraG의 Fe 단백질로의 확산을 유도하고, 이것은 ADP-리보스를 제거하고 니트로게나제를 활성화한다. 본원에서 설명되는 방법은 또한 nifH, nifD, nifK, 및 draT 유전자에 유전자 변이를 도입하는 것을 고려한다.
일부 식물내생체는 시험관 내에서 질소를 고정하는 능력을 갖지만, 종종 외인성 화학 비료의 높은 수준에 의해 유전학이 재배지에서 침묵화된다. 재배지 기반의 질소 고정을 용이하게 하기 위해 니트로게나제 효소의 발현으로부터 외인성 질소의 감지를 분리할 수 있다. 시간 경과에 따른 전체 니트로게나제 활성을 개선하는 것은 추가로 작물에 의한 이용을 위한 질소의 생산을 증가시키는 역할을 한다. 본원에서 설명되는 방법을 사용하여 재배지 기반 질소 고정을 용이하게 하는 유전자 변이에 대한 특정 표적은 nifA , nifL , ntrB , ntrC , glnA , glnB , glnK , draT , amtB , glnD , glnE , nifJ , nifH , nifD, nifK , nifY , nifE , nifN , nifU , nifS , nifV , nifW , nifZ , nifM , nifF , nifB , 및 nifQ로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함한다.
본원에서 설명되는 방법을 사용하여 재배지 기반 질소 고정을 용이하게 하는 유전자 변이를 위한 추가의 표적은 NifA 단백질이다. NifA 단백질은 전형적으로 질소 고정 유전자의 발현을 위한 활성제이다. NifA의 생산량 증가(구성적으로 또는 높은 암모니아 조건 동안)는 천연 암모니아 감지 경로를 우회한다. 또한, NifA의 알려진 억제제인 NifL 단백질의 생성을 감소시키면, 자유 활성 NifA의 수준이 증가한다. 또한, nifAL 오페론의 전사 수준을 증가시키면(구성적으로 또는 높은 암모니아 조건 동안), NifA 단백질의 전체적인 수준이 더 높아진다. 상승한 nifAL 발현 수준은 프로모터 자체를 변경하거나 NtrB의 발현(원래는 높은 질소 조건 동안 nifAL 오페론을 차단하는 NtrB 및 ntrC 신호전달 캐스케이드의 일부)을 감소시킴으로써 달성된다. 본원에서 설명되는 이들 또는 임의의 다른 방법에 의해 달성되는 높은 수준의 NifA는 식물내생체의 질소 고정 활성을 증가시킨다.
본원에서 설명되는 방법을 사용하여 재배지 기반 질소 고정을 용이하게 하는 유전자 변이의 또 다른 표적은 GlnD/GlnB/GlnK PII 신호전달 캐스케이드이다. 세포내 글루타민 수준은 GlnD/GlnB/GlnK PII 신호전달 캐스케이드를 통해 감지된다. GlnD의 우리딜릴 제거 활성을 무능화하는 GlnD의 활성 부위 돌연변이는 질소 감지 캐스케이드를 붕괴시킨다. 또한, GlnB 농도의 감소는 글루타민 감지 캐스케이드를 단축시킨다. 이러한 돌연변이는 세포를 질소 제한 상태를 인식하도록 속여, 질소 고정 수준 활성을 증가시킨다.
amtB 단백질이 또한 본원에서 설명되는 방법을 사용하여 재배지 기반 질소 고정을 용이하게 하기 위한 유전자 변이의 표적이다. amtB 단백질의 발현 수준을 감소시킴으로써 환경으로부터의 암모니아 흡수를 감소시킬 수 있다. 세포내 암모니아가 없다면, 식물내생체는 높은 수준의 암모니아를 감지할 수 없으므로, 질소 고정 유전자의 하향 조절을 방지한다. 세포내 구획으로 들어간 임의의 암모니아는 글루타민으로 전환된다. 세포내 글루타민 수준은 질소 감지의 주요 척도이다. 세포내 글루타민 수준을 감소시키면, 세포가 환경에서 높은 암모늄 농도를 감지하지 못하게 된다. 이것은 글루타민을 글루타메이트로 전환시키는 효소인 글루타미나제의 발현 수준을 증가시킴으로써 가능해진다. 또한, 세포내 글루타민은 또한 글루타민 신타제(암모니아를 글루타민으로 전환시키는 효소)를 감소시킴으로써 감소될 수 있다. 디아조 영양 생물에서, 고정된 암모니아는 신속하게 글루타민 및 글루타메이트로 동화되어 세포 과정에 사용된다. 암모니아 동화 작용에 장애가 발생하면, 고정된 질소를 암모니아로서 세포로부터 방출되도록 전환할 수 있다. 고정된 암모니아는 glnA에 의해 코딩되는 글루타민 합성효소(GS)에 의해 글루타민으로 주로 동화되고, 이어서 글루타민 옥소글루타레이트 아미노트랜스퍼라제(GOGAT)에 의해 글루타민으로 동화된다. 일부 예에서, glnS는 글루타민 합성효소를 코딩한다. GS는 각각 그의 아데닐릴 트랜스퍼라제(AT) 및 아데닐릴 제거(AR) 도메인의 활성을 통해 GS의 아데닐릴화 및 탈아데닐릴화 둘 모두를 촉매화하는, glnE에 의해 코딩되는 이기능성 효소인 GS 아데닐릴 트랜스퍼라제(GlnE)에 의해 번역 후 조절된다. 질소 제한 조건 하에서, glnA가 발현되고, GlnE의 AR 도메인은 GS를 탈아디닐릴화하여 이를 활성화한다. 질소 과잉의 조건 하에서, glnA 발현은 꺼지고, GlnE의 AT 도메인은 글루타민에 의해 알로스테릭하게(allosterically) 활성화되어 GS의 아데닐릴화 및 불활성화를 야기한다.
또한, draT 유전자가 본원에서 설명되는 방법을 사용하여 재배지 기반 질소 고정을 용이하게 하는 유전자 변이의 표적일 수 있다. 일단 질소 고정 효소가 세포에 의해 생성되면, 니트로게나제 차단은 세포가 고 질소 조건에서 고정 활성을 하향조절하는 또 다른 수준을 나타낸다. 상기 차단은 DraT의 발현 수준을 감소시킴으로써 제거될 수 있다.
새로운 미생물 표현형을 부여하는 방법은 전사, 번역 및 번역 후 수준에서 수행될 수 있다. 전사 수준은 프로모터에서의 변화(예컨대, 시그마 인자 친화도 또는 프로모터의 전부 또는 일부의 결실을 포함하는 전사 인자에 대한 결합 부위의 변화) 또는 전사 종결자 및 감쇠제(attenuator)의 변화를 포함한다. 번역 수준은 리보솜 결합 부위의 변화 및 mRNA 분해 신호의 변화를 포함한다. 번역 후 수준은 효소의 활성 부위의 돌연변이 및 단백질-단백질 상호작용의 변화를 포함한다. 이러한 변화는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 발현 수준의 감소(또는 완전한 무능화)는 천연 리보솜 결합 부위(RBS) 또는 프로모터를 더 낮은 강도/효율을 갖는 또 다른 것으로 교체함으로써 달성될 수 있다. ATG 출발 부위는 GTG, TTG 또는 CTG 출발 코돈으로 교체되어, 코딩 영역의 번역 활동이 감소될 수 있다. 발현의 완전한 무능화는 유전자의 코딩 영역을 낙아웃(결실)함으로써 수행될 수 있다. 개방 해독 프레임(ORF)의 프레임쉬프팅(frameshifting)은 ORF를 따라 조기 정지 코돈을 초래하여, 비기능적 말단절단 생성물을 생성할 것이다. 인-프레임(in-frame) 정지 코돈의 삽입이 또한 유사하게 비기능적 말단절단 생성물을 생성할 것이다. 특정 유전자의 유효 농도를 감소시키기 위해 N 또는 C 말단에 분해 태그를 부가할 수도 있다.
반대로, 본원에서 설명되는 유전자의 발현 수준은 보다 강한 프로모터를 사용함으로써 달성될 수 있다. 고 질소 수준 조건(또는 임의의 다른 조건) 동안 높은 프로모터 활성을 보장하기 위해, 높은 질소 수준 조건에서 전체 게놈의 전사 프로파일을 수득할 수 있고, 약한 프로모터를 대체하기 위해 원하는 전사 수준을 갖는 활성 프로모터를 그 데이터세트로부터 선택할 수 있다. 약한 출발 코돈은 보다 좋은 번역 개시 효율을 위해 ATG 출발 코돈으로 교체될 수 있다. 약한 리보솜 결합 부위(RBS)는 또한 보다 높은 번역 개시 효율을 갖는 상이한 RBS로 교체될 수 있다. 또한, 부위 특이적 돌연변이 유발을 수행하여 효소의 활성을 변경할 수도 있다.
식물에서 발생하는 질소 고정의 수준을 증가시키면, 작물 생산에 필요한 화학 비료의 양을 감소시키고 온실 가스 배출(예를 들어, 아산화질소)을 감소시킬 수 있다.
연속적인 계배배양
식물 형질(예를 들어, 질소 고정)을 개선하는 박테리아의 생산은 연속적인 계배배양을 통해 달성될 수 있다. 이것은 하나 이상의 식물에 하나 이상의 개선된 형질을 부여할 수 있는 박테리아 및/또는 조성물을 확인하는 것 이외에, 미생물총(microbial flora)에 의해 영향을 받는 특정한 개선된 형질을 갖는 식물을 선택함으로써 행해질 수 있다. 식물 형질을 개선하는 박테리아를 생산하는 하나의 방법은 (a) 제1 식물의 조직 또는 토양으로부터 박테리아를 단리하는 단계; (b) 하나 이상의 변이체 박테리아를 생산하기 위해 하나 이상의 박테리아에 유전자 변이를 도입하는 단계; (c) 다수의 식물을 변이체 박테리아에 노출시키는 단계; (d) 다수의 식물 중 하나의 조직 또는 토양으로부터 박테리아를 단리하는 단계로서, 그로부터 박테리아가 단리된 식물은 다수의 식물에서 다른 식물에 비해 개선된 형질을 갖는 것인 단계; 및 (e) 개선된 형질을 갖는 식물로부터 단리된 박테리아(단계 (d))를 사용하여 단계 (b) 내지 (d)를 반복하는 단계를 포함한다. 단계 (b) 내지 (d)는 식물의 개선된 형질이 원하는 수준에 도달할 때까지 임의의 횟수(예컨대, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 10회, 또는 그 초과)로 반복될 수 있다. 또한, 다수의 식물은 2개 초과의 식물, 예컨대 10개 내지 20개의 식물 또는 20개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 300개 이상, 500개 이상, 또는 1000개 이상의 식물일 수 있다.
개선된 형질을 갖는 식물을 수득하는 것 이외에, 하나 이상의 유전자(예를 들어, 질소 고정을 조절하는 유전자)에 도입된 하나 이상의 유전자 변이를 포함하는 박테리아를 포함하는 박테리아 군집이 수득된다. 위에 설명된 단계를 반복함으로써, 관심 식물 형질과 상관관계가 있는 집단의 가장 적절한 구성원을 포함하는 박테리아 군집을 수득할 수 있다. 이 집단 내의 박테리아는 예컨대 유전학 및/또는 표현형 분석에 의해 확인되고 유익한 특성이 결정될 수 있다. 유전 분석은 단계 (a)에서 단리된 박테리아에 대해 수행될 수 있다. 표현형 및/또는 유전자형 정보는 다음을 포함하는 기술을 사용하여 얻을 수 있다: 식물 기원의 화학 성분의 고효율 스크리닝, 유전 물질의 고효율 서열결정을 포함하는 서열결정 기술, 차등 디스플레이 기술(DDRT-PCR 및 DD-PCR 포함), 핵산 마이크로어레이 기술, RNA-seq(전체 총전사체 샷건 서열결정(Whole Transcriptome Shotgun Sequencing)) 및 qRT-PCR(정량적 실시간 PCR). 얻어진 정보는 계통 발생 분석 또는 rRNA 오페론의 구성 요소 또는 다른 분류학적 정보 제시 유전자좌를 인코딩하는 핵산의 마이크로어레이 기반 스크리닝과 같은, 존재하는 박테리아의 정체 및 활성에 대한 군락 프로파일링 정보를 얻기 위해 사용할 수 있다. 분류학적 정보 제시 유전자좌의 예는 16S rRNA 유전자, 23S rRNA 유전자, 5S rRNA 유전자, 5.8S rRNA 유전자, 12S rRNA 유전자, 18S rRNA 유전자, 28S rRNA 유전자, gyrB 유전자, rpoB 유전자, fusA 유전자, recA 유전자, coxl 유전자, nifD 유전자를 포함한다. 집단에 존재하는 분류군을 결정하기 위한 분류학적 프로파일링 과정의 예가 US20140155283에 기재되어 있다. 박테리아 확인은 하나 이상의 유전자 또는 하나 이상의 신호전달 경로, 예컨대 질소 고정 경로와 관련된 유전자의 활성을 특징짓는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상이한 박테리아 종 사이의 상승작용적 상호작용(조합에 의해 두 성분이 첨가된 양보다 많은 수준으로 원하는 효과를 증가시키는 경우)이 박테리아 군집에 존재할 수 있다.
유전자 변이는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자일 수 있다: nifA , nifL, ntrB , ntrC , glnA , glnB , glnK , draT , amtB , glnD , glnE , nifJ , nifH , nifD , nifK, nifY , nifE , nifN , nifU , nifS , nifV , nifW , nifZ , nifM , nifF , nifB , 및 nifQ. 상기 유전자 변이는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 내의 변이일 수 있다: 글루타민 합성효소, 글루타미나제, 글루타민 합성효소 아데닐릴트랜스퍼라제, 전사 활성제, 항전사 활성제, 피루베이트 플라보독신 산화환원효소, 플라보독신, 또는 NAD+-이질소-환원효소 aDP-D-리보실트랜스퍼라제. 유전자 변이는 다음 중 하나 이상을 초래하는 돌연변이일 수 있다: NifA 또는 글루타미나제의 발현 또는 활성의 증가; NifL, NtrB, 글루타민 합성효소, GlnB, GlnK, DraT, AmtB의 발현 또는 활성의 감소; GlnE의 아데닐릴 제거 활성의 감소; 또는 GlnD의 우리딜릴 제거 활성의 감소. 유전자 변이를 도입하는 것은 표적 부위에서 하나 이상의 뉴클레오티드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 방법의 하나 이상의 박테리아에 도입된 유전자 변이는 낙아웃 돌연변이(예를 들어, 프로모터의 결실, 조기 정지 코돈을 생성하기 위한 삽입 또는 결실, 전체 유전자의 결실)일 수 있거나, 단백질 도메인의 제거 또는 무능화(예를 들어, 활성 부위에 영향을 주는 점 돌연변이, 또는 단백질 산물의 관련 부분을 코딩하는 유전자의 부분의 결실)일 수 있거나, 또는 표적 유전자의 조절 서열을 변경 또는 무능화할 수 있다. 이종성 조절 서열 및 유전자 변이가 도입된 박테리아에 대응하는 박테리아 종 또는 속의 게놈 내에서 발견되는 조절 서열을 포함하는 하나 이상의 조절 서열이 또한 삽입될 수 있다. 더욱이, 조절 서열은 박테리아 배양액 또는 식물 조직 내에서의 유전자 발현 수준에 기초하여 선택될 수 있다. 유전자 변이는 표적 부위에 특이적으로 도입된 미리 결정된 유전자 변이일 수 있다. 유전자 변이는 표적 부위 내의 무작위 돌연변이일 수 있다. 유전자 변이는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실일 수 있다. 어떤 경우에는, 형질 개선을 평가하기 위해 박테리아를 식물에 노출시키기 전에 다수의 상이한 유전자 변이(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10개 또는 그 초과)를 하나 이상의 격리된 박테리아 내에 도입한다. 다수의 유전자 변이는 임의의 상기 유형, 동일하거나 상이한 유형, 및 임의의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 다수의 상이한 유전자 변이가 연속적으로 도입되고, 여기서 제1 단리 단계 후에 제1 유전자 변이를 도입하고, 제2 단리 단계 후에 제2 유전자 변이를 도입하는 단계 등을 수행함으로써 박테리아에 다수의 유전자 변이를 축적시켜 관련 식물에 대해 점진적으로 개선된 형질을 부여한다.
일반적으로, "유전자 변이"라는 용어는 참조 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 참조 게놈 또는 그의 일부, 또는 참조 유전자 또는 그의 일부에 비해 폴리뉴클레오티드 서열에 도입된 임의의 변화를 의미한다. 유전자 변이는 "돌연변이"로 언급될 수 있고, 유전자 변이를 포함하는 서열 또는 유기체는 "유전자 변이체" 또는 "돌연변이체"로 지칭될 수 있다. 유전자 변이는 유전자 발현, 대사 및 세포 신호전달을 비롯한 일부 생물학적 활성의 증가 또는 감소와 같은 여러 가지 효과를 가질 수 있다. 유전자 변이는 표적 부위에 특이적으로 도입되거나, 무작위로 도입될 수 있다. 유전자 변이를 도입하기 위해 다양한 분자 도구 및 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 돌연변이 유발, 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발, 포화 돌연변이 유발, 단편 셔플링(shuffling) 돌연변이 유발, 상동성 재조합, CRISPR/Cas9 시스템, 화학적 돌연변이 유발 및 이들의 조합을 통해 유전자 변이를 도입할 수 있다. 유전자 변이를 도입하는 화학적 방법은 DNA를 화학적 돌연변이 유발원, 예를 들어 에틸 메탄술포네이트(EMS), 메틸 메탄술포네이트(MMS), N-니트로소우레아(ENU), N-메틸-N-니트로-N'-니트로소구아니딘, 4-니트로퀴놀린 N-옥시드, 디에틸술페이트, 벤조피렌, 시클로포스파미드, 블레오마이신, 트리에틸멜라민, 아크릴아미드 단량체, 질소 머스타드, 빈크리스틴, 디에폭시알칸(예를 들어, 디에톡시부탄), ICR-170, 포름알데히드, 프로카르바진 히드로클로라이드, 에틸렌 옥시드, 디메틸니트로사민, 7,12 디메틸벤즈(a)안트라센, 클로람부실, 헥사메틸포스포르아미드, 비술판 등에 노출시키는 것을 포함한다. 방사선 돌연변이 유발제는 자외선, γ-선, X-선 및 고속 중성자 폭격을 포함한다. 유전자 변이는 또한 예를 들어 자외선과 함께 트리메틸소랄렌을 사용하여 핵산에 도입될 수 있다. 이동 가능한 DNA 요소, 예를 들면, 전위(transposable) 요소의 무작위 또는 표적화된 삽입은 유전자 변이를 생성하는 또 다른 적합한 방법이다. 유전자 변이는 예를 들어 오류가 발생하기 쉬운(error-prone) PCR과 같은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술을 사용하여 무세포 시험관 내 시스템에서 증폭하는 동안 핵산에 도입될 수 있다. 유전자 변이는 DNA 셔플 기술(엑손 셔플링, 도메인 교환 등)을 사용하여 시험관 내에서 핵산에 도입할 수 있다. 유전자 변이는 또한 세포에서 DNA 복구 효소가 결핍된 결과로서 핵산에 도입될 수 있고, 예를 들어, 돌연변이체 DNA 복구 효소를 인코딩하는 돌연변이체 유전자의 세포 내 존재는 세퐁 게놈 내에서 높은 빈도의 돌연변이(즉, 약 1개 돌연변이/100개 유전자 내지 약 1개 돌연변이/10,000개 유전자)를 생성할 것으로 예상된다. DNA 복구 효소를 인코딩하는 유전자의 예는 Mut H, Mut S, Mut L 및 Mut U, 및 다른 종에서의 그의 상동체(예를 들어, MSH 1 6, PMS 1 2, MLH 1, GTBP, ERCC-1 등)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 유전자 변이를 도입하기 위한 다양한 방법에 대한 예시적인 설명은 문헌 [Stemple (2004) Nature 5:1-7]; [Chiang et al. (1993) PCR Methods Appl 2(3): 210-217]; [Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751]; 및 미국 특허 제6,033,861호 및 제6,773,900호에 제시되어 있다.
순환 증폭 기술로서, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 돌연변이 유발은 돌연변이 유발 프라이머를 사용하여 원하는 돌연변이를 도입한다. PCR은 변성, 어닐링 및 연장의 사이클에 의해 수행된다. PCR에 의한 증폭 후, 돌연변이된 DNA의 선택 및 모 플라스미드 DNA의 제거는 다음에 의해 수행될 수 있다: 1) PCR 동안 히드록시메틸화된 dCTP에 의해 dCTP를 치환한 후, 제한 효소를 사용한 소화에 의해 비히드록시메틸화된 모 DNA만을 제거하는 단계; 2) 항생제 내성 유전자와 연구된 유전자 둘 모두의 동시 돌연변이 유발에 의해 플라스미드를 상이한 항생제 내성으로 변화시키는 단계(여기서, 새로운 항생제 내성은 이후 원하는 돌연변이의 선택을 용이하게 함); 3) 원하는 돌연변이를 도입한 후, 메틸화된 DNA만을 절단하는 제한 효소 Dpn1에 의해 모 메틸화된 주형 DNA를 절단하여, 돌연변이 유발된 비메틸화된 사슬이 회수되는 단계; 또는 4) 돌연변이된 DNA의 형질전환 효율을 증가시키기 위한 추가의 라이게이션 반응에서 돌연변이된 PCR 산물의 고리화. 예시적인 방법에 대한 추가의 설명은 예를 들어, US7132265, US6713285, US6673610, US6391548, US5789166, US5780270, US5354670, US5071743, 및 US20100267147에서 볼 수 있다.
부위 지정(site-directed) 돌연변이 유발이라고도 불리는 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발은 전형적으로 합성 DNA 프라이머를 이용한다. 이 합성 프라이머는 원하는 돌연변이를 포함하고, 돌연변이 부위 주위의 주형 DNA와 상보성이므로 관심 유전자 내의 DNA와 혼성화할 수 있다. 돌연변이는 단일 염기 변화(점 돌연변이), 다중 염기 변화, 결실 또는 삽입, 또는 이들의 조합일 수 있다. 이어서, 단일 가닥 프라이머는 유전자의 나머지를 복제하는 DNA 폴리머라제를 사용하여 연장된다. 이렇게 복제된 유전자는 돌연변이된 부위를 포함하고, 벡터로서 숙주 세포에 도입되어 클로닝될 수 있다. 마지막으로, 돌연변이체는 원하는 염기 서열을 포함하고 있는지 확인하기 위해 DNA 서열결정에 의해 선택될 수 있다.
유전자 변이는 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 사용하여 도입될 수 있다. 이 기술에서, 관심 유전자는 서열 복제의 정확성이 부족한 조건 하에서 DNA 폴리머라제를 이용하여 증폭된다. 그 결과, 증폭 산물은 서열에서 적어도 하나의 오류를 포함한다. 유전자가 증폭되고 생성되는 반응 생성물(들)이 주형 분자와 비교할 때 서열에 하나 이상의 변경을 포함할 때, 생성된 생성물은 주형과 비교하여 돌연변이 유발된 것이다. 무작위 돌연변이를 도입하는 또 다른 수단은 니트로소구아니딘 또는 에틸 메탄술포네이트와 같은 화학적 돌연변이 유발원에 세포를 노출시키는 것이고(Nestmann, Mutat Res 1975 June; 28(3):323-30), 이어서 유전자를 함유하는 벡터가 숙주로부터 단리된다.
포화 돌연변이 유발은 유전자의 특정 부위 또는 좁은 영역에서 모든 또는 거의 모든 가능한 돌연변이를 생성하려고 하는 무작위 돌연변이 유발의 또 다른 형태이다. 일반적인 의미에서, 포화 돌연변이 유발은 돌연변이 유발될 한정된 폴리뉴클레오티드 서열(돌연변이 유발될 서열의 길이는 예를 들어 15 내지 100,000개 염기임)에서 돌연변이 유발 카세트의 완전한 세트(각각의 카세트의 길이는 예를 들어 1-500개 염기임)를 돌연변이 유발하는 것으로 이루어진다. 따라서, 일군의 돌연변이(예를 들어, 1 내지 100개의 돌연변이)가 돌연변이 유발되는 각각의 카세트에 도입된다. 하나의 카세트에 도입될 돌연변이의 분류는 1라운드의 포화 돌연변이 유발의 적용 동안 제2 카세트에 도입될 돌연변이의 제2 분류와 상이하거나 동일할 수 있다. 이러한 분류는 특정 코돈의 결실, 부가, 분류, 및 특정 뉴클레오티드 카세트의 분류에 의해 예시된다.
DNA 셔플링이라고도 하는 단편 셔플링 돌연변이 유발은 유익한 돌연변이를 빠르게 증식시키는 방법이다. 셔플링 과정의 예에서, DNAse는 모 유전자의 세트를, 예를 들어 약 50-100 bp 길이의 조각으로 단편화하기 위해 사용된다. 이어서, 프라이머가 없는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)이 수행되고 - 충분히 중복되는 상동성 서열을 갖는 DNA 단편은 서로 어닐링된 후, DNA 폴리머라제에 의해 연장된다. DNA 분자의 일부가 모 유전자의 크기에 도달한 후에, 상기 PCR 연장의 여러 라운드가 일어날 수 있다. 그런 다음, 이들 유전자를 또 다른 PCR로 증폭할 수 있고, 이번에는 가닥의 말단에 상보성이도록 설계된 프라이머를 첨가한다. 프라이머는 그의 5' 말단에 부가된 추가의 서열, 예컨대 클로닝 벡터 내로의 라이게이션에 필요한 제한 효소 인식 부위에 대한 서열을 가질 수 있다. 셔플링 기술의 추가의 예는 US20050266541에 제시되어 있다.
상동성 재조합 돌연변이 유발은 외인성 DNA 단편과 표적화된 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 재조합을 수반한다. 이중 가닥 판단이 발생한 후, 파단체의 5' 말단 부근의 DNA의 부분이 절제라고 불리는 과정에서 절단된다. 이어지는 가닥 침입 단계에서, 파단된 DNA 분자의 돌출형(overhanging) 3' 말단은 이어서 파단되지 않은 유사하거나 동일한 DNA 분자에 "침입"한다. 이 방법을 사용하여 유전자를 결실시키고, 엑손을 제거하고, 유전자를 부가하고, 점 돌연변이를 도입할 수 있다. 상동성 재조합 돌연변이 유발은 영구적이거나 조건적일 수 있다. 전형적으로, 재조합 주형이 또한 제공된다. 재조합 주형은 또 다른 벡터의 성분이거나, 별개의 벡터에 포함되거나, 별개의 폴리뉴클레오티드로서 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 주형은 부위 특이적 뉴클레아제에 의해 닉 형성되거나 절단된 표적 서열 내 또는 근처과 같이 상동성 재조합에서 주형으로 작용하도록 설계된다. 주형 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 길이, 예를 들어 약 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 일부분에 상보성이다. 최적으로 정렬되면, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드(예를 들어, 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드)와 중첩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 주형 서열 및 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 최적으로 정렬되는 경우, 주형 폴리뉴클레오티드의 가장 가까운 뉴클레오티드는 표적 서열로부터 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 내에 존재한다. 상동성 재조합 방법에 유용한 부위 지정 뉴클레아제의 비제한적인 예는 징크 핑거 뉴클레아제, CRISPR 뉴클레아제, TALE 뉴클레아제 및 메가뉴클레아제를 포함한다. 이러한 뉴클레아제의 용도에 대한 추가의 설명에 대해서는, 예를 들어 US8795965 및 US20140301990을 참조한다.
CRISPR/Cas9(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부)/CRISPR 관련(Cas) 시스템은 침입하는 핵산의 침묵화를 유도하기 위해 CRISPR RNA(crRNA)를 사용하여 바이러스 및 플라스미드에 대한 적응 면역을 박테리아 및 고세균에 제공한다. Cas9 단백질(또는 그의 기능적 등가물 및/또는 그의 변이체, 즉 Cas9 유사 단백질)은 천연적으로 crRNA 및 tracrRNA(가이드 RNA라고도 함)로 불리는 2개의 천연 생성 또는 합성 RNA 분자와 단백질의 회합에 의존하는 DNA 엔도뉴클레아제 활성을 함유한다. 일부 경우에, 두 분자가 공유 연결되어 단일 분자(단일 가이드 RNA("sgRNA")라고도 함)를 형성한다. 따라서, Cas9 또는 Cas9 유사 단백질은 Cas9 또는 Cas9 유사 단백질을 활성화하고 이 단백질을 표적 핵산 서열로 가이드하는 DNA 표적화 RNA(이 용어는 2분자 가이드 RNA 구성 및 단일 분자 가이드 RNA 구성을 모두 포함한다)와 회합한다. Cas9 또는 Cas9 유사 단백질이 그의 천연 효소 기능을 유지한다면, 이것은 표적 DNA를 절단하여 이중 가닥 파단을 생성하고, 이것은 게놈 변화(즉, 편집: 결실, 삽입(공여자 폴리뉴클레오티드가 존재할 때), 교체 등)를 일으켜 유전자 발현을 변경할 수 있다. Cas9의 일부 변이체(변이체는 용어 Cas9 유사에 의해 포함됨)는 DNA 절단 활성이 감소되도록 변형되었다(일부 경우에 이들은 표적 DNA의 두 가닥 대신에 단일 가닥을 절단하는 반면, 다른 경우에는 심하게 감소된 DNA 절단 활성을 갖거나 이 활성을 갖지 않는다). 유전자 변이를 도입하기 위한 CRISPR 시스템의 추가의 예시적인 설명은 예를 들어 US8795965에서 볼 수 있다.
화학적 돌연변이 유발원 또는 방사선을 포함하는, 주로 점 돌연변이 및 짧은 결실, 삽입, 전위(transversion) 및/또는 전이(transition)를 생성하는 돌연변이 유발원을 사용하여 유전자 변이를 생성할 수 있다. 돌연변이 유발원은 에틸 메탄술포네이트, 메틸메탄 술포네이트, N-에틸-N-니트로소우레아, 트리에틸멜라민, N-메틸-N-니트로소우레아, 프로카르바진, 클로람부실, 시클로포스파미드, 디에틸 술페이트, 아크릴아미드 단량체, 멜팔란, 질소 머스타드, 빈크리스틴, 디메틸니트로사민, N-메틸-N'-니트로-니트로소구아니딘, 니트로소구아니딘, 2-아미노퓨린, 7,12 디메틸-벤즈(a)안트라센, 에틸렌 옥시드, 헥사메틸포스포르아미드, 비술판, 디에폭시알칸(디에폭시옥탄, 디에폭시부탄 등), 2-메톡시-6-클로로-9-[3-(에틸-2-클로로-에틸)아미노프로필아미노]아크리딘 디히드로클로라이드 및 포름알데히드를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
유전자 변이를 도입하는 것은 불완전한 공정일 수 있고, 따라서 처리된 박테리아 군집에서 일부 박테리아는 원하는 돌연변이를 보유하는 반면에, 다른 박테리아는 그렇지 않다. 일부 경우에, 원하는 유전자 변이를 보유하는 박테리아를 풍부하게 하기 위해 선택 압력을 가하는 것이 바람직하다. 전통적으로, 성공적인 유전자 변이체에 대한 선택은 항생제 내성 유전자를 삽입하거나 치명적이지 않은 화합물을 치명적인 대사산물로 전환할 수 있는 대사 활성을 무능화하는 경우와 같이, 유전자 변이에 의해 부여되거나 무능화되는 일부 기능에 대한 선택을 수반하였다. 또한, 원하는 유전자 변이만 도입될 필요가 있도록(예를 들어, 선택 가능한 마커를 또한 요구하지 않으면서), 폴리뉴클레오티드 서열 자체에 기초한 선택 압력을 적용할 수 있다. 이 경우, 선택 압력은 유전자 변이가 도입될 참조 서열에 대한 선택이 효과적으로 유도되도록, 표적 부위에 도입된 유전자 변이가 결여된 게놈을 절단하는 것을 포함할 수 있다. 전형적으로, 절단은 표적 부위의 100개 뉴클레오티드 내(예를 들어, 표적 부위에서 또는 표적 부위 내에서의 절단을 포함하여, 표적 부위로부터 75, 50, 25, 10개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 내)에서 발생한다. 절단은 징크 핑거 뉴클레아제, CRISPR 뉴클레아제, TALE 뉴클레아제(TALEN) 또는 메가뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된 부위 특이적 뉴클레아제에 의해 지시될 수 있다. 이러한 과정은 상동성 재조합을 위한 주형이 제공되지 않는 것을 제외하고는 표적 부위에서 상동성 재조합을 향상시키는 과정과 유사하다. 결과적으로, 원하는 유전자 변이가 결여된 박테리아는 절단을 겪을 가능성이 더 크고, 이것은 복구되지 않은 채로 유지되면 세포 사멸을 초래한다. 선택에서 생존한 박테리아는 이후 개선된 형질의 부여를 평가하기 위해 식물에 노출시키는 용도를 위해 단리될 수 있다.
CRISPR 뉴클레아제를 표적 부위에 대한 절단을 유도하기 위한 부위 특이적 뉴클레아제로 사용할 수 있다. 돌연변이된 미생물의 개선된 선택은 비돌연변이된 세포를 사멸시키기 위해 Cas9를 사용하여 얻을 수 있다. 이어서, 식물은 공생을 재확인하고 효율적인 공생자를 선택하는 진화 압력을 만들기 위해 돌연변이된 미생물을 접종한다. 이어서, 미생물은 식물 조직으로부터 재단리될 수 있다. 비변이체에 대한 선택을 위해 사용되는 CRISPR 뉴클레아제 시스템은 상동성 재조합을 위한 주형이 제공되지 않는다는 점을 제외하고는, 유전자 변이의 도입에 관하여 상기 설명된 것들과 유사한 요소를 사용할 수 있다. 따라서, 표적 부위에 대한 절단은 영향받은 세포의 사멸을 증가시킨다.
징크 핑커 뉴클레아제, TALE 뉴클레아제(TALEN) 시스템 및 메가뉴클레아제와 같은 표적 부위에서 특이적으로 절단을 유도하기 위한 다른 옵션이 이용 가능하다. 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)는 징크 핑거 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 생성된 인공 DNA 엔도뉴클레아제이다. ZFN은 원하는 DNA 서열을 표적으로 하도록 조작될 수 있고, 이것은 징크 핑거 뉴클레아제가 특유한 표적 서열을 절단할 수 있게 한다. 세포에 도입되면, ZFN은 이중 가닥 파단을 유도함으로써 세포(예를 들어, 세포의 게놈) 내의 표적 DNA를 편집하기 위해 사용될 수 있다. 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)는 TAL(전사 활성제 유사) 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 생성된 인공 DNA 엔도뉴클레아제이다. TALEN은 임의의 원하는 DNA 서열에 실질적으로 신속하게 결합하도록 조작될 수 있고, 세포에 도입되면, TALEN은 이중 가닥 파단을 유도함으로써 세포(예를 들어, 세포의 게놈) 내의 표적 DNA를 편집하기 위해 사용될 수 있다. 메가뉴클레아제(호밍(homing) 엔도뉴클레아제)는 큰 인식 부위(12 내지 40개 염기쌍의 이중 가닥 DNA 서열)를 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제이다. 메가뉴클레아제는 고도로 표적화된 방법으로 서열을 대체, 제거 또는 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 단백질 조작을 통해 그의 인식 서열을 변형함으로써, 표적화된 서열을 변경할 수 있다. 메가뉴클레아제는 박테리아, 식물 또는 동물의 모든 게놈 유형을 변형하는 데 사용할 수 있으며, 일반적으로 LAGLIDADG 패밀리, GIY-YIG 패밀리, His-Cyst 박스 패밀리 및 HNH 패밀리의 4개의 패밀리로 분류된다. 예시적인 호밍 엔도뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII을 포함한다.
본 개시내용의 방법은 하나 이상의 다양한 바람직한 형질을 도입하거나 개선하기 위해 사용될 수 있다. 도입되거나 개선될 수 있는 형질의 예는 다음을 포함한다: 뿌리 바이오매스, 뿌리 길이, 높이, 싹 길이, 잎 수, 물 사용 효율, 전체 바이오매스, 수확량, 과일 크기, 곡물 크기, 광합성 속도, 가뭄 내성, 내열성, 내염성, 선충 스트레스에 대한 내성, 진균 병원체에 대한 내성, 박테리아 병원체에 대한 내성, 바이러스 병원체에 대한 내성, 대사산물의 수준 및 단백질체(proteome) 발현. 높이, 전체 바이오매스, 뿌리 및/또는 싹 바이오매스, 종자 발아, 묘목 생존, 광합성 효율, 증산율, 종자/과일 수 또는 질량, 식물 곡물 또는 과일 수확량, 잎 엽록소 함량, 광합성 비율, 뿌리 길이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 바람직한 형질이 성장을 측정하기 위해 사용되고, 동일한 조건 하에서 성장한 참조 농업용 식물(예를 들어, 개선된 형질이 없는 식물)의 성장률과 비교될 수 있다. 도입되거나 개선되는 바람직한 형질은 본원에서 설명되는 질소 고정이다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 방법으로부터 생성된 식물은 토양에서 동일한 조건 하에서 성장되는 참조 농업용 식물보다 적어도 약 5% 이상, 예를 들어 적어도 약 5중량%, 적어도 약 8중량%, 적어도 약 10중량%, 적어도 약 15중량%, 적어도 약 20중량%, 적어도 약 25중량%, 적어도 약 30중량%, 적어도 약 40중량%, 적어도 약 50중량%, 적어도 약 60중량%, 적어도 약 75중량%, 적어도 약 80중량%, 적어도 약 80중량%, 적어도 약 90중량%, 또는 적어도 100중량%, 적어도 약 200중량%, 적어도 약 300중량%, 적어도 약 400% 또는 그 초과의 형질 차이를 보인다.
개선된 형질은 하나 이상의 생물적 또는 비생물적 스트레스 인자의 적용을 포함하는 조건 하에서 평가될 수 있다. 스트레스 인자의 예는 비생물적 스트레스(예컨대, 열 스트레스, 염 스트레스, 가뭄 스트레스, 저온 스트레스, 및 낮은 영양분 스트레스) 및 생물적 스트레스(예컨대, 선충 스트레스, 곤충 초식 스트레스, 진균 병원체 스트레스, 박테리아 병원체 스트레스 및 바이러스 병원체 스트레스)를 포함한다.
본 개시내용의 방법 및 조성물에 의해 개선된 형질은 이전에 질소 고정이 불가능한 식물에서의 것을 포함하는 질소 고정일 수 있다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 방법에 따라 단리된 박테리아는 식물 질소의 1% 이상(예를 들어, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20% 또는 그 초과)을 생산하고, 이것은 임의의 유전자 변이를 도입하기 전에 제1 식물로부터 단리된 박테리아에 비해 적어도 2배(예를 들어, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배, 100배, 1000배, 또는 그 초과)의 질소 고정 능력의 증가를 나타낼 수 있다. 일부 경우에는, 박테리아는 식물 질소의 5% 이상을 생산한다. 원하는 질소 고정 수준은 유전자 변이를 도입하는 단계, 다수의 식물에 노출시키는 단계, 및 개선된 형질을 갖는 식물로부터 박테리아를 단리하는 단계를 1회 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25회 또는 그 초과로) 반복한 후에 달성될 수 있다. 일부 경우에, 향상된 질소 고정 수준은 글루타민, 암모니아, 또는 질소의 다른 화학적 공급원으로 보충된 비료의 존재 하에 달성된다. 질소 고정의 정도를 평가하는 방법은 공지되어 있으며, 그 예가 본원에서 설명된다.
질소 고정
식물에서 질소 고정을 증가시키는 방법이 본원에서 설명되고, 이 방법은 질소 고정을 조절하는 하나 이상의 유전자에 도입된 하나 이상의 유전자 변이를 포함하는 박테리아에 식물을 노출시키는 단계를 포함하고, 여기서 박테리아는 식물에서 1% 이상(예를 들어, 2%, 5%, 10% 또는 그 초과)의 질소를 생산하고, 이것은 박테리아가 없는 식물에 비해 적어도 2배의 질소 고정 능력을 나타낼 수 있다. 박테리아는 글루타민 또는 암모니아로 보충된 비료의 존재 하에 질소를 생산할 수 있다. 유전자 변이는 임의의 수 및 임의의 조합으로 상기 제시된 예를 포함하는 본원에서 설명되는 임의의 유전자 변이일 수 있다. 유전자 변이는 nifA, nifL, ntrB, ntrC, 글루타민 합성효소, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, 글루타미나제, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, 및 nifQ로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 도입될 수 있다. 유전자 변이는 다음 중 하나 이상을 유도하는 돌연변이일 수 있다: NifA 또는 글루타미나제의 발현 또는 활성의 증가; NifL, NtrB, 글루타민 합성효소, glnB, glnK, draT, amtB의 발현 또는 활성의 감소; GlnE의 아데닐릴 제거 활성의 감소; 또는 GlnD의 우리딜릴 제거 활성의 감소. 본원에 개시된 방법의 하나 이상의 박테리아에 도입된 유전자 변이는 낙아웃 돌연변이일 수 있거나 또는 표적 유전자의 조절 서열을 무능화할 수 있거나, 또는 이종성 조절 서열의 삽입. 예를 들어, 동일한 박테리아 종 또는 속의 게놈 내에서 발견되는 조절 서열의 삽입을 포함할 수 있다. 조절 서열은 박테리아 배양액 또는 식물 조직 내에서 유전자의 발현 수준에 기초하여 선택될 수 있다. 유전자 변이는 화학적 돌연변이 유발에 의해 생성될 수 있다. 단계 (c)에서 성장한 식물은 생물적 또는 비생물적 스트레스 인자에 노출될 수 있다.
본원에서 설명되는 식물에서 발생하는 질소 고정의 양은 여러 가지 방법으로, 예를 들어 아세틸렌 환원(AR) 검정에 의해 측정될 수 있다. 아세틸렌 환원 검정은 시험 관 내에서 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 특정 박테리아가 식물에 고정된 질소를 제공한다는 증거는 다음을 포함할 수 있다: 1) 전체 식물의 N은 접종시에 유의하게 증가하며, 바람직하게는 식물에서의 N 농도의 증가와 함께 증가하고: 2) 질소 결핍 증상은 접종시 N 제한 조건 하에서 완화되고(건조 물질의 증가를 포함하여야 함), 3) N2 고정은 15N 방법(동위원소 희석 실험, 15N2 감소 검정 또는 15N 천연 풍부도 검정일 수 있음)을 사용하여 입증되고; 4) 고정된 N은 식물 단백질 또는 대사산물에 혼입되고; 5) 이러한 모든 효과는 접종되지 않은 식물에서 또는 접종 균주의 돌연변이체로 접종된 식물에서는 나타나지 않는다.
야생형 질소 고정 조절 캐스케이드는 입력 O2 및 NH4 +가 NOR 게이트를 통과하고 그 출력은 ATP와 함께 AND 게이트로 도입되는 디지털 논리 회로로 표시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 방법은 조절 캐스케이드의 여러 지점에서 이 회로에 대한 NH4 +의 영향을 차단하여, 미생물은 시비된 재배지에서도 질소를 생성할 수 있다. 그러나, 본원에서 개시되는 방법은 또한 ATP 또는 O2의 회로에 대한 영향을 변경하거나, 회로를 세포 내의 다른 조절 캐스케이드로 교체하거나, 질소 고정 이외의 다른 유전자 회로를 변경하는 것을 고려한다. 유전자 클러스터는 이종성 조절 시스템의 제어 하에 기능적 생성물을 생산하도록 재조작될 수 있다. 유전자 클러스터의 코딩 서열 외부 및 내부에서 천연 조절 요소를 제거하고 이를 대체 조절 시스템으로 대체함으로써, 복잡한 유전자 오페론 및 다른 유전자 클러스터의 기능적 생성물은 제어되고/되거나, 천연 유전자가 유래된 종 이외의 다른 종의 세포를 포함하는 이종성 세포로 이동될 수 있다. 재조직된 합성 유전자 클러스터는 유전자 회로 또는 다른 유도성 조절 시스템에 의해 제어될 수 있고, 따라서 원하는 대로 생성물의 발현을 제어할 수 있다. 발현 카세트는 논리 게이트, 펄스 발생기, 진동자(oscillator), 스위치 또는 메모리 장치로 작용하도록 설계될 수 있다. 제어 발현 카세트는 발현 카세트가 산소, 온도, 접촉, 삼투압 스트레스, 막 스트레스 또는 레독스 센서와 같은 환경 센서로서 기능하도록 프로모터에 연결될 수 있다.
예로서, nifL, nifA, nifT 및 nifX 유전자는 nif 유전자 클러스터로부터 제거될 수 있다. 합성 유전자는 각각의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA의 코돈 무작위 분류에 의해 설계될 수 있다. 코돈 사용 빈도는 천연 유전자의 코돈 사용 빈도로부터 가능한 한 한 벗어나는 것을 명시하는 코돈 선택이 수행된다. 제안된 서열은 제한 효소 인식 부위, 트랜스포존 인식 부위, 반복 서열, 시그마 54 및 시그마 70 프로모터, 크립틱(cryptic) 리보솜 결합 부위 및 로(rho) 독립적 종결자와 같은 임의의 바람직하지 않은 특징에 대해 조사된다. 합성 리보좀 결합 부위는 예컨대 유전자의 출발 코돈을 둘러싸고 있는 150 bp(-60 내지 +90)가 형광 유전자에 융합된 형광 리포터 플라스미드를 구축함으로써 대응하는 각각의 천연 리보솜 결합 부위의 강도와 일치하도록 선택된다. 이 키메라는 Ptac 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있으며, 형광은 유동 세포 계측법을 통해 측정된다. 합성 리보솜 결합 부위를 생성하기 위해, 합성 발현 카세트의 150 bp(-60 내지 +90)를 사용하는 리포터 플라스미드의 라이브러리가 생성된다. 간단히 설명하면, 합성 발현 카세트는 무작위 DNA 스페이서, RBS 라이브러리를 인코딩하는 축퇴성(degenerate) 서열 및 각각의 합성 유전자에 대한 코딩 서열로 이루어질 수 있다. 천연 리보솜 결합 부위와 가장 잘 일치하는 합성 리보솜 결합 부위를 확인하기 위해 다중 클론을 스크리닝한다. 따라서, 천연 오페론과 동일한 유전자로 이루어진 합성 오페론은 기능 보완을 위해 구축되고 시험된다. 합성 오페론의 추가의 예시적인 설명은 US20140329326에 제시되어 있다.
박테리아 종
본원에 개시된 방법 및 조성물에 유용한 미생물은 천연 식물의 표면 또는 조직으로부터 미생물을 추출하거나; 미생물을 단리하기 위해 종자를 연마하거나; 다양한 토양 샘플에 종자를 심고 조직으로부터 미생물을 회수하거나; 또는 외인성 미생물로 식물을 접종하고 어떤 미생물이 식물 조직에 나타나는지 결정하는 것에 의해 얻을 수 있다. 식물 조직의 비제한적인 예는 종자, 묘목, 잎, 절단체(cutting), 식물, 구근 또는 괴경을 포함한다. 일부 경우에, 박테리아가 종자로부터 단리된다. 샘플 처리를 위한 파라미터는 근권성, 식물착생체(epiphyte) 또는 식물내생체와 같은 연관 미생물의 상이한 유형을 단리하기 위해 다양할 수 있다. 박테리아는 제1 식물로부터 초기에 단리하는 대신에, 환경 균주 집단과 같은 저장소로부터 공급받을 수도 있다. 미생물은 단리된 미생물의 게놈을 서열결정하거나; 식물 내에 있는 집단의 구성을 프로파일링하거나; 집단 또는 단리된 미생물의 총전사체 기능을 특성화하거나; 또는 선택 또는 표현형 결정 배지를 사용하여 미생물 특징(예를 들어, 질소 고정 또는 포스페이트 가용 표현형)을 스크리닝함으로써 유전자형을 결정하고 표현형을 결정할 수 있다. 선택된 후보 균주 또는 집단은 서열 데이터; 표현형 데이터; 식물 데이터(예를 들어, 게놈, 표현형 및/또는 수확량 데이터); 토양 데이터(예를 들어, pH, N/P/K 함량 및/또는 벌크 토양 생물 집단); 또는 이들의 임의의 조합을 통해 얻을 수 있다.
본원에서 설명되는 박테리아 및 박테리아를 생산하는 방법은 손상된 식물 방어 반응을 유도하지 않으면서 잎 표면, 뿌리 표면 또는 식물 조직 내에서 효율적으로 자자 증식할 수 있는 박테리아 또는 식물 방어 반응에 저항성인 박테리아에 적용될 수 있다. 본원에서 설명되는 박테리아는 질소가 첨가되지 않은 배지에서 식물 조직 추출물 또는 잎 표면 세척액을 배양함으로써 단리될 수 있다. 그러나, 박테리아는 배양 가능하지 않거나, 배양 가능한 것으로 알려지지 않았거나, 관련 기술 분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 배양하기 어려울 수 있다. 본원에서 설명되는 박테리아는 식물내생체 또는 식물착생체 또는 식물 근권에 서식하는 박테리아(근권 박테리아)일 수 있다. 유전자 변이를 도입하는 단계, 복수의 식물에 대한 노출 단계, 및 개선된 형질을 갖는 식물로부터 박테리아를 단리하는 단계를 1회 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25회 또는 그 초과로) 반복한 후에 얻은 박테리아는 식물내생성, 식물착생성 또는 근권성일 수 있다. 식물내생체는 질병 증상을 일으키지 않거나 공생 구조의 형성을 유도하지 않으면서 식물의 내부로 들어가는 유기체로서, 식물 성장을 향상시키고(예를 들어, 질소 고정을 통해) 식물의 영양을 개선할 수 있기 때문에 작물학적 관심을 끌고 있다. 박테리아는 종자 전염성(seed-borne) 식물내생체일 수 있다. 종자 전염성 식물내생체는 성숙하고 건조하며 손상이 없는(예를 들어, 균열, 가시적인 진균 감염 또는 조기 발아가 없는) 종자에서 발견되는 종자 전염성 박테리아 식물내생체와 같이 목초 또는 식물의 종자와 관련되거나 이들 종자로부터 유래된 박테리아를 포함한다. 종자 전염성 박테리아 식물내생체는 종자의 표면과 회합되거나 이로부터 유래될 수 있고; 별법으로 또는 부가적으로, 내부 종자 구획(예를 들어, 표면 멸균 종자의)과 회합되거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 종자 전염성 박테리아 식물내생체는 식물 조직 내(예를 들어, 종자의 내부)에서 복제할 수 있다. 또한, 일부 경우에, 종자 전염성 박테리아 식물내생체는 건조 상황으로부터 생존할 수 있다.
본 개시내용의 방법에 따라 단리된 박테리아는 다수의 상이한 박테리아 분류를 조합하여 포함할 수 있다. 예를 들어, 박테리아는 프로테오박테리아(예컨대, 슈도모나스(Pseudomonas), 엔테로박터(Enterobacter), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 부르크홀데리아(Burkholderia), 리조비움(Rhizobium), 헤르바스피릴룸(Herbaspirillum), 판토에아(Pantoea), 세라티아(Serratia), 라넬라(Rahnella), 아조스피릴룸(Azospirillum), 아조리조비움(Azorhizobium), 아조토박터(Azotobacter), 두가렐라(Duganella), 델프티아(Delftia), 브라디리조비움(Bradyrhizobiun), 시노리조비움(Sinorhizobium) 및 할로모나스(Halomonas)), 피르미쿠테스(Firmicutes)(예컨대, 바실루스(Bacillus), 파에니바실루스(Paenibacillus), 락토바실루스(Lactobacillus), 미코플라스마(Mycoplasma), 및 아세타박테리움(Acetabacterium)), 및 악티노박테리아(Actinobacteria)(예컨대, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 로다코쿠스(Rhodacoccus), 미크로박테리움(Microbacterium), 및 쿠르토박테리움(Curtobacterium))를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 방법에 의해 생성될 수 있는 박테리아는 아조토박터 종(Azotobacter sp.), 브라디리조비움 종(Bradyrhizobium sp.), 클렙시엘라 종(Klebsiella sp.) 및 시노리조비움 종(Sinorhizobium sp.)을 포함한다. 박테리아는 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii), 브라디리조비움 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) 및 시노리조비움 멜릴로티(Sinorhizobium meliloti)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 박테리아는 엔테로박터, 라넬라 및 코사코니아(Kosakonia) 속일 수 있다.
박테리아는 그의 토양, 식물, 진균, 동물(무척추동물 포함) 및 호수 및 강의 퇴적물, 물 및 생물상(biota)을 포함하는 다른 생물상을 포함한 임의의 일반적인 육상 환경; 해양 환경, 그의 생물상 및 퇴적물(예를 들어, 해수, 해양 진흙, 해양 식물, 해양 무척추동물(예를 들어, 해면), 해양 척추동물(예를 들어, 어류)); 육상 및 해양 지권(geosphere)(예를 들어, 표토 및 암석, 예를 들어 지하 분쇄암, 모래 및 점토); 빙하권 및 그의 용융물; 대기(예를 들어, 여과된 공기 먼지, 구름 및 빗방울); 도시, 산업 및 기타 인위적인 환경(예를 들어, 콘크리트, 갓길 배수로, 지붕 표면 및 노면에 축적된 유기물 및 광물질)로부터 수득될 수 있다.
그로부터 박테리아가 수득되는 식물은 하나 이상의 바람직한 형질을 갖는 식물, 예를 들어 특정 환경에서 또는 특정 관심 조건 하에서 자연적으로 성장하는 식물일 수 있다. 예로서, 특정 식물은 높은 염분의 또는 극한 온도 하의 또는 물이 거의 없는 사질 토양 또는 모래에서 자연적으로 성장할 수 있거나, 또는 환경에 존재하는 특정 해충 또는 질병에 내성이 있을 수 있으며, 상업 작물이 그러한 조건에서 성장하는 것이, 특히 상기 조건이 특정 지리적 위치에서 사용할 수 있는 유일한 조건인 경우에 바람직할 수 있다. 추가의 예로서, 박테리아는 이러한 환경에서 성장하는 상업 작물로부터 수집될 수 있거나, 보다 구체적으로 임의의 특정 환경 환경에서 성장한 작물 중 관심 형질을 가장 잘 나타내는 개개의 작물 식물, 예를 들어 염분 제한 토양에서 성장한 작물 중 가장 빠르게 성장하는 작물 또는 심각한 곤충 손상 또는 질병 전염병에 노출된 작물에서 피해가 가장 적은 식물, 또는 섬유 함량, 오일 함량 등을 포함하는 원하는 양의 특정 대사산물 및 다른 화합물을 갖는 식물, 또는 바람직한 색, 맛 또는 냄새를 나타내는 식물로부터 수집될 수 있다. 박테리아는 진균 및 다른 동물 및 식물 생물상, 토양, 물, 퇴적물 및 이전에 언급된 환경의 다른 요소를 포함하는, 관심 식물 또는 관심 환경에서 발생하는 임의의 물질로부터 수집될 수 있다.
박테리아는 식물 조직으로부터 단리될 수 있다. 이 단리는 예를 들어 뿌리, 줄기 및 잎, 및 식물 생식 조직을 비롯한 식물의 임의의 적절한 조직으로부터 이루어질 수 있다. 예를 들어, 식물로부터의 단리를 위한 통상적인 방법은 전형적으로 관심 식물 물질(예를 들어, 뿌리 또는 줄기 길이, 잎)을 멸균 절제하는 단계, 적절한 용액(예를 들어, 2% 차아염소산나트륨)으로 표면 멸균하는 단계, 이어서 식물 물질을 미생물 성장을 위한 영양 배지에 두는 단계를 포함한다. 별법으로, 표면 멸균된 식물 물질은 멸균 액체(대체로 물) 내에서 분쇄되고, 분쇄된 식물 물질의 작은 조각을 포함하는 액체 현탁액은 선택적이거나 선택적이지 않을 수 있는(예를 들어, 인 공급원으로서 피트산만을 함유함) 적절한 고체 아가 배지(들)의 표면에 엷게 바를 수 있다. 이 방법은 단리된 콜로니를 형성하고 영양 배지의 플레이트를 분리하기 위해 개별적으로 선택하여 잘 알려진 방법에 의해 단일 종으로 더욱 정제될 수 있는 박테리아에 특히 유용하다. 별법으로, 식물 뿌리 또는 잎 샘플은 표면 멸균되지 않고 단지 완만하게 세척되어 단리 과정에서 표면 거주하는 식물착생성 미생물을 포함하거나, 또는 식물착생성 미생물은 식물 뿌리, 줄기 또는 잎의 조각을 아가 배지의 표면 상에 각인하고 들어올린 후, 상기한 바와 같이 개별 콜로니를 단리함으로써 별개로 단리될 수 있다. 이 방법은 예를 들어 박테리아에 특히 유용하다. 별법으로, 뿌리는 뿌리에 부착된 소량의 토양을 세척하지 않고 처리될 수 있으며, 따라서 식물 근권을 콜로니화하는 미생물을 포함한다. 그렇지 않으면, 뿌리에 달라붙은 토양을 제거하고, 희석하여 적당한 선택적 및 비선택적 배지의 아가에 엷게 발라서 근권성 박테리아의 개별 콜로니를 분리할 수 있다.
라넬라 아쿠아틸리스(Rahnella aquatilis) 및 엔테로박터 사카리(Enterobacter sacchari)의 생물학적으로 순수한 배양액은 2015년 7월 14일에 미국 버지니아주 매나서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC: American Type Culture Collection, 국제 기탁 기관)에 기탁되었고, 각각 ATTC 특허 기탁 지정 번호 PTA-122293 및 PTA-122294가 부여되었다. 상기 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 규칙(Budapest Treaty)의 규정 하에 이루어졌다.
조성물
본원에서 설명되는 방법에 따라 생성된 및/또는 본원에서 설명되는 특징을 갖는 박테리아 또는 박테리아 군집을 포함하는 조성물이 또한 식물 형질을 개선하는데 사용될 수 있다. 박테리아 군집을 포함하는 조성물은 종자의 표면 상에 코팅될 수 있으며, 액체 형태일 수 있다. 상기 조성물은 수수, 카놀라, 토마토, 딸기, 보리, 벼, 옥수수 및 밀과 같은 상업적으로 중요한 농작물에 대한 종자 코팅을 포함한다. 조성물은 또한 식물의 대기 부분에 분무될 수 있거나, 식물 종자가 심어진 고랑에 삽입하고, 토양에 물을 주거나, 뿌리를 조성물의 현탁액에 침지함으로써 뿌리에 적용될 수 있다. 조성물은 세포 생존 능력 및 숙주 식물을 인위적으로 접종하고 콜로니화하는 능력을 유지하는 적절한 방식으로 탈수될 수 있다. 박테리아 종은 108 내지 1010 CFU/ml의 농도로 조성물에 존재할 수 있다. 조성물은 미량의 금속 이온, 예컨대 몰리브덴 이온, 철 이온, 망간 이온, 또는 이들 이온의 조합으로 보충될 수 있다. 본원에서 설명되는 조성물 내의 이온 농도는 약 0.1 mM 내지 약 50 mM일 수 있다. 조성물은 또한 베타-글루칸, 카르복실메틸 셀룰로스(CMC), 박테리아 세포외 중합체 물질(EPS), 설탕, 동물 우유 또는 다른 적합한 담체와 같은 담체로 제제화될 수 있다. 별법으로, 이탄(peat) 또는 식재 재료가 담체로서 사용될 수 있거나, 조성물이 생체 중합체에 포획되는 생체 중합체가 담체로서 사용될 수 있다. 본원에서 설명되는 박테리아 군집을 포함하는 조성물은 식물 성장의 촉진, 잎 내의 높은 엽록소 함량의 유지, 열매 또는 종자 수의 증가, 및 과일 또는 종자 단위 중량의 증가와 같이 식물 형질을 개선할 수 있다.
본원에서 설명되는 박테리아 군집을 포함하는 조성물은 종자의 표면 상에 코팅될 수 있다. 따라서, 본원에서 설명되는 하나 이상의 박테리아로 코팅된 종자를 포함하는 조성물이 또한 고려된다. 종자 코팅은 박테리아 군집을 다공성의 화학적으로 비활성 인 과립 담체와 혼합함으로써 형성될 수 있다. 별법으로, 조성물은 종자가 심어진 고랑에 직접 삽입하거나, 식물 잎에 분무하거나, 또는 뿌리를 조성물의 현탁액에 침지함으로써 적용될 수 있다. 유효량의 조성물은 식물의 뿌리에 인접한 지하 토양 아래 영역에 생존 가능한 박테리아를 성장시키기 위해, 또는 식물의 잎에 생존 가능한 박테리아를 성장시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 유효량은 개선된 형질(예를 들어, 원하는 수준의 질소 고정)을 유도하기에 충분한 양이다.
본원에서 설명되는 박테리아 조성물은 농업상 허용되는 담체를 사용하여 제제화될 수 있다. 이들 실시양태에 유용한 제제는 점착부여제, 미생물 안정화제, 살진균제, 살세균제, 제초제, 살선충제, 살곤충제, 식물 성장 조절제, 비료, 살서제(rodenticide), 건조제 및 영양분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 설명되는 임의의 조성물은 농업상 허용되는 담체(예를 들어, 비천연 생성 비료와 같은 하나 이상의 비료, 비천연 생성 접착제와 같은 접착제 및 비천연 생성 살충제와 같은 살충제)를 포함할 수 있다. 비천연 생성 접착제는 예를 들어 중합체, 공중합체 또는 합성 왁스일 수 있다. 예를 들어, 본원에서 설명되는 임의의 코팅된 종자, 묘목 또는 식물은 종자 코팅에 농업상 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본원에서 설명되는 임의의 조성물 또는 방법에서, 농업상 허용되는 담체는 비천연 생성 화합물(예를 들어, 비천연 생성 비료, 비천연 생성 접착제, 예컨대 중합체, 공중합체 또는 합성 왁스 또는 비천연 생성 살충제)일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 농업상 허용되는 담체의 비제한적 예가 아래에서 설명된다. 농업상 허용되는 담체의 추가의 예는 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
일부 경우에, 박테리아는 농업상 허용되는 담체와 혼합된다. 담체는 고체 담체 또는 액체 담체일 수 있고, 미세구, 분말, 에멀젼 등을 포함하는 다양한 형태일 수 있다. 담체는 증가된 안정성, 습윤성 또는 분산성과 같은 다양한 특성을 부여하는 다수의 담체 중 임의의 하나 이상일 수 있다. 비이온성 또는 이온성 계면활성제 또는 이들의 조합물일 수 있는 천연 또는 합성 계면활성제와 같은 습윤제가 조성물에 포함될 수 있다. 유중수 에멀젼은 또한 단리된 박테리아를 포함하는 조성물을 제제화하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,485,451호 참조). 제조될 수 있는 적합한 제제는 습윤성 분말, 과립, 겔, 아가 스트립 또는 펠렛, 증점제 등, 미세캡슐화된 입자 등, 액체, 예컨대 수성 액상수화제(flowable), 수성 현탁액, 유중수 에멀젼 등을 포함한다. 제제는 곡물 또는 콩과 식물 제품, 예를 들면, 제분된 곡물 또는 콩, 곡물 또는 콩 유래의 즙(broth) 또는 가루, 전분, 설탕 또는 오일을 포함할 수있다.
일부 실시양태에서, 농업용 담체는 토양 또는 식물 성장 배지일 수 있다. 사용될 수 있는 다른 농업용 담체는 물, 비료, 식물유, 습윤제 또는 이들의 조합물을 포함한다. 별법으로, 농업용 담체는 규조토, 양토, 실리카, 알기네이트, 점토, 벤토나이트, 질석, 과피(seed case), 다른 식물 및 동물 산물, 또는 과립, 펠렛 또는 현탁액을 포함하는 조합물과 같은 고체일 수 있다. 비제한적인 예로서 페스타(pesta)(밀가루 및 카올린 점토), 아가 또는 양토, 모래 또는 점토 내의 밀가루 기재 펠렛과 같은 상기 언급된 임의의 성분의 혼합물이 또한 담체로서 고려된다. 제제는 보리, 벼, 또는 다른 생물학적 물질, 예컨대 종자, 식물 부분, 사탕수수 바가스(bagasse), 낟알 가공에서 나온 겉껍질 또는 줄기, 지면 식물 물질 또는 건축 부지 쓰레기의 목재, 종이, 직물 또는 목재의 재활용에 따른 톱밥 또는 섬유와 같은 박테리아의 먹이 공급원을 포함할 수 있다.
예를 들어, 비료를 사용하여 성장을 촉진하거나 종자, 묘목 또는 식물에 영양분을 제공할 수 있다. 비료의 비제한적인 예는 질소, 인, 칼륨, 칼슘, 황, 마그네슘, 붕소, 염화물, 망간, 철, 아연, 구리, 몰리브덴 및 셀레늄(또는 이의 염)을 포함한다. 비료의 추가의 예는 하나 이상의 아미노산, 염, 탄수화물, 비타민, 포도당, NaCl, 효모 추출물, NH4H2PO4, (NH4)2SO4 글리세롤, 발린, L-류신, 락트산, 프로피온산, 숙신산, 말산, 시트르산, KH 타르트레이트, 크실로스, 릭소스 및 레시틴을 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 다른 활성제를 물질(예를 들어, 종자의 표면)에 결합시키는 것을 돕기 위해 점착부여제 또는 점착제(접착제로 지칭됨)를 포함할 수 있다. 이러한 제제는 박테리아를 다른 화합물(예를 들어, 생물학적 물질이 아닌 조절제)을 함유할 수 있는 담체와 조합하여 코팅 조성물을 수득하는데 유용하다. 이러한 조성물은 미생물 및 다른 제제와 식물 또는 식물 부분과의 접촉을 유지하기 위해 식물 또는 종자 주위에 코팅을 생성하는 것을 돕는다. 한 실시양태에서, 접착제는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 알기네이트, 검, 전분, 레시틴, 포르모노네틴, 폴리비닐 알콜, 알칼리 포르모노네티네이트, 헤스페레틴, 폴리비닐 아세테이트, 세팔린, 아라비아 검, 크산탄 검, 미네랄 오일, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 피롤리돈(PVP), 아라비노-갈락탄, 메틸 셀룰로스, PEG 400, 키토산, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴로니트릴, 글리세롤, 트리에틸렌 글리콜, 비닐 아세테이트, 겔란 검, 폴리스티렌, 폴리비닐, 카르복시메틸 셀룰로스, 가티 검, 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 블록 공중합체.
일부 실시양태에서, 접착제는 예를 들어 왁스, 예컨대 카르나우바 왁스, 밀랍, 중국 왁스, 셸락(shellac) 왁스, 경랍 왁스, 칸델릴라(candelilla) 왁스, 캐스터 왁스, 오우리쿠리(ouricury) 왁스 및 쌀겨 왁스, 다당류(예를 들어, 전분, 덱스트린, 말토덱스트린, 알기네이트 염 및 키토산), 지방, 오일, 단백질(예를 들어, 젤라틴 및 제인), 아라블 검(gum arable) 및 셸락일 수 있다. 접착제는 비천연 생성 화합물, 예를 들어 중합체, 공중합체 및 왁스일 수 있다. 예를 들어, 접착제로서 사용될 수 있는 중합체의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 아세테이트 공중합체, 에틸렌 비닐 아세테이트(EVA) 공중합체, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 알코올 공중합체, 셀룰로스(예를 들어, 에틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스 및 카르복시메틸셀룰로스), 폴리비닐피롤리돈, 염화비닐, 염화비닐리덴 공중합체, 리그노술폰산칼슘트, 아크릴 공중합체, 폴리비닐아크릴레이트, 폴리에틸렌 옥시드, 아실아미드 중합체 및 공중합체, 폴리히드록시에틸 아크릴레이트, 메틸아크릴아미드 단량체 및 폴리클로로프렌.
일부 예에서, 접착제, 항진균제, 성장 조절제 및 살충제(예를 들어, 살곤충제) 중 하나 이상은 천연 생성 화합물(예를 들어, 임의의 조합의)이다. 농업상 허용되는 담체의 추가의 예는 분산제(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 PVPIVA S-630), 계면활성제, 결합제 및 충전제를 포함한다.
제제는 또한 계면활성제를 함유할 수 있다. 계면활성제의 비제한적인 예는 질소-계면활성제 블렌드, 예컨대 프레퍼(Prefer) 28(Cenex), Surf-N(US), 인핸스(Inhance)(Brandt), P-28(Wilfarm) 및 패트롤(Patrol)(Helena)을 포함하고; 에스테르화 종자 오일은 Sun-It II(AmCy), MSO(UAP), 스코일(Scoil)(Agsco), 하스텐(Hasten)(Wilfarm) 및 Mes-100(Drexel)을 포함하고; 유기 실리콘 계면활성제는 실Ÿ‡(Silwet) L77(UAP), 실리킨(Silikin)(Terra), 다인-아믹(Dyne-Amic)(Helena), 키네틱(Kinetic)(Helena), 실가드(Sylgard) 309(Wilbur-Ellis) 및 센튜리(Century)(Precision)를 포함한다. 한 실시양태에서, 계면활성제는 0.01% v/v 내지 10% v/v의 농도로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 계면활성제는 0.1% v/v 내지 1% v/v의 농도로 존재한다.
특정 경우에, 제제는 미생물 안정화제를 포함한다. 안정화제는 화합물 또는 화합물들이 사실상 액체 접종제에 대한 건조 효과를 갖는 농도로 사용되는지의 여부와 상관없이 건조제로 분류될 수 있는 임의의 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 포함할 수 있는 건조제를 포함할 수 있다. 이러한 건조제는 사용된 박테리아 군집과 이상적으로 상용성이고, 종자에 대한 적용시에 생존하고 건조 상태에서 생존하는 미생물 집단의 능력을 촉진해야 한다. 적합한 건조제의 예는 트레할로스, 수크로스, 글리세롤 및 메틸렌 글리콜 중 하나 이상을 포함한다. 다른 적합한 건조제는 비환원당 및 당 알콜(예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 제제에 도입되는 건조제의 양은 중량/부피 기준으로 약 5% 내지 약 50%, 예를 들어 약 10% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 35%, 또는 약 20% 내지 약 30%일 수 있다. 일부 경우에, 제제가 살진균제, 살세균제, 제초제, 살선충제, 살곤충제, 식물 성장 조절제, 살서제 또는 영양분과 같은 작용제를 함유하는 것이 바람직하다. 성장 조절제의 비제한적인 예는 브라시노스테로이드, 사이토카인(예를 들어, 키네틴 및 제아틴), 옥신(예를 들어, 인돌릴아세트산 및 인돌릴아세틸 아스파르테이트), 플라보노이드 및 이소플라바노이드(예를 들어, 포르모노네틴 및 디오스메틴), 피토아익신(예를 들어, 글리세올린), 및 피토알렉신 유도 올리고당(예를 들어, 펙틴, 키틴, 키토산, 폴리갈라쿠론산, 및 올리고갈락투론산), 및 지베렐린을 포함한다. 이러한 성장 조절제는 제제가 적용되는 농업용 종자 또는 묘목과 이상적으로 상용성이다(예를 들어, 식물의 성장 또는 건강에 유해하지 않아야 함). 또한, 상기 성장 조절제는 인간, 동물 또는 산업적 용도에 대한 안전성 문제를 일으키지 않는 것이 이상적이다(예를 들어, 안전성 문제가 없거나, 화합물은 식물에서 유래된 유용한 식물 제품이 무시할 정도의 양의 화합물을 함유하도록 충분히 불안정함).
액체 형태, 예를 들어, 용액 또는 현탁액에서, 박테리아 군집은 물 또는 수용액에서 혼합되거나 현탁될 수 있다. 적합한 액체 희석제 또는 담체는 물, 수용액, 석유 증류액 또는 다른 액체 담체를 포함한다.
고체 조성물은 이탄, 밀, 왕겨, 질석, 점토, 활석, 벤토나이트, 규조토, 풀러토(fuller's earth), 저온 멸균된 토양 등과 같은 적절하게 분리된 고형 담체 내 및 상에 박테리아 군집을 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 그러한 제제가 습윤성 분말로서 사용될 때, 생물학적으로 상용성인 분산제, 예컨대 비이온성, 음이온성, 양쪽성 또는 양이온성 분산제 및 유화제가 사용될 수 있다.
제제화시에 사용되는 고체 담체는 예를 들어 카올린 점토, 엽납석(pyrophyllite), 벤토나이트, 몬트모릴로나이트, 규조토, 산성 백토, 질석 및 펄라이트와 같은 광물 담체, 및 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아, 염화암모늄 및 탄산칼슘과 같은 무기염을 포함한다. 또한, 밀가루, 밀기울 및 쌀겨와 같은 유기 미세 분말이 사용될 수도 있다. 액체 담체는 대두유 및 면실유와 같은 식물성 오일, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 등을 포함한다.
식물 종
본원에서 설명되는 방법 및 박테리아는 임의의 다양한 식물, 예컨대 호르데움(Hordeum), 오리자(Oryza), 제아(Zea) 및 트리티세애(Triticeae) 속의 식물에 적합하다. 적합한 식물의 다른 비제한적인 예는 이끼, 지의류 및 조류를 포함한다. 일부 경우에, 식물은 식량 작물, 섬유 작물, 오일 작물, 임업 또는 펄프 및 제지 산업의 식물, 바이오 연료 생산을 위한 공급 원료 및/또는 관상용 식물과 같은 경제적, 사회적 및/또는 환경적 가치를 갖는다. 작물 식물의 비제한적 예는 옥수수, 벼, 밀, 보리, 수수, 기장, 귀리, 호밀, 라이밀, 메밀, 단 옥수수, 사탕수수, 양파, 토마토, 딸기 및 아스파라거스를 포함한다.
본원에 개시된 방법 및 조성물을 사용하여 수득되거나 개선될 수 있는 식물은 또한 파인애플, 바나나, 코코넛, 백합 및 목초; 및 쌍자엽 식물, 예컨대 완두콩, 알팔파, 큰포도꽈리(tomatillo), 멜론, 병아리콩(chickpea), 치커리, 클로버, 케일, 렌틸콩(lentil), 대두, 담배, 감자, 고구마, 무, 양배추, 평지, 사과나무, 포도, 면화, 해바라기, 애기장대(thale cress), 카놀라, 감귤류(오렌지, 귤, 금귤, 레몬, 라임, 자몽, 탕헤르 오렌지(tangerine), 탄젤로(tangelo), 시트론(citron), 포멜로(pomelo)), 후추, 콩, 및 상추를 포함한다.
일부 경우에, 개선될 식물은 실험 조건에 용이하게 적용될 수 없다. 예를 들어, 작물 식물은 여러 번 반복되는 과정에서 연속적으로 개선된 형질을 실질적으로 평가하기 위해 충분히 성장하기까지는 시간이 너무 오래 걸릴 수 있다. 따라서, 박테리아가 초기에 단리된 제1 식물 및/또는 유전적으로 조작된 박테리아가 적용되는 다수의 식물은 모델 식물, 예컨대 원하는 조건 하에서 평가가 보다 용이한 식물일 수 있다. 모델 식물의 비제한적인 예는 세타리아, 브라키포디움 및 아라비돕시스를 포함한다. 모델 식물을 사용하여 본 개시내용의 방법에 따라 단리된 박테리아의 능력은 이어서 개선된 형질의 부여를 확인하기 위해 또 다른 유형의 식물(예를 들어, 작물 식물)에 적용될 수 있다.
본원에 개시된 방법에 의해 개선될 수 있는 형질은 예를 들어, 성장 속도, 높이, 중량, 색상, 맛, 냄새, 식물에 의한 하나 이상의 화합물(예를 들어, 대사산물, 단백질, 약물, 탄수화물, 오일 및 임의의 다른 화합물)의 생산의 변화를 포함하는 식물의 관찰 가능한 임의의 특징을 포함한다. 유전자형 정보를 기초로 하여 식물을 선택하는 것도 고려된다(예를 들어, 박테리아에 대한 반응으로 식물 유전자 발현의 패턴 또는 증가된 질소 고정과 관련된 것과 같은 유전자 마커의 존재 확인을 포함함). 또한, 식물은 특정 특징 또는 형질(예컨대, 바람직한 특징 또는 형질)의 존재와 달리, 특정 특징 또는 형질(예컨대, 바람직하지 않은 특징 또는 형질)의 부재, 억제 또는 저해를 기초로 하여 선택될 수 있다.
실시예
본원에서 제시되는 실시예는 박테리아 단리, 박테리아 및 식물 분석, 및 식물 형질 개선 방법을 설명한다. 실시예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 어떤 식으로든 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 식물 조직으로부터 미생물의 단리
표토는 미국 캘리포니아 중앙의 여러 농업 지역으로부터 얻었다. 중점토, 이탄 점토 양토, 미사질 점토 및 사양토를 비롯하여 다양한 토성 특징을 갖는 20개의 토양이 수집되었다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 다양한 재배지 옥수수, 단 옥수수, 헤리티지(heritage) 옥수수, 토마토의 종자를 각각의 토양에 심었다.
<표 1>
다양한 특징을 갖는 토양에 심어진 작물 유형 및 품종
Figure 112018014581293-pct00001
식물을 2-4주의 성장 후에 뿌리째 뽑고, 뿌리 표면 상의 과량의 토양을 탈이온수로 제거하였다. 토양 제거 후, 표백제로 식물을 표면 멸균하고, 멸균수로 격렬하게 헹구었다. 뿌리의 깨끗한 1 cm 절편을 식물로부터 절제하고, 3 mm 강철 비드를 포함하는 포스페이트 완충 염수 용액에 배치하였다. 퀴아겐 티슈라이저(Qiagen TissueLyser) II로 용액을 격렬하게 흔들어서 슬러리를 생성하였다.
뿌리 및 염분 슬러리를 희석하고, 다양한 유형의 성장 배지 상에 접종하여 근권성, 식물내생성, 식물착생성, 및 다른 식물 결합 미생물을 단리하였다. R2A 및 Nfb 아가 배지를 단일 콜로니를 얻기 위해 사용하였고, 반고체 Nfb 사면 배지를 사용하여 질소 고정 박테리아의 집단을 얻었다. 반고체 Nfb 사면 배지에서 2-4주간 인큐베이팅한 후, 미생물 집단을 채취하고, 도 1a-b에 도시된 바와 같이 R2A 아가에서 단일 콜로니를 얻기 위해 도말하였다. 단일 콜로니를 R2A와 글리세롤의 혼합물에 재현탁하고, PCR 분석을 실시하고, 추후 분석을 위해 -80℃에서 동결하였다. 약 1,000개의 단일 콜로니가 얻어졌고, "단리된 미생물"로 지정되었다.
이어서, 단리물을 디아조 영양 생물을 확인하기 위해 nifH 유전자의 존재를 검출하기 위해 콜로니 PCR 스크린에 적용하였다. 스크린에서 90% 초과의 디아조 영양 생물을 검출하는 것으로 밝혀진, 앞서 기술된 프라이머 세트 Ueda 19F/388R을 사용하여 각각의 단리물에서 nif 클러스터의 존재를 조사하였다(Ueda et al. 1995; J. Bacteriol. 177: 1414-1417). 정제된 단리물의 단일 콜로니를 채취하여 PBS에 재현탁하고, 도 2에 도시된 바와 같이 콜로니 PCR을 위한 주형으로 사용하였다. 양성 PCR 밴드를 생성한 단리물의 콜로니를 재도말하고, 디아조 영양 생물의 위양성 확인을 방지하기 위해 콜로니 PCR 및 재도말 과정을 2회 반복하였다. 이어서, 정제된 단리물을 "후보 미생물"로 지정하였다.
실시예 2: 단리된 미생물의 특성 결정
서열결정, 분석 및 계통 발생적 특성 결정
515f-806r 프라이머 세트를 사용한 16S rDNA의 서열결정을 사용하여 단리된 및 후보 미생물에 대한 예비 계통 발생 종류(preliminary phylogenetic identity)를 생성하였다(예를 들어, 문헌 [Vernon et al.; BMC Microbiol. 2002 Dec 23;2:39] 참조). 미생물은 다음을 포함하는 다양한 속을 포함한다: 엔테로박터, 부르크홀데리아, 클렙시엘라, 브라디리조비움, 라넬라, 크산토모나스(Xanthomonas), 라오울텔라(Raoultella), 판토에아(Pantoea), 슈도모나스(Pseudomonas), 브레분디모나스(Brevundimonas), 아그로박테리움(Agrobacterium) 및 파에니바실루스(Paenibacillus)를 포함한다.
<표 2>
심층 16S rDNA 서열결정에 의해 결정된 토마토 식물로부터 단리된 미생물의 다양성.
Figure 112018014581293-pct00002
이어서, 39개의 후보 미생물의 게놈을 일루미나(Illumina) Miseq 플랫폼을 사용하여 서열결정하였다. QIAmp DNA 미니 키트(QIAGEN)를 사용하여 순수 배양액으로부터 게놈 DNA를 추출하고, 서열결정을 위한 전체 DNA 라이브러리를 제3 공급업체(SeqMatic, Hayward)를 통해 준비하였다. 게놈 조립은 A5 파이프라인을 통해 수행되었다(Tritt et al. 2012; PLoS One 7(9):e42304). 유전자를 확인하고, 주석을 달았으며, 질소 고정의 조절 및 발현과 관련된 것들이 돌연변이 유발의 표적으로 기록되었다.
후보 미생물의 총전사체 프로파일링
환경 질소의 존재 하에서 활성인 프로모터를 확인하기 위해 균주 CI010의 총전사체 프로파일링을 수행하였다. 균주 CI010을 10 mM 글루타민으로 보충된 한정된 무질소 배지에서 배양하였다. 총 RNA를 이들 배양액으로부터 추출하고(QIAGEN RNeasy 키트), 일루미나 HiSeq(SeqMatic, 미국 캘리포니아주 크레몬트 소재)를 통해 RNAseq 서열결정을 수행하였다. 서열결정 판독은 Geneious를 사용하여 CI010 게놈 데이터에 매핑되었고, 근접한 전사 프로모터의 제어 하에 고로도 발현되는 유전자가 확인되었다. 표 3a-c는 총 RNA의 RNASeq 서열결정을 통해 측정된 유전자 및 이들의 상대적인 발현 수준을 제시한다. 근접한 프로모터의 서열을 nif 경로, 질소 이용 관련 경로 또는 원하는 발현 수준을 갖는 다른 유전자의 돌연변이 유발에 사용하기 위해 기록하였다.
유전자 추적성 평가
후보 미생물은 형질전환성 및 유전자 추적성을 기초로 하여 특성화되었다. 먼저, 최적의 탄소원 이용은 작은 규모의 관련 배지 상에서의 성장뿐만 아니라 무질소 및 질소 풍부 배지 둘 모두에서의 성장 곡선에 의해 결정되었다. 둘째로, 각각의 균주의 천연 항생제 내성은 돌연변이 유발을 위한 선택적 마커로 사용되는 일군의 항생제를 포함하는 액체 배양액에서의 스폿 플레이팅(spot-plating) 및 성장을 통해 결정되었다. 셋째, 각각의 균주는 플라스미드 집합체의 전기천공을 통해 형질전환 가능성을 시험하였다. 플라스미드 집합체는 7개의 복제 기점, 즉 p15a, pSC101, CloDF, colA, RK2, pBBR1 및 pRO1600 및 4개의 항생제 내성 마커, 즉 CmR, KmR, SpecR 및 TetR의 조합 팽창을 포함한다. 상기 기점 및 내성 마커 상용성에 대한 체계적인 평가는 후보 미생물에서 플라스미드 기반 돌연변이 유발을 위한 벡터를 확인하는 데 사용되었다.
실시예 3: 후보 미생물의 돌연변이 유발
람다 - 레드 (Lambda-Red) 매개 낙아웃
후보 미생물의 몇몇 돌연변이체는 플라스미드 pKD46 또는 카나마이신 내성 마커를 함유하는 유도체(Datsenko et al. 2000; PNAS 97(12):6640-6645)를 사용하여 생성하였다. 낙아웃 카세트는 표적 유전자의 측접하는 250 bp의 상동성을 갖도록 설계되었고 오버랩 연장 PCR을 통해 생성되었다. 후보 미생물을 pKD46으로 형질전환시키고, 아라비노스의 존재 하에 배양하여 람다-레드 기구(machinery) 발현을 유도하고, 전기천공을 위해 예비처리한 다음, 낙아웃 카세트로 형질전환시켜 후보 돌연변이 균주를 생성하였다. 4개의 후보 미생물 및 1개의 실험실 균주, 즉 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) M5A1을 사용하여 표 4에 제시된 질소 고정 조절 유전자 nifL, glnB, 및 amtB의 13개의 후보 돌연변이체를 생성하였다.
<표 4>
람다-레드 돌연변이 유발을 통해 생성된 단일 낙아웃 돌연변이체의 목록
Figure 112018014581293-pct00003
Cas9 선택을 이용한 올리고 유도 돌연변이 유발
올리고 유도 돌연변이 유발을 사용하여 이. 콜라이(E. coli) DH10B에서 rpoB 유전자의 게놈 변화를 표적화하고, 돌연변이체를 CRISPR-Cas 시스템으로 선택하였다. 돌연변이 유발 올리고(ss1283:
"G*T*T*G*ATCAGACCGATGTTCGGACCTTCcaagGTTTCGATCGGACATACGCGACCGTAGTGGGTCGGGTGTACGTCTCGAACTTCAAAGCC", 여기서 *는 포스포로티오에이트 결합을 나타냄)는 4-bp 돌연변이를 통한 리팜피신 내성을 rpoB 유전자에 부여하도록 설계되었다. Cas9를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 세포를 Cas9 발현을 위해 유도하고, 전기천공을 위해 예비처리한 후, 돌연변이 유발원 올리고 및 WT rpoB 서열의 Cas9 절단을 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)의 구성적 발현을 코딩하는 플라스미드 둘 모두를 사용하여 전기천공하였다. 전기천공된 세포는 생성되는 돌연변이된 염색체의 충분한 분리를 허용하기 위해 밤새 비선택 배지에서 회복되었다. gRNA 코딩 플라스미드에 대한 선택을 위해 플레이팅한 후, 스크리닝된 10개의 콜로니 중 2개가 원하는 돌연변이를 포함하는 것으로 나타났고, 나머지는 gRNA 플라스미드 또는 Cas9 플라스미드 소실에서 프로토스페이서(protospacer) 돌연변이를 통해 생성된 탈출 돌연변이체인 것으로 밝혀졌다.
Cas9 선택을 이용한 람다 - 레드 돌연변이 유발
후보 미생물 CI006 및 CI010의 돌연변이체를 CRISPR-Cas에 의한 선택을 사용한 람다-레드 돌연변이 유발을 통해 생성하였다. 낙아웃 카세트는 전사 프로파일링을 통해 확인된 내인성 프로모터(실시예 2 및 표 3에 기재됨) 및 결실 표적의 측접하는 ~250 bp 상동성 영역을 함유하였다. CI006 및 CI010을 아라비노스 유도성 프로모터의 제어 하에 람다-레드 재조합 시스템(exo, beta, gam 유전자)을, 및 IPTG 유도성 프로모터의 제어 하에 Cas9를 인코딩하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체에서 Red 재조합 및 Cas9 시스템을 유도하고, 균주를 전기천공을 위해 준비하였다. 낙아웃 카세트 및 플라스미드 코딩된 선택 gRNA는 이어서 수용성(competent) 세포 내로 형질전환되었다. Cas9 플라스미드 및 gRNA 플라스미드 둘 모두에 대해 선택적인 항생제를 플레이팅한 후, 스크리닝된 10개의 콜로니 중 7개가 도 3에 도시된 바와 같이 의도된 낙아웃 돌연변이를 보였다.
실시예 4: 후보 분자의 시험관 내 표현형 결정
니트로게나제 생합성 및 다양한 돌연변이체의 활성에 대한 외인성 질소의 영향을 평가하였다. 아세틸렌 환원 검정(ARA)(Temme et al. 2012; 109(18): 7085-7090)을 사용하여 순수한 배양 조건에서 니트로게나제 활성을 측정하였다. 균주는 기밀 시험관에서 성장시키고, 아세틸렌의 에틸렌으로의 환원은 애질런트(Agilent) 6890 기체 크로마토그래피로 정량하였다. 0 내지 10 mM 글루타민으로 보충된 질소 고정 배지에서 성장한 후보 미생물 및 대응 후보 돌연변이체의 ARA 활성을 도 4a-b 및 도 10a-c에 나타내었다.
혐기성 배양 조건 하에서, 다양한 글루타민 및 암모니아 농도를 시험하여 질소 고정 활성에 대한 영향을 정량하였다. 야생형 세포에서는, 글루타민 농도가 증가함에 따라 활성이 빠르게 감소하였다. 그러나, 일련의 초기 낙아웃 돌연변이에서, 그렇지 않으면 야생형에서 활성을 차단할 글루타민의 농도 하에서 질소 고정 유전자의 발현을 가능하게 하는 돌연변이의 종류가 확인되었다. 이 프로파일은 도 4c에서 볼 수 있는 바와 같이 4개의 상이한 종의 디아조 영양 생물에서 생성되었다. 또한, 확인된 유전자 부분을 사용하여 조절 네트워크를 재설계함으로써 질소 고정 활동 수준이 예측 가능하게 조정되었다. 이는 균주 CM023, CM021, CM015 및 CI006을 보여주는 도 4b에 제시되어 있다. 균주 CM023은 진화된 균주(저)이고; 균주 CM021은 진화된 균주(중)이고; 균주 CM015는 진화된 균주(고)이고; 균주 CI006은 야생형(균주 2)이다. 배양 상청액에 배출된 암모니아를 효소 기반 검정(MEGAZYME)을 사용하여 시험하였다. 이 검정은 340 nm의 흡광도에서 소비되는 NADPH의 양을 측정한다. 이 검정은 질소가 없는 혐기성 환경에서 1E9 CFU/ml의 초기 밀도로 성장한 박테리아 배양액에 대해 수행되었다. 6개의 진화된 균주 패널에 걸쳐, 하나의 균주는 도 4d에 도시된 바와 같이, 48시간에 걸쳐서 100 μM까지의 암모니아를 배출하였다. 또한, 이중 돌연변이체는 도 11에 도시된 바와 같이, 그가 유래된 단일 돌연변이체보다 더 높은 암모니아 배출을 나타내었다. 이것은 그의 생리적 요구를 초과하여 암모니아를 생산할 수 있는 미생물의 능력을 입증한다.
순수한 배양액의 전사 프로파일링
CI006의 전사 활성을 나노스트링 엘리먼츠(Nanostring Elements) 플랫폼을 사용하여 측정하였다. 세포를 질소가 없는 배지에서 성장시키고, 4시간 동안 인큐베이팅한 후 10E8 세포를 수집하였다. 총 RNA는 퀴아겐 RNeasy 키트를 사용하여 추출하였다. 정제된 RNA는 도 5에 도시된 바와 같이, 프로브 혼성화 및 디지털 어낼라이저(Digital Analyzer) 분석을 위해 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 코어 다이어그노스틱스(Core Diagnostics)에 제출하였다.
실시예 5: 후보 미생물의 식물 내에서의 표현형 결정
후보 미생물에 의한 식물의 콜로니화
후보 미생물에 의한 목적하는 숙주 식물의 콜로니화를 단기간의 식물 성장 실험을 통해 정량하였다. 옥수수 식물에 플라스미드로부터 또는 Tn5-통합 RFP 발현 카세트로부터 RFP를 발현하는 균주를 접종하였다. 식물을 멸균된 모래와 비멸균 이탄 배지 모두에서 재배하고, 발아 3일 후에 출현하는 식물 자엽초(coleoptile)에 직접 1 mL의 세포 배양액을 피펫팅하여 접종을 수행하였다. 플라스미드는 적절한 항생제를 함유하는 용액을 식물에게 공급하여 유지되었다. 3주 후에, 식물 뿌리를 모으고, 멸균수로 3회 세정하여 눈에 보이는 흙을 제거한 다음, 2개의 샘플로 나누었다. 하나의 뿌리 샘플은 후보 미생물의 국소화 패턴을 확인하기 위해 형광 현미경을 통해 분석되었다. 현미경 검사는 도 6에 도시된 바와 같이, 10 mm 길이의 가장 양호한 무손상 식물 뿌리에서 수행되었다.
콜로니화를 평가하기 위한 제2 정량 방법이 개발되었다. 정량적 PCR 검정은 식물내생체로 접종된 식물의 뿌리로부터 전체 DNA 제제에 대해 수행하였다. 옥수수 종자(Dekalb DKC-66-40)는 2.5인치 x 2.5인치 x 10인치 화분의 미리 고압살균한 모래에서 발아시켰다. 식재 1일 후에, 종자가 있는 지점에 1 ml의 식물내생체 밤샘 배양액(SOB 배지)를 흠뻑 적졌다. 1 mL의 상기 밤샘 배양액은 약 109 cfu와 거의 같고, 사용되는 균주에 따라 서로 3배 이내에서 상이하다. 각각의 모종에는 2.5 mM 또는 0.25 mM 질산암모늄으로 보충된 50 mL 변형 호아글란드(Hoagland) 용액을 매주 3회 시비하였다. 식재 4주 후에, DNA 추출을 위해 뿌리 샘플을 채취하였다. 토양 찌꺼기는 가압수 분무를 사용하여 씻어내었다. 이어서, 이러한 조직 샘플을 퀴아겐 티슈라이저(QIAGEN Tissuelyzer)를 사용하여 균질화한 다음, DNA를 QIAmp DNA 미니 키트(QIAGEN)를 권장 프로토콜에 따라 사용하여 추출하였다. qPCR 검정은 식물내생체의 게놈 각각의 유전자좌에 특이적이도록(NCBI의 프라이머 BLAST를 사용하여) 설계된 프라이머를 사용하여, 이들 DNA 추출물에 대해 스트라타젠(Stratagene) Mx3005P RT-PCR을 사용하여 수행하였다. 식물내생체의 게놈 카피의 존재를 정량하였다. 식물내생체의 종류를 추가로 확인하기 위해, PCR 증폭 산물의 서열을 결정하였고, 이 산물은 정확한 서열을 갖는 것으로 확인되었다. 후보 미생물로부터의 균주 CI006 및 CI008의 콜로니화 프로파일에 대한 요약은 표 5에 제시된다. 뿌리의 107x cfu/g fw만큼 높은 콜로니화 속도가 균주 CI008에서 증명되었다.
<표 5> qPCR에 의해 측정된 옥수수의 콜로니화
Figure 112018014581293-pct00004
식물 내에서의 RNA 프로파일링
식물 내에서 nif 경로 성분의 생합성은 nif 유전자의 전사를 측정함으로써 추정하였다. 총 RNA는 CI006 접종 식물(상기한 바와 같은 식재 방법)의 뿌리 식물 조직으로부터 얻었다. RNA 추출은 권장 프로토콜(QIAGEN)에 따라 RNEasy 미니 키트를 사용하여 수행하였다. 이어서, 이들 식물 조직으로부터의 총 RNA는 균주 CI006의 게놈에서 nif 유전자에 특이적인 프로브를 사용하여 나노스트링 엘리먼츠 키트(NanoString Technologies, Inc.)를 사용하여 검정하였다. 식물 내에서의 nif 유전자 발현의 데이터는 표 6에 요약되어 있다. nifH 유전자의 발현은 CM013 균주에 접종된 식물에서 검출되었지만, nifH 발현은 CI006 접종 식물에서는 검출되지 않았다. 균주 CM013은 nifL 유전자가 낙아웃된 균주 CI006의 유도체이다.
kb 1백만당 전사체(TPM)에 의해 평가된, CM011의 고도로 발현된 유전자는 시비된 조건 하에 식물 내에서 측정되었다. 이러한 고도로 발현된 유전자의 일부의 발현을 제어하는 프로모터를 표적화된 질소 고정 및 동화 유전자좌 내로의 상동성 재조합을 위한 주형으로 사용하였다. 온실에서 자란 CM011 접종 식물의 RNA 샘플을 추출하고, 리보-제로(Ribo-Zero) 키트를 사용하여 rRNA를 제거하고, 일루미나의 Truseq 플랫폼을 사용하여 서열결정한 다음, CM011의 게놈으로 다시 매핑하였다. CM011에서 고도로 발현된 유전자는 표 7에 제시된다.
<표 6> 식물 내에서의 nifH의 발현
Figure 112018014581293-pct00005
<표 7>
Figure 112018014581293-pct00006
Figure 112018014581293-pct00007
15 N 분석법
고정을 입증하기 위한 1차 방법은 14N에 대한 설정 속도로 대기에서 발견되는 질소 동위원소 15N을 사용한다. 비료 또는 대기를 농축된 수준의 15N으로 보충함으로써, 15N2 가스로 보충된 대기로부터 고정된 15N의 증가한 양으로 직접(Yoshida 1980), 또는 반대로, 농축된 비료를 식물 조직 내의 대기 중 N2 가스로 희석함으로써 고정을 관찰할 수 있다(Iniguez 2004). 희석 방법은 식물 성장 과정에 걸쳐 누적된 고정 질소를 관찰할 수 있는 반면, 15N2 가스 방법은 식물이 포함된 대기에서 자랄 수 있는 짧은 간격에 걸쳐 발생하는 고정을 측정(속도 측정)하는 것으로 제한된다. 따라서, 가스 방법은 특이성에서 우수하지만(대기 속도 초과의 식물 내의 15N2 수준의 임의의 상승은 명확하게 고정에 의한 것일 수 있기 때문에), 누적된 활성을 나타낼 수는 없다.
야생형 및 접종되지 않은 옥수수 식물에 비해 개선된 균주의 고정 활성을 측정하기 위해 두 가지 유형의 검정을 수행하였고, 개선된 균주 중 몇몇 균주에 대해 증가된 고정 속도가 식물 내에서 관찰되었다(도 12, 도 14a 및 도 14b). 이러한 검정은 시험관 내에서 관찰된 균주의 활성이 생체 내 결과로 변환됨을 입증하는데 중요하다. 또한, 이들 검정은 비료가 균주 활성에 미치는 영향을 측정할 수 있고, 이것은 농업 환경에서 적절한 기능성을 제시한다. 세타리아 식물에 야생형 및 개선된 균주를 접종한 경우에도 유사한 결과가 관찰되었다(도 13). 도 14a-14c에 도시된 식물 내에서의 고정 활성은 총전사체 데이터에 의해 추가로 뒷받침된다. 진화된 균주는 야생형 대응 균주에 비해 증가된 nifH 전사체 수준을 나타낸다. 또한, 식물 내에서의 미생물 유도 질소 수준은 식물별로 식물에 대한 콜로니화 수준과도 상관관계가 있다. 이러한 결과(도 12, 도 13, 도 14a-14c, 도 15a 및 도 15b)는 미생물이 nif 유전자 클러스터의 개선된 조절을 통해 식물 조직에서 관찰된 대기 유래 질소의 증가에 대한 가능성 있는 원인이라는 가설을 지지한다. 고정을 직접 측정하는 것 이외에, 질소 스트레스가 가해진 식물 바이오매스 검정에서 개선된 균주로 식물을 접종할 때의 영향을 측정하였다. 식물 바이오매스는 식물과의 많은 가능한 미생물 상호작용과 관련될 수 있지만, 질소가 제한적일 때 고정된 질소의 첨가가 식물 표현형에 영향을 줄 것이라고 예상할 수 있다. 접종된 식물은 질소가 완전히 없는 상태에서 성장되었고, 처리되지 않은 대조군에 비해 접종된 식물에서 잎 면적, 싹의 신선 및 건조 중량, 및 뿌리의 신선 및 건조 중량의 유의한 증가가 관찰되었다(도 14c). 이러한 차이는 질소 고정에 의한 것이라고만 할 수는 없지만, 개선된 균주가 질소를 식물에 적극적으로 공급한다는 결론을 지지한다. 옥수수 및 세타리아 식물을 상기 설명한 바와 같이 성장시키고 접종하였다. 1.2% 15N을 포함하는 비료를 관수를 통해 정기적으로 식물에 공급하였다. 미생물에 의한 질소 고정은 식물 조직에서 15N 수준을 측정함으로써 정량하였다. 식재 4주 후에, 4번째 잎 조직을 수확한 후 건조하였다. 말린 잎 샘플을 비드(QIAGEN Tissuelyzer)를 사용하여 균질화하고, IRMS(MBL Stable Isotope Laboratory, The Ecosystems Center, 미국 매사추세츠주 우즈 홀 소재)를 위한 주석 캡슐 내에 분취하였다. 대기로부터 유래된 질소(NDFA)를 계산하고, CI050 및 CM002에 의한 질소 생산을 도 7에 나타내었다.
식물 호르몬 생산 검정
난쟁이 토마토(솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum)) 재배종인 '마이크로-톰'은 이전에 시험관 내 검정을 통해 과일 숙성에 대한 인돌-3-아세트산의 영향을 연구하는데 사용되었다(Cohen 1996; J Am Soc Hortic Sci 121: 520-524). 후보 미생물에 의한 식물 호르몬 생성 및 분비를 평가하기 위해, 미성숙 마이크로-톰 과일을 사용한 플레이트 기반 스크리닝 검정이 개발되었다. 12웰 조직 배양 시험 플레이트는 웰을 아가 배지로 채우고, 응고시키고, 도 8에 도시된 바와 같이 10 ㎕의 밤샘 미생물 배양액을 아가 표면에 스포팅(spotting)함으로써 준비하였다. 증가량의 지베렐산(GA)을 함유하지만 박테리아 배양액은 함유하지 않는 아가가 존재하는 웰을 양성 대조군 및 표준물질로서 사용하였다. 성장하는 마이크로-톰 식물로부터 절제된 개화 1일 후의 꽃을 박테리아 스폿 배양 지점에서 아가에 줄기부터 시작하여 삽입하였다. 이 꽃을 2-3주 동안 모니터링하고, 그 후에 과일을 수확하고 무게를 측정하였다. 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 여러 반복실험체에 걸친 식물 과일 질량의 증가는 접종 미생물에 의한 식물 호르몬의 생산을 나타낸다.
실시예 6: 주기적 숙주-미생물 진화
옥수수 식물에 CM013을 접종하고, 대략 V5 성장 단계까지 4주 동안 성장시켰다. 15N 분석을 통해 미생물 공급원으로부터의 질소 축적이 개선되었음을 보인 식물을 뿌리째 뽑고, 뿌리를 가압수로 세척하여 과량의 토양을 제거하였다. 0.25 g의 뿌리 절편을 잘라내고, PBS 용액으로 세정하여 미세한 토양 입자 및 비부착성 미생물을 제거하였다. 조직 샘플은 퀴아겐 티슈라이저 II에서 3 mm 강철 비드를 사용하여 균질화되었다. 균질액을 희석하고, SOB 아가 배지에 플레이팅하였다. 단일 콜로니를 액체 배지에 재현탁하고, 접종 균주에 특유한 16s rDNA 및 돌연변이의 PCR 분석을 실시하였다. 미생물 단리, 돌연변이 유발, 접종 및 재단리 과정은 미생물 특징, 식물 형질 및 미생물의 콜로니화 능력을 개선하기 위해 반복적으로 수행될 수 있다.
실시예 7: 지리에 걸친 상용성
접종된 식물체에 콜로니를 형성하기 위한 개선된 미생물의 능력은 재배지 조건 하에서 식물의 성공에 중요하다. 설명된 단리 방법은 옥수수와 같은 작물 식물과 밀접한 관계가 존재할 수 있는 토양 미생물을 선택하도록 설계되었지만, 많은 균주는 다양한 식물 유전자형, 환경, 토양 유형 또는 접종 조건에 걸쳐 효과적으로 콜로니화되지 않을 수 있다. 콜로니화는 미생물 균주와 숙주 식물 사이의 다양한 상호작용을 필요로 하는 복잡한 과정이기 때문에, 콜로니화 능력에 대한 스크리닝은 추가 개발을 위한 우선 순위 균주를 선택하기 위한 핵심 방법이 되었다. 콜로니화를 평가하기 위한 초기의 노력은 효과적이지만 시간 소모적이고 균주별 기준으로 확장할 수 없는 균주의 형광 태그 부착을 사용하였다. 콜로니화 활성은 직접적으로 개선될 수 없기 때문에, 잠재적인 생성 후보는 천연 콜로니 형성자인 균주로부터 선택되는 것이 필수적이다.
검정은 qPCR 및 집단 샘플에서 균주 특이적으로 설계된 프라이머를 사용하여 임의의 주어진 숙주 식물에서 야생형 균주의 강력한 콜로니화를 시험하기 위해 설계되었다. 이 검정은 옥수수 조직 샘플로부터 미생물의 콜로니화 속도를 빠르게 측정하는 것이 의도된다. 형광 현미경 검사 및 플레이트 기반 기술을 사용하여 가능한 콜로니 형성자로 평가된 균주를 이용한 초기 시험은 qPCR 방법이 정량적이고 확장성이 있음을 나타내었다.
전형적인 검정은 다음과 같이 수행된다: 식물, 대부분 옥수수 및 밀의 품종은 균주당 6개의 반복실험체로 온실의 이탄 혼합 상토(peat potting mix)에서 성장한다. 식재 4일 또는 5일 후에, 0.6-1.0의 OD590(약 5E+08 CFU/mL)으로 희석된 박테리아의 초기 고정상 배양액의 1 mL를 출현하는 자엽초에 피펫팅한다. 식물은 수돗물만 공급하고, 샘플 채취 전에 4주 동안 성장시킨 후, 식물을 뿌리째 뽑고, 뿌리를 대부분의 이탄 잔류물을 제거하기 위해 철저히 세척한다. 깨끗한 뿌리의 샘플을 절제하고 균질화하여 식물 세포 파편 및 관련된 박테리아 세포의 슬러리를 생성한다. 본 발명자들은 qPCR의 주형으로 사용할 박테리아 DNA의 식물의 혼합물을 효과적으로 생산하는 고효율 DNA 추출 프로토콜을 개발하였다. 박테리아 세포의 스파이크-인(spike-in) 실험을 기초로 하여, 이 DNA 추출 과정은 뿌리의 생중량과 관련하여 정량적인 박테리아 DNA 샘플을 제공한다. 각각의 균주는 프라이머 BLAST(Ye 2012)를 사용하여 설계된 균주 특이적 프라이머를 사용하여 평가하고, 접종되지 않은 식물의 배경 증폭과 비교된다. 일부 프라이머는 접종되지 않은 식물에서 표적 외의 증폭을 나타내므로, 콜로니화는 증폭의 존재 또는 정확한 생산물의 증폭이 배경 수준과 비교하여 결정된다.
이 검정은 상이한 토양 지리에 걸쳐 미생물 생성물의 상용성을 측정하기 위해 사용되었다. 재배지의 토양 품질 및 재배지 조건은 미생물 생성물의 효과에 큰 영향을 줄 수 있다. 토양 pH, 수분 보유 능력 및 경쟁 미생물은 토양에서 접종원 생존 및 콜로니화 능력에 영향을 미칠 수 있는 요소의 단지 몇 가지 예일 뿐이다. 식물 성장 배지로 캘리포니아의 농경지로부터 샘플링한 3개의 다양한 토양 유형을 사용하여 콜로니화 검정을 수행하였다(도 16a). 중간 접종 밀도가 현실적인 농업 조건에 근접하도록 사용되었다. 3주 이내에, 균주 5는 모든 식물에서 1E+06 내지 1E+07 CFU/g FW로 콜로니화하였다. 식물 성장 7주 후에, 균주 1의 진화된 버전은 모든 토양 유형에서 높은 콜로니화 속도(1E+06 CFU/g FW)을 나타냈다(도 16b).
또한, 재배지 조건의 복잡성에서 콜로니화를 평가하기 위해, 재배지 옥수수의 2개의 품종에서 야생형 균주 7개의 영향 및 콜로니화를 평가하고자 2015년 6월에 미국 샌 루이스 오비스포에서 1에이커의 재배지 시험을 실시하였다. 이 시험의 농경지 설계 및 실행은 계약 재배지 연구 기관인 퍼시픽 에이쥐 리써치(Pacific Ag Research)에 의해 수행되었다. 접종을 위해, 접종 방법 실험에서 시험된 것과 동일한 이탄 배양 종자 코팅 기술이 사용되었다. 성장기가 진행되는 동안, 뿌리 및 줄기 내부의 콜로니화를 평가하기 위해 식물 샘플을 수집하였다. 식재 4주 및 8주 후에 각각의 처리의 3개 반복시험 구획지로부터 샘플을 채취하고, 16주에 수확 직전에 각각의 처리의 6개의 모든 반복시험 구획지로부터 샘플을 수집하였다. 추가의 샘플은 12주째에 균주 1 및 균주 2로 접종된 처리의 6개의 모든 반복시험 구획지 및 처리되지 않은 대조군으로부터 수집하였다. 세척된 뿌리의 생중량 1그램당 세포의 수는 qPCR 및 균주 특이적 프라이머를 사용하여 다른 콜로니화 검정과 마찬가지로 평가되었다. 균주 1 및 균주 2의 두 균주는 12주에 최고치를 기록한 후 급격히 감소하는 일관되고 광범위한 뿌리 콜로니로 보였다(도 16c). 균주 2는 균주 1보다 더 낮은 차수의 수치로 존재하는 것으로 나타난 반면에, 그것은 개별 식물에서는 보다 일관된 수치로 발견되었다. 줄기 내부에 효과적으로 콜로니화하는 균주는 보이지 않는다. qPCR 콜로니화 데이터를 뒷받침하기 위해, 두 균주는 모두 일치하는 서열의 단리물을 확인하기 위해 플레이팅 및 16S 서열결정을 사용하여 뿌리 샘플로부터 성공적으로 재단리되었다.
본 발명을 설명하는 맥락에서(특히 아래의 청구항의 맥락에서) 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 지시자의 사용은 본원에서 달리 표시되거나 문맥에 의해 명백하게 부인되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "포함하는", "갖는", "포괄하는" 및 "함유하는"이라는 용어는 달리 표시되지 않는 한, 개방형 용어(즉, "포함하고 이로 제한되지 않는"을 의미함)로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위를 열거한 것은 본원에서 달리 표시되지 않는 한, 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 것의 약기 방법의 역할을 하도록 의도되며, 각각의 개별 값은 마치 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 예를 들어, 범위 10-15가 개시되면, 11, 12, 13, 및 14가 또한 개시된 것이다. 본원에서 설명되는 모든 방법은 본원에서 달리 표시되거나 문맥에 의해 명백하게 부인되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 및 모든 실시예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "~와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 제시하도록 의도된 것이며, 달리 주장되지 않는 한 본 발명의 범위에 대한 제한을 제시하지 않는다. 본원 명세서의 어떠한 용어도 임의의 비청구된 요소가 본 발명의 실시에 필수적인 것임을 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에서 제시되고 설명되었지만, 그러한 실시양태가 단지 예로서 제공된다는 것이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명을 벗어나지 않으면서 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 다양한 변형, 변경 및 대체가 이루어질 것이다. 본원에서 설명된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 하기 청구항은 본 발명의 범위를 정의하고, 청구항의 범위 내에 있는 방법 및 구조 및 그의 균등물은 그에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
<표 3a>
Figure 112018014581293-pct00008
<표 3b>
Figure 112018014581293-pct00009
<표 3c>
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<균주의 표>
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<균주의 표> (계속)
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첨부된 청구범위에도 불구하고, 본원에서 제시된 개시내용은 또한 다음의 항목들에 의해 정의된다:
1. 하나 이상의 박테리아의 생산 방법으로서,
(a) 제1 식물의 조직 또는 토양으로부터 박테리아를 단리하는 단계;
(b) 하나 이상의 변이체 박테리아를 생산하기 위해 하나 이상의 박테리아에 유전자 변이를 도입하는 단계;
(c) 다수의 식물을 변이체 박테리아에 노출시키는 단계;
(d) 다수의 식물의 하나의 조직 또는 토양으로부터 박테리아를 단리하는 단계로서, 그로부터 박테리아가 단리된 식물은 다수의 식물 내의 다른 식물에 비해 개선된 형질을 갖는 것인 단계; 및
(e) 단계 (d)에서 단리된 박테리아를 사용하여 단계 (b) 내지 (d)를 반복하는 단계
를 포함하는, 하나 이상의 박테리아를 생산하는 방법.
2. 제1항목에 있어서, 개선된 형질이, 그로부터 박테리아가 단리된 식물에서 향상된 질소 고정인 방법.
3. 제1항목에 있어서, 유전자 변이가 nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, 및 nifQ로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 내의 변이인 방법.
4. 제1항목에 있어서, 유전자 변이가 글루타민 합성효소, 글루타미나제, 글루타민 합성효소 아데닐릴트랜스퍼라제, 전사 활성제, 항전사 활성제, 피루베이트 플라보독신 산화환원효소, 플라보독신, 또는 NAD+-이질소-환원효소 ADP-D-리보실트랜스퍼라제로 이루어진 군으로부터 선택된 기능성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 내의 변이인 방법.
5. 제1항목에 있어서, 유전자 변이가 NifA 또는 글루타미나제의 발현 또는 활성의 증가; NifL, NtrB, 글루타민 합성효소, GlnB, GlnK, DraT, AmtB의 발현 또는 활성의 감소; GlnE의 아데닐릴 제거 활성의 감소; 또는 GlnD의 우리딜릴 제거 활성의 감소 중 하나 이상을 유발하는 돌연변이인 방법.
6. 제1항목에 있어서, 유전자 변이가 낙아웃 돌연변이인 방법.
7. 제1항목에 있어서, 유전자 변이가 단백질 도메인의 활성의 근절 또는 제거를 유발하는 것인 방법.
8. 제1항목에 있어서, 유전자 변이가 표적 유전자의 조절 서열을 변경 또는 무능화하는 것인 방법.
9. 제1항목에 있어서, 유전자 변이가 이종성 조절 서열의 삽입을 포함하는 것인 방법.
10. 제1항목에 있어서, 유전자 변이가 도입된 박테리아에 대응하는 박테리아 종 또는 속의 게놈 내에서 발견되는 조절 서열의 삽입이 유전자 변이에 포함되는 것인 방법.
11. 제10항목에 있어서, 조절 서열이 박테리아 배양액 또는 식물 조직 내에서의 유전자의 발현 수준에 기초하여 선택되는 것인 방법.
12. 제1항목에 있어서, 유전자 변이가 화학적 돌연변이 유발에 의해 생성되는 것인 방법.
13. 제1항목에 있어서, 단계 (c)가 식물을 생물적 또는 비생물적 스트레스 인자에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
14. 제2항목에 있어서, 단계 (b) 내지 (d)를 1회 이상 반복한 후에 단리된 박테리아가 제1 식물과 동일한 유형의 제2 식물에서 질소의 1% 이상을 생성하는 것인 방법.
15. 제2항목에 있어서, 단계 (b) 내지 (d)를 1회 이상 반복한 후에 단리된 박테리아가 제1 식물로부터 단리된 박테리아에 비해 질소 고정에 있어서 적어도 2배의 증가를 나타내는 것인 방법.
16. 제14항목에 있어서, 제2 식물이 글루타민, 암모니아 또는 질소의 다른 화학적 공급원으로 보충된 비료의 존재 하에 재배되는 것인 방법.
17. 제1항목에 있어서, 제1 식물이 농작물 식물인 방법.
18. 제17항목에 있어서, 농작물 식물이 보리, 벼, 옥수수, 밀, 수수, 단 옥수수, 사탕수수, 양파, 토마토, 딸기 또는 아스파라거스로부터 선택되는 것인 방법.
19. 제1항목에 있어서, 제1 식물 또는 다수의 식물 내의 식물이 모델 식물인 방법.
20. 제19항목에 있어서, 모델 식물이 세타리아, 브라키포디움, 또는 아라비돕시스로부터 선택되는 것인 방법.
21. 제1항목에 있어서, 유전자 변이가, 표적 부위에 특이적으로 도입된 예정된 유전자 변이인 방법.
22. 제1항목에 있어서, 유전자 변이가 표적 부위 내의 무작위 돌연변이인 방법.
23. 제1항목에 있어서, 단계 (a)가 단리된 박테리아의 유전 분석을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
24. 제1항목에 있어서, 단계 (b)가 유전자 변이를 포함하는 박테리아를 풍부하게 하기 위한 선택 압력을 적용하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
25. 제24항목에 있어서, 선택 압력이 표적 부위에 도입된 유전자 변이가 결여된 게놈을 절단하는 단계를 포함하고, 여기서 절단은 표적 부위의 100개의 뉴클레오티드 이내에서 발생하는 것인 방법.
26. 제24항목에 있어서, 선택 압력을 견디는 박테리아를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
27. 제25항목에 있어서, 절단이 징크 핑거 뉴클레아제, CRISPR 뉴클레아제, TALE 뉴클레아제, 또는 메가뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 부위 특이적 뉴클레아제에 의해 유도되는 것인 방법.
28. 제27항목에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가 CRISPR 뉴클레아제인 방법.
29. 제1항목에 있어서, 유전자 변이가 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인 방법.
30. 제1항목에 있어서, 단계 (b) 내지 단계 (d)를 1회 이상 반복한 후에 단리된 박테리아가 식물내생성, 식물착생성 또는 근권성인 방법.
31. 제1항목에 있어서, 단계 (b) 내지 단계 (d)를 1회 이상 반복한 후에 단리된 박테리아가 다수의 상이한 박테리아 분류군을 포함하는 것인 방법.
32. 제1항목에 있어서, 박테리아가 식물 조직으로부터 단리되는 것인 방법.
33. 제1항목에 있어서, 단계 (a)에서 박테리아를 단리하는 단계가 제1 식물의 종자로부터 박테리아를 단리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
34. 식물에서 질소 고정을 증가시키는 방법으로서, 식물을 질소 고정을 조절하는 하나 이상의 유전자에 도입된 하나 이상의 유전자 변이를 포함하는 박테리아에 노출시키는 단계를 포함하고, 상기 박테리아가 식물에서 질소의 1% 이상을 생성하는 것인, 식물에서 질소 고정을 증가시키는 방법.
35. 제34항목에 있어서, 박테리아가 식물에서 질소의 5% 이상을 생성하는 것인 방법.
36. 제34항목에 있어서, 박테리아가 식물에서 질소의 10% 이상을 생성하는 것인 방법.
37. 제34항목에 있어서, 박테리아가 글루타민, 암모니아 또는 보충 질소의 다른 화학적 공급원으로 보충된 비료의 존재 하에 질소를 생성하는 것인 방법.
38. 제34항목에 있어서, 유전자 변이가 nifA, nifL, ntrB, ntrC, 글루타민 합성효소, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, 글루타미나제, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB 및 nifQ로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 내의 변이인 방법.
39. 제34항목에 있어서, 유전자 변이가 nifA 또는 글루타미나제의 발현 또는 활성의 증가; nifL, ntrB, 글루타민 합성효소, glnB, glnK, draT, amtB의 발현 또는 활성의 감소; GlnE의 아데닐릴 제거 활성의 감소; 또는 GlnD의 우리딜릴 제거 활성의 감소 중 하나 이상을 유발하는 돌연변이인 방법.
40. 제34항목에 있어서, 유전자 변이가 (a) 낙아웃 돌연변이이거나, (b) 표적 유전자의 조절 서열을 변경 또는 무능화하거나; 또는 (c) 이종성 조절 서열의 삽입을 포함하는 것인 방법.
41. 제34항목에 있어서, 박테리아가 엔테로박터 속에 속하는 것인 방법.
42. 제34항목에 있어서, 박테리아가 라넬라 속에 속하는 것인 방법.
43. 제34항목에 있어서, 박테리아가 식물내생성, 식물착생성 또는 근권성인 방법.
44. 제34항목에 있어서, 박테리아가 다수의 상이한 박테리아 분류군을 포함하는 것인 방법.
45. 제34항목에 있어서, 식물이 농작물 식물인 방법.
46. 제34항목 내지 제45항목 중 어느 한 항목에 있어서, 식물이 비콩과 식물인 방법.
47. 제45항목에 있어서, 농작물 식물이 수수, 카놀라, 토마토, 딸기, 보리, 벼, 옥수수 및 밀로부터 선택되는 것인 방법.
48. 제45항목에 있어서, 식물이 유전자 변형 유기체(GMO)인 방법.
49. 제45항목에 있어서, 식물이 유전자 변형 유기체(GMO)가 아닌 것인 방법.
50. 제45항목에 있어서, 식물이 효율적인 질소 사용을 위해 유전적으로 조작되거나 육종된 것인 방법.
51. 박테리아 군집으로서, 질소 고정을 조절하는 하나 이상의 유전자에 도입된 하나 이상의 유전자 변이를 포함하고, 박테리아는 박테리아 군집의 존재 하에서 성장한 식물에서 질소의 1% 이상을 생성하는 것인 박테리아 군집.
52. 제51항목에 있어서, 박테리아가 글루타민, 암모니아 또는 보충 질소의 다른 화학적 공급원으로 보충된 비료의 존재 하에 질소를 생성하는 것인 박테리아 군집.
53. 제51항목에 있어서, 상기 유전자 변이가 nifA, nifL, ntrB, ntrC, 글루타민 합성효소, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, 글루타미나제, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB 및 nifQ로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 내의 변이인 박테리아 군집.
54. 제51항목에 있어서, 유전자 변이가 nifA 또는 글루타미나제의 발현의 증가; nifL, ntrB, 글루타민 합성효소, glnB, glnK, draT, amtB의 발현의 감소; GlnE의 아데닐릴 제거 활성의 감소; 또는 GlnD의 우리딜릴 제거 활성의 감소 중 하나 이상을 유발하는 돌연변이인 박테리아 군집.
55. 제51항목에 있어서, 유전자 변이가 (a)가 낙아웃 돌연변이이거나, (b) 표적 유전자의 조절 서열을 변경 또는 무능화하거나; 또는 (c) 이종성 조절 서열의 삽입을 포함하는 것인 박테리아 군집.
56. 제51항목에 있어서, 박테리아가 엔테로박터인 박테리아 군집.
57. 제51항목에 있어서, 박테리아가 라넬라인 박테리아 군집.
58. 제51항목에 있어서, 박테리아가 식물내생성, 식물착생성 또는 근권성인 박테리아 군집.
59. 제51항목에 있어서, 박테리아가 다수의 상이한 박테리아 분류군을 포함하는 것인 박테리아 군집.
60. 제51항목 내지 제59항목 중 어느 한 항목의 박테리아 군집을 포함하는 조성물.
61. 제60항목에 있어서, 조성물이 종자의 표면 상에 코팅된 박테리아 군집을 포함하는 것인 조성물.
62. 제60항목에 있어서, 조성물이 액체 또는 분말로서 제제화되는 것인 조성물.
63. ATCC 기탁 번호가 PTA-122293 또는 PTA-122294인 박테리아.

Claims (143)

  1. 재배지의 옥수수 식물에서의 대기 유래 질소의 양의 증가 방법으로서,
    복수의 조작된 질소고정 박테리아에 상기 재배지의 상기 옥수수 식물을 노출시키는 단계를 포함하며, 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아는 질소 고정 유전자 조절 네트워크에 도입된 하나 이상의 유전자 변이를 포함하고, 이에 의해 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아와 동일한 종인 동일한 양의 복수의 비-조작된 질소고정 박테리아에 노출된 옥수수 식물에 비해 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아에 노출된 상기 옥수수 식물 내의 대기 유래 질소의 양을 증가시키고,
    여기서 상기 질소 고정 유전자 조절 네트워크에 도입된 상기 하나 이상의 유전자 변이는 NifA의 증가된 발현 또는 활성, 또는 NifL의 감소된 발현 또는 활성 중 하나 이상을 야기하는 돌연변이를 포함하고;
    상기 질소 고정 유전자 조절 네트워크에 도입된 하나 이상의 유전자 변이는 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아의 속의 박테리아의 게놈 내에서 발견되는 이종성 서열의 삽입을 포함하고;
    상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아의 유전 물질은 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아의 속의 박테리아로부터의 유전 물질로 본질적으로 이루어지고;
    비-질소-제한 조건 하에서의 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아의 질소 고정 활성은 유사한 비-질소-제한 조건 하에서 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아와 동일한 종인 동일한 양의 상기 복수의 비-조작된 질소고정 박테리아의 질소 고정 활성보다 더 큰 것인, 재배지의 옥수수 식물에서의 대기 유래 질소의 양의 증가 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아는 질소 동화 유전자 조절 네트워크로 도입된 하나 이상의 유전자 변이를 더 포함하는 증가 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아는 상기 옥수수 식물의 종자를 심은 고랑에 적용되는 증가 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아는 상기 옥수수 식물의 종자 상에 코팅되는 증가 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아는, 조직의 생중량 1 g당 적어도 105 콜로니 형성 단위의 양으로 상기 옥수수 식물에 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아가 존재하도록 적어도 상기 옥수수 식물의 뿌리에 콜로니를 형성하는 증가 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아는 질소 고정의 질소 함유 생성물을 식물 내에서 분비하는 증가 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아는 상기 옥수수 식물에서 1% 이상의 고정된 질소를 식물 내에서 생성하는 증가 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아에 의해 생성된 상기 옥수수에서의 상기 고정된 질소는 1.2% 15N을 함유하는 비료로 처리된 재배지에서 성장된 옥수수 식물에서 15N의 희석에 의해 측정되는 증가 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아는 상기 옥수수 식물에서 5% 이상의 고정된 질소를 식물 내에서 생성하는 증가 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아는 유도 돌연변이 유발(directed mutagenesis) 및 무작위 돌연변이 유발(random mutagenesis)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유형의 조작을 사용하여 조작되는 증가 방법.
  11. 제1항에 있어서, 비-질소-제한 조건 하에서의 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아의 질소 고정 활성은 동일한 비-질소-제한 조건 하에서 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아와 동일한 종인 동일한 양의 복수의 비-조작된 질소고정 박테리아의 질소 고정 활성보다 더 큰 것인 증가 방법.
  12. 제6항에 있어서, 상기 복수의 조작된 질소고정 박테리아는 식물착생성 질소고정 박테리아, 식물내생성 질소고정 박테리아, 및 근권성 질소고정 박테리아로 이루어진 군으로부터 선택되는 증가 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 이종성 서열은 이종성 조절 서열인 증가 방법.
  14. 재배지의 옥수수 식물에서의 대기 유래 질소의 양의 증가 방법으로서,
    글루타민 합성효소 아데닐릴트랜스퍼라제/아데닐릴-제거 효소(GlnE) 중에 유전자 변이를 포함하는 복수의 조작된 디아조 영양 생물에 재배지의 옥수수 식물을 노출시키는 단계를 포함하며, 여기서 GlnE 중의 상기 유전자 변이는 이중기능성 글루타민 합성효소의 감소된 활성, 아데닐릴 트랜스퍼라제 활성의 감소된 활성, 또는 아데닐릴 제거 효소 활성의 감소된 활성 중 하나 이상을 야기하며, 이에 의해 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물과 동일한 양의 비-조작된 디아조 영양 생물에 노출되는 옥수수 식물에 비해 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물에 노출되는 상기 옥수수 식물 내의 대기 유래 질소의 양을 증가시키며, 여기서 상기 비-조작된 디아조 영양 생물은 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물과 동일한 종의 것인, 재배지의 옥수수 식물에서의 대기 유래 질소의 양의 증가 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 조작된 디아조 영양 생물은 질소 고정 유전자 조절 경로 내에서의 변형을 더 포함하는 증가 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 조작된 디아조 영양 생물은 식물착생체를 포함하는 증가 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 조작된 디아조 영양 생물은 식물내생체를 포함하는 증가 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 조작된 디아조 영양 생물은 근권생물(rhizophyte)을 포함하는 증가 방법.
  19. 제14항에 있어서, 복수의 조작된 디아조 영양 생물의 유전 물질은 상기 조작된 디아조 영양 생물과 동일한 속의 디아조 영양 생물로부터 유래된 유전 물질로 본질적으로 이루어지는 증가 방법.
  20. 제14항에 있어서, 복수의 조작된 디아조 영양 생물에 옥수수 식물을 노출시키는 것은 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물을 상기 옥수수 식물의 종자를 심은 고랑에 적용하는 것을 포함하는 증가 방법.
  21. 제14항에 있어서, 복수의 조작된 디아조 영양 생물에 옥수수 식물을 노출시키는 것은 상기 옥수수 식물의 종자 상에 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물을 코팅하는 것을 포함하는 증가 방법.
  22. 제14항에 있어서, 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물은 조직의 생중량 1 g당 적어도 105 콜로니 형성 단위의 양으로 상기 옥수수 식물에 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물이 존재하도록 적어도 상기 옥수수 식물의 뿌리에 콜로니를 형성하는 증가 방법.
  23. 제14항에 있어서, 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물은 상기 옥수수 식물에서 1% 이상의 고정된 질소를 생성하는 증가 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물에 의해 생성된 상기 옥수수 식물에서의 상기 고정된 질소는 1.2% 15N을 함유하는 비료로 처리된 토양에서 성장된 옥수수 식물에서 15N의 희석에 의해 측정되는 증가 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물은 상기 옥수수 식물에서 5% 이상의 고정된 질소를 생성하는 증가 방법.
  26. 제14항에 있어서, 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물은 엔테로박터(Enterobacter), 라넬라(Rahnella), 코사코니아(Kosakonia), 부르크홀데리아(Burkholderia) 및 클렙시엘라(Klebsiella)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 것인 증가 방법.
  27. 제14항에 있어서, 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물은 단일 종(single species)의 것인 증가 방법.
  28. 제14항에 있어서, 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물은 NifA의 증가된 발현 또는 활성, 또는 NifL의 감소된 발현 또는 활성 중 하나 이상을 야기하는 돌연변이를 더 포함하는 증가 방법.
  29. 재배지의 옥수수 식물에서의 대기 유래 질소의 양의 증가 방법으로서,
    nifH의 발현 또는 활성을 증가시키는 질소 고정 유전자 조절 네트워크에 도입된 하나 이상의 유전자 변이를 포함하는 복수의 조작된 디아조 영양 생물에 재배지의 옥수수 식물을 노출시키는 단계를 포함하며, 여기서 하나 이상의 도입된 유전자 변이는 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물과 동일한 속의 하나 이상의 유기체로부터 유래된 유전 물질을 포함하고,
    이에 의해 조작된 디아조 영양 생물에 노출된 옥수수 식물은 조작된 디아조 영양 생물과 동일한 종의 동일한 양의 비-조작된 디아조 영양 생물에 노출되는 옥수수 식물에 비해 증가된 양의 대기 유래 질소를 포함하는, 재배지의 옥수수 식물에서의 대기 유래 질소의 양의 증가 방법.
  30. 제29항에 있어서, 하나 이상의 도입된 유전자 변이는 조작된 디아조 영양 생물과 동일한 종의 디아조 영양 생물로부터의 유전 물질의 삽입을 포함하는 증가 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물과 동일한 속의 디아조 영양 생물로부터 유래된 상기 유전 물질은 조절 요소를 포함하는 증가 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 조절 요소는 이종성 조절 요소인 증가 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 조절 요소는 프로모터인 증가 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 프로모터는 환경 질소의 존재시에 활성인 프로모터인 증가 방법.
  35. 제29항에 있어서, 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물은 질소 동화 유전자 조절 경로 내에서의 변형을 더 포함하는 증가 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물은 GlnE, AmtB, ntrB, ntrC, 글루타민 합성효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, glnA, glnB, glnK, draT, 글루타미나제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 glnD로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 활성 또는 발현을 변경하는 변형을 포함하는 증가 방법.
  37. 제29항에 있어서, nifH의 발현 또는 활성을 증가시키는 질소 고정 유전자 조절 네트워크에 도입된 상기 하나 이상의 유전자 변이는 비-질소 제한 조건 하에서 nifH의 발현 또는 활성을 증가시키는 증가 방법.
  38. 제29항에 있어서, 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물은 동일한 재배지에서의 동일한 종의 복수의 비-조작된 디아조 영양 생물과 비교하여 재배지에 있는 경우에 nifH의 발현 또는 활성을 증가시키는 증가 방법.
  39. 제29항에 있어서, 상기 재배지는 0.01 mM 이상의 고정된 질소를 포함하는 증가 방법.
  40. 제29항에 있어서, 상기 재배지는 0.1 mM 이상의 고정된 질소를 포함하는 증가 방법.
  41. 제29항에 있어서, 상기 재배지는 0.5 mM 이상의 고정된 질소를 포함하는 증가 방법.
  42. 제29항에 있어서, 복수의 조작된 디아조 영양 생물은 식물착생체를 포함하는 증가 방법.
  43. 제29항에 있어서, 복수의 조작된 디아조 영양 생물은 식물내생체를 포함하는 증가 방법.
  44. 제29항에 있어서, 복수의 조작된 디아조 영양 생물은 근권생물을 포함하는 증가 방법.
  45. 제29항에 있어서, 복수의 조작된 디아조 영양 생물의 유전 물질은 상기 복수의 조작된 디아조 영양 생물과 동일한 종의 디아조 영양 생물로부터 유래된 유전 물질로 본질적으로 이루어지는 증가 방법.
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